JPH066074B2 - ルミノ−ルまたは７−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子収率を高める方法及びペルオキシダ−ゼ測定用試薬 - Google Patents
ルミノ−ルまたは７−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子収率を高める方法及びペルオキシダ−ゼ測定用試薬Info
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- JPH066074B2 JPH066074B2 JP61300228A JP30022886A JPH066074B2 JP H066074 B2 JPH066074 B2 JP H066074B2 JP 61300228 A JP61300228 A JP 61300228A JP 30022886 A JP30022886 A JP 30022886A JP H066074 B2 JPH066074 B2 JP H066074B2
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- G01—MEASURING; TESTING
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- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
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Description
【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、ペルオキシダーゼ（POD）の存在下における
ペルオキシド化合物によるルミノールまたはルミノール
誘導体の酸化の際の化学ルミネッセンス（Ccemilumines
zenz）の量子収率を高める方法に関する。
ペルオキシド化合物によるルミノールまたはルミノール
誘導体の酸化の際の化学ルミネッセンス（Ccemilumines
zenz）の量子収率を高める方法に関する。
従来の技術 化学ルミネッセンス反応は、発光可能な分子を、化学的
エネルギーにより、可視光としてのエネルギーを放出す
る励起電子状態にする工程である。生物発光反応は、酸
素が電子受容体として作用する酵素触媒性化学ルミネッ
センス反応である。量子収率（反応した分子１個当りの
化学ルミネッセンス−光電子の割合）は、いずれにせよ
約１％である〔K.D.グンターマン（Guntermann）．Ange
w.Chemie７７（1965）、５７２〜５８０頁、Chemiker-Z
eitung９９（１９７５）、No.６．２７９〜２８５参
照〕。
エネルギーにより、可視光としてのエネルギーを放出す
る励起電子状態にする工程である。生物発光反応は、酸
素が電子受容体として作用する酵素触媒性化学ルミネッ
センス反応である。量子収率（反応した分子１個当りの
化学ルミネッセンス−光電子の割合）は、いずれにせよ
約１％である〔K.D.グンターマン（Guntermann）．Ange
w.Chemie７７（1965）、５７２〜５８０頁、Chemiker-Z
eitung９９（１９７５）、No.６．２７９〜２８５参
照〕。
ペルオキシドを用いるルミノール（３−アミノ−フタル
酸ヒドラジド）又はルミノール誘導体のペルオキシダー
ゼ触媒反応は、免疫検定で指示薬反応として使用され、
この際、POD又はルミノールが標識物質として使用でき
る。ペルオキシダーゼ〔POD：供給体：H2O2−オキシド
レダクターゼ、ＥＣ１．１１．１．７〕とは、多数の有
機化合物の酸化を触媒作用する酵素の１群を呼称する。
酸ヒドラジド）又はルミノール誘導体のペルオキシダー
ゼ触媒反応は、免疫検定で指示薬反応として使用され、
この際、POD又はルミノールが標識物質として使用でき
る。ペルオキシダーゼ〔POD：供給体：H2O2−オキシド
レダクターゼ、ＥＣ１．１１．１．７〕とは、多数の有
機化合物の酸化を触媒作用する酵素の１群を呼称する。
POD−測定は、特にH2O2が形成される前反応と連結し
て、例えば血糖測定のために、並びにPODを標識酵素と
して使用する酵素−免疫学的測定法で重要である。POD
測定が重要である他の分析法は、例えば、ガラクトース
ー、過酸化水素−、カタラーゼ−又はオキシダーゼ測定
である。
て、例えば血糖測定のために、並びにPODを標識酵素と
して使用する酵素−免疫学的測定法で重要である。POD
測定が重要である他の分析法は、例えば、ガラクトース
ー、過酸化水素−、カタラーゼ−又はオキシダーゼ測定
である。
H2O2又は水素供給体の減少によりかつ酸化された化合物
の生成によりPODを測定することは公知である。この
際、特に、後者方法が重要であり、この際、基質として
は、例えばジ−アニシジン、グアヤコール又はABTS
（２，２′−アジノジ〔３−エチル−ベンズチアゾリン
−(6)−スルホン酸〕）が使用される。
の生成によりPODを測定することは公知である。この
際、特に、後者方法が重要であり、この際、基質として
は、例えばジ−アニシジン、グアヤコール又はABTS
（２，２′−アジノジ〔３−エチル−ベンズチアゾリン
−(6)−スルホン酸〕）が使用される。
これらの公知方法は有効ではあるが、酵素−免疫テスト
の領域でのPOD−測定の時間を短縮するために、方法で
の高感度の要求が存在する。PODは、例えばELISA原理
（ELISA-Prinzip：enzyme-linked immuno sorbent assa
y）によるいわゆる酵素−免疫−検定での標識酵素とし
て重要な役割を演じる。しかしながら、この系に関する
多くの市販の試薬を用いると、基質としての例えばABTS
を用いる固有のPOD−測定の時間（これは、約６０分で
ある）は極めて不充分である。
の領域でのPOD−測定の時間を短縮するために、方法で
の高感度の要求が存在する。PODは、例えばELISA原理
（ELISA-Prinzip：enzyme-linked immuno sorbent assa
y）によるいわゆる酵素−免疫−検定での標識酵素とし
て重要な役割を演じる。しかしながら、この系に関する
多くの市販の試薬を用いると、基質としての例えばABTS
を用いる固有のPOD−測定の時間（これは、約６０分で
ある）は極めて不充分である。
この問題の解決のために、ルミノールとペルオキシド化
合物とのペルオキシダーゼ触媒反応を、量子収率を上昇
させることにより、より敏感にすることが試みられた。
合物とのペルオキシダーゼ触媒反応を、量子収率を上昇
させることにより、より敏感にすることが試みられた。
西ドイツ特許出願公告（ＤＥ−ＡＳ）第２９０６７３２
号明細書から、化学ルミネッセンス反応を用いるペルオ
キシダーゼの活性測定法が公知であり、この方法は、良
好な量子収率を生じ、従って、酵素免疫検定の領域でPO
D−測定の感度を高め、測定時間を著るしく低下させる
ことができる。
号明細書から、化学ルミネッセンス反応を用いるペルオ
キシダーゼの活性測定法が公知であり、この方法は、良
好な量子収率を生じ、従って、酵素免疫検定の領域でPO
D−測定の感度を高め、測定時間を著るしく低下させる
ことができる。
この化学ルミネッセンス反応は、ルミノールとペルオキ
シド化合物との反応を基礎にしているが、ルミノールの
代りに７−ジメチルアミノナフタリン−１，２−ジカル
ボン酸−ヒドラジドが使用され、これにより、化学ルミ
ネッセンスの量子収率（化学ルミネッセンスの収率）の
上昇が達成される。
シド化合物との反応を基礎にしているが、ルミノールの
代りに７−ジメチルアミノナフタリン−１，２−ジカル
ボン酸−ヒドラジドが使用され、これにより、化学ルミ
ネッセンスの量子収率（化学ルミネッセンスの収率）の
上昇が達成される。
ホワイトヘッド（Whitehead）等によるネーチュアー（N
ature）３０５（１９８３）、１５８〜１５９頁から、
ルミノールのPOD−触媒酸化のルミネッセンス収率は、
ファイアフライールシフエリン（firefly-Luciferin）
の添加により数倍も上昇することは公知であり、このよ
うな上昇は、６−ヒドロキシ−ベンゾチアゾールの添加
によっても公知である〔Thorpe等によるAnal.Biochem.
１４５（１９８５）、９６〜１００参照〕か又はフエノ
ール誘導体の添加によっても公知である〔Thorpe等によ
るClin.Chem.３１（１９８５）、１３３５〜１３４１、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第0116454号明細書参照〕。
ature）３０５（１９８３）、１５８〜１５９頁から、
ルミノールのPOD−触媒酸化のルミネッセンス収率は、
ファイアフライールシフエリン（firefly-Luciferin）
の添加により数倍も上昇することは公知であり、このよ
うな上昇は、６−ヒドロキシ−ベンゾチアゾールの添加
によっても公知である〔Thorpe等によるAnal.Biochem.
１４５（１９８５）、９６〜１００参照〕か又はフエノ
ール誘導体の添加によっても公知である〔Thorpe等によ
るClin.Chem.３１（１９８５）、１３３５〜１３４１、
欧州特許（ＥＰ−Ａ）第0116454号明細書参照〕。
この方法で量子収率の上昇は達成できるが、必要な添加
物（活性化剤）は、容易に得ることはできず、かつ／又
はその水中の劣悪な溶解性に基づき、有機溶剤と混合し
てのみ使用可能である欠点を有する。
物（活性化剤）は、容易に得ることはできず、かつ／又
はその水中の劣悪な溶解性に基づき、有機溶剤と混合し
てのみ使用可能である欠点を有する。
発明が解決しようとする問題点 従って、本発明の目的は、前記の欠点をさけ、酵素免疫
検定でのPODの敏感かつ迅速な測定に好適な、PODの存在
におけるペルオキシド化合物によるルミノールの酸化の
際の量子収率を高める方法を得ることであった。この課
題は、本発明方法で解決される。
検定でのPODの敏感かつ迅速な測定に好適な、PODの存在
におけるペルオキシド化合物によるルミノールの酸化の
際の量子収率を高める方法を得ることであった。この課
題は、本発明方法で解決される。
問題点を解決するための手段 フルオレッセインの存在で反応を実施し、この際、個々
の化学ルミネッセンス物質の量子収率の合計よりも大き
い過加算性（共働的）量子収率を得るフルオレッセイン
の濃度範囲を示す際に、PODの存在でのペルオキシド化
合物によるルミノールの酸化の際に、量子収率を高める
ことができることを発見した。
の化学ルミネッセンス物質の量子収率の合計よりも大き
い過加算性（共働的）量子収率を得るフルオレッセイン
の濃度範囲を示す際に、PODの存在でのペルオキシド化
合物によるルミノールの酸化の際に、量子収率を高める
ことができることを発見した。
従って、本発明の目的は、PODの存在におけるペルオキ
シド化合物によるルミノール又はアルキル基が１〜３個
の炭素原子を有する７−ジアルキルアミノ−ナフタリン
−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子
収率を高めるための特許請求の範囲第１項に記載の方法
であり、これは、反応をフルオレッセインの存在で実施
し、この際、フルオレッセインの濃度は、個々の化学ル
ミネッセンス物質の量子収率の合計よりも大きい量子収
率を生じる濃度範囲に存在することを特徴とする。
シド化合物によるルミノール又はアルキル基が１〜３個
の炭素原子を有する７−ジアルキルアミノ−ナフタリン
−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子
収率を高めるための特許請求の範囲第１項に記載の方法
であり、これは、反応をフルオレッセインの存在で実施
し、この際、フルオレッセインの濃度は、個々の化学ル
ミネッセンス物質の量子収率の合計よりも大きい量子収
率を生じる濃度範囲に存在することを特徴とする。
この方法の有利な実施形は、特許請求の範囲第２項から
第６項に記載されている。
第６項に記載されている。
過酸化水素の作用下にフルオレッセインも化学ルミネッ
センス現象を示すことは公知であり〔Nilson及びKearns
によるJ.Phys.Chem.７８（１９７４）、１６８１〜１６
８３参照〕、これは、免疫検定でのフルオレッセインで
標識された化合物の測定のために使用される〔欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第0054952号、同第００４６５６３号、西
ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第３１３２４９１号明細書参
照〕。B.A.ルシン（Rusin）等による研究〔Khim.Vys.En
erg.１１（１）（１９７７）９３〜９４、ＣＡ８６（１
９７７）５９５頁１３０３２１ｓ参照〕から、ルミノー
ルの酸化の際の化学ルミネッセンスは、フルオレッセイ
ンにより消失されることは公知である。従って、化学ル
ミネッセンス反応の量子収率の過加算性（共働的）上昇
が現われる濃度範囲を示すことは意想外のことであると
みるべきである。
センス現象を示すことは公知であり〔Nilson及びKearns
によるJ.Phys.Chem.７８（１９７４）、１６８１〜１６
８３参照〕、これは、免疫検定でのフルオレッセインで
標識された化合物の測定のために使用される〔欧州特許
（ＥＰ−Ａ）第0054952号、同第００４６５６３号、西
ドイツ特許（ＤＥ−Ａ）第３１３２４９１号明細書参
照〕。B.A.ルシン（Rusin）等による研究〔Khim.Vys.En
erg.１１（１）（１９７７）９３〜９４、ＣＡ８６（１
９７７）５９５頁１３０３２１ｓ参照〕から、ルミノー
ルの酸化の際の化学ルミネッセンスは、フルオレッセイ
ンにより消失されることは公知である。従って、化学ル
ミネッセンス反応の量子収率の過加算性（共働的）上昇
が現われる濃度範囲を示すことは意想外のことであると
みるべきである。
７−ジアルキルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボ
ン酸−ヒドラジド中のアルキル基は、種々異なっていて
よいか又は同じで、分枝しているか又は有利に直鎖であ
ってよく、例えばメチル、エチル、プロピル及び／又は
イソプロピルである。
ン酸−ヒドラジド中のアルキル基は、種々異なっていて
よいか又は同じで、分枝しているか又は有利に直鎖であ
ってよく、例えばメチル、エチル、プロピル及び／又は
イソプロピルである。
７−ジメチルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン
酸−ヒドラジドを使用するのが有利である。
酸−ヒドラジドを使用するのが有利である。
ペルオキシドとしては、過酸化水素と共にPODと認溶性
の、比較可能な酸化電位を有するすべてのペルオキシド
化合物例えばアルカリペルオキシド、ホウ酸（ペルボレ
ート）又は尿素への過酸化水素の付加化合物が好適であ
り、殊に酵素−免疫検定のために過ホウ酸ナトリウム及
び第１にH2O2を使用するのが有利である。
の、比較可能な酸化電位を有するすべてのペルオキシド
化合物例えばアルカリペルオキシド、ホウ酸（ペルボレ
ート）又は尿素への過酸化水素の付加化合物が好適であ
り、殊に酵素−免疫検定のために過ホウ酸ナトリウム及
び第１にH2O2を使用するのが有利である。
本発明方法は、7.5〜９ののpH値で殊に、約8.5のpH値で
実施するのが有利である。緩衝剤として、燐酸カリウム
緩衝剤又はグリシン−NaOH−緩衝剤が有利であるが他の
慣用の緩衝剤例えばトリス−HCl、トリス硫酸塩及びト
リス−酢酸塩も好適である。この際、有利な緩衝剤濃度
は１０〜１０００ｍモル／である。ルミノール又は７
−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸
−ヒドラジド又は過酸化水素の濃度は、この濃度がこの
反応で決められない場合は、この化学ルミネッセンス反
応に慣用の濃度範囲内にあり、ルミノール又は７−ジア
ルキルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒ
ドラジドは、有利に、１０μｍモル／〜１００ｍモル
／の範囲の量で使用する。本発明方法は、有利に、酵
素測定に慣用の温度（一般に２０〜３７゜C）で実施され
るが、この際、この方法により低い又はより高い温度も
使用でき、殊に、２２〜３０゜Cの範囲の温度が有利であ
る。
実施するのが有利である。緩衝剤として、燐酸カリウム
緩衝剤又はグリシン−NaOH−緩衝剤が有利であるが他の
慣用の緩衝剤例えばトリス−HCl、トリス硫酸塩及びト
リス−酢酸塩も好適である。この際、有利な緩衝剤濃度
は１０〜１０００ｍモル／である。ルミノール又は７
−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸
−ヒドラジド又は過酸化水素の濃度は、この濃度がこの
反応で決められない場合は、この化学ルミネッセンス反
応に慣用の濃度範囲内にあり、ルミノール又は７−ジア
ルキルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒ
ドラジドは、有利に、１０μｍモル／〜１００ｍモル
／の範囲の量で使用する。本発明方法は、有利に、酵
素測定に慣用の温度（一般に２０〜３７゜C）で実施され
るが、この際、この方法により低い又はより高い温度も
使用でき、殊に、２２〜３０゜Cの範囲の温度が有利であ
る。
化学ルミネッセンス反応の量子収率の過加算性（共働
的）上昇が現われるフルオレッセインの濃度範囲は、他
の反応成分の種類及び濃度及び反応条件に依るが、その
都度の条件にとって、最適範囲は、僅かなその方向に向
けられた実験で容易に決めることができる。殊に、酵素
−免疫−検定のための指示反応として、PODの存在でル
ミノール及び過酸化水素を酸化するのが有利であり、こ
の反応は、有利にフルオレッセインの存在で実施され、
この際、１０〜１０００μモル／有利に２０〜１００
μモル／の範囲で操作され、この範囲で、それぞれの
個々の化学ルミネッセンス物質の量子収率の合計から生
じる収率の約１０倍に相当する量子収率の上昇が得られ
る。
的）上昇が現われるフルオレッセインの濃度範囲は、他
の反応成分の種類及び濃度及び反応条件に依るが、その
都度の条件にとって、最適範囲は、僅かなその方向に向
けられた実験で容易に決めることができる。殊に、酵素
−免疫−検定のための指示反応として、PODの存在でル
ミノール及び過酸化水素を酸化するのが有利であり、こ
の反応は、有利にフルオレッセインの存在で実施され、
この際、１０〜１０００μモル／有利に２０〜１００
μモル／の範囲で操作され、この範囲で、それぞれの
個々の化学ルミネッセンス物質の量子収率の合計から生
じる収率の約１０倍に相当する量子収率の上昇が得られ
る。
この高い量子収率に基づき、本発明方法は免疫検定のPO
D−活性の測定のために使用でき、この際、単独の基質
としてのルミノールを用いる試験に比べて、感度を１０
倍も高めることができる。PODの測定以外に、本発明の
方法は、反応に関与するペルオキシド例えば過酸化水素
の測定のため又はルミノール又は７−ジアルキルアミノ
−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの測
定のために好適でもある。
D−活性の測定のために使用でき、この際、単独の基質
としてのルミノールを用いる試験に比べて、感度を１０
倍も高めることができる。PODの測定以外に、本発明の
方法は、反応に関与するペルオキシド例えば過酸化水素
の測定のため又はルミノール又は７−ジアルキルアミノ
−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの測
定のために好適でもある。
本発明方法により、例えばELISA−テストにおける純粋
な酵素活性測定のための測定時間を約２〜３分まで短縮
することができる。この測定は、一定時間間隔で測定し
た光量を測定するように行なうのが有利である。
な酵素活性測定のための測定時間を約２〜３分まで短縮
することができる。この測定は、一定時間間隔で測定し
た光量を測定するように行なうのが有利である。
従って、本発明の目的は、本発明の方法をPODの測定又
は殊に免疫検定で標識物質として使用されるルミノール
又は７−ジアルキルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカ
ルボン酸−ヒドラジドの測定のためにも使用することで
ある。
は殊に免疫検定で標識物質として使用されるルミノール
又は７−ジアルキルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカ
ルボン酸−ヒドラジドの測定のためにも使用することで
ある。
本発明方法の使用下におけるPOD−測定は、例えば免疫
学的ハプテン測定の領域で実施でき、この測定では、PO
Dで標識されたハプテンの既知量を相応する未知量のハ
プテンを含有する試料に添加し、次いでこの試料を固体
担体に結合した特異的なハプテンの抗体と接触させ、固
相を液相から分離し、双方の相の１方でPOD−活性を測
定する（ELISA−テスト）。このテストで、例えば血清
中のジゴキシン、チロキシン（T4）又はインシュリンを
測定することができ、この際、例えば西ドイツ特許出願
公告（DE-AS）第２９０６７３２号明細書に記載の方法
で操作することができる。
学的ハプテン測定の領域で実施でき、この測定では、PO
Dで標識されたハプテンの既知量を相応する未知量のハ
プテンを含有する試料に添加し、次いでこの試料を固体
担体に結合した特異的なハプテンの抗体と接触させ、固
相を液相から分離し、双方の相の１方でPOD−活性を測
定する（ELISA−テスト）。このテストで、例えば血清
中のジゴキシン、チロキシン（T4）又はインシュリンを
測定することができ、この際、例えば西ドイツ特許出願
公告（DE-AS）第２９０６７３２号明細書に記載の方法
で操作することができる。
本発明のもう１つの目的物は、本発明方法でPODを測定
するための試薬でもあり、これは、ルミノール又はアル
キル基１個当り炭素原子１〜３を有する７−ジアルキル
アミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジ
ド、フルオレッセイン、過酸化水素供給体、緩衝物質
（pH7.5〜９）及び場合によっては保存剤を含有するこ
とよりなる。
するための試薬でもあり、これは、ルミノール又はアル
キル基１個当り炭素原子１〜３を有する７−ジアルキル
アミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジ
ド、フルオレッセイン、過酸化水素供給体、緩衝物質
（pH7.5〜９）及び場合によっては保存剤を含有するこ
とよりなる。
試験溶液１当りの有利な試薬は次のものを含有する： ７−ジアルキルアミノナフタリ ン−１，２−ジカルボン酸−ヒド ラジド又は有利にルミノール １０〜１０００
μモル フルオレッセイン １０〜１０００μモル 燐酸カリウム−又はグリシ ン−緩衝剤（pH7.5〜９） ５０〜５００ｍモ
ル H2O2 及び場合により １０〜２
００μモル 保存剤 0.01〜１ｍモル 場合により使用すべき保存剤としては、このために公知
の物質例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）及び
類似の、このために慣用の化合物がこれに該当する。更
に、この試薬は、慣用の安定剤例えば血清アルブミン、
炭水化物及び類似物を含有していてよい。H2O2−供給体
としては、H2O2そのもの並びに公知のH2O2放出性の物質
例えば尿素−過水和物（固体H2O2）及び類似物であって
もよい。
μモル フルオレッセイン １０〜１０００μモル 燐酸カリウム−又はグリシ ン−緩衝剤（pH7.5〜９） ５０〜５００ｍモ
ル H2O2 及び場合により １０〜２
００μモル 保存剤 0.01〜１ｍモル 場合により使用すべき保存剤としては、このために公知
の物質例えばエチレンジアミンテトラ酢酸（EDTA）及び
類似の、このために慣用の化合物がこれに該当する。更
に、この試薬は、慣用の安定剤例えば血清アルブミン、
炭水化物及び類似物を含有していてよい。H2O2−供給体
としては、H2O2そのもの並びに公知のH2O2放出性の物質
例えば尿素−過水和物（固体H2O2）及び類似物であって
もよい。
前記成分以外に、本発明の試薬は、この試薬が酵素−免
疫−テストの領域で使用されるべき際は、PODで標識さ
れたハプテン並びに担体結合した、それぞれのハプテン
に対して特異的な抗体を含有していてもよい。更に、他
の例えばこのようなELISA−試薬中に慣用の成分例えば
他の緩衝物質、安定剤及び類似物を含有していてよい。
疫−テストの領域で使用されるべき際は、PODで標識さ
れたハプテン並びに担体結合した、それぞれのハプテン
に対して特異的な抗体を含有していてもよい。更に、他
の例えばこのようなELISA−試薬中に慣用の成分例えば
他の緩衝物質、安定剤及び類似物を含有していてよい。
実施例 次の例につき本発明を詳述するが、本発明はこれに限定
されるものではない。特にことわりのないかぎり、温度
は「゜C」であり、パーセント及び量の記載は「重量％」
及び「重量部」である。
されるものではない。特にことわりのないかぎり、温度
は「゜C」であり、パーセント及び量の記載は「重量％」
及び「重量部」である。
例 １ この例は、量子収率に対するフルオレッセイン−濃度の
影響を説明する。
影響を説明する。
すべての実験をベルトホールド社（Fa.Berthold,Wildba
d）のTypビオルメート（Biolumat）ＬＢ９５００の生物
発光測定装置を用いて実施した。試験量は５００μ、
温度は３０゜Cであった。
d）のTypビオルメート（Biolumat）ＬＢ９５００の生物
発光測定装置を用いて実施した。試験量は５００μ、
温度は３０゜Cであった。
次の濃度（テストでの最終濃度）を用いた： 過酸化水素 0.1ｍモル／ ルミノール ２５μモル／ ペルオキシダーゼ ２０ｍｇ／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤（ｐＨ＝８．５） ９０ｍ
モル／ 第１図は光放出とフルオレッセイン濃度との関係を示す
曲線である。第１図に示すように、光放出は１０〜１０
００μモル／のフルオレッセイン濃度では数倍も活性
化される。
モル／ 第１図は光放出とフルオレッセイン濃度との関係を示す
曲線である。第１図に示すように、光放出は１０〜１０
００μモル／のフルオレッセイン濃度では数倍も活性
化される。
例 ２ この例は、ルミノールとフルオレッセインの共同作用時
の過加算性（共働的）効果を、ルミノール又はフルオレ
ッセイン単独の使用の際と比較して説明する。
の過加算性（共働的）効果を、ルミノール又はフルオレ
ッセイン単独の使用の際と比較して説明する。
次の濃度（テストでの最終濃度）で操作した： ルミノール ０．１ｍモル／ フルオレッセイン ２５μモル／ POD ２０ｎｇモル／ 過酸化水素 ０．１ｍモル／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤 （ｐＨ＝８．５） ９０ｍモル／ 次の第１表に得られた結果をまとめる。
Imaxは２秒当りの光放出の数〔衝突数（Impacts）／２
秒〕を意味する。
秒〕を意味する。
この第１表から、ルミノールとフルオレッセインとの共
同作用時の共働効果は、明白に認識可能である：ルミノ
ールとフルオレッセインの存在時に最大光強度（Imax）
は、ルミノールもしくはフルオレッセイン単独（テスト
No.４及び２）の存在下での反応の強度の合計の約１０
倍も大きい。この表から、フルオレッセインがPODの存
在で空気とも化学ルミネッセンスのもとに反応する（テ
ストNo.５参照）ことが推定できる。
同作用時の共働効果は、明白に認識可能である：ルミノ
ールとフルオレッセインの存在時に最大光強度（Imax）
は、ルミノールもしくはフルオレッセイン単独（テスト
No.４及び２）の存在下での反応の強度の合計の約１０
倍も大きい。この表から、フルオレッセインがPODの存
在で空気とも化学ルミネッセンスのもとに反応する（テ
ストNo.５参照）ことが推定できる。
例 ３ この例は、この反応に対するPOD−濃度の影響を示して
いる。
いる。
その測定は、先の例におけると同様に行なう。次の濃度
（テストでの最終濃度）で操作した： ルミノール ０．１ｍモル／ 過酸化水素 ０．１ｍモル／ フルオレッセイン ２５μモル／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤 （ｐＨ＝８．５） ９０ｍモル／ 次の第２表に記載の結果が得られた。
（テストでの最終濃度）で操作した： ルミノール ０．１ｍモル／ 過酸化水素 ０．１ｍモル／ フルオレッセイン ２５μモル／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤 （ｐＨ＝８．５） ９０ｍモル／ 次の第２表に記載の結果が得られた。
例 ４ この例は、反応に対するpH−値の影響を示す。例３に記
載の濃度で操作した。POD−濃度は９×１０-10モル／
であり、種々のpH−値のトリス-HCl-緩衝剤の濃度は９０ｍ
モル／であった。12.6のpH−値は、苛性ソーダ１モル
／の添加により達成した。
載の濃度で操作した。POD−濃度は９×１０-10モル／
であり、種々のpH−値のトリス-HCl-緩衝剤の濃度は９０ｍ
モル／であった。12.6のpH−値は、苛性ソーダ１モル
／の添加により達成した。
第２図に光放出（Imax）に対するpH−値の影響を示す。
例 ５ 例２と同様に操作するが、過酸化水素の代りに、酸化剤
として過ホウ酸ナトリウムを使用した。
として過ホウ酸ナトリウムを使用した。
この第３表の結果からも、ルミノール及びフルオレッセ
インの存在での操作時に得られる過加算性効果は明確に
認識可能である。
インの存在での操作時に得られる過加算性効果は明確に
認識可能である。
例 ６ この例は、本発明方法を唾液−α−アミラーゼの測定の
ためのELISA−原理による酵素−免疫−検定での使用を
説明する。
ためのELISA−原理による酵素−免疫−検定での使用を
説明する。
このテストを次の方法で実施した： １．ルミネッセンス小菅（Lumacuvett p Poly-styrene、
Recorder Nr.４９６０、Lumac System AG、Basel、Schwei
z）を、ヒト唾液アミラーゼに特異的に結合するヒト唾
液アミラーゼに対するモノクロナール抗体（５μｇ／ｍ
）と共に５０mM炭酸塩緩衝剤（pH＝9.3）（500μ）
中、４゜Cで１８時間インキュベートする。このモノクロ
ナー抗体は、NCACC 84111305なる名称で、ナショナル・
コレクション・オブ・アメリカン・セル・カルチュア
（National Collection of American Cell Culuture,Po
rton Down,GB）に寄託されていて、欧州特許第０１５０
３０９号明細書の記載により製造される。
Recorder Nr.４９６０、Lumac System AG、Basel、Schwei
z）を、ヒト唾液アミラーゼに特異的に結合するヒト唾
液アミラーゼに対するモノクロナール抗体（５μｇ／ｍ
）と共に５０mM炭酸塩緩衝剤（pH＝9.3）（500μ）
中、４゜Cで１８時間インキュベートする。このモノクロ
ナー抗体は、NCACC 84111305なる名称で、ナショナル・
コレクション・オブ・アメリカン・セル・カルチュア
（National Collection of American Cell Culuture,Po
rton Down,GB）に寄託されていて、欧州特許第０１５０
３０９号明細書の記載により製造される。
２．この小菅を１５０mMの燐酸塩緩衝剤（pH＝7.2、Nac
l１４５mM）及び１％牛血清アルブミン（BSA）で洗浄す
る。
l１４５mM）及び１％牛血清アルブミン（BSA）で洗浄す
る。
３．燐酸塩緩衝剤（pH7.2）１５０ｍモル／、Nacl１
４５ｍモル／及び２％牛血清で、この小菅の後処理
（後被覆）を行なう。次いで、この小菅を室温で時間放
置する。
４５ｍモル／及び２％牛血清で、この小菅の後処理
（後被覆）を行なう。次いで、この小菅を室温で時間放
置する。
４．この小菅を２に記載のように洗浄する。
５．ヒト唾液−α−アミラーゼ−POD−接合体を種々の
濃度で３７゜Cでこのルミネッセンス小菅内で４時間イン
キュベートする（５００μ）。
濃度で３７゜Cでこのルミネッセンス小菅内で４時間イン
キュベートする（５００μ）。
６．これを、２の記載と同様に５回洗浄する。
７．ａ）現像のために、ABTS−試薬（Enzymun-Test Dig
oxin,Boechringer Mannheim GmbH,カタログNo.１９９６
５６）１mを各小菅に加える。正確に９分後に、イン
キュベートされなかったABS−試薬に対する４０５nmで
の光の吸収を測定する。
oxin,Boechringer Mannheim GmbH,カタログNo.１９９６
５６）１mを各小菅に加える。正確に９分後に、イン
キュベートされなかったABS−試薬に対する４０５nmで
の光の吸収を測定する。
ｂ）フルオレッセイン不含のルミネッセンス試薬５００
μ（最終濃度例２参照）を各小菅中に入れる。正確に
３０秒又は１７分後に、ルミネッセンスを測定する〔装
置：ベルトホールド社の生物発光測定装置Typs Bioluma
t LB 9500T、集積時間６０秒〕。
μ（最終濃度例２参照）を各小菅中に入れる。正確に
３０秒又は１７分後に、ルミネッセンスを測定する〔装
置：ベルトホールド社の生物発光測定装置Typs Bioluma
t LB 9500T、集積時間６０秒〕。
ｃ）ルミネッセンス溶液５００μにフルオレッセイン
（最終濃度例２参照）を加え、次いで、そのルミネッセ
ンスを７ｂ）に記載と同様に測定する。
（最終濃度例２参照）を加え、次いで、そのルミネッセ
ンスを７ｂ）に記載と同様に測定する。
第３図は、指示薬反応ａ）、ｂ）及びｃ）で得られた較
正曲線を示している。ここで、得られる測定信号（ａの
場合：光吸収ｂ及びｃの場合：光放出）は、結合した唾
液アミラーゼ−POD−接合体の濃度の関数として示され
ている。
正曲線を示している。ここで、得られる測定信号（ａの
場合：光吸収ｂ及びｃの場合：光放出）は、結合した唾
液アミラーゼ−POD−接合体の濃度の関数として示され
ている。
例 ７ ７−ジメチルアミノ−ナフタリン−１，２−ジカルボン
酸−ヒドラジド（DNH）の使用時の共働効果。
酸−ヒドラジド（DNH）の使用時の共働効果。
例１と同様に操作した。テストの最終濃度は次のとおり
である： DNH ０．１ｍモル／ フルオレッセイン ２５μモル／ POD ２０ｎｇ／ 過酸化水素 ０．１ｍモル／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤 （ｐＨ＝８．５） ９０．０ｍモル／ 第４表から、７−ジメチルアミノ−ナフタリン−１，２
−ジカルボン酸−ヒドラジド及びフルオレッセインの使
用時に共働効果が測定できることが明らかである。
である： DNH ０．１ｍモル／ フルオレッセイン ２５μモル／ POD ２０ｎｇ／ 過酸化水素 ０．１ｍモル／ トリス−ＨＣｌ−緩衝剤 （ｐＨ＝８．５） ９０．０ｍモル／ 第４表から、７−ジメチルアミノ−ナフタリン−１，２
−ジカルボン酸−ヒドラジド及びフルオレッセインの使
用時に共働効果が測定できることが明らかである。
第１図は光放出とフルオレッセイン濃度との関係を示す
曲線図、第２図は光放出に対するpH−値の影響を示す
図、第３図は例６における指示薬反応ａ）、ｂ）及び
ｃ）で得られた較正曲線図である。
曲線図、第２図は光放出に対するpH−値の影響を示す
図、第３図は例６における指示薬反応ａ）、ｂ）及び
ｃ）で得られた較正曲線図である。
Claims (8)
- 【請求項１】ペルオキシダーゼの存在におけるペルオキ
シド化合物によるルミノールまたは各アルキル基が炭素
原子数１〜３を有する７−ジアルキルアミノナフタリン
−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子
収率を高める方法において、反応をフルオレッセインの
存在で実施し、この際、フルオレッセインの濃度は、個
々の化学ルミネッセンス物質の量子収率の合計よりも大
きい量子収率を生じる濃度範囲に存在することを特徴と
する、ルミノールまたは７−ジアルキルアミノナフタリ
ン−１，２−ジカルボン酸ヒドラジドの量子収率を高め
る方法。 - 【請求項２】ペルオキシド化合物として、過酸化水素を
使用する、特許請求の範囲第１項記載の方法。 - 【請求項３】反応を7.5〜９のpH値で実施する、特許請
求の範囲第１項又は第２項記載の方法。 - 【請求項４】pH−値は8.5である、特許請求の範囲第３
項記載の方法。 - 【請求項５】ルミノールをペルオキシダーゼの存在で、
過酸化水素で酸化する、特許請求の範囲第１項から第４
項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項６】反応をフルオレッセイン１０〜１０００μ
モル／の存在で実施する、特許請求の範囲第１項から
第５項までのいずれか１項記載の方法。 - 【請求項７】ルミノールまたは各アルキル基が炭素原子
数１〜３を有する７−ジアルキルアミノ−ナフタリン−
１，２−ジカルボン酸−ヒドラジド、フルオレッセイ
ン、過酸化水素供給体、緩衝物質（pH7.5〜９）及び場
合により保存剤を含有することを特徴とするペルオキシ
ダーゼ測定用試薬。 - 【請求項８】ルミノールまたは７−ジアルキルアミノナ
フタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジド１０〜１
０００μモル／ フルオレッセイン１０〜１０００μモル／ 燐酸カリウム−又はグリセリ ン−緩衝剤５０〜５００ｍモル／ 過酸化水素１０〜２００μモル／ 及び場合により 保存剤0.01〜１ｍモル／ を含有する、特許請求の範囲第９項記載の試薬。
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| DE3545398.2 | 1985-12-20 | ||
| DE19853545398 DE3545398A1 (de) | 1985-12-20 | 1985-12-20 | Verfahren zur steigerung der quanten-ausbeute bei der oxidation von luminol durch peroxide in gegenwart von peroxidase |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS62156546A JPS62156546A (ja) | 1987-07-11 |
| JPH066074B2 true JPH066074B2 (ja) | 1994-01-26 |
Family
ID=6289141
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP61300228A Expired - Lifetime JPH066074B2 (ja) | 1985-12-20 | 1986-12-18 | ルミノ−ルまたは７−ジアルキルアミノナフタリン−１，２−ジカルボン酸−ヒドラジドの酸化の際の量子収率を高める方法及びペルオキシダ−ゼ測定用試薬 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
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| EP (1) | EP0228046B1 (ja) |
| JP (1) | JPH066074B2 (ja) |
| AT (1) | ATE74209T1 (ja) |
| DE (2) | DE3545398A1 (ja) |
| DK (1) | DK612186A (ja) |
| ES (1) | ES2031065T3 (ja) |
| FI (1) | FI84519C (ja) |
| ZA (1) | ZA869544B (ja) |
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| US5731148A (en) * | 1995-06-07 | 1998-03-24 | Gen-Probe Incorporated | Adduct protection assay |
| DE19623814C2 (de) * | 1995-06-15 | 1999-02-11 | Lab Molecular Biophotonics | Verfahren und Vorrichtung zur analytischen Bestimmung von 5-Hydroxyindolen oder Catecholaminen |
| GB9514594D0 (en) * | 1995-07-17 | 1995-09-13 | Johnson & Johnson Clin Diag | Chemiluminescent analytical method |
| US7799573B2 (en) | 2005-08-31 | 2010-09-21 | Normadics, Inc. | Detection of explosives and other species |
| WO2008121124A1 (en) | 2007-03-19 | 2008-10-09 | Nomadics, Inc. | Hydrogen peroxide detector and methods |
| US20120083038A1 (en) * | 2009-06-16 | 2012-04-05 | Martin Jan Peter Eversdijk | Methods for Detecting the Presence or Absence of Blood |
| KR101099508B1 (ko) | 2010-06-30 | 2011-12-27 | 중앙대학교 산학협력단 | 과붕산염 선택성을 갖는 플루오레세인계 화합물을 포함하는 센서 및 이를 이용한 과붕산염 검출방법 |
| CN101936911B (zh) * | 2010-08-06 | 2012-07-04 | 陕西师范大学 | 具有长波长化学发光及荧光和显色功能的血迹检测方法 |
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|---|---|---|---|---|
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| US4277437A (en) * | 1978-04-05 | 1981-07-07 | Syva Company | Kit for carrying out chemically induced fluorescence immunoassay |
| US4372745A (en) * | 1979-12-19 | 1983-02-08 | Electro-Nucleonics, Inc. | Chemical luminescence amplification substrate system for immunochemistry involving microencapsulated fluorescer |
| US4358535A (en) * | 1980-12-08 | 1982-11-09 | Board Of Regents Of The University Of Washington | Specific DNA probes in diagnostic microbiology |
| US4709016A (en) * | 1982-02-01 | 1987-11-24 | Northeastern University | Molecular analytical release tags and their use in chemical analysis |
| WO1983003104A1 (en) * | 1982-03-03 | 1983-09-15 | Carter, Timothy, Joseph, Nicholas | Enhanced luminescent and luminometric assay |
| JPS58158542A (ja) * | 1982-03-17 | 1983-09-20 | Hitachi Ltd | 化学発光増感法 |
| DE3463395D1 (en) * | 1983-02-11 | 1987-06-04 | Nat Res Dev | Enhanced luminescent or luminometric assay |
| AU582357B2 (en) * | 1984-04-06 | 1989-03-23 | Minnesota Mining And Manufacturing Company | Chemiluminescent methods and kit |
| GB8420053D0 (en) * | 1984-08-07 | 1984-09-12 | Secr Social Service Brit | Enhanced luminescent/luminometric assay |
-
1985
- 1985-12-20 DE DE19853545398 patent/DE3545398A1/de not_active Withdrawn
-
1986
- 1986-12-10 US US06/939,867 patent/US4834918A/en not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-17 FI FI865166A patent/FI84519C/fi not_active IP Right Cessation
- 1986-12-18 JP JP61300228A patent/JPH066074B2/ja not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-18 DK DK612186A patent/DK612186A/da not_active Application Discontinuation
- 1986-12-19 ES ES198686117749T patent/ES2031065T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 DE DE8686117749T patent/DE3684577D1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 AT AT86117749T patent/ATE74209T1/de not_active IP Right Cessation
- 1986-12-19 EP EP86117749A patent/EP0228046B1/de not_active Expired - Lifetime
- 1986-12-19 ZA ZA869544A patent/ZA869544B/xx unknown
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| ZA869544B (en) | 1987-08-26 |
| ATE74209T1 (de) | 1992-04-15 |
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| FI84519B (fi) | 1991-08-30 |
| FI865166A0 (fi) | 1986-12-17 |
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| FI84519C (fi) | 1991-12-10 |
| DE3545398A1 (de) | 1987-06-25 |
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| EP0228046A3 (en) | 1988-09-07 |
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