JP2000297098A - 抗ｍｃｐ−１抗体認識ペプチドミミックス、その製造方法およびその用途 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【解決手段】 単球の遊走に密接に関与しているＭＣＰ
−１の、その受容体との相互作用を制御・調節すること
が可能なペプチドミミックス、当該ペプチドミミックス
を有効成分とする医薬組成物、単球遊走阻害剤。抗ＭＣ
Ｐ−１抗体を用いてファージランダムペプチドライブラ
リーをスクリーニングすることを含む当該ペプチドミミ
ックスの製造方法。 【効果】 単球の遊走に密接に関与していると考えられ
るＭＣＰ−１と、その受容体との相互作用を制御・調節
することが可能な本発明のペプチドミミックスは、単球
遊走阻害剤として有用であり、各種炎症性疾患へ提供が
期待できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は抗ＭＣＰ−１抗体と
結合し得るＭＣＰ−１様ペプチドミミックス（ｍｉｍｉ
ｃｓ−模倣物の意）、その製造方法ならびにその用途に
関する。

【０００２】

【従来の技術】ケモカインとは白血球走化作用を有する
サイトカインの総称である。約３０種が存在し、いずれ
も構造的に４つのシステイン残基の位置が保存され、約
１万の分子量を有する。初めの２つのシステインの間に
アミノ酸が１つ入るＣＸＣケモカインと、入らないＣＣ
ケモカインに分別される。ＣＸＣケモカインは好中球
に、ＣＣケモカインは単球またはマクロファージに作用
する。これらのケモカインは炎症刺激により産生される
ことから、炎症時に炎症局所に白血球を誘導するものと
考えられる（生化学、６９巻１２号、１３７３〜７７
頁、１９９７年発行）。また、最近では走化作用以外に
も、接着分子の発現、血管新生の抑制、脱顆粒、ヒスタ
ミン遊離、抗腫瘍活性の増強、造血、器官形成への関与
等が明らかになりつつある（呼吸、１７巻１号、２〜９
頁、１９９８年発行）。従って、ケモカインを阻害する
物質の、炎症性疾患への適用、すなわち、抗炎症剤、抗
アレルギー剤等としての用途が期待されている。

【０００３】標的細胞にはこのケモカインに対する受容
体が存在する。現在９種類が同定されて、いずれも７回
膜貫通型のＧ蛋白質結合性受容体ファミリーに属する。

【０００４】Monocyte Chemoattractant Protein-1(Ｍ
ＣＰ−１)は７６個のアミノ酸からなる塩基性蛋白質
で、その構造上からケモカインの中のＣＣサブファミリ
ーに分類される。ＭＣＰ−１は単球に対して特異的な遊
走活性を示す。また、単球表面の接着分子の発現にＭＣ
Ｐ−１が関与しており、炎症局所への単球の遊走、内皮
細胞との接着および内皮下への浸潤というプロセスに深
いかかわりを持つ。実際の疾患ではＭＣＰ−１は慢性関
節リウマチ、肺線維症、腎炎等の慢性炎症性疾患、粥状
動脈硬化症および種々の悪性腫瘍で産生が認められ、局
所の単球・マクロファージの浸潤に重要な役割を果たし
ていると考えられている。また、近年ケモカイン受容体
はＨＩＶ−１感染のコレセプター（補助受容体）である
という発見がなされ、ＭＣＰ−１のレセプターの一つで
あるＣＣＲ２もＨＩＶ−１感染のコレセプターのひとつ
であることが明らかにされている（ジャーナル・クリニ
カル・インベスト、１００巻、４９７〜５０２頁、１９
９７年発行、参照）

【０００５】最近、受容体−リガンド系における相互作
用部位を同定する手段として、ファージランダムペプチ
ドライブラリーを用いたスクリーニング法が注目されて
いる（サイエンス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９
９０年発行）。これはファージの構成蛋白質であるｐ３
分子をコードする遺伝子（ジーン３）にランダムなアミ
ノ酸配列を有するペプチド分子をコードする遺伝子を挿
入することにより、当該ペプチド分子を含んだ形のｐ３
分子（ジーン３蛋白質とランダムなアミノ酸配列を有す
るペプチド分子との融合体。以下、Ｇ３Ｐ体とも呼ぶ）
をｆｄ−ｔｅｔファージ（繊維状一本鎖ＤＮＡのファー
ジ）上に発現させ、ファージランダムペプチドライブラ
リーを作成し、パンニング等で目的とするペプチド分子
を発現しているファージをスクリーニングし、当該ファ
ージのジーン３遺伝子部分の塩基配列解析を行って、相
互作用部位を決定する方法である。

【０００６】この方法を用いて、抗ｐ５３モノクローナ
ル抗体によるｐ５３分子上のエピトープの決定（ただ
し、ｐ５３と相同性が高い）、抗ｂＥＧＦ抗体によりス
クリーニングされたｂＥＧＦ類似体がｂＦＧＦとその受
容体ＦＧＦＲ−１の結合を阻害したこと、あるいは抗ア
セチルコリン受容体エピトープ抗体と結合するペプチド
配列の発見（当該受容体とは相同性がないが、アセチル
コリンと結合するか否かは言及せず）等が報告されてい
る（Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，
１９９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３
〜４７，１９９３年発行）。

【０００７】また、この手法をさらに発展させて、ＣＴ
ＬＡ−４に関して、抗ＣＴＬＡ−４モノクローナル抗体
を用いて、当該抗体が結合する標的分子の立体構造をア
ミノ酸の一次配列に依存せずに模倣する分子であり、且
つ受容体−リガンドの相互作用を制御できるような分子
を得る方法も報告されている（ネイチャー・バイオテク
ノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発
行。）

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、単球の遊走
活性に密接に関与しているＭＣＰ−１の、受容体との相
互作用を制御・調節することが可能なペプチドミミック
スを提供することを目的とする。さらに本発明は当該ペ
プチドミミックスの単球遊走阻害剤としての利用を目的
とする

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは上記の事情
を考慮して、さらに研究を行った結果、抗ＭＣＰ−１抗
体と結合し、かつＭＣＰ−１の単球遊走活性に対する阻
害効果を有するファージクローンを単離することに成功
した。さらに、抗ＭＣＰ−１抗体と結合するＭＣＰ−１
様ペプチドミミックスを同定し、本発明を完成した。本
発明は抗ＭＣＰ−１抗体と結合するＭＣＰ−１様ペプチ
ドミミックス、当該ペプチドミミックスとジーン３蛋白
質との融合体、当該ペプチドミミックスの単球遊走阻害
剤としての用途、および抗ＭＣＰ−１抗体を用いてファ
ージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングす
ることにより当該ペプチドミミックスを得る方法に関す
る。

【００１０】すなわち本発明は以下の通りである。 １）抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ペプチ
ドミミックス。 ２）ＭＣＰ−１のアミノ酸配列とは相同性がない上記
１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス。 ３）ＭＣＰ−１と立体構造が類似している、および／ま
たはＭＣＰ−１とその受容体との相互作用を制御・調節
する上記１）または２）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミ
ミックス。 ４）１５残基のアミノ酸配列を有するポリペプチドであ
る上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス。 ５）以下の(1)または(2)のアミノ酸配列を有するポリペ
プチドである上記１）記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミ
ックス。 (1)ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ（配列表配列番号
３） (2)ＮＳＧＳＩＣＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号
４） （Ｒはアルギニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシン
を、Ｆはフェニルアラニンを、Ｇはグリシンを、Ｃはシ
ステインを、Ｖはバリンを、Ｎはアスパラギンを、Ｓは
セリンを、Ｉはイソロイシンを、Ｗはトリプトファン
を、Ｙはチロシンをそれぞれ示す。） ６）上記１）〜５）のいずれかに記載のＭＣＰ−１様ペ
プチドミミックスとジーン３蛋白質との融合体。 ７）上記１）〜５）のいずれかに記載のＭＣＰ−１様ペ
プチドミミックス、あるいは上記６）記載のＭＣＰ−１
様ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融合体を有
効成分として含有する医薬組成物。 ８）上記１）〜５）のいずれかに記載のＭＣＰ−１様ペ
プチドミミックス、あるいは上記６）記載のＭＣＰ−１
様ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融合体を有
効成分として含有する単球遊走阻害剤。 １０）抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファージランダムペ
プチドライブラリーをスクリーニングし、当該抗ＭＣＰ
−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
を発現しているファージクローンを単離することを含
む、抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ペプチ
ドミミックスの製造方法。

【００１１】

【発明の実施の態様】本発明において抗ＭＣＰ−１抗体
と結合するＭＣＰ−１様ペプチドミミックスとは、抗Ｍ
ＣＰ−１抗体と結合する、ＭＣＰ−１と立体構造が非常
によく類似している、ＭＣＰ−１のアミノ酸配列とは相
同性がほとんどない、ＭＣＰ−１とその受容体との相互
作用を制御・調節する、等の特徴を有するものである。
全体では少なくとも８個のアミノ酸を有する分子であ
り、好ましくは１５個のアミノ酸からなるペプチドミミ
ックスが例示される。

【００１２】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
の具体例としては、ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ
（配列表配列番号３；以下、当該アミノ酸配列からなる
ペプチドミミックスを、後述する由来ファージクローン
に基づいてＣ２７ミミックスともいう）、ＮＳＧＳＩＣ
ＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号４；以下、当該ア
ミノ酸配列からなるペプチドミミックスを、後述する由
来ファージクローンに基づいてＧ２５ミミックスともい
う）等のアミノ酸配列からなるペプチド分子等が挙げら
れる。尚、各アミノ酸配列中の各記号は前述の定義のと
おりである。

【００１３】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
は抗ＭＣＰ−１抗体と結合する為に必要な立体構造を保
持した状態であればその使用形態は特に限定されず、何
らかのキャリヤー上か、あるいは何らかの蛋白質に組み
込まれた形態であるか、またはペプチド合成等により作
成し得るペプチド単独の形態でも使用可能である。より
具体的には前述のＣ２７ミミックス、Ｇ２５ミミックス
ならびにこれらのミミックスがジーン３蛋白質に組み込
まれている態様であるＧ３Ｐ体（それぞれＣ２７−Ｇ３
Ｐ、Ｇ２５−Ｇ３Ｐともいう）等が挙げられる。当該ペ
プチドミミックスは、それぞれのアミノ酸配列情報に基
づきその立体構造を保持した状態で使用し、当該立体構
造が保持された範囲であれば当該アミノ酸配列を欠失、
置換、付加または修飾させてもよい。

【００１４】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
は、例えば、ＭＣＰ−１−受容体系に関与した分子間の
結合を阻止し、且つＭＣＰ−１の立体構造を認識するこ
とができる抗体（好ましくはモノクローナル抗体）を用
いて、１０⁸種類以上のランダムに並んだ少なくとも８
個以上のアミノ酸を有するペプチド分子を提示する、フ
ァージランダムペプチドライブラリーのスクリーニン
グ、ファージクローンの選択、選択したファージクロー
ンの回収、当該ファージからの精製といった一連の工程
を行うことによって得ることができる。本発明のＭＣＰ
−１様ペプチドミミックスは、精製した状態のものの
他、ペプチドミミックスがその表面に提示されたファー
ジとしても使用可能である。

【００１５】本発明において使用される抗ＭＣＰ−１抗
体は、ＭＣＰ−１−受容体系に関与した分子間の結合を
阻害する能力のある抗体であればどのような動物種の抗
体でもよく、サブクラスやアイソタイプは限定されない
が、立体構造を認識することができる抗体が例示され
る。当該抗体としては、コンフォメーショナルエピトー
プを認識する抗体が挙げられる。

【００１６】ここで、コンフォメーショナルエピトープ
を認識する抗体とは、エピトープの立体構造を認識する
抗体、すなわち、その抗体の抗原結合領域がカウンター
パートの立体構造の鋳型となるような抗体をいう。具体
的には免疫沈降反応等抗原がネイティブな状態であれば
結合できるが、抗原が変性状態にある場合に結合できな
い抗体のことであり、例えば還元状態下でのウエスタン
ブロッティング法では抗原と結合できない抗体、または
エピトープの構成アミノ酸配列をもとに合成されたリニ
アなペプチドには結合できないような抗体等が挙げられ
る。

【００１７】本発明において使用される抗ＭＣＰ−１抗
体の具体例としては、マウス抗ヒトＭＣＰ−１モノクロ
ーナル抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、およびＦ９）が挙げら
れる。

【００１８】当該Ｍ２７９ならびにＥ１１はＭＣＰ−１
とその受容体との結合阻害活性を有する中和抗体であっ
て、ＭＣＰ−１の一次構造を認識することができる。Ｍ
２７９はＲ＆Ｄシステム社より販売されている。Ｅ１１
はネイチャーバイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２
７０頁、１９９８年発行、での記載に準じて調製するこ
とができる。

【００１９】また、Ｆ９は同じく中和抗体であって、Ｍ
ＣＰ−１の三次構造を認識することができる。Ｆ９もＥ
１１と同じく、ネイチャーバイオテクノロジー、１６
巻、２６７〜２７０頁、１９９８年発行、での記載に準
じて調製することができる。

【００２０】本発明で使用するファージランダムペプチ
ドライブラリーは、ファージ表面にランダムなアミノ酸
配列を有するペプチド分子が提示されているものであれ
ば、いかなる種類のファージベクターで構築されたもの
でも使用可能であり、具体的には公知の方法（サイエン
ス、２４９巻、３８６〜３９０頁、１９９０年発行。
Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８，ｐ５８〜７８，１９
９５年発行。Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．
ＵＳＡ，９０，１０６３８〜４２および１０６４３〜４
７，１９９３年発行。ネイチャー・バイオテクノロジ
ー、１６巻、２７８〜２７０頁、１９９８年発行等）に
よって作製され得る。ファージ表面に提示されるべく挿
入される遺伝子は、８個以上、好ましくは１５個のアミ
ノ酸からなるペプチド分子をコードするものが例示され
る。さらにランダムなアミノ酸配列を有するペプチド分
子はファージの表面に提示されていれば、いかなるファ
ージの構成蛋白質に挿入されていてもよいが、ジーン３
蛋白質に挿入されたものが好ましい。ジーン３蛋白質の
Ｎ末端から４番目のＡｌａと５番目のＧｌｙの間に８個
以上、好ましくは１５個のランダムに並んだアミノ酸か
らなるペプチド分子が挿入されているものならば当該挿
入されたペプチド分子の両端に延びるアミノ酸配列が、
その挿入ペプチド分子の三次構造に及ぼす影響を最小限
に抑えることができる。

【００２１】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
の製造方法は、前述の抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファ
ージランダムペプチドライブラリーをスクリーニングす
ることから開始する。スクリーニング法としては抗体を
プレート上に固定化して使用する一般的なパンニング方
法や、抗体を固定化したアフィニティーカラム法等を使
用することができる。また、パンニング→ファージ回収
→ファージの増殖→パンニングの工程を３回以上繰り返
すことによって、目的のファージクローンを濃縮するこ
とができる。このようなスクリーニング法によって抗Ｍ
ＣＰ−１抗体に結合するペプチドミミックスをその表面
に提示しているファージクローンを濃縮することができ
る。通常、このようにして得られたファージクローン
は、抗体との結合力の差や保持されているアミノ酸配列
の種類によって、いくつかのクローン集団に分類するこ
とができる。得られたファージクローンの遺伝子の塩基
配列解析はジデオキシ法等の常法により簡単に行うこと
ができる。

【００２２】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス
は、その微細な受容体結合様式の違いにより、また、Ｍ
ＣＰ−１とその受容体の系に関与する分子の発現状態に
より、ＭＣＰ−１に対して正の制御または負の制御を行
うことができる。特に炎症性疾患時のようにＭＣＰ−１
−受容体系が異常亢進している場合には負の制御を行う
ことができる。故にＭＣＰ−１活性阻害剤あるいは単球
遊走阻害剤として、また、慢性関節リウマチ、肺線維
症、腎炎等の慢性炎症性疾患、アテローム、動脈硬化
症、悪性腫瘍等の予防および治療に対して有用である。

【００２３】本発明の医薬組成物ならびに単球遊走阻害
剤は、有効成分である本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミ
ミックス、あるいはジーン３蛋白質と当該ＭＣＰ−１様
ペプチドミミックスとの融合体を、必要に応じて適宜の
医薬的に許容される添加剤（例えば、担体、賦形剤、希
釈剤等）等の製薬上必要な成分と混合し、粉末、顆粒、
錠剤、カプセル剤等の態様にて経口的に、また注射剤等
の態様にて非経口的に投与することができる。投与量は
有効成分の種類（ペプチドミミックスの種類）、投与ル
ート、患者の病状および疾患の種類、体重、年齢、性別
等に応じて適宜増減できるが、一般的には成人１日当た
りペプチドミミックスの量で０．００１〜１０００ｍｇ
を、1日1回乃至数回に分けて投与するのが望ましい。

【００２４】

【実施例】本発明をより詳細に説明するために実施例お
よび実験例を挙げるが、本発明はこれらにより何ら限定
されるものではない。 実施例１ （１）ファージ・デイスプレイ・ライブラリーおよびパ
ンニング ファージランダムペプチドデイスプレイライブラリ−の
構築およびマイクロパンニングは福本らの報告（ネイチ
ャー・バイオテクノロジー、１６巻、２７８〜２７０
頁、１９９８年発行）に準じて行った。ｆｄ−ｔｅｔフ
ァージの改変体であるｆＵＳＥ５ベクター中のジーン３
蛋白質（以下、Ｇ３Ｐとも呼称。このものはリーダー配
列を切断して成熟型として存在する。）のＮ末から５番
目の位置に１５残基のランダムなアミノ酸配列からなる
ペプチド分子を挿入した。種々のランダムペプチド分子
をその表面に発現する各種ファージをライブラリーとし
て構築した。

【００２５】続いて、抗ヒトＭＣＰ−１モノクローナル
抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、Ｆ９）を用いて、ファージラ
ンダムペプチドライブラリーのパンニングを行った。当
該抗ＭＣＰ−１抗体はファージを選択するための鋳型と
して使用した。ライブラリーをスクリーニングして、抗
ＭＣＰ−１抗体に結合するファージクローンを単離し
た。

【００２６】各種抗ＭＣＰ−１抗体をそれぞれ３５ｍｍ
のプラスチックプレート（岩城ガラス社製）に１０μｇ
コーテイングしたものに、先で調製したファージライブ
ラリー〔５×１０¹²Transducing Unit（以下、ＴＵ）〕
とを４℃で１６時間反応させた（パンニング）。未結合
のファージを０．５％トウイーン２０を含むトリス塩酸
緩衝生理食塩液（ＴＢＳ；５０ｍＭトリス塩酸、０．１
５Ｍ塩化ナトリウム含有、ｐＨ７．５）で洗浄後に、
０．１Ｎ塩酸−グリシン緩衝液（ｐＨ２．２）を用い
て、各種抗ＭＣＰ−１抗体と結合したファージを溶出し
た。回収後に１Ｍトリス塩酸（ｐＨ９．１）で中和し
た。得られたファージを大腸菌Ｋ９１ｋａｎ（ネイチャ
ー・バイオテクノロジー、１６巻、２６７〜２７０頁、
１９９８年発行。）に感染・増殖させた。パンニングに
用いる各種抗ＭＣＰ−１抗体量を５μｇ、１μｇと減ら
しながら同じ操作を繰り返し、より強く特異的に抗ＭＣ
Ｐ−１抗体と結合するファージクローンを選別した。

【００２７】得られた約１００個のファージクローンに
ついてＥＬＩＳＡ法による一次スクリーニングを行っ
た。ＥＬＩＳＡ用プレート（住友ベークライト社製）に
各種抗ＭＣＰ−１抗体 １００ｎｇ／４０μｌ／穴を用
いて４℃で一晩コーテイングした。１％ＢＳＡ（ウシ血
清アルブミン、シグマ社製）を含むＴＢＳ１００μｌを
用いて室温で２時間ブロッキングした。０．５％トウイ
ーン２０を含むＴＢＳでプレートを洗浄し、各種ファー
ジクローン２×１０¹⁰ビリオン／４０μｌ／穴およびビ
オチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体（ファルマシア社
製）４０ｎｇ／４０μｌ／穴を添加した。１０００分の
１に希釈したアルカリホスファターゼ（ＡＰ）標識スト
レプトアビジン（ベクターラボ社製）を室温で１時間反
応させ、洗浄後に基質であるｐ−ニトロフェニルリン酸
ナトリウム６水和物（和光純薬）を添加し、４０５ｎｍ
における吸光度を測定した。７個のクローンが抗ＭＣＰ
−１抗体と特異的に結合した。

【００２８】さらに、抗ＭＣＰ−１抗体と特異的に結合
した７個のファージクローンについて、それぞれのＧ３
Ｐ体（すなわち各ペプチドミミックスとジーン３蛋白質
との融合体）を福本らの報告（上記）に準じて精製し
た。

【００２９】（２） パンニングにより選択したファー
ジに挿入されているＤＮＡの配列解析 ジーン３蛋白質に組み込まれた各種ペプチドミミックス
のＤＮＡ配列をＤＮＡシークエンサー（Applied Biosys
tems社製の３７３Ａ−３６Ｓ型）を用いて解析した。プ
ライマーとして以下の塩基配列を有する合成オリゴヌク
レオチドを用いた。 TGAATTTTCT GTATGAGG （配列表配列番号２） 結果、ジーン３蛋白質のアミノ酸配列（配列表配列番号
１）の４番目のＡｌａと５番目のＧｌｙの間に挿入され
ているペプチドミミックスは配列表配列番号３または配
列表配列番号４で示されるアミノ酸配列を有するものの
２種類に分類できた。配列表配列番号３で示されるアミ
ノ酸配列を有するペプチドミミックスが挿入されている
ファージクローンの代表的なものとしてＣ２７ファー
ジ、配列表配列番号４で示されるアミノ酸配列を有する
ペプチドミミックスが挿入されているファージクローン
の代表的なものとしてＧ２５ファージをそれぞれ得た。
尚、便宜上、上記ファージ由来の挿入されたペプチドミ
ミックスはその由来に因んでそれぞれＣ２７ミミック
ス、Ｇ２５ミミックスと、さらにそれらのペプチドミミ
ックスが挿入されているジーン３蛋白質（Ｇ３Ｐ体）を
それぞれＣ２７−Ｇ３Ｐ、Ｇ２５−Ｇ３Ｐという。

【００３０】同定された二種類のペプチドミミックスの
アミノ酸配列には明確な共通配列は見当たらなかった。
さらにジーンワークス（帝人）あるいはＰＩＭＡ法によ
りこれらのミミックスとＭＣＰ−１とのホモロジー検索
を行ったが、一次配列に類似性を示さなかった。Ｃ２
７、Ｇ２５ミミックスは２個のシステイン残基を有して
いた。

【００３１】実験例１ 各種抗ＭＣＰ−１抗体（Ｍ２７９、Ｅ１１、Ｆ９）、マ
ウスＩｇＧ１κモノクローナル抗体（ＭＯＰＣ−２１、
ファーミンゲン製）を用いて、実施例１で得られたファ
ージクローンとの反応性を確認した。分析は実施例１の
ＥＬＩＳＡ法によった。その結果、いずれのミミックス
とも抗ＭＣＰ−１抗体とは特異的に結合したが、ＩｇＧ
１κ抗体とは反応しなかった。結果を表１に示す。

【００３２】

【表１】

【００３３】実験例２ ファージクローンのＭＣＰ−１受容体への結合活性をＦ
ＡＣＳにより確認した。ＭＣＰ−１受容体発現細胞とし
て、ＴＨＰ−１細胞（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７
４（８），４６４６〜５４頁，１９９９年発行による）
を用いた。ＴＨＰ−１細胞（５×１０⁵）をマウスＩｇ
Ｇ ４００μｇ／ｍｌと１時間反応して、Ｆｃ受容体を
ブロックした。このものは、抗ＣＣＲ２モノクローナル
抗体と反応することを別途確認した。２％ＦＣＳ、０．
１％ＮａＮ₃を含むＰＢＳで洗浄し、ＭＣＰ−１を２０
μｇ／ｍｌ加え、あるいは加えないで１時間反応させ
た。細胞を洗浄し、各種ファージクローン３．３×１０
¹³ビリオン／ｍｌを加えて1時間反応させた。細胞を洗
浄し、ビオチン化抗Ｍ１３モノクローナル抗体３３μｇ
／ｍｌを加えて３０分間反応し、ＦＩＴＣ標識ストレプ
トアビジン（ラインコ社製）を用いて検出した。反応は
氷上で行った。分析はコールターＥＰＩＣＳ ＸＬによ
った。Ｌ４ファージ（抗ＭＣＰ−１抗体との結合性を有
しないファージ）を対照ファージクローンとして用い
た。結果を表２に示す。

【００３４】

【表２】

【００３５】Ｃ２７ファージ、Ｇ２５ファージはＴＨＰ
−１細胞に結合し、ＭＣＰ−１でその結合が阻害される
ことが判明した。

【００３６】実験例３ ファージクローンの単球遊走阻害活性をケモタキス阻害
分析法を用いて確認した。分析には４８穴ケモタキス・
チャンバーと孔径５μｍのポリカルボネート・フィルタ
ー（いずれもニューロプローブ社製）を使用した。下層
チャンバーに１０ｎＭ ＭＣＰ−１を３０μｌ加え、上
層チャンバーにＰＢＭＣ（peripheral blood mononucle
ar cell（末梢血単核細胞）；４×１０⁴／４０μｌ）４
０μｌと各種濃度（１×１０⁶〜１×１０¹⁰ビリオン／
ｍｌ）のファージクローン１０μｌ加えた。３７℃、５
％二酸化炭素下で９０分間反応させた後に、フィルター
をＤｉｆｆ−Ｑｕｉｋで染色し、顕微鏡で遊走細胞を数
えた。結果を表３に示す。

【００３７】

【表３】

【００３８】Ｃ２７ファージ、Ｇ２５ファージはＰＢＭ
Ｃの遊走、すなわち、単球の遊走を阻害することが判明
した。

【００３９】

【発明の効果】本発明のＭＣＰ−１様ペプチドミミック
スは、単球の遊走に密接に関与しているＭＣＰ−１の、
受容体との相互作用を制御・調節することが可能であ
り、単球遊走阻害剤として有用である。炎症反応におけ
るＭＣＰ−１の作用を考えると、本発明のＭＣＰ−１様
ペプチドミミックスは、各種炎症性の疾患に適用可能で
ある。

【００４０】

【配列表フリーテキスト】配列表配列番号２：シークエ
ンシングプライマーとして作用するよう設計されたオリ
ゴヌクレオチド。 配列表配列番号３：抗ＭＣＰ−１抗体によって認識され
るペプチド。 配列表配列番号４：抗ＭＣＰ−１抗体によって認識され
るペプチド。

【００４１】

【配列表】 SPECIMEN SEQUENCE LISTING <110> Yoshitomi Pharmaceutical Industries, Ltd. <120> PEPTIDE MIMICS RECOGNIZED WITH ANTI-MCP-1 ANTIBODY, METHOD FOR PRODUCTION THEREOF AND USE THEREOF <130> A3939 <160> 4 <210> 1 <211> 432 <212> PRT <213> bacteriophage (fd-tet) <400> 1 Val Lys Lys Leu Leu Phe Ala Ile Pro Leu Val Val Pro Phe Tyr Ser -15 -10 -5 His Ser Ala Asp Gly Ala Gly Ala Ala Gly Ala Glu Thr Val Glu Ser 1 5 10 Cys Leu Ala Lys Pro His Thr Glu Asn Ser Phe Thr Asn Val Trp Lys 15 20 25 30 Asp Asp Lys Thr Leu Asp Arg Tyr Ala Asn Tyr Glu Gly Cys Leu Trp 35 40 45 Asn Ala Thr Gly Val Val Val Cys Thr Gly Asp Glu Thr Gln Cys Tyr 50 55 60 Gly Thr Trp Val Pro Ile Gly Leu Ala Ile Pro Glu Asn Glu Gly Gly 65 70 75 Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly 80 85 90 Thr Lys Pro Pro Glu Tyr Gly Asp Thr Pro Ile Pro Gly Tyr Thr Tyr 95 100 105 110 Ile Asn Pro Leu Asp Gly Thr Tyr Pro Pro Gly Thr Glu Gln Asn Pro 115 120 125 Ala Asn Pro Asn Pro Ser Leu Glu Glu Ser Gln Pro Leu Asn Thr Phe 130 135 140 Met Phe Gln Asn Asn Arg Phe Arg Asn Arg Gln Gly Ala Leu Thr Val 145 150 155 Tyr Thr Gly Thr Val Thr Gln Gly Thr Asp Pro Val Lys Thr Tyr Tyr 160 165 170 Gln Tyr Thr Pro Val Ser Ser Lys Ala Met Tyr Asp Ala Tyr Trp Asn 175 180 185 190 Gly Lys Phe Arg Asp Cys Ala Phe His Ser Gly Phe Asn Glu Asn Pro 195 200 205 Phe Val Cys Glu Tyr Gln Gly Gln Ser Ser Asp Leu Pro Gln Pro Pro 210 215 220 Val Asn Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu 225 230 235 Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly Gly Gly Ser Glu Gly 240 245 250 Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Glu Lys 255 260 265 270 Met Ala Asn Ala Asn Lys Gly Ala Met Thr Glu Asn Ala Asp Glu Asn 275 280 285 Ala Leu Gln Ser Asp Ala Lys Gly Lys Leu Asp Ser Val Ala Thr Asp 290 295 300 Tyr Gly Ala Ala Ile Asp Gly Phe Ile Gly Asp Val Ser Gly Leu Ala 305 310 315 Asn Gly Asn Gly Ala Thr Gly Asp Phe Ala Gly Ser Asn Ser Gln Met 320 325 330 Ala Gln Val Gly Asp Gly Asp Asn Ser Pro Leu Met Asn Asn Phe Arg 335 340 345 350 Gln Tyr Leu Pro Ser Leu Pro Gln Ser Val Glu Cys Arg Pro Tyr Val 355 360 365 Phe Gly Ala Gly Lys Pro Tyr Glu Phe Ser Ile Asp Cys Asp Lys Ile 370 375 380 Asn Leu Phe Arg Gly Val Phe Ala Phe Leu Leu Tyr Val Ala Thr Phe 385 390 395 Met Tyr Val Phe Ser Thr Phe Ala Asn Ile Leu Arg Asn Lys Glu Ser 400 405 410 <210> 2 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial sequence <220> <223> Oligonucleotide designed to act as sequencing primer. <400> 2 tgaattttct gtatgagg 18 <210> 3 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide recognized with anti-MCP-1 antibody. <400> 3 Arg Pro Leu Pro Pro Arg Phe Gly Cys Val Pro Leu Gly Cys Leu 1 5 10 15 <210> 4 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial sequence <220> <223> Peptide recognized with anti-MCP-1 antibody. <400> 4 Asn Ser Gly Ser Ile Cys Gly Phe Ser Val Pro Trp Tyr Ser Cys 1 5 10 15

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７ Ａ６１Ｋ 31/00 ６３７Ｅ 38/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ０７Ｋ 14/00 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｄ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｃ１２Ｎ 7/00 // Ｃ１２Ｎ 7/00 Ａ６１Ｋ 37/02 15/09 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA80 CA04 DA20 GA11 HA04 4B064 AG01 CA12 CC24 DA01 4B065 AA98X AB01 BA02 CA24 CA44 4C084 AA02 AA07 AA18 BA01 BA08 BA18 BA41 CA56 NA14 ZA452 ZA592 ZB112 ZB152 ZB262 ZC412 4H045 AA10 AA20 AA30 BA15 BA16 BA17 BA41 CA01 DA01 DA86 EA22 FA74

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−
   １様ペプチドミミックス。
2. 【請求項２】 ＭＣＰ−１のアミノ酸配列とは相同性が
   ない請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミックス。
3. 【請求項３】 ＭＣＰ−１と立体構造が類似している、
   および／またはＭＣＰ−１とその受容体との相互作用を
   制御・調節する請求項１または２記載のＭＣＰ−１様ペ
   プチドミミックス。
4. 【請求項４】 １５残基のアミノ酸配列を有するポリペ
   プチドである請求項１記載のＭＣＰ−１様ペプチドミミ
   ックス。
5. 【請求項５】 以下の(1)または(2)のアミノ酸配列を有
   するポリペプチドである請求項１記載のＭＣＰ−１様ペ
   プチドミミックス。 (1)ＲＰＬＰＰＲＦＧＣＶＰＬＧＣＬ（配列表配列番号
   ３） (2)ＮＳＧＳＩＣＧＦＳＶＰＷＹＳＣ（配列表配列番号
   ４） （Ｒはアルギニンを、Ｐはプロリンを、Ｌはロイシン
   を、Ｆはフェニルアラニンを、Ｇはグリシンを、Ｃはシ
   ステインを、Ｖはバリンを、Ｎはアスパラギンを、Ｓは
   セリンを、Ｉはイソロイシンを、Ｗはトリプトファン
   を、Ｙはチロシンをそれぞれ示す。）
6. 【請求項６】 請求項１〜５のいずれかに記載のＭＣＰ
   −１様ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融合
   体。
7. 【請求項７】 請求項１〜５のいずれかに記載のＭＣＰ
   −１様ペプチドミミックス、あるいは請求項６記載のＭ
   ＣＰ−１様ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融
   合体を有効成分として含有する医薬組成物。
8. 【請求項８】 請求項１〜５のいずれかに記載のＭＣＰ
   −１様ペプチドミミックス、あるいは請求項６記載のＭ
   ＣＰ−１様ペプチドミミックスとジーン３蛋白質との融
   合体を有効成分として含有する単球遊走阻害剤。
9. 【請求項９】 抗ＭＣＰ−１抗体を用いて、ファージラ
   ンダムペプチドライブラリーをスクリーニングし、当該
   抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様ペプチドミ
   ミックスを発現しているファージクローンを単離するこ
   とを含む、抗ＭＣＰ−１抗体と結合し得るＭＣＰ−１様
   ペプチドミミックスの製造方法。