JP2000308492A - ヒトナース細胞レセプター遺伝子 - Google Patents
ヒトナース細胞レセプター遺伝子Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】新規なヒトナース細胞レセプター遺伝子を提供
する。 【解決手段】 配列番号２１の１位のMetから８６６位
のLeuまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置
換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、
かつヒトナース細胞レセプターであるポリペプチド。
する。 【解決手段】 配列番号２１の１位のMetから８６６位
のLeuまでのアミノ酸配列を含むポリペプチドまたは該
アミノ酸配列において１もしくは数個のアミノ酸が置
換、欠失、挿入または付加されたアミノ酸配列を含み、
かつヒトナース細胞レセプターであるポリペプチド。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、ヒトナース細胞レセプ
ター；本発明のポリペプチドをコードするDNA；本発明
の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含
み、該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生
するハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクタ
ー；本発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組
換えヒトナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒ
トナース細胞レセプターに特異的に結合するリガンドの
スクリーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプタ
ーとリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニン
グ方法；本発明のスクリーニング方法により得られる医
薬；本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出
するためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾
患を検出するためのキットに関する。
ター；本発明のポリペプチドをコードするDNA；本発明
の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含
み、該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生
するハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクタ
ー；本発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組
換えヒトナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒ
トナース細胞レセプターに特異的に結合するリガンドの
スクリーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプタ
ーとリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニン
グ方法；本発明のスクリーニング方法により得られる医
薬；本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出
するためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾
患を検出するためのキットに関する。
【０００２】
【従来の技術】胸腺は、免疫機能の発達に重要な役割を
果たし、特にT細胞の分化や成熟に不可欠な器官であ
る。胸腺微小環境は、マクロファージ、樹状細胞、線維
細胞、上皮細胞などから構成される。この上皮細胞に、
胸腺ナース細胞が存在している(Wekerle, H. et al., N
ature, 283:402, 1980; Wekerle, H. et al., J. Exp.
Med., 151:929, 1980)。さらに、ナース細胞は胸腺以外
の、ヒトやマウスの皮膚組織（Iwagami, S. etal., I.
Immunol., 153, 2927-2938, 1994）、骨髄（豊崎ら, 炎
症と免疫, 2:643-649, 1994）、リウマチ患者の滑膜
（豊崎ら, 臨床免疫, 27: 167, 1995）、腫瘍の原発巣
及び転移巣（Itoh, T. et al., Eur. J. Immunol., 18,
821-824,1988、Hiai, H. et al., J. Natl. Cancer In
st., 66, 713-722, 1981）に存在することが確認されて
いる。胸腺ナース細胞は、未熟なT細胞を細胞内に多数
抱え込んだ細胞である。従って、このナース細胞は、T
細胞の成熟・分化に関与し、T細胞のpositive selectio
nおよびnegative selectionに関与している可能性があ
るものの、その機能については不明な点が多い。
果たし、特にT細胞の分化や成熟に不可欠な器官であ
る。胸腺微小環境は、マクロファージ、樹状細胞、線維
細胞、上皮細胞などから構成される。この上皮細胞に、
胸腺ナース細胞が存在している(Wekerle, H. et al., N
ature, 283:402, 1980; Wekerle, H. et al., J. Exp.
Med., 151:929, 1980)。さらに、ナース細胞は胸腺以外
の、ヒトやマウスの皮膚組織（Iwagami, S. etal., I.
Immunol., 153, 2927-2938, 1994）、骨髄（豊崎ら, 炎
症と免疫, 2:643-649, 1994）、リウマチ患者の滑膜
（豊崎ら, 臨床免疫, 27: 167, 1995）、腫瘍の原発巣
及び転移巣（Itoh, T. et al., Eur. J. Immunol., 18,
821-824,1988、Hiai, H. et al., J. Natl. Cancer In
st., 66, 713-722, 1981）に存在することが確認されて
いる。胸腺ナース細胞は、未熟なT細胞を細胞内に多数
抱え込んだ細胞である。従って、このナース細胞は、T
細胞の成熟・分化に関与し、T細胞のpositive selectio
nおよびnegative selectionに関与している可能性があ
るものの、その機能については不明な点が多い。
【０００３】一方、ディジョージ症候群は、胸腺の無ま
たは低形成、副甲状腺の無または低形成に起因する低カ
ルシウム血症、顔貌異常、心大血管系異常を特徴とする
先天性自己免疫疾患および臓器形成異常性疾患である。
ディジョージ症候群の多くの症例で、第２２染色体長腕
の欠失が観察されることにより、ディジョージ症候群を
含む臓器形成異常性疾患、特にＣＡＴＣＨ２２（cardia
c defects, abnormalfacies, thymic hypoplasia, clef
t palate, and hypocalcemia on chromosome22）の責任
遺伝子が同じ部位に存在するのではないかと想定されて
いる。
たは低形成、副甲状腺の無または低形成に起因する低カ
ルシウム血症、顔貌異常、心大血管系異常を特徴とする
先天性自己免疫疾患および臓器形成異常性疾患である。
ディジョージ症候群の多くの症例で、第２２染色体長腕
の欠失が観察されることにより、ディジョージ症候群を
含む臓器形成異常性疾患、特にＣＡＴＣＨ２２（cardia
c defects, abnormalfacies, thymic hypoplasia, clef
t palate, and hypocalcemia on chromosome22）の責任
遺伝子が同じ部位に存在するのではないかと想定されて
いる。
【０００４】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、ヒト
ナース細胞レセプター；本発明のポリペプチドをコード
するDNA；ヒトナース細胞レセプター遺伝子；本発明の
塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含み、
該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリペプ
チドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生する
ハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクター；本
発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組換えヒ
トナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒトナー
ス細胞レセプターに特異的に結合するリガンドのスクリ
ーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプターとリ
ガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方
法；本発明のスクリーニング方法により得られる医薬；
本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出する
ためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾患を
検出するためのキットを提供することにある。
ナース細胞レセプター；本発明のポリペプチドをコード
するDNA；ヒトナース細胞レセプター遺伝子；本発明の
塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含み、
該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリペプ
チドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生する
ハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクター；本
発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組換えヒ
トナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒトナー
ス細胞レセプターに特異的に結合するリガンドのスクリ
ーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプターとリ
ガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方
法；本発明のスクリーニング方法により得られる医薬；
本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出する
ためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾患を
検出するためのキットを提供することにある。
【０００５】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、ナース細
胞の機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねてきた。その
結果、ヒトナース細胞膜表面に発現するヒトナース細胞
レセプター（以下、ヒトB6TNC#10または本レセプターと
略する）をコードする遺伝子を見出し、本発明を完成す
るに至った。本レセプター遺伝子は、全長3,462bpから
なり、ディジョージ症候群の原因領域に相当するヒトゲ
ノムDNA配列（GenBank Accession No.:AC005500）に相
同性を示す。また、本レセプターは、遺伝子の塩基配列
から予想されるオープンリーディングフレームでは８６
６個のアミノ酸からなるタンパク質である。マウスB6TN
C#10以外で、本レセプターのcDNAと最も高い相同性を示
したのは、アセチル低比重リポタンパク質（low densit
y lipoprotein: LDL）レセプター（Adachi, H. et al.,
J. Biol. Chem., 272, 31217-31220, 1997）であり、
相同性は、３９％であった。アセチルLDLレセプター
は、アセチルLDLを細胞内へ取り込む機能を有する（Gol
dstein, J. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76, 333-337, 1979）。このような機能を有するレセプ
ターは、スカベンジャーレセプターと命名されている。
スカベンジャーレセプターは、マクロファージの泡沫化
に関与し、動脈硬化形成の原因と考えられる。本レセプ
ターもスカベンジャーレセプターファミリーに属するこ
とが想定される。
胞の機能の解明を目指して鋭意研鑚を重ねてきた。その
結果、ヒトナース細胞膜表面に発現するヒトナース細胞
レセプター（以下、ヒトB6TNC#10または本レセプターと
略する）をコードする遺伝子を見出し、本発明を完成す
るに至った。本レセプター遺伝子は、全長3,462bpから
なり、ディジョージ症候群の原因領域に相当するヒトゲ
ノムDNA配列（GenBank Accession No.:AC005500）に相
同性を示す。また、本レセプターは、遺伝子の塩基配列
から予想されるオープンリーディングフレームでは８６
６個のアミノ酸からなるタンパク質である。マウスB6TN
C#10以外で、本レセプターのcDNAと最も高い相同性を示
したのは、アセチル低比重リポタンパク質（low densit
y lipoprotein: LDL）レセプター（Adachi, H. et al.,
J. Biol. Chem., 272, 31217-31220, 1997）であり、
相同性は、３９％であった。アセチルLDLレセプター
は、アセチルLDLを細胞内へ取り込む機能を有する（Gol
dstein, J. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA,
76, 333-337, 1979）。このような機能を有するレセプ
ターは、スカベンジャーレセプターと命名されている。
スカベンジャーレセプターは、マクロファージの泡沫化
に関与し、動脈硬化形成の原因と考えられる。本レセプ
ターもスカベンジャーレセプターファミリーに属するこ
とが想定される。
【０００６】すなわち、本発明は、配列番号２１の１位
のMetから８６６位のLeuまでのアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド；本発明のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミ
ノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプターである
ポリペプチド；本発明のポリペプチドからなるヒトナー
ス細胞レセプター；本発明のポリペプチドをコードする
DNA；配列番号２０の７２位のAから２６６９位のGまで
の塩基配列を含む本発明のDNA；本発明のDNAとストリン
ジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒトナース細
胞レセプターであるポリペプチドをコードするDNA；本
発明のDNAからなるヒトナース細胞レセプター遺伝子；
配列番号２０に記載の塩基配列中の連続した少なくとも
１４個の塩基を含み、該塩基配列と特異的に結合するDN
A；配列番号１３から１９のいずれかに記載の塩基配列
中の連続した少なくとも１４個の塩基を含む本発明のDN
A；本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体；モ
ノクローナル抗体である、本発明の抗体；本発明のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ；本発明のDN
Aを有する発現ベクター；本発明の発現ベクターを宿主
に導入して得られる形質転換体；本発明の形質転換体を
培養する工程、および生産された組換えタンパク質を培
養培地から回収する工程を包含する、組換えヒトナース
細胞レセプターの製造方法；本発明の形質転換体または
本発明の製造方法より得られたヒトナース細胞レセプタ
ーを用いた、ヒトナース細胞レセプターに特異的に結合
するリガンドのスクリーニング方法；本発明の形質転換
体または本発明の製造方法より得られたヒトナース細胞
レセプターと本発明のスクリーニング方法より得られる
リガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方
法；本発明のスクリーニング方法より得られる医薬；本
発明のDNAを含む、ディジョージ症候群を検出するため
のキット；本発明のDNAを含む、自己免疫疾患を検出す
るためのキット、に関する。
のMetから８６６位のLeuまでのアミノ酸配列を含むポリ
ペプチド；本発明のアミノ酸配列において１もしくは数
個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加されたアミ
ノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプターである
ポリペプチド；本発明のポリペプチドからなるヒトナー
ス細胞レセプター；本発明のポリペプチドをコードする
DNA；配列番号２０の７２位のAから２６６９位のGまで
の塩基配列を含む本発明のDNA；本発明のDNAとストリン
ジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒトナース細
胞レセプターであるポリペプチドをコードするDNA；本
発明のDNAからなるヒトナース細胞レセプター遺伝子；
配列番号２０に記載の塩基配列中の連続した少なくとも
１４個の塩基を含み、該塩基配列と特異的に結合するDN
A；配列番号１３から１９のいずれかに記載の塩基配列
中の連続した少なくとも１４個の塩基を含む本発明のDN
A；本発明のポリペプチドを特異的に認識する抗体；モ
ノクローナル抗体である、本発明の抗体；本発明のモノ
クローナル抗体を産生するハイブリドーマ；本発明のDN
Aを有する発現ベクター；本発明の発現ベクターを宿主
に導入して得られる形質転換体；本発明の形質転換体を
培養する工程、および生産された組換えタンパク質を培
養培地から回収する工程を包含する、組換えヒトナース
細胞レセプターの製造方法；本発明の形質転換体または
本発明の製造方法より得られたヒトナース細胞レセプタ
ーを用いた、ヒトナース細胞レセプターに特異的に結合
するリガンドのスクリーニング方法；本発明の形質転換
体または本発明の製造方法より得られたヒトナース細胞
レセプターと本発明のスクリーニング方法より得られる
リガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニング方
法；本発明のスクリーニング方法より得られる医薬；本
発明のDNAを含む、ディジョージ症候群を検出するため
のキット；本発明のDNAを含む、自己免疫疾患を検出す
るためのキット、に関する。
【０００７】本発明のポリペプチドは、「配列番号２１
の１位のMetから８６６位のLeuまでのアミノ酸配列を含
むポリペプチド」または「該アミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加さ
れたアミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプタ
ーであるポリペプチド」を指す。「アミノ酸が置換され
たアミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプター
であるポリペプチド」としては、配列番号２４のポリペ
プチドが例示される。また、「アミノ酸が挿入されたア
ミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプターであ
るポリペプチド」としては、配列番号２６のポリペプチ
ドが例示される。「ヒトナース細胞レセプター」とは、
ヒトナース細胞の細胞膜に発現するタンパク質である。
「ナース細胞」とは、リンパ球など自分自身以外の細胞
を細胞内に抱き込むことができる能力がある細胞を言
う。ヒトナース細胞株としては、ヒト細胞株SK-LMS-1細
胞（ATCC No. HTB 88）、HSNC細胞（Iwagami, S. et a
l. (1994) J. Immunol. 153,2927）、Hs729T細胞（ATCC
No. HTB 153）、Hs67細胞（ATCC No. HTB 163）、CCD-
19Lu細胞（ATCC No. CCL 211）、RANC細胞（Shimaoka,
Y. et al., (1998) J.Clin. Invest., 102, 606）が例
示できる。
の１位のMetから８６６位のLeuまでのアミノ酸配列を含
むポリペプチド」または「該アミノ酸配列において１も
しくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加さ
れたアミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプタ
ーであるポリペプチド」を指す。「アミノ酸が置換され
たアミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプター
であるポリペプチド」としては、配列番号２４のポリペ
プチドが例示される。また、「アミノ酸が挿入されたア
ミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプターであ
るポリペプチド」としては、配列番号２６のポリペプチ
ドが例示される。「ヒトナース細胞レセプター」とは、
ヒトナース細胞の細胞膜に発現するタンパク質である。
「ナース細胞」とは、リンパ球など自分自身以外の細胞
を細胞内に抱き込むことができる能力がある細胞を言
う。ヒトナース細胞株としては、ヒト細胞株SK-LMS-1細
胞（ATCC No. HTB 88）、HSNC細胞（Iwagami, S. et a
l. (1994) J. Immunol. 153,2927）、Hs729T細胞（ATCC
No. HTB 153）、Hs67細胞（ATCC No. HTB 163）、CCD-
19Lu細胞（ATCC No. CCL 211）、RANC細胞（Shimaoka,
Y. et al., (1998) J.Clin. Invest., 102, 606）が例
示できる。
【０００８】本発明のDNAとは、本発明のポリペプチド
をコードするDNAを指す。例えば、配列番号２０の７２
位のAから２６６９位のGまでの塩基配列を含むDNAが例
示される。更に、本発明のDNAとストリンジェントな条
件でハイブリダイズし、かつヒトナース細胞レセプター
であるポリペプチドをコードするDNAも、本発明のDNAに
含まれる。「DNAにストリンジェントな条件でハイブリ
ダイズするDNA」は、コード領域のDNAをプローブとして
用いることにより得ることが出来る。ここで、「ストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例え
ば、６ｘSSC、0.5%SDSおよび50%ホルムアミドの溶液中
で42℃にて加温した後、0.1xSSC、0.5%SDSの溶液中で68
℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイ
ズのシグナルが観察されることを表す。「本発明のDNA
にストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA」
としては、配列番号２３または配列番号２５で示される
DNAが例示される。更に、本発明のDNAには、「配列番号
２０に記載の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の
塩基を含み、該塩基配列と特異的に結合するDNA」も含
まれる。好ましくは、配列番号１３から１９、２２のい
ずれかに記載の塩基配列を含むDNAである。「特異的に
結合する」とは、ハイブリダイスすることを指す。この
ようなDNAは、プライマーまたはプローブとして有用で
ある。このようなDNAを用いることにより、ディジョー
ジ症候群の検出が可能となる。従って、本発明のDNAは
ディジョージ症候群の検出キットを提供するものであ
る。更に、本レセプターが欠損した場合には、ナース細
胞によるT細胞の成熟・分化が正常におこなわれない可
能性がある。従って、本発明のDNAは、本レセプターの
欠損に起因する自己免疫疾患の検出キットを提供するも
のである。
をコードするDNAを指す。例えば、配列番号２０の７２
位のAから２６６９位のGまでの塩基配列を含むDNAが例
示される。更に、本発明のDNAとストリンジェントな条
件でハイブリダイズし、かつヒトナース細胞レセプター
であるポリペプチドをコードするDNAも、本発明のDNAに
含まれる。「DNAにストリンジェントな条件でハイブリ
ダイズするDNA」は、コード領域のDNAをプローブとして
用いることにより得ることが出来る。ここで、「ストリ
ンジェントな条件でハイブリダイズする」とは、例え
ば、６ｘSSC、0.5%SDSおよび50%ホルムアミドの溶液中
で42℃にて加温した後、0.1xSSC、0.5%SDSの溶液中で68
℃にて洗浄する条件でも依然として陽性のハイブリダイ
ズのシグナルが観察されることを表す。「本発明のDNA
にストリンジェントな条件でハイブリダイズするDNA」
としては、配列番号２３または配列番号２５で示される
DNAが例示される。更に、本発明のDNAには、「配列番号
２０に記載の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の
塩基を含み、該塩基配列と特異的に結合するDNA」も含
まれる。好ましくは、配列番号１３から１９、２２のい
ずれかに記載の塩基配列を含むDNAである。「特異的に
結合する」とは、ハイブリダイスすることを指す。この
ようなDNAは、プライマーまたはプローブとして有用で
ある。このようなDNAを用いることにより、ディジョー
ジ症候群の検出が可能となる。従って、本発明のDNAは
ディジョージ症候群の検出キットを提供するものであ
る。更に、本レセプターが欠損した場合には、ナース細
胞によるT細胞の成熟・分化が正常におこなわれない可
能性がある。従って、本発明のDNAは、本レセプターの
欠損に起因する自己免疫疾患の検出キットを提供するも
のである。
【０００９】本発明の抗体は、本発明のポリペプチドま
たはエピトープを構成しえるペプチド断片に対する抗体
であり、モロクローナル抗体とポリクローナル抗体のい
ずれをも含む。本発明のハイブリドーマは、該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明の
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、cDNAライ
ブラリーのスクリーニング、診断薬・実験用試薬等に有
用である。また、医薬として使用することもできる。
たはエピトープを構成しえるペプチド断片に対する抗体
であり、モロクローナル抗体とポリクローナル抗体のい
ずれをも含む。本発明のハイブリドーマは、該モノクロ
ーナル抗体を産生するハイブリドーマである。本発明の
抗体は、アフィニティークロマトグラフィー、cDNAライ
ブラリーのスクリーニング、診断薬・実験用試薬等に有
用である。また、医薬として使用することもできる。
【００１０】本発明には、本発明のDNAを有する発現ベ
クター、該発現ベクターを宿主に導入することにより形
質転換体、該形質転換体を用いた組換えヒトナース細胞
レセプターの製造方法が提供される。「発現ベクター」
としては、例えば、細菌についてはpRSET、pET、pGEME
X、pKK233-2など、酵母についてはpYES2、昆虫細胞につ
いてはpVL1393、pFastBac1、動物細胞についてはpEF-BO
S、pSRa、pDR2などが挙げられる。「宿主」としては、
細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞が挙げられる。
クター、該発現ベクターを宿主に導入することにより形
質転換体、該形質転換体を用いた組換えヒトナース細胞
レセプターの製造方法が提供される。「発現ベクター」
としては、例えば、細菌についてはpRSET、pET、pGEME
X、pKK233-2など、酵母についてはpYES2、昆虫細胞につ
いてはpVL1393、pFastBac1、動物細胞についてはpEF-BO
S、pSRa、pDR2などが挙げられる。「宿主」としては、
細菌、酵母、昆虫細胞、または動物細胞が挙げられる。
【００１１】本発明は、本レセプターに特異的に結合す
るリガンドのスクリーニング方法と提供する。リガンド
としては、分泌型ペプチド、細胞膜タンパク質、
脂肪や核酸などの生体内代謝物、などが考えられる。リ
ガンドのスクリーニング方法としては、このようなリガ
ンド候補物質をアイソトープラベルや蛍光ラベルし、本
レセプターを発現する細胞または膜画分との結合試験を
行なう方法が挙げられる。実施例で示すとおり、本レセ
プターは、アセチルLDL（low density lipoprotein）レ
セプターと相同性を示す。アセチルLDLは、変性した脂
肪であり、生体内代謝物に該当する。従って、アセチル
LDLが本レセプターのリガンドである可能性は高い。
るリガンドのスクリーニング方法と提供する。リガンド
としては、分泌型ペプチド、細胞膜タンパク質、
脂肪や核酸などの生体内代謝物、などが考えられる。リ
ガンドのスクリーニング方法としては、このようなリガ
ンド候補物質をアイソトープラベルや蛍光ラベルし、本
レセプターを発現する細胞または膜画分との結合試験を
行なう方法が挙げられる。実施例で示すとおり、本レセ
プターは、アセチルLDL（low density lipoprotein）レ
セプターと相同性を示す。アセチルLDLは、変性した脂
肪であり、生体内代謝物に該当する。従って、アセチル
LDLが本レセプターのリガンドである可能性は高い。
【００１２】リガンドが特定されれば、本ヒトナース細
胞レセプターとリガンドの結合を阻害する化合物のスク
リーニングが可能となる。「リガンドの結合を阻害する
化合物」には、アゴニスト及びアンタゴニストが含まれ
る。該化合物のスクリーニング方法としては、標識した
リガンド、本レセプターおよび候補化合物をインキュベ
ートし、結合活性を測定する方法が挙げられる。
胞レセプターとリガンドの結合を阻害する化合物のスク
リーニングが可能となる。「リガンドの結合を阻害する
化合物」には、アゴニスト及びアンタゴニストが含まれ
る。該化合物のスクリーニング方法としては、標識した
リガンド、本レセプターおよび候補化合物をインキュベ
ートし、結合活性を測定する方法が挙げられる。
【００１３】前述のとおり、本発明のヒトナース細胞レ
セプターは、スカベンジャーレセプターとして機能し、
動脈硬化に関与することが予想される。従って、本発明
のペプチドとリガンドとの結合を阻害する化合物は、動
脈硬化の治療に有用であると考えられる。また、前述の
とおり、ナース細胞は、胸腺、皮膚組織、骨髄、リンパ
節、肝臓、脳、リウマチ患者の滑膜、癌の原発巣及び転
移巣に存在することが確認されている。ナース 細胞
は、血球系幹細胞の増殖と自己再生能の維持及びリンパ
球の正及び負の選択に関与し、正常な免疫系の発生とメ
モリー細胞の維持に関与していると考えられる。よっ
て、ナース細胞膜表面に発現する本レセプターの機能異
常が免疫系の機能異常と自己免疫疾 患の発症に関わる
ことが予想される。そのため、本発明のスクリーニング
により得られるアゴニストおよびアンタゴニストは、自
己免疫疾患と腫瘍に対する治療に有用であることが考え
られる。
セプターは、スカベンジャーレセプターとして機能し、
動脈硬化に関与することが予想される。従って、本発明
のペプチドとリガンドとの結合を阻害する化合物は、動
脈硬化の治療に有用であると考えられる。また、前述の
とおり、ナース細胞は、胸腺、皮膚組織、骨髄、リンパ
節、肝臓、脳、リウマチ患者の滑膜、癌の原発巣及び転
移巣に存在することが確認されている。ナース 細胞
は、血球系幹細胞の増殖と自己再生能の維持及びリンパ
球の正及び負の選択に関与し、正常な免疫系の発生とメ
モリー細胞の維持に関与していると考えられる。よっ
て、ナース細胞膜表面に発現する本レセプターの機能異
常が免疫系の機能異常と自己免疫疾 患の発症に関わる
ことが予想される。そのため、本発明のスクリーニング
により得られるアゴニストおよびアンタゴニストは、自
己免疫疾患と腫瘍に対する治療に有用であることが考え
られる。
【００１４】
【発明の実施の形態】本発明は、おもにヒトナース細胞
レセプターに関する。以下に本発明タンパク質の調製工
程、抗体の調製工程、リガンドのスクリーニング方法、
アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法を
説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当
該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫
細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技
術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免
疫学的手法が採用される。
レセプターに関する。以下に本発明タンパク質の調製工
程、抗体の調製工程、リガンドのスクリーニング方法、
アゴニスト及びアンタゴニストのスクリーニング方法を
説明する。本明細書において、特に指示のない限り、当
該分野で公知である遺伝子組換え技術、動物細胞、昆虫
細胞、酵母および大腸菌での組換えタンパク質の生産技
術、発現したタンパク質の分離精製法、分析法および免
疫学的手法が採用される。
【００１５】本発明タンパク質の調製 本発明タンパク質をコードするDNAを含むDNA断片の配列
決定方法を例示する。このDNA断片の配列は、例えば、
マウス細胞株B6TNC（Nanno, M. et al., J. Immunol.,
155, 2918, 1995）などから由来したcDNAから得ること
ができる。そのためには、まず、cDNAから本タンパク質
をコードするcDNAのクローニングを行なうためのプライ
マーが必要である。 （１） マウスナース細胞レセプターをコードするcDNA
断片の単離 ナース細胞特異的に発現する遺伝子を得るため、ナース
細胞（例えば、B6TNC）および非ナース細胞（例えば、L
929細胞）よりmRNAを精製する。ナース細胞mRNAよりfir
st strand cDNAを合成する。得られたFirst strand cDN
Aは一本鎖化する。一方、非ナース細胞mRNAはビオチン
化を行なう。ナース細胞first strand cDNAとビオチン
化非ナース細胞mRNAをインキュベートする。インキュベ
ート後、ストレプトアビジンを添加し、ハイブリダイズ
したcDNAとビオチン化mRNAを抽出する。残ったcDNAはナ
ース細胞特異的cDNAである。このcDNAより二本鎖cDNAを
合成し、プラスミドベクターに挿入する。このプラスミ
ドを大腸菌などに遺伝子導入し、プラスミドDNAを回収
し、cDNA断片の塩基配列を決定する。
決定方法を例示する。このDNA断片の配列は、例えば、
マウス細胞株B6TNC（Nanno, M. et al., J. Immunol.,
155, 2918, 1995）などから由来したcDNAから得ること
ができる。そのためには、まず、cDNAから本タンパク質
をコードするcDNAのクローニングを行なうためのプライ
マーが必要である。 （１） マウスナース細胞レセプターをコードするcDNA
断片の単離 ナース細胞特異的に発現する遺伝子を得るため、ナース
細胞（例えば、B6TNC）および非ナース細胞（例えば、L
929細胞）よりmRNAを精製する。ナース細胞mRNAよりfir
st strand cDNAを合成する。得られたFirst strand cDN
Aは一本鎖化する。一方、非ナース細胞mRNAはビオチン
化を行なう。ナース細胞first strand cDNAとビオチン
化非ナース細胞mRNAをインキュベートする。インキュベ
ート後、ストレプトアビジンを添加し、ハイブリダイズ
したcDNAとビオチン化mRNAを抽出する。残ったcDNAはナ
ース細胞特異的cDNAである。このcDNAより二本鎖cDNAを
合成し、プラスミドベクターに挿入する。このプラスミ
ドを大腸菌などに遺伝子導入し、プラスミドDNAを回収
し、cDNA断片の塩基配列を決定する。
【００１６】（２）全長マウスB6TNC#10 cDNAの同定 単離されたcDNA断片を元に、ホモロジー検索を行なう。
その結果、ディジョージ症候群遺伝子座に相当するマウ
スゲノムDNA配列と相同性を示した。このマウスゲノムD
NA配列は、アセチルLDLレセプターcDNAと相同性を示
す。そこで、ゲノム配列を元に、プライマーを合成す
る。つぎに、例えばマウス細胞株B6TNC（Nanno, M. et
al., J. Immunol., 155, 2918, 1995）、IT-79 MTNC3
(Itoh, T. et al.(1998) Eur. J. Immunol. 18,821)、D
oi Nurse（Iwagami, S. et al. (1994) J. Immunol. 15
3,2927）、C3H10T1/2 clone8 (ATCC No.CCL-226)からTRI
zol TM（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いてtotal
RNAを調製する。得られたtotal RNAはmRNA purificatio
n Kit（ファルマシア社）を用いて精製し、mRNAを得
る。このmRNAからcDNA末端迅速増幅法（rapid amplific
ation of cDNA enbs, RACE法）（Frohman et al., Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002, 1988）によ
り5'側、3'側および5'RACEおよび3'RACEで同定していな
い領域のcDNA断片を増幅し、cDNAの全長にわたる塩基配
列を決定する。5'RACEと3'RACEは、5' RACE System for
Rapid Amplification of cDNA Ends（Life Technologi
es, Inc.）と合成したプライマーを用いる。5'RACEと3'
RACEで同定していない領域は、Super Script TM Preamp
lificationSystem for First Strand cDNA Synthesis
（Life Technologies, Inc.）と合成したプライマーを
用いる。得られたそれぞれのDNA断片は、プラスミドベ
クターに挿入し、クローニングする。クローニングした
DNA断片は、ABI Prism TM dRhodamine Terminator Cycl
e Sequenceing Ready Reaction Kit（Applied Biosyste
ms社）とABI Prism TM 310 Genetic Analyzer（Applied
Biosystems社）を用いて、塩基配列決定を行なう。決
定した３種類のcDNAクローンの塩基配列に共通する領域
を調べ、これにより、全長cDNAの塩基配列が決定され
る。
その結果、ディジョージ症候群遺伝子座に相当するマウ
スゲノムDNA配列と相同性を示した。このマウスゲノムD
NA配列は、アセチルLDLレセプターcDNAと相同性を示
す。そこで、ゲノム配列を元に、プライマーを合成す
る。つぎに、例えばマウス細胞株B6TNC（Nanno, M. et
al., J. Immunol., 155, 2918, 1995）、IT-79 MTNC3
(Itoh, T. et al.(1998) Eur. J. Immunol. 18,821)、D
oi Nurse（Iwagami, S. et al. (1994) J. Immunol. 15
3,2927）、C3H10T1/2 clone8 (ATCC No.CCL-226)からTRI
zol TM（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いてtotal
RNAを調製する。得られたtotal RNAはmRNA purificatio
n Kit（ファルマシア社）を用いて精製し、mRNAを得
る。このmRNAからcDNA末端迅速増幅法（rapid amplific
ation of cDNA enbs, RACE法）（Frohman et al., Pro
c. Natl.Acad. Sci. USA, 85: 8998-9002, 1988）によ
り5'側、3'側および5'RACEおよび3'RACEで同定していな
い領域のcDNA断片を増幅し、cDNAの全長にわたる塩基配
列を決定する。5'RACEと3'RACEは、5' RACE System for
Rapid Amplification of cDNA Ends（Life Technologi
es, Inc.）と合成したプライマーを用いる。5'RACEと3'
RACEで同定していない領域は、Super Script TM Preamp
lificationSystem for First Strand cDNA Synthesis
（Life Technologies, Inc.）と合成したプライマーを
用いる。得られたそれぞれのDNA断片は、プラスミドベ
クターに挿入し、クローニングする。クローニングした
DNA断片は、ABI Prism TM dRhodamine Terminator Cycl
e Sequenceing Ready Reaction Kit（Applied Biosyste
ms社）とABI Prism TM 310 Genetic Analyzer（Applied
Biosystems社）を用いて、塩基配列決定を行なう。決
定した３種類のcDNAクローンの塩基配列に共通する領域
を調べ、これにより、全長cDNAの塩基配列が決定され
る。
【００１７】（３）全長ヒトB6TNC#10 cDNAの同定 単離されたマウスB6TNC#10 cDNA配列を元に、ホモロジ
ー検索を行なう。その結果、ディジョージ症候群遺伝子
座に相当するゲノムDNA配列（GenBank Accession No.:
AC005500）と相同性を示す。そこで、ヒトゲノム配列と
マウスB6TNC#10cDNAに相同性を示した部分を元に、プラ
イマーを合成する。つぎに、例えばヒトナース細胞株SK
-LMS-1細胞（ATCC No. HTB 88）からTRIzol TM（LIFE T
ECHNOLOGIES,INC.社製）を用いてtotal RNAを調製す
る。得られたtotal RNAはmRNA purification Kit（ファ
ルマシア社）を用いて精製し、mRNAを得る。このmRNAか
らcDNA末端迅速増幅法（rapid amplification of cDNA
enbs,RACE法）（Frohman et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 85: 8998-9002, 1988）により5'側、3'側およ
び5'RACEおよび3'RACEで同定していない領域のcDNA断片
を増幅し、cDNAの全長にわたる塩基配列を決定する。5'
RACEと3'RACEは、5' RACE System for Rapid Amplifica
tion of cDNA Ends（Life Technologies, Inc.）と合成
したプライマーを用いる。5'RACEと3'RACEで同定してい
ない領域は、Super Script TM PreamplificationSystem
for First Strand cDNA Synthesis（Life Technologie
s, Inc.）と合成したプライマーを用いる。得られたそ
れぞれのDNA断片は、プラスミドベクターに挿入し、ク
ローニングする。クローニングしたDNA断片は、ABI Pri
sm TM dRhodamine Terminator Cycle Sequenceing Read
y Reaction Kit（Applied Biosystems社）とABI Prism
TM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を
用いて、塩基配列決定を行なう。決定した３種類のcDNA
クローンの塩基配列に共通する領域を調べ、これによ
り、ヒトB6TNC#10の全長cDNAの塩基配列が決定される。
ー検索を行なう。その結果、ディジョージ症候群遺伝子
座に相当するゲノムDNA配列（GenBank Accession No.:
AC005500）と相同性を示す。そこで、ヒトゲノム配列と
マウスB6TNC#10cDNAに相同性を示した部分を元に、プラ
イマーを合成する。つぎに、例えばヒトナース細胞株SK
-LMS-1細胞（ATCC No. HTB 88）からTRIzol TM（LIFE T
ECHNOLOGIES,INC.社製）を用いてtotal RNAを調製す
る。得られたtotal RNAはmRNA purification Kit（ファ
ルマシア社）を用いて精製し、mRNAを得る。このmRNAか
らcDNA末端迅速増幅法（rapid amplification of cDNA
enbs,RACE法）（Frohman et al., Proc. Natl. Acad. S
ci. USA, 85: 8998-9002, 1988）により5'側、3'側およ
び5'RACEおよび3'RACEで同定していない領域のcDNA断片
を増幅し、cDNAの全長にわたる塩基配列を決定する。5'
RACEと3'RACEは、5' RACE System for Rapid Amplifica
tion of cDNA Ends（Life Technologies, Inc.）と合成
したプライマーを用いる。5'RACEと3'RACEで同定してい
ない領域は、Super Script TM PreamplificationSystem
for First Strand cDNA Synthesis（Life Technologie
s, Inc.）と合成したプライマーを用いる。得られたそ
れぞれのDNA断片は、プラスミドベクターに挿入し、ク
ローニングする。クローニングしたDNA断片は、ABI Pri
sm TM dRhodamine Terminator Cycle Sequenceing Read
y Reaction Kit（Applied Biosystems社）とABI Prism
TM 310 Genetic Analyzer（Applied Biosystems社）を
用いて、塩基配列決定を行なう。決定した３種類のcDNA
クローンの塩基配列に共通する領域を調べ、これによ
り、ヒトB6TNC#10の全長cDNAの塩基配列が決定される。
【００１８】（４）組換え体の発現 得られた全長cDNAを適当な発現ベクターに組み込み、タ
ンパク質を発現するための発現ベクターとする。適切な
発現ベクターとしては、例えば、細菌についてはpRSE
T、pET、pGEMEX、pKK233-2など、酵母についてはpYES
2、昆虫細胞についてはpVL1393、pFastBac1、動物細胞
についてはpEF-BOS、pSRa、pDR2などが挙げられる。こ
の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して、形質転換
体を作製する。宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細
胞、または動物細胞が挙げられる。大腸菌、酵母では、
強力なプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺
伝子を挿入した発現ベクターで形質転換し、これら形質
転換体を培養することによりタンパク質を産生できる。
昆虫細胞、動物細胞では、タンパク質の遺伝子を強力な
プロモーターの下流に挿入し、効果的な選択マーカーと
共に動物細胞に導入し、薬剤に対する耐性により細胞を
選択し、高発現の細胞株を樹立し得る。また、タンパク
質前駆体の遺伝子をウイルスまたはレトロウイルスに組
み込み、この組換えウイルスを動物細胞に感染させるこ
とにより、発現し得る。これら形質転換体を培養するこ
とにより、タンパク質が産生され得る。得られたタンパ
ク質の精製は、当業者に周知の方法、例えば、アフィニ
ティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水
クルマトグラフィーなどを組み合わせて行なうことがで
きる（Imai et al., J. Biol. Chem., 271: 21514-2152
1, 1996）。
ンパク質を発現するための発現ベクターとする。適切な
発現ベクターとしては、例えば、細菌についてはpRSE
T、pET、pGEMEX、pKK233-2など、酵母についてはpYES
2、昆虫細胞についてはpVL1393、pFastBac1、動物細胞
についてはpEF-BOS、pSRa、pDR2などが挙げられる。こ
の発現ベクターを適当な宿主細胞に導入して、形質転換
体を作製する。宿主細胞としては、細菌、酵母、昆虫細
胞、または動物細胞が挙げられる。大腸菌、酵母では、
強力なプロモーターの下流にタンパク質をコードする遺
伝子を挿入した発現ベクターで形質転換し、これら形質
転換体を培養することによりタンパク質を産生できる。
昆虫細胞、動物細胞では、タンパク質の遺伝子を強力な
プロモーターの下流に挿入し、効果的な選択マーカーと
共に動物細胞に導入し、薬剤に対する耐性により細胞を
選択し、高発現の細胞株を樹立し得る。また、タンパク
質前駆体の遺伝子をウイルスまたはレトロウイルスに組
み込み、この組換えウイルスを動物細胞に感染させるこ
とにより、発現し得る。これら形質転換体を培養するこ
とにより、タンパク質が産生され得る。得られたタンパ
ク質の精製は、当業者に周知の方法、例えば、アフィニ
ティーカラム、イオン交換クロマトグラフィー、ゲル濾
過クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー、疎水
クルマトグラフィーなどを組み合わせて行なうことがで
きる（Imai et al., J. Biol. Chem., 271: 21514-2152
1, 1996）。
【００１９】（５）変異体の作成 アミノ酸配列は、任意のアミノ酸配列を欠失させ、所望
のアミノ酸、ないしはアミノ酸配列を導入することによ
って置換される。アミノ酸配列の置換処理には、プロテ
インエンジニアリングとして知られる方法が広く利用で
きるが、例えば、Site-diredted deletion（部位指定削
除）法（Nucl. Acids Res., 11, 1645,1983）、Site-sp
ecific mutagenesis（部位特異的変異）法（Zoller, M.
J. etal., Methods in Enzymol., 100, 468, 1983、Ku
nkel. T.A. et al., Methods in Enzymol., 154, 367-3
82, 1987）、PCR突然変異生成法、制限酵素処理と合成
遺伝子の利用による方法等がある。部位特異的変異法で
あれば、例えばMolecuar Cloning: A Laboratory Manua
l第２版第１−３巻 Sambrook, J.ら著、Cold Spring Ha
rber Laboratory Press出版New York 1989年に記載の部
位特異的変異誘発法やPCR法などの方法を用い、本発明
のDNA配列に変異を導入する。これら方法により変異が
導入されたDNA配列は、適当なベクターおよび宿主系を
用いて、例えばMolecuar Cloning: A Laboratory Manua
l第２版第１−３巻 Sambrook, J.ら著、Cold Spring Ha
rber Laboratory Press出版New York 1989年に記載の方
法により、遺伝子工学的に発現させればよい。例えば、
Mutan TM -SuperExpress Km、Mutan TM -K（宝酒造社
製）、Quik Change Site- Directed Mutagenesis Kit
（Stratagene社製）といったキットが使用できる。
のアミノ酸、ないしはアミノ酸配列を導入することによ
って置換される。アミノ酸配列の置換処理には、プロテ
インエンジニアリングとして知られる方法が広く利用で
きるが、例えば、Site-diredted deletion（部位指定削
除）法（Nucl. Acids Res., 11, 1645,1983）、Site-sp
ecific mutagenesis（部位特異的変異）法（Zoller, M.
J. etal., Methods in Enzymol., 100, 468, 1983、Ku
nkel. T.A. et al., Methods in Enzymol., 154, 367-3
82, 1987）、PCR突然変異生成法、制限酵素処理と合成
遺伝子の利用による方法等がある。部位特異的変異法で
あれば、例えばMolecuar Cloning: A Laboratory Manua
l第２版第１−３巻 Sambrook, J.ら著、Cold Spring Ha
rber Laboratory Press出版New York 1989年に記載の部
位特異的変異誘発法やPCR法などの方法を用い、本発明
のDNA配列に変異を導入する。これら方法により変異が
導入されたDNA配列は、適当なベクターおよび宿主系を
用いて、例えばMolecuar Cloning: A Laboratory Manua
l第２版第１−３巻 Sambrook, J.ら著、Cold Spring Ha
rber Laboratory Press出版New York 1989年に記載の方
法により、遺伝子工学的に発現させればよい。例えば、
Mutan TM -SuperExpress Km、Mutan TM -K（宝酒造社
製）、Quik Change Site- Directed Mutagenesis Kit
（Stratagene社製）といったキットが使用できる。
【００２０】一般に、部位特異的変異法は、まず、タン
パク質をコードするDNA配列をその配列中に含む一本鎖
ベクターを得ることによって実施することができる。所
望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライ
マーを、一般的には合成によって、例えばクレア等（Cr
ea, R. et al., Proc. Natl. Acsd. Sci. U.S.A., 75,
5765, 1978）の方法によって製造する。次ぎに、このプ
ライマーを一本鎖の本レセプター配列含有ベクターとア
ニーリングし、大腸菌ポリメラーゼIクレノウフラグメ
ントのようなDNA重合酵素を作用させて、突然変異含有
鎖の合成を完成する。このようにして、第一の鎖は元の
非突然変異配列をコードしており、第二の鎖は所望の突
然変異を有しているヘテロ二本鎖が形成される。次い
で、この二本鎖ベクターを用いて、適当な細菌、または
細胞を形質転換し、32P−標識突然変異生成プライマー
から成る放射性プローブへのハイブリダイゼーションを
介してクローンを選択する（Wallace, R.B., Nucleic A
cids Res., 9, 3647, 1981）。選択されたクローンに
は、突然変異した配列を有する組換えベクターを含んで
いる。このようなクローンを選択した後、突然変異した
本レセプターの領域を形質転換に使用される型の発現ベ
クターに入れることができる。
パク質をコードするDNA配列をその配列中に含む一本鎖
ベクターを得ることによって実施することができる。所
望の突然変異した配列を持つオリゴヌクレオチドプライ
マーを、一般的には合成によって、例えばクレア等（Cr
ea, R. et al., Proc. Natl. Acsd. Sci. U.S.A., 75,
5765, 1978）の方法によって製造する。次ぎに、このプ
ライマーを一本鎖の本レセプター配列含有ベクターとア
ニーリングし、大腸菌ポリメラーゼIクレノウフラグメ
ントのようなDNA重合酵素を作用させて、突然変異含有
鎖の合成を完成する。このようにして、第一の鎖は元の
非突然変異配列をコードしており、第二の鎖は所望の突
然変異を有しているヘテロ二本鎖が形成される。次い
で、この二本鎖ベクターを用いて、適当な細菌、または
細胞を形質転換し、32P−標識突然変異生成プライマー
から成る放射性プローブへのハイブリダイゼーションを
介してクローンを選択する（Wallace, R.B., Nucleic A
cids Res., 9, 3647, 1981）。選択されたクローンに
は、突然変異した配列を有する組換えベクターを含んで
いる。このようなクローンを選択した後、突然変異した
本レセプターの領域を形質転換に使用される型の発現ベ
クターに入れることができる。
【００２１】本発明タンパク質に対する抗体の調製 本発明のレセプターに対する抗体は、以下の方法により
作製される。 （１）ポリクローナル抗体の作製 推定されるアミノ酸配列の一部に基づいて通常のペプチ
ド合成機で合成した合成ペプチドや、本レセプターを発
現するベクターで形質転換した細菌、酵母、昆虫細胞、
動物細胞、などにより産生されたタンパク質を通常のタ
ンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原とする。こ
の免疫原を用いて、Antibodies; A Laboratory Manual,
Lane,H.D.ら編、Cold Spring Harber Laboratory Pres
s出版 New York 1989年などに記載の方法に従って、適
切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるタン
パク質を特異的に認識するポリクローナル抗体を容易に
作製し、精製することができる。マウス、ラット、ハム
スター、ウサギなどの動物を免疫し、その血清由来のポ
リクローナル抗体を作製すればよい。
作製される。 （１）ポリクローナル抗体の作製 推定されるアミノ酸配列の一部に基づいて通常のペプチ
ド合成機で合成した合成ペプチドや、本レセプターを発
現するベクターで形質転換した細菌、酵母、昆虫細胞、
動物細胞、などにより産生されたタンパク質を通常のタ
ンパク化学的方法で精製し、これらを免疫原とする。こ
の免疫原を用いて、Antibodies; A Laboratory Manual,
Lane,H.D.ら編、Cold Spring Harber Laboratory Pres
s出版 New York 1989年などに記載の方法に従って、適
切な方法で動物を免疫することにより、抗原となるタン
パク質を特異的に認識するポリクローナル抗体を容易に
作製し、精製することができる。マウス、ラット、ハム
スター、ウサギなどの動物を免疫し、その血清由来のポ
リクローナル抗体を作製すればよい。
【００２２】（２）モノクローナル抗体 前述の免疫原で免疫したマウスやハムスターの脾臓また
はリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細胞と
融合させてKohlerとMilsteinの方法［Nature,256, 495-
497(1975)］またはその改良法であるUedaらの方法［Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA, 79:4386-4390, 1982)］に従って
ハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマから単
クローン抗体を産生させ得る。例えば以下の工程により
本レセプターのモノクルーナル抗体を得ることができ
る： （ａ） タンパク質によるマウスの免疫、（ｂ） 免疫
マウスの脾臓の除去および脾臓細胞の分離、（ｃ） 分
離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進
剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記
のKohlerらに記載の方法による融合、（ｄ） 未融合ミ
エローマ細胞が成長しない選択培地での得られたハイブ
リドーマ細胞の培養、（ｅ） 酵素結合免疫吸着検定
(ELISA)、ウェスターンブロットなどの方法による所望
の抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選択および限定
希釈法等によるクローニング、（ｆ） モノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマ細胞を培養し、モノクル
ーナル抗体を収穫する。
はリンパ節からリンパ球を取りだし、ミエローマ細胞と
融合させてKohlerとMilsteinの方法［Nature,256, 495-
497(1975)］またはその改良法であるUedaらの方法［Pro
c.Natl.Acad.Sci.USA, 79:4386-4390, 1982)］に従って
ハイブリドーマを作製した後、該ハイブリドーマから単
クローン抗体を産生させ得る。例えば以下の工程により
本レセプターのモノクルーナル抗体を得ることができ
る： （ａ） タンパク質によるマウスの免疫、（ｂ） 免疫
マウスの脾臓の除去および脾臓細胞の分離、（ｃ） 分
離された脾臓細胞とマウスミエローマ細胞との融合促進
剤（例えばポリエチレングリコール）の存在下での上記
のKohlerらに記載の方法による融合、（ｄ） 未融合ミ
エローマ細胞が成長しない選択培地での得られたハイブ
リドーマ細胞の培養、（ｅ） 酵素結合免疫吸着検定
(ELISA)、ウェスターンブロットなどの方法による所望
の抗体を生産するハイブリドーマ細胞の選択および限定
希釈法等によるクローニング、（ｆ） モノクローナル
抗体を生産するハイブリドーマ細胞を培養し、モノクル
ーナル抗体を収穫する。
【００２３】リガンドのスクリーニング方法 リガンドのスクリーニング方法としては、例えば、放射
性アイソトープ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスフ
ァターゼのような酵素あるいは蛍光色素などで標識した
一定量のリガンド候補物質に、本レセプターを発現した
細胞または細胞膜画分を加え、結合試験を行わせる方法
が例示できる。細胞等と結合した標識リガンド候補物質
と細胞等に結合していない標識リガンド候補物質とを適
当な方法で分離し、細胞等と結合した標識リガンド候補
物質の放射能量、酵素活性または蛍光強度を測定する。
これにより、標識リガンド候補物質が、本レセプターの
リガンドとなりうるかどうかを判定することが出来る。
本発明のレセプターのリガンドとしては、分泌型ペプ
チド、細胞膜タンパク質、脂肪や核酸などの生体内
代謝物、などが考えられる。本レセプターは、アセチル
LDLレセプターと相同性を示ため、アセチルLDLが本レセ
プターのリガンドであることが期待できる。
性アイソトープ、ペルオキシダーゼやアルカリフォスフ
ァターゼのような酵素あるいは蛍光色素などで標識した
一定量のリガンド候補物質に、本レセプターを発現した
細胞または細胞膜画分を加え、結合試験を行わせる方法
が例示できる。細胞等と結合した標識リガンド候補物質
と細胞等に結合していない標識リガンド候補物質とを適
当な方法で分離し、細胞等と結合した標識リガンド候補
物質の放射能量、酵素活性または蛍光強度を測定する。
これにより、標識リガンド候補物質が、本レセプターの
リガンドとなりうるかどうかを判定することが出来る。
本発明のレセプターのリガンドとしては、分泌型ペプ
チド、細胞膜タンパク質、脂肪や核酸などの生体内
代謝物、などが考えられる。本レセプターは、アセチル
LDLレセプターと相同性を示ため、アセチルLDLが本レセ
プターのリガンドであることが期待できる。
【００２４】アゴニスト及びアンタゴニストのスクリー
ニング方法 本レセプターのリガンドが特定された後、アゴニスト及
びアンタゴニストのスクリーニングは以下の方法により
行なうことができる。排除型の結合実験の場合、一定量
の本レセプターを発現する細胞に一定量の標識リガンド
と各種の濃度の非標識のアゴニスト及びアンタゴニスト
候補化合物を加えて反応させる。洗浄後、細胞を50μl
の1% Triton X-100を含む10 mM Tris-HCl (pH 8.0)など
で溶解し、上清中の放射能量、酵素活性または蛍光強度
を測定する。一定濃度の標識リガンドに対し非標識のア
ゴニスト及びアンタゴニスト候補化合物の濃度を変化さ
せたときの標識リガンドの本レセプター発現細胞への結
合量の変化を調べる。これにより、アゴニスト及びアン
タゴニストの結合阻害活性を検討することができる。飽
和型の結合実験の場合、一定量の本レセプターを発現す
る細胞に各種濃度の標識リガンドと一定量の非標識のア
ゴニスト及びアンタゴニスト候補化合物を加えて反応さ
せる。上記と同様に、洗浄後、細胞を50μlの1% Triton
X-100を含む10 mM Tris-HCl (pH 8.0)などで溶解し、
遠心後、上清中の放射能量、酵素活性または蛍光強度を
測定する。一定濃度の非標識アゴニスト及びアンタゴニ
スト候補化合物に対し標識リガンドの濃度を変化させた
ときの標識リガンドの本レセプター発現細胞への結合量
の変化を調べる。
ニング方法 本レセプターのリガンドが特定された後、アゴニスト及
びアンタゴニストのスクリーニングは以下の方法により
行なうことができる。排除型の結合実験の場合、一定量
の本レセプターを発現する細胞に一定量の標識リガンド
と各種の濃度の非標識のアゴニスト及びアンタゴニスト
候補化合物を加えて反応させる。洗浄後、細胞を50μl
の1% Triton X-100を含む10 mM Tris-HCl (pH 8.0)など
で溶解し、上清中の放射能量、酵素活性または蛍光強度
を測定する。一定濃度の標識リガンドに対し非標識のア
ゴニスト及びアンタゴニスト候補化合物の濃度を変化さ
せたときの標識リガンドの本レセプター発現細胞への結
合量の変化を調べる。これにより、アゴニスト及びアン
タゴニストの結合阻害活性を検討することができる。飽
和型の結合実験の場合、一定量の本レセプターを発現す
る細胞に各種濃度の標識リガンドと一定量の非標識のア
ゴニスト及びアンタゴニスト候補化合物を加えて反応さ
せる。上記と同様に、洗浄後、細胞を50μlの1% Triton
X-100を含む10 mM Tris-HCl (pH 8.0)などで溶解し、
遠心後、上清中の放射能量、酵素活性または蛍光強度を
測定する。一定濃度の非標識アゴニスト及びアンタゴニ
スト候補化合物に対し標識リガンドの濃度を変化させた
ときの標識リガンドの本レセプター発現細胞への結合量
の変化を調べる。
【００２５】
【実施例】本発明を以下の実施例によりさらに説明す
る。本発明の各工程において用いた一般的な実験手法
（DNAのアガロースゲル電気泳動、ライゲーション反
応、大腸菌の形質転換、DNAの制限酵素による消化、ノ
ザン解析等）はCurrent Protocols in Molecular Biolo
gy (F. M. Ausubel et al. Ed., John Wiley & Sons. I
nc.)によった。
る。本発明の各工程において用いた一般的な実験手法
（DNAのアガロースゲル電気泳動、ライゲーション反
応、大腸菌の形質転換、DNAの制限酵素による消化、ノ
ザン解析等）はCurrent Protocols in Molecular Biolo
gy (F. M. Ausubel et al. Ed., John Wiley & Sons. I
nc.)によった。
【００２６】実施例１ マウスB6TNC#10 cDNAの単離 （１）ナース細胞特異的遺伝子の単離 マウス細胞株B6TNC（Nanno, M. et al. (1995) J. Immu
nol. 155,2918）および、L929細胞（ATCC No.CCL-1）よ
り、AGPC法（Analytical Biochemistry （1987） 162,
156-159）によりtotal RNAを調製し、PolyATtract syst
em 1000（Promega社製）を用いてmRNAを精製した。B6TN
C mRNAからfirst strand cDNAを合成するためにNot I p
rimer-adapter用いた。 Not I primer-adapter 5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCC
GCCC（T）15-3'(配列番号３)
nol. 155,2918）および、L929細胞（ATCC No.CCL-1）よ
り、AGPC法（Analytical Biochemistry （1987） 162,
156-159）によりtotal RNAを調製し、PolyATtract syst
em 1000（Promega社製）を用いてmRNAを精製した。B6TN
C mRNAからfirst strand cDNAを合成するためにNot I p
rimer-adapter用いた。 Not I primer-adapter 5'-pGACTAGTTCTAGATCGCGAGCGGCC
GCCC（T）15-3'(配列番号３)
【００２７】B6TNC mRNA 5 μgにNot I primer-adapter
をアニーリング後、MMLV RTase （LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製SuperScript Plasumid System）を用いてInstru
ction Manualに従いfirst strand cDNAを合成した。合
成したfirst strand cDNAをフェノール/クロロホルム抽
出、エタノール沈殿・乾燥後50μlのTEに溶解した。こ
れを終濃度0.3 N NaOH、0.025 M EDTAで25℃、一晩処理
し、1本鎖化をおこなった。終濃度100 mM Tris-HCl （p
H8.0）、0.12 N HClなるようにし、中和をおこない、エ
タノール沈殿・乾燥後40μlのDEPC処理水に溶解した。1
本鎖化をおこなったfirst strand cDNAの３'端をグアニ
ン残基の付加をTakara Manualの条件下terminal deoxyn
ucleotidyl transferase (宝酒造社製) 0.3u/μlの濃度
で30℃、30分反応後、終濃度6mMのEDTAを添加した。以
下定法に従いフェノール/クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿・乾燥後20μlのDEPC処理水に溶解した。
をアニーリング後、MMLV RTase （LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製SuperScript Plasumid System）を用いてInstru
ction Manualに従いfirst strand cDNAを合成した。合
成したfirst strand cDNAをフェノール/クロロホルム抽
出、エタノール沈殿・乾燥後50μlのTEに溶解した。こ
れを終濃度0.3 N NaOH、0.025 M EDTAで25℃、一晩処理
し、1本鎖化をおこなった。終濃度100 mM Tris-HCl （p
H8.0）、0.12 N HClなるようにし、中和をおこない、エ
タノール沈殿・乾燥後40μlのDEPC処理水に溶解した。1
本鎖化をおこなったfirst strand cDNAの３'端をグアニ
ン残基の付加をTakara Manualの条件下terminal deoxyn
ucleotidyl transferase (宝酒造社製) 0.3u/μlの濃度
で30℃、30分反応後、終濃度6mMのEDTAを添加した。以
下定法に従いフェノール/クロロホルム抽出、エタノー
ル沈殿・乾燥後20μlのDEPC処理水に溶解した。
【００２８】一方、L929 mRNAのビオチン化をBresatec
社Photobiotin Labelling Kit Manualに従いおこなっ
た。L929 mRNA 15 μg (1 μg/μl)とフォトビオチン酢
酸塩15μg (1 mg/ml) (Bresatec社製、Sigma社製) を加
え、BHRF-300水銀ランプ下10 cmで20分間照射後、2-ブ
タノールで抽出し、エタノール沈殿、８０% エタノール
洗浄、乾燥しD.D.WでmRNA終濃度(1μg/μl)に溶解し
た。さらに、このビオチン化操作を2回（計3回）おこな
った後、D.D.W.でmRNA終濃度(1μg/μl)に溶解した。
社Photobiotin Labelling Kit Manualに従いおこなっ
た。L929 mRNA 15 μg (1 μg/μl)とフォトビオチン酢
酸塩15μg (1 mg/ml) (Bresatec社製、Sigma社製) を加
え、BHRF-300水銀ランプ下10 cmで20分間照射後、2-ブ
タノールで抽出し、エタノール沈殿、８０% エタノール
洗浄、乾燥しD.D.WでmRNA終濃度(1μg/μl)に溶解し
た。さらに、このビオチン化操作を2回（計3回）おこな
った後、D.D.W.でmRNA終濃度(1μg/μl)に溶解した。
【００２９】1本鎖化したB6TNC first strand cDNA（0.
5〜1.5μｇ）とビオチン化L929 mRNA（15μｇ）を合わ
せ、ポリエチレングリコール沈殿、エタノール洗浄、乾
燥後、hybridization buffer(終濃度50 mM Hepes pH 7.
6、2 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.2％ SDS)20μlに溶解、
ミネラルオイルを一滴滴下し、95℃、1分間処理し、65
℃、50時間インキュベートした。クロロホルム抽出後、
水層（50μl）に10μgのstreptavidin (1 mg/ml)を加
え、室温、5分間放置し、等量のフェノールで抽出操作
をおこなう。この操作によりビオチン化mRNAとハイブリ
ダイズしたcDNAは有機層および中間層に抽出される。こ
の操作を計３回おこなった。次に、水層（250μl）をエ
ーテル抽出、エタノール沈殿、８０% エタノール洗浄、
乾燥後、20μlのD.D.W.に溶解し、subtracted single s
trand cDNAサンプルとした。
5〜1.5μｇ）とビオチン化L929 mRNA（15μｇ）を合わ
せ、ポリエチレングリコール沈殿、エタノール洗浄、乾
燥後、hybridization buffer(終濃度50 mM Hepes pH 7.
6、2 mM EDTA、0.5 M NaCl、0.2％ SDS)20μlに溶解、
ミネラルオイルを一滴滴下し、95℃、1分間処理し、65
℃、50時間インキュベートした。クロロホルム抽出後、
水層（50μl）に10μgのstreptavidin (1 mg/ml)を加
え、室温、5分間放置し、等量のフェノールで抽出操作
をおこなう。この操作によりビオチン化mRNAとハイブリ
ダイズしたcDNAは有機層および中間層に抽出される。こ
の操作を計３回おこなった。次に、水層（250μl）をエ
ーテル抽出、エタノール沈殿、８０% エタノール洗浄、
乾燥後、20μlのD.D.W.に溶解し、subtracted single s
trand cDNAサンプルとした。
【００３０】次に、LIFE TECHNOLOGIES Instruction Ma
nualに従い２本鎖cDNAを合成した。subtracted single
strand cDNAサンプルとOligoｄ（pＧ）12-18primer（終
濃度50ng/μl）をアニーリングし、大腸菌 DNA Polymer
ase を用いて２本鎖cDNAを合成後、T４DNA Polymerase
で末端修復をおこない、Not Iで切断した。このサンプ
ルをプラスミドベクターpCDL SRα296 (Takebe, Y. et
al. (1988) Mol. Cell.Biol. 8, 466)のSma I、Not I部
位に挿入した。このプラスミドを大腸菌 JM109に遺伝子
導入し、プラスミドDNAを回収し、塩基配列の決定をお
こなった。決定した塩基配列をGenBankに対してホモロ
ジー検索を行ない、新規遺伝子と考えられるクローンに
ついて、B6TNC細胞での発現特異性を調べるために、B6T
NC細胞およびL929細胞におけるmRNAの発現をノザンブロ
ット法で調べた。その結果、B6TNC細胞に発現し、L929
細胞に発現していないB6TNC細胞特異的遺伝子マウスB6T
NC#10 クローン遺伝子断片を得ることができた。
nualに従い２本鎖cDNAを合成した。subtracted single
strand cDNAサンプルとOligoｄ（pＧ）12-18primer（終
濃度50ng/μl）をアニーリングし、大腸菌 DNA Polymer
ase を用いて２本鎖cDNAを合成後、T４DNA Polymerase
で末端修復をおこない、Not Iで切断した。このサンプ
ルをプラスミドベクターpCDL SRα296 (Takebe, Y. et
al. (1988) Mol. Cell.Biol. 8, 466)のSma I、Not I部
位に挿入した。このプラスミドを大腸菌 JM109に遺伝子
導入し、プラスミドDNAを回収し、塩基配列の決定をお
こなった。決定した塩基配列をGenBankに対してホモロ
ジー検索を行ない、新規遺伝子と考えられるクローンに
ついて、B6TNC細胞での発現特異性を調べるために、B6T
NC細胞およびL929細胞におけるmRNAの発現をノザンブロ
ット法で調べた。その結果、B6TNC細胞に発現し、L929
細胞に発現していないB6TNC細胞特異的遺伝子マウスB6T
NC#10 クローン遺伝子断片を得ることができた。
【００３１】（２）全長マウスB6TNC#10 cDNAの同定 単離したマウスB6TNC#10 cDNA断片をもとに遺伝子解析
プログラムBLAST(インターネット・アドレス http://ww
w.ncbi.nlm.gov/BLAST)で検索し、ヒトDiGeorge症候群
遺伝子座に相当するマウスゲノムDNA配列（アクセッシ
ョン ナンバー AC000096）の一部と相同性を示した。こ
のマウスゲノムDNA配列をもとに以下のプライマーを合
成した。 B6RACE 5'-CTGTCTGTGGATCG-3' (配列番号４) B6K36 5'-CCTCGTTTTCTGAGCACGTGGAATTGCCTTCG-3' (配列番号５) B6K311 5'-AGCCAGAGCAGCAGCAGCAGTC-3' (配列番号６) B6K56 5'-TGCGCGACAAGACTCGCAGC-3' (配列番号７) B6N10-51 5'-AAGGCATTTCATTGGCCCCCAA-3' (配列番号８) B6K58 5'-ACTCCGCTTCCGGCCGCCCTTG-3' (配列番号９) B6N10-33 5'-AGCTTTGGCCTGCTATGAGGA-3' (配列番号１０) また、マウスB6TNC#10遺伝子の5'RACE、3'RACEに必要な
プライマーの配列を示す。 3'RACE Adapter Primer （3'RACE AP） 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3' (配列番号１１) Abridged Universal Amplification Primer (AUAP) 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (配列番号１２)
プログラムBLAST(インターネット・アドレス http://ww
w.ncbi.nlm.gov/BLAST)で検索し、ヒトDiGeorge症候群
遺伝子座に相当するマウスゲノムDNA配列（アクセッシ
ョン ナンバー AC000096）の一部と相同性を示した。こ
のマウスゲノムDNA配列をもとに以下のプライマーを合
成した。 B6RACE 5'-CTGTCTGTGGATCG-3' (配列番号４) B6K36 5'-CCTCGTTTTCTGAGCACGTGGAATTGCCTTCG-3' (配列番号５) B6K311 5'-AGCCAGAGCAGCAGCAGCAGTC-3' (配列番号６) B6K56 5'-TGCGCGACAAGACTCGCAGC-3' (配列番号７) B6N10-51 5'-AAGGCATTTCATTGGCCCCCAA-3' (配列番号８) B6K58 5'-ACTCCGCTTCCGGCCGCCCTTG-3' (配列番号９) B6N10-33 5'-AGCTTTGGCCTGCTATGAGGA-3' (配列番号１０) また、マウスB6TNC#10遺伝子の5'RACE、3'RACEに必要な
プライマーの配列を示す。 3'RACE Adapter Primer （3'RACE AP） 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3' (配列番号１１) Abridged Universal Amplification Primer (AUAP) 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (配列番号１２)
【００３２】全長マウスB6TNC#10 cDNAを単離するため
に、まず、B6TNC細胞mRNAを調製した。マウス細胞株B6T
NC細胞5X 106個当たり１mlのTRIzol TM（LIFE TECHNOLO
GIES,INC.社製）を加え、細胞を溶解した。クロロホル
ム0.2 ml添加し、攪拌後、12,000rpm 10分間遠心した。
上清を回収し、0.5 mlのイソプロパノールを添加し攪拌
後、12,000 rpm 10分間遠心し、75%エタノール洗浄後、
風乾し、沈殿を注射用水（扶桑薬品工業社製）で溶解
し、 B6TNC細胞total RNAサンフ゜ルとした。B6TNC細胞total
RNAよりmRNA Purification Kit （ファルマシア社製）
を用いてB6TNC細胞mRNAを精製した。
に、まず、B6TNC細胞mRNAを調製した。マウス細胞株B6T
NC細胞5X 106個当たり１mlのTRIzol TM（LIFE TECHNOLO
GIES,INC.社製）を加え、細胞を溶解した。クロロホル
ム0.2 ml添加し、攪拌後、12,000rpm 10分間遠心した。
上清を回収し、0.5 mlのイソプロパノールを添加し攪拌
後、12,000 rpm 10分間遠心し、75%エタノール洗浄後、
風乾し、沈殿を注射用水（扶桑薬品工業社製）で溶解
し、 B6TNC細胞total RNAサンフ゜ルとした。B6TNC細胞total
RNAよりmRNA Purification Kit （ファルマシア社製）
を用いてB6TNC細胞mRNAを精製した。
【００３３】次に、マウスB6TNC#10 cDNAの5'RACEをお
こなった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonu
clease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1μl、D.D.W. 6.5μlで室温15分間 インキュベ
ートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μl添加し、65 ℃、
15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置した。B6T
NC細胞cDNAの合成するために、５’RACE System for Ra
pid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 (LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。DNase I処理したB6
TNC細胞cDNA 0.5μg(5 μl) にD.D.W. 15μl、1μM B6R
ACE primer（配列番号４） 5μlを添加し、70 ℃、10分
間インキュベートし、50℃に保温する（溶液Ａ）。一
方、10 X PCR buffer 5μl、25 mMMgCl2 5μl、10mM d
NTPs 2.5μl、 0.1 M DTT 5μl、D.D.W. 6.5μlを50℃
で保温する（溶液Ｂ）。溶液Ａと溶液ＢとSuperScript
TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50℃、50分間イ
ンキュベートした。70℃、15分間処理後、氷上に5分間
放置した。RNase MIX 1μl添加し37℃、30分間インキュ
ベートした。225μlの6M NaIを添加し、GLASSMAX DNA I
solation Spin Cartridge Systemを用い、cDNAを50μl
のD.D.W.で溶出して精製した。精製したcDNA 10μlに、
D.D.W. 4μl、5XTailing Buffer 5μl、1 mM dATP 5μl
を添加し、94℃、2分間処理後、氷上に1分間放置した。
terminal deoxynucleotidyl transferaseを1μl添加
し、37℃、10分間インキュベートした。65℃、10分間処
理後、氷上に放置し、これを5' RACE用の鋳型cDNAとし
た。
こなった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonu
clease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1μl、D.D.W. 6.5μlで室温15分間 インキュベ
ートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μl添加し、65 ℃、
15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置した。B6T
NC細胞cDNAの合成するために、５’RACE System for Ra
pid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 (LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。DNase I処理したB6
TNC細胞cDNA 0.5μg(5 μl) にD.D.W. 15μl、1μM B6R
ACE primer（配列番号４） 5μlを添加し、70 ℃、10分
間インキュベートし、50℃に保温する（溶液Ａ）。一
方、10 X PCR buffer 5μl、25 mMMgCl2 5μl、10mM d
NTPs 2.5μl、 0.1 M DTT 5μl、D.D.W. 6.5μlを50℃
で保温する（溶液Ｂ）。溶液Ａと溶液ＢとSuperScript
TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50℃、50分間イ
ンキュベートした。70℃、15分間処理後、氷上に5分間
放置した。RNase MIX 1μl添加し37℃、30分間インキュ
ベートした。225μlの6M NaIを添加し、GLASSMAX DNA I
solation Spin Cartridge Systemを用い、cDNAを50μl
のD.D.W.で溶出して精製した。精製したcDNA 10μlに、
D.D.W. 4μl、5XTailing Buffer 5μl、1 mM dATP 5μl
を添加し、94℃、2分間処理後、氷上に1分間放置した。
terminal deoxynucleotidyl transferaseを1μl添加
し、37℃、10分間インキュベートした。65℃、10分間処
理後、氷上に放置し、これを5' RACE用の鋳型cDNAとし
た。
【００３４】Polymerase Chain Reaction（PCR）はTaKa
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4μl、10μM 3'RACE-AP primer
(配列番号１１) 1μl、10 μMB6K36 primer (配列番号
５) 1μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W.
3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、1分
間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、2分間を1
回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を50倍
希釈したものを2.5μl、2X GC buffer 12.5μl、2.5 mM
dNTPs 4μl、10μM AUAP primer (配列番号１２) 1μ
l、10μM B6K311 primer (配列番号６) 1μl、TaKaRa L
A Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W. 3.75μlを混ぜて、9
4℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2
分間を20回、72℃、2分間を1回で2回目のPCRをおこなっ
た。2回目のPCR反応液をフェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガルース電気泳動
により確認した約230 bpのDNA断片をWizard TM PCR Pre
ps DNA Purification System (Promega社製) を用いて
回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM-T-E
asy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をABI P
rism TM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Rea
dy Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI Pr
ism TM 310 ジェネティックアナライザー （Applied Bi
osystems社製）を用いておこなった。
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4μl、10μM 3'RACE-AP primer
(配列番号１１) 1μl、10 μMB6K36 primer (配列番号
５) 1μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W.
3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、1分
間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、2分間を1
回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を50倍
希釈したものを2.5μl、2X GC buffer 12.5μl、2.5 mM
dNTPs 4μl、10μM AUAP primer (配列番号１２) 1μ
l、10μM B6K311 primer (配列番号６) 1μl、TaKaRa L
A Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W. 3.75μlを混ぜて、9
4℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2
分間を20回、72℃、2分間を1回で2回目のPCRをおこなっ
た。2回目のPCR反応液をフェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガルース電気泳動
により確認した約230 bpのDNA断片をWizard TM PCR Pre
ps DNA Purification System (Promega社製) を用いて
回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM-T-E
asy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をABI P
rism TM dRhodamine Terminator Cycle Sequencing Rea
dy Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI Pr
ism TM 310 ジェネティックアナライザー （Applied Bi
osystems社製）を用いておこなった。
【００３５】次に、マウスB6TNC#10 cDNAの3'RACEをお
こなった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonu
clease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1μl、D.D.W. 6.5μlで室温15分間 インキュベ
ートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μl添加し、65 ℃、
15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置した。B6T
NC細胞cDNAの合成するために、５’RACE System for Ra
pid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 (LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）と新たに合成した3’RACE AP
プライマー(配列番号１１)を用いた。DNase I処理したB
6TNC細胞cDNA 0.5 μg(5 μl) にD.D.W. 19 μl、10 μ
M 3’RACEAPプライマー(配列番号１１) 1μlを添加し、
70 ℃、10分間インキュベートし、50℃に保温する（溶
液Ｃ）。一方、10X PCR buffer 5μl、25 mM MgCl2 5
μl、10mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5μl、D.D.W.
6.5μlを50℃で保温する（溶液Ｄ）。溶液Ｃと溶液Ｄと
SuperScript TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50
℃、50分間インキュベートした。70℃、15分間処理後、
氷上に5分間放置した。RNase MIX 1μl添加し37℃、30
分間インキュベートした。これを3’RACE用の鋳型cDNA
とした。
こなった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonu
clease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,I
NC.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1μl、D.D.W. 6.5μlで室温15分間 インキュベ
ートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μl添加し、65 ℃、
15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置した。B6T
NC細胞cDNAの合成するために、５’RACE System for Ra
pid Amplification of cDNA Ends，Version 2.0 (LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）と新たに合成した3’RACE AP
プライマー(配列番号１１)を用いた。DNase I処理したB
6TNC細胞cDNA 0.5 μg(5 μl) にD.D.W. 19 μl、10 μ
M 3’RACEAPプライマー(配列番号１１) 1μlを添加し、
70 ℃、10分間インキュベートし、50℃に保温する（溶
液Ｃ）。一方、10X PCR buffer 5μl、25 mM MgCl2 5
μl、10mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5μl、D.D.W.
6.5μlを50℃で保温する（溶液Ｄ）。溶液Ｃと溶液Ｄと
SuperScript TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50
℃、50分間インキュベートした。70℃、15分間処理後、
氷上に5分間放置した。RNase MIX 1μl添加し37℃、30
分間インキュベートした。これを3’RACE用の鋳型cDNA
とした。
【００３６】Polymerase Chain Reaction（PCR）はTaKa
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4μl、10μM AUAPプライマー(配
列番号１２) 1μl、10μM B6K56プライマー(配列番号
７) 1μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W.
3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、1分
間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、5分間を1
回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を50倍
希釈したものを2.5μl、2X GC buffer 12.5μl、2.5 mM
dNTPs 4 μl、10μM AUAPプライマー (配列番号１２)
1μl、10μM B6N10-51プライマー(配列番号８) 1μl、T
aKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W. 3.75μlを混
ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、1分間、
72℃、2分間を20回、72℃、5分間を1回で2回目のPCRを
おこなった。2回目のPCR反応液をフェノール／クロロホ
ルム抽出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガロース電
気泳動により確認した約600 bpのDNA断片をWizard TM P
CR Preps DNA Purification System (Promega社製)を用
いて回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM
-T-Easy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をA
BI Prism TM dRhodamine Terminator CycleSequencing
Ready Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI
Prism TM310 ジェネティックアナライザー（Applied B
iosystems社製）を用いておこなった。
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4μl、10μM AUAPプライマー(配
列番号１２) 1μl、10μM B6K56プライマー(配列番号
７) 1μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W.
3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、1分
間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、5分間を1
回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を50倍
希釈したものを2.5μl、2X GC buffer 12.5μl、2.5 mM
dNTPs 4 μl、10μM AUAPプライマー (配列番号１２)
1μl、10μM B6N10-51プライマー(配列番号８) 1μl、T
aKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μl、D.D.W. 3.75μlを混
ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、1分間、
72℃、2分間を20回、72℃、5分間を1回で2回目のPCRを
おこなった。2回目のPCR反応液をフェノール／クロロホ
ルム抽出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガロース電
気泳動により確認した約600 bpのDNA断片をWizard TM P
CR Preps DNA Purification System (Promega社製)を用
いて回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM
-T-Easy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をA
BI Prism TM dRhodamine Terminator CycleSequencing
Ready Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI
Prism TM310 ジェネティックアナライザー（Applied B
iosystems社製）を用いておこなった。
【００３７】全長マウスB6TNC#10 cDNAの塩基配列の決
定するために、5’RACEと3’RACEで同定していないマウ
スB6TNC#10 cDNAの領域を同定した。genomic DNAを除去
するために、Deoxyribonuclease I, Amplification Gra
de（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。 B6TNC細
胞mRNA 1μg（1μl） 、10X DNase I Buffer１μl、RNa
se free DNase I (1 U/μl) 1μl、D.D.W. 7μlで室温1
5分間 インキュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μ
l添加し、65 ℃、15分間インキュベート後、氷上に5分
間、放置した。B6TNC細胞cDNAの合成するために、Super
Script TM Preamplification System for First Strand
cDNA Synthesis (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用
いた。DNase I処理したB6TNC細胞cDNA 0.5μg(5μl) に
D.D.W. 19μl、Oligo（dT）12-18 primer（0.5μg/μ
l）1μlを添加し、70 ℃、10分間インキュベートし、50
℃に保温する（溶液Ｅ）。一方、10X PCR buffer 5μ
l、25mM MgCl2 5μl、10mM dNTPs 2.5μl、 0.1 M DTT
5μl、D.D.W. 6.5μlを50℃で保温する（溶液Ｆ）。溶
液Ｅと溶液ＦとSuperScript TM II (200 units/μl)1μ
l混ぜ合わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、1
5分間処理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1μl添
加し37℃、30分間インキュベートし、これを鋳型DNAと
した。鋳型DNA 1μl、2X GC buffer 25μl、2.5 mM dNT
Ps 8μl、100μM B6K58プライマー(配列番号９) 0.25μ
l、100μM B6N10-33プライマー(配列番号１０) 0.25μ
l、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.5μl、D.D.W. 15μlを
混ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、60℃、1分
間、72℃、4分30秒間を35回、72℃、2分間を1回でPCRを
おこなった。PCR反応液をフェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈澱後、1％ 低融点アガロース電気泳動
により確認した約３kbpのPCR増幅DNA断片をWizard TM P
CR Preps DNA Purification System (Promega社製)を用
いて回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM
-T-Easy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をA
BI Prism TM dRhodamine Terminator CycleSequencing
Ready Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI
Prism TM310 ジェネティックアナライザー（Applied B
iosystems社製）を用いておこなった。以上、マウスB6T
NC#10遺伝子の5'RACEと3'RACEのPCR産物、ならびにB6K5
8プライマーとB6N10-33プライマーにより得られたPCR産
物の塩基配列をもとに全長マウスB6TNC#10 cDNAの塩基
配列（配列番号１）を確定した。その結果、マウスB6TN
C#10 cDNAは全長3,274 bpからなることを同定した。
定するために、5’RACEと3’RACEで同定していないマウ
スB6TNC#10 cDNAの領域を同定した。genomic DNAを除去
するために、Deoxyribonuclease I, Amplification Gra
de（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。 B6TNC細
胞mRNA 1μg（1μl） 、10X DNase I Buffer１μl、RNa
se free DNase I (1 U/μl) 1μl、D.D.W. 7μlで室温1
5分間 インキュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1μ
l添加し、65 ℃、15分間インキュベート後、氷上に5分
間、放置した。B6TNC細胞cDNAの合成するために、Super
Script TM Preamplification System for First Strand
cDNA Synthesis (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用
いた。DNase I処理したB6TNC細胞cDNA 0.5μg(5μl) に
D.D.W. 19μl、Oligo（dT）12-18 primer（0.5μg/μ
l）1μlを添加し、70 ℃、10分間インキュベートし、50
℃に保温する（溶液Ｅ）。一方、10X PCR buffer 5μ
l、25mM MgCl2 5μl、10mM dNTPs 2.5μl、 0.1 M DTT
5μl、D.D.W. 6.5μlを50℃で保温する（溶液Ｆ）。溶
液Ｅと溶液ＦとSuperScript TM II (200 units/μl)1μ
l混ぜ合わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、1
5分間処理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1μl添
加し37℃、30分間インキュベートし、これを鋳型DNAと
した。鋳型DNA 1μl、2X GC buffer 25μl、2.5 mM dNT
Ps 8μl、100μM B6K58プライマー(配列番号９) 0.25μ
l、100μM B6N10-33プライマー(配列番号１０) 0.25μ
l、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.5μl、D.D.W. 15μlを
混ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、60℃、1分
間、72℃、4分30秒間を35回、72℃、2分間を1回でPCRを
おこなった。PCR反応液をフェノール／クロロホルム抽
出、エタノール沈澱後、1％ 低融点アガロース電気泳動
により確認した約３kbpのPCR増幅DNA断片をWizard TM P
CR Preps DNA Purification System (Promega社製)を用
いて回収した。このDNA断片をプラスミドベクター pGEM
-T-Easy （Promega社製）に挿入し、塩基配列の決定をA
BI Prism TM dRhodamine Terminator CycleSequencing
Ready Reaction Kit （Applied Biosystems社製）とABI
Prism TM310 ジェネティックアナライザー（Applied B
iosystems社製）を用いておこなった。以上、マウスB6T
NC#10遺伝子の5'RACEと3'RACEのPCR産物、ならびにB6K5
8プライマーとB6N10-33プライマーにより得られたPCR産
物の塩基配列をもとに全長マウスB6TNC#10 cDNAの塩基
配列（配列番号１）を確定した。その結果、マウスB6TN
C#10 cDNAは全長3,274 bpからなることを同定した。
【００３８】実施例２ ヒトB6TNC#10遺伝子の単離 単離したマウスB6TNC#10 cDNA配列（配列番号１）をも
とに遺伝子解析プログラムBLAST(インターネット・アト゛レス http:/
/www.ncbi.nlm.gov/BLAST)で検索し、ヒトDiGeorge症候
群遺伝子座に相当するゲノムDNA配列（アクセッション
ナンバー AC005500）と相同性を示した。このヒトゲノ
ムDNA配列のマウスB6TNC#10 cDNA配列（配列番号１）と
相同性を示した部分をもとに以下のプライマーを合成し
た。 h#10-35 5'-CTGGTTGTTGCAGC-3' (配列番号１３) h#10-31 5'-GGGTGGCAGCTACACAGCTCCTTGCAGTCGGG-3' (配列番号１４) h#10-32 5'-ACAAGTACACTGGCCTGTCACGTCCTCGCACT-3' (配列番号１５) h#10-56 5'-GTTGCGTCTCATTGGCTCAGGTCC-3' (配列番号１６) h#10-57 5'-CGCTCCTCAGGGGCTTAGTCCGTC-3' (配列番号１７) h#10-511 5'-ACTCCGCTTCCGGCCGCTCTCGCTG-3' (配列番号１８) h#10-36 5'-GGGAGGCCATCAAAACCAGCTGACAGCTGAGG -3' (配列番号１９) また、ヒトB6TNC#10遺伝子の5'RACE、3'RACEに必要なフ゜
ライマーの配列を示す。 3'RACE Adapter Primer （3'RACE AP） 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3' (配列番号１１) Abridged Universal Amplification Primer (AUAP) 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (配列番号１２)
とに遺伝子解析プログラムBLAST(インターネット・アト゛レス http:/
/www.ncbi.nlm.gov/BLAST)で検索し、ヒトDiGeorge症候
群遺伝子座に相当するゲノムDNA配列（アクセッション
ナンバー AC005500）と相同性を示した。このヒトゲノ
ムDNA配列のマウスB6TNC#10 cDNA配列（配列番号１）と
相同性を示した部分をもとに以下のプライマーを合成し
た。 h#10-35 5'-CTGGTTGTTGCAGC-3' (配列番号１３) h#10-31 5'-GGGTGGCAGCTACACAGCTCCTTGCAGTCGGG-3' (配列番号１４) h#10-32 5'-ACAAGTACACTGGCCTGTCACGTCCTCGCACT-3' (配列番号１５) h#10-56 5'-GTTGCGTCTCATTGGCTCAGGTCC-3' (配列番号１６) h#10-57 5'-CGCTCCTCAGGGGCTTAGTCCGTC-3' (配列番号１７) h#10-511 5'-ACTCCGCTTCCGGCCGCTCTCGCTG-3' (配列番号１８) h#10-36 5'-GGGAGGCCATCAAAACCAGCTGACAGCTGAGG -3' (配列番号１９) また、ヒトB6TNC#10遺伝子の5'RACE、3'RACEに必要なフ゜
ライマーの配列を示す。 3'RACE Adapter Primer （3'RACE AP） 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC(T)17-3' (配列番号１１) Abridged Universal Amplification Primer (AUAP) 5'-GGCCACGCGTCGACTAGTAC-3' (配列番号１２)
【００３９】全長ヒトB6TNC#10 cDNAを単離するため
に、まず、ヒト細胞株SK-LMS-1細胞（ATCC No. HTB 8
8）からmRNAを調製した。SK-LMS-1細胞5X 106個当たり
１mlのTRIzol TM（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を加
え、細胞を溶解した。クロロホルム0.2 ml添加し、攪拌
後、12,000 rpm 10分間遠心した。上清を回収し、0.5
mlのイソプロパノールを添加し攪拌後、12,000 rpm 10
分間遠心し、75%エタノール洗浄後、風乾し、沈殿を注
射用水（扶桑薬品工業社製）で溶解し、 SK-LMS-1細胞t
otal RNAサンプルとした。 SK-LMS-1細胞total RNAより
mRNA Purification Kit（ファルマシア社製）を用いてS
K-LMS-1細胞mRNAを精製した。
に、まず、ヒト細胞株SK-LMS-1細胞（ATCC No. HTB 8
8）からmRNAを調製した。SK-LMS-1細胞5X 106個当たり
１mlのTRIzol TM（LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を加
え、細胞を溶解した。クロロホルム0.2 ml添加し、攪拌
後、12,000 rpm 10分間遠心した。上清を回収し、0.5
mlのイソプロパノールを添加し攪拌後、12,000 rpm 10
分間遠心し、75%エタノール洗浄後、風乾し、沈殿を注
射用水（扶桑薬品工業社製）で溶解し、 SK-LMS-1細胞t
otal RNAサンプルとした。 SK-LMS-1細胞total RNAより
mRNA Purification Kit（ファルマシア社製）を用いてS
K-LMS-1細胞mRNAを精製した。
【００４０】次に、ヒトB6TNC#10 cDNAの5'RACEをおこ
なった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonucl
ease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,IN
C.社製）を用いた。 SK-LMS-1細胞mRNA 1.5 μg（1.5μ
l） 、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I
(1 U/μl) 1 μl、D.D.W. 6.5 μlで室温15分間 インキ
ュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1 μl添加し、65
℃、15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置し
た。SK-LMS-1細胞cDNAの合成するために、５’RACE Sys
tem for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version
2.0 (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。DNase I
処理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg(5 μl)にD.D.W. 15
μl、1 μM h#10-35 primer(配列番号１３) 5 μlを添
加し、70℃、10分間インキュベートし、50℃に保温する
（溶液Ｇ）。一方、10 X PCR buffer 5 μl、25 mM MgC
l2 5 μl、10 mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5 μl、
D.D.W. 6.5 μlを50℃で保温する（溶液Ｈ）。溶液Ｇと
溶液ＨとSuperScript TM II (200 units/μl) 1 μl混
ぜ合わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、15分
間処理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1 μl添加
し37℃、30分間インキュベートした。225 μlの6M NaI
を添加し、GlassMAX DNA Isolation Spin Cartridge Sy
stemを用い、50μlのD.D.W.で溶出してcDNAを精製し
た。精製したcDNA10 μlに、D.D.W. 4 μl、5X Tailing
Buffer 5 μl、1 mM dATP 5 μlを添加し、94℃、2分
間処理後、氷上に1分間放置した。terminal deoxynucle
otidyl transferaseを1 μl添加し、37℃、10分間イン
キュベートした。65℃、10分間処理後、氷上に放置し、
これを5'RACE用の鋳型cDNAとした。
なった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonucl
ease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,IN
C.社製）を用いた。 SK-LMS-1細胞mRNA 1.5 μg（1.5μ
l） 、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I
(1 U/μl) 1 μl、D.D.W. 6.5 μlで室温15分間 インキ
ュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1 μl添加し、65
℃、15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置し
た。SK-LMS-1細胞cDNAの合成するために、５’RACE Sys
tem for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version
2.0 (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。DNase I
処理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg(5 μl)にD.D.W. 15
μl、1 μM h#10-35 primer(配列番号１３) 5 μlを添
加し、70℃、10分間インキュベートし、50℃に保温する
（溶液Ｇ）。一方、10 X PCR buffer 5 μl、25 mM MgC
l2 5 μl、10 mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5 μl、
D.D.W. 6.5 μlを50℃で保温する（溶液Ｈ）。溶液Ｇと
溶液ＨとSuperScript TM II (200 units/μl) 1 μl混
ぜ合わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、15分
間処理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1 μl添加
し37℃、30分間インキュベートした。225 μlの6M NaI
を添加し、GlassMAX DNA Isolation Spin Cartridge Sy
stemを用い、50μlのD.D.W.で溶出してcDNAを精製し
た。精製したcDNA10 μlに、D.D.W. 4 μl、5X Tailing
Buffer 5 μl、1 mM dATP 5 μlを添加し、94℃、2分
間処理後、氷上に1分間放置した。terminal deoxynucle
otidyl transferaseを1 μl添加し、37℃、10分間イン
キュベートした。65℃、10分間処理後、氷上に放置し、
これを5'RACE用の鋳型cDNAとした。
【００４１】Polymerase Chain Reaction（PCR）はTaKa
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM 3'RACE-AP prime
r (配列番号１１) 1 μl、10 μM h#10-32 primer (配
列番号１５) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μ
l、D.D.W. 3.75 μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、
94℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72
℃、2分間を1回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR
反応液を50倍希釈したものを2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM AUAP primer
(配列番号１２) 1 μl、10 μM h#10-31 primer (配列
番号１４) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μ
l、D.D.W. 3.75μlを混ぜて、94℃、2分間を1回、94
℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を20回、72℃、2
分間を1回で2回目のPCRをおこなった。2回目のPCR反応
液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱
後、3％ 低融点アガロース電気泳動により確認した約45
0 bpのDNA断片をWizard TM PCR Preps DNA Purificatio
n System (Promega社製) を用いて回収した。このDNA断
片をプラスミドベクター pGEM-T-Easy （Promega社製）
に挿入し、塩基配列の決定をABI Prism TM dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit （A
pplied Biosystems社製）とABI Prism TM 310 ジネティ
ックアナライザー （Applied Biosystems社製）を用い
ておこなった。
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM 3'RACE-AP prime
r (配列番号１１) 1 μl、10 μM h#10-32 primer (配
列番号１５) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25μ
l、D.D.W. 3.75 μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、
94℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72
℃、2分間を1回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR
反応液を50倍希釈したものを2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5 μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM AUAP primer
(配列番号１２) 1 μl、10 μM h#10-31 primer (配列
番号１４) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μ
l、D.D.W. 3.75μlを混ぜて、94℃、2分間を1回、94
℃、1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を20回、72℃、2
分間を1回で2回目のPCRをおこなった。2回目のPCR反応
液をフェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱
後、3％ 低融点アガロース電気泳動により確認した約45
0 bpのDNA断片をWizard TM PCR Preps DNA Purificatio
n System (Promega社製) を用いて回収した。このDNA断
片をプラスミドベクター pGEM-T-Easy （Promega社製）
に挿入し、塩基配列の決定をABI Prism TM dRhodamine
Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit （A
pplied Biosystems社製）とABI Prism TM 310 ジネティ
ックアナライザー （Applied Biosystems社製）を用い
ておこなった。
【００４２】次に、ヒトB6TNC#10 cDNAの3'RACEをおこ
なった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonucl
ease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,IN
C.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5 μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1 μl、D.D.W. 6.5 μlで室温15分間 インキュ
ベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1 μl添加し、65
℃、15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置し
た。SK-LMS-1細胞cDNAの合成するために、５'RACE Syst
em for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version
2.0 (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）と新たに合成した
3'RACE AP primer(配列番号１１)を用いた。DNase I処
理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg(5 μl) にD.D.W. 19
μl、10 μM 3'RACE AP primer(配列番号１１) 1 μlを
添加し、70 ℃、10分間インキュヘ゛ートし、50℃に保温する
（溶液Ｉ）。一方、10X PCR buffer 5 μl、25 mM MgCl
2 5 μl、10mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5 μl、D.
D.W. 6.5 μlを50℃で保温する（溶液Ｊ）。溶液Ｉと溶
液ＪとSuperScript TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合
わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、15分間処
理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1 μl添加し37
℃、30分間インキュベートした。これを3'RACE用の鋳型
cDNAとした。
なった。genomic DNAを除去するために、Deoxyribonucl
ease I, Amplification Grade（LIFE TECHNOLOGIES,IN
C.社製）を用いた。 B6TNC細胞mRNA 1.5 μg（1.5μl）
、10X DNase I Buffer１μl、RNase free DNase I (1
U/μl) 1 μl、D.D.W. 6.5 μlで室温15分間 インキュ
ベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1 μl添加し、65
℃、15分間インキュベート後、氷上に5分間、放置し
た。SK-LMS-1細胞cDNAの合成するために、５'RACE Syst
em for Rapid Amplification of cDNA Ends，Version
2.0 (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）と新たに合成した
3'RACE AP primer(配列番号１１)を用いた。DNase I処
理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg(5 μl) にD.D.W. 19
μl、10 μM 3'RACE AP primer(配列番号１１) 1 μlを
添加し、70 ℃、10分間インキュヘ゛ートし、50℃に保温する
（溶液Ｉ）。一方、10X PCR buffer 5 μl、25 mM MgCl
2 5 μl、10mM dNTPs 2.5 μl、 0.1 M DTT 5 μl、D.
D.W. 6.5 μlを50℃で保温する（溶液Ｊ）。溶液Ｉと溶
液ＪとSuperScript TM II (200 units/μl) 1μl混ぜ合
わせ50℃、50分間インキュベートした。70℃、15分間処
理後、氷上に5分間放置した。RNase MIX 1 μl添加し37
℃、30分間インキュベートした。これを3'RACE用の鋳型
cDNAとした。
【００４３】Polymerase Chain Reaction（PCR）はTaKa
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM AUAP primer (配
列番号１２) 1 μl、10 μMh#10-56 primer (配列番号
１６) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μl、D.
D.W. 3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、
1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、5分間
を1回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を5
0倍希釈したものを2.5 μl、2X GC buffer 12.5 μl、
2.5 mM dNTPs 4μl、10 μM AUAP primer (配列番号１
２) 1 μl、10 μM h#10-57 primer (配列番号１７) 1
μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μl、D.D.W. 3.75
μlを混ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、
1分間、72℃、2分間を20回、72℃、5分間を1回で2回目
のPCRをおこなった。2回目のPCR反応液をフェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガ
ロース電気泳動により確認した約280 bpのDNA断片をWiz
ard TM PCR Preps DNA Purification System (Promega
社製) を用いて回収した。このDNA断片をプラスミドベ
クター pGEM-T-Easy（Promega社製）に挿入し、塩基配
列の決定をABI Prism TM dRhodamine Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit （Applied Biosystem
s社製）とABIPrism TM 310 ジネティックアナライザー
（Applied Biosystems社製）を用いておこなった。
Ra LA Taq TM with GC Buffer（宝酒造社製）を用いて
おこなった。上記の鋳型cDNA 2.5 μl、2X GC buffer 1
2.5μl、2.5 mM dNTPs 4 μl、10 μM AUAP primer (配
列番号１２) 1 μl、10 μMh#10-56 primer (配列番号
１６) 1 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μl、D.
D.W. 3.75μlを混ぜた溶液を94℃、2分間を1回、94℃、
1分間、55℃、1分間、72℃、2分間を30回、72℃、5分間
を1回で1回目のPCRをおこなった。1回目のPCR反応液を5
0倍希釈したものを2.5 μl、2X GC buffer 12.5 μl、
2.5 mM dNTPs 4μl、10 μM AUAP primer (配列番号１
２) 1 μl、10 μM h#10-57 primer (配列番号１７) 1
μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μl) 0.25 μl、D.D.W. 3.75
μlを混ぜて、94℃、2分間を1回、94℃、1分間、55℃、
1分間、72℃、2分間を20回、72℃、5分間を1回で2回目
のPCRをおこなった。2回目のPCR反応液をフェノール／
クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、3％ 低融点アガ
ロース電気泳動により確認した約280 bpのDNA断片をWiz
ard TM PCR Preps DNA Purification System (Promega
社製) を用いて回収した。このDNA断片をプラスミドベ
クター pGEM-T-Easy（Promega社製）に挿入し、塩基配
列の決定をABI Prism TM dRhodamine Terminator Cycle
Sequencing Ready Reaction Kit （Applied Biosystem
s社製）とABIPrism TM 310 ジネティックアナライザー
（Applied Biosystems社製）を用いておこなった。
【００４４】全長ヒトB6TNC#10 cDNAの塩基配列の決定
するために、5'RACEと3'RACEで同定していないヒトB6TN
C#10 cDNAの領域を同定した。genomic DNAを除去するた
めに、Deoxyribonuclease I, Amplification Grade（LI
FE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。 SK-LMS-1細胞m
RNA 1 μg（1 μl） 、10X DNase I Buffer１μl、RNas
e free DNase I (1 U/μl) 1 μl、D.D.W. 7 μlで室温
15分間 インキュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1
μl添加し、65 ℃、15分間インキュベート後、氷上に5
分間、放置した。SK-LMS-1細胞cDNAを合成するために、
SuperScript T M Preamplification System for First S
trand cDNA Synthesis (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）
を用いた。DNase I処理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg
(5 μl)にD.D.W. 19 μl、Oligo（dT）12-18 primer
（0.5 μg/μl）1 μlを添加し、70℃、10分間インキュ
ベートし、50℃に保温する（溶液Ｋ）。一方、10X PCR
buffer 5 μl、25 mM MgCl2 5 μl、10mM dNTPs 2.5
μl、 0.1 M DTT 5 μl、D.D.W. 6.5 μlを50℃で保温
する（溶液Ｌ）。溶液Ｋと溶液ＬとSuperScript TM II
(200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50℃、50分間インキュ
ベートした。70℃、15分間処理後、氷上に5分間放置し
た。RNase MIX 1 μl添加し37℃、30分間インキュベー
トし、これを鋳型DNAとした。鋳型DNA 1 μl、2X GC bu
ffer 25 μl、2.5mM dNTPs 8 μl、100 μM h#10-511 p
rimer (配列番号１８) 0.25 μl、100 μM h#10-36 pri
mer (配列番号１９) 0.25 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μ
l) 0.5 μl、D.D.W. 15 μlを混ぜて、94℃、2分間を1
回、94℃、1分間、60℃、1分間、72℃、4分30秒間を35
回、72℃、2分間を1回でPCRをおこなった。PCR反応液を
フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、1
％ 低融点アガロース電気泳動により確認した約３kbpの
PCR増幅DNA断片をWizard TM PCR Preps DNA Purificati
on System (Promega社製) を用いて回収した。このDNA
断片をプラスミドベクター pGEM-T-Easy （Promega社
製）に挿入し、塩基配列の決定をABI Prism TM dRhodam
ine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
（Applied Biosystems社製）とABI Prism TM 310 ジネ
ティックアナライザー （Applied Biosystems社製）を
用いておこなった。以上、ヒトB6TNC#10遺伝子の5'RACE
と3'RACEのPCR産物、ならびに h#10-511 primer（配列
番号１８）とh#10-36 primer（配列番号１９） により
得られたPCR産物の塩基配列をもとに全長ヒトB6TNC#10
cDNAの塩基配列（配列番号２０）を確定した。その結
果、ヒトB6TNC#10 cDNAは全長3,462bpからなることを同
定した。
するために、5'RACEと3'RACEで同定していないヒトB6TN
C#10 cDNAの領域を同定した。genomic DNAを除去するた
めに、Deoxyribonuclease I, Amplification Grade（LI
FE TECHNOLOGIES,INC.社製）を用いた。 SK-LMS-1細胞m
RNA 1 μg（1 μl） 、10X DNase I Buffer１μl、RNas
e free DNase I (1 U/μl) 1 μl、D.D.W. 7 μlで室温
15分間 インキュベートした。25 mM EDTA (pH 8.0)を1
μl添加し、65 ℃、15分間インキュベート後、氷上に5
分間、放置した。SK-LMS-1細胞cDNAを合成するために、
SuperScript T M Preamplification System for First S
trand cDNA Synthesis (LIFE TECHNOLOGIES,INC.社製）
を用いた。DNase I処理したSK-LMS-1細胞cDNA 0.5 μg
(5 μl)にD.D.W. 19 μl、Oligo（dT）12-18 primer
（0.5 μg/μl）1 μlを添加し、70℃、10分間インキュ
ベートし、50℃に保温する（溶液Ｋ）。一方、10X PCR
buffer 5 μl、25 mM MgCl2 5 μl、10mM dNTPs 2.5
μl、 0.1 M DTT 5 μl、D.D.W. 6.5 μlを50℃で保温
する（溶液Ｌ）。溶液Ｋと溶液ＬとSuperScript TM II
(200 units/μl) 1μl混ぜ合わせ50℃、50分間インキュ
ベートした。70℃、15分間処理後、氷上に5分間放置し
た。RNase MIX 1 μl添加し37℃、30分間インキュベー
トし、これを鋳型DNAとした。鋳型DNA 1 μl、2X GC bu
ffer 25 μl、2.5mM dNTPs 8 μl、100 μM h#10-511 p
rimer (配列番号１８) 0.25 μl、100 μM h#10-36 pri
mer (配列番号１９) 0.25 μl、TaKaRa LA Taq (5 U/μ
l) 0.5 μl、D.D.W. 15 μlを混ぜて、94℃、2分間を1
回、94℃、1分間、60℃、1分間、72℃、4分30秒間を35
回、72℃、2分間を1回でPCRをおこなった。PCR反応液を
フェノール／クロロホルム抽出、エタノール沈澱後、1
％ 低融点アガロース電気泳動により確認した約３kbpの
PCR増幅DNA断片をWizard TM PCR Preps DNA Purificati
on System (Promega社製) を用いて回収した。このDNA
断片をプラスミドベクター pGEM-T-Easy （Promega社
製）に挿入し、塩基配列の決定をABI Prism TM dRhodam
ine Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit
（Applied Biosystems社製）とABI Prism TM 310 ジネ
ティックアナライザー （Applied Biosystems社製）を
用いておこなった。以上、ヒトB6TNC#10遺伝子の5'RACE
と3'RACEのPCR産物、ならびに h#10-511 primer（配列
番号１８）とh#10-36 primer（配列番号１９） により
得られたPCR産物の塩基配列をもとに全長ヒトB6TNC#10
cDNAの塩基配列（配列番号２０）を確定した。その結
果、ヒトB6TNC#10 cDNAは全長3,462bpからなることを同
定した。
【００４５】実施例３ ヒトB6TNC#10の推定アミノ酸配列解析 確定したヒトB6TNC#10 cDNAの塩基配列（配列番号２
０）および内部に終始コドンを持たないopen reading f
rame (ORF)のアミノ酸配列（配列番号２１）を図１（図
１および図２）に示す。ヒトB6TNC#10 cDNAは全長3,462
bpからなり、3'非翻訳領域にポリＡ付加シグナル（二
重下線）を確認できた。この遺伝子は866個のアミノ酸
配列よりなるORFを有し、2箇所に疎水性の強いアミノ酸
（下線）を有する遺伝子であることが明らかになり、膜
タンパク質、もしくは膜に存在するレセプタータンパク
質であることが推定される。この866個のアミノ酸から
なるタンパク質の分子量は、計算によると91,720であっ
た。
０）および内部に終始コドンを持たないopen reading f
rame (ORF)のアミノ酸配列（配列番号２１）を図１（図
１および図２）に示す。ヒトB6TNC#10 cDNAは全長3,462
bpからなり、3'非翻訳領域にポリＡ付加シグナル（二
重下線）を確認できた。この遺伝子は866個のアミノ酸
配列よりなるORFを有し、2箇所に疎水性の強いアミノ酸
（下線）を有する遺伝子であることが明らかになり、膜
タンパク質、もしくは膜に存在するレセプタータンパク
質であることが推定される。この866個のアミノ酸から
なるタンパク質の分子量は、計算によると91,720であっ
た。
【００４６】アミノ酸配列の類似性解析は遺伝子解析ソ
フトGENETYX-SV/RC Ver.3.2.0.（ソフトウェアー開発社
製）を用いておこなった。マウスB6TNC#10（配列番号
２）とヒトB6TNC#10（配列番号２１）との相同性を図３
に示す。相同性は84％と非常に高く、単離したヒトB6TN
C#10クローンはマウスB6TNC#10のヒトに相当する遺伝子
であることが推察される。また、 B6TNC#10以外で最も
相同性が高かったヒトアセチルLDLレセプター（Adachi,
H., Tsujimoto, M., Arai, H. & Inoue, K. (1997) J.
Biol. Chem. 272, 31217-31220）との結果を図４に示
す。保存されているアミノ酸は＊印で示した。ヒトB6TN
C#10とヒトアセチルLDLレセプターとの相同性は39％
で、特に、細胞外領域と考えられる部分の相同性が高か
った。このことからヒトB6TNC#10はスカベンジャー受容
体ファミリーの一つであることが予想される。
フトGENETYX-SV/RC Ver.3.2.0.（ソフトウェアー開発社
製）を用いておこなった。マウスB6TNC#10（配列番号
２）とヒトB6TNC#10（配列番号２１）との相同性を図３
に示す。相同性は84％と非常に高く、単離したヒトB6TN
C#10クローンはマウスB6TNC#10のヒトに相当する遺伝子
であることが推察される。また、 B6TNC#10以外で最も
相同性が高かったヒトアセチルLDLレセプター（Adachi,
H., Tsujimoto, M., Arai, H. & Inoue, K. (1997) J.
Biol. Chem. 272, 31217-31220）との結果を図４に示
す。保存されているアミノ酸は＊印で示した。ヒトB6TN
C#10とヒトアセチルLDLレセプターとの相同性は39％
で、特に、細胞外領域と考えられる部分の相同性が高か
った。このことからヒトB6TNC#10はスカベンジャー受容
体ファミリーの一つであることが予想される。
【００４７】図５、図６および図７にヒトB6TNC#10の蛋
白質の推定される構造を示す。ヒトB6TNC#10とヒトアセ
チルLDLレセプターで保存されているアミノ酸の繰り返
し配列のアミノ酸配列を示した。ヒトB6TNC#10の細胞外
領域と考えられる部分でシステイン残基とグリシン残基
が保存された10個の繰り返し配列がヒトアセチルLDLレ
セプター同様存在した（図５）。また、アミノ酸の繰り
返し配列中に7個のEGF様リピートが保存されており、タ
ンパク質間の結合、またはリガンドの結合に必要な領域
であることが推定される（図６）。図７にヒトB6TNC#10
タンパクの全体構造を示した。2箇所に疎水性の強いア
ミノ酸（細下線）、そして細胞外領域に7個のEGF様リピ
ート（太線）が存在する。細胞内領域はセリン／プロリ
ンに富んでおり、リン酸化を受けることが予想され、ヒ
トB6TNC#10はシグナルを細胞内に伝えることができる分
子であることが推定される。特に、波線で示した領域は
チロシン残基がリン酸化を受けた時、SH２ドメインを持
つタンパク質の結合部位になることが予想される。ま
た、二重下線のプロリン残基が富んだ領域はSH３ドメイ
ンを持つタンパク質の結合部位になることが予想され
る。
白質の推定される構造を示す。ヒトB6TNC#10とヒトアセ
チルLDLレセプターで保存されているアミノ酸の繰り返
し配列のアミノ酸配列を示した。ヒトB6TNC#10の細胞外
領域と考えられる部分でシステイン残基とグリシン残基
が保存された10個の繰り返し配列がヒトアセチルLDLレ
セプター同様存在した（図５）。また、アミノ酸の繰り
返し配列中に7個のEGF様リピートが保存されており、タ
ンパク質間の結合、またはリガンドの結合に必要な領域
であることが推定される（図６）。図７にヒトB6TNC#10
タンパクの全体構造を示した。2箇所に疎水性の強いア
ミノ酸（細下線）、そして細胞外領域に7個のEGF様リピ
ート（太線）が存在する。細胞内領域はセリン／プロリ
ンに富んでおり、リン酸化を受けることが予想され、ヒ
トB6TNC#10はシグナルを細胞内に伝えることができる分
子であることが推定される。特に、波線で示した領域は
チロシン残基がリン酸化を受けた時、SH２ドメインを持
つタンパク質の結合部位になることが予想される。ま
た、二重下線のプロリン残基が富んだ領域はSH３ドメイ
ンを持つタンパク質の結合部位になることが予想され
る。
【００４８】実施例４ ヒトB6TNC#10 cDNAのプラスミドライブラリーからの単
離 ヒトB6TNC#10 cDNAのスプライシングバリアント等を単
離する目的でプラスミドライブラリーからヒトB6TNC#10
cDNAを単離することを試みた。まず、ヒト細胞株SK-LM
S-1細胞（ATCC No. HTB 88）からmRNAを調製した。SK-L
MS-1細胞5X 10 6個当たり1 mlのTRIzolTM（LIFE TECHNOL
OGIES,INC.社製）を加え、細胞を溶解した。クロロホル
ム0.2 ml添加し、攪拌後、12,000 rpm 10分間遠心し
た。上清を回収し、0.5 mlのイソプロパノールを添加し
攪拌後、12,000 rpm 10分間遠心し、75% エタノール洗
浄後、風乾し、沈殿を注射用水（ 扶桑薬品工業社製）
で溶解し、SK-LMS-1細胞total RNAサンフ゜ルとした。 SK-LM
S-1細胞total RNAよりmRNAPurification Kit （ファルマシア
社製）を用いてSK-LMS-1細胞mRNAを精製した。SK-LMS-1
細胞mRNAを用いて、SK−LMS−1 cDNA ライブラリーをSU
PERSCRIPTTMChoice System for cDNA Synthesis（LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）を用い、pBluescript II KS＋
のEcoRI部位に挿入して作製した。ヒトB6TNC#10 cDNAの
スクリーニングのために以下のプライマーを合成した。 h#10-56 5'-GTTGCGTCTCATTGGCTCAGGTCC-3' （配列番号１６） h#10-34 5'-GGTAGCCCTAACCAAGTCCACTCC-3' （配列番号２２） h#10-56プライマーとh#10-34プライマーを用いて、PCR
法で単離した全長ヒトB6TNC#10 cDNAをpGEM-T-Easyに組
み込んだものを鋳型にしてPCR法によりヒトB6TNC#10プ
ローブとビオチン化ヒトB6TNC#10プローブを作製した。
さらに、ビオチン化ヒトB6TNC#10プローブによりCloneC
aptureTM cDNA Selection Kit （CLONTECH社製）を用
い、ヒトB6TNC#10 cDNAクローンを濃縮し、ヒトB6TNC#1
0プローブを用いたハイブリダイゼーション法によりヒ
トB6TNC#10 cDNAクローンを単離した。単離したクロー
ンの塩基配列の決定をABI PRISMTM dRhodamine Termina
tor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit （Applied
Biosystems社製）とABI PRISMTM 310 シ゛ネティックアナライサ゛ー
（Applied Biosystems社製）を用いておこなった。その
結果、スプライシングの位置が異なり遺伝子多型のある
2種類のヒトB6TNC#10 cDNAクローン（ヒトB6TNC#10aと
ヒトB6TNC#10bとする。）を単離した。ヒトB6TNC#10aの
塩基配列を配列番号２３に、予想されるアミノ酸配列を
配列番号２４に、ヒトB6TNC#10bの塩基配列を配列番号
２５に、予想されるアミノ酸配列を配列番号２６に示
す。ヒトB6TNC#10aは配列番号20の12位のＧから始まり
2,515位のＣがＧ、2,569位のＣがＧ、2,733位のＡがＣ
に置換されていた。また、ヒトB6TNC#10bは配列番号20の
21位のＣから始まり591位のＣがＴ、3,460位のＣがＧに
置換され、さらに、1,494位と1,495位の間に15塩基の挿
入が見られた。その結果、予想されるアミノ酸配列はヒ
トB6TNC#10aでは配列番号21の815位のAlaがGly、833位
のAlaがGlyに置換される。ヒトB6TNC#10bでは配列番号2
1の174位のProがSerに置換され、かつ475位と476位の間
に５アミノ酸が挿入される。異なる配列がある部位には
＊印をつけた（図８及び図９）。
離 ヒトB6TNC#10 cDNAのスプライシングバリアント等を単
離する目的でプラスミドライブラリーからヒトB6TNC#10
cDNAを単離することを試みた。まず、ヒト細胞株SK-LM
S-1細胞（ATCC No. HTB 88）からmRNAを調製した。SK-L
MS-1細胞5X 10 6個当たり1 mlのTRIzolTM（LIFE TECHNOL
OGIES,INC.社製）を加え、細胞を溶解した。クロロホル
ム0.2 ml添加し、攪拌後、12,000 rpm 10分間遠心し
た。上清を回収し、0.5 mlのイソプロパノールを添加し
攪拌後、12,000 rpm 10分間遠心し、75% エタノール洗
浄後、風乾し、沈殿を注射用水（ 扶桑薬品工業社製）
で溶解し、SK-LMS-1細胞total RNAサンフ゜ルとした。 SK-LM
S-1細胞total RNAよりmRNAPurification Kit （ファルマシア
社製）を用いてSK-LMS-1細胞mRNAを精製した。SK-LMS-1
細胞mRNAを用いて、SK−LMS−1 cDNA ライブラリーをSU
PERSCRIPTTMChoice System for cDNA Synthesis（LIFE
TECHNOLOGIES,INC.社製）を用い、pBluescript II KS＋
のEcoRI部位に挿入して作製した。ヒトB6TNC#10 cDNAの
スクリーニングのために以下のプライマーを合成した。 h#10-56 5'-GTTGCGTCTCATTGGCTCAGGTCC-3' （配列番号１６） h#10-34 5'-GGTAGCCCTAACCAAGTCCACTCC-3' （配列番号２２） h#10-56プライマーとh#10-34プライマーを用いて、PCR
法で単離した全長ヒトB6TNC#10 cDNAをpGEM-T-Easyに組
み込んだものを鋳型にしてPCR法によりヒトB6TNC#10プ
ローブとビオチン化ヒトB6TNC#10プローブを作製した。
さらに、ビオチン化ヒトB6TNC#10プローブによりCloneC
aptureTM cDNA Selection Kit （CLONTECH社製）を用
い、ヒトB6TNC#10 cDNAクローンを濃縮し、ヒトB6TNC#1
0プローブを用いたハイブリダイゼーション法によりヒ
トB6TNC#10 cDNAクローンを単離した。単離したクロー
ンの塩基配列の決定をABI PRISMTM dRhodamine Termina
tor Cycle Sequencing Ready Reaction Kit （Applied
Biosystems社製）とABI PRISMTM 310 シ゛ネティックアナライサ゛ー
（Applied Biosystems社製）を用いておこなった。その
結果、スプライシングの位置が異なり遺伝子多型のある
2種類のヒトB6TNC#10 cDNAクローン（ヒトB6TNC#10aと
ヒトB6TNC#10bとする。）を単離した。ヒトB6TNC#10aの
塩基配列を配列番号２３に、予想されるアミノ酸配列を
配列番号２４に、ヒトB6TNC#10bの塩基配列を配列番号
２５に、予想されるアミノ酸配列を配列番号２６に示
す。ヒトB6TNC#10aは配列番号20の12位のＧから始まり
2,515位のＣがＧ、2,569位のＣがＧ、2,733位のＡがＣ
に置換されていた。また、ヒトB6TNC#10bは配列番号20の
21位のＣから始まり591位のＣがＴ、3,460位のＣがＧに
置換され、さらに、1,494位と1,495位の間に15塩基の挿
入が見られた。その結果、予想されるアミノ酸配列はヒ
トB6TNC#10aでは配列番号21の815位のAlaがGly、833位
のAlaがGlyに置換される。ヒトB6TNC#10bでは配列番号2
1の174位のProがSerに置換され、かつ475位と476位の間
に５アミノ酸が挿入される。異なる配列がある部位には
＊印をつけた（図８及び図９）。
【００４９】実施例５ ヒトB6TNC#10発現ベクターの構築 2種類のヒトB6TNC#10aとヒトB6TNC#10bのプラスミドか
ら制限酵素SalIで切り出し、それぞれ発現ベクターpCAG
GS-neo（Niwa, H. et al. (1991) Gene 108,193）のXho
I部位に挿入した。大腸菌JM109に発現ベクターを組み込
み、プラスミドDNAをQIAGEN Plasmid Kit （QIAGEN社
製）で精製した。
ら制限酵素SalIで切り出し、それぞれ発現ベクターpCAG
GS-neo（Niwa, H. et al. (1991) Gene 108,193）のXho
I部位に挿入した。大腸菌JM109に発現ベクターを組み込
み、プラスミドDNAをQIAGEN Plasmid Kit （QIAGEN社
製）で精製した。
【００５０】実施例６ ヒトB6TNC#10のアセチルLDL結合実験 6 wellプレートに10 μｇ/ml ヒトファイブロネクチン
（GIBCO BRL社製）を500μｌ/wellずつ入れ、室温2時間
放置する。２mlのPBS（-）で２回洗浄後、ヒト胎児腎臓
由来細胞株293細胞（ATCC No.CRL-1573）を6 wellプレ
ートにD-MEM（HighGlucose）（日研生物医学研究所製）
/10 ％ FCS培地を用いて2 X105個/wellで巻き込み、37
℃、5％ CO2で培養する。24時間後、2 mlのOPTI-MEM I
Reduced-Serum Medium（GIBCO BRL社製）で２回、細胞
を洗浄し、1 mlのOPTI-MEM I Reduced-Serum Mediumを
加える。 pCAGGS-neo 、 pCAGGS- hB6TNC#10a、 pCAGGS
- hB6TNC#10bベクターをそれぞれのwellに１ μｇ/well
で入れ、さらに、全wellにリポフェクトアミン（ GIBCO
BRL社製）６ μl/wellずつ入れよく混ぜる。37℃、5％
CO2で４時間培養後、 2 mlのD-MEM（High Glucose）/10
％ FCS 培地で2回細胞を洗浄後、 D-MEM（High Glucos
e）/10 ％ FCS 培地を用いて37℃、5％ CO2で48時間培
養する。細胞を2回、2 mlのD-MEM（High Glucose）/10
％ FCS培地で洗浄後、DiI-Ac-LDL（Biomedical Technol
ogies Inc.製）を終濃度5 μｇ/mlになるように加えたD
-MEM（High Glucose）/10 ％ FCS培地で37℃、5％ CO2
で3時間培養する。細胞をPBS（-）/10 ％ FCS で2回洗
浄し、さらにPBS（-）で2回洗浄する。1 ml/well でイ
ソプロパノールを加え、室温15分間、緩やかに振とうす
る。イソプロパノールを1.5 mlチューブに回収し、12,0
00回転で10分間、4℃で遠心後、上清を蛍光測定サンプ
ルとする。wellに残った細胞と遠心後の沈殿物を1 mlの
0.2 N NaOHで溶解し、蛋白量測定サンプルとする。蛍光
測定サンプルを蛍光光度計LS50B（PERKIN ELMER社製）
を用いて励起波長520 nm、蛍光波長566 nmで蛍光強度を
測定した。また、検量線を100、200、400、600、800、1
000 μｇ/mlのDiI-Ac-LDLの蛍光強度を測定して作成
し、蛍光測定サンプルの蛍光強度からDiI-Ac-LDL濃度を
求めた。また、蛋白量測定サンプルを滅菌水で2倍希釈
し、BCAキット（PIERCE社製）で蛋白濃度を測定した。
各well当たりのDiI-Ac-LDLの結合量を各well当たりの蛋
白量で割り、細胞蛋白量当りの細胞に結合したDiI-Ac-L
DLの結合量を求めた。ヒトB6TNC#10特異的に結合するDi
I-Ac-LDL量をpCAGGS-neoを導入した細胞のDiI-Ac-LDL結
合量で引くことで求めた。結果を図１０に示す。この結
果によれば、本レセプターは、アセチルLDLを取り込
み、レセプターとしての機能を有することが確認され
た。
（GIBCO BRL社製）を500μｌ/wellずつ入れ、室温2時間
放置する。２mlのPBS（-）で２回洗浄後、ヒト胎児腎臓
由来細胞株293細胞（ATCC No.CRL-1573）を6 wellプレ
ートにD-MEM（HighGlucose）（日研生物医学研究所製）
/10 ％ FCS培地を用いて2 X105個/wellで巻き込み、37
℃、5％ CO2で培養する。24時間後、2 mlのOPTI-MEM I
Reduced-Serum Medium（GIBCO BRL社製）で２回、細胞
を洗浄し、1 mlのOPTI-MEM I Reduced-Serum Mediumを
加える。 pCAGGS-neo 、 pCAGGS- hB6TNC#10a、 pCAGGS
- hB6TNC#10bベクターをそれぞれのwellに１ μｇ/well
で入れ、さらに、全wellにリポフェクトアミン（ GIBCO
BRL社製）６ μl/wellずつ入れよく混ぜる。37℃、5％
CO2で４時間培養後、 2 mlのD-MEM（High Glucose）/10
％ FCS 培地で2回細胞を洗浄後、 D-MEM（High Glucos
e）/10 ％ FCS 培地を用いて37℃、5％ CO2で48時間培
養する。細胞を2回、2 mlのD-MEM（High Glucose）/10
％ FCS培地で洗浄後、DiI-Ac-LDL（Biomedical Technol
ogies Inc.製）を終濃度5 μｇ/mlになるように加えたD
-MEM（High Glucose）/10 ％ FCS培地で37℃、5％ CO2
で3時間培養する。細胞をPBS（-）/10 ％ FCS で2回洗
浄し、さらにPBS（-）で2回洗浄する。1 ml/well でイ
ソプロパノールを加え、室温15分間、緩やかに振とうす
る。イソプロパノールを1.5 mlチューブに回収し、12,0
00回転で10分間、4℃で遠心後、上清を蛍光測定サンプ
ルとする。wellに残った細胞と遠心後の沈殿物を1 mlの
0.2 N NaOHで溶解し、蛋白量測定サンプルとする。蛍光
測定サンプルを蛍光光度計LS50B（PERKIN ELMER社製）
を用いて励起波長520 nm、蛍光波長566 nmで蛍光強度を
測定した。また、検量線を100、200、400、600、800、1
000 μｇ/mlのDiI-Ac-LDLの蛍光強度を測定して作成
し、蛍光測定サンプルの蛍光強度からDiI-Ac-LDL濃度を
求めた。また、蛋白量測定サンプルを滅菌水で2倍希釈
し、BCAキット（PIERCE社製）で蛋白濃度を測定した。
各well当たりのDiI-Ac-LDLの結合量を各well当たりの蛋
白量で割り、細胞蛋白量当りの細胞に結合したDiI-Ac-L
DLの結合量を求めた。ヒトB6TNC#10特異的に結合するDi
I-Ac-LDL量をpCAGGS-neoを導入した細胞のDiI-Ac-LDL結
合量で引くことで求めた。結果を図１０に示す。この結
果によれば、本レセプターは、アセチルLDLを取り込
み、レセプターとしての機能を有することが確認され
た。
【００５１】
【発明の効果】本発明によれば、ヒトナース細胞レセプ
ター；本発明のポリペプチドをコードするDNA；本発明
の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含
み、該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生
するハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクタ
ー；本発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組
換えヒトナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒ
トナース細胞レセプターに特異的に結合するリガンドの
スクリーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプタ
ーとリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニン
グ方法；本発明のスクリーニング方法により得られる医
薬；本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出
するためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾
患を検出するためのキットが提供される。
ター；本発明のポリペプチドをコードするDNA；本発明
の塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含
み、該塩基配列と特異的に結合するDNA；本発明のポリ
ペプチドを特異的に認識する抗体；本発明の抗体を産生
するハイブリドーマ；本発明のDNAを含む発現ベクタ
ー；本発明の発現ベクターより得られる形質転換体；組
換えヒトナース細胞レセプターの製造方法；本発明のヒ
トナース細胞レセプターに特異的に結合するリガンドの
スクリーニング方法；本発明のヒトナース細胞レセプタ
ーとリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリーニン
グ方法；本発明のスクリーニング方法により得られる医
薬；本発明プライマーを含むディジョージ症候群を検出
するためのキット；本発明プライマーを含む自己免疫疾
患を検出するためのキットが提供される。
【００５２】本発明のDNAの一部をプライマーとして用
いることにより、ディジョージ症候群の検出が可能とな
る。更に、本レセプターが欠損した場合には、ナース細
胞によるT細胞の成熟・分化が正常におこなわれない可
能性がある。従って、本発明のDNAの一部をプライマー
として用いることにより、本レセプターの欠損に起因す
る自己免疫疾患の検出が可能となる。更に、本発明のレ
セプターは、レセプターに対するアゴニスト及びアンタ
ゴニストのスクリーニングに有用である。前述のとお
り、本レセプターは、スカベンジャーレセプターとして
機能し、動脈硬化に関与することが予想される。従っ
て、本レセプターの阻害物質は、動脈硬化の治療に有用
であると考えられる。
いることにより、ディジョージ症候群の検出が可能とな
る。更に、本レセプターが欠損した場合には、ナース細
胞によるT細胞の成熟・分化が正常におこなわれない可
能性がある。従って、本発明のDNAの一部をプライマー
として用いることにより、本レセプターの欠損に起因す
る自己免疫疾患の検出が可能となる。更に、本発明のレ
セプターは、レセプターに対するアゴニスト及びアンタ
ゴニストのスクリーニングに有用である。前述のとお
り、本レセプターは、スカベンジャーレセプターとして
機能し、動脈硬化に関与することが予想される。従っ
て、本レセプターの阻害物質は、動脈硬化の治療に有用
であると考えられる。
【００５３】また、前述のとおり、ナース細胞は、胸
腺、皮膚組織、骨髄、リンパ節、肝臓、脳、リウマチ患
者の滑膜、癌の原発巣及び転移巣に存在することが確認
されている。ナース細胞は、血球系幹細胞の増殖と自己
再生能の維持及びリンパ球の正及び負の選択に関与し、
正常な免疫系の発生とメモリー細胞の維持に関与してい
ると考えられる。よって、ナース細胞膜表面に発現する
本レセプターの機能異常が免疫系の機能異常と自己免疫
疾 患の発症に関わることが予想される。そのため、本
発明のスクリーニングにより得られるアゴニストおよび
アンタゴニストは、自己免疫疾患と腫瘍に対する治療に
有用であることが考えられる。
腺、皮膚組織、骨髄、リンパ節、肝臓、脳、リウマチ患
者の滑膜、癌の原発巣及び転移巣に存在することが確認
されている。ナース細胞は、血球系幹細胞の増殖と自己
再生能の維持及びリンパ球の正及び負の選択に関与し、
正常な免疫系の発生とメモリー細胞の維持に関与してい
ると考えられる。よって、ナース細胞膜表面に発現する
本レセプターの機能異常が免疫系の機能異常と自己免疫
疾 患の発症に関わることが予想される。そのため、本
発明のスクリーニングにより得られるアゴニストおよび
アンタゴニストは、自己免疫疾患と腫瘍に対する治療に
有用であることが考えられる。
【００５４】
【配列表】 SEQUENCE LISTING <110> Shionogi & Co.,Ltd. <120> A Gene Encoding Human Nures Cell Receptor <130> 00P00018 <150> JP 46604/1999 <151> 1999-02-24 <160> 26 <170> PatentIn Ver. 2.0 <210> 1 <211> 3274 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (65)..(2563) <400> 1 actccgcttc cggccgccct tgccgcggcc gcacccgcgc ccacccgcgc ctgccccgcg 60 cctc atg gag ggc gca ggg tcc cgg ggg gcc ggg ccg gcg cgg cgc cag 109 Met Glu Gly Ala Gly Ser Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Arg Gln 1 5 10 15 gga gcc cga ggg ctg gga ctg ctg ctg ctg ctc tgg ctg ctg ccc ggt 157 Gly Ala Arg Gly Leu Gly Leu Leu Leu Leu Leu Trp Leu Leu Pro Gly 20 25 30 ctc gcg gcg ccc cag gac ttg aac ccg cga ggc cgc aac gtg tgc cgc 205 Leu Ala Ala Pro Gln Asp Leu Asn Pro Arg Gly Arg Asn Val Cys Arg 35 40 45 acg ccc ggt tcc cag gtg ctc acg tgt tgc gct ggc tgg agg cag ctg 253 Thr Pro Gly Ser Gln Val Leu Thr Cys Cys Ala Gly Trp Arg Gln Leu 50 55 60 ggg gat gag tgt ggg ata gcg gtg tgc gaa ggc aat tcc acg tgc tca 301 Gly Asp Glu Cys Gly Ile Ala Val Cys Glu Gly Asn Ser Thr Cys Ser 65 70 75 gaa aac gag gtg tgc gtg cgg cca ggc gaa tgc cgc tgc cga cat ggc 349 Glu Asn Glu Val Cys Val Arg Pro Gly Glu Cys Arg Cys Arg His Gly 80 85 90 95 tac ttt ggt gcc aac tgc gac aca aag tgc ccg cgc cag ttc tgg ggc 397 Tyr Phe Gly Ala Asn Cys Asp Thr Lys Cys Pro Arg Gln Phe Trp Gly 100 105 110 cct gac tgc aag gag agg tgc agt tgc cac ccg cac gga cag tgc gag 445 Pro Asp Cys Lys Glu Arg Cys Ser Cys His Pro His Gly Gln Cys Glu 115 120 125 gac gtg acc gga cag tgt acg tgt cac gcg cgc cgc tgg ggt gcg cgc 493 Asp Val Thr Gly Gln Cys Thr Cys His Ala Arg Arg Trp Gly Ala Arg 130 135 140 tgc gag cat gct tgc caa tgc cag cat ggc acg tgc cac ccg cgg agc 541 Cys Glu His Ala Cys Gln Cys Gln His Gly Thr Cys His Pro Arg Ser 145 150 155 ggc gcg tgc cgg tgc gag ccg ggc tgg tgg ggt gcg caa tgc gct agc 589 Ｇｌｙ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｐｒｏ Ｇｌｙ Ｔｒｐ
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ １６０ １６５
１７０ １７５ ｇｃｔ ｔｇｃ ｔａｔ ｔｇｃ ａｇｃ ｇｃｔ ａｃｔ ｔｃｃ ｃｇｇ
ｔｇｃ ｇａｔ ｃｃａ ｃａｇ ａｃａ ｇｇｃ ｇｃｃ ６３７ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ １８０
１８５ １９０ ｔｇｃ ｃｔｇ ｔｇｃ ｃａｃ ｇｔａ ｇｇｃ ｔｇｇ ｔｇｇ ｇｇｃ
ｃｇｃ ａｇｃ ｔｇｔ ａａｃ ａａｃ ｃａｇ ｔｇｃ ６８５ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ １９５ ２００
２０５ ｇｃｃ ｔｇｃ ａａｃ ｔｃｇ ｔｃｇ ｃｃｃ ｔｇｃ ｇａｇ ｃａｇ
ｃａｇ ａｇｔ ｇｇｃ ｃｇｃ ｔｇｃ ｃａｇ ｔｇｔ ７３３ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ ２１０ ２１５
２２０ ｃｇｃ ｇａｇ ｃｇｃ ａｔｇ ｔｔｔ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃｇｃ ｔｇｔ
ｇａｔ ｃｇｃ ｔａｔ ｔｇｃ ｃａｇ ｔｇｃ ｔｃｔ ７８１ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ ２２５ ２３０
２３５ ｃａｃ ｇｇｔ ｃｇｃ ｔｇｃ ｃａｃ ｃｃｇ ｇｔｇ ｇａｃ ｇｇｃ
ａｃｇ ｔｇｔ ｇｃｃ ｔｇｃ ｇａｔ ｃｃｔ ｇｇｃ ８２９ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ２４０ ２４５
２５０ ２５５ ｔａｃ ｃｇｇ ｇｇｃ ａａｇ ｔａｔ ｔｇｔ ｃｇｃ ｇａｇ ｃｃａ
ｔｇｃ ｃｃｃ ｇｃｔ ｇｇａ ｔｔｃ ｔａｔ ｇｇｃ ８７７ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２６０
２６５ ２７０ ｃｃｇ ｇｇｃ ｔｇｔ ｃｇｃ ｃｇｔ ｃｇｇ ｔｇｔ ｇｇｃ ｃａａ
ｔｇｃ ａａａ ｇｇｃ ｃａｇ ｃａｇ ｃｃｇ ｔｇｃ ９２５ 275 280 285 acg gta gtc gaa ggc cgc tgt ctg aca tgc gag ccc ggc tgg aac gga 973 Thr Val Val Glu Gly Arg Cys Leu Thr Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly 290 295 300 acc aaa tgt gac caa ccc tgc gcc acc ggt ttc tac ggc gaa ggt tgt 1021 Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys 305 310 315 ggc cac cgc tgc cca ccc tgc cgc gac ggg cat gcc tgc aac cat gtc 1069 Gly His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp Gly His Ala Cys Asn His Val 320 325 330 335 acc ggc aag tgt acg cac tgc aat gcg ggc tgg atc ggc gac cgg tgc 1117 Thr Gly Lys Cys Thr His Cys Asn Ala Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys 340 345 350 gag act aag tgc agt aat ggc act tac ggt gag gac tgt gcc ttc gtg 1165 Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val 355 360 365 tgc tct gat tgc ggc agc ggc cac tgt gac ttc cag tcc ggg cgc tgc 1213 Cys Ser Asp Cys Gly Ser Gly His Cys Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys 370 375 380 ctt tgc agc cct ggt gtt cac gga cct cac tgt aat gta act tgc ccg 1261 Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro His Cys Asn Val Thr Cys Pro 385 390 395 gcc ggg ctc cac ggc gtg gac tgc gcc cag gcc tgc agc tgt cac gag 1309 Ala Gly Leu His Gly Val Asp Cys Ala Gln Ala Cys Ser Cys His Glu 400 405 410 415 gaa tca tgc gac ccg gtc acc ggt gcc tgc cac ctg gag acc aat cag 1357 Glu Ser Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala Cys His Leu Glu Thr Asn Gln 420 425 430 cgc aaa ggt gtg atg ggc gcg ggc gct ctg ctc acg ctg ctc ctc ggc 1405 Arg Lys Gly Val Met Gly Ala Gly Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly 435 440 445 ctg ctg ctc tcg ctg ctc ggt tgt tgc tgc gcc tgc cgg ggc aag gac 1453 Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp 450 455 460 tcg gcg cgc cgg gag ctc acc ctt gga agg aag aag gcg cct caa cgt 1501 Ser Ala Arg Arg Glu Leu Thr Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro Gln Arg 465 470 475 ttt tgt gga agc ttc agc cgc atc agc atg aag ctg ccc cga atc ccg 1549 Phe Cys Gly Ser Phe Ser Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro 480 485 490 495 ctt cgc agg cag aag ctg ccc aaa gtc gta gtg gcc cat cat gac cta 1597 Leu Arg Arg Gln Lys Leu Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu 500 505 510 gac aac aca ctc aac tgc agt ttt ctg gac cca ccc tca ggg ctg gag 1645 Asp Asn Thr Leu Asn Cys Ser Phe Leu Asp Pro Pro Ser Gly Leu Glu 515 520 525 cag ccc tct cca tca tgg tcc tcc agg gcc tcc ttc tca tca ttc gac 1693 Gln Pro Ser Pro Ser Trp Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp 530 535 540 acc aca gat gaa ggc cct gtg tac tgt gtg ccc cac gag gaa gcg act 1741 Thr Thr Asp Glu Gly Pro Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Thr 545 550 555 gcc gac agc cga gac ctg gaa gcg act gcc gct ctc act gag gtg gcc 1789 Ala Asp Ser Arg Asp Leu Glu Ala Thr Ala Ala Leu Thr Glu Val Ala 560 565 570 575 gct gtg tcc tta gag ccc acg ggc acc tcg acg ccc ggg gag gag gca 1837 Ala Val Ser Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ser Thr Pro Gly Glu Glu Ala 580 585 590 gcg gtc ctc cct gca tcc tca gac agc gag cgc tcc gca tca agc gtg 1885 Ala Val Leu Pro Ala Ser Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val 595 600 605 gag ggg ccg agc ggg gcg ctg tac gcg cgt gtg gcc cgg cgc gag gcc 1933 Glu Gly Pro Ser Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala 610 615 620 cgg ccg gcc cgg acc cga aat gag gct ggg ggc ttg tca ctg tcc cca 1981 Arg Pro Ala Arg Thr Arg Asn Glu Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro 625 630 635 tcg ccc gag cgc agg aag ccg cca cca cca gac cct gcc acc aag cct 2029 Ser Pro Glu Arg Arg Lys Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro 640 645 650 655 aag gtg tcc tgg atc cac ggc aag cac agc gcc gct gcc gct gca ccg 2077 Lys Val Ser Trp Ile His Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Pro 660 665 670 tcg cct ccg cct gca ggc cgc aag gct gcg ccg agc cct agc ggg agg 2125 Ser Pro Pro Pro Ala Gly Arg Lys Ala Ala Pro Ser Pro Ser Gly Arg 675 680 685 aaa cgg acc ccc agc aac tcg tcg gtg cag ccc ccc gga ctg acc gag 2173 Lys Arg Thr Pro Ser Asn Ser Ser Val Gln Pro Pro Gly Leu Thr Glu 690 695 700 gag gcc ccc ggc ccg gct tca ccc acg cca ccc cgc gcc cga gcg cgc 2221 Glu Ala Pro Gly Pro Ala Ser Pro Thr Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg 705 710 715 ggc cgc ggc ctg ggg ctc tcg gag cca acg gac gcg gga ggt ccc ccg 2269 Gly Arg Gly Leu Gly Leu Ser Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro 720 725 730 735 cgc agc gcg ccc gag gcc gcc tct atg ctg gca gct gag ctg cgc gac 2317 Arg Ser Ala Pro Glu Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Asp 740 745 750 aag act cgc agc tta ggc cgc gcc gag aag ccg ccg ccg ccg cag aag 2365 Lys Thr Arg Ser Leu Gly Arg Ala Glu Lys Pro Pro Pro Pro Gln Lys 755 760 765 gcc aag cgc tcc gtg ctc ccc gcc gcg acg gtc cgc aca gcc tcg gcg 2413 Ala Lys Arg Ser Val Leu Pro Ala Ala Thr Val Arg Thr Ala Ser Ala 770 775 780 tcc gag gcc tcg ggg tca gag aag gcg gcg gcc agc gca cct gcg ccc 2461 Ser Glu Ala Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro 785 790 795 gag acc cct cgg aag aaa acc ccc atc cag aaa ccg cct cgg aag aag 2509 Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile Gln Lys Pro Pro Arg Lys Lys 800 805 810 815 agc agg gag gca gcg ggg gag ccg agt agg gcg ggc acg gcc ccc gga 2557 Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Pro Ser Arg Ala Gly Thr Ala Pro Gly 820 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Ala Gly Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly Leu 435 440 445 Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Ser 450 455 460 Ala Arg Arg Glu Leu Thr Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro Gln Arg Phe 465 470 475 480 Cys Gly Ser Phe Ser Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu 485 490 495 Arg Arg Gln Lys Leu Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp 500 505 510 Asn Thr Leu Asn Cys Ser Phe Leu Asp Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln 515 520 525 Pro Ser Pro Ser Trp Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr 530 535 540 Thr Asp Glu Gly Pro Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Thr Ala 545 550 555 560 Asp Ser Arg Asp Leu Glu Ala Thr Ala Ala Leu Thr Glu Val Ala Ala 565 570 575 Val Ser Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ser Thr Pro Gly Glu Glu Ala Ala 580 585 590 Val Leu Pro Ala Ser Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu 595 600 605 Gly Pro Ser Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg 610 615 620 Pro Ala Arg Thr Arg Asn Glu Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser 625 630 635 640 Pro Glu Arg Arg Lys 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tttttttttt tttt 44 <210> 4 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 4 ctgtctgtgg atcg 14 <210> 5 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 5 cctcgttttc tgagcacgtg gaattgcctt cg 32 <210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 6 agccagagca gcagcagcag tc 22 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 7 tgcgcgacaa gactcgcagc 20 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 8 aaggcatttc attggccccc aa 22 <210> 9 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 9 actccgcttc cggccgccct tg 22 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 10 agctttggcc tgctatgagg a 21 <210> 11 <211> 37 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 11 ggccacgcgt cgactagtac tttttttttt ttttttt 37 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 12 ggccacgcgt cgactagtac 20 <210> 13 <211> 14 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 13 ctggttgttg cagc 14 <210> 14 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <400> 14 gggtggcagc 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gcg tgc cag 542 Thr Cys His Ala Arg Arg Trp Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Cys Gln 145 150 155 tgc cag cac ggc acg tgc cac ccg cgg agc ggc gcg tgc cgc tgt gag 590 Cys Gln His Gly Thr Cys His Pro Arg Ser Gly Ala Cys Arg Cys Glu 160 165 170 ccc ggc tgg tgg ggc gcg cag tgc gcc agc gcg tgc tac tgc agc gcc 638 Pro Gly Trp Trp Gly Ala Gln Cys Ala Ser Ala Cys Tyr Cys Ser Ala 175 180 185 acg tcg cgc tgc gac cca cag acc ggc gcc tgc ctg tgc cac gca ggc 686 Thr Ser Arg Cys Asp Pro Gln Thr Gly Ala Cys Leu Cys His Ala Gly 190 195 200 205 tgg tgg ggc cgc agc tgc aac aac cag tgc gcc tgc aac tcg tct ccc 734 Trp Trp Gly Arg Ser Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro 210 215 220 tgc gag cag cag agc ggc cgc tgt cag tgc cgc gag cgt acg ttc ggc 782 Cys Glu Gln Gln Ser Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly 225 230 235 gcg cgc tgc gat cgc tac tgc cag tgc ttc cgc ggc cgc tgc cac cct 830 Ala Arg Cys Asp Arg Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro 240 245 250 gtg gac ggc acg tgt gcc tgc gag ccg ggc tac cgc ggc aag tac tgt 878 Val Asp Gly Thr Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys 255 260 265 cgc gag ccg tgc ccc gcc ggc ttc tac ggc ttg ggc tgt cgc cgc cgg 926 Arg Glu Pro Cys Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg 270 275 280 285 tgt ggc cag tgc aag ggc cag cag ccg tgc acg gtg gcc gag ggc cgc 974 Cys Gly Gln Cys Lys Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg 290 295 300 tgc ttg acg tgc gag ccc ggc tgg aac gga acc aag tgc gac cag cct 1022 Cys Leu Thr Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro 305 310 315 tgc gcc acc ggt ttc tat ggc gag ggc tgc agc cac cgc tgt ccg cca 1070 Cys Ala Thr Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro 320 325 330 tgc cgc gac ggg cat gcc tgt aac cat gtc acc ggc aag tgt acg cgc 1118 Cys Arg Asp Gly His Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg 335 340 345 tgc aac gcg ggc tgg atc ggc gac cgg tgc gag acc aag tgt agc aat 1166 Cys Asn Ala Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn 350 355 360 365 ggc act tac ggc gag gac tgc gcc ttc gtg tgc gcc gac tgc ggc agc 1214 Gly Thr Tyr Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser 370 375 380 gga cac tgc gac ttc cag tcg ggg cgc tgc ctg tgc agc cct ggc gtc 1262 Gly His Cys Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val 385 390 395 cac ggg ccc cac tgt aac gtg acg tgc ccg ccc gga ctc cac ggc gcg 1310 His Gly Pro His Cys Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala 400 405 410 gac tgt gct cag gcc tgc agc tgc cac gag gac acg tgc gac ccg gtc 1358 Asp Cys Ala Gln Ala Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val 415 420 425 act ggt gcc tgc cac cta gaa acc aac cag cgc aag ggc gtg atg ggc 1406 Thr Gly Ala Cys His Leu Glu Thr Asn Gln Arg Lys Gly Val Met Gly 430 435 440 445 gcg ggc gcg ctg ctc gtc ctg ctc gtc tgc ctg ctg ctc tcg ctg ctc 1454 Ala Gly Ala Leu Leu Val Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu 450 455 460 ggc tgc tgc tgc gct tgc cgc ggc aag gac cct acg cgc cgg gag ctt 1502 Gly Cys Cys Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Glu Leu 465 470 475 tcg ctt ggg agg aag aag gcg ccg cac cga cta tgc ggg cgc ttc agt 1550 Ser Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg Phe Ser 480 485 490 cgc atc agc atg aag ctg ccc cgg atc ccg ctc cgg agg cag aaa cta 1598 Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Lys Leu 495 500 505 ccc aaa gtc gta gtg gcc cac cac gac ctg gat aac aca ctc aac tgc 1646 Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu Asn Cys 510 515 520 525 agc ttc ctg gag cca ccc tca ggg ctg gag cag ccc tca cca tcc tgg 1694 Ser Phe Leu Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro Ser Trp 530 535 540 tcc tct cgg gcc tcc ttc tcc tcg ttt gac acc act gat gaa ggc cct 1742 Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu Gly Pro 545 550 555 gtg tac tgt gta ccc cat gag gag gca cca gcg gag agc cgg gac ccc 1790 Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg Asp Pro 560 565 570 gaa gtc ccc act gtc cct gcc gag gcg ccg gcg ccg tcc cct gtg ccc 1838 Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro Val Pro 575 580 585 ttg acc acg cca gcc tcc gcc gag gag gcg ata ccc ctc ccc gcg tcc 1886 Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro Ala Ser 590 595 600 605 tcc gac agc gag cgg tcg gcg tcc agc gtg gag ggg ccc gga ggg gct 1934 Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly Gly Ala 610 615 620 ctg tac gcg cgc gtg gcc cga cgc gag gcc cgg ccg gcc cgg gcc cgg 1982 Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg Ala Arg 625 630 635 ggc gag att ggg ggc ctg tcg ctg tcg cca tcg ccc gag cgc agg aaa 2030 Gly Glu Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg Arg Lys 640 645 650 ccg ccg cca cct gac ccc gcc acc aag cct aag gtg tcc tgg atc cac 2078 Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp Ile His 655 660 665 ggc aag cac agc gcc gct gca gct ggc cgt gcg ccc tca cca ccg ccg 2126 Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro Pro Pro 670 675 680 685 cca ggc tcc gag gcc gcg ccc agc ccc agc aag agg aaa cgg acg ccc 2174 Pro Gly Ser Glu Ala Ala Pro Ser 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ggt gcc aac tgc gac acc aag tgc ccg 393 Arg Cys Arg His Gly Tyr Phe Gly Ala Asn Cys Asp Thr Lys Cys Pro 100 105 110 cgc cag ttc tgg ggc ccc gac tgc aag gag ctg tgt agc tgc cac cca 441 Arg Gln Phe Trp Gly Pro Asp Cys Lys Glu Leu Cys Ser Cys His Pro 115 120 125 130 cac ggg cag tgc gag gac gtg aca ggc cag tgt act tgt cac gcg cgg 489 His Gly Gln Cys Glu Asp Val Thr Gly Gln Cys Thr Cys His Ala Arg 135 140 145 cgc tgg ggc gcg cgc tgc gag cat gcg tgc cag tgc cag cac ggc acg 537 Arg Trp Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Cys Gln Cys Gln His Gly Thr 150 155 160 tgc cac ccg cgg agc ggc gcg tgc cgc tgt gag tcc ggc tgg tgg ggc 585 Cys His Pro Arg Ser Gly Ala Cys Arg Cys Glu Ser Gly Trp Trp Gly 165 170 175 gcg cag tgc gcc agc gcg tgc tac tgc agc gcc acg tcg cgc tgc gac 633 Ala Gln Cys Ala Ser Ala Cys Tyr Cys Ser Ala Thr Ser Arg Cys Asp 180 185 190 cca cag acc ggc gcc tgc ctg tgc cac gca ggc tgg tgg ggc cgc agc 681 Pro Gln Thr Gly Ala Cys Leu Cys His Ala Gly Trp Trp Gly Arg Ser 195 200 205 210 tgc aac aac cag tgc gcc tgc aac tcg tct ccc tgc gag cag cag agc 729 Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro Cys Glu Gln Gln Ser 215 220 225 ggc cgc tgt cag tgc cgc gag cgt acg ttc ggc gcg cgc tgc gat cgc 777 Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly Ala Arg Cys Asp Arg 230 235 240 tac tgc cag tgc ttc cgc ggc cgc tgc cac cct gtg gac ggc acg tgt 825 Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro Val Asp Gly Thr Cys 245 250 255 gcc tgc gag ccg ggc tac cgc ggc aag tac tgt cgc gag ccg tgc ccc 873 Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys Arg Glu Pro Cys Pro 260 265 270 gcc ggc ttc tac ggc ttg ggc tgt cgc cgc cgg tgt ggc cag tgc aag 921 Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg Cys Gly Gln Cys Lys 275 280 285 290 ggc cag cag ccg tgc acg gtg gcc gag ggc cgc tgc ttg acg tgc gag 969 Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg Cys Leu Thr Cys Glu 295 300 305 ccc ggc tgg aac gga acc aag tgc gac cag cct tgc gcc acc ggt ttc 1017 Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr Gly Phe 310 315 320 tat ggc gag ggc tgc agc cac cgc tgt ccg cca tgc cgc gac ggg cat 1065 Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp Gly His 325 330 335 gcc tgt aac cat gtc acc ggc aag tgt acg cgc tgc aac gcg ggc tgg 1113 Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg Cys Asn Ala Gly Trp 340 345 350 atc ggc gac cgg tgc gag acc aag tgt agc aat ggc act tac ggc gag 1161 Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr Gly Glu 355 360 365 370 gac tgc gcc ttc gtg tgc gcc gac tgc ggc agc gga cac tgc gac ttc 1209 Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser Gly His Cys Asp Phe 375 380 385 cag tcg ggg cgc tgc ctg tgc agc cct ggc gtc cac ggg ccc cac tgt 1257 Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro His Cys 390 395 400 aac gtg acg tgc ccg ccc gga ctc cac ggc gcg gac tgt gct cag gcc 1305 Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala Asp Cys Ala Gln Ala 405 410 415 tgc agc tgc cac gag gac acg tgc gac ccg gtc act ggt gcc tgc cac 1353 Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala 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Leu Glu Gln Pro Ser Pro Ser Trp 535 540 545 tcc tct cgg gcc tcc ttc tcc tcg ttt gac acc act gat gaa ggc cct 1737 Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu Gly Pro 550 555 560 gtg tac tgt gta ccc cat gag gag gca cca gcg gag agc cgg gac ccc 1785 Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg Asp Pro 565 570 575 gaa gtc ccc act gtc cct gcc gag gcg ccg gcg ccg tcc cct gtg ccc 1833 Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro Val Pro 580 585 590 ttg acc acg cca gcc tcc gcc gag gag gcg ata ccc ctc ccc gcg tcc 1881 Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro Ala Ser 595 600 605 610 tcc gac agc gag cgg tcg gcg tcc agc gtg gag ggg ccc gga ggg gct 1929 Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly Gly Ala 615 620 625 ctg tac gcg cgc gtg gcc cga cgc gag gcc cgg ccg gcc cgg gcc cgg 1977 Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg Ala Arg 630 635 640 ggc gag att ggg ggc ctg tcg ctg tcg cca tcg ccc gag cgc agg aaa 2025 Gly Glu Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg Arg Lys 645 650 655 ccg ccg cca cct gac ccc gcc acc aag cct aag gtg tcc tgg atc cac 2073 Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp Ile His 660 665 670 ggc aag cac agc gcc gct gca gct ggc cgt gcg ccc tca cca ccg ccg 2121 Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro Pro Pro 675 680 685 690 cca ggc tcc gag gcc gcg ccc agc ccc agc aag agg aaa cgg acg ccc 2169 Pro Gly Ser Glu Ala Ala Pro Ser Pro Ser Lys Arg Lys Arg Thr Pro 695 700 705 agc gac aaa tcg gcg cat acg gtc gaa cac ggc agc ccc cgg acc cgc 2217 Ser Asp Lys Ser Ala His Thr Val Glu His Gly Ser Pro Arg Thr Arg 710 715 720 gac cca acg ccg cgg ccc ccc ggg ctg ccc gag gag gcg aca gcc ctc 2265 Asp Pro Thr Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Glu Glu Ala Thr Ala Leu 725 730 735 gct gcg ccc tcg ccg ccc agg gcc cga gcg cgg ggc cgc ggc ccc ggc 2313 Ala Ala Pro Ser Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly Pro Gly 740 745 750 ctc ttg gag ccc acg gac gcc ggc ggt ccc ccg cga agc gcg ccc gag 2361 Leu Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro Arg Ser Ala Pro Glu 755 760 765 770 gct gcc tcc atg ttg gcc gct gag ctg cgc ggc aag act cgc agc ctg 2409 Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Gly Lys Thr Arg Ser Leu 775 780 785 ggc cgc gcc gag gtg gcc ctg ggc gcg cag ggc ccc agg gaa aag ccg 2457 Gly Arg Ala Glu Val Ala Leu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Glu Lys Pro 790 795 800 gcg ccc cca cag aaa gcc aag cgc tcc gtg ccg cca gcc tcg ccc gcc 2505 Ala Pro Pro Gln Lys Ala Lys Arg Ser Val Pro Pro Ala Ser Pro Ala 805 810 815 cgc gcg ccc cca gcg acc gaa acc ccg ggg cct gag aag gcg gcg acc 2553 Arg Ala Pro Pro Ala Thr Glu Thr Pro Gly Pro Glu Lys Ala Ala Thr 820 825 830 gac ttg ccc gcg cct gag acc ccc cgg aag aag acc ccc atc cag aag 2601 Asp Leu Pro Ala Pro Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile Gln Lys 835 840 845 850 ccg ccg cgc aag aag agc cgg gag gcg gcg ggc gag ctg ggc agg gcg 2649 Pro Pro Arg Lys Lys Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Leu Gly Arg Ala 855 860 865 ggc gca ccc acc ctg tagcaggctg tggctcgtcc gcgcgcagct ccctcagctt 2704 Gly Ala Pro Thr Leu 870 cgcagcgccg cccgccaccc cacacctccc acgctaccgg gcacgggcgg cctcctattg 2764 gccgggcacc gcgcggctag cggaggttgc gtctcattgg ctcaggtcct gcagccgctc 2824 ctggattgga gcagtgtgct ctggcgggaa gggcccatcc cgttggtcga ggcctgacag 2884 gcgcttagcg ggcgactccc tccccattgg ccgagttatg gagcgctccg accagacagc 2944 gtctcattgg ccaaagatgg gagggttccg cttaaagacc gcctcttact ggccaggagt 3004 ggacttggtt agggctacct tctcattggt tgcagccaga ggcacttctg cccgggctgc 3064 ctctcccccg ctagggcctg gtgcctctgg ctggaggctc cctcccttgg ccgtcccaat 3124 agagcccggg gctacttcca ctggccaggc tcccgggcat ctggttgacc ccagcctggg 3184 gaggagggct ggtctccgct cctcaggggc ttagtccgtc ccaccccttc ccttccctgg 3244 cgccccgggc ccaggcccct cagctgtcag ctggttttga tggcctccca ctgccccaca 3304 cgccgcggga cctccagggg cgactctagt ggcctgagga gatgtattta taggccccca 3364 gcagggctgc tcccccctcg gccggtgccc caggatgggc tcctcccggc gggggcttgg 3424 ccaaagcttt cttaataaaa tgcctttccc gtc 3457 <210> 26 <211> 871 <212> PRT <213> Homo 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Ser Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro Cys Glu Gln 210 215 220 Gln Ser Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly Ala Arg Cys 225 230 235 240 Asp Arg Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro Val Asp Gly 245 250 255 Thr Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys Arg Glu Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg Cys Gly Gln 275 280 285 Cys Lys Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg Cys Leu Thr 290 295 300 Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp 325 330 335 Gly His Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg Cys Asn Ala 340 345 350 Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr 355 360 365 Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser Gly His Cys 370 375 380 Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro 385 390 395 400 His Cys Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala Asp Cys Ala 405 410 415 Gln Ala Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala 420 425 430 Cys His Leu Glu Thr Asn Gln Arg Lys Gly Val Met Gly Ala Gly Ala 435 440 445 Leu Leu Val Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys 450 455 460 Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg 465 470 475 480 Glu Leu Ser Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg 485 490 495 Phe Ser Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln 500 505 510 Lys Leu Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu 515 520 525 Asn Cys Ser Phe Leu Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro 530 535 540 Ser Trp Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu 545 550 555 560 Gly Pro Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg 565 570 575 Asp Pro Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro 580 585 590 Val Pro Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro 595 600 605 Ala Ser Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly 610 615 620 Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg 625 630 635 640 Ala Arg Gly Glu Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg 645 650 655 Arg Lys Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp 660 665 670 Ile His Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro 675 680 685 Pro Pro Pro Gly Ser Glu Ala Ala Pro Ser Pro Ser Lys Arg Lys Arg 690 695 700 Thr Pro Ser Asp Lys Ser Ala His Thr Val Glu His Gly Ser Pro Arg 705 710 715 720 Thr Arg Asp Pro Thr Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Glu Glu Ala Thr 725 730 735 Ala Leu Ala Ala Pro Ser Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly 740 745 750 Pro Gly Leu Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro Arg Ser Ala 755 760 765 Pro Glu Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Gly Lys Thr Arg 770 775 780 Ser Leu Gly Arg Ala Glu Val Ala Leu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Glu 785 790 795 800 Lys Pro Ala Pro Pro Gln Lys Ala Lys Arg Ser Val Pro Pro Ala Ser 805 810 815 Pro Ala Arg Ala Pro Pro Ala Thr Glu Thr Pro Gly Pro Glu Lys Ala 820 825 830 Ala Thr Asp Leu Pro Ala Pro Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile 835 840 845 Gln Lys Pro Pro Arg Lys Lys Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Leu Gly 850 855 860 Arg Ala Gly Ala Pro Thr Leu 865 870
Ｔｒｐ Ｇｌｙ Ａｌａ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｓｅｒ １６０ １６５
１７０ １７５ ｇｃｔ ｔｇｃ ｔａｔ ｔｇｃ ａｇｃ ｇｃｔ ａｃｔ ｔｃｃ ｃｇｇ
ｔｇｃ ｇａｔ ｃｃａ ｃａｇ ａｃａ ｇｇｃ ｇｃｃ ６３７ Ａｌａ Ｃｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｓｅｒ Ａｌａ Ｔｈｒ Ｓｅｒ Ａｒｇ
Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｎ Ｔｈｒ Ｇｌｙ Ａｌａ １８０
１８５ １９０ ｔｇｃ ｃｔｇ ｔｇｃ ｃａｃ ｇｔａ ｇｇｃ ｔｇｇ ｔｇｇ ｇｇｃ
ｃｇｃ ａｇｃ ｔｇｔ ａａｃ ａａｃ ｃａｇ ｔｇｃ ６８５ Ｃｙｓ Ｌｅｕ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｖａｌ Ｇｌｙ Ｔｒｐ Ｔｒｐ Ｇｌｙ
Ａｒｇ Ｓｅｒ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ａｓｎ Ｇｌｎ Ｃｙｓ １９５ ２００
２０５ ｇｃｃ ｔｇｃ ａａｃ ｔｃｇ ｔｃｇ ｃｃｃ ｔｇｃ ｇａｇ ｃａｇ
ｃａｇ ａｇｔ ｇｇｃ ｃｇｃ ｔｇｃ ｃａｇ ｔｇｔ ７３３ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｎ Ｓｅｒ Ｓｅｒ Ｐｒｏ Ｃｙｓ Ｇｌｕ Ｇｌｎ
Ｇｌｎ Ｓｅｒ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ ２１０ ２１５
２２０ ｃｇｃ ｇａｇ ｃｇｃ ａｔｇ ｔｔｔ ｇｇｃ ｇｃｃ ｃｇｃ ｔｇｔ
ｇａｔ ｃｇｃ ｔａｔ ｔｇｃ ｃａｇ ｔｇｃ ｔｃｔ ７８１ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ａｒｇ Ｍｅｔ Ｐｈｅ Ｇｌｙ Ａｌａ Ａｒｇ Ｃｙｓ
Ａｓｐ Ａｒｇ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ｇｌｎ Ｃｙｓ Ｓｅｒ ２２５ ２３０
２３５ ｃａｃ ｇｇｔ ｃｇｃ ｔｇｃ ｃａｃ ｃｃｇ ｇｔｇ ｇａｃ ｇｇｃ
ａｃｇ ｔｇｔ ｇｃｃ ｔｇｃ ｇａｔ ｃｃｔ ｇｇｃ ８２９ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ａｒｇ Ｃｙｓ Ｈｉｓ Ｐｒｏ Ｖａｌ Ａｓｐ Ｇｌｙ
Ｔｈｒ Ｃｙｓ Ａｌａ Ｃｙｓ Ａｓｐ Ｐｒｏ Ｇｌｙ ２４０ ２４５
２５０ ２５５ ｔａｃ ｃｇｇ ｇｇｃ ａａｇ ｔａｔ ｔｇｔ ｃｇｃ ｇａｇ ｃｃａ
ｔｇｃ ｃｃｃ ｇｃｔ ｇｇａ ｔｔｃ ｔａｔ ｇｇｃ ８７７ Ｔｙｒ Ａｒｇ Ｇｌｙ Ｌｙｓ Ｔｙｒ Ｃｙｓ Ａｒｇ Ｇｌｕ Ｐｒｏ
Ｃｙｓ Ｐｒｏ Ａｌａ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｔｙｒ Ｇｌｙ ２６０
２６５ ２７０ ｃｃｇ ｇｇｃ ｔｇｔ ｃｇｃ ｃｇｔ ｃｇｇ ｔｇｔ ｇｇｃ ｃａａ
ｔｇｃ ａａａ ｇｇｃ ｃａｇ ｃａｇ ｃｃｇ ｔｇｃ ９２５ 275 280 285 acg gta gtc gaa ggc cgc tgt ctg aca tgc gag ccc ggc tgg aac gga 973 Thr Val Val Glu Gly Arg Cys Leu Thr Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly 290 295 300 acc aaa tgt gac caa ccc tgc gcc acc ggt ttc tac ggc gaa ggt tgt 1021 Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys 305 310 315 ggc cac cgc tgc cca ccc tgc cgc gac ggg cat gcc tgc aac cat gtc 1069 Gly His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp Gly His Ala Cys Asn His Val 320 325 330 335 acc ggc aag tgt acg cac tgc aat gcg ggc tgg atc ggc gac cgg tgc 1117 Thr Gly Lys Cys Thr His Cys Asn Ala Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys 340 345 350 gag act aag tgc agt aat ggc act tac ggt gag gac tgt gcc ttc gtg 1165 Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val 355 360 365 tgc tct gat tgc ggc agc ggc cac tgt gac ttc cag tcc ggg cgc tgc 1213 Cys Ser Asp Cys Gly Ser Gly His Cys Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys 370 375 380 ctt tgc agc cct ggt gtt cac gga cct cac tgt aat gta act tgc ccg 1261 Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro His Cys Asn Val Thr Cys Pro 385 390 395 gcc ggg ctc cac ggc gtg gac tgc gcc cag gcc tgc agc tgt cac gag 1309 Ala Gly Leu His Gly Val Asp Cys Ala Gln Ala Cys Ser Cys His Glu 400 405 410 415 gaa tca tgc gac ccg gtc acc ggt gcc tgc cac ctg gag acc aat cag 1357 Glu Ser Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala Cys His Leu Glu Thr Asn Gln 420 425 430 cgc aaa ggt gtg atg ggc gcg ggc gct ctg ctc acg ctg ctc ctc ggc 1405 Arg Lys Gly Val Met Gly Ala Gly Ala Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly 435 440 445 ctg ctg ctc tcg ctg ctc ggt tgt tgc tgc gcc tgc cgg ggc aag gac 1453 Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp 450 455 460 tcg gcg cgc cgg gag ctc acc ctt gga agg aag aag gcg cct caa cgt 1501 Ser Ala Arg Arg Glu Leu Thr Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro Gln Arg 465 470 475 ttt tgt gga agc ttc agc cgc atc agc atg aag ctg ccc cga atc ccg 1549 Phe Cys Gly Ser Phe Ser Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro 480 485 490 495 ctt cgc agg cag aag ctg ccc aaa gtc gta gtg gcc cat cat gac cta 1597 Leu Arg Arg Gln Lys Leu Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu 500 505 510 gac aac aca ctc aac tgc agt ttt ctg gac cca ccc tca ggg ctg gag 1645 Asp Asn Thr Leu Asn Cys Ser Phe Leu Asp Pro Pro Ser Gly Leu Glu 515 520 525 cag ccc tct cca tca tgg tcc tcc agg gcc tcc ttc tca tca ttc gac 1693 Gln Pro Ser Pro Ser Trp Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp 530 535 540 acc aca gat gaa ggc cct gtg tac tgt gtg ccc cac gag gaa gcg act 1741 Thr Thr Asp Glu Gly Pro Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Thr 545 550 555 gcc gac agc cga gac ctg gaa gcg act gcc gct ctc act gag gtg gcc 1789 Ala Asp Ser Arg Asp Leu Glu Ala Thr Ala Ala Leu Thr Glu Val Ala 560 565 570 575 gct gtg tcc tta gag ccc acg ggc acc tcg acg ccc ggg gag gag gca 1837 Ala Val Ser Leu Glu Pro Thr Gly Thr Ser Thr Pro Gly Glu Glu Ala 580 585 590 gcg gtc ctc cct gca tcc tca gac agc gag cgc tcc gca tca agc gtg 1885 Ala Val Leu Pro Ala Ser Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val 595 600 605 gag ggg ccg agc ggg gcg ctg tac gcg cgt gtg gcc cgg cgc gag gcc 1933 Glu Gly Pro Ser Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala 610 615 620 cgg ccg gcc cgg acc cga aat gag gct ggg ggc ttg tca ctg tcc cca 1981 Arg Pro Ala Arg Thr Arg Asn Glu Ala Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro 625 630 635 tcg ccc gag cgc agg aag ccg cca cca cca gac cct gcc acc aag cct 2029 Ser Pro Glu Arg Arg Lys Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro 640 645 650 655 aag gtg tcc tgg atc cac ggc aag cac agc gcc gct gcc gct gca ccg 2077 Lys Val Ser Trp Ile His Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Ala Pro 660 665 670 tcg cct ccg cct gca ggc cgc aag gct gcg ccg agc cct agc ggg agg 2125 Ser Pro Pro Pro Ala Gly Arg Lys Ala Ala Pro Ser Pro Ser Gly Arg 675 680 685 aaa cgg acc ccc agc aac tcg tcg gtg cag ccc ccc gga ctg acc gag 2173 Lys Arg Thr Pro Ser Asn Ser Ser Val Gln Pro Pro Gly Leu Thr Glu 690 695 700 gag gcc ccc ggc ccg gct tca ccc acg cca ccc cgc gcc cga gcg cgc 2221 Glu Ala Pro Gly Pro Ala Ser Pro Thr Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg 705 710 715 ggc cgc ggc ctg ggg ctc tcg gag cca acg gac gcg gga ggt ccc ccg 2269 Gly Arg Gly Leu Gly Leu Ser Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro 720 725 730 735 cgc agc gcg ccc gag gcc gcc tct atg ctg gca gct gag ctg cgc gac 2317 Arg Ser Ala Pro Glu Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Asp 740 745 750 aag act cgc agc tta ggc cgc gcc gag aag ccg ccg ccg ccg cag aag 2365 Lys Thr Arg Ser Leu Gly Arg Ala Glu Lys Pro Pro Pro Pro Gln Lys 755 760 765 gcc aag cgc tcc gtg ctc ccc gcc gcg acg gtc cgc aca gcc tcg gcg 2413 Ala Lys Arg Ser Val Leu Pro Ala Ala Thr Val Arg Thr Ala Ser Ala 770 775 780 tcc gag gcc tcg ggg tca gag aag gcg gcg gcc agc gca cct gcg ccc 2461 Ser Glu Ala Ser Gly Ser Glu Lys Ala Ala Ala Ser Ala Pro Ala Pro 785 790 795 gag acc cct cgg aag aaa acc ccc atc cag aaa ccg cct cgg aag aag 2509 Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile Gln Lys Pro Pro Arg Lys Lys 800 805 810 815 agc agg gag gca gcg ggg gag ccg agt agg gcg ggc acg gcc ccc gga 2557 Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Pro Ser Arg Ala Gly Thr Ala Pro Gly 820 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cag gaa 206 Leu Leu Leu Leu Leu Trp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Pro Gln Glu 30 35 40 45 ctg aac cct cgc ggc cgc aac gtg tgc cgt gct ccc ggc tcc cag gtg 254 Leu Asn Pro Arg Gly Arg Asn Val Cys Arg Ala Pro Gly Ser Gln Val 50 55 60 ccc acg tgc tgc gct ggc tgg agg cag caa ggg gac gag tgt ggg att 302 Pro Thr Cys Cys Ala Gly Trp Arg Gln Gln Gly Asp Glu Cys Gly Ile 65 70 75 gcg gtg tgc gaa ggc aac tcc acg tgc tca gag aac gag gtg tgc gtg 350 Ala Val Cys Glu Gly Asn Ser Thr Cys Ser Glu Asn Glu Val Cys Val 80 85 90 agg cct ggc gag tgc cgc tgc cgc cac ggc tac ttc ggt gcc aac tgc 398 Arg Pro Gly Glu Cys Arg Cys Arg His Gly Tyr Phe Gly Ala Asn Cys 95 100 105 gac acc aag tgc ccg cgc cag ttc tgg ggc ccc gac tgc aag gag ctg 446 Asp Thr Lys Cys Pro Arg Gln Phe Trp Gly Pro Asp Cys Lys Glu Leu 110 115 120 125 tgt agc tgc cac cca cac ggg cag tgc gag gac gtg aca ggc cag tgt 494 Cys Ser Cys His Pro His Gly Gln Cys Glu Asp Val Thr Gly Gln Cys 130 135 140 act tgt cac gcg cgg cgc tgg ggc gcg cgc tgc gag cat gcg tgc cag 542 Thr Cys His Ala Arg Arg Trp Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Cys Gln 145 150 155 tgc cag cac ggc acg tgc cac ccg cgg agc ggc gcg tgc cgc tgt gag 590 Cys Gln His Gly Thr Cys His Pro Arg Ser Gly Ala Cys Arg Cys Glu 160 165 170 ccc ggc tgg tgg ggc gcg cag tgc gcc agc gcg tgc tac tgc agc gcc 638 Pro Gly Trp Trp Gly Ala Gln Cys Ala Ser Ala Cys Tyr Cys Ser Ala 175 180 185 acg tcg cgc tgc gac cca cag acc ggc gcc tgc ctg tgc cac gca ggc 686 Thr Ser Arg Cys Asp Pro Gln Thr Gly Ala Cys Leu Cys His Ala Gly 190 195 200 205 tgg tgg ggc cgc agc tgc aac aac cag tgc gcc tgc aac tcg tct ccc 734 Trp Trp Gly Arg Ser Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro 210 215 220 tgc gag cag cag agc ggc cgc tgt cag tgc cgc gag cgt acg ttc ggc 782 Cys Glu Gln Gln Ser Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly 225 230 235 gcg cgc tgc gat cgc tac tgc cag tgc ttc cgc ggc cgc tgc cac cct 830 Ala Arg Cys Asp Arg Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro 240 245 250 gtg gac ggc acg tgt gcc tgc gag ccg ggc tac cgc ggc aag tac tgt 878 Val Asp Gly Thr Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys 255 260 265 cgc gag ccg tgc ccc gcc ggc ttc tac ggc ttg ggc tgt cgc cgc cgg 926 Arg Glu Pro Cys Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg 270 275 280 285 tgt ggc cag tgc aag ggc cag cag ccg tgc acg gtg gcc gag ggc cgc 974 Cys Gly Gln Cys Lys Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg 290 295 300 tgc ttg acg tgc gag ccc ggc tgg aac gga acc aag tgc gac cag cct 1022 Cys Leu Thr Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro 305 310 315 tgc gcc acc ggt ttc tat ggc gag ggc tgc agc cac cgc tgt ccg cca 1070 Cys Ala Thr Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro 320 325 330 tgc cgc gac ggg cat gcc tgt aac cat gtc acc ggc aag tgt acg cgc 1118 Cys Arg Asp Gly His Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg 335 340 345 tgc aac gcg ggc tgg atc ggc gac cgg tgc gag acc aag tgt agc aat 1166 Cys Asn Ala Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn 350 355 360 365 ggc act tac ggc gag gac tgc gcc ttc gtg tgc gcc gac tgc ggc agc 1214 Gly Thr Tyr Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser 370 375 380 gga cac tgc gac ttc cag tcg ggg cgc tgc ctg tgc agc cct ggc gtc 1262 Gly His Cys Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val 385 390 395 cac ggg ccc cac tgt aac gtg acg tgc ccg ccc gga ctc cac ggc gcg 1310 His Gly Pro His Cys Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala 400 405 410 gac tgt gct cag gcc tgc agc tgc cac gag gac acg tgc gac ccg gtc 1358 Asp Cys Ala Gln Ala Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val 415 420 425 act ggt gcc tgc cac cta gaa acc aac cag cgc aag ggc gtg atg ggc 1406 Thr Gly Ala Cys His Leu Glu Thr Asn Gln Arg Lys Gly Val Met Gly 430 435 440 445 gcg ggc gcg ctg ctc gtc ctg ctc gtc tgc ctg ctg ctc tcg ctg ctc 1454 Ala Gly Ala Leu Leu Val Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu 450 455 460 ggc tgc tgc tgc gct tgc cgc ggc aag gac cct acg cgc cgg gag ctt 1502 Gly Cys Cys Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Glu Leu 465 470 475 tcg ctt ggg agg aag aag gcg ccg cac cga cta tgc ggg cgc ttc agt 1550 Ser Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg Phe Ser 480 485 490 cgc atc agc atg aag ctg ccc cgg atc ccg ctc cgg agg cag aaa cta 1598 Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Lys Leu 495 500 505 ccc aaa gtc gta gtg gcc cac cac gac ctg gat aac aca ctc aac tgc 1646 Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu Asn Cys 510 515 520 525 agc ttc ctg gag cca ccc tca ggg ctg gag cag ccc tca cca tcc tgg 1694 Ser Phe Leu Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro Ser Trp 530 535 540 tcc tct cgg gcc tcc ttc tcc tcg ttt gac acc act gat gaa ggc cct 1742 Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu Gly Pro 545 550 555 gtg tac tgt gta ccc cat gag gag gca cca gcg gag agc cgg gac ccc 1790 Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg Asp Pro 560 565 570 gaa gtc ccc act gtc cct gcc gag gcg ccg gcg ccg tcc cct gtg ccc 1838 Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro 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Cys Cys 450 455 460 Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Glu Leu Ser Leu Gly 465 470 475 480 Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg Phe Ser Arg Ile Ser 485 490 495 Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Lys Leu Pro Lys Val 500 505 510 Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu Asn Cys Ser Phe Leu 515 520 525 Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro Ser Trp Ser Ser Arg 530 535 540 Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu Gly Pro Val Tyr Cys 545 550 555 560 Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg Asp Pro Glu Val Pro 565 570 575 Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro Val Pro Leu Thr Thr 580 585 590 Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro Ala Ser Ser Asp Ser 595 600 605 Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly Gly Ala Leu Tyr Ala 610 615 620 Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg Ala Arg Gly Glu Ile 625 630 635 640 Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg Arg Lys Pro Pro Pro 645 650 655 Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp Ile His Gly Lys His 660 665 670 Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro Pro Pro Pro Gly Ser 675 680 685 Glu Ala Ala Pro Ser Pro Ser Lys Arg Lys Arg Thr Pro Ser Asp Lys 690 695 700 Ser Ala His Thr Val Glu His Gly Ser Pro Arg Thr Arg Asp Pro Thr 705 710 715 720 Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Glu Glu Ala Thr Ala Leu Ala Ala Pro 725 730 735 Ser Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly Pro Gly Leu Leu Glu 740 745 750 Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro Arg Ser Ala Pro Glu Ala Ala Ser 755 760 765 Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Gly Lys Thr Arg Ser Leu Gly Arg Ala 770 775 780 Glu Val Ala Leu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Glu Lys Pro Ala Pro Pro 785 790 795 800 Gln Lys Ala Lys Arg Ser Val Pro Pro Ala Ser Pro Ala Arg Gly Pro 805 810 815 Pro Ala Thr Glu Thr Pro Gly Pro Glu Lys Ala Ala Thr Asp Leu Pro 820 825 830 Gly Pro Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile Gln Lys Pro Pro Arg 835 840 845 Lys Lys Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Leu Gly Arg Ala Gly Ala Pro 850 855 860 Thr Leu 865 <210> 25 <211> 3457 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (52)..(2664) <400> 25 cgctgcggcc gcacccgcgc ccgtgcccgc cccgcgcctg ccccgcgcct c atg gag 57 Met Glu 1 ggc gca ggg ccc cgg ggg gcc ggg ccg gcg cgg cgc cgg gga gcc ggg 105 Gly Ala Gly Pro Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Arg Arg Gly Ala Gly 5 10 15 ggg ccg ccg tca ccg ctg ctg ccg tcg ctg ctg ctg ctg ctg ctg ctc 153 Gly Pro Pro Ser Pro Leu Leu Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu Leu Leu 20 25 30 tgg atg ctg ccg gac acc gtg gcg cct cag gaa ctg aac cct cgc ggc 201 Trp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Pro Gln Glu Leu Asn Pro Arg Gly 35 40 45 50 cgc aac gtg tgc cgt gct ccc ggc tcc cag gtg ccc acg tgc tgc gct 249 Arg Asn Val Cys Arg Ala Pro Gly Ser Gln Val Pro Thr Cys Cys Ala 55 60 65 ggc tgg agg cag caa ggg gac gag tgt ggg att gcg gtg tgc gaa ggc 297 Gly Trp Arg Gln Gln Gly Asp Glu Cys Gly Ile Ala Val Cys Glu Gly 70 75 80 aac tcc acg tgc tca gag aac gag gtg tgc gtg agg cct ggc gag tgc 345 Asn Ser Thr Cys Ser Glu Asn Glu Val Cys Val Arg Pro Gly Glu Cys 85 90 95 cgc tgc cgc cac ggc tac ttc ggt gcc aac tgc gac acc aag tgc ccg 393 Arg Cys Arg His Gly Tyr Phe Gly Ala Asn Cys Asp Thr Lys Cys Pro 100 105 110 cgc cag ttc tgg ggc ccc gac tgc aag gag ctg tgt agc tgc cac cca 441 Arg Gln Phe Trp Gly Pro Asp Cys Lys Glu Leu Cys Ser Cys His Pro 115 120 125 130 cac ggg cag tgc gag gac gtg aca ggc cag tgt act tgt cac gcg cgg 489 His Gly Gln Cys Glu Asp Val Thr Gly Gln Cys Thr Cys His Ala Arg 135 140 145 cgc tgg ggc gcg cgc tgc gag cat gcg tgc cag tgc cag cac ggc acg 537 Arg Trp Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Cys Gln Cys Gln His Gly Thr 150 155 160 tgc cac ccg cgg agc ggc gcg tgc cgc tgt gag tcc ggc tgg tgg ggc 585 Cys His Pro Arg Ser Gly Ala Cys Arg Cys Glu Ser Gly Trp Trp Gly 165 170 175 gcg cag tgc gcc agc gcg tgc tac tgc agc gcc acg tcg cgc tgc gac 633 Ala Gln Cys Ala Ser Ala Cys Tyr Cys Ser Ala Thr Ser Arg Cys Asp 180 185 190 cca cag acc ggc gcc tgc ctg tgc cac gca ggc tgg tgg ggc cgc agc 681 Pro Gln Thr Gly Ala Cys Leu Cys His Ala Gly Trp Trp Gly Arg Ser 195 200 205 210 tgc aac aac cag tgc gcc tgc aac tcg tct ccc tgc gag cag cag agc 729 Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro Cys Glu Gln Gln Ser 215 220 225 ggc cgc tgt cag tgc cgc gag cgt acg ttc ggc gcg cgc tgc gat cgc 777 Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly Ala Arg Cys Asp Arg 230 235 240 tac tgc cag tgc ttc cgc ggc cgc tgc cac cct gtg gac ggc acg tgt 825 Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro Val Asp Gly Thr Cys 245 250 255 gcc tgc gag ccg ggc tac cgc ggc aag tac tgt cgc gag ccg tgc ccc 873 Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys Arg Glu Pro Cys Pro 260 265 270 gcc ggc ttc tac ggc ttg ggc tgt cgc cgc cgg tgt ggc cag tgc aag 921 Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg Cys Gly Gln Cys Lys 275 280 285 290 ggc cag cag ccg tgc acg gtg gcc gag ggc cgc tgc ttg acg tgc gag 969 Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg Cys Leu Thr Cys Glu 295 300 305 ccc ggc tgg aac gga acc aag tgc gac cag cct tgc gcc acc ggt ttc 1017 Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr Gly Phe 310 315 320 tat ggc gag ggc tgc agc cac cgc tgt ccg cca tgc cgc gac ggg cat 1065 Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp Gly His 325 330 335 gcc tgt aac cat gtc acc ggc aag tgt acg cgc tgc aac gcg ggc tgg 1113 Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg Cys Asn Ala Gly Trp 340 345 350 atc ggc gac cgg tgc gag acc aag tgt agc aat ggc act tac ggc gag 1161 Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr Gly Glu 355 360 365 370 gac tgc gcc ttc gtg tgc gcc gac tgc ggc agc gga cac tgc gac ttc 1209 Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser Gly His Cys Asp Phe 375 380 385 cag tcg ggg cgc tgc ctg tgc agc cct ggc gtc cac ggg ccc cac tgt 1257 Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro His Cys 390 395 400 aac gtg acg tgc ccg ccc gga ctc cac ggc gcg gac tgt gct cag gcc 1305 Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala Asp Cys Ala Gln Ala 405 410 415 tgc agc tgc cac gag gac acg tgc gac ccg gtc act ggt gcc tgc cac 1353 Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala Cys His 420 425 430 cta gaa acc aac cag cgc aag ggc gtg atg ggc gcg ggc gcg ctg ctc 1401 Leu Glu Thr Asn Gln Arg Lys Gly Val Met Gly Ala Gly Ala Leu Leu 435 440 445 450 gtc ctg ctc gtc tgc ctg ctg ctc tcg ctg ctc ggc tgc tgc tgc gct 1449 Val Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys Cys Ala 455 460 465 tgc cgc ggc aag gac cct acg cgc cga ccc cgc ccc cgc agg gag ctt 1497 Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg Glu Leu 470 475 480 tcg ctt ggg agg aag aag gcg ccg cac cga cta tgc ggg cgc ttc agt 1545 Ser Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg Phe Ser 485 490 495 cgc atc agc atg aag ctg ccc cgg atc ccg ctc cgg agg cag aaa cta 1593 Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln Lys Leu 500 505 510 ccc aaa gtc gta gtg gcc cac cac gac ctg gat aac aca ctc aac tgc 1641 Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu Asn Cys 515 520 525 530 agc ttc ctg gag cca ccc tca ggg ctg gag cag ccc tca cca tcc tgg 1689 Ser Phe Leu Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro Ser Trp 535 540 545 tcc tct cgg gcc tcc ttc tcc tcg ttt gac acc act gat gaa ggc cct 1737 Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu Gly Pro 550 555 560 gtg tac tgt gta ccc cat gag gag gca cca gcg gag agc cgg gac ccc 1785 Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg Asp Pro 565 570 575 gaa gtc ccc act gtc cct gcc gag gcg ccg gcg ccg tcc cct gtg ccc 1833 Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro Val Pro 580 585 590 ttg acc acg cca gcc tcc gcc gag gag gcg ata ccc ctc ccc gcg tcc 1881 Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro Ala Ser 595 600 605 610 tcc gac agc gag cgg tcg gcg tcc agc gtg gag ggg ccc gga ggg gct 1929 Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly Gly Ala 615 620 625 ctg tac gcg cgc gtg gcc cga cgc gag gcc cgg ccg gcc cgg gcc cgg 1977 Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg Ala Arg 630 635 640 ggc gag att ggg ggc ctg tcg ctg tcg cca tcg ccc gag cgc agg aaa 2025 Gly Glu Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg Arg Lys 645 650 655 ccg ccg cca cct gac ccc gcc acc aag cct aag gtg tcc tgg atc cac 2073 Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp Ile His 660 665 670 ggc aag cac agc gcc gct gca gct ggc cgt gcg ccc tca cca ccg ccg 2121 Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro Pro Pro 675 680 685 690 cca ggc tcc gag gcc gcg ccc agc ccc agc aag agg aaa cgg acg ccc 2169 Pro Gly Ser Glu Ala Ala Pro Ser Pro Ser Lys Arg Lys Arg Thr Pro 695 700 705 agc gac aaa tcg gcg cat acg gtc gaa cac ggc agc ccc cgg acc cgc 2217 Ser Asp Lys Ser Ala His Thr Val Glu His Gly Ser Pro Arg Thr Arg 710 715 720 gac cca acg ccg cgg ccc ccc ggg ctg ccc gag gag gcg aca gcc ctc 2265 Asp Pro Thr Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Glu Glu Ala Thr Ala Leu 725 730 735 gct gcg ccc tcg ccg ccc agg gcc cga gcg cgg ggc cgc ggc ccc ggc 2313 Ala Ala Pro Ser Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly Pro Gly 740 745 750 ctc ttg gag ccc acg gac gcc ggc ggt ccc ccg cga agc gcg ccc gag 2361 Leu Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro Arg Ser Ala Pro Glu 755 760 765 770 gct gcc tcc atg ttg gcc gct gag ctg cgc ggc aag act cgc agc ctg 2409 Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Gly Lys Thr Arg Ser Leu 775 780 785 ggc cgc gcc gag gtg gcc ctg ggc gcg cag ggc ccc agg gaa aag ccg 2457 Gly Arg Ala Glu Val Ala Leu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Glu Lys Pro 790 795 800 gcg ccc cca cag aaa gcc aag cgc tcc gtg ccg cca gcc tcg ccc gcc 2505 Ala Pro Pro Gln Lys Ala Lys Arg Ser Val Pro Pro Ala Ser Pro Ala 805 810 815 cgc gcg ccc cca gcg acc gaa acc ccg ggg cct gag aag gcg gcg acc 2553 Arg Ala Pro Pro Ala Thr Glu Thr Pro Gly Pro Glu Lys Ala Ala Thr 820 825 830 gac ttg ccc gcg cct gag acc ccc cgg aag aag acc ccc atc cag aag 2601 Asp Leu Pro Ala Pro Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile Gln Lys 835 840 845 850 ccg ccg cgc aag aag agc cgg gag gcg gcg ggc gag ctg ggc agg gcg 2649 Pro Pro Arg Lys Lys Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Leu Gly Arg Ala 855 860 865 ggc gca ccc acc ctg tagcaggctg tggctcgtcc gcgcgcagct ccctcagctt 2704 Gly Ala Pro Thr Leu 870 cgcagcgccg cccgccaccc cacacctccc acgctaccgg gcacgggcgg cctcctattg 2764 gccgggcacc gcgcggctag cggaggttgc gtctcattgg ctcaggtcct gcagccgctc 2824 ctggattgga gcagtgtgct ctggcgggaa gggcccatcc cgttggtcga ggcctgacag 2884 gcgcttagcg ggcgactccc tccccattgg ccgagttatg gagcgctccg accagacagc 2944 gtctcattgg ccaaagatgg gagggttccg cttaaagacc gcctcttact ggccaggagt 3004 ggacttggtt agggctacct tctcattggt tgcagccaga ggcacttctg cccgggctgc 3064 ctctcccccg ctagggcctg gtgcctctgg ctggaggctc cctcccttgg ccgtcccaat 3124 agagcccggg gctacttcca ctggccaggc tcccgggcat ctggttgacc ccagcctggg 3184 gaggagggct ggtctccgct cctcaggggc ttagtccgtc ccaccccttc ccttccctgg 3244 cgccccgggc ccaggcccct cagctgtcag ctggttttga tggcctccca ctgccccaca 3304 cgccgcggga cctccagggg cgactctagt ggcctgagga gatgtattta taggccccca 3364 gcagggctgc tcccccctcg gccggtgccc caggatgggc tcctcccggc gggggcttgg 3424 ccaaagcttt cttaataaaa tgcctttccc gtc 3457 <210> 26 <211> 871 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Met Glu Gly Ala Gly Pro Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Arg Arg Gly 1 5 10 15 Ala Gly Gly Pro Pro Ser Pro Leu Leu Pro Ser Leu Leu Leu Leu Leu 20 25 30 Leu Leu Trp Met Leu Pro Asp Thr Val Ala Pro Gln Glu Leu Asn Pro 35 40 45 Arg Gly Arg Asn Val Cys Arg Ala Pro Gly Ser Gln Val Pro Thr Cys 50 55 60 Cys Ala Gly Trp Arg Gln Gln Gly Asp Glu Cys Gly Ile Ala Val Cys 65 70 75 80 Glu Gly Asn Ser Thr Cys Ser Glu Asn Glu Val Cys Val Arg Pro Gly 85 90 95 Glu Cys Arg Cys Arg His Gly Tyr Phe Gly Ala Asn Cys Asp Thr Lys 100 105 110 Cys Pro Arg Gln Phe Trp Gly Pro Asp Cys Lys Glu Leu Cys Ser Cys 115 120 125 His Pro His Gly Gln Cys Glu Asp Val Thr Gly Gln Cys Thr Cys His 130 135 140 Ala Arg Arg Trp Gly Ala Arg Cys Glu His Ala Cys Gln Cys Gln His 145 150 155 160 Gly Thr Cys His Pro Arg Ser Gly Ala Cys Arg Cys Glu Ser Gly Trp 165 170 175 Trp Gly Ala Gln Cys Ala Ser Ala Cys Tyr Cys Ser Ala Thr Ser Arg 180 185 190 Cys Asp Pro Gln Thr Gly Ala Cys Leu Cys His Ala Gly Trp Trp Gly 195 200 205 Arg Ser Cys Asn Asn Gln Cys Ala Cys Asn Ser Ser Pro Cys Glu Gln 210 215 220 Gln Ser Gly Arg Cys Gln Cys Arg Glu Arg Thr Phe Gly Ala Arg Cys 225 230 235 240 Asp Arg Tyr Cys Gln Cys Phe Arg Gly Arg Cys His Pro Val Asp Gly 245 250 255 Thr Cys Ala Cys Glu Pro Gly Tyr Arg Gly Lys Tyr Cys Arg Glu Pro 260 265 270 Cys Pro Ala Gly Phe Tyr Gly Leu Gly Cys Arg Arg Arg Cys Gly Gln 275 280 285 Cys Lys Gly Gln Gln Pro Cys Thr Val Ala Glu Gly Arg Cys Leu Thr 290 295 300 Cys Glu Pro Gly Trp Asn Gly Thr Lys Cys Asp Gln Pro Cys Ala Thr 305 310 315 320 Gly Phe Tyr Gly Glu Gly Cys Ser His Arg Cys Pro Pro Cys Arg Asp 325 330 335 Gly His Ala Cys Asn His Val Thr Gly Lys Cys Thr Arg Cys Asn Ala 340 345 350 Gly Trp Ile Gly Asp Arg Cys Glu Thr Lys Cys Ser Asn Gly Thr Tyr 355 360 365 Gly Glu Asp Cys Ala Phe Val Cys Ala Asp Cys Gly Ser Gly His Cys 370 375 380 Asp Phe Gln Ser Gly Arg Cys Leu Cys Ser Pro Gly Val His Gly Pro 385 390 395 400 His Cys Asn Val Thr Cys Pro Pro Gly Leu His Gly Ala Asp Cys Ala 405 410 415 Gln Ala Cys Ser Cys His Glu Asp Thr Cys Asp Pro Val Thr Gly Ala 420 425 430 Cys His Leu Glu Thr Asn Gln Arg Lys Gly Val Met Gly Ala Gly Ala 435 440 445 Leu Leu Val Leu Leu Val Cys Leu Leu Leu Ser Leu Leu Gly Cys Cys 450 455 460 Cys Ala Cys Arg Gly Lys Asp Pro Thr Arg Arg Pro Arg Pro Arg Arg 465 470 475 480 Glu Leu Ser Leu Gly Arg Lys Lys Ala Pro His Arg Leu Cys Gly Arg 485 490 495 Phe Ser Arg Ile Ser Met Lys Leu Pro Arg Ile Pro Leu Arg Arg Gln 500 505 510 Lys Leu Pro Lys Val Val Val Ala His His Asp Leu Asp Asn Thr Leu 515 520 525 Asn Cys Ser Phe Leu Glu Pro Pro Ser Gly Leu Glu Gln Pro Ser Pro 530 535 540 Ser Trp Ser Ser Arg Ala Ser Phe Ser Ser Phe Asp Thr Thr Asp Glu 545 550 555 560 Gly Pro Val Tyr Cys Val Pro His Glu Glu Ala Pro Ala Glu Ser Arg 565 570 575 Asp Pro Glu Val Pro Thr Val Pro Ala Glu Ala Pro Ala Pro Ser Pro 580 585 590 Val Pro Leu Thr Thr Pro Ala Ser Ala Glu Glu Ala Ile Pro Leu Pro 595 600 605 Ala Ser Ser Asp Ser Glu Arg Ser Ala Ser Ser Val Glu Gly Pro Gly 610 615 620 Gly Ala Leu Tyr Ala Arg Val Ala Arg Arg Glu Ala Arg Pro Ala Arg 625 630 635 640 Ala Arg Gly Glu Ile Gly Gly Leu Ser Leu Ser Pro Ser Pro Glu Arg 645 650 655 Arg Lys Pro Pro Pro Pro Asp Pro Ala Thr Lys Pro Lys Val Ser Trp 660 665 670 Ile His Gly Lys His Ser Ala Ala Ala Ala Gly Arg Ala Pro Ser Pro 675 680 685 Pro Pro Pro Gly Ser Glu Ala Ala Pro Ser Pro Ser Lys Arg Lys Arg 690 695 700 Thr Pro Ser Asp Lys Ser Ala His Thr Val Glu His Gly Ser Pro Arg 705 710 715 720 Thr Arg Asp Pro Thr Pro Arg Pro Pro Gly Leu Pro Glu Glu Ala Thr 725 730 735 Ala Leu Ala Ala Pro Ser Pro Pro Arg Ala Arg Ala Arg Gly Arg Gly 740 745 750 Pro Gly Leu Leu Glu Pro Thr Asp Ala Gly Gly Pro Pro Arg Ser Ala 755 760 765 Pro Glu Ala Ala Ser Met Leu Ala Ala Glu Leu Arg Gly Lys Thr Arg 770 775 780 Ser Leu Gly Arg Ala Glu Val Ala Leu Gly Ala Gln Gly Pro Arg Glu 785 790 795 800 Lys Pro Ala Pro Pro Gln Lys Ala Lys Arg Ser Val Pro Pro Ala Ser 805 810 815 Pro Ala Arg Ala Pro Pro Ala Thr Glu Thr Pro Gly Pro Glu Lys Ala 820 825 830 Ala Thr Asp Leu Pro Ala Pro Glu Thr Pro Arg Lys Lys Thr Pro Ile 835 840 845 Gln Lys Pro Pro Arg Lys Lys Ser Arg Glu Ala Ala Gly Glu Leu Gly 850 855 860 Arg Ala Gly Ala Pro Thr Leu 865 870
【図１】 ヒトナース細胞レセプターcDNA（hB6TNC#10 c
DNA）の塩基配列およびアミノ酸を示す図である。
DNA）の塩基配列およびアミノ酸を示す図である。
【図２】図２は、図１の続きを示す図である。
【図３】 ヒトナース細胞レセプター（hB6TNC#10）のア
ミノ酸配列とマウスナース細胞レセプター（mB6TNC#1
0）のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
ミノ酸配列とマウスナース細胞レセプター（mB6TNC#1
0）のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図４】 ヒトナース細胞レセプター（hB6TNC#10）のア
ミノ酸配列とヒトアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）
のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
ミノ酸配列とヒトアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）
のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図５】ヒトナース細胞レセプター（hB6TNC#10）とヒ
トアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）で保存されてい
る１０個のシステイン残基とグリシン残基の繰り返し配
列を示す図である。
トアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）で保存されてい
る１０個のシステイン残基とグリシン残基の繰り返し配
列を示す図である。
【図６】ヒトナース細胞レセプター（hB6TNC#10）とヒ
トアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）で保存されてい
るEGF様リピートを示す図である。
トアセチルLDLレセプター（hAc-LDLR）で保存されてい
るEGF様リピートを示す図である。
【図７】ヒトナース細胞レセプターのアミノ酸配列中
の、疎水性アミノ酸部位、EGF様リピート部位、SH２ド
メインを持つタンパク質の結合部位、SH３ドメインを持
つタンパク質の結合部位を示す図である。
の、疎水性アミノ酸部位、EGF様リピート部位、SH２ド
メインを持つタンパク質の結合部位、SH３ドメインを持
つタンパク質の結合部位を示す図である。
【図８】PCRで同定した遺伝子（ヒトB6TNC#10）と新た
に単離した2種類の遺伝子（ヒトB6TNC#10a及びヒトB6TN
C#10b）のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
に単離した2種類の遺伝子（ヒトB6TNC#10a及びヒトB6TN
C#10b）のアミノ酸配列の相同性を示す図である。
【図９】図９は、図８の続きを示す図である。
【図１０】 ヒトB6TNC#10のアセチルLDL取込み機能を示
す図である。
す図である。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｎ 1/19 1/21 1/21 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:19）
Claims (20)
- 【請求項１】配列番号２１の１位のMetから８６６位のL
euまでのアミノ酸配列を含むポリペプチド。 - 【請求項２】請求項１に記載のアミノ酸配列において１
もしくは数個のアミノ酸が置換、欠失、挿入または付加
されたアミノ酸配列を含み、かつヒトナース細胞レセプ
ターであるポリペプチド。 - 【請求項３】請求項１記載のポリペプチドからなるヒト
ナース細胞レセプター。 - 【請求項４】請求項１または２に記載のポリペプチドを
コードするDNA。 - 【請求項５】配列番号２０の７２位のAから２６６９位
のGまでの塩基配列を含む請求項４記載のDNA。 - 【請求項６】請求項４または５に記載のDNAとストリン
ジェントな条件でハイブリダイズし、かつヒトナース細
胞レセプターであるポリペプチドをコードするDNA。 - 【請求項７】請求項４、５または６のいずれかに記載の
DNAからなるヒトナース細胞レセプター遺伝子。 - 【請求項８】配列番号２０に記載の塩基配列中の連続し
た少なくとも１４個の塩基を含み、該塩基配列と特異的
に結合するDNA。 - 【請求項９】配列番号１３から１９のいずれかに記載の
塩基配列中の連続した少なくとも１４個の塩基を含む請
求項８に記載のDNA。 - 【請求項１０】請求項１または２に記載のポリペプチド
を特異的に認識する抗体。 - 【請求項１１】モノクローナル抗体である、請求項１０
に記載の抗体。 - 【請求項１２】請求項１１に記載のモノクローナル抗体
を産生するハイブリドーマ。 - 【請求項１３】請求項４から６のいずれかに記載のDNA
を有する発現ベクター。 - 【請求項１４】請求項１３記載の発現ベクターを宿主に
導入して得られる形質転換体。 - 【請求項１５】請求項１４に記載の形質転換体を培養す
る工程、および生産された組換えタンパク質を培養培地
から回収する工程を包含する、組換えヒトナース細胞レ
セプターの製造方法。 - 【請求項１６】請求項１４記載の形質転換体または請求
項１５に記載の製造方法より得られたヒトナース細胞レ
セプターを用いた、ヒトナース細胞レセプターに特異的
に結合するリガンドのスクリーニング方法。 - 【請求項１７】請求項１４記載の形質転換体または請求
項１５に記載の製造方法より得られたヒトナース細胞レ
セプターと請求項１６に記載のスクリーニング方法より
得られるリガンドとの結合を阻害する化合物のスクリー
ニング方法。 - 【請求項１８】請求項１７に記載のスクリーニング方法
より得られる医薬。 - 【請求項１９】請求項８または９に記載のDNAを含む、
ディジョージ症候群を検出するためのキット。 - 【請求項２０】請求項８または９に記載のDNAを含む、
自己免疫疾患を検出するためのキット。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000045321A JP2000308492A (ja) | 1999-02-24 | 2000-02-23 | ヒトナース細胞レセプター遺伝子 |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP11-46604 | 1999-02-24 | ||
| JP4660499 | 1999-02-24 | ||
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