JP2000298129A - ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法 - Google Patents
ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法Info
- Publication number
- JP2000298129A JP2000298129A JP11267130A JP26713099A JP2000298129A JP 2000298129 A JP2000298129 A JP 2000298129A JP 11267130 A JP11267130 A JP 11267130A JP 26713099 A JP26713099 A JP 26713099A JP 2000298129 A JP2000298129 A JP 2000298129A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- compound
- peroxidase
- acid
- substituted
- stabilizing
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 title claims abstract description 47
- 230000000694 effects Effects 0.000 title claims abstract description 44
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 28
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 title claims abstract description 23
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 title claims abstract description 22
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 title claims abstract description 18
- 239000002253 acid Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 150000001412 amines Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- 150000003573 thiols Chemical class 0.000 claims abstract description 12
- RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N Diethyl ether Chemical compound CCOCC RTZKZFJDLAIYFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 9
- 150000001408 amides Chemical class 0.000 claims abstract description 7
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000001424 substituent group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 7
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 150000002148 esters Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims abstract description 6
- 150000002367 halogens Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims abstract description 6
- 125000000449 nitro group Chemical class [O-][N+](*)=O 0.000 claims abstract description 6
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims abstract description 6
- 125000003107 substituted aryl group Chemical group 0.000 claims abstract description 6
- 125000000026 trimethylsilyl group Chemical group [H]C([H])([H])[Si]([*])(C([H])([H])[H])C([H])([H])[H] 0.000 claims abstract description 6
- BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M sulfonate Chemical compound [O-]S(=O)=O BDHFUVZGWQCTTF-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims abstract description 5
- 125000002485 formyl group Chemical class [H]C(*)=O 0.000 claims abstract 3
- 108010001336 Horseradish Peroxidase Proteins 0.000 claims description 49
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 31
- 102000036675 Myoglobin Human genes 0.000 claims description 30
- 108010062374 Myoglobin Proteins 0.000 claims description 30
- -1 arylboronic acid compound Chemical group 0.000 claims description 20
- QBLFZIBJXUQVRF-UHFFFAOYSA-N (4-bromophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=C(Br)C=C1 QBLFZIBJXUQVRF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 14
- 150000001543 aryl boronic acids Chemical class 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 11
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 9
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 9
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 9
- IBTSWKLSEOGJGJ-UHFFFAOYSA-N (3-acetamidophenyl)boronic acid Chemical compound CC(=O)NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 IBTSWKLSEOGJGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 claims description 4
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 claims description 4
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 claims description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims description 3
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims description 3
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 3
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 claims description 3
- 230000002335 preservative effect Effects 0.000 claims description 3
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 claims description 3
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 claims description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 claims description 2
- ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N Phosphorous acid Chemical class OP(O)=O ABLZXFCXXLZCGV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 2
- 150000007513 acids Chemical class 0.000 claims 1
- 230000003053 immunization Effects 0.000 claims 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 claims 1
- 150000003871 sulfonates Chemical class 0.000 claims 1
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 abstract description 22
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 5
- UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M phosphonate Chemical compound [O-]P(=O)=O UEZVMMHDMIWARA-UHFFFAOYSA-M 0.000 abstract description 4
- 239000003381 stabilizer Substances 0.000 description 32
- 102000013415 peroxidase activity proteins Human genes 0.000 description 31
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 23
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 21
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 15
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 15
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 15
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 108010090804 Streptavidin Proteins 0.000 description 10
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 9
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 9
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 description 8
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N cholesterol Chemical compound C1C=C2C[C@@H](O)CC[C@]2(C)[C@@H]2[C@@H]1[C@@H]1CC[C@H]([C@H](C)CCCC(C)C)[C@@]1(C)CC2 HVYWMOMLDIMFJA-DPAQBDIFSA-N 0.000 description 8
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 8
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 8
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 8
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 8
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 7
- JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N octhilinone Chemical compound CCCCCCCCN1SC=CC1=O JPMIIZHYYWMHDT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000008057 potassium phosphate buffer Substances 0.000 description 7
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- PLVCYMZAEQRYHJ-UHFFFAOYSA-N (2-bromophenyl)boronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1Br PLVCYMZAEQRYHJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N N,N-Dimethylformamide Chemical compound CN(C)C=O ZMXDDKWLCZADIW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N Phenytoin Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C1(C=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 CXOFVDLJLONNDW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 6
- 229960002036 phenytoin Drugs 0.000 description 6
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 6
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 6
- 229960003604 testosterone Drugs 0.000 description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 description 5
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 5
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 5
- JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N succinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate Chemical compound C1CC(CN2C(C=CC2=O)=O)CCC1C(=O)ON1C(=O)CCC1=O JJAHTWIKCUJRDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 5
- MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N Testostosterone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@H](CC4)O)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 MUMGGOZAMZWBJJ-DYKIIFRCSA-N 0.000 description 4
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 4
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 4
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 4
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 4
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 4
- 235000012000 cholesterol Nutrition 0.000 description 4
- 229940127121 immunoconjugate Drugs 0.000 description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 4
- HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N phenylboronic acid Chemical compound OB(O)C1=CC=CC=C1 HXITXNWTGFUOAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 2-acetylsulfanylacetate Chemical compound CC(=O)SCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O FLCQLSRLQIPNLM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 2-(3,4-dimethoxyphenyl)-5-hydroxy-7-methoxychromen-4-one Chemical compound C=1C(OC)=CC(O)=C(C(C=2)=O)C=1OC=2C1=CC=C(OC)C(OC)=C1 HIXDQWDOVZUNNA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000035195 Peptidases Human genes 0.000 description 3
- 108091005804 Peptidases Proteins 0.000 description 3
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 3
- 125000000751 azo group Chemical class [*]N=N[*] 0.000 description 3
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 3
- 230000007423 decrease Effects 0.000 description 3
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 3
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 3
- HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N luminol Chemical class O=C1NNC(=O)C2=C1C(N)=CC=C2 HWYHZTIRURJOHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000027756 respiratory electron transport chain Effects 0.000 description 3
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 4-aminoantipyrine Chemical compound CN1C(C)=C(N)C(=O)N1C1=CC=CC=C1 RLFWWDJHLFCNIJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108700020962 Peroxidase Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N boronic acid Chemical compound OBO ZADPBFCGQRWHPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000747 cardiac effect Effects 0.000 description 2
- 238000002967 competitive immunoassay Methods 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 229940024999 proteolytic enzymes for treatment of wounds and ulcers Drugs 0.000 description 2
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 2
- 239000012086 standard solution Substances 0.000 description 2
- 239000010409 thin film Substances 0.000 description 2
- LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K tripotassium phosphate Chemical compound [K+].[K+].[K+].[O-]P([O-])([O-])=O LWIHDJKSTIGBAC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 2
- UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-(2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl)pentanoylamino]hexanoate Chemical compound S1CC2NC(=O)NC2C1CCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O UVGHPGOONBRLCX-NJSLBKSFSA-N 0.000 description 1
- ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N (2,5-dioxopyrrolidin-1-yl) 6-[6-[5-[(3as,4s,6ar)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]hexanoylamino]hexanoate Chemical compound C([C@H]1[C@H]2NC(=O)N[C@H]2CS1)CCCC(=O)NCCCCCC(=O)NCCCCCC(=O)ON1C(=O)CCC1=O ATYCFNRXENKXSE-MHPIHPPYSA-N 0.000 description 1
- SNUSZUYTMHKCPM-UHFFFAOYSA-N 1-hydroxypyridin-2-one Chemical compound ON1C=CC=CC1=O SNUSZUYTMHKCPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940046305 5-bromo-5-nitro-1,3-dioxane Drugs 0.000 description 1
- FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 8-anilinonaphthalene-1-sulfonic acid Chemical compound C=12C(S(=O)(=O)O)=CC=CC2=CC=CC=1NC1=CC=CC=C1 FWEOQOXTVHGIFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101710132601 Capsid protein Proteins 0.000 description 1
- 241001227713 Chiron Species 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000018832 Cytochromes Human genes 0.000 description 1
- 108010052832 Cytochromes Proteins 0.000 description 1
- QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N Dicylcohexylcarbodiimide Chemical compound C1CCCCC1N=C=NC1CCCCC1 QOSSAOTZNIDXMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N Digoxin Natural products O([C@H]1[C@H](C)O[C@H](O[C@@H]2C[C@@H]3[C@@](C)([C@@H]4[C@H]([C@]5(O)[C@](C)([C@H](O)C4)[C@H](C4=CC(=O)OC4)CC5)CC3)CC2)C[C@@H]1O)[C@H]1O[C@H](C)[C@@H](O[C@H]2O[C@@H](C)[C@H](O)[C@@H](O)C2)[C@@H](O)C1 LTMHDMANZUZIPE-AMTYYWEZSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 description 1
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 description 1
- 102000003864 Human Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010082302 Human Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- 102000004882 Lipase Human genes 0.000 description 1
- 108090001060 Lipase Proteins 0.000 description 1
- 239000004367 Lipase Substances 0.000 description 1
- 208000008167 Magnesium Deficiency Diseases 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N N-Hydroxysuccinimide Chemical compound ON1C(=O)CCC1=O NQTADLQHYWFPDB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 1
- 150000008061 acetanilides Chemical class 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 206010000891 acute myocardial infarction Diseases 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000003125 aqueous solvent Substances 0.000 description 1
- 150000004982 aromatic amines Chemical class 0.000 description 1
- 239000000022 bacteriostatic agent Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 150000001555 benzenes Chemical group 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 230000000975 bioactive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 229910021538 borax Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000001642 boronic acid derivatives Chemical class 0.000 description 1
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Substances BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 1
- XVBRCOKDZVQYAY-UHFFFAOYSA-N bronidox Chemical compound [O-][N+](=O)C1(Br)COCOC1 XVBRCOKDZVQYAY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 159000000007 calcium salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- 239000004568 cement Substances 0.000 description 1
- 239000003610 charcoal Substances 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N chloroacetamide Chemical compound NC(=O)CCl VXIVSQZSERGHQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001840 cholesterol esters Chemical class 0.000 description 1
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 1
- NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N cyclohexanecarboxylic acid Chemical compound OC(=O)C1CCCCC1 NZNMSOFKMUBTKW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N danazol Chemical compound C1[C@]2(C)[C@H]3CC[C@](C)([C@](CC4)(O)C#C)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=CC2=C1C=NO2 POZRVZJJTULAOH-LHZXLZLDSA-N 0.000 description 1
- 229960000766 danazol Drugs 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000001627 detrimental effect Effects 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N digoxin Chemical compound C1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](C)O[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](C)O[C@@H](O[C@@H]2[C@H](O[C@@H](O[C@@H]3C[C@@H]4[C@]([C@@H]5[C@H]([C@]6(CC[C@@H]([C@@]6(C)[C@H](O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)C[C@@H]2O)C)C[C@@H]1O LTMHDMANZUZIPE-PUGKRICDSA-N 0.000 description 1
- 229960005156 digoxin Drugs 0.000 description 1
- LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N digoxine Natural products C1C(O)C(O)C(C)OC1OC1C(C)OC(OC2C(OC(OC3CC4C(C5C(C6(CCC(C6(C)C(O)C5)C=5COC(=O)C=5)O)CC4)(C)CC3)CC2O)C)CC1O LTMHDMANZUZIPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N disodium;3,7-dioxido-2,4,6,8,9-pentaoxa-1,3,5,7-tetraborabicyclo[3.3.1]nonane Chemical compound [Na+].[Na+].O1B([O-])OB2OB([O-])OB1O2 UQGFMSUEHSUPRD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001035 drying Methods 0.000 description 1
- 239000012149 elution buffer Substances 0.000 description 1
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006911 enzymatic reaction Methods 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 235000011187 glycerol Nutrition 0.000 description 1
- 238000007756 gravure coating Methods 0.000 description 1
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 description 1
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 230000036046 immunoreaction Effects 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 235000019421 lipase Nutrition 0.000 description 1
- JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N m-aminophenylboronic acid Chemical compound NC1=CC=CC(B(O)O)=C1 JMZFEHDNIAQMNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000004764 magnesium deficiency Nutrition 0.000 description 1
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 230000004060 metabolic process Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- HUMMCEUVDBVXTQ-UHFFFAOYSA-N naphthalen-1-ylboronic acid Chemical compound C1=CC=C2C(B(O)O)=CC=CC2=C1 HUMMCEUVDBVXTQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000001624 naphthyl group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 1
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 1
- 150000002978 peroxides Chemical class 0.000 description 1
- 150000002989 phenols Chemical class 0.000 description 1
- 125000001997 phenyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(*)C([H])=C1[H] 0.000 description 1
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910000160 potassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011009 potassium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 235000004252 protein component Nutrition 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 239000012088 reference solution Substances 0.000 description 1
- 230000004044 response Effects 0.000 description 1
- 238000012552 review Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 1
- 235000010339 sodium tetraborate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004328 sodium tetraborate Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 238000005507 spraying Methods 0.000 description 1
- 230000007480 spreading Effects 0.000 description 1
- 238000003892 spreading Methods 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 1
- 150000003626 triacylglycerols Chemical class 0.000 description 1
- 238000009827 uniform distribution Methods 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/0004—Oxidoreductases (1.)
- C12N9/0065—Oxidoreductases (1.) acting on hydrogen peroxide as acceptor (1.11)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/96—Stabilising an enzyme by forming an adduct or a composition; Forming enzyme conjugates
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
(57)【要約】 （修正有）
【課題】免疫分析法等の分析法で使用するペルオキシダ
ーゼ及び生物活性分子のような他の分子に結合したペル
オキシダーゼの安定化方法の提供。 【解決手段】ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化
合物の安定化法であって、置換されていないか、又はア
ルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる
置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミ
ン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオ
ール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホ
ネート、ホスホネート、及びトリメチルシリルよりなる
群から選択される１つ又はそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも１種のアリールボロン酸化物を、当該免
疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、ペルオキシ
ターゼ活性を有する化合物を添加する上記方法。
ーゼ及び生物活性分子のような他の分子に結合したペル
オキシダーゼの安定化方法の提供。 【解決手段】ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化
合物の安定化法であって、置換されていないか、又はア
ルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる
置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換アミ
ン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオ
ール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホ
ネート、ホスホネート、及びトリメチルシリルよりなる
群から選択される１つ又はそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも１種のアリールボロン酸化物を、当該免
疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、ペルオキシ
ターゼ活性を有する化合物を添加する上記方法。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、分析法で使用する
ための、ペルオキシダーゼ、および生物活性分子のよう
な他の分子に結合したペルオキシダーゼを安定化するた
めの方法に関する。
ための、ペルオキシダーゼ、および生物活性分子のよう
な他の分子に結合したペルオキシダーゼを安定化するた
めの方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】ペルオキシダーゼ特に西洋ワサビペルオ
キシダーゼ（ＨＲＰ）は、免疫測定法を含む分析法で一
般的に使用される酵素である。多くのフォーマットが知
られており、抗原、抗体、ハプテン、および他のアナラ
イトの測定のために広く使用されている。いくつかの例
は競合法及び免疫測定法である。競合的免疫測定法の場
合、標識アナライトは、固定化されたアナライト結合分
子種への結合について試料中のアナライトと競合する。
すなわち試料中のアナライトの濃度を増加させると、固
定化される標識アナライトが減少する。免疫測定法の場
合、標識アナライト結合物質は、試料中のアナライトお
よび固定化アナライト結合物質と複合体を形成する。こ
のタイプの測定法では、試料中のアナライトの濃度を上
昇させると、固定化される標識アナライト結合物質が増
加する。どちらのタイプの免疫測定法でも、固定化標識
アナライトを非結合標識アナライトから分離し、固定化
または非結合ＨＲＰ活性を測定する。
キシダーゼ（ＨＲＰ）は、免疫測定法を含む分析法で一
般的に使用される酵素である。多くのフォーマットが知
られており、抗原、抗体、ハプテン、および他のアナラ
イトの測定のために広く使用されている。いくつかの例
は競合法及び免疫測定法である。競合的免疫測定法の場
合、標識アナライトは、固定化されたアナライト結合分
子種への結合について試料中のアナライトと競合する。
すなわち試料中のアナライトの濃度を増加させると、固
定化される標識アナライトが減少する。免疫測定法の場
合、標識アナライト結合物質は、試料中のアナライトお
よび固定化アナライト結合物質と複合体を形成する。こ
のタイプの測定法では、試料中のアナライトの濃度を上
昇させると、固定化される標識アナライト結合物質が増
加する。どちらのタイプの免疫測定法でも、固定化標識
アナライトを非結合標識アナライトから分離し、固定化
または非結合ＨＲＰ活性を測定する。
【０００３】分析法（例えば、免疫測定法）で使用され
る試薬は、製造、出荷、および保存期間後活性を維持し
なければならない。この期間、これらは、活性に影響を
与える比較的高温度または低温度にさらされることがあ
る。従ってペルオキシダーゼ標識物質または他の活性な
生物学的成分を含有する安定な試薬を提供することは商
業的に有利である。これは、多くの生物学的物質では容
易には達成されない。例えば酵素標識分子および他の複
雑な生物学的分子は、免疫測定法に広く使用されてお
り、酵素または活性分子の活性（特に、免疫測定法で使
用される低濃度では）は時間とともに低下することがあ
る。保存温度が上昇すると、生物活性は一層急速に低下
することがわかっている。酵素または活性分子に結合し
た酵素の活性の低下を遅らせるか防止する１つの方法
は、安定化を達成するのに充分な量で溶液中の酵素に安
定剤を添加することである。
る試薬は、製造、出荷、および保存期間後活性を維持し
なければならない。この期間、これらは、活性に影響を
与える比較的高温度または低温度にさらされることがあ
る。従ってペルオキシダーゼ標識物質または他の活性な
生物学的成分を含有する安定な試薬を提供することは商
業的に有利である。これは、多くの生物学的物質では容
易には達成されない。例えば酵素標識分子および他の複
雑な生物学的分子は、免疫測定法に広く使用されてお
り、酵素または活性分子の活性（特に、免疫測定法で使
用される低濃度では）は時間とともに低下することがあ
る。保存温度が上昇すると、生物活性は一層急速に低下
することがわかっている。酵素または活性分子に結合し
た酵素の活性の低下を遅らせるか防止する１つの方法
は、安定化を達成するのに充分な量で溶液中の酵素に安
定剤を添加することである。
【０００４】ペルオキシダーゼまたはＨＲＰの安定化法
には、ポリエチレングリコールおよびカルシウム塩の添
加（米国特許第４，７２８，０２３号）；８−アニリノ
−ｌ−ナフタレンスルホン酸の添加（ＦＲＧ特許第３，
１００，０７６号）；フェノールおよびＣ1 −Ｃ3 低級
アルキル、塩素および臭素からの１つまたはそれ以上の
置換基を有する置換フェノールの添加（米国特許第４，
７６４，４６８号）；４−アミノアンチピリンの添加
（ヨーロッパ特許第０７０，９９２号）；III 族および
IV族の多価イオンの添加（米国特許第４，１６９，０１
２号）および４−ヒドロキシまたは４−アルコキシアリ
ールアセトアミドの添加（米国特許第５，３７２，９３
２号）がある。ＨＲＰおよび他の生物学的分子の両方の
安定化は、少なくとも１つのヒドロキシル基およびハメ
ット（Hammett ）シグマ値（σｐ）−０．２０≦ｘ≧＋
０．２４の基またはアミドで置換されたベンゼン環を有
する化合物の添加（米国特許第５，５１６，６７２号）
により達成される。
には、ポリエチレングリコールおよびカルシウム塩の添
加（米国特許第４，７２８，０２３号）；８−アニリノ
−ｌ−ナフタレンスルホン酸の添加（ＦＲＧ特許第３，
１００，０７６号）；フェノールおよびＣ1 −Ｃ3 低級
アルキル、塩素および臭素からの１つまたはそれ以上の
置換基を有する置換フェノールの添加（米国特許第４，
７６４，４６８号）；４−アミノアンチピリンの添加
（ヨーロッパ特許第０７０，９９２号）；III 族および
IV族の多価イオンの添加（米国特許第４，１６９，０１
２号）および４−ヒドロキシまたは４−アルコキシアリ
ールアセトアミドの添加（米国特許第５，３７２，９３
２号）がある。ＨＲＰおよび他の生物学的分子の両方の
安定化は、少なくとも１つのヒドロキシル基およびハメ
ット（Hammett ）シグマ値（σｐ）−０．２０≦ｘ≧＋
０．２４の基またはアミドで置換されたベンゼン環を有
する化合物の添加（米国特許第５，５１６，６７２号）
により達成される。
【０００５】現在公知の添加物は、ペルオキシダーゼお
よび他の生物学的分子の安定性を改良するが、さらなる
改良に対するニーズがある。特に試薬の輸送の間に遭遇
する室温および高温での安定性が改良された試薬調製物
が好ましい。既知の添加物のあるものは、分析試薬調製
物でしばしば使用され、かつ免疫測定法で使用される免
疫反応に影響を与えることがあるタンパク質および他の
成分と相互作用し得る。調製物の活性成分を安定化し、
他の成分に対して有害な作用を有さない添加物もまた好
ましい。
よび他の生物学的分子の安定性を改良するが、さらなる
改良に対するニーズがある。特に試薬の輸送の間に遭遇
する室温および高温での安定性が改良された試薬調製物
が好ましい。既知の添加物のあるものは、分析試薬調製
物でしばしば使用され、かつ免疫測定法で使用される免
疫反応に影響を与えることがあるタンパク質および他の
成分と相互作用し得る。調製物の活性成分を安定化し、
他の成分に対して有害な作用を有さない添加物もまた好
ましい。
【０００６】水溶液中の有機ホウ素化合物は、多くの分
子と強く相互作用する。多くの異なる機構による相互作
用は、種々の物質の精製に使用されている。例えば固体
支持体に結合した３−アミノフェニルボロン酸は、糖タ
ンパク質の分画で使用される。有機ホウ酸塩は、多くの
酵素を阻害し、動物の代謝に影響を与えることがあり、
そして認識された静菌剤である（総合的な総説について
は、生物学的分離におけるボロン酸塩リガンド（Borona
te Ligands in Biochemical Separations ）、アミコン
・コーポレーション（Amicon Corporation）、Danvers
、刊行物５０７、１９８１、を参照されたい）。有機
ホウ素化合物はまた、単独でまたはフェノール性もしく
は芳香族アミンエンハンサー（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２
３０６０）と組合せたＨＲＰ（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１
６１９５）により触媒される化学発光反応からの光の出
力を増加させることもわかっている。
子と強く相互作用する。多くの異なる機構による相互作
用は、種々の物質の精製に使用されている。例えば固体
支持体に結合した３−アミノフェニルボロン酸は、糖タ
ンパク質の分画で使用される。有機ホウ酸塩は、多くの
酵素を阻害し、動物の代謝に影響を与えることがあり、
そして認識された静菌剤である（総合的な総説について
は、生物学的分離におけるボロン酸塩リガンド（Borona
te Ligands in Biochemical Separations ）、アミコン
・コーポレーション（Amicon Corporation）、Danvers
、刊行物５０７、１９８１、を参照されたい）。有機
ホウ素化合物はまた、単独でまたはフェノール性もしく
は芳香族アミンエンハンサー（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／２
３０６０）と組合せたＨＲＰ（ＰＣＴ公報ＷＯ９３／１
６１９５）により触媒される化学発光反応からの光の出
力を増加させることもわかっている。
【０００７】有機ホウ素化合物はまた、電子移動電極で
使用されている（ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０２８６１）。
アリールボロン酸は、有機ホウ素群内の化合物のファミ
リーである。アリールボロン酸は、タンパク質分解酵素
を含有する液体界面活性剤の調製物で使用されている
（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１９７０７）。高濃度のアリー
ルボロン酸では、タンパク質分解酵素は、界面活性剤調
製物の他のタンパク質成分を分解することが妨害され
る。洗浄水での以後の希釈において、タンパク質分解酵
素は再度活性になる。
使用されている（ＰＣＴ公報ＷＯ８５／０２８６１）。
アリールボロン酸は、有機ホウ素群内の化合物のファミ
リーである。アリールボロン酸は、タンパク質分解酵素
を含有する液体界面活性剤の調製物で使用されている
（ＰＣＴ公報ＷＯ９２／１９７０７）。高濃度のアリー
ルボロン酸では、タンパク質分解酵素は、界面活性剤調
製物の他のタンパク質成分を分解することが妨害され
る。洗浄水での以後の希釈において、タンパク質分解酵
素は再度活性になる。
【０００８】驚くべきことに我々は、アリールボロン酸
化合物は、免疫測定法で使用するための、ペルオキシダ
ーゼ、または別の分子に結合したペルオキシダーゼ（以
後ペルオキシダーゼ標識結合体または結合体と呼ぶ）、
特にＨＲＰまたはＨＲＰ−結合体の活性の低下を遅らせ
るかまたは防止する安定剤として添加することができる
ことを発見した。
化合物は、免疫測定法で使用するための、ペルオキシダ
ーゼ、または別の分子に結合したペルオキシダーゼ（以
後ペルオキシダーゼ標識結合体または結合体と呼ぶ）、
特にＨＲＰまたはＨＲＰ−結合体の活性の低下を遅らせ
るかまたは防止する安定剤として添加することができる
ことを発見した。
【０００９】
【発明が解決しようとする課題】従って、本発明の目的
は、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を含む安
定なペルオキシダーゼ組成物を提供することである。本
発明の第２の目的は、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）
に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添加する
ことを含む、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）の安定化
法を提供することである。本発明の第３の目的は、結合
体試薬に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添
加することによりペルオキシダーゼ標識結合体の安定化
法を提供することである。安定化組成物は、分析法で有
用である。これらは、酵素免疫測定法で特に有用であ
る。
は、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を含む安
定なペルオキシダーゼ組成物を提供することである。本
発明の第２の目的は、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）
に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添加する
ことを含む、ペルオキシダーゼ（特にＨＲＰ）の安定化
法を提供することである。本発明の第３の目的は、結合
体試薬に少なくとも１種のアリールボロン酸化合物を添
加することによりペルオキシダーゼ標識結合体の安定化
法を提供することである。安定化組成物は、分析法で有
用である。これらは、酵素免疫測定法で特に有用であ
る。
【００１０】
【課題を解決するための手段】本発明の１つの実施態様
は、ペルオキシダーゼと、置換されていないか、または
アルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによ
る置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換ア
ミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チ
オール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スル
ホネート、ホスホネート、トリメチルシリルよりなる群
から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物とを含ん
でなる、安定化ペルオキシダーゼ試薬である。本発明の
別の実施態様は、ペルオキシダーゼに、置換されていな
いか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒド
ロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、ア
ミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、
チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エ
ステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチ
ルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上
の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロ
ン酸化合物を、ペルオキシダーゼを安定化するのに有効
な量で添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ活
性の安定化法である。好適な実施態様は、ペルオキシダ
ーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである上記組成物ま
たは方法である。
は、ペルオキシダーゼと、置換されていないか、または
アルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルによ
る置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換ア
ミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チ
オール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スル
ホネート、ホスホネート、トリメチルシリルよりなる群
から選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換され
た、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物とを含ん
でなる、安定化ペルオキシダーゼ試薬である。本発明の
別の実施態様は、ペルオキシダーゼに、置換されていな
いか、またはアルキル、置換アルキル、アリール、ヒド
ロキシルによる置換を除く置換アリール、エーテル、ア
ミン、置換アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、
チオール、チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エ
ステル、スルホネート、ホスホネート、およびトリメチ
ルシリルよりなる群から選択される１つまたはそれ以上
の置換基で置換された、少なくとも１種のアリールボロ
ン酸化合物を、ペルオキシダーゼを安定化するのに有効
な量で添加することを特徴とする、ペルオキシダーゼ活
性の安定化法である。好適な実施態様は、ペルオキシダ
ーゼが西洋ワサビペルオキシダーゼである上記組成物ま
たは方法である。
【００１１】
【発明の実施の形態】本発明は、ＨＲＰの安定剤として
のアリールボロン酸化合物の使用に関する。安定剤は、
式ＡｒＢ（ＯＨ）2 （式中、Ａｒはフェニルまたはナフ
チルである）のアリールボロン酸である。アリール構造
は、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキ
ル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリ
ール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、
ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデ
ヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネー
ト、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される
１つまたはそれ以上の置換基で置換されてよい。置換ま
たは非置換化合物のいくつかの例を以下に示す。
のアリールボロン酸化合物の使用に関する。安定剤は、
式ＡｒＢ（ＯＨ）2 （式中、Ａｒはフェニルまたはナフ
チルである）のアリールボロン酸である。アリール構造
は、置換されていないか、またはアルキル、置換アルキ
ル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く置換アリ
ール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、アミド、
ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導体、アルデ
ヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、ホスホネー
ト、およびトリメチルシリルよりなる群から選択される
１つまたはそれ以上の置換基で置換されてよい。置換ま
たは非置換化合物のいくつかの例を以下に示す。
【００１２】
【化１】 フェニルボロン酸
【００１３】
【化２】 ４−ブロモフェニルボロン酸
【００１４】
【化３】 ３−アセトアミドフェニルボロン酸
【００１５】
【化４】 １−ナフチルボロン酸
【００１６】本発明で使用される好適な化合物は、上記
の４−ブロモフェニルボロン酸、３−アセトアミドフェ
ニルボロン酸、およびフェニルボロン酸である。本発明
の好適な実施態様は、ブロモフェニルボロン酸を含む安
定化ＨＲＰ組成物、またはブロモフェニルボロン酸を使
用するＨＲＰの安定化法である。特に４−ブロモフェニ
ルボロン酸は、好ましい溶解度と適切な安定化作用を示
した。しかし特定の状況に適したアリールボロン酸化合
物の選択法は、当業者に公知であろう。
の４−ブロモフェニルボロン酸、３−アセトアミドフェ
ニルボロン酸、およびフェニルボロン酸である。本発明
の好適な実施態様は、ブロモフェニルボロン酸を含む安
定化ＨＲＰ組成物、またはブロモフェニルボロン酸を使
用するＨＲＰの安定化法である。特に４−ブロモフェニ
ルボロン酸は、好ましい溶解度と適切な安定化作用を示
した。しかし特定の状況に適したアリールボロン酸化合
物の選択法は、当業者に公知であろう。
【００１７】アリールボロン酸安定剤は、任意の所望の
時点でペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体
に添加することができる。試薬成分、安定剤自体および
ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体、なら
びに種々の他の部分の測定試薬は、固体型または溶解型
で存在してもよい。安定剤は、安定化を達成するのに充
分な量で添加すべきである。好ましくは安定剤は、０．
０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（質量／体
積）（％w/v ）である量で添加される。
時点でペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体
に添加することができる。試薬成分、安定剤自体および
ペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体、なら
びに種々の他の部分の測定試薬は、固体型または溶解型
で存在してもよい。安定剤は、安定化を達成するのに充
分な量で添加すべきである。好ましくは安定剤は、０．
０１％〜０．５％、好ましくは約０．１％（質量／体
積）（％w/v ）である量で添加される。
【００１８】本発明の１つの実施態様において、安定剤
のより均一な分布および従って有効範囲の下限に近い添
加の場合により良好な作用が達成されるため、安定剤
は、以後乾燥される液体試薬に加えることができる。例
えばアリールボロン酸化合物は、凍結乾燥する前かまた
は凍結乾燥物質を水性溶媒で復元後に、ペルオキシダー
ゼまたは結合体溶液に添加することができる。後者の場
合は、もちろん溶媒はまず安定剤と混合し次に凍結乾燥
物質に添加してそれを溶解することができる。例えばも
しペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体が、
乾式分析測定要素（例えば薄膜またはスライド要素）の
成分であるなら、被覆プロセスの前に安定剤を被覆溶液
に加えることが好ましいであろう。しかし被覆プロセス
の完了後に安定剤を加えることも企図される。例えば、
噴霧することにより。
のより均一な分布および従って有効範囲の下限に近い添
加の場合により良好な作用が達成されるため、安定剤
は、以後乾燥される液体試薬に加えることができる。例
えばアリールボロン酸化合物は、凍結乾燥する前かまた
は凍結乾燥物質を水性溶媒で復元後に、ペルオキシダー
ゼまたは結合体溶液に添加することができる。後者の場
合は、もちろん溶媒はまず安定剤と混合し次に凍結乾燥
物質に添加してそれを溶解することができる。例えばも
しペルオキシダーゼまたはペルオキシダーゼ結合体が、
乾式分析測定要素（例えば薄膜またはスライド要素）の
成分であるなら、被覆プロセスの前に安定剤を被覆溶液
に加えることが好ましいであろう。しかし被覆プロセス
の完了後に安定剤を加えることも企図される。例えば、
噴霧することにより。
【００１９】ペルオキシダーゼは、生物活性を有するか
または免疫学的に有効な別の分子に結合してもよい。そ
のような分子は本明細書において、「活性分子」と呼
ぶ。活性分子は、分析法で使用することができる分子で
ある。好ましくは該活性分子は、抗体もしくはその断
片、抗原またはハプテン、タンパク質、糖タンパク質、
ペプチド、タンパク質ミメティック、核酸配列、ステロ
イド、ホルモン、または前記いずれかの誘導体、または
前記の２つ以上または組合せから作成される化合物であ
ろう。
または免疫学的に有効な別の分子に結合してもよい。そ
のような分子は本明細書において、「活性分子」と呼
ぶ。活性分子は、分析法で使用することができる分子で
ある。好ましくは該活性分子は、抗体もしくはその断
片、抗原またはハプテン、タンパク質、糖タンパク質、
ペプチド、タンパク質ミメティック、核酸配列、ステロ
イド、ホルモン、または前記いずれかの誘導体、または
前記の２つ以上または組合せから作成される化合物であ
ろう。
【００２０】本発明の実施において、保存剤も加えるこ
とも好ましいことがある。一般的な保存剤には、例えば
２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、クロロアセト
アミド、Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−（Ｎ−１−ヒドロキ
シルメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニ
ル）−尿素、５ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサ
ンがある。７．０に近いかまたはこれより低いｐＨを有
する溶液において、ボロン酸塩は荷電しておらず、疎水
性相互作用および電荷移動相互作用は、多くの分子（特
にタンパク質）に対して強い結合を引き起こす。驚くべ
きことに我々は、この相互作用が生物活性分子に安定化
作用を与えることを見いだした。
とも好ましいことがある。一般的な保存剤には、例えば
２−ヒドロキシピリジン−Ｎ−オキシド、クロロアセト
アミド、Ｎ，Ｎ−メチレン−ビス−（Ｎ−１−ヒドロキ
シルメチル）−２，５−ジオキソ−４−イミダゾリジニ
ル）−尿素、５ブロモ−５−ニトロ−１，３−ジオキサ
ンがある。７．０に近いかまたはこれより低いｐＨを有
する溶液において、ボロン酸塩は荷電しておらず、疎水
性相互作用および電荷移動相互作用は、多くの分子（特
にタンパク質）に対して強い結合を引き起こす。驚くべ
きことに我々は、この相互作用が生物活性分子に安定化
作用を与えることを見いだした。
【００２１】アリールボロン酸が、ペルオキシダーゼ標
識物を含有する試薬に添加されるいくつかの測定法が行
われた。標識リガンドを形成するためにリガンドに結合
されるか、または標識リガンド結合物質を形成するため
にリガンド結合物質に結合されることができる酵素標識
物を使用して、測定を行うことができる。ペルオキシダ
ーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ））のような酵素は好適な標識物である。好適な実施
態様では、酵素はペルオキシダーゼである。この酵素に
は多様な型がある。ＨＲＰは最も好適な型であり、容易
に入手できる。特定の酵素標識物に適した基質を決定す
るのは、当業者の技術の範囲内である。基質は、酵素標
識物により直接作用を受ける物質または標識物の酵素反
応が関与する一連の反応に関与する物質であってよい。
本発明の有効性と利点は、以下の例により例示される。
識物を含有する試薬に添加されるいくつかの測定法が行
われた。標識リガンドを形成するためにリガンドに結合
されるか、または標識リガンド結合物質を形成するため
にリガンド結合物質に結合されることができる酵素標識
物を使用して、測定を行うことができる。ペルオキシダ
ーゼ（例えば、西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲ
Ｐ））のような酵素は好適な標識物である。好適な実施
態様では、酵素はペルオキシダーゼである。この酵素に
は多様な型がある。ＨＲＰは最も好適な型であり、容易
に入手できる。特定の酵素標識物に適した基質を決定す
るのは、当業者の技術の範囲内である。基質は、酵素標
識物により直接作用を受ける物質または標識物の酵素反
応が関与する一連の反応に関与する物質であってよい。
本発明の有効性と利点は、以下の例により例示される。
【００２２】
【実施例】実施例１：ＨＲＰ−抗体結合体の安定化 ピアス・アンド・ワリナー（Pierce and Warriner ）
（チェスター、英国）から得られたスクシニミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−ア
セチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を使用して、モノク
ローナル抗体（ヒト卵胞刺激ホルモンに対して作成し
た）をＨＲＰに結合した。次にＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−Ｎ
ＨＳ（カルビオケム（Calbiochem）、ビーストン（Bees
ton ）、英国）を使用して、ＨＲＰ−抗体結合体をビオ
チン化した。ビオチン化ＨＲＰ−抗体を、溶出緩衝液と
して３００mM塩化ナトリウムを含有する１００mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、製造業者の
プロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ファルマシ
アバイオテク（Pharmacia ）、セントアルバンス（St.
Albans）、英国）で脱塩した。結合体をＵＶ吸収で定量
し、種々の添加物で試験試薬を希釈し、次に２〜８℃ま
たは３７℃で保存した。次に試薬中の結合体の活性を、
ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロ
ウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Orth
o-Clinical Diagnostics）、英国）中の試薬１００μｌ
を、３７℃で１５分インキュベートして試験した。イン
キュベーション中に、ビオチン化ＨＲＰ−抗体結合体
は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応によりマイ
クロウェルの表面に固定化された。マイクロウェルを洗
浄後、固定化ＨＲＰ−抗体複合体の活性を、増強発光反
応（米国特許第５，３７２，９３１号）を使用して測定
した。発光性基質（ルミノール誘導体と過酸塩）と電子
移動物質を含有するＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬
を、マイクロウェルに加えた。結合した結合体中のＨＲ
Ｐは、ルミノール誘導体の酸化を触媒して光を放出す
る。電子移動物質（置換アセトアニリド）は産生される
光のレベルを増加させ、その発光を延長させる。マイク
ロウェルからの光シグナルを、ＡＭＥＲＬＩＴＥアナラ
イザー（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Orth
o-Clinical Diagnostics）、英国）を使用して測定し
た。
（チェスター、英国）から得られたスクシニミジル−４
−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カル
ボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−ア
セチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）を使用して、モノク
ローナル抗体（ヒト卵胞刺激ホルモンに対して作成し
た）をＨＲＰに結合した。次にＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−Ｎ
ＨＳ（カルビオケム（Calbiochem）、ビーストン（Bees
ton ）、英国）を使用して、ＨＲＰ−抗体結合体をビオ
チン化した。ビオチン化ＨＲＰ−抗体を、溶出緩衝液と
して３００mM塩化ナトリウムを含有する１００mMリン酸
カリウム緩衝液（ｐＨ６．０）を使用して、製造業者の
プロトコールに従って、ＰＤ−１０カラム（ファルマシ
アバイオテク（Pharmacia ）、セントアルバンス（St.
Albans）、英国）で脱塩した。結合体をＵＶ吸収で定量
し、種々の添加物で試験試薬を希釈し、次に２〜８℃ま
たは３７℃で保存した。次に試薬中の結合体の活性を、
ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロ
ウェル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Orth
o-Clinical Diagnostics）、英国）中の試薬１００μｌ
を、３７℃で１５分インキュベートして試験した。イン
キュベーション中に、ビオチン化ＨＲＰ−抗体結合体
は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応によりマイ
クロウェルの表面に固定化された。マイクロウェルを洗
浄後、固定化ＨＲＰ−抗体複合体の活性を、増強発光反
応（米国特許第５，３７２，９３１号）を使用して測定
した。発光性基質（ルミノール誘導体と過酸塩）と電子
移動物質を含有するＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬
を、マイクロウェルに加えた。結合した結合体中のＨＲ
Ｐは、ルミノール誘導体の酸化を触媒して光を放出す
る。電子移動物質（置換アセトアニリド）は産生される
光のレベルを増加させ、その発光を延長させる。マイク
ロウェルからの光シグナルを、ＡＭＥＲＬＩＴＥアナラ
イザー（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Orth
o-Clinical Diagnostics）、英国）を使用して測定し
た。
【００２３】前述のビオチン化ＨＲＰ−抗体結合体を
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し
て、１０ng/ml の濃度を得た。マグネシウム欠乏ＫＡＴ
ＨＯＮ（ロームアンドハース（Rohm and Haas ）、英
国）を保存剤（１％w/v ）として添加し、マイクロウェ
ルの表面への結合体の非特異吸着を防ぐためにウシ血清
アルブミン（１％w/v ）を加えた。各アリールボロン酸
安定剤を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２００mg
/ml 溶液として調製し、結合体溶液に加えて安定剤の所
望のモル濃度を得た。結合体溶液を２〜８℃または３７
℃で２時間、２４時間、９６時間、および９週間保存し
た。結合体中のＨＲＰの活性を前記のように測定した。
結果を表１に示す。
０．１Ｍリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で希釈し
て、１０ng/ml の濃度を得た。マグネシウム欠乏ＫＡＴ
ＨＯＮ（ロームアンドハース（Rohm and Haas ）、英
国）を保存剤（１％w/v ）として添加し、マイクロウェ
ルの表面への結合体の非特異吸着を防ぐためにウシ血清
アルブミン（１％w/v ）を加えた。各アリールボロン酸
安定剤を、ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）で２００mg
/ml 溶液として調製し、結合体溶液に加えて安定剤の所
望のモル濃度を得た。結合体溶液を２〜８℃または３７
℃で２時間、２４時間、９６時間、および９週間保存し
た。結合体中のＨＲＰの活性を前記のように測定した。
結果を表１に示す。
【００２４】
【表１】
【００２５】ＨＲＰ活性は、対照光の出力（添加物無し
− ２〜８℃で２時間保存）のパーセントとして表さ
れる光の出力である。表１から、安定剤の非存在下では
３７℃で保存後にＨＲＰの活性は顕著に低下したことが
わかる。ＨＲＰ活性は、２〜８℃でまたはアリールボロ
ン酸化合物の存在下で保存すると保持される。安定剤の
存在下では３７℃で９週間保存後でも、ＨＲＰ活性は初
期活性の５０％を超えている。
− ２〜８℃で２時間保存）のパーセントとして表さ
れる光の出力である。表１から、安定剤の非存在下では
３７℃で保存後にＨＲＰの活性は顕著に低下したことが
わかる。ＨＲＰ活性は、２〜８℃でまたはアリールボロ
ン酸化合物の存在下で保存すると保持される。安定剤の
存在下では３７℃で９週間保存後でも、ＨＲＰ活性は初
期活性の５０％を超えている。
【００２６】実施例２：ＨＲＰ−テストステロン結合体
の安定化 ジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemic
al Co.）、ギリンガム（Gillingham）、英国）とを反応
させて、ＨＲＰをテストステロン−３−カルボキシメチ
ルオキシムに化学結合させた。精製結合体を、１．３％
塩化ナトリウム、２％ショ糖、０．５％マグネシウム欠
乏ＫＡＴＨＯＮ、０．２％ウシ血清アルブミン、および
ステロイド放出剤としての６００μg/l のＤＡＮＡＺＯ
Ｌを含有する５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中６０
ng/ml の濃度に希釈した。結合体溶液を、２５℃で種々
の濃度の４−ブロモフェニルボロン酸の存在下で保存
し、次にＨＲＰ結合体活性を競合的免疫測定法で測定し
た。
の安定化 ジシクロヘキシルカルボジイミドとＮ−ヒドロキシスク
シンイミド（アルドリッチケミカル社（Aldrich Chemic
al Co.）、ギリンガム（Gillingham）、英国）とを反応
させて、ＨＲＰをテストステロン−３−カルボキシメチ
ルオキシムに化学結合させた。精製結合体を、１．３％
塩化ナトリウム、２％ショ糖、０．５％マグネシウム欠
乏ＫＡＴＨＯＮ、０．２％ウシ血清アルブミン、および
ステロイド放出剤としての６００μg/l のＤＡＮＡＺＯ
Ｌを含有する５０mMリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中６０
ng/ml の濃度に希釈した。結合体溶液を、２５℃で種々
の濃度の４−ブロモフェニルボロン酸の存在下で保存
し、次にＨＲＰ結合体活性を競合的免疫測定法で測定し
た。
【００２７】テストステロンに対するモノクローナル抗
体を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス・アンド・ワリ
ナー（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を
使用してビオチン化し、１．３％塩化ナトリウム、７０
mM ＥＤＴＡ、０．５％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯ
Ｎ、１％ヒト血漿、０．０５％正常マウス血清および６
００μg/l のＤＡＮＡＺＯＬを含有する５０mMリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．３）で１０mg/Lに希釈した。チ
ャコールストリップしたヒト血漿（２５μｌ）を、ＶＩ
ＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Cl
inical Diagnostics）、英国）中の５０μｌのＨＲＰ−
テストステロン結合体溶液と１００μｌのビオチン化抗
体溶液とともに、３７℃で３０分インキュベートした。
インキュベーションの間、ＨＲＰ−テストステロン結合
体はビオチン化抗体に結合し、複合体は、ビオチンとス
トレプトアビジンとの反応により、ストレプトアビジン
被覆マイクロウェルの表面に固定化された。マイクロウ
ェルを洗浄後、ＨＲＰ活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシ
グナル試薬を使用してＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉアナライザ
ーで測定した。結果を表２に示す。
体を、ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン（ピアス・アンド・ワリ
ナー（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を
使用してビオチン化し、１．３％塩化ナトリウム、７０
mM ＥＤＴＡ、０．５％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯ
Ｎ、１％ヒト血漿、０．０５％正常マウス血清および６
００μg/l のＤＡＮＡＺＯＬを含有する５０mMリン酸カ
リウム緩衝液（ｐＨ７．３）で１０mg/Lに希釈した。チ
ャコールストリップしたヒト血漿（２５μｌ）を、ＶＩ
ＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Cl
inical Diagnostics）、英国）中の５０μｌのＨＲＰ−
テストステロン結合体溶液と１００μｌのビオチン化抗
体溶液とともに、３７℃で３０分インキュベートした。
インキュベーションの間、ＨＲＰ−テストステロン結合
体はビオチン化抗体に結合し、複合体は、ビオチンとス
トレプトアビジンとの反応により、ストレプトアビジン
被覆マイクロウェルの表面に固定化された。マイクロウ
ェルを洗浄後、ＨＲＰ活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシ
グナル試薬を使用してＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉアナライザ
ーで測定した。結果を表２に示す。
【００２８】
【表２】
【００２９】ＨＲＰ活性は、０日保存の光の出力のパー
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は、２５
℃で２１日間保存後に８３．４％まで低下していた。ブ
ロモフェニルボロン酸量の増加とともに、結合体はより
安定になった。安定剤の非存在下で２６〜２８日間保存
後、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は７７．１％
まで低下していた。再度ブロモフェニルボロン酸量の増
加とともに、結合体はより安定になった。
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は、２５
℃で２１日間保存後に８３．４％まで低下していた。ブ
ロモフェニルボロン酸量の増加とともに、結合体はより
安定になった。安定剤の非存在下で２６〜２８日間保存
後、ＨＲＰ−テストステロン結合体の活性は７７．１％
まで低下していた。再度ブロモフェニルボロン酸量の増
加とともに、結合体はより安定になった。
【００３０】実施例３：ＨＲＰ−抗体／抗原複合体の安
定化 スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−ス
クシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）
を使用して、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）に対するモノ
クローナル抗体にＨＲＰを化学的に結合した。精製ＨＲ
Ｐ結合体を、２．０％塩化ナトリウム、２．０％マグネ
シウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、２．０％ウシ血清アルブミ
ン、および０．０６５μg/ml組換えＨＢｃ（カイロンコ
ーポレーション（Chiron Corporation）、エメリービル
（Emeryville）、カリホルニア州、米国）を含有する２
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）で０．０５
７μg/mlの濃度に希釈した。ＨＲＰ標識抗ＨＢｃ抗体は
ＨＢｃ抗原と結合して、ＨＲＰ標識抗体／抗原複合体を
形成する。溶液を、２５℃または３７℃で４−ブロモフ
ェニルボロン酸の存在下または非存在下で保存し、次に
ＨＲＰ抗体／抗原複合体活性を免疫測定法を使用して測
定した。
定化 スクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロ
ヘキサン−１−カルボキシレート（ＳＭＣＣ）とＮ−ス
クシニミジルＳ−アセチルチオアセテート（ＳＡＴＡ）
を使用して、Ｂ型肝炎コア抗原（ＨＢｃ）に対するモノ
クローナル抗体にＨＲＰを化学的に結合した。精製ＨＲ
Ｐ結合体を、２．０％塩化ナトリウム、２．０％マグネ
シウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、２．０％ウシ血清アルブミ
ン、および０．０６５μg/ml組換えＨＢｃ（カイロンコ
ーポレーション（Chiron Corporation）、エメリービル
（Emeryville）、カリホルニア州、米国）を含有する２
０mMリン酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ６．２）で０．０５
７μg/mlの濃度に希釈した。ＨＲＰ標識抗ＨＢｃ抗体は
ＨＢｃ抗原と結合して、ＨＲＰ標識抗体／抗原複合体を
形成する。溶液を、２５℃または３７℃で４−ブロモフ
ェニルボロン酸の存在下または非存在下で保存し、次に
ＨＲＰ抗体／抗原複合体活性を免疫測定法を使用して測
定した。
【００３１】ヒトＩｇＭに対するモノクローナル抗体を
ＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−ＮＨＳ（カルビオケム（Calbioch
em）、ビーストン（Beeston ）、英国）を使用してビオ
チン化し、０．５％ウシ血清アルブミンと０．９６％マ
グネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する２５mMリン酸カ
リウム／１５mMテトラホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．２）で０．７５mg/lに希釈した。ＨＢｃに対するＩ
ｇＭ抗体を含有するヒト血漿を、０．９％塩化ナトリウ
ム、５％ウシ血清アルブミンおよび１％ＢＲＯＮＩＤＯ
Ｘ（ヘンケル・ケー・ジー（Henkel K. G.）、ドイツ）
を含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液で１／２０に
希釈した。２５μｌの希釈血漿を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣ
ｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリ
ニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnos
tics）、英国）中のビオチン化抗ＩｇＭ抗体溶液１４５
μｌで３７℃で１５分インキュベートした。インキュベ
ーション中に、血漿中のＩｇＭ抗体は、ビオチン化Ｉｇ
Ｍとの反応およびビオチンとストレプトアビジンとの反
応により、ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表
面に固定化される。マイクロウェルを洗浄後、１００μ
ｌのＨＲＰ標識抗体／抗原複合体溶液をマイクロウェル
に加え、３７℃でさらに１５分インキュベートする。こ
の反応中に、複合体中のＨＢｃは、マイクロウェル上に
固定化されたＨＢｃに対する抗体と反応する。マイクロ
ウェルを洗浄後、マイクロウェルの表面に結合したＨＲ
Ｐの活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬を使用
してＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉアナライザーで測定した。結
果を表３に示す。
ＢＩＯＴＩＮ−ＸＸ−ＮＨＳ（カルビオケム（Calbioch
em）、ビーストン（Beeston ）、英国）を使用してビオ
チン化し、０．５％ウシ血清アルブミンと０．９６％マ
グネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する２５mMリン酸カ
リウム／１５mMテトラホウ酸ナトリウム緩衝液（ｐＨ
８．２）で０．７５mg/lに希釈した。ＨＢｃに対するＩ
ｇＭ抗体を含有するヒト血漿を、０．９％塩化ナトリウ
ム、５％ウシ血清アルブミンおよび１％ＢＲＯＮＩＤＯ
Ｘ（ヘンケル・ケー・ジー（Henkel K. G.）、ドイツ）
を含有する１００mMリン酸カリウム緩衝液で１／２０に
希釈した。２５μｌの希釈血漿を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣ
ｉストレプトアビジン被覆マイクロウェル（オーソクリ
ニカルダイアグノスティクス（Ortho-Clinical Diagnos
tics）、英国）中のビオチン化抗ＩｇＭ抗体溶液１４５
μｌで３７℃で１５分インキュベートした。インキュベ
ーション中に、血漿中のＩｇＭ抗体は、ビオチン化Ｉｇ
Ｍとの反応およびビオチンとストレプトアビジンとの反
応により、ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表
面に固定化される。マイクロウェルを洗浄後、１００μ
ｌのＨＲＰ標識抗体／抗原複合体溶液をマイクロウェル
に加え、３７℃でさらに１５分インキュベートする。こ
の反応中に、複合体中のＨＢｃは、マイクロウェル上に
固定化されたＨＢｃに対する抗体と反応する。マイクロ
ウェルを洗浄後、マイクロウェルの表面に結合したＨＲ
Ｐの活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬を使用
してＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉアナライザーで測定した。結
果を表３に示す。
【００３２】
【表３】
【００３３】ＨＲＰ活性は、０日保存の光の出力のパー
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、ＨＲＰ結合体の活性は１週間保存後に１％未満
まで低下していた。０．０１％ブロモフェニルボロン酸
では、結合体は２５℃で１週間保存後にその活性の３８
％を保持し、０．１％ブロモフェニルボロン酸では、２
５℃で１５週間保存後に活性の４５％そして３７℃で１
週間保存後に活性の１５％を保持した。
セントとして表される光の出力である。安定剤の非存在
下では、ＨＲＰ結合体の活性は１週間保存後に１％未満
まで低下していた。０．０１％ブロモフェニルボロン酸
では、結合体は２５℃で１週間保存後にその活性の３８
％を保持し、０．１％ブロモフェニルボロン酸では、２
５℃で１５週間保存後に活性の４５％そして３７℃で１
週間保存後に活性の１５％を保持した。
【００３４】実施例４：乾式薄膜フォーマットで使用さ
れるＨＲＰ結合体 前記したように上記実施例以外に、本発明は乾式免疫測
定分析要素において有用であることが企図される。従っ
て以下の例は、本発明の有利な性質を有する酵素結合体
を与える本発明の実施態様を記載する。アナライト（例
えば、特に限定されないが、グルコース、トリグリセリ
ド、リパーゼ、グリセロール、コレステロール、コレス
テロールエステル）の存在または量を測定するためのＨ
ＲＰを含む乾式分析要素は公知である。ＨＲＰ−結合体
を含む乾式免疫測定分析要素は公知であり、例えばＣ−
反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ジゴキシン、フェニトイ
ンを測定するための免疫測定要素がある。
れるＨＲＰ結合体 前記したように上記実施例以外に、本発明は乾式免疫測
定分析要素において有用であることが企図される。従っ
て以下の例は、本発明の有利な性質を有する酵素結合体
を与える本発明の実施態様を記載する。アナライト（例
えば、特に限定されないが、グルコース、トリグリセリ
ド、リパーゼ、グリセロール、コレステロール、コレス
テロールエステル）の存在または量を測定するためのＨ
ＲＰを含む乾式分析要素は公知である。ＨＲＰ−結合体
を含む乾式免疫測定分析要素は公知であり、例えばＣ−
反応性タンパク質（ＣＲＰ）、ジゴキシン、フェニトイ
ンを測定するための免疫測定要素がある。
【００３５】安定剤は、展開層、下塗層、および／また
は試薬層を含む任意の層またはゾーンに、公知の方法
（例えば、ホッパーおよびグラビア被覆法）を使用して
要素内に導入してもよい。好適な要素では、ＨＲＰと安
定剤は一緒に存在する。コレステロール測定のための、
同じ層中にＨＲＰとアリールボロン酸安定剤を含む分析
要素は、以下の組成およびフォーマットを有するであろ
う：
は試薬層を含む任意の層またはゾーンに、公知の方法
（例えば、ホッパーおよびグラビア被覆法）を使用して
要素内に導入してもよい。好適な要素では、ＨＲＰと安
定剤は一緒に存在する。コレステロール測定のための、
同じ層中にＨＲＰとアリールボロン酸安定剤を含む分析
要素は、以下の組成およびフォーマットを有するであろ
う：
【００３６】
【表４】
【００３７】要素はスライドにマウントし、ストリップ
または他の適当な型で維持し、試験すべき条件下で保存
することができる。対照要素（例えば、新鮮な要素）を
使用してコレステロール標準物質で得られた、反射分光
計を使用して測定される反射密度は、試験条件下で保存
した要素と比較することができる。当業者に公知のよう
に、要素中の安定剤の位置および安定剤の量は所望の安
定性が得られるまで容易に変更することができる。
または他の適当な型で維持し、試験すべき条件下で保存
することができる。対照要素（例えば、新鮮な要素）を
使用してコレステロール標準物質で得られた、反射分光
計を使用して測定される反射密度は、試験条件下で保存
した要素と比較することができる。当業者に公知のよう
に、要素中の安定剤の位置および安定剤の量は所望の安
定性が得られるまで容易に変更することができる。
【００３８】実施例５：フェニトインの検出のための乾
式免疫測定要素 フェニトイン測定のための、同じ層中にフェニトイン−
ＨＲＰ結合体とアリールボロン酸安定剤を含む免疫測定
分析要素は、以下の組成およびフォーマットを有するで
あろう：
式免疫測定要素 フェニトイン測定のための、同じ層中にフェニトイン−
ＨＲＰ結合体とアリールボロン酸安定剤を含む免疫測定
分析要素は、以下の組成およびフォーマットを有するで
あろう：
【００３９】
【表５】
【００４０】上記のように要素はスライドにマウント
し、ストリップまたは他の適当な型で維持し、試験すべ
き条件下で保存することができる。対照要素（例えば、
新鮮な要素）を使用してフェニトイン標準物質で得られ
た反射密度は、試験条件下で保存された要素と比較する
ことができる。当業者に公知のように、要素中の安定剤
の位置および安定剤の量は、所望の安定性が得られるま
で容易に変更することができる。アリールボロン酸化合
物は、上記コレステロール要素以外にアナライトに対す
るＨＲＰを含む乾式分析要素を安定化し、フェニトイン
について上記したもの以外に免疫測定法に対するＨＲＰ
−結合体を含む乾式免疫測定分析要素を安定化するのに
作用するであろう。
し、ストリップまたは他の適当な型で維持し、試験すべ
き条件下で保存することができる。対照要素（例えば、
新鮮な要素）を使用してフェニトイン標準物質で得られ
た反射密度は、試験条件下で保存された要素と比較する
ことができる。当業者に公知のように、要素中の安定剤
の位置および安定剤の量は、所望の安定性が得られるま
で容易に変更することができる。アリールボロン酸化合
物は、上記コレステロール要素以外にアナライトに対す
るＨＲＰを含む乾式分析要素を安定化し、フェニトイン
について上記したもの以外に免疫測定法に対するＨＲＰ
−結合体を含む乾式免疫測定分析要素を安定化するのに
作用するであろう。
【００４１】実施例６−ミオグロビンの安定化 ミオグロビン、ヘモグロビンおよびサイトクロームＣ
は、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
これらのタンパク質の酵素活性は、免疫測定法で使用さ
れており、これらはルミノールと過酸化物との酵素触媒
発光反応により検出されている（ＧＢ特許第２，０６
３，４６９号）。ミオグロビンは、急性心筋梗塞の有用
なマーカーであることが証明されている（米国特許第
５，７４４，３５８号）。ミオグロビンの標準的参照溶
液は、免疫反応によりこのアナライトの測定において使
用され、これらの溶液の安定性はアリールボロン酸化合
物の添加により改良することができる。
は、ペルオキシダーゼ活性を有するタンパク質である。
これらのタンパク質の酵素活性は、免疫測定法で使用さ
れており、これらはルミノールと過酸化物との酵素触媒
発光反応により検出されている（ＧＢ特許第２，０６
３，４６９号）。ミオグロビンは、急性心筋梗塞の有用
なマーカーであることが証明されている（米国特許第
５，７４４，３５８号）。ミオグロビンの標準的参照溶
液は、免疫反応によりこのアナライトの測定において使
用され、これらの溶液の安定性はアリールボロン酸化合
物の添加により改良することができる。
【００４２】ミオグロビンの免疫測定法 ミオグロビンに対する２つのマウスモノクローナル抗体
は、ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacific,
USA）から得られた。ＨＲＰは、ピアス・アンド・ワリ
ナー（Pierce and Warriner ）（チェスター、英国）か
ら得られたスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−
ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセ
テート（ＳＡＴＡ）を使用して、ミオグロビンモノクロ
ーナル抗体の１つに化学的に結合させた。精製したＨＲ
Ｐ結合体を、１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮお
よび０．５％ウシ血清アルブミンを含有する１００mMリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に３μg/mlで希釈し
た。
は、ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacific,
USA）から得られた。ＨＲＰは、ピアス・アンド・ワリ
ナー（Pierce and Warriner ）（チェスター、英国）か
ら得られたスクシニミジル−４−（Ｎ−マレイミドメチ
ル）シクロヘキサン−１−カルボキシレート（スルホ−
ＳＭＣＣ）とＮ−スクシニミジルＳ−アセチルチオアセ
テート（ＳＡＴＡ）を使用して、ミオグロビンモノクロ
ーナル抗体の１つに化学的に結合させた。精製したＨＲ
Ｐ結合体を、１．０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮお
よび０．５％ウシ血清アルブミンを含有する１００mMリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）に３μg/mlで希釈し
た。
【００４３】第２のミオグロビンモノクローナル抗体を
ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（ピアス・アンド・ワリナー
（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を使用
してビオチン化し、５．０％ウシ血清アルブミンと１．
０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する１００mM
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で３μg/mlに希釈
した。ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacifi
c ）、エメリービル（Emeryville）, USA ）から得られ
たヒト心臓ミオグロビンの標準溶液を、１．０％マグネ
シウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミ
ン、１０mM塩化ナトリウムおよび１mM ＥＤＴＡを含有
する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で調
製した。
ビオチン−ＬＣ−ＮＨＳ（ピアス・アンド・ワリナー
（Pierce and Warriner ）、チェスター、英国）を使用
してビオチン化し、５．０％ウシ血清アルブミンと１．
０％マグネシウム欠乏ＫＡＴＨＯＮを含有する１００mM
リン酸カリウム緩衝液（ｐＨ６．５）で３μg/mlに希釈
した。ビオスパシフィック・ユーエスエー（BiosPacifi
c ）、エメリービル（Emeryville）, USA ）から得られ
たヒト心臓ミオグロビンの標準溶液を、１．０％マグネ
シウム欠乏ＫＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミ
ン、１０mM塩化ナトリウムおよび１mM ＥＤＴＡを含有
する１００mMリン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で調
製した。
【００４４】１０μｌの標準ミオグロビン溶液を、ＶＩ
ＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Cl
inical Diagnostics）、英国）中で７０μｌのビオチン
化モノクローナル抗体溶液および７０μｌのＨＲＰ標識
モノクローナル抗体溶液とともに３７℃で８分間インキ
ュベートした。インキュベーションの間に、ビオチン化
抗体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応により
ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化
される。同意に標準溶液中のミオグロビンはビオチン化
抗体に固定化され、またＨＲＰ標識モノクローナル抗体
に結合する。マイクロウェルを洗浄後、マイクロウェル
の表面に結合したＨＲＰの活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣ
ｉアナラーザー中でＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬
を使用して測定した。アナライザー中の光出力として測
定したマイクロウェルに結合したＨＲＰの活性は、測定
中に加えたミオグロビンの免疫反応性に比例する。ミオ
グロビンの免疫反応性に対する光出力の応答曲線を、０
〜１７５７ng/ml の範囲をカバーする一連の標準ミオグ
ロビン溶液を使用して作製した。
ＴＲＯＳ ＥＣｉストレプトアビジン被覆マイクロウェ
ル（オーソクリニカルダイアグノスティクス（Ortho-Cl
inical Diagnostics）、英国）中で７０μｌのビオチン
化モノクローナル抗体溶液および７０μｌのＨＲＰ標識
モノクローナル抗体溶液とともに３７℃で８分間インキ
ュベートした。インキュベーションの間に、ビオチン化
抗体は、ビオチンとストレプトアビジンとの反応により
ストレプトアビジン被覆マイクロウェルの表面に固定化
される。同意に標準溶液中のミオグロビンはビオチン化
抗体に固定化され、またＨＲＰ標識モノクローナル抗体
に結合する。マイクロウェルを洗浄後、マイクロウェル
の表面に結合したＨＲＰの活性を、ＶＩＴＲＯＳ ＥＣ
ｉアナラーザー中でＶＩＴＲＯＳ ＥＣｉシグナル試薬
を使用して測定した。アナライザー中の光出力として測
定したマイクロウェルに結合したＨＲＰの活性は、測定
中に加えたミオグロビンの免疫反応性に比例する。ミオ
グロビンの免疫反応性に対する光出力の応答曲線を、０
〜１７５７ng/ml の範囲をカバーする一連の標準ミオグ
ロビン溶液を使用して作製した。
【００４５】ミオグロビンの安定性 ヒト心臓ミオグロビンを、１．０％マグネシウム欠乏Ｋ
ＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミン、１０mM塩化
ナトリウムおよび１mM ＥＤＴＡを含有する１００mMリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３５０ng/ml の濃
度に溶解した。４−ブロモフェニルボロン酸と３−アセ
トアミドフェニルボロン酸を、それぞれエタノール中の
１００mg/ml 溶液として調製し、ミオグロビン溶液に添
加して安定剤の所望の濃度を得た。次にミオグロビン溶
液を２５℃または３７℃で保存し、１週間および２週間
後免疫反応性ミオグロビンの量を上記の免疫測定法を使
用して測定した。ミオグロビン安定性に及ぼす４−ブロ
モフェニルボロン酸と３−アセトアミドフェニルボロン
酸の影響を表４に示し、４−ブロモフェニルボロン酸の
濃度を変化させることの影響を表５に示す。
ＡＴＨＯＮ、５．０％ウシ血清アルブミン、１０mM塩化
ナトリウムおよび１mM ＥＤＴＡを含有する１００mMリ
ン酸カリウム緩衝液（ｐＨ７．０）で３５０ng/ml の濃
度に溶解した。４−ブロモフェニルボロン酸と３−アセ
トアミドフェニルボロン酸を、それぞれエタノール中の
１００mg/ml 溶液として調製し、ミオグロビン溶液に添
加して安定剤の所望の濃度を得た。次にミオグロビン溶
液を２５℃または３７℃で保存し、１週間および２週間
後免疫反応性ミオグロビンの量を上記の免疫測定法を使
用して測定した。ミオグロビン安定性に及ぼす４−ブロ
モフェニルボロン酸と３−アセトアミドフェニルボロン
酸の影響を表４に示し、４−ブロモフェニルボロン酸の
濃度を変化させることの影響を表５に示す。
【００４６】
【表６】
【００４７】ミオグロビンの免疫反応性は、０日保存時
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週
間保存後に４９％に低下した。０．１２％４−ブロモフ
ェニルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は２５
℃で２週間保存後にその活性の７９％を保持し、０．１
２％３−アセトアミドフェニルボロン酸では２５℃で２
週間保存後に活性の８０％を保持した。安定剤の非存在
下では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で２週間保
存後に１２％に低下した。０．１２％４−ブロモフェニ
ルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で
２週間保存後にその活性の２５％を保持し、０．１２％
３−アセトアミドフェニルボロン酸では３７℃で２週間
保存後に活性の４２％を保持した。
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週
間保存後に４９％に低下した。０．１２％４−ブロモフ
ェニルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は２５
℃で２週間保存後にその活性の７９％を保持し、０．１
２％３−アセトアミドフェニルボロン酸では２５℃で２
週間保存後に活性の８０％を保持した。安定剤の非存在
下では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で２週間保
存後に１２％に低下した。０．１２％４−ブロモフェニ
ルボロン酸では、ミオグロビンの免疫反応性は３７℃で
２週間保存後にその活性の２５％を保持し、０．１２％
３−アセトアミドフェニルボロン酸では３７℃で２週間
保存後に活性の４２％を保持した。
【００４８】
【表７】
【００４９】ミオグロビンの免疫反応性は、０日保存時
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週
間保存後に４９％に低下し、３７℃で２週間保存後に１
２％に低下した。４−ブロモフェニルボロン酸の量を増
加させると、ミオグロビンはより安定であった。０．５
％４−ブロモフェニルボロン酸の存在下では、２５℃で
２週間保存後にミオグロビンの免疫反応性の７４％が保
持され、３７℃で２週間保存後に２６％が保持された。
本明細書で引用したすべて材料は、参照することにより
本明細書の一部とする。さらに本発明は、請求の範囲の
範囲内のすべての修飾を包含することに注意されたい。
本発明の範囲と目的を逸脱することなく多くの変更およ
び修飾が可能であることを理解されたい。
の免疫反応性のパーセントとして表される。安定剤の非
存在下では、ミオグロビンの免疫反応性は２５℃で２週
間保存後に４９％に低下し、３７℃で２週間保存後に１
２％に低下した。４−ブロモフェニルボロン酸の量を増
加させると、ミオグロビンはより安定であった。０．５
％４−ブロモフェニルボロン酸の存在下では、２５℃で
２週間保存後にミオグロビンの免疫反応性の７４％が保
持され、３７℃で２週間保存後に２６％が保持された。
本明細書で引用したすべて材料は、参照することにより
本明細書の一部とする。さらに本発明は、請求の範囲の
範囲内のすべての修飾を包含することに注意されたい。
本発明の範囲と目的を逸脱することなく多くの変更およ
び修飾が可能であることを理解されたい。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者 グラハム ドゥ リースル イヤーウッド イギリス国，ロンドン エヌ11 ２ティー エックス，バウンズ グリーン，ウォーウ ィック ロード，テュークスベリー コー ト，９ (72)発明者 パトリック キルマーティン イギリス国，オックスフォードシャー オ ーエックス11 ７アールティー，ディドコ ット，レディーグローブ，ロザー ガー ス，14 (72)発明者 ベロウカ スザンナ マン イギリス国，ロンドン ダブリュシー１エ ヌ ２エヌダブリュ，ノーシントン スト リート，18 (72)発明者 エイドリアン チャールズ ドークス イギリス国，バークシャー エスエル４ ３ピーエフ，ウィンザー，カレッジ クレ セント，15
Claims (21)
- 【請求項１】 ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性
化合物の安定化法であって、置換されていないか、また
はアルキル、置換アルキル、アリール、ヒドロキシルに
よる置換を除く置換アリール、エーテル、アミン、置換
アミン、アゾ、アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、
チオール誘導体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、ス
ルホネート、ホスホネート、およびトリメチルシリルよ
りなる群から選択される１つまたはそれ以上の置換基で
置換された、少なくとも１種のアリールボロン酸化合物
を、当該免疫活性化合物を安定化するのに有効な量で、
ペルオキシダーゼ活性を有する化合物に添加することを
特徴とする上記方法。 - 【請求項２】 前記アリールボロン酸が４−ブロモフェ
ニルボロン酸である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項３】 前記アリールボロン酸が３−アセトアミ
ドフェニルボロン酸である、請求項１に記載の方法。 - 【請求項４】 前記免疫活性化合物がミオグロビンであ
る、請求項１〜３までのいずれか１項に記載の方法。 - 【請求項５】 前記免疫活性化合物がペルオキシダーゼ
である、請求項１〜３までのいずれか１項に記載の方
法。 - 【請求項６】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペル
オキシダーゼである、請求項５に記載の方法。 - 【請求項７】 前記ペルオキシダーゼが活性分子に結合
している、請求項５または６に記載の方法。 - 【請求項８】 前記活性分子が、抗体もしくはその断
片；抗原；ハプテン；タンパク質；糖タンパク質；タン
パク質ミメティック；核酸配列；ステロイド；ホルモ
ン；または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択
される、請求項７に記載の方法。 - 【請求項９】 前記アリールボロン酸化合物およびペル
オキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水溶
液中に存在する、請求項１〜８までのいずれか１項に記
載の方法。 - 【請求項１０】 前記アリールボロン酸化合物の添加量
が０．０１％〜０．５％（質量／体積）である、請求項
９に記載の方法。 - 【請求項１１】 ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活
性化合物と、置換されていないか、またはアルキル、置
換アルキル、アリール、ヒドロキシルによる置換を除く
置換アリール、エーテル、アミン、置換アミン、アゾ、
アミド、ハロゲン、ニトロ、チオール、チオール誘導
体、アルデヒド、酸、酸塩、エステル、スルホネート、
ホスホネート、およびトリメチルシリルよりなる群から
選択される１つまたはそれ以上の置換基で置換された、
少なくとも１種のアリールボロン酸化合物とを含んでな
る、安定化試薬。 - 【請求項１２】 前記アリールボロン酸化合物が４−ブ
ロモフェニルボロン酸である、請求項１１に記載の安定
化試薬。 - 【請求項１３】 前記アリールボロン酸化合物が３−ア
セトアミドフェニルボロン酸である、請求項１１に記載
の安定化試薬。 - 【請求項１４】 前記試薬がさらに保存剤を含む、請求
項１１〜１３までのいずれか１項に記載の安定化試薬。 - 【請求項１５】 前記免疫活性化合物がミオグロビンで
ある、請求項１１〜１４までのいずれか１項に記載の安
定化試薬。 - 【請求項１６】 前記免疫活性化合物がペルオキシダー
ゼである、請求項１１〜１４までのいずれか１項に記載
の安定化試薬。 - 【請求項１７】 前記ペルオキシダーゼが西洋ワサビペ
ルオキシダーゼである、請求項１６に記載の安定化試
薬。 - 【請求項１８】 前記ペルオキシダーゼが活性分子に結
合した、請求項１６または１７に記載の安定化試薬。 - 【請求項１９】 前記活性分子が、抗体もしくはその断
片；抗原；ハプテン；タンパク質；糖タンパク質；タン
パク質ミメティック；核酸配列；ステロイド；ホルモ
ン；または前記いずれかの誘導体、よりなる群から選択
される、請求項１８に記載の安定化試薬。 - 【請求項２０】 前記アリールボロン酸化合物およびペ
ルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物が一緒に水
溶液中に存在する、請求項１１〜１９までのいずれか１
項に記載の安定化試薬。 - 【請求項２１】 前記アリールボロン酸化合物が０．０
１％〜０．５％（質量／体積）の量で存在する、請求項
２０に記載の安定化試薬。
Applications Claiming Priority (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| GBGB9820641.0A GB9820641D0 (en) | 1998-09-22 | 1998-09-22 | Stabilisation of peroxidases |
| GB9920670A GB2353797A (en) | 1999-09-01 | 1999-09-01 | Stabilisation of peroxidases |
| GB9820641:0 | 1999-09-01 | ||
| GB9920670:8 | 1999-09-01 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2000298129A true JP2000298129A (ja) | 2000-10-24 |
| JP3742258B2 JP3742258B2 (ja) | 2006-02-01 |
Family
ID=26314405
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP26713099A Expired - Fee Related JP3742258B2 (ja) | 1998-09-22 | 1999-09-21 | ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法 |
Country Status (8)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP0997527B1 (ja) |
| JP (1) | JP3742258B2 (ja) |
| AT (1) | ATE470709T1 (ja) |
| AU (1) | AU769123B2 (ja) |
| CA (1) | CA2282217C (ja) |
| DE (1) | DE69942483D1 (ja) |
| ES (1) | ES2346604T3 (ja) |
| NO (1) | NO994580L (ja) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007051076A (ja) * | 2005-08-16 | 2007-03-01 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ミオグロビン複合体 |
| JPWO2019168109A1 (ja) * | 2018-03-02 | 2021-02-25 | 栄研化学株式会社 | 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 |
Families Citing this family (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| GB2418665B8 (en) * | 2004-10-04 | 2008-03-25 | Biotrin Intellectual Pty Ltd | Stabilising diluent for a protein-horseradish peroxidase conjugate |
| CN112285342B (zh) * | 2020-09-28 | 2023-09-19 | 北京森康维特生物技术研究所 | 用于辣根过氧化物酶标记抗体的稀释稳定保护剂，其制备方法及试剂盒 |
| WO2022159439A2 (en) * | 2021-01-21 | 2022-07-28 | Jp Laboratories, Inc. | Materials and methods for extending shelf-life of foods |
Family Cites Families (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CZ230593A3 (en) * | 1991-04-30 | 1994-04-13 | Procter & Gamble | Liquid detergents with arylboric acid |
| DE69318966T2 (de) * | 1992-02-10 | 1998-11-12 | British Tech Group | Chemilumineszenzverstärker |
| CN1127014A (zh) * | 1993-07-09 | 1996-07-17 | 诺沃挪第克公司 | 作为酶稳定剂的一烃基硼酸或二烃基硼酸衍生物 |
| US5512448A (en) * | 1994-04-28 | 1996-04-30 | Yamazaki; Hiroshi | Stabilization of peroxidase conjugates in solution |
-
1999
- 1999-09-17 AU AU48789/99A patent/AU769123B2/en not_active Ceased
- 1999-09-21 DE DE69942483T patent/DE69942483D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-21 ES ES99307443T patent/ES2346604T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-21 NO NO994580A patent/NO994580L/no not_active Application Discontinuation
- 1999-09-21 EP EP99307443A patent/EP0997527B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1999-09-21 JP JP26713099A patent/JP3742258B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1999-09-21 AT AT99307443T patent/ATE470709T1/de not_active IP Right Cessation
- 1999-09-21 CA CA002282217A patent/CA2282217C/en not_active Expired - Fee Related
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2007051076A (ja) * | 2005-08-16 | 2007-03-01 | National Institute Of Advanced Industrial & Technology | ミオグロビン複合体 |
| JPWO2019168109A1 (ja) * | 2018-03-02 | 2021-02-25 | 栄研化学株式会社 | 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 |
| JP7237924B2 (ja) | 2018-03-02 | 2023-03-13 | 栄研化学株式会社 | 検体中に含まれる蛋白質を安定化する方法、検体中に含まれる蛋白質を安定化させるための溶液 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2346604T3 (es) | 2010-10-18 |
| NO994580D0 (no) | 1999-09-21 |
| ATE470709T1 (de) | 2010-06-15 |
| JP3742258B2 (ja) | 2006-02-01 |
| NO994580L (no) | 2000-03-23 |
| EP0997527B1 (en) | 2010-06-09 |
| AU769123B2 (en) | 2004-01-15 |
| CA2282217C (en) | 2009-11-17 |
| EP0997527A1 (en) | 2000-05-03 |
| DE69942483D1 (de) | 2010-07-22 |
| CA2282217A1 (en) | 2000-03-22 |
| AU4878999A (en) | 2000-03-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US4668639A (en) | Biochemical detection method and kit for use therein | |
| EP0062277A1 (en) | A method for carrying out non-isotopic immunoassays, labeled analytes and kits for use in such assays | |
| US5516672A (en) | Stabilized peroxidase compositions and antibody compositions | |
| JP2000508075A (ja) | 発光特異的結合アッセイ | |
| US5332678A (en) | Process for liberating an analyte from its binding protein | |
| EP2705031B1 (en) | Flash and glow 1,2-dioxetanes | |
| DK160335B (da) | Immunkemisk fremgangsmaade til bestemmelser af en iodthyronin i en biologisk vaeske med 2-hydroxy-4-methoxybenzophenon-5-sulfonsyre eller et salt deraf som tbp-blokeringsmiddel, samt reagenssystem, testsaet og testmateriale til anvendelse ved metoden | |
| JP3742258B2 (ja) | ペルオキシダーゼ活性を有する免疫活性化合物の安定化法 | |
| US5047330A (en) | Compound labelled by the acetyl cholinesterase of Electrophorus electricus, its preparation process and its use as a tracer or marker in enzymoimmunological determinations | |
| CN113640511A (zh) | 一种磁微粒电化学发光试剂盒 | |
| US5998156A (en) | Color developing method, enzyme immunoassay using the color developing method, and immunochromatography incorporating the enzyme immunoassay | |
| US4757016A (en) | Process for stabilizing the activity of peroxidase in solution | |
| JP4264199B2 (ja) | 疎水性の肺界面活性剤タンパク質ｓｐ−ｃの測定 | |
| JPH066074B2 (ja) | ルミノ−ルまたは７−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子収率を高める方法及びペルオキシダ−ゼ測定用試薬 | |
| JPH06508217A (ja) | 結合蛋白質捕捉アッセイ | |
| GB2353797A (en) | Stabilisation of peroxidases | |
| WO1990008320A1 (en) | Immunoassay method, reagent and kit | |
| JP3230897B2 (ja) | 特異結合反応用組成物及び特異結合反応媒体組成物 | |
| JP3315775B2 (ja) | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 | |
| JP2004037209A (ja) | アロマターゼ活性の測定方法、並びにアロマターゼの活性阻害の評価方法、およびそれらの方法のための組成物 | |
| OKADA et al. | Fluorimetric assay for catechol-O-methyltransferase | |
| CN108548918A (zh) | 酶联免疫吸附法封闭溶液、制备方法、应用及具有其的试剂盒 | |
| JP3712963B2 (ja) | ペルオキシダーゼ標識抗体を含有する水溶液 | |
| JP2002323495A (ja) | 標識物としてパーオキシダーゼを用いる化学発光分析方法 | |
| JP3746381B2 (ja) | 化学発光酵素免疫測定方法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20031202 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20040301 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20040304 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20050104 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20050401 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20050406 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20050701 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20051011 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20051110 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091118 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20091118 Year of fee payment: 4 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20101118 Year of fee payment: 5 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111118 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20111118 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121118 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20121118 Year of fee payment: 7 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20131118 Year of fee payment: 8 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |