JPH03505732A - 移動刺激因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 移動刺激因子 本発明は以下移動刺激因子（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ｓｔｉｍｕｌａｔｉｏｎ　ｆ ａｃｔｏｒ）　（ＭＳ　Ｆ）と称される新規ポリペプチド、それらの製造方法及 び診断及び治療における使用に関する。

各種の線維芽細胞の細胞培養が研究され、胎児及び成人の移動的挙動は相違し、 この相違は“細胞密度移動（ｃｅｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎ） 　（ＣＤＭ）　”　（Ｊ、　Ｃｅ１１．　Ｓｃｉ、、７３．２２１−２３４（１ ９８５））によって定量的に表現できることが示された。本発明者等は胎児の線 維芽細胞及び癌患者の“胎児様”線維芽細胞により分泌され、及びこれらの細胞 の特徴的な移動的挙動を仲介する際に含まれるポリペプチドを特定した。

このポリペプチドは移動刺激因子−１又はＭＳＦ−１と呼称された。

更に研究を行うことによりＭＳＦ−１を分泌し、及び又移動刺激活性を有する細 胞の或もの、しかし総てではない細胞系により分泌される追加的なポリペプチド が解明された。これらは更に移動刺激因子（ＭＳＦ）と呼称された。ＭＳＦは線 維芽細胞による基質の生合成、特にヒアルロン酸（ＨＡ）の生合成に影響を与え る。ＨＡ生合成に及ぼすこの効果は、線維芽細胞の移動に及ぼす従来観察された ＭＳＦの効果と恐らく対応している。又ＭＳＦはヒトの乳房の上皮細胞による蛋 白質合成に影響するとも考えられている。

各種の細胞の移動的活性を促進する他のポリペプチドも文献中に記載されている 。これらは下記に説明されるようにＭＳＦとは異なるものと思われる：　“散乱 因子（Ｓｃａｔｔｅｒ　Ｆａｃｔｏｒ）”　　［Ｍ、ストーカ−（Ｓｔｏｋｅｒ ）及びトクリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）運動因子”　（ＡＭＦ）［Ｌ、リオッタ （Ｌｉｏｔｔａ）等、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＵＳＡ ）、蔓、３３０２−３３０６（１９８６）コは、ＭＳＦ−１を生産することが知 られている胎児様乳癌線維芽細胞が散乱因子の分析で活性を呈しないことが知ら れており、及びＡＭＦは温度安定性、ｐＨ感受性、標的細胞特異性及びアミノ酸 組成においてＭＳＦ−１と相違する点でＭＳＦとは別種である。形質転換成長因 子−β（ＴＦＧ−β）は腫瘍周辺細胞中のＨＡ合成を刺激するが、乳房縮小形成 から得られた対応する正常細胞中のＨＡ合成を阻害し、一方ＭＳＦ−１は成人の 線維芽細胞中のＨＡ合成を刺激する。ＨＡ刺激因子（ＨＡＳＦ）は胎児の線維芽 細胞により生産されるが、成人の線維芽細胞により生産されず、しかしＭＳＦ− １が陽イオン性であるが、ＨＡＳＦが陰イオン性である点でＭＳＦ−１と異なっ ている。

従って、本発明における一つの態様によれば、移動刺激因子が提供される。

ＭＳＦ−１はポリアクリルアミドゲル電気泳動によれば、７０ｋＤの分子量を有 するポリペプチドであり、溶液中で下記の性質を有する：処狸　　　　　　　安 定性の諾否 ５６℃に加熱　　　　　否 １００℃に加熱　　　　否 トリプシン　　　　　　否 ｐＨ２諾 ｐＨ１０否 アルキル化／ 還元　　　　　　　　否 ＭＳＦ−１は１０％飽和の硫酸アンモニウムにより沈澱し、ヘバリンアフィニテ ィ　カラムに結合し、０．３及び０．６Ｍ塩化ナトリウムで溶離する。ＭＳＦ− １はＡｌａ−Ｐｒｏ−１ｉｅ−ＰｒｏのＮ−末端配列を有すると考えられる。

胎児及び乳癌線維芽細胞由来のＭＳＦ−１のアミノ酸組成は下記のように分析さ れた： １００当たりの残基 ア　ミ　ノ　酸　　　胎児ＭＳＦ−１患者ＭＳ　Ｆ−１ａｓｐ＋ａｓｎ　　　　 　　　　９．０　　　　　　　　９．７ｆ　Ｉｕ十ｇＩｎ　　　　　　　１２． ８　　　　　　１４．２ｓｅｒ　　　　　　　　　　　　８．０　　　　　　　 　８．５ｇ１Ｖ　　　　　　　　　　　２４．４　　　　　　　１９．８ｈｉｓ 　　　　　　　　　　　　１．６　　　　　　　　２．０ａ　ｒ　ｇ　　　　　 　　　　　　　４．１　　　　　　　　４．２ｔ　ｈ　ｒ　　　　　　　　　　 　　４．４　　　　　　　　４．７ａｈａ　　　　　　　　１０．５　　　　１ ０．０ｐ　ｒ　ｏ　　　　　　　　　　　　２．２　　　　　　　　２．６ｔ　 ｙ　ｒ　　　　　　　　　　　　１．４　　　　　　　　１．４ｖａｌ　　　　 　　　　　　　　４．８　　　　　　　　５．０ｍｅｔ　　　　　　　　　　　 　−− １１ｅ　　　　　　　　　　　　３．１　　　　　　　　３．２］　ｅ　ｕ　　 　　　　　　　　　　５．１　　　　　　　　５．２ｐｈｅ　　　　　　　　　 　　　３．１　　　　　　　　２．８Ｉｙｓ　　　　　　　　　　　　３．９　 　　　　　　　４．５システイン酸　　　　　　　　２．２　　　　　　　　２ ．４Ｍ５Ｆ−１は陽イオン性である、従って陰イオン交換樹脂とは結合しない。

そ打は陽イオン交換樹脂と結合し、そこから０．３Ｍ塩化ナトリウム溶液を用い て溶離できる。

ＭＳＦ−２及びＭＳＦ−３は陰イオン性であり、陰イオン交換樹脂から０．３又 は３．０塩化ナトリウムで溶離される：それらは陽イオン交換引脂には結合せず 、１０ないし２０又は２０ないし３０％飽和硫酸アンモニウムで溶液から沈澱す る。

従って本発明は更に、それ自身はポリペプチドを生産しない正常な成人の線維芽 細胞、特にゲル濾過により５Ｏ−７０ｋＤの範囲の見掛けの分子量を有し、且つ 上記のような溶液的性質を有する、成人の皮膚線維芽細胞の移動を刺激すること ができるポリペプチドを提供する。本ポリペプチドは適当に条件付は培地（ｃｏ ｎｄｉｔｉｏｎｅｄ　ａ＋ｅｄｉｕｍ）の精製により又は合成又は組換えＤＮＡ 技術により得ることができる。それらは移動刺激活性が保存されていれば、事実 上ＭＳＦ、そのフラグメント又はＭＳＦの同族体又はそのフラグメントと同一で ある。かような活性は下記に記載する技術により直ちに分析できる。

別な態様によれば、本発明は更に（ａ）好適には生理学的ｐＨ及び塩濃度におけ る、随時緩衝剤、血清、栄養分及び／又は細胞培地の他の成分の存在における溶 液中の前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチド、及び（ｂ）純粋な固体 形における又は事実上血清、及び／又は細胞培地の成分を含まない溶液中におけ る前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを提供する。特に好適な態様 において、本発明は均一な形態の前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチ ドを提供する。

本発明の最も好適な具体化はＭＳＦ−１，である。

本発明は更にヒト又は動物の治療の方法又はヒト又は動物体について行われる診 断の方法において使用するための前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチ ドを提供する。前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドは、診断及び癌 の治療において及び創傷の治癒、及び線維芽細胞移動、増殖、生合成活性及び他 の細胞種、特に上皮細胞と相互作用する能力の変調を含む他の疾患において有益 性を与える。

本発明は更に前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを希釈剤又はその キャリヤーと共に、及び随意更に安定剤、酸化防止剤、抗細菌剤及び／又は抗黴 剤のような抗生物質、緩衝剤、塩等を含有して成る製薬学的組成物を提供する。

本発明は更に前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドの無毒的な有効量 を、それらを必要とする患者に投与することを含んで成るヒト又は動物体の治療 方法を提供する。

投与は任意の適当な径路によることができ、且つ該径路により及び例えば線維芽 細胞の移動又は線維芽細胞生合成活性の変調に及ぼす所望の効果を達成するのに 充分な量で投与するのに適当した、任意の製薬学的に許容し得る形態で投与を行 うことができる。

本発明は更に治療によるヒト又は動物体の処置の方法、又はヒト又は動物体につ いて行われる診断方法において使用するための薬剤の製造における、前記に規定 されたようなＭＳＦ又はポリペプチドの使用を提供する。

本発明は更にＭＳＦを分泌しないＭＳＦ感受性細胞、好適には成人の線維芽細胞 を、前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを含むと思われる試料と接 触させることを含んで成る試験方法又は分析方法を提供する。例えば培養基又は 全血又は血清のような体液の試料中の前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペ プチドの存在及び／又は濃度は、例えば細胞の移動的挙動を観察することにより （好適にはそれらのＣＤＭＴの測定により）及び随意それらの挙動を標準と比較 することにより検出及び／又は測定される。ＭＳＦ感受性細胞は好適には正常な 成人の皮膚の線維芽細胞であり、好適には３次元的コラーゲンマトリックス上の 集密培養の形態にあるものである。試料は分別され、細胞の応答を最適化するよ うにＭＳＦ又はポリペプチドの濃度を調節するために希釈又は濃縮することがで きる。好適には試験又は分析は溶液例えば緩衝液中で行われ、及び最も好適には 溶液が約１０ｎｇ／ｍ１のＭＳＦ又はポリペプチドの濃度を有する。

この試験又は分析方法の一つの態様において、試料は細胞培養液又はその部分的 に精製された前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドの溶液のような画 分てあり、試験又は分析は細胞が前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチ ドを生産できるか否か（及び従ってそれらがこの特殊な性質に関して“胎児様（ ｆｏｅｔａｌ　−１ｉｋｅ）”であるか否か：組織試料中のかような変態的線維 芽細胞は癌の増殖の疑いの濃いことを示唆するものであろう）測定するために行 われる。この方法は細胞培養液から前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプ チドを得るための精製工程の一部として又はＭＳＦ又はポリペプチドを含む画分 を同定するためにも使用することができる。

この試験又は分析方法の第二の態様において、試料は血清のような体液であり、 分析は癌の診断又は予後への補助として行われる：例えば前記に規定されたよう なＭＳＦ又はポリペプチドが高水準で循環していれば、癌の発生又は既に癌を持 つ個体における疾患の予後の危険が大きいことに関連する可能性がある。

試験又は分析方法の第三の態様において、試料は癌患者から、又は乳癌のような 癌の危険があると思われる個体から得た線維芽細胞を培養することによって調製 された条件付は培地であることができ、及び試験及び分析は診断又は予後への補 助として行われることができる。

前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドは慣用の免疫技術により抗体を 作り出すために使用することができる。抗体（多クローン性又は単クローン性） は更に本発明の一つの態様である。それらは培地又は体液のような試料中のＭＳ Ｆ又はポリペプチドを検出するためのラジオイムノアッセイ（ＲＩ　Ａ）又はエ ンザイムーリンクトイムノンルベントアッセイ（ＥＬＩ　ＳＡ）技術のような試 験又は分析技術において使用される。

本発明は更に前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを製造する方法を 提供し、該方法は胎児の線維芽細胞、癌患者の胎児様線維芽細胞又は適当な培地 中でＭＳＦを発現することができる口腔粘膜線維芽細胞のような正常な成人中に 見出される他のＭＳＦ分泌線維芽細胞を培養し、及びこうして生産された条件付 は培地を回収することを含んで成る方法である。成人の皮膚の線維芽細胞はＭＳ Ｆを分泌しないが、口腔粘膜線維芽細胞は分泌するように見え、口腔粘膜中の傷 の修復の胎児様方式と一致する。好適には本方法は更にゲル濾過及び／又は逆相 クロマトグラフィー及び／又は追加的な慣用の精製段階を含む。

条件付は培地から前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを精製するた めには、前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを含む両分を同定する ためのバイオアッセイ又は他の分析技術を確立することが必要である。適当なバ イオアッセイ技術は、前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドの存在に 高度に感受性であるＦ　Ｓ　Ｆ　３７細胞又は任意の他の線維芽細胞を用いる下 記の実施例１に記載される方法である。高度に感受性である細胞は、前記に規定 されたようなＭＳＦ又はポリペプチドを含む胎児又は形質変換された線維芽細胞 条件付は培地を用いて線維芽細胞又は線維芽細胞の細胞系列をスクリーニングし 、及び移動的挙動の増大の見地から、充分に高い又は最も高い応答を示す細胞又 は細胞系列を選択することにより同定することができる。

本発明は更に線維芽細胞を前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドと接 触させることを含んで成る、線維芽細胞の移動を増大する方法を提供する。更に 本発明の態様において；前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドに対す る抗体；前記に規定されたようなＭＳＦ又はポリペプチドをコード化するＲＮＡ 及びＤＮＡフラグメント：調節ＤＮＡ配列及び前記に規定されたようなＭＳＦ又 はポリペプチドをコード化するＤＮＡを含む遺伝子；前記に規定されたようなり ＮＡ又は遺伝子を含むクローン化及び／又は表現ベクター；かようなりローン化 及び／又は表現ベクターで形質転換された細胞及び前記に規定されたようなＲＮ Ａ又はＤＮＡフラグメント又は遺伝子を検出するための核酸プローブ：が提供さ れる。

本発明は更に下記の本発明を限定するものではない実施例により、及び添付図面 を参照しながら例示される：図１＝高密度及び低密度の細胞密度で平板培養され た正常な成人、胎児及び乳癌患者（Ｂ　Ｓ　Ｆ）の皮膚の線維芽細胞の移動値の 散布図。

図２＝高密度で平板培養された包皮線維芽細胞標的系統（ＢＳＦ３７）の移動に 及ぼす胎児（〇−〇）及びＢＳＦ　（・−・）条件付は培地の効果に関する投与 一応答データ。

より分別し、次いで集められた試料をＦＳＦ３７標的細胞の移動を刺激する能力 について試験した。標準的な移動分析のように、ＦｓＦ３７ｃＭ画分は５％血清 を含む培地中で２５％の最終濃度で試験された。最初の棒線（“Ｃ”と標識）は ＳＦ−ＭＥＭをＦＳ６ＣＭＳ２Ｏ代わりに使用した対照培地中で達成されたＦＳ Ｆ３７の移動水準である。

」：胎児（ＦＳ６）及び包皮（ＦＳＦ３７）線維芽細胞の増殖に及ぼす胎児及び ＢＳＦ　　ＣＭの効果。細胞は３５ｍｍの組織培養皿中に一皿当たり２Ｘ１０’ 細胞を用い、５％の血清を含む培地中で（Ｘ−Ｘ）、又は２５％の胎児（０−０ ）又はＢＳＦ　（・−・）ＣＭを補充して培養された。胎児線維芽細胞は成人の 細胞密度（１，４Ｘ１０りよりも高いプラトー細胞密度（４，９Ｘ１０’）に達 した。胎児又はＢＳＦ　ＣＭのいずれも細胞の増殖に影響しなかった。

実施例　１ 本発明者等は前に（ａ）３次元的コラーゲンマトリックス中への胎児及び成人線 維芽細胞の移動は細胞密度により異なる影響を受けること、及び（ｂ）癌患者か らの皮膚の線維芽細胞は共通的に胎児様の移動的挙動を呈することを報告した。

ここで提示したデータはこれらの細胞種における移動の差異は高密度で（即ち細 胞集密で）培養された培地中で特に明らかであり、これらの条件下で胎児の線維 芽細胞と癌患者の胎児様の線維芽細胞は、正常な成人の細胞よりも著しく広範囲 に３次元コラーゲンマトリックス中に移動する。これらの観察結果の生化学的基 礎に関するこの初期の研究において、胎児又は癌患者の線維芽細胞により条件付 けた培地は集密した成人細胞の移動を刺激することが報告された。この移動の刺 激は、集密していない成人の線維芽細胞の移動がこれらの条件付は培地により影 響されないので、集密細胞に特異的である。胎児線維芽細胞条件付は培地のゲル 濾過クロマトグラフィーは、移動刺激活性が５Ｏ−６０ｋＤの範囲の見掛は分子 量を持った単一ピークとして回収されることを示している。胎児及び癌患者の双 方の線維芽細胞条件付は培地中の活性移動刺激因子（ＭＳＦ）は酸性のｐＨで安 定であるが、熱、アルカリ性ｐＨ及び還元的アルキル化により不活性化される蛋 白質であるように思われる。胎児及び癌患者線維芽細胞により生産されるＭＳＦ は、集密培養中のこれらの細胞により示される特徴的に高い水準に恐ら（関連が あり、それによりこの因子の作用のオートタリン（ａｕｔｏｃｒｉｎｅ）様式を 示唆するものであろう。ＭＳＦによる成人細胞の移動の刺激は血清、又は血小板 が少ない血漿のいずれかの存在を必要とし、血清を含まない培地中では観察され ない。ＭＳＦは試験されたいずれの培養条件下でも、正常な成人の細胞の増殖又 は形態のいずれにも影響しないように見える。

線維芽細胞は広範に組織内に分布し、比較的容易に培養できるにも拘らず、線維 芽細胞は生体外では共通的に紡錘形のような非特異的な属性を有するものとして 余り明確に定義されていない細胞群である。最近の研究結果によれば、線維芽細 胞は増殖、成長因子に対する応答及び基質（ｍａｔｒｉｘ）生合成のような細胞 挙動の基本的な側面において、発育及び部位特異的な相違の両面を呈する事実上 極めて異質性の細胞系であるという事実を強調する証拠が挙げられている（ショ ー［５ｃｈｏｒ］及びショー、１９８７ａ）。この線維芽細胞表現型の異質性は 、隣接する上皮との誘導的な相互作用をも含めて、結合組織の正常な機能に対し 恐らく基本的に重要である。

皮膚の線維芽細胞をｌ型コラーゲン繊維の三次元ゲルの表面に平面培養すると、 それらは２４時間以内に下方のゲルマトリックス中に下がって移動し始める。こ の線維芽細胞の移動的挙動（即ち、ゲル表面から内部への）の態様は、ゲル表面 の細胞密度を含めて多数の実験的パラメーターによって影響される（ショー等、 １９８２）。細胞密度の線維芽細胞移動への影響は我々により“細胞密度移動指 数（ｃｅｌｌ　ｄｅｎｓｉｔｙ　ｍｉｇｒａｔｉｏｎｉｎｄｅｘ）”又は“（Ｃ ＤＭＩ）”として定義された（ショー等、１９８５ａ）関数により定量的に表現 することができる。この実験的アプローチを用いて、我々は以前に （ａ）胎児及び正常な成人の皮膚線維芽細胞はそれらが表現する明確なＣＤＭＩ 値を基礎として区別することができる（ショー等、１９８５ａ）及び（ｂ）癌患 者からの見掛は上正常な皮膚線維芽細胞は共通的に胎児範囲内に入るＣＤＭＩ値 を表現する（ダーニング［Ｄｕｒｎｉｎｇ］等、１９８４：ショー等、１９８５ ｂ、ショー、等１９８６：ハギー［ＩＴａｇｇｉｅコ等、１９８７）　：と−を 報告した。これらの発見を基礎として我々は成人中の胎児様線維芽細胞の存続に より起こる正常な上皮−間葉相互作用における機能障害が、癌の発生に対する嫌 疑の増大をもたらすことを示唆する仮説を提出（ショー等、１９８７）　した。

ＣＤＭＩは特に移動に対する細胞密度の効果の目安である。この細胞密度により 異なる効果は、（ａ）ゲル中のコラーゲン繊維の配向及び／又は充填密度におけ る細胞誘発性変調（グリネル［Ｇｒｉｎｎｅｌ］及びラムヶ［Ｌａｍｋｅ］　、 　１９８４）、（ｂ）細胞移動に影響することが知られている特異的な基質巨大 分子（例えばフィブリネクチン）の沈着における密度依存的な変化（モートナー ［Ｍａｕｔｎｅｒコ及びハインズ［Ｈｙｎｅｓ］、１９７７：ショー等、１９８ １）、（ｃ）細胞間の集団的相互作用（アバ−クロンビー、１９７０）、及び（ ｃｌ）移動刺激性又は阻害性の可溶性因子の分泌、を含む多数の機構によって仲 介されることができる。これらの差異の可能性は最近の綜説に論じられている（ ショー及びショー、１９８７ｂ）。

本研究の目的は胎児、正常な成人及び癌患者の皮膚の線維芽細胞により示される ＣＤＭＩ値の相違の生化学的基礎に関してとり多くを学び取ることである。我々 のデータは胎児の線維芽細胞及び癌患者の胎児様線維芽細胞が正常な成人細胞に より生産さねないオートリリン移動刺激因子を分泌することを示唆している。

細胞系統はハム（ＪＩａｍＸ１９８０）により記載されたような体外移植組織培 養から得られた。ＦＳＦ３７細胞を６オの子供の包皮生検材料から誘導した。こ の研究で使用された正常な成人及び胎児線維芽細胞に関する詳細なデータはショ ー等（１９８５ａ）に記載されている；乳癌の患者の皮膚の線維芽細胞に関する 類似のデータはバギー等（１’１８７）により示されている。

皮膚線維芽細胞の原料培養は、９０ｍｍのプラスチック製組織皿中の１５％の無 菌的の新生児子牛血清、グルタミン、非必須アミノ酸、ピルビン酸ナトリウム、 ペニシリン及びストレプトマイシンを補給したＭＥＭ１成長培地（ギボーバイオ カルト［Ｇｉｂｏ−ＢｉｏＣｕｌｔ］、スコツトランド）中で成長した（ショー 及びコート［Ｃｏｕｒｔ］、１９７９）。培養は集密が達成された時、週に約一 度１：５の分離比で継代培養した。

指示されたような牛血漿及び血清はボーゲル（Ｖｏｇｅｌ）等（１９７８）によ り記載されたように調製した。

条件付は培地の捕集及び処理 集密した原料培養を血清を含まない成長培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で５回洗浄し、次 いで湿潤したガスを供給されたインキュベーター中で３７℃で７２時間５ｍｌの ＳＦ−ＭＥＭを用いてインキュベートした。得られる条件付は培地（ＣＭ）を集 めて領２２μのミリボア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）濾過器を通して細胞の残骸を除 去して、必要時まで７０℃で貯蔵した。

指示されたようなＣＭの試料は下記のように処理された：（ａ）漫ｆｒ：１００ ｘ容のＳＦ−ＭＥＭに対し４℃で２４時間；　（ｂ）トリプシン処理：カルシウ ム及びマグネシウムを含まないダルベツコ（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ）の燐酸塩緩衝食 塩水（ＰＢＳ）中に２．５％の結晶性トリプシン（シグマ・ケミカル社［Ｓｉｇ ｍａ　Ｃｈｅｍｉｃａｌ　Ｃｏ、　：ｌ製、Ｔ−０１３４）溶液を加えてトリプ シンの最終濃度を０．２５％とした；３７℃で１０分間インキュベート後、大豆 トリプシン阻害剤（シグマ・ケミカル社製、Ｔ−９００３）を添加してトリプシ ンを不活性化した；　（Ｃ）加熱処理＝６０℃又は１００℃に１０分間、（ｄ） ｐＨ安定化：ｌＮＨＣｌでｐＨ２又はｌＮＮａＯＨでｐＨ１０とし、４℃で６０ 分間インキュベートし、次いでｐＨ７，２に再調整した；　（ｅ）還元的アルキ ル化：室温で２４時間２０ｍＭのメルカプトエタノールでＣＭを処理し、次いで ヨード酢酸（１８μｇ／ｍｌ）を添加し、４０℃で１時間インキュベートした； 次いで固体状トリス−塩基でｐＨを７．５に再調整し、処理された試料をＳＦ− ＭＥＭに対し２４時間透析した。

ＹＭ５膜（分子量５０００　ｋ’　Ｄカットオフ）を備えたアミ：］　ン（Ａｍ ｉｃｏｎ）濾過セルを用いて、胎児線維芽細ＩＩ＠　（ＦＳ６）０Ｍ試料を１０ 倍に濃縮した。ファルマシア（Ｆａｒｍａｃｊ　ａ）高速蛋白質液体クロマトグ ラフィー装置（ＦＰＬｃＩｆｆｉ）を用いるゲル濾過クロマトグラフィーにより 生の又は濃縮ＣＭを分別した。２００μｌのＣＭをスパロース（Ｓｕｐｅｒｏｓ ｅ）　１２カラムにかけ、０．１２ＭのＮａＣ１を含む２０ｍＭのトリス緩衝液 （ｐ　ｌ−１７，４）中で０．３ｍ］／分の流速で分別した。１ｍｌの両分を集 め、次いで４℃で４８時間ＳＦ−ＭＥＭに対して透析した。分子量標準の混合物 （Ｂ−アミラーゼ、２００ｋＤ　、アルコールデヒドロゲナーゼ、１５０ｋＤ： 牛血清アルブミン、６６ｋＤ；炭酸デヒドラターゼ、２９ｋＤ；シトクロムＣ， １２，４ｋＤ）を流してカラムを校正した。

細胞成長及び移動分析 細胞増殖は以前に記載（ショー、１９８０）のようにして測定した。３５ｍｍの プラスチック製組織培養皿上に成長した細胞を、２ｍＭのエチレングリコール− ビス（ｂ−アミノエチルエーテル）−Ｎ、Ｎ’−テトラ酢酸（ＥＧＴＡ）を含む ＰＢＳ中で０．０５％のトリプシンで処理することにより、単細胞懸濁物とした 。細胞数はコールタ−（Ｃｏｕｌｔｅｒ）電子粒子計数機で測定した。

Ｉ型コラーゲンをラットの尾の虜から３％の酢酸中に抽出し、蒸留水に対し三日 間透析し、前記（ショー及びコート、１９７９）のような３５ｍｍプラスチック 製組織培養皿中の２ｍｌのコラーゲンゲルをつくるために使用した。移動分析の ために、コラーゲンゲルをＳＦ　　ＭＥＭ又はＣＭのいずれかで覆った。原料培 養中で成長する線維芽細胞をトリプシン処理し、２０％の血清を含む成長培地中 に再懸濁した。次いでこの細胞懸濁液を用いて二種の平面培養用接種材料（夫々 、高及び低密度）を調製した。高密度接種材料中の細胞数は、平面培養用材料１ ｍｌがゲル表面上に２．５Ｘ１０’細胞／ｃｍ”を与えるように調節された：低 密度接種材料中の細胞数は、同様に１０３細胞／ｃｍ”を与えるように調節され た。線維芽細胞をつけると、平面培養後２時間以内にゲル表面上に一杯に広がっ た；低密度培養中の細胞はゲル上に殆ど分布しなかったが、高密度培養中の細胞 は拡散後直ちに集密な層を形成した。水和コラーゲンの容積は２ｍｌであるから 、この方法は標準移動分析中に５％血清及び２５％ＣＭの最終濃度を与える。繰 り返して高及び低密度培養を四日間インキュベートし、ゲル表面上及び三次元コ ラーゲンマトリックス中の細胞数を位相差光学系を用いる生体培養の顕微鏡的観 察により測定（ショー、１９８０）　した。データをゲルマトリックス中に見出 された細胞のパーセントとして表現した。夫々低密度及び高密度で平面培養され た細胞の各パーセント点を測定すると最低１００及び１５００の細胞が計数され “細胞密度移動指数”又はＣＤＭＩ”は線維芽細胞移動に及ぼす細胞密度の効果 を定量的に表現するために使用することができる（ショー等、１９８５ａ）。Ｃ ＤＭＩは下記のように定義される：ＣＤＭＩ＝ｌｏｇ　Ｃ移動低密度／移動高密 度］上式で“移動低密度（ｍｉｇｒａｔｉｏｎ　ＩＯＷ　ｄｅｎｓｉｔｙ）”は 低密度培養におけるゲルマトリックス内の細胞の％であり、゛移動高密度（ｍｉ ｇｒａｔｉｏｎ　ｈｉｇｈｄｅｎｓｉｔｙ）”は高密度培養の場合の対応する値 である。正常な成人、包皮、胎児及び明白に形質転換した細胞系統の特性を表す 多数のウェルを用いて得られた結果を基礎として、我々は以前に四つの範囲のＣ ＤＭＩ値を定義した（ショー等、１９８５ａ）　　；即ち、−領４よりも小さい ＣＤＭＴ値を有する形質転換範囲（Ｔ）　、−０，４ないしＯの間のＣＤＭＩ値 を有する形質転換／胎児範囲（Ｔ／Ｆ）　、０ないし＋０．４の間の値を有する 胎児／正常範囲（Ｆ／Ｎ）及び十０．４より大きいＣＤＭＩ値を有する正常範囲 （Ｎ）である。これらの四つの範囲は、正常な成人及び包皮の９０％以上がＮ範 囲に入るＣＤＭＩ値を有するが、胎児細胞の９０％以上がＦ／Ｎ及びＴ／Ｆ範囲 のＣＤＭＩを有するように、経験的に誘導された。本報告においては分かり易く するために、Ｎ範囲は新たにＡ（正常な成人［ａｄｕｌｔ］として）と再命名さ れ、一方Ｔ／Ｆ及びＦ／Ｎ範囲は一括してＦ（胎児［ｆｅｔａｌ］として）範囲 と称される。

杭愚 成人、胎児及び乳癌患者の皮膚の線維芽細胞の移動に及ぼす細胞密度の区別的効 果 線維芽細胞を１０３細胞／ａｍ２（低密度）及び２．５Ｘ１０’細胞／ｃｍ２（ 高密度）の割合でコラーゲンゲル基質上で平面培養し、次いで細胞のゲル中への 移動を原料及び方法の項に記載したように測定した。

４０系統の成人の皮膚の線維芽細胞、２６系統の胎児の皮膚の線維芽細胞及び１ ５系統の乳癌患者の皮膚の線維芽細胞（Ｂ　Ｓ　Ｆ）を用いて得られたデータが 図１に示しである。成人の皮膚の線維芽細胞は、低密度培養のゲル内では２４． ６％細胞の中位値（ｏ＋ｅｄｉａｎ　ｖａｌｕｅ）を有し、高密度培養中では５ ．９％を有し、細胞密度に逆比例している。対照的に、胎児細胞の移動は低密度 及び高密度培養において夫々１６．５％及び１５゜８％の中位値を有し、細胞密 度に顕著に影響されなかった。ＢＳＦＩＢ胞の場合の対応するデータは、２５． ３％（低密度培養）及び１３．２％（高密度培養）の中位値を与えた。これらの 結果は高密度培養における胎児及びＢＳＦ線維芽細胞は正常な成人の細胞よりも 著しく大きい範囲にまで移動する（両方ともスチューデント式テストでｐ＜０． ００１）ことを示している。

個々の細胞系統のＣＤＭＩ値がこれらの結果から計算された。成人の線維芽細胞 系統の３６／４０　（９０％）はＡ範囲に入るＣＤＭＩ値を与え、胎児の線維芽 細胞の２４／２６　（９２％）はＦ範囲に入り、及びＢＳＦ細胞の１３／１５　 （８７％）はＦ範囲に入った。

細胞移動に及ぼす条件付は培地の効果 成人、胎児及びＢＳＦ線維芽細胞の特徴的な移動的挙動の測定において、細胞が 生産した可溶性因子の掛わり合いの可能性が下記のようにして研究された。包皮 （ＦＳＦ３７）及び胎児（ＦＳ５６）線維芽細胞が、最終濃度５％の血清を含み 、包皮、胎児又はＢＳＦ皮膚線維芽細胞からの２５％の条件付は培地を有し、又 は有しない成長培地中で、高又は低密度の両方で複製コラーゲンゲル上で平面培 養された。四日間のインキュベート後、コラーゲンマトリックス内に存在する細 胞の％を測定した。

以前の研究（ショー等、１９８５ａ）で示されたデータは、包皮線維芽細胞（２ ないし８才の範囲の年令の供与者から得られた）はコラーゲンゲル上の移動的挙 動の点で正常の成人細胞（各種の解剖的部位から得られた、男女両方の）と区別 できないことを示した。表１から分かるように、ＦＳＦ３７包皮線維芽細胞はＣ Ｍの不存在下にインキュベートした対照培養において、細胞密度に対する特徴的 に成人様移動的応答を呈する：これらの条件下で高密度培養においては僅か２． ０％がゲルマトリックス内にあったのに対し、低密度培養においては細胞の２０ ．８％がゲルマトリックス内にあり、得られたＣＤＭＩは＋１．０２（Ａ範囲） であった。

胎児のＣＭの存在は、低密度培養においてはＦＳＦ３７細胞の移動に及ぼす効果 が顕著ではない（１８，６％）が、高密度培養における移動には約６倍の刺激（ １２，７％）をもたらした；これらの細胞は今度は特徴的な胎児様移動方式を示 し、ＣＤＭＩの計算値は＋０．１６（Ｆ範囲）成人（ＦＳＦ３７）　　無し　　 ２０．８　　２．０　　　＋１．０２　（Ａ）ＦＳ６　　　１８．６　１２．７ 　　　＋０．１６（Ｆ）ＦＳＦ３７　２７．８　　３．９　　　＋１．１４（Ａ ）ＢＳＦＩＩ　　１９．７　１３．６　　　＋０．１５　（Ｆ）胎児（Ｆ　Ｓ　 ６）　　　無し　　　１５．３　１４．８　　　＋０．０１（Ｆ）ＦＳ６　　　 １１．１　１０．５　　　＋０．０２（Ｆ）ＦＳＦ３７　１５．９　１２．６　 　　＋０．１０　（Ｆ）ＢＳＦＩＩ　　１４．８　１５．０　−０．０１　（Ｆ ）条件付は培地（ＣＭ）は血清を含まない成長培地中に種々の線維芽細胞系統の 集密培養を三日間インキュベートすることにより調製された。移動分析は５％血 清及び２５％のＣＭの存在下で行われた。高及び低密度培養で得られた移動デー タは夫々のＣＤＭＩ値を計算するのに使用された：Ａ＝正常な成人範囲及びＦ＝ 胎児範囲。

ＢＳＦＣＭはＦＳＦ３７ＣＭの移動に対し胎児のＣＭと類似の効果を有し、低及 び高密度培養におけるゲルマトリックス中で夫々１９．７％及び１３．９％の細 胞値を与えた（計算されたＣＤＭＩ値はＦ範囲の十０．１５であった）。ＦＳＦ ３７ＣＭの存在は低及び高細胞密度のいずれにおいてもＦＳＦ３７細胞の移動に は効果がなかった。

反復実験において、ＦＳ６胎児線維芽細胞は総ての培養条件下で特徴的な胎児様 移動的挙動を呈した。試験されたＣＭのいずれも低及び高細胞密度において細胞 移動に顕著な影響を持たなかった。ＦＳＦ３７線維芽細胞ＣＭは高密度培養にお いて胎児線維芽細胞の移動を示さなかったことに留意すべきである。低及び高細 胞密度の両方でのＢＳＦ細胞の移動は同様に試験された総てのＣＭにより同様に 影響を受けなかった。

高密度細胞におけるＦＳＦ３７細胞の移動に及ぼす多数の他の成人、胎児及びＢ ＳＦ皮膚線維芽細胞系統により生産されたＣＭの効果は表２に示されている。成 人のＣＭはいずれも細胞の移動に影響を示さなかつた。対照的に、総ての胎児及 びＢＳＦ系統は顕著な移動の刺激を誘発した。これらのＣＭのいずれも低密度培 養において既に高水準にあるＦＳＦ３７細胞の移動には影響しなかった。

表２　：ＦＳＦ３７細胞の移動に及ぼす（ａ）対照　　　　　　　　　２．２　 　　　　　　５．９ＣＭ無し くｂ）胎児 ＦＳ６　　　　　　　１３．１　　　　　　５．９ＦＳ２　　　　　　　１２． ９　　　　　　５．８ＦＳ８　　　　　　　１５．９　　　　　　７．２ＦＳ１ ３　　　　　　１．３．４　　　　　　６．０ＦＳＩ０　　　　、　　１７．９ 　　　　　　８．１ＦＳ１２　　　　　　　９．２　　　　　　４．２平均＝６ ．２＋／−１，３ （ｃ）成人 ＦＳＦ３７　　　　　　１．２　　　　　　０．６ＦＳＦ３６　　　　　　２． １　　　　　　０．９ＮＳＦ２８　　　　　　２．９　　　　　　１．３ＮＳＦ ３０　　　　　　２．４　　　　　　１．１ＮＳＦＩＩＩ　　　　　　２．２　 　　　　　１．０ＮＳＦ１３０　　　　　２．Ｌ　　　　　　　１．１平均＝１ ．０＋／−０，２ （ｄ）乳癌患者 ＢＳＦ７　　　　　　　８．７　　　　　　３．９ＢＳＦＩＩＰＳ　　　１２． ６　　　　　　”５．７ＢＳＦ３０　　　　　１０．１　　　　　　４．６ＢＳ Ｆ、３１　　ＳＥ　　　１０．７−　　　　　４．８ＮＳＦ３７　　ＥＷＴ　　 　６．７　　　　　　３．１平均＝４．４＋／−１，０ 高密度培養における標的包皮線維芽細抱系統（ＦＳＦ３７）の移動に及ぼす種々 の胎児、正常な成人及び乳癌患者の皮膚の線維芽細胞により生産された条件付は 培地の効果に関するデータが示されている。各群の線維芽細胞（胎児、成人及び 乳癌患者）に対する平均＋／−５Ｄも示され上記の結果は胎児及びＢＳＦ皮膚線 維芽細胞は高密度培養における成人の線維芽細胞の移動を刺激するが、低密度培 養における細胞の移動には効果を持たない、可溶性因子を生産することを示唆す る。胎児及びＢＳＦＣＭ中の活性移動刺激因子（ＭＳＦ）の初期特性に関するデ ータが表３に示されている。胎児及びＢＳＦＣＭを各種の処理に暴露し、次いで 高密度培養におけるＦＳＦ３７線維芽細胞の移動を刺激する能力について試験し た。その結果は、胎児及びＢＳＦ　ＣＭにおける移動刺激因子は非透析性であり 、酸−安定性であり、熱、トリプシン、ｐＨ１０への暴露及びアルキル化還元に より不活性化されないことを示している。これらのデータはＭＳＦがその活性に 必要なジスルフィド結合を含む蛋白質であることに合致している。低密度培養に おけるＦＳＦ３７細胞の移動は、上記の方法のいずれにより処理されたＣＭによ っても影響を受けなかった。

胎児及びＢＳＦＣＭによるＦＳＦ３７線維芽細胞の移動の刺激に関する投与量一 応答データが図２に示されている。１−２５％の間ではＣＭ濃度に対するほぼ直 線的な応答が存在したが、その点の後は刺激の平坦な水準が達成された。胎児及 びＢＳＦ　ＣＭの双方により同一の結果が得られた。ＦＳＦ３７移動の最大刺激 （１３，３％）は高密度培養における胎児及びＢＳＦ細胞自体により示される範 囲内（図１参照）である。

表３：各種の処理に対する胎児ＢＳＦ　ＣＭの感受性胎児ＣＭ　　　　　　　　 ＢＳＦ　ＣＭ低　密度　　　高　密度　　　高　密享（ａ）対照　′ （即ち、ＣＭ無し）　　２３．７　　　　　１．７　　　、　　　１．７（ｂ） 処理 無し　　　　　　　２２．７　　　　１３．３　　　　１２．６５６℃　　　　 　　２１．８　　　　４．８　　　　３．３１００℃　　　　　２２．８　　　 　１．７　　　　１．５トリプシン　　　　２０．６　　　　０．５　　　　３ ．０透析　　　　　　　２５．１　　　　１２．４　　　　１０．２ｐＨ２１９ ，７８，６１６，６ ｐＨ１０２２，２１，９、５，５ アルキル化／　　　　２４．．８　　　　　２．９　　　　　３．２還元 胎児（ＦＳ６）及び乳癌患者（ＢＳＦＩＩ）の線維芽細胞から得られたＣＭを表 中に示された各種の処理に暴露し、標的細胞系統としてＦＳＦ線維芽細胞を用い る標準的移動分析に使用した。胎児ＣＭの効果は高及び低移植密度の双方で確認 されたが、ＢＳＦＣＭは高密度暴露中でのみ試験された。

胎児線維芽細胞ＣＭのゲル濾過クロマトグラフィーいて記載されたようにゲル濾 過クロマトグラフィーにより分別した。次いで個々の両分について、標準的分析 法における高密度で平面培養されたＦＳＦ３７線維芽細胞の移動を刺激する能力 の試験を行った。図３に見られるように、５Ｏ−６０ｋＤの範囲の見掛けの分子 量に対応する画分１１及び１２中に移動刺激活性の単一なピークが回収された。

１０倍濃縮されたＦＳ６　ＣＭの画分についても同一の結果が得られた（データ は示していない）。

線維芽細胞の増殖に及ぼす胎児及びＢＳＦＣＭの効果胎児（ＦＳ６）及び成人（ ＦＳＦ３７）線維芽細胞の増殖に及ぼす胎児及びＢＳＦ　ＣＭの効果が図４に示 されている。細胞は５％の血清及び２５％の指示されたＣＭを含む培地中で３５ ｍｍのプラスチック組織培養皿に一皿当たり２Ｘ１０’細胞で平面培養された。

胎児の線維芽細胞は成人（１，４Ｘ１０１＋細胞／皿）よりも高度な飽和密度（ ４，９Ｘ１０５細胞／皿）に達した。胎児又はＢＳＦＣＭのいずれもこれらの細 胞の増殖に効果を持たなかった。三次元コラーゲンゲル基質上又は基質内のＦＳ Ｆ３７細胞の成長は、同様に胎児又はＢＳＦＣＭの双方によっても影響されなか った（データは示していない）。

細胞の移動は多数の特性の分かった可溶性成長因子；例えば、血小板由来の成長 因子、ＰＤＧＦ　（バーンステーン［Ｂｅｒｎｓｔｅｉｎ］等、１９８２）及び 表皮成長因子、ＥＧＦ　（プレー［Ｂ１ａｙ］及びブラ→ン［Ｂｒｏｗｎ］、１ ９８５）、により影響を受けることが知られている。これらの因子は血清及び血 漿中に種々の量で存在する。この原理を考慮に入れて、我々は胎児及び乳癌患者 の線維芽細胞条件付は培地がＦＳＦ３７標的包皮細胞の移動を刺激する能力に及 ぼす血清及び血漿の効果を試験した。

表４に示された実験において、細胞は（ａ）血清を含まない培地、（ｂ）５％の 牛血漿を補給された培地及び（ｃ）５％の牛血溝を補給された培地中で、種々の 条件付は培地の存在又は不存在下に高密度で平面培養された。実験の結果は条件 付は培地の不存在下の細胞の移動が血清を含まない培地及び血清又は血漿を補給 された培地中で同稈度に起こることを示している。これらの結果は、ヒトの皮膚 の線維芽細胞及び黒色腫細胞を含む各種の型の細胞のコラーゲンゲル中への移動 が、血清の存在に依存しないことを指摘する従来の報告と一致している（ショー 等、１９８１）。対照的に胎児又は乳癌患者のいずれかの条件付は培地による高 密度培養におけるＦＳＦ３７移動の刺激は、血清又は血漿の存在においてのみ観 察された；血清を含まない培地中で培養された細胞はこれらの条件付は培地に完 全に応答しなかった。

無　　し　　　　　　　　　　　　　４．６　　　　　　　２．３　　　　　　 　４．９胎児　　　　３．９　　８．４　　１０．８乳癌　　　　４．６　　９ ．４　　１１．１ＦＳＦ包皮線維芽細胞は（ａ）血清を含まない培地、（ｂ）５ ％の牛血漿を含む培地及び（Ｃ）５％の牛血溝を含む培地中で、胎児（Ｆ　Ｓ　 ６）及び乳癌患者（ＢＳＦＩＩ）線維芽細胞条件付は培地の存在又は不存在下に 高密度でコラーゲンゲル上に平面培養された。ゲルマトリックス内の細胞の％は 四日間のインキュベーション後に測定された。

寒寒 ここに提示したデータは（ａ）胎児及びＢＳＦ線維芽細胞は高密度培養中で正常 な成人の細胞よりも顕著に大きい範囲で移動する、（ｂ）胎児及びＢＳＦ線維芽 細胞は高密度培養中で正常な成人の細胞の移動を刺激する可溶性因子（ＭＳＦ） を生産する（その結果ＣＤＭＩの値が胎児範囲に入る）、（Ｃ）胎児及びＢＳＦ 　ＣＭは低密度培養では成人細胞に移動に影響しない、及び（ｄ）成人の線維芽 細胞ＣＭは細胞の移動を阻害しない、ことを示している。高密度及び低密度にお けるＦＳＦ３７細胞の移動に及ぼす因子の差別的効果は、種々の群の線維芽細胞 により明示される特性的なＣＤＭＩ値を測定する際のこの因子の潜在的な役割と 一致する。

胎児及びＢＳＦ　ＣＭにおける移動刺激活性は各種の処理（トリプシン処理、透 析、加熱、ｐＨ変化、還元的アルキル化）に対し同じ感受性を見せた。胎児及び ＢＳＦ移動刺激活性の類似性は夫々のＣＭの投与量応答曲線により再び指摘され る。夫々の因子を更に特性決定し精製することによって、胎児及び乳癌患者線維 芽細胞のＭＳＦが実際に同一か否か明らかになるであろう。胎児線維芽細胞ＣＭ のゲル濾過クロマトグラフィーは、５Ｏ−６０ｋＤの範囲の見掛けの分子量を有 することを指摘している。同一の結果は他の胎児及び乳癌患者の線維芽細胞によ り生産されたＭＳＦについても得られている；これらのデータは、ＭＳＦの精製 及び生化学的特性に関する一層の詳細が述べられている、今後の報告（グレー［ Ｇｒｅｙ）等、準備中）に提示されるであろう。

各種の目的（ＭＳＦの精製を含む）のために、移動刺激活性をＣＭＩｍ１当たり の単位又は蛋白質１μｇ当たりの単位を用いて表現することが便利である。従っ て我々は高密度培養における標的成人線維芽細胞の移動に３倍の刺激を生産する のに必要なものを活性の単位として定義した。図２に示される投与量一応答デー タをみれば、１単位の移動刺激活性に対応する移動水準は、１０％ＣＭ濃度で達 成されることが示される。

胎児及びＢＳＦ　ＣＭは１ｍｌ当たり約５０μｇの蛋白質を含むから、これらの ＣＭは約１ｍｌ当たり１０単位で蛋白質１μｇ当たり０．２単位を含むと計算さ れる。

胎児及びＢＳＦのＣＭはいずれも成人細胞の増殖を刺激しなかった；これらの結 果はＭＳＦが線維芽細胞の移動を刺激する能力は、細胞の増殖の誘発に依存しな いことを示している。この点に関して、最近のデータはＭＳＦによる成人線維芽 細胞の移動の刺激はマトリックス巨大分子、特にヒアルロン酸の沈着に及ぼすそ の一次的効果の二次的な結果であることを示唆している（ショー及びショー、１ ９８７ｂ）。この発見は多数の可溶性“成長”因子、例えば形質転換成長因子− ベータがマトリックス合成に一次的効果を及ぼすことを指摘（イグノッツ［Ｉｇ ｎｏｔｚ］及びマツサグ［Ｍａｓｓａｇｕｅ］　）する成長体の証跡と合致して いる。

表４に示された結果はＭＳＦが細胞の移動を刺激する機構は、血漿又は血清のい ずれかに存在する他の因子の協調作用に依存することを指摘している。これらの 結果はＰＤＧＦ及び他の血小板由来の因子への依存性を排除するものであり、こ れらは血小板に乏しい血漿中には存在しないからである。又ＭＳＦ作用の血清又 は血漿への絶対的依存性とは対照的に、それは血清を含まない条件下で胎児及び 乳癌患者の双方の線維芽細胞により、即ち、条件付は培地を得る標準的方法によ り、生産されることに留意しなければならない。

各種の細胞型により生産され、各種の標的細胞特異性を見せる移動刺激因子が最 近記述されている。多数のこれらの因子が５Ｏ−６０ｋＤの範囲の見掛けの分子 量を有する（ストーカ−［５ｔｏｋｅｒ］及びベニマン［Ｐｅｎ−ｎｙｍａｎ］ 、１９８６；リオッタ［Ｌｉｏｔｔａコ等、１９８６；ストーク［５ｔｏｋｅ］ 等、１９１１！７；アトニブ［Ａｔｎ１ｐ］等、１９８７）ことに注目すること は興味あることである。しかし多数の証拠物件は、それらが線維芽細胞ＭＳＦと 同一ではないことを示唆している。例えば胎児の線維芽細胞は正常の表皮細胞の その特徴的な緊密に充填されたコロニーからの分散を誘発する、散乱因子を生じ る（ストーカ−［５ｔｏｋｅｒ］及びベニマン［Ｐｅｎｎｙｍａｎ］、１９８６ 　；ストーカ−等、１９８７）。この分析方法を用いて、ＦＳ６胎児線維芽細胞 ＣＭは測定し得る散乱活性を含むことが見出されたが、ＢＳＦＩＩ乳癌患者線維 芽細胞条件付は培地は陰性であることが見出された（ストーカ−等、１９８７　 、及び私信）。これらの結果はストーカ−により記載された表皮散乱因子（胎は ないであろう。更に、散乱因子は胎児の線維芽細胞により生産されるので、バラ タリン（ｐａｒａｃｒｉｎｅ）様式で作用するが、正常な表皮細胞にその生物学 的活性を発揮する；対照的に、本報告で記載される移動刺激因子は標的成人線維 芽細抱に及ぼすその効果によって分析される。高密度培養における胎児及びＢＳ Ｆ線維芽細胞により表示される高水準の移動は、恐ら（これらの細胞によるＭＳ Ｆの体質的生産の結果として生じるものであり、それによりこの因子のオートク リン作用様式を示唆するものであろう。

移動刺激因子は又転移性（ｍｅｔａｓｔｉｃ）腫瘍細胞系統により生じることが 報告されている。リオッタ等（１９８６）により記載されたオートシリン運動性 因子（ＡＭＦ）は恐らく最も良く特性が示されたものであろう。我々の予備的デ ータによれば、ＡＭＦは線維芽細胞ＭＳＦと同じ分子ではない；二つの因子の間 の顕著な差異は、（ａ）熱安定性（ＭＳＦは６０℃に加熱されると失活するが、 ＡＭＦはしない）、（ｂ）ｐＨ安定性（ＭＳＦは酸性ｐＨで安定であり、アルカ リ性ｐＨで不安定であるが、ＡＭＦは酸性ｐＨで不安定であり、アルカリ性ｐＨ で安定である）、（Ｃ）血清又は血漿への依存性（ＭＳＦは活性化のために血清 又は血漿のいずれかの存在を必要とするが、ＡＭＦは血清を含まない培地中で分 析される）、及び（ｄ）標的細胞の特異性（ＭＳＦは非生産性の正常な成人の標 的細胞の移動を刺激するに対し、ＡＭＦは生産する転移性腫瘍細胞系統の移動を 刺激するが、正常又は非転移性細胞系統を刺激しない）、ことが含まれる。

これらの各種の移動刺激因子の活性は全く異なる条件下で分析される、ＭＳＦは ４日間の長いインキュベート期間に亙って三次元コラーゲンゲル中への線維芽細 胞移動の刺激により、散乱因子はプラスチック皿上における表皮細胞の分散によ り及びＡＭＦは僅か４時間のインキュベート期間に亙るニュクレオボア（Ｎｕｃ ｌｅｏｐｏｒｅ）濾過器中への細胞の移動に及ぼす効果により、夫々分析される 。細胞移動のような複雑な挙動的性質に影響する異なる因子を比較する時には、 分析方法のこれらの基本的な差異を心に留めていなければならない。これらの重 要な警告にも拘らず、これらの各種の因子により提示されう分子量（５０−６０ ｋＤ）の見掛けの類似性は、それらが類縁した分子群の一員であるかもしれない という可能性に興味がそそられる。

我々は以前に成人における胎児様線維芽細胞の存在は、正常な表皮−間葉相互作 用において生じる機能不全のために、癌の発生の嫌疑を増大する可能性を論じた （ショー等、１９８７）。現在の研究において、我々は癌患者の胎児様線維芽細 胞が裏体ｐ胎児細胞により生産される因子と類似の生化学的性質を有する移動刺 激因子を分泌することを示した。癌患者の胎児様線維芽細胞及び病原論における それらの潜在的関係についての一層詳細な議論は別な機会に提示される。

線維芽細胞系統はハム（Ｈａｍ０１９８０）により記載されたような体外移植組 織培養から得られた。本研究において使用された細胞系統は：６才の男子の供与 者から得られたＦＳＦ３７包皮線維芽細胞；１２週の女子の胎児から得られたＦ Ｓ６Ｓ２Ｏ四肢の皮膚線維芽細胞；家族性乳癌を有する５０才の女子患者から得 られたＢＳＦＩＩ前腕皮膚線維芽細胞；であった。ＦＳＦ３７包皮線維芽細胞は 移動的挙動の特徴的な成人様式を明示し、ＭＳＦを生産しない：従ってこれらの 細胞は本報告においては成人線維芽細胞と称される。原料培養は、９０ｍｍのプ ラスチック製組織皿中の１５％の無菌的の新生児子牛血清、グルタミン、非必須 アミ、ノ酸、ピルビン酸ナトリウム、ペニシリン及びストレプトマイシンを補給 したＭＥＭ成長培地で成長させた（ショー及びコート、１９７９）。培養基は集 密か達成された時、週に約一度１：３の分離比で継代培養した。５−１０の継代 培養の間の線維芽細胞がこの研究に使用された。実験に使用された細胞は蛍光性 ヘキスト（Ｈｏｅｃｈｓｔ）　３３２５６染色によりスクリ９０ｍｍのプラスチ ック製皿中で培養された集密した胎児及び乳癌患者の皮膚線維芽細胞を、血清を 含まない成長培地（ＳＦ−ＭＥＭ）で５回洗浄し、次いで空気中に５％の炭酸ガ スを含む湿潤したガスが供給されたインキュベーター中で、３７℃で７２時間５ ｍｌのＳＦ−ＭＥＭを用いてインキュベートした。得られる条件材は培地（ＣＭ ）を集めて０゜２２μのミリポア（ｌｌｉｌｌｉｐｏｒｅ）濾過器を通して細胞 の残骸を除去して、必要時まで一７０℃で貯蔵した。

我々は前にＣＭ中の総てのＭＳＦ活性はヘパリンアフィニティーカラムにより吸 着され、０．３−０．６Ｍ　ＮａＣｌで溶離することを示した。従ってＣＭの１ ｍｌのアリコートは、従前に２０ｍＭトリス−ＨＣｌ１０．ＩＭ　ＮａＣ１（ｐ Ｈ７，０）で平衡化された固定化ヘバリンアフィニティ・カラム（０，４−０， ５ｍｇ／ｍＩのヘパリンを有する４％ビーズ状アガロース：ピアス・バイオケミ カルズ［Ｐｉｅｒｃｅ　Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ］、チェスター［Ｃｈｅｓｔ ｅｒ］、英国）に吸着させた。次いでカラムを５ｍｌの平衡緩衝液で洗浄し、Ａ ２１１゜により測定して総ての蛋白質が溶離するまで２０ｍＭトリス−ＨＣｌ　 　（ｐＨ７，０）中の０．３及び０．６ＭＮａＣ１を用いて段階的溶離によりＭ ＳＦ活性物を溶離した（約５ｍ１）。貯留された０、３ＭＮａＣ］溶離液をＹＭ ＩＯダイアフロ（Ｄｉａｆｌｏ）膜を備えたアミコン濾過装置（アミコン社、グ ルセスタシャイア［Ｇ１ｏｕｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ］、英国）を用いる限外濾 過により１０×に濃縮した。得られた濃縮物質を実施例１に記載されたようなフ ァルマシア高速蛋白質液体クロマトグラフィー装置（ＦＰＬｃ”）を用いるゲル 濾過クロマトグラフィーにより分別した。これは２００μｍのアリコートをスパ ロース１２カラムにかけ、０．１５ＭＮａＣ］を含む２０ｍＭのトリス緩衝液（ ｐＨ７゜４）中で０．３ｍｌ／分の流速で流すことを含んでいる。１ｍｌの画分 を集め、次いで４８時間ＳＦ−ＭＥＭに対して透析した。かように処理された胎 児及び癌患者皮膚線維芽細胞ＣＭから得られた試料中で１２−１３ｍ１の保持容 量（Ｖｏ＝６．５ｍ１１Ｖ＋＝２５ｍｌ）を有するＭＳＦ活性物のピークが溶離 された。この物質（ＭＳＦ）を凍結乾燥し、必要時まで一２５℃で貯蔵し、使用 前にＳＦ−ＭＥＭ中で再構成した。

細胞移動分析 Ｉ型コラーゲンをラットの尾の脚から３％の酢酸中に抽出し、蒸留水に対し三日 間透析し、３５ｍｍプラスチック製組織培養皿中の２ｍｌのコラーゲンゲルをつ くるために使用した（ショー及びコート、１９７９）。

標準的移動分析のために、コラーゲンゲルをＳＦ−ＭＥＭ　（対照）、生のＣＭ 又は４０　ｎ　ｇ／ｍ　］のＭＳＦを含むＳＦ−ＭＥＭのいずれかで覆った。Ｆ ＳＦ３７線維芽細胞はＭＳＦを生産しないがそれに応答するから、分析中で標的 細胞として使用した。ＦＳＦ３７包皮線維芽細胞の集密原料培養をトリプシン処 理し、２０％の血清を含む成長培地中に再懸濁した。次いでこの細胞懸濁液を用 いて高及び低密度の平面培養用接種材料を調製した：高密度接種材料中の細胞数 は、平面培養用材料１ｍｌがコラーゲンケル表面上に２．５Ｘ１０’細胞／ｃｍ ２（即ち集密的密度）を与えるように調節され、一方低密度接種材料中の細胞数 は、１０３細胞／ｃｍ２（即ち、亜集密的密度）を与えるように調節された。コ ラーゲンゲルの容積は２ｍｌであるから、この方法は総ての培養中に５％血清、 及び夫々の試験培養中に２５％ＣＭ又は１０ｎｇ／ｍ１Ｍ５Ｆのいずれかの最終 濃度を与える。移動データを四日間インキュベート後の三次元コラーゲンマトリ ックス内に見いだされた細胞数のパーセントとして表現する。これらの値はうイ ツ・ラボヴエルト（Ｌｅｉｔ、ｚ　Ｌａｂｏｖｅｒｔ）顕微鏡を用いる１０−１ ５のランダムに選択した視野中のゲル表面上、及びコラーゲンマトリックス内の 細胞数を計数することにより測定された（ショー、１９８０）。低密度培養中で は最低５００の細胞が計数され、一方高密度培養中では１０００以上の細胞が計 数された。複数のゲルが各パーセント点について計数された。

実施例１及び２に関する文献 アバ−クロンビー（ＡＢＥＲＣＲＯＭＢＩＥ）、　Ｍ、　（１９７０）、組織培 養中の収縮阻害。Ｎａｔ−ｕｒｅ、　Ｌｏｎｄ、　２７９．４４２−４４４アト ニブ（ＡＴＩ讐ＩＰ）、　Ｋ、　Ｄ、カーター（ＣＡＲＴＥＲ）、ニコルマン（ ＮＩＣＯＬＳＯＮ）、　Ｇ、　Ｌ及びダバウス（ＤＡＢＢＯＵＳ）、　Ｍ、　Ｋ 、　（１９８７）腫瘍由来の細胞分裂へのラットの乳房の腺癌細胞クローンの化 学走性的応答。Ｂｉｏｃｈｅｍ、　Ｂｉｏｐｈｙｓ、　Ｒｅｓ、Ｃｏｍｍ。

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Ｐｈｙｓｉｏｌ、　１２４．１０７−１１２’；’　　−−ン’ｊ　（ＤｔｌＲ ＮＩＢＧ）、　Ｐショー　（ＳＣＨＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ及Ｕセルウッ）’（ＳＥ ＬＬｌｔｏｏＤ）。

Ｒ１＾、Ｓ、　（１９８４）乳癌を有する患者からの線維芽細胞は試験管内で異 常な移動的挙動を示す。Ｌａｎｃｅｔ　Ｉ、８９０−８９２グリネル（ＧＩ？Ｉ ＮＮＥＬ）、　Ｆ、及びラムヶ（ＬＡＭＫＥ）、　Ｃ，Ｒ１（１９８４）ヒトの 皮膚の線維芽細胞による水和コラーゲンの再組織化。］、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、 　６６．５１−６３バギー（ＢＡＧＧＩＥ）、　Ｊ、　、ハウエル（ＨＯＷＥＬ Ｌ）、　Ａ、　、セルウッド（ＳＥＬＩＪＯＯＤ）、Ｒ，Ａ。

バーチ（ＢＩＲＣＨ）、　Ｊ、　Ｍ、及びショー（ＳＣＨＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、 　（１９８７）遺伝的乳癌を有するハム（ＲＡＭ）、　Ｒ，Ｇ、　（１９８０） 皮膚の線維芽細胞。細胞生理学の方法、２１巻（Ｃ，ハリス、Ｂ、Ｆ、トランプ 及びＧ、ストナーＩＱ）２５５−２７６頁。ニューヨーク：アカデミツク・プレ ス イク／　ツク（ＩＧＮＯＴＺ）、　Ｒ，Ａ、　及びマツサグ（ＭＡＳＳＡＧＬＩ Ｅ）、　Ｊ、　（＋９８６）形質転換成長因子ベータはフィブロネクチン及びコ ラーゲンの発現及びそれらの細胞外マトリックス中へのとりこみを刺激する。Ｊ 、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅｍ、２６１．４３３７’Ｊ　ｔ　−ｙ　９　（ＬＩＱＴ ＴＡ）、　Ｌ、　Ａ、　、　７　：／　Ｆ　−ｙ　−（ＭＡＮＤＬＥＲ）、　Ｒ ，、ムラ／　（ＭｔｌＲＡmＯ）、　Ｇ、　。

カツク（ＫＡＴＺ）、　Ｄ、　Ａ、　、ゴートン（ＧＯＲＤＯＮ）、　Ｒ，Ｋ、 　、チャ：／（ＣＨＡＮＧ））、　Ｐ、　Ｋ、及びシフマン（ＳＣＨＩＦＦＭＡ ＮＮ）、　Ｅ、　（１９８６）腫瘍細胞オートクリン運動因子。Ｐｒｏｃ。

Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、（ＵＳＡ）８３．３３０２−３３０６モンター 　（ＭＡＬＩＮＴＥＲ）、　Ｖ、及びハインズ（ＨＹＮＥＳ）、　Ｒ，Ｏ，（１ ９７７）正常及び形質転換した線維芽細胞の細胞骨格に関するＬＥＴＳ蛋白質の 表面分布。Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ、　７５．７４３−７６８シヨー（ＳＣＨ ＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、　（１９８０）三次元コラーゲンゲル中の細胞増殖及び移 動。

Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　４１．１５９−１７５シヨー（ＳＣＨＯＲ）、　Ｓ 、　Ｌ、及びコート（ＣＯＵＲＴ）、　Ｊ、　（１９７９）細胞の天然及び変性 コラーゲンへの付着に含まれる各種の機構。Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、３８，２ ６７−２８１シｑ　　（ＳＣＨＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、及びシａ　−（ＳＣＨＯＲ ）、　Ａ、　Ｍ、　（１９８７ａ）線維芽細胞表現型におけるクローン的異質性 二表皮−間葉相互作用の調節に対する連携関係。ＢｉｏＥｓｓａｙｓ　７．２０ ０−２０４シヨー（ＳＣ）ＩＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、及びショー（ＳＣＨＯＲ）、 　Ａ、　Ｍ、　（１９８７ｂ）線維芽細胞表現型における胎児から成人への転移 ：癌の病原論への関連。細胞挙動：形態、融着及び運動性（Ｊ、ヘイズマン、＾ 、ミツドルトン及びＦ、ワットＩｉ）ケンブリッジ大学プレス。］、　Ｃｅ１ｌ 、　Ｓｃｉ、　５ｕｐｐ１．　Ｎｏ、　８．１６５−１８０（１９８７）シａ　 　（ＳＣＨＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、　、シａ　　（ＳＣＨＯＲ）、　Ａ、　Ｍ、及 びバジル（ＢＡＺＩＬＬ）、　Ｇ、　！、　（１９８１）ヒトの包皮線維芽細胞 及びシリャハムスター黒色腫細胞の天然コラーゲン繊維の三次元ゲル中への移動 に及ぼすフィブロネクチンの効果。Ｊ。

Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、　４８．３０１−３１４シヨー（ＳＣＩＩＯＲ）、　Ｓ、　 Ｌ、　、ショー（ＳＣ）ＩＯＲ）、＾１Ｍ９、ウィン（ＩＩＩＮＮ）、Ｂ、　、 及びラシトン（ＲＵＳ）ＩＴＯＮ）、　Ｇ、　（１９８２）試験管内での腫瘍細 胞侵入の研究のための三次元コラーゲンゲルの利用ニゲルマトリックス中への細 胞移動に影響する実験的パラメーター。Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　２９， ５７−６２シヨー（ＳＣ）ＩＯＲ）、　Ｓ、　Ｌ、　、ショー（ＳＣｒｌＯＲ） 、＾９Ｍ、ラシトン（ＲＵＳＨＴＯＮ）、　Ｇ、及びスミス（ＳＭＩＴＨ）、　 Ｌ、　、　（１９８５ａ）成人、胎児及び形質転換された線維芽細胞はコラーゲ ンゲル上で異なる移動的表現型を呈する・胎児の発育の間の同型的遷移の証拠。

Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、７３，２２１−２３４シヨー（ＳＣ）ＩＯＲ）、　Ｓ 、　Ｌ、　、ショー（ＳＣＦＩＯＲ）、　Ａ、　Ｍ、　、ダーニング（ＤＵＲＮ ＩＮＧ）、　Ｐ、及びラシトン（ＲＵＳＩ（ＴＯＮ）、　Ｇ、　（１９８５ｂ） 癌患者から得られた皮膚の線維芽細胞はコラーゲンゲル上で胎児様挙動を呈する 。Ｊ、　Ｃｅ１ｌ　Ｓｃｉ、７３．２３５−２４４シヨー（ＳＣ）ＩＯＲ）、　 Ｓ、　Ｌ、　、バギー（）ＩＡＧＧＩＥ）、　Ｊ、　、ダーニング（ＤＩＪＲＮ ＩＮＧ）、ハウエル（）ＩＯＷＥＬＬ）、＾、、スミス（ＳＭＩＴＨ）ル、セル ウッド（ＳＥＬＩＪＯＯＤ）及びクラウザー（ＣＲＯＷＴ）ＩＥＲ）、　Ｄ、　 （１９８６）家族性乳癌における胎児線維芽細胞表現型の発生。

Ｉｎｔ、　Ｊ、　Ｃａｎｃｅｒ　３７，８３１−８３６シヨー（ＳＣＨＯＲ）、 　Ｓ、　Ｌ、　、ショー（ＳＣＨＯＲ）、　Ａ」、　、ハウエル（Ｉ（ＯＷＥＬ Ｌ）、　Ａ、及びクラウザー（ＣＲＯＷＴＲＥＩ？）、　Ｄ、　（１９８７）仮 説：線維芽細胞による胎児表現型特質の存続的発現は腫瘍性疾病の嫌疑の増大と 関連する。Ｅｘｐｌ、　Ｃｅ１ｌ　Ｂｉｏｌ。

５５．１１−１７ ストーカ−（ＳＴＯＫＥＲ）、　Ｍ、及びベニマン（ＰＥＮＮＹＭＡＮ）、　Ｍ 、　（１９８６）胎芽線維芽細胞により放出された上皮散乱因子。Ｊ、　Ｃｅ１ ｌ　Ｓｃｉ、７７．２０９−２２４ストーカ−（ＳＴＯＫＥＲ）、　Ｍ、　、ゲ ラルディ（Ｇ）ＩＥＲＡＲＤＩ）、　Ｅ、　、ベニマン（ＰＥＮＮＹＭＡＮ）。

組及びグレー（ＧＲＡＹ）、　Ｊ、　（１９８７）散乱因子は上皮細胞運動性の 線維芽細胞由来の転形因子である。Ｎａｔｕｒｅ　３２７．２３９−２４２ポー ケル（ＶＯＧＥＬ）、　Ａ、　Ｅ、　、　レ−ンズ（ＲＡＩＮＦＳ）、　Ｂ、　 、　７’７　！Ｊ　ヤ（ＫＡＲＩＹＡ）、　Ｂ、　、　hＪヴエ スト（ＲＩＶＥＳＴ）、　Ｍ、及びロス（ＲＯＳＳ）、　Ｒ，（１９７８）血小 板由来成長因子及び血漿成分による３Ｔ３細胞増殖の協調的調節。Ｐｒｏｃ、　 Ｎａｔ、　Ａｃａｄ、　Ｓｃｉ、　（ＬＩＳ＾）補正書の写しく翻訳文）提出書 　（特許法第１８４条の８）平成３年１月５日 特許庁長官　植　松　　　敏　殿 １、特許出願の表示 ＰＣＴ／ＧＢ　８９１００７６８ ２、発明の名称 移動刺激因子 ３、特許出願人 住　所　イギリス国ロンドンニスダブリュー１ワイ　５エイアール・カールトン ハウステラス２ （１）補正書の写しく翻訳文）　　　　　　　　　１通７、補正の説明 添付の補正書の写しく翻訳文）は請求の範囲の全文差し替えであります。

請求の範囲 １、それ自身ポリペプチドを生産しない正常な成人の線維芽細胞の移動を刺激す ることが可能であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により７０ｋＤの見掛け の分子量を有し、生理学的ｐＨで陽イオン性であり、１０％飽和の硫酸アンモニ ウムにより水溶液から沈澱し、ｐＨ２では溶液中で安定であるがｐＨ１０では安 定でなく、５６℃で変性し、トリプシン及びアルキル化／還元に感受性であり、 及びヘパリンに結合するポリペプチドである移動刺激性因子−１゜２、それ自身 移動刺激性因子を分泌せず、ゲル濾過により５０ないし７０ｋＤの見掛けの分子 量を有し、ｐＨ２では溶液中で安定であるがｐＨｌ０では安定でな（，５６℃で 変性し、トリプシン及びアルキル化／還元に感受性である、正常な成人の線維芽 細胞の移動を刺激することができるポリペプチド。

３、ヒト又は動物体の治療のための方法において又はヒト又は動物体に実施され る診断の方法において使用するための請求の範囲１ないし２項の任意の項に記載 の移動刺激性因子又はポリペプチド。

４、請求の範囲工ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子及びそれに対す る製薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤を含有して成る製薬学的組成物。

５、移動刺激性因子に感受性であると思われる細胞を請求の範囲工ないし３項の 任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチドと接触させることを特徴とす る試験又は分析。

６、請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチ ドを含むと思われる試料を移動刺激性因子に感受性であると思われる細胞と接触 させることを特徴とする試験又は分析。

７．細胞の移動的挙動が細胞密度移動指数を測定することにより評価される請求 の範囲５項又は６項に記載の試験又は分析。

８、請求の範囲工ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチ ドに対する抗体。

９、請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチ ドを含むと思われる試料を請求の範囲８項に記載の抗体と接触させることを特徴 とする試験又は分析。

国際調査報告 １″Ｉｎｌ＋ｔ６１１ｅ′１＋１　Ａｅｅｍ°ｌ′”　”　ＰＣＴ／ＧＢ　８９ １００７６８

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．移動刺激性因子。
2. ２．それ自身ポリペプチドを生産しない正常な成人の線維芽細胞の移動を刺激す ることが可能であり、ポリアクリルアミドゲル電気泳動により７０ｋＤの見掛け の分子量を有し、生理学的ｐＨで陽イオン性であり、１０％飽和の硫酸アンモニ ウムにより水溶液から沈澱し、ｐＨ２では溶液中で安定であるがｐＨ１０では安 定でなく、５６℃で変性し、トリプシン及びアルキル化／還元に感受性であり、 及びヘパリンに結合するポリペプチドである移動刺激性因子−１。
3. ３．それ自身移動刺激性因子を分泌せず、ゲル濾過により５０ないし７０ｋＤの 見掛けの分子量を有し、ｐＨ２では溶液中で安定であるがｐＨ１０では安定でな く、５６℃で変性し、トリプシン及びアルキル化／還元に感受性である、正常な 成人の線維芽細胞の移動を刺激することができるポリペプチド。
4. ４．ヒト又は動物体の治療のための方法において又はヒト又は動物体に実施され る診断の方法において使用するための請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載 の移動刺激性因子又はポリペプチド。
5. ５．請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子及びそれに対す る製薬学的に許容し得るキャリヤー又は希釈剤を含有して成る製薬学的組成物。
6. ６．移動刺激性因子に感受性であると思われる細胞を請求の範囲１ないし３項の 任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチドと接触させることを特徴とす る試験又は分析。
7. ７．請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチ ドを含むと思われる試料を移動刺激性因子に感受性であると思われる細胞と接触 させることを特徴とする試験又は分析。
8. ８．細胞の移動的挙動が細胞密度移動指数を測定することにより評価される請求 の範囲６項又は７項に記載の試験又は分析。
9. ９．請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプチ ドに対する抗体。
10. １０．請求の範囲１ないし３項の任意の項に記載の移動刺激性因子又はポリペプ チドを含むと思われる試料を請求の範囲９項に記載の抗体と接触させることを特 徴とする試験又は分析。