JP2000287683A - ニューロン生存活性を有する筋由来成分およびｒｎａ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ニューロンに対して生存活性等の生理活性を
有し、神経変性疾患をはじめとする各種疾患（特に筋萎
縮性側索硬化症）の治療、予防、検査等に有用な生体由
来成分を提供する。 【解決手段】 筋肉組織を用いて何回かのカラムクロマ
トグラフィーを含む所定の精製工程を行った時に、最終
フラクションに含有されているニューロン生存活性成分
である。この生存活性成分は、おそらくＲＮＡだろうと
推測され、いずれにしても、精製されたニューロン生存
活性成分の少なくとも一部は、ＲＮＡまたはＲＮＡの分
子構造の一部により構成されている。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明はニューロン生存活性
等のニューロン生理活性を有する成分に関する。

【０００２】

【従来の技術】胚形成の過程では、初期において過剰に
神経細胞が形成されてから、その数が減少する。この過
程を自然細胞死と言う。例えば、腰部脊髄においては４
０％程度の運動ニューロンが死滅することが観察されて
いる。また、この運動ニューロン死は、神経筋シナプス
結合の形成時期と一致して進行することも観察されてい
る。胚形成の過程において標的組織である骨格筋が神経
支配される前に、当該骨格筋を実験的に除去すると、運
動ニューロンが死滅する。そして、胚形成の過程におい
て骨格筋を実験的に除去し、当該骨格筋があった付近に
別の胚から肢芽を取り出して植え込むと、ほんのわずか
しか運動ニューロンが死滅しない。従って、運動ニュー
ロン同士は、標的組織由来の限られた量の栄養因子を互
いに奪い合い、その結果、当該因子を十分に獲得したも
のだけが神経筋接合を形成し、一方、当該因子を獲得し
損ねた運動ニューロンは死滅するものと仮説が立てられ
ている。運動ニューロンの自然細胞死のメカニズムにつ
いては、標的組織に依存して生死が決まるとの考え方が
一般的に受け入れられている。

【０００３】神経成長因子（ＮＧＦ）は栄養因子の原型
（プロトタイプ）であり、発達中の交感神経細胞と感覚
神経細胞の生存を促進することが見出されている。運動
ニューロンに関しては、ＮＧＦは自然細胞死に何の影響
も及ぼさなかったが、新生仔において軸索切断によって
もたらされる細胞死をむしろ増大させた。１９７０年代
から、末梢および中枢神経に関与すると思われるＮＧＦ
以外の因子を単離するための研究が行われてきた。これ
までに単離された因子としては、脳由来神経栄養因子
（ＢＤＮＦ）、ニューロトロフィン−３（ＮＴ−３）、
白血病抑制因子（ＬＩＦ）、グリア細胞株由来神経栄養
因子（ＧＤＮＦ）などがインビボまたはインビトロにお
いて運動ニューロンの死滅を阻止することが見出されて
いる。これらのいずれも骨格筋から単離されたものでは
ないが、骨格筋の中でも発現（存在）することが認めら
れている。しかしながら、ＮＧＦ、ＢＤＮＦ、ＮＴ−
３、ＬＩＦあるいはＧＤＮＦのどれかをコードしている
マウス遺伝子を選択的に破壊しても、運動ニューロンの
生存にはほとんど影響がなかった。複数遺伝子が欠損し
た場合の影響はあまり知られていないが、これらの遺伝
子ノックアウトの結果は、これらの各ファクターは真の
運動ニューロン生存因子ではないことを示唆しており、
骨格筋の中に同定すべき別の分子がまだ残っていると思
われる。

【０００４】ある一群の神経変性疾患は特定の神経栄養
因子の異常によって招来するものとの仮説もあり、当該
神経栄養因子は神経変性疾患の治療に極めて大きな可能
性を秘めている。しかしながら、これらの因子を、運動
ニューロン疾患のひとつである筋萎縮性側索硬化症（Ａ
ＬＳ）の患者に対して臨床試験したけれど、現状では無
効と判定されている。従って、ＡＬＳあるいはその他の
運動ニューロン疾患を軽減できそうな全く新規の因子
（または複合的な因子群）が治療剤として得られはしな
いかと待望されている。

【０００５】

【発明が解決しようとする課題】本発明は上記の実状に
鑑みて成し遂げられたものであり、その目的は、ニュー
ロンに対して生存活性等の生理活性を有し、神経変性疾
患をはじめとする各種疾患の治療、予防、検査等に有用
な生体由来成分を提供することにある。

【０００６】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究したところ、運動ニューロン
に生存作用をもたらす成分を、ある一連のカラムクロマ
トグラフィーを使ってニワトリの骨格筋から単離するこ
とに成功した。我々は、研究を始めた当初、今までに知
られている栄養因子と同様に、活性成分としては蛋白質
またはポリペプチドが単離されるだろうと予想していた
が、新しく単離された活性成分は蛋白質でもポリペプチ
ドでもなかった。そして、新しく単離された活性成分
は、おそらくＲＮＡ、ＲＮＡの分子構造の一部を構成要
素として含む単一成分（例えばＲＮＡ誘導体、修飾体、
複合体）、前記いずれかを含む複合成分系またはこれら
のいずれかを含む混合成分系だろうということが判明し
た。本発明は、このような知見に基づいて成し遂げられ
たものである。

【０００７】本発明によれば、下記の精製工程を行った
時に最終フラクションに含有されているニューロン生存
活性成分が提供される：ステップ１において骨格筋をホ
モジナイズして、２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液で抽出
し、遠心分離して上澄を採取し；ステップ２において、
ステップ１で得られた上澄に、アセトンを当該アセトン
の最終濃度が３０％（ｖ／ｖ）となるように加え、遠心
分離によって上澄を取り、この上澄に、アセトンの最終
濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるように、アセトンをさら
に加え、遠心分離を行って沈殿を採取し；ステップ３に
おいて、ステップ２で得られた沈殿物を、５０％（ｗ／
ｖ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶液に溶解し、遠心分離し、上
澄を採取し；ステップ４において、ステップ３で得られ
た上澄を、等容量のフェノール：クロロホルム混液
（１：１、ｖ／ｖ）と混合し、室温にて振とうさせ、遠
心分離を行い、水相を採取し；ステップ５において、ス
テップ４で得られた水相を、フェニールセファロースＣ
Ｌ−４Ｂカラムを用いて５０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄含有５
０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐH７．５）で洗浄し、５０ｍＭ
ＨＥＰＥＳ（ｐH７．５）で溶出させて流出液を採取
し；ステップ６において、ステップ５で得られた流出液
を、Capcell−PakＣ₁₈カラムを用いて０−２５％ＣＨ₃
ＯＨ（ｐＨ６．５）のグラジュエント溶出を行って、所
定間隔でフラクションを区切り、最も活性の大きいフラ
クションを採取し；ステップ７において、ステップ６で
得られたフラクションを、ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを用
いて０−０．５M ＮａＣｌ（ｐＨ７．５）のグラジュエ
ント溶出を行って、所定間隔でフラクションを区切り、
最も活性の大きいフラクションを採取し；ステップ８に
おいて、ステップ７で得られたフラクションを、Capcel
l−PakＣ ₁₈カラムを用いて５−１９．２５％ＣＨ₃ＣＮ
（ｐH６．７５）のグラジュエント溶出を行って、所定
間隔でフラクションを区切り、最も活性の大きいフラク
ションを最終フラクションとして選択する。

【０００８】本発明にかかるニューロン生存活性成分
は、骨格筋またはそれ以外の筋肉組織から取り出すこと
ができる。なお、ステップ１において骨格筋をホモジナ
イズした後、アセトンなどを用いて脱脂してからステッ
プ２に移行するのが好ましい。

【０００９】前記のニューロン生存活性成分は、おそら
くＲＮＡだろうと推測されるが、現時点では断定できな
い。しかしながら、いずれにしても、精製されたニュー
ロン生存活性成分の少なくとも一部は、ＲＮＡまたはＲ
ＮＡの分子構造の一部により構成されている。

【００１０】本発明にかかる生存活性成分は、神経細胞
に対して重要な生理活性を示す可能性があり、神経細胞
が何らかの形で関与する疾患の治療、予防、診断に利用
できる可能性がある。特に、本発明にかかる生存活性成
分は、脊髄運動ニューロンに対して生存活性を示すこと
が確認されたことから、脊髄運動ニューロンの変性疾患
である筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、予防、診
断への利用が大いに期待される。

【００１１】

【発明の実施の形態】我々は、先ず、ニワトリ胚の骨格
筋を使用して、いくつもの精製ステップを順次、試行錯
誤しながら行って、脊髄運動ニューロンに対して生存活
性を示す生理活性成分を得た。そして、この生理活性成
分が有している生存活性と共に、物理化学的性質を調査
した。このような初期実験の結果を考慮して、この成分
がＲＮＡ、ＲＮＡ誘導体（例えば修飾体、複合体）また
はこれらのいずれかを含有する混合物であろうと推測
し、初期に行った精製方法を修正して同じ活性成分をニ
ワトリ胚の骨格筋から効率よく精製すると共に、この修
正精製法によって得られた活性成分を酵素学的に同定し
た。

【００１２】Ａ．初期における活性成分の精製 （１）実験材料 白色レグホンの受精卵を一般市場から購入し、加湿した
ふらん器内に３７℃で６日から１９日間インキュベート
した胚（これは、Hamburger Hamiltonのステージ２９
またはステージ４５にそれぞれ相当する）を使用した。

【００１３】（２）バイオアッセイ系の調製 脊髄ニューロンの初代培養系を上記白色レグホン受精卵
の６日齢胚から得て、精製過程で得られる各フラクショ
ンの活性をスクリーニングする生物学的検定に使用し
た。６日齢胚を用いたのは、運動ニューロンの自然細胞
死は、このステージから起き始めるからである。

【００１４】抗生物質（ペニシリン（10ｕｎｉｔ／ｍ
ｌ、明治）とストレプトマイシン（50μｇ／ｍｌ、明
治））および１０％加熱失活牛胎児血清（ＦＢＳ）（三
菱化成）を添加したダルベッコのモディファイドイーグ
ル培地（Dulbecco's modified Eagle's medium）（ＤＭ
ＥＭ）（Gibco BRL）を氷冷した中に６日齢胚の脊髄を
入れて、その中で実体顕微鏡で見ながらハサミを使って
分断した。それを、トリプシン０．２５％含有Ｃａ
²⁺−、Ｍｇ²⁺−フリー燐酸緩衝生理食塩水１０ｍｌ中
で、攪拌水浴（約７０サイクル／分）を使って、３７℃
で１５分間インキュベートした。トリプシンの反応は、
加熱失活馬血清を２ｍｌ添加することにより停止させ
た。１，０００ｒｐｍで５分間遠心分離した後、上澄を
除去し、沈殿物に６ｍｌのＤＭＥＭ／ＴＩＰ〔すなわ
ち、トランスフェリン（５μｇ／ｍｌ、Sigma）、イン
スリン（５μｇ／ｍｌ、Collaborative Res.）プロゲ
ステロン（０．２μＭ、Sigma）および上記同様の抗生
物質を添加したＤＭＥＭ〕を加え、プラスチック製チッ
プで吸引と排出を２０セット繰り返すことにより攪拌し
て、細胞相互を分離した。得られた脊髄ニューロン懸濁
液を、ナイロンメッシュ（＃１５０）に通してろ過し、
その後の培養を行うために、ＤＭＥＭ／ＴＩＰ培地を用
いて１×１０⁵ cells／ｍｌとなるように希釈した。組
織培養のためのウエル（培養皿）（１５ｍｍ径、住友）
は、少なくとも４時間かけてポリエチレンイミンでプレ
コートした。プレコートしたプレートは、滅菌蒸留水で
２回ほどすすぎ、抗生物質含有ＤＭＥＭを加えた。分離
した脊髄ニューロンを、１ｍｌ／wellの濃度で植え付け
た。この濃度は、２００ cells／ｍｍ²に相当した。

【００１５】このようにして培養細胞を撒いたウエル
に、被験サンプルを加えて検定を行った。具体的には、
３つの異なる容量の筋抽出物または分留サンプルをマイ
クロ遠心分離チューブ（Ultrafree C3GV、Millipore
社）を使って滅菌ろ過したものを、各容量ごとに、それ
ぞれ３つのウエルに加えた。それから、５％CO₂−９５
％空気の加湿器内で３７℃にて２日間インキュベートし
た後、各ウエルの所定エリア（８９５μｍ×１３４０μ
ｍ）に生存する神経細胞の数を、位相差顕微鏡（ニコン
社）を使ってかぞえた。生物学的活性の１ユニットは、
初期の脊髄ニューロン数の少なくとも１０％を生存させ
る被験サンプルの最小容量と定義した。

【００１６】一連の精製過程によって最終的に得られた
活性成分を検定するために、脊髄運動ニューロンを多量
に含有する培養細胞系（運動ニューロン培養系）を用い
た。この運動ニューロン培養系は、Arakawa et. alに
記載された方法を若干改変した方法により調製した。具
体的には、先ず、スクリーニング用の上記初代培養系と
同様の作業を行うことにより、６日齢胚の脊髄を分断
し、トリプシン処理し、加熱失活馬血清を添加し、遠心
分離して細胞の沈渣を得た。この沈渣を、Ｃａ²⁺−、Ｍ
ｇ²⁺−フリーグルコース（４ｍｇ／ｌ）を添加した低温
のHank平衡塩溶液（ＨＢＳＳ）の４ｍｌ中に懸濁させ、
プラスチック製チップで吸引と排出を２０セット繰り返
すことにより攪拌して、細胞相互を分離した。得られた
脊髄ニューロン懸濁液を、ナイロンメッシュ（＃１５
０）に通してろ過した後、ガラスチューブ中の６．８％
メトリザミド含有、２５ｍＭ ＨＥＰＥＳ添加ＨＢＳＳ
（ｐＨ７．５）４ｍｌの上に積層し、４℃にて４００×
ｇで１５分間遠心分離させた。中間層に含まれる運動ニ
ューロンは、約５倍容量の１０％ＦＢＳおよび抗生物質
添加ＤＭＥＭ（上述のもの）で希釈され、１，０００ｒ
ｐｍで５分間遠心分離された。得られた細胞の沈渣はＤ
ＭＥＭ／ＴＩＰで希釈された。このメトリザミド分留の
手順によれば、大きな運動ニューロンを８３％と豊富な
割合で培養細胞系に含ませることができる。

【００１７】（３）精製手順 生存活性成分を精製するために、１９日齢ニワトリ胚由
来の骨格筋を用い、下記の第１表に示すようなステップ
１からステップ９までの各精製ステップを順次、試行錯
誤しながら行った。

【００１８】

【表１】

【００１９】１９日齢胚を用いたのは、６日齢胚では小
さすぎて多量の骨格筋を集められないからである。そし
て、我々の予備的実験によれば、４日齢から２１日齢ま
での被験筋のなかで、１９日齢胚および２０日齢胚由来
の骨格筋が最も強い生物学的活性（unit／wet weigh
t）を持っていることが示された。

【００２０】先ず、総量で約１ｋｇの骨格筋を１９日齢
胚の後肢から取り出し、直ちにエタノール／ドライアイ
ス中で冷凍した。骨格筋を５０ｇずつ解凍し、１００％
氷冷アセトン中でホモジナイズし、脂質を除去した。そ
れらを４℃にて、９，０００ｒｐｍで３０分間遠心分離
し、沈殿物を濾取し、乾燥した（アセトンパウダー）。
ステップ１においては、このアセトンパウダーを２リッ
トルの２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液を用いて２回ほど
抽出した。そして、２回分の抽出液を合わせた。

【００２１】ステップ２においては、アセトンを当該ア
セトンの最終濃度が３０％（ｖ／ｖ）となるように抽出
液に加え、遠心分離によって上澄を取った。この上澄
に、アセトンの最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）となるよう
に、アセトンをさらに加え、遠心分離を行って沈殿を得
た。

【００２２】ステップ３においては、アセトンによる沈
殿物を蒸留水に溶解した。この溶液に、（ＮＨ₄）₂ＳＯ
₄水溶液を、当該（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の最終濃度が３０％
（ｗ／ｖ）となるように加え、遠心分離によって上澄を
取った。この上澄に、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の最終濃度が５
０％（ｗ／ｖ）となるように、（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶液
をさらに加え、再び遠心分離によって上澄を取った。こ
のようにして得られた上澄に、ステップ４からステップ
９までの一連のカラムクロマトグラフィーを順次行っ
た。用いたカラム、平衡用および洗浄用緩衝液、溶出条
件を以下に示す。

【００２３】ステップ４：フェニールセファロース Ｃ
Ｌ−４Ｂ（Pharmacia社）、５０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ₄）
₂ＳＯ₄含有５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）による
洗浄２回、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．５）による
溶出。

【００２４】ステップ５：ＤＥＡＥ−セファロース Ｃ
Ｌ−６Ｂ（Pharmacia社）、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ７．５）による平衡化、０ Ｍ、０．２ Ｍお
よび０．５ Ｍ ＮａＣｌのステップ溶出。

【００２５】ステップ６：preparative ＤＥＡＥ−５Ｐ
Ｗ（２１．５ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ、トウソー）、
５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）による平衡
化、ＮａＣｌの０−０．５Ｍグラジュエント溶出。

【００２６】ステップ７：preparative ＰＯＲＯＳ−５
０ＰＥ（１０ｍｍＩ．Ｄ．×１５ｍｍ、Perseptive
社）、５０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄含有２０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）による平衡化、（Ｎ
Ｈ₄）₂ＳＯ₄の５０−０％グラジュエント溶出。

【００２７】ステップ８：preparative Capcell−Pak
Ｃ₁₈（２０ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、資生堂）、１０
ｍＭ ＣＨ₃ＣＯＯＮＨ₄（ｐＨ８．９）による平衡化、
メタノールの０−２０％（ｖ／ｖ）グラジュエント。

【００２８】ステップ９：analytical Capcell−Pak
Ｃ₁₈（４．６ｍｍＩ．Ｄ．×２５０ｍｍ、資生堂）、１
０ｍＭ ＣＨ₃ＣＯＯＮＨ₄（ｐＨ８．９）による平衡
化、メタノールの０−２０％（ｖ／ｖ）グラジュエン
ト。

【００２９】preparative ＤＥＡＥ−５ＰＷ、preparat
ive ＰＯＲＯＳ−５０ＰＥ、およびpreparative Capce
ll−Pak Ｃ₁₈は、ＪＡＳＣＯ社のＨＰＬＣシステム「Gu
lliver」によって稼動させ、それらの流速は５ｍｌ／ｍ
ｉｎとした。また、analytical Capcell−Pak Ｃ
₁₈は、ヒューレットパッカード（シリーズ１１００）に
よって、流速１ｍｌ／ｍｉｎで稼動させた。

【００３０】ステップ４（フェニールセファロース Ｃ
Ｌ−４Ｂ）では、全ての溶出液を次のステップに使用し
た。ステップ５では、０．２Ｍでは流れ出ず、０．５Ｍ
で流出したものを次のステップに使用した。ステップ６
から８については連続的に５分ごとにフラクション（分
留分画）を回収し、スクリーニングアッセイでもっとも
活性が高かったフラクションを次のステップに使用し
た。ステップ９については連続的に１分ごとに回収し
て、各フラクションの活性をスクリーニングした。それ
ぞれ１／１０００容量（ステップ１から７）または１／
１００容量（ステップ８と９）の抽出物またはフラクシ
ョンを凍結乾燥し、ＤＭＥＭ／ＴＩＰ １００μｌに溶
解し、上記した生物学的検定を行った。

【００３１】（４）結果 ２％ＮａＣｌ水溶液による抽出物の総生物学的活性は
４，０００，０００ユニットと評価された（第１表）。
スクリーニング用の一次培養系脊髄ニューロンをウエル
に撒いた直後は、球状に丸まって培地中に浮遊した。こ
の条件では、２日後に生存している神経細胞はほとんど
なかった。しかしながら、ＮａＣｌ抽出物を培地に添加
すると、神経細胞は２日後にも生存し続け、それらの一
部は突起を伸展させた。ＮａＣｌ抽出物は、脊髄運動ニ
ューロンを多量に含有する培養細胞系（運動ニューロン
培養系）に対しても生存活性を示した。従って、我々
は、２％ＮａＣｌを使ってニワトリ骨格筋から抽出した
成分が運動ニューロンに対して生存作用を有しているこ
とを確認した。しかしながら、連続して行う一連のカラ
ムクロマトグラフィーにより分留された多数のフラクシ
ョンを分析するために、運動ニューロン培養系を常に使
用することが不可能だった。そこで我々は、調製が比較
的容易な上述の初代培養系をアッセイシステムとして使
用した。第１表に示すように、初期の生物学的活性の半
分が、５０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の上澄に認められた。そ
の上澄をフェニールセファロース ＣＬ−４Ｂで脱塩し
た後、ＤＥＡＥ−セファロース ＣＬ−６Ｂを使用し
て、０．２Mと０．５M ＮａＣｌからなる２段階溶出を
行った。その溶出液を、０−０．５Ｍ ＮａＣｌのリニ
アグラジュエントを行うＨＰＬＣシステムを用いるprep
arative ＤＥＡＥ−５ＰＷに通した。活性を保持し続け
ているフラクションは、Ａ、ＢおよびＣと称する３つの
グループに分けられた（第１表）。フラクションＡは、
ＮａＣｌ濃度が０．２５Ｍ以下の時に溶出されたもので
あり、フラクションＢは、０．３Ｍ前後の時のものであ
り、フラクションＣは、０．３５Ｍ以上の時のものであ
る。これらのうち、フラクションＣが最も強い生物学的
活性を示し、次のステップに供された。ＰＯＲＯＳ−５
０ＰＥカラムクロマトグラフィーを行うと、活性は、２
つのフラクションＣ１、Ｃ２にあった。フラクションＣ
２の１．４倍高い活性を有するフラクションＣ１のほう
を、preparative Capcell−Pak Ｃ₁₈にかけた。する
と、活性を示す顕著なピークが一つだけ検出された。こ
のフラクションを、最終ステップであるanalytical Ca
pcell−Pak Ｃ₁₈にかけた。この最終ステップで得られ
た溶出液について２５４ｎｍでのＵＶ吸収で見た溶出プ
ロフィールではリテンションタイムが３０分の時点に単
一ピークが認められ、そこに全ての生物学的活性が含ま
れていた（図１（ａ））。２５分から３５分の間に溶出
した物質は全て、図２（ｂ）に示すような同一のＵＶス
ペクトルを示した。その極大ＵＶ吸収は２５８ｎｍで観
察された。この結果は、活性成分が蛋白質でもなければ
ペプチドでもないことを表している。後述する修正法に
より筋抽出物を精製した場合にも、最終的に得られた活
性成分は、上記分析用Capcell−Pak Ｃ₁₈によって同一
のリテンションタイムの時点でだけ検出した。この活性
成分を、脊髄運動ニューロンを多量に含有する培養細胞
系（運動ニューロン培養系）に添加したところ、運動ニ
ューロンは生存し続けた。この結果は、精製した成分が
脊髄運動ニューロンに対して生存活性を及ぼすことを示
している。

【００３２】（５）初期の精製実験についての考察 我々は、脊髄運動ニューロンに対して生存活性を示す成
分をニワトリ骨格筋から精製することに成功した。この
成分は、カラムクロマトグラフィーの溶出プロフィール
において単一のピークを示す（図２（ａ））と共に、Ｕ
Ｖ吸収のプロフィールに照らすとフラクション中の成分
はペプチド類ではなかった（図２（ｂ））。精製プロセ
スの過程において我々は、よりよい結果を得るために様
々なカラムや溶剤を試験した。我々は、精製手順の各ス
テップにおいて、そのステップでもっとも高い生存活性
を示したフラクションを選び、次のステップに用いた。
第１表の最終ステップ９において、我々は、活性成分を
含有するフラクションを得た。ＵＶ吸収は２５８ｎｍが
極大であり、２３０ｎｍが極小であり、比（Ａ₂₆₀／Ａ
₂₈₀）は１．９２だった。従って、我々は、ペプチド類
とは全く違うものであると結論した。この吸収特性から
みて、我々が得た活性成分は、核酸または核酸の誘導体
である可能性がある。

【００３３】精製された成分には、精製過程において次
のような特徴が見られた。（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄溶出ステッ
プにおいて、生存活性は、５０％（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄の上
澄中に回収された。それゆえに、上澄中に含有される活
性成分は、分子サイズが小さいであろうことが示唆され
た。ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを使用して、最高の活性を
有するフラクション（フラクションＣ）を溶出させるた
めには、ほとんど中性（ｐＨ７．５）の条件で高いイオ
ン濃度（＞０．３５Ｍ ＮａＣｌ）が必要だった。その
濃度は、蛋白質やペプチドを溶出するのに必要な程度よ
りも、さらに高濃度だった。それに加えて、生存活性を
有する成分は、陽イオン交換カラムには決して吸着され
ないことが、付加的に行った実験で観察された。これら
の結果は、活性フラクション中に強い負電荷を帯びた酸
性成分が含有されていることを示唆している。精製の試
みを始めた当初は、我々は、活性成分はペプチドか或い
は蛋白質であろうと信じていた。従って、上述の結論か
ら、精製された成分は小さなサイズの酸性ペプチドであ
ろうと我々は考えた。しかしながら、次のような結果に
よって、活性成分はペプチド類ではないことが我々に強
く指し示された。すなわち、本実験において、Capcell
−Pak Ｃ₁₈を、アセトニトリルよりも疎水性に乏しいＭ
ｅＯＨ／ＣＨ₃ＣＯＯＮＨ₄系と組み合わせて使用した。
acetonitrile／trifluoroacetic acid系を用いて行った
我々の予備的実験においては、一般的な蛋白質またはペ
プチドを溶出するのに用いられる溶媒と比べて、アセト
ニトリル濃度の低い（＜５％）時点でだけ弱い活性が回
収された。それゆえ、活性成分が強い親水性を有してい
ることが示唆される。さらに、我々は、精製した成分の
アミノ酸シークエンスをEdomanの分解法によって分析し
ようと試みたが、シグナルが得られなかった。これらを
総合すると、精製された成分は、蛋白質でもペプチドで
もないと考えられ、これらの全特徴はリボ核酸の特徴と
一致している。

【００３４】精製の過程で、生存活性を有するフラクシ
ョンがいくつか存在した。このことは、今回の研究で精
製された成分以外の他の活性分子が骨格筋に含有されて
いる可能性がある。調製用ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムを使
用して分離した後、活性成分は３つの異なるフラクショ
ンに認められた（第１表）。それらのフラクションは、
ＤＥＡＥ−５ＰＷカラムクロマトグラフィーを行った時
だけでなく、ＰＯＲＯＳ−５０ＰＥカラムクロマトグラ
フィーを行った時にもリテンションタイムが異なってい
た。このことから考えて、これら３つのフラクションは
全く別の活性成分を含有していると考えられた。従っ
て、筋肉には、生存活性を有する成分が一種類だけでな
く複数含有していそうである。ニワトリまたはラットの
骨格筋から部分的に精製された幾つかの蛋白質は、運動
ニューロンの生存を促進することが認められており、こ
れらがインビトロにおいて形態的およびアセチルコリン
（ＡＣｈ）を誘導するという分化を引き起こすことも認
められている。

【００３５】精製作業の過程において、脊髄運動ニュー
ロンに対する生存活性を、６日齢ニワトリ胚由来の脊髄
ニューロンの初代培養系を用いて検定した。この初代培
養系には、脊髄の運動ニューロンだけでなく当該脊髄の
介在ニューロンも比較的多量に含まれているので、介在
ニューロンも活性値に寄与していたかもしれないが、精
製された成分は運動ニューロンに富む培養系で生存活性
を示した。従って、我々は、この研究で精製された成分
は、インビトロにおいて運動ニューロンを生存させるよ
うに働くのはまちがいなく、それ以外に、介在ニューロ
ン等の他の神経細胞にも生存活性を示す可能性があると
結論した。

【００３６】Heftiらは、神経栄養因子を、「神経細胞
の生存、成長、形態学的可塑性、或いは、神経細胞が有
する分化した機能を維持するための蛋白の合成を調節し
ている内因性の可溶性蛋白」と定義した。従って、我々
が精製した成分は、非ペプチド的な特徴が認められるも
のであるから、このような定義の神経栄養因子には当て
はまらない。

【００３７】Ｂ．修正法による精製と活性成分の同定 （１）実験材料 上述した初期の実験と同様に、白色レグホンの受精卵を
一般市場から購入し、加湿したふらん器内に３７℃で６
日から１９日間インキュベートした胚を使用した。

【００３８】（２）バイオアッセイ系の調製 上述した初期の実験で使用したのと同様のアッセイ系を
使用した。すなわち、精製過程で得られる各フラクショ
ンの生存活性をスクリーニングするために、調製は比較
的容易だが介在ニューロン等の他の神経細胞が比較的多
量に含まれる初代培養系を用い、同じテクニックで検定
を行った。また、最終的な精製成分は、脊髄運動ニュー
ロンを多量に含有する培養細胞系（運動ニューロン培養
系）を用いる上述のテクニックて検定した。全ての試料
について、３段階の濃度のそれぞれで、各濃度につき３
ウエルずつ検定を行った。

【００３９】（３）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル分析 初期の実験で行ったのと同じ方法で精製した最終の活性
フラクション、すなわち、UVによりλmaxが２５８ｎｍ
の単一ピークが検出されるフラクション（約１５０μ
ｇ）を、凍結乾燥してからＤ₂Ｏ（９９．８％、メルク
社）に溶解した。この溶解液について、ＪＮＭ−α６０
０スペクトル測定機（ＪＥＯＬ社）を使って、６００Ｍ
Ｈｚ、室温（２７℃）にて¹Ｈ−ＮＭＲ測定を行った。

【００４０】（４）精製法の修正 後述する¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルの結果から、活性成分
がＲＮＡ、その誘導体または、それらのいずれかを含有
する成分群ではないかと予測されたので、初期に行って
いた精製法を次のように修正した。

【００４１】すなわち、１９日齢ニワトリ胚の骨格筋を
アセトン中にホモジナイズして、濾紙に通し、アセトン
パウダーを回収した。ステップ１においては、このアセ
トンパウダーを、２％（ｗ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液で抽出
し、１２，０００×ｇで、４℃にて、３０分間遠心分離
した（これと同じ遠心分離の条件は、特に説明が無い限
り、精製の全手順を通して採用された）。

【００４２】ステップ２においては、得られた上澄に、
アセトンを当該アセトンの最終濃度が３０％（ｖ／ｖ）
となるように加え、遠心分離によって上澄を取った。こ
の上澄に、アセトンの最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）とな
るように、アセトンをさらに加え、遠心分離を行って沈
殿を得た。

【００４３】ステップ３においては、アセトンによる沈
殿物を、５０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶液に直
接溶解し、遠心分離し、上澄を取った。

【００４４】ステップ４においては、この（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄水溶液の上澄を、等容量のフェノール：クロロホル
ム混液（１：１、ｖ／ｖ）と混合し、室温にて振とうさ
せ、遠心分離を行い、水層を取った。

【００４５】このようにして得られた水層に、ステップ
５からステップ８までの一連のカラムクロマトグラフィ
ーを順次行った。用いたカラム、平衡用および洗浄用緩
衝液、溶出条件を以下に示す。

【００４６】ステップ５：フェニールセファロース Ｃ
Ｌ−４Ｂカラム（Pharmacia社）、５０％（ＮＨ₄）₂Ｓ
Ｏ₄含有５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐH７．５）による洗浄
２回、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐH７．５）による溶
出； ステップ６：Capcell−PakＣ₁₈（２０ｍｍＩ．Ｄ．×２
５０ｍｍ、資生堂）、１０ｍＭ ＣＨ₃ＣＯＯ（ＮＨ₄）
（ｐＨ６．５）による平衡化、０−２５％ＣＨ ₃ＯＨ含
有１０ｍM ＣＨ₃ＣＯＯ（ＮＨ₄）（ｐＨ６．５）のリニ
アグラジュエント（８ｍｌ／ｍｉｎ．、１００分間）に
よる逆相ＨＰＬＣ。部分的精製成分（ＰＰＳ）がこのス
テップ６により得られた。結果の図４を参照のこと）。

【００４７】ステップ７：ＤＥＡＥ−５ＰＷ（２１．５
ｍｍＩ．Ｄ．×１５０ｍｍ）、５０ｍM Tris−HCl（ｐ
Ｈ７．５）による平衡化、０−０．５M ＮａＣｌ含有５
０ｍM Tris−HCl（ｐＨ７．５）のリニアグラジュエン
ト（５ｍｌ／ｍｉｎ．、１２０分間）による陰イオン交
換ＨＰＬＣ。

【００４８】ステップ８：Capcell−PakＣ₁₈（２０ｍｍ
Ｉ．Ｄ．×２５０ｍｍ）、５％（ｖ／ｖ）ＣＨ₃ＣＮ含
有１００ｍM triethylamine−acetate（ｐH６．７５）
（平衡用バッファーＡ）による平衡化、５−１９．２５
％ＣＨ₃ＣＮ（ｐH６．７５）のリニアグラジュエント
（８ｍｌ／ｍｉｎ．、／１５０分間）による逆相ＨＰＬ
Ｃ。この溶出は、１００％のバッファーＡから１００％
のバッファーＢ（１９．２５％（ｖ／ｖ）ＣＨ₃ＣＮ含
有８５ｍM triethylamine−acetate（ｐH６．７５））
へと溶出液を徐々に変えることにより行った。

【００４９】ステップ５（フェニールセファロース Ｃ
Ｌ−４Ｂ）では、全ての溶出液を次のステップに使用し
た。ステップ６から８については連続的に５分ごとにフ
ラクション（分留分画）を回収し、スクリーニングアッ
セイでもっとも活性が高かったフラクションを選択し
た。各ステップの抽出物またはフラクションを凍結乾燥
し、ＤＭＥＭ／ＴＩＰに溶解し、上記した生物学的検定
を行った。

【００５０】（５）RNase AおよびプロテイナーゼKに
対する部分的精製成分（ＰＰＳ）の反応性 ステップ６（逆相Capcell−PakＣ₁₈）により得られた活
性フラクションは、溶出プロフィール（λmax２５８ｎ
ｍ）のピークに対応する生物学的活性を有しており、Ｐ
ＰＳを含有していた。このＰＰＳフラクションを、酵素
として１０単位のRNase Aまたは４単位のプロテイナー
ゼKを用いて消化した。ＰＰＳフラクションの分取試料
（１．６６ｇの骨格筋に相当する）のうちのひとつには
蒸留水のみ加え、酵素は添加しなかった（コントロー
ル）。別の分取試料のひとつは、何の処理もしないで４
℃でインキュベートした（オリジナル）。RNase Aまた
はプロテイナーゼKで処理した試料とコントロールは、
３７℃にて３時間インキュベートした。酵素処理した試
料は、インキュベート後、VP−３１８（４．６ｍｍＩ．
Ｄ．×１５０ｍｍ、センシュパック社）を用い、１０ｍ
Ｍ ammonium acetate（ｐＨ６．５）により平衡化
し、０−２５％（ｖ／ｖ）メタノールのグラジュエント
溶出（１ｍｌ／ｍｉｎ．）による逆相ＨＰＬＣ（ヒュー
レットパッカードのシリーズ１１００）を行い、消化酵
素を除去した。それから各試料について、脊髄運動ニュ
ーロンを多量に含有する培養細胞系（運動ニューロン培
養系）を用いて生存活性を検定した。

【００５１】（６）ニワトリ胚からの筋粗抽出物（ＣＭ
Ｘ）の調製 １８日齢および１９日齢ニワトリ胚を、２％（ｗ／ｖ）
ＮａＣｌ水溶液中でホモジナイズし、１５０，０００×
ｇ、４℃で１５分間超遠心分離することにより、筋粗抽
出物（ＣＭＸ）を調製した。上澄を、等量のフェノー
ル：クロロホルム：イソアミルアルコール（２５：２
４：１、ｖ／ｖ）中に懸濁し、１９，０００×ｇ、４℃
で１０分間遠心分離した。上側の水層（０．１ｇの骨格
筋に相当）を回収し、脊髄運動ニューロンを多量に含有
する培養細胞系（運動ニューロン培養系）を用いて神経
細胞の生存数をかぞえ、生存活性を検定した。後述する
ように、修正精製法の最終フラクションの活性を、ＣＭ
Ｘの活性と比較した。

【００５２】（７）結果 初期の方法により精製した最終フラクションに含有され
ていた成分の¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ポリマーに特
徴的なピークを示した（図２）。β−Ｄ−リボースとプ
リン塩基とピリミジン塩基のプロトンに帰結するシグナ
ルが観察されたが、ＤＮＡの2''−デオキシ−β−Ｄ−
リボースの2'Hと2''Hに帰結するシグナルは観察されな
かった（図２）。この結果は、精製成分がリボヌクレオ
チド（ＲＮＡ）であることを示していた。

【００５３】次に、筋粗抽出物（ＣＭＸ）をフェノール
／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、生物
学的検定を行った。ＣＭＸをフェノール／クロロホルム
／イソアミルアルコールにより抽出した後も、各被験量
における培養脊髄ニューロンの生存を維持する能力が維
持されていたので（図３）、生物学的活性成分が蛋白質
ではないことは示された。この事実は、¹Ｈ−ＮＭＲス
ペクトルの結果では精製成分がＲＮＡであることを示し
ていたのを補強している。

【００５４】問題の活性成分がＲＮＡであると考えて、
初期に行っていた精製法を改変し、精製ステップのひと
つとしてフェノール／クロロホルム抽出を組み込んだ。
修正精製法によって最終的に得られたフラクションに
は、ＵＶによる溶出プロフィールにおいてλmax２５８
ｎｍのピークが認められ、スクリーニングアッセイによ
れば、最初に撒いた細胞数の３８〜４０％が生存したま
ま残存していた（骨格筋を用いて同じ精製を独立して２
回行った結果に基づいている）。

【００５５】この修正精製法によって得られた部分的精
製成分（ＰＰＳ）を、RNase処理に対する感受性につい
て試験した。RNase A処理によって、ＰＰＳの生物学的
活性は完全に失われた（図４）。これに対して、プロテ
イナーゼＫで処理した場合には、ＰＰＳの生物学的活性
に顕著な影響は現れなかった（図４）。これらの結果
は、脊髄ニューロンを用いる生物学的検定において生物
学的活性に関与する成分が、蛋白質ではなく、ＲＮＡ分
子であることを示唆している。

【００５６】さらに、修正精製法によって得られた最終
フラクションの生存活性と、ＣＭＸの生存活性を、脊髄
運動ニューロンを多量に含有する培養細胞系（運動ニュ
ーロン培養系）を用いて検定し、比較した。運動ニュー
ロン培養系を用いた上述のアッセイ系では、最大の生存
効果を与えるＣＭＸの量は、１０ｍｇの骨格筋に相当
し、この量において、ほぼ１００％の神経細胞が生存す
る。これに対して、修正精製法により得られたフラクシ
ョンに含有される精製成分を、３８４ｎｇのＲＮＡまた
は２４０μｇの骨格筋に相当する量だけ、培地１ｍｌ中
に添加すると、ＣＭＸ処理ニューロンの１１０±３．２
％（mean±SEM）相当の生存が維持することができた。
また、ＣＭＸ処理ニューロンの３９±４．８％（mean±
SEM）相当の生存効果が、３８．４ｎｇのＲＮＡに相当
する量の精製成分によって得られた。

【００５７】（８）精製成分の同定に関する考察¹ Ｈ−ＮＭＲによるスペクトル分析によって、精製され
た生物学的活性成分の主要な構成要素がＲＮＡであるこ
とが明らかになった（図２）。我々が得た成分がフェノ
ール／クロロホルム／イソアミルアルコールによって効
果的に精製されるという観察結果（図３）を考慮して、
初期の精製法を修正した。修正精製法によって得られた
ＰＰＳ試料の、RNase AおよびプロテイナーゼKを用い
た酵素学的消化によって、生物学的活性成分がＲＮＡで
あることが確認された（図４）。

【００５８】ＤＮＡのプロトンＮＭＲスペクトルは、リ
ボース残基のプロトンシグナルに基づいてＲＮＡのスペ
クトルと区別することが可能である。ＤＮＡにおいて
は、2''−デオキシ−β−Ｄ−リボースの2'Hと2''Hに帰
結するシグナルの化学シフト（δ）が１．８〜３．０ｐ
ｐｍの範囲になるが、この領域内では目立ったシグナル
は検出されなかった（図２）。この結果から、精製され
た成分がＲＮＡであり、ＤＮＡではないことがさらに確
認された。

【００５９】精製成分の特徴をすべて総合した結果、我
々は、それがＲＮＡ鎖（ポリリボヌクレオチド）であっ
てリボヌクレオチドのモノマーではないという結論に達
した。例えば：１）生物学的活性は、RNase A処理によ
って消失した；２）¹Ｈ−ＮＭＲスペクトルは、ポリマ
ーであることを表すブロードのピークを示した；３）こ
の成分は、熱に対して不安定（９６℃、５分間）であっ
たが、リボヌクレオチドのモノマーは熱処理に対して安
定である；４）分子重量は１７，０００〜４７，０００
と評価された（ゲル浸透クロマトグラフィーによる）。

【００６０】部分的精製成分（ＰＰＳ）は、エンドリボ
ヌクレアーゼ（RNase T₁,RNase U ₂、RNase B. cere
us およびRNase Phy M）による消化に対しては、むし
ろ感受性が無く、完全に不活化するためには比較的多量
のRNase A（１０単位、図４）を必要とした。一方、エ
クソヌクレアーゼ消化を行うと、酵素が少量でも（０．
０４単位のヌクレアーゼＰ₁）生物学的活性を効果的に
消失させた。エンドリボヌクレアーゼ処理に対するＰＰ
Ｓの抵抗性は、ＲＮＡ分子の内部に形成される潜在的な
二次構造によるものなのかもしれない。この抵抗性は、
RNase A処理、あるいは、適用された一連の生成過程で
の劣化に対する生物学的活性成分の安定性を高めるのに
寄与しているであろう。

【００６１】研究当初の実験では、生物学的活性成分が
ＲＮＡであることは指示されていなかった。例えば、我
々は、ＣＭＸに含有される生物学的活性成分が、トリプ
シン処理によって活性を著しく減少させることを観察し
た。そして、同じような結果は、パン酵母（baker's y
est）のｔＲＮＡを用いて、ＨＰＬＣ溶出プロフィール
とポリアクリルアミドゲル電気泳動により検定を行った
時にも観察された。しかしながら我々は、この現象は、
市販されている試薬のトリプシン中に存在している痕跡
量のエクソヌクレアーゼによって招来する人為的要素だ
と考えている。

【００６２】修正精製法においては、各精製ステップに
おいて直前のステップで回収された生物学的活性の５０
％以上が残存しているフラクションを選び、それをさら
に精製した。このことは、精製したＲＮＡが、ＣＭＸ由
来の生物学的活性成分のうちのかなり大きな部分を占め
ていることを表している。この生存活性成分が、胚の脊
髄運動ニューロンの自然細胞死が起こる時期において卵
内（in ovo）で果たす潜在的役割を特定するために
は、さらなる研究が必要であろうが、ＲＮＡを少量添加
（３８４ｎｇ ＲＮＡ／ｍｌ）しただけでも脊髄運動ニ
ューロンが死滅するのを阻止できることが観察されたこ
とによって、細胞間情報伝達分子としてのＲＮＡの新し
い境地が切り開かれるであろう。

【００６３】

【発明の効果】以上に述べたように、本発明に係る活性
成分がＲＮＡを主要な構成要素としていることはほぼ間
違いないと思われるが、現時点では完全に断定すること
ができない。また、この精製成分の本質が、ＲＮＡ単独
なのか、ＲＮＡの誘導体なのか、あるいは、ＲＮＡまた
はその誘導体を構成要素のひとつとして含む複合成分系
（例えば、複合体、混合物など）なのかは、まだ不明で
ある。

【００６４】いずれにしても、本発明に係る活性成分
が、脊髄運動ニューロンに対してインビトロにおいて生
存活性を示すことが確認された。従って、本発明に係る
活性成分は、脊髄運動ニューロンに対してインビボにお
いても重要な生理活性を有している可能性が大きいと考
えられ、脊髄運動ニューロンの変性疾患である筋萎縮性
側索硬化症（ＡＬＳ）の治療、予防、診断への利用が大
いに期待される。

【００６５】また、本発明に係る活性成分は、脊髄運動
ニューロン以外の神経細胞、特に、脊髄運動ニューロン
以外の脊髄ニューロン（例えば介在ニューロン）や、脊
髄以外の部分の運動ニューロン等に対しても重要な生理
活性を示す可能性があり、神経細胞が何らかの形で関与
するＡＬＳ以外の疾患の治療、予防、診断に利用できる
可能性もある。

【図面の簡単な説明】

【図１】初期に行われた精製手順により得られた最終フ
ラクションのＵＶ吸収特性を示す図である。図１（ａ）
は、Capcell−Pak Ｃ₁₈分析のＵＶ溶出プロフィール
と、対応する生存活性を示した図である。図１（ｂ）
は、精製された活性成分のＵＶ吸収スペクトルを示した
図である。

【図２】初期に行われた精製手順により得られた最終フ
ラクションに含有される活性成分を、６００ＭＨｚでの
¹Ｈ−ＮＭＲスペクトル（Ｄ₂Ｏを使用）を示す図であ
る。図中の各数字は、予想されるケミカルシフトに基づ
いて決定された位置を示す：1'、2'、3'、4'、5'、およ
び5''は、それぞれβ−Ｄ−リボースの1'H、2'H、3'H、
4'H、5'H、および5''Hに対応し；5および6はピリミジン
塩基の5Hおよび6Hに対応し；2および8は、プリン塩基の
2Hおよび8Hに対応する。ＨＯＤ、Ａｃ、ＣＤ ₃ＯＤは、
それぞれＨ₂Ｏ中のＨＯＤ、酢酸アンモニウムおよびメ
チルアルコールを示し、これらはＨＰＬＣの溶出用バッ
ファとして使用された。ケミカルシフトは、parts/mill
ion（ｐｐｍ）で表した。

【図３】筋粗抽出物（ＣＭＸ）からフェノール／クロロ
ホルム／イソアミルアルコール混液を使って抽出した時
の生物学的活性の回収率を示す図である。所定の長方形
エリア内（８９５μｍ×１３４０μｍ、１．２ｍｍ²）
に生存していた脊髄ニューロンの数（mean±S.D.）を数
えた。試料の添加量は、１０ｍｇの骨格筋に相当する量
を１とした時の指数で表した。異なる２つの分析法によ
り、次のことが明らかになった：１）生物学的活性成分
は、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコール
混液抽出後に、水相（ＣＭＸ／ＰｈＯｈ）に移行した
（Ｐ＝０．２５）；２）生物学的活性は試料の添加量に
依存しなかった（Ｐ＜０．０５）。

【図４】部分的精製成分（ＰＰＳ）を酵素により不活化
した結果を示す図である。ＰＰＳは、プロテイナーゼＫ
またはRNase Aで処理し、３７℃で３時間インキュベー
トし、ＨＰＬＣで精製し、脊髄ニューロン培養細胞に添
加した。生存している脊髄ニューロン数（mean±S.D.）
を無血清培地で２日間培養後に数えた。試料の添加量
は、１６６ｍｇの骨格筋に相当する量を１とした時の指
数で表した。異なる２つの分析法により、次のことが明
らかになった：１）酵素処理の効果には有意差があった
（Ｐ＜０．０５）；２）試料の添加量によって結果に有
意の変化をもたらした（Ｐ＜０．０５）。試料の添加量
が１／１０当量の時には４つのサンプルの間に統計学的
には有意差がなかった（Ｐ＞０．０５）が、試料の添加
量が１当量の時には、プロテイナーゼＫとRNase Aに統
計学的な有意差が認められた（Ｐ＜０．０５）。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 宮田 雄平 千葉県我孫子市つくし野５−６−５ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA11 BA80 4C087 AA02 AA04 AA05 AA10 BB47 CA20 NA14 ZA01

Claims (4)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 下記の精製工程を行った時に最終フラク
   ションに含有されている、ニューロン生存活性成分：ス
   テップ１において骨格筋をホモジナイズして、２％（ｗ
   ／ｖ）ＮａＣｌ水溶液で抽出し、遠心分離して上澄を採
   取し；ステップ２において、ステップ１で得られた上澄
   に、アセトンを当該アセトンの最終濃度が３０％（ｖ／
   ｖ）となるように加え、遠心分離によって上澄を取り、
   この上澄に、アセトンの最終濃度が５０％（ｖ／ｖ）と
   なるように、アセトンをさらに加え、遠心分離を行って
   沈殿を採取し；ステップ３において、ステップ２で得ら
   れた沈殿物を、５０％（ｗ／ｖ）（ＮＨ₄）₂ＳＯ₄水溶
   液に溶解し、遠心分離し、上澄を採取し；ステップ４に
   おいて、ステップ３で得られた上澄を、等容量のフェノ
   ール：クロロホルム混液（１：１、ｖ／ｖ）と混合し、
   室温にて振とうさせ、遠心分離を行い、水相を採取し；
   ステップ５において、ステップ４で得られた水相を、フ
   ェニールセファロースＣＬ−４Ｂカラムを用いて５０％
   （ＮＨ₄）₂ＳＯ₄含有５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐH７．
   ５）で洗浄し、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ（ｐH７．５）で
   溶出させて流出液を採取し；ステップ６において、ステ
   ップ５で得られた流出液を、Capcell−PakＣ₁₈カラムを
   用いて０−２５％ＣＨ₃ＯＨ（ｐＨ６．５）のグラジュ
   エント溶出を行って、所定間隔でフラクションを区切
   り、最も活性の大きいフラクションを採取し；ステップ
   ７において、ステップ６で得られたフラクションを、Ｄ
   ＥＡＥ−５ＰＷカラムを用いて０−０．５M ＮａＣｌ
   （ｐＨ７．５）のグラジュエント溶出を行って、所定間
   隔でフラクションを区切り、最も活性の大きいフラクシ
   ョンを採取し；ステップ８において、ステップ７で得ら
   れたフラクションを、Capcell−PakＣ ₁₈カラムを用いて
   ５−１９．２５％ＣＨ₃ＣＮ（ｐH６．７５）のグラジュ
   エント溶出を行って、所定間隔でフラクションを区切
   り、最も活性の大きいフラクションを最終フラクション
   として選択する。
2. 【請求項２】 前記のニューロン生存活性成分の少なく
   とも一部が、ＲＮＡまたはＲＮＡの分子構造の一部によ
   り構成されていることを特徴とする、請求項１に記載の
   ニューロン生存活性成分。
3. 【請求項３】 ニューロン生存活性を有する、筋肉組織
   由来のＲＮＡ。
4. 【請求項４】 骨格筋に由来する、請求項３に記載のＲ
   ＮＡ。