JP2000319238A - 被酸化性発色試薬用色原体、及びこれを用いる測定方法並びに測定試薬 - Google Patents

被酸化性発色試薬用色原体、及びこれを用いる測定方法並びに測定試薬

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Nobuo Hisae
信雄 久江
Hisashi Ashida
久 芦田
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Shino Test Corp
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Abstract

(57)【要約】 【目的】生成する色素の呈色が極めて安定であり、生体
試料中にビリルビン、ヘモグロビン、及びアスコルビン
酸等の共存物質が含まれることにより生じる測定値への
誤差の発生を抑制することができ、更に、アジ化物等の
近傍の試薬に含まれる成分が試薬に溶け込むことによる
試薬の劣化及び機能の低下を防ぐことがでる、被酸化性
発色試薬用色原体、及びこれを用いる測定方法並びに測
定試薬を提供する。 【構成】下記の化学式（１） 【化１】 （式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ
２は水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、
Ｒ３は、カルボキシル基で置換された炭素数１〜３のア
ルキル基を示す。）で示される、３−アルコキシアニリ
ン誘導体又はその塩。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、新規な３−アルコ
キシアニリン誘導体又はその塩、及びこれを色原体とし
て用いる、酸化性物質又はペルオキシダーゼ様物質の測
定方法及び測定試薬に関する。本発明は、特に、化学、
生命科学、及び臨床検査等の分野において有用なもので
ある。
【０００２】
【従来の技術】血液、尿などの生体試料中に含まれる生
体成分を測定することは、疾病の診断において大変有用
なものであり、臨床検査においては酵素学的測定法が普
及し、様々な測定方法が開発されている。このような方
法としては、例えば、酸化酵素を用いて、生体成分から
直接又は間接的に酸化性物質である過酸化水素を生成さ
せ、これをペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混
合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸
化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定すること
により生成した過酸化水素の測定を行い、これにより生
体試料中に含まれる生体成分を測定する方法を挙げるこ
とができる。例えば、尿酸、ブドウ糖、及びコレステロ
ール等の測定に、それぞれウリカーゼ、グルコースオキ
シダーゼ、及びコレステロールオキシダーゼ等の酸化酵
素を働かせて過酸化水素を生成させ、この生成した過酸
化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発色試薬と混
合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応により被酸
化性発色試薬から生成した色素を光学的に測定すること
により測定し、これより各生体成分を正確に測定するこ
とができる。
【０００３】従来、この方法に用いられる被酸化性発色
試薬としては、主に４−アミノアンチピリン等のカップ
ラーと、その縮合対象物として、フェノール又はその誘
導体、あるいはアニリン誘導体等の色原体とを組み合わ
せたものが用いられてきた。しかしながら、これらの被
酸化性発色試薬は、発色後の退色が大きいため呈色の安
定性が悪く、生体試料中のビリルビンやヘモグロビン、
アスコルビン酸等の共存物質の影響を受け、測定誤差を
生じやすいこと、感度が小さく微量成分の測定に不十分
なこと等の欠点を有しているため、より優れた色原体が
求められていた。
【０００４】そこで、特公昭５７−２７１０６号公報、
特公昭５８−９０９４号公報、及び特公平２−１５１９
８号公報にはこれらの問題点を解決すべく、種々のアニ
リン誘導体が色原体として提案されている。しかしなが
ら、これらのアニリン誘導体を色原体に用いた被酸化性
発色試薬は、生成する色素の水溶性は良好であり発色感
度は高いものの、生成する色素の退色が大きいため呈色
の安定性が不十分であったり、生体試料中のビリルビン
やヘモグロビン、アスコルビン酸等の共存物質の影響を
受けやすく、正確な測定をするには必ずしも満足のゆく
ものではない。
【０００５】また、特開平４−２０２１６４号公報や特
開平５−２６２７１６号公報にはアニリン誘導体にフル
オロ基を導入したｐ−フルオロアニリン誘導体が色原体
として提案されている。しかしながら、ｐ−フルオロア
ニリン誘導体の合成は一般的でなく非常に煩雑でありし
かも高価につくことが難点である。
【０００６】更に、最近、これらの色原体を使用する被
酸化性発色試薬を用いて、生体試料を測定する場合に、
他の試薬に防腐剤として含有させたアジ化ナトリウムが
アジ化水素として気化し、その近傍の色原体を含有する
被酸化性発色試薬に溶け込み、目的とする生体成分が存
在しないにもかかわらず、色原体であるＮ−（２−ヒド
ロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−ジメトキシア
ニリンナトリウム（略名：ＨＤＡＯＳ）、Ｎ−スルホプ
ロピル−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＨＤＡＰ
Ｓ）、Ｎ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スルホ
プロピル）−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＤＡ
ＯＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ−スルホプロピル−３，５−ジ
メトキシアニリン（略名：ＤＡＰＳ）、Ｎ−エチル−Ｎ
−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）−３，５−
ジメトキシ−４−フルオロアニリン、Ｎ−エチル−Ｎ−
スルホプロピル−３，５−ジメトキシ−４−フルオロア
ニリン、又はＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチ
ル−３，５−ジメトキシアニリン（略名：ＣＥＤＢ）等
の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させてしま
い、測定に用いることが出来なくなることが知られてい
る。
【０００７】また、自動分析装置においては、アジ化物
等の試薬に含まれる成分が自動分析装置等の試薬プロー
ブ（試薬採取ノズル）に付着することにより、この試薬
プローブが次の試薬を採取した際に、試薬プローブに付
着したアジ化物等がその試薬に混入し、色原体である前
記等の電子供与基を有するアニリン誘導体を発色させて
しまい、測定に用いることが出来なくなることが知られ
ている。
【０００８】
【発明が解決しようとする課題】本発明は、前記の従来
技術における問題点に鑑み、生成する色素の呈色の安定
性が十分であり、かつ生体試料中のビリルビン、ヘモグ
ロビン、及びアスコルビン酸等の共存物質により生じる
測定値への誤差の発生を抑制でき、更にアジ化物等の近
傍の試薬に含まれる成分が試薬に溶け込むことによる試
薬の劣化、及び機能の低下を防ぐことができる被酸化性
発色試薬用色原体、及びこれを用いる測定方法並びに測
定試薬の提供を目的とする。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、前記目的
を達成するために、鋭意検討を行った結果、下記の化学
式（１）で表わされる３−アルコキシアニリン誘導体又
はその塩を色原体として使用し、カップラーと組み合わ
せて用いた場合、生成する色素の呈色は極めて安定で、
かつ生体試料中にビリルビン、ヘモグロビン、及びアス
コルビン酸等の共存物質が含まれることにより生じる測
定値への誤差の発生を抑制することができ、更にアジ化
物等の近傍の試薬に含まれる成分が試薬に溶け込むこと
による試薬の劣化及び機能の低下を防ぐことができ、酸
化性物質又はペルオキシダーゼ様物質を正確に測定する
ことができることを確認して、本発明を完成するに至っ
た。
【００１０】従って、本発明は、下記の化学式（１）
【化２】 （式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ
２は水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、
Ｒ３はカルボキシル基で置換された炭素数１〜３のアル
キル基を示す。）で示される、３−アルコキシアニリン
誘導体又はその塩である。
【００１１】また、本発明は、前記の３−アルコキシア
ニリン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラー
を被酸化性発色試薬として用いることを特徴とする酸化
性物質の測定方法である。
【００１２】更に、本発明は、前記の３−アルコキシア
ニリン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラー
を被酸化性発色試薬として用いることを特徴とするペル
オキシダーゼ様物質の測定方法である。また、本発明の
測定方法においては、カップラーが４−アミノアンチピ
リンであることが好適である。
【００１３】また、本発明は、前記の３−アルコキシア
ニリン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラー
を被酸化性発色試薬として含有することを特徴とする酸
化性物質の測定試薬である。
【００１４】更に、本発明は、前記の３−アルコキシア
ニリン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラー
を被酸化性発色試薬として含有することを特徴とするペ
ルオキシダーゼ様物質の測定試薬である。
【００１５】また、本発明の測定試薬においては、カッ
プラーが４−アミノアンチピリンであることが好適であ
る。
【００１６】
【発明の実施の形態】本発明において、化学式（１）で
示される３−アルコキシアニリン誘導体又はその塩にお
いて、Ｒ１としては、例えば、メトキシ基、エトキシ
基、プロポキシ基等の炭素数１〜３のアルコキシ基が挙
げられる。ここで、このアルコキシ基は、直鎖でも分枝
鎖の何れでもよい。Ｒ２としては、水素原子、又は例え
ば、メチル基、エチル基、プロピル基等の炭素数１〜３
のアルキル基が挙げられる。ここで、このアルキル基
は、直鎖でも分枝鎖の何れでもよい。Ｒ３としては、例
えば、カルボキシメチル基、カルボキシエチル基、カル
ボキシプロピル基等の炭素数１〜３のカルボキシル基で
置換されたアルキル基が挙げられる。ここで、炭素数１
〜３のカルボキシル基で置換されたアルキル基は、直鎖
でも分枝鎖の何れでもよく、カルボキシル基の置換位置
も特に限定されない。
【００１７】より具体的には、Ｒ１としてはＯＣＨ３、
ＯＣ２Ｈ５又はＯＣ３Ｈ７が挙げられ、Ｒ２としては
Ｈ、ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ３、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ３又はＣ
Ｈ（ＣＨ３）２が挙げられ、Ｒ３としてはＣＨ２ＣＯＯ
Ｈ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯＨ、ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２ＣＯＯ
Ｈ、ＣＨ（ＣＨ３）ＣＨ２ＣＯＯＨ又はＣＨ２ＣＨ（Ｃ
Ｈ３）ＣＯＯＨが挙げられる。
【００１８】また、化学式（１）で示される３−アルコ
キシアニリン誘導体の塩としては、例えば、ナトリウム
塩、カリウム塩、若しくはカルシウム塩等の金属塩、ア
ンモニウム塩、又はトリエチルアミン塩等を挙げること
ができる。
【００１９】本発明における、化学式（１）で示される
３−アルコキシアニリン誘導体は、例えば、以下のよう
にして合成することができる。すなわち、化学式（２）
（式中、Ｒ１は前記に同じ。）で示される化合物１モル
に対して１〜３モルの化学式（３）（式中、Ｘはハロゲ
ン原子を示す。Ｒ２は前記に同じ。）で示される化合物
を、メタノール、エタノール、又はイソプロパノールな
どのアルコール類、又は１，４−ジオキサン、テトラヒ
ドロフラン（ＴＨＦ）などの環状エーテル類等の溶媒中
で、１０〜１００℃で１〜５０時間反応させる。
【化３】
【化４】 次に、常法により精製を行い、化学式（４）（式中、Ｒ
１及びＲ２は前記に同じ。）で示される化合物を得る。
【化５】
【００２０】次に、前記化学式（４）で示される化合物
１モルに対して１〜３モルの化学式（５）（式中、Ｒ４
及びＲ５は各々水素原子又はアルキル基を、Ｒ６はアル
キル基を示す。）で示される化合物を、メタノール、エ
タノール、又はイソプロパノールなどのアルコール類、
或いは１，４−ジオキサン、テトラヒドロフラン（ＴＨ
Ｆ）などの環状エーテル類等に水を混ぜたものに溶解す
る。
【化６】 これに前記化学式（４）で示される化合物１当量に対し
て１〜３当量の、例えば水酸化ナトリウム、水酸化カリ
ウムなどのアルカリ金属水酸化物、又は例えば炭酸ナト
リウム、炭酸カリウムなどのアルカリ金属炭酸塩を添加
し、１０〜１００℃で１〜５０時間反応させた後、常法
により精製を行い、化学式（６）（式中、Ｒ１、Ｒ２、
Ｒ４、Ｒ５及びＲ６は前記に同じ。）で示される化合物
を得る。
【化７】
【００２１】次に、化学式（６）で示される化合物１モ
ルに対して１〜５モルの水酸化ナトリウム水溶液を加
え、室温で１〜１０時間反応させた後、塩酸を添加して
酸性にし、常法により精製することにより、本発明の３
−アルコキシアニリン誘導体又はその塩が得られる。
【００２２】なお、化学式（１）のＲ２が水素原子であ
る化合物を合成する場合には、前記した合成法の反応工
程のうち、必要な工程のみを行えばよい。
【００２３】また、本発明の３−アルコキシアニリン誘
導体又はその塩の製造に用いられる前記化学式（２）で
示される化合物は、広く市販されているので、市販品を
そのまま用いればよい。
【００２４】本発明の酸化性物質の測定方法及び測定試
薬は、前記化学式（１）の３−アルコキシアニリン誘導
体又はその塩よりなる色原体及びカップラーを被酸化性
発色試薬として用いる又は含有させることを特徴とする
ものである。
【００２５】本発明の３−アルコキシアニリン誘導体又
はその塩を色原体として使用し、カップラーと組み合わ
せて用いた場合、その呈色が極めて安定な色素を生成す
る。この色素は、生体試料中の共存物質による影響を抑
制できるものである。従って、本発明の３−アルコキシ
アニリン誘導体又はその塩は、酸化性物質の測定やペル
オキシダーゼ様物質の測定における被酸化性発色試薬の
色原体として好適である。
【００２６】本発明の測定方法及び測定試薬を用いて測
定することができる生体成分としては、酵素反応により
直接又は間接的に生成する過酸化水素等の酸化性物質を
測定することにより測定することができる生体成分、又
はペルオキシダーゼ様物質等を挙げることができる。例
えば、尿酸、ブドウ糖、コレステロール、トリグリセラ
イド、リン脂質、コリンエステラーゼ等が挙げられる。
【００２７】また、本発明の測定方法及び測定試薬にお
ける試料としては、前記した生体成分を含むことが推測
され、その試料中の生体成分の存在の有無の測定、又は
生体成分濃度の測定を行おうとするもの等を挙げること
ができる。例えば、ヒト又は動物の血液、血清、血漿、
尿、精液、髄液、唾液、汗、涙、腹水、羊水等の体液；
ヒト若しくは動物の膵臓、肝臓等の臓器、毛髪、皮膚、
爪、筋肉、又は神経組織等の抽出液；ヒト又は動物の糞
便の抽出液又は懸濁液；細胞の抽出液；植物の抽出液等
が挙げられる。
【００２８】本発明の測定方法及び測定試薬において
は、本発明の３−アルコキシアニリン誘導体又はその塩
と、例えば、４−アミノアンチピリン又はその誘導体、
フェニレンジアミン、３−メチル−２−ベンゾチアゾリ
ノンヒドラゾン（ＭＢＴＨ）等のカップラーとを組み合
わせたものを被酸化性発色試薬として用いる以外は、従
来より公知の酵素学的測定方法及び測定試薬、例えば、
過酸化水素を生成する酸化酵素を用いて、生体成分から
直接過酸化水素を生成させるか、又は生体成分から酵素
反応によって得られた生成物に過酸化水素を生成する酸
化酵素を作用させて、間接的に過酸化水素を生成させ、
生成した過酸化水素をペルオキシダーゼ及び被酸化性発
色試薬と混合、接触させて発色系に導き、酸化縮合反応
により被酸化性発色試薬から生成した色素を光学的に測
定することにより生体成分を測定する測定方法及び測定
試薬に従えばよい。また、本発明の測定方法及び測定試
薬におけるカップラーとしては、特に、４−アミノアン
チピリン又はその誘導体が好適である。
【００２９】本発明の測定方法及び測定試薬において、
用いられるペルオキシダーゼは、西洋ワサビ又は微生物
等由来のものを、２０単位／Ｌ以上の濃度で用いること
が好ましい。また、被酸化性発色試薬の使用濃度は、色
原体としての本発明の３−アルコキシアニリン誘導体又
はその塩が、好ましくは０．０５〜２０ｍＭの濃度範
囲、特に好ましくは０．２〜５ｍＭの濃度範囲であり、
カップラーは好ましくは０．０５〜１０ｍＭの濃度範
囲、特に好ましくは０．１〜５ｍＭの濃度範囲で、適宜
組み合わせればよい。
【００３０】本発明の測定方法及び測定試薬において、
測定反応液のｐＨは、ｐＨ４．０〜１０．０の範囲にあ
ることが好ましく、ｐＨ６．０〜８．０の範囲が特に好
ましい。また、緩衝剤としては、前記のｐＨ範囲に緩衝
能がある緩衝剤を適宜用いることが好ましい。このよう
な緩衝剤としては、例えば、リン酸緩衝液、Ｔｒｉｓ、
イミダゾール、グリシルグリシン、ＭＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔ
ｒｉｓ、ＡＤＡ、ＡＣＥＳ、Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓプロパ
ン、ＰＩＰＥＳ、ＭＯＰＳＯ、ＭＯＰＳ、ＢＥＳ、ＨＥ
ＰＥＳ、ＴＥＳ、ＤＩＰＳＯ、ＴＡＰＳＯ、ＰＯＰＳ
Ｏ、ＨＥＰＰＳ、ＨＥＰＰＳＯ、Ｔｒｉｃｉｎｅ、Ｂｉ
ｃｉｎｅ、ＴＡＰＳ等を挙げることができる。
【００３１】本発明の測定方法及び測定試薬には、更
に、安定化剤、活性化剤、防腐剤、又は他の試薬成分等
を含有させてもよい。
【００３２】安定化剤、活性化剤としては、例えば、補
酵素、界面活性剤、アルカリ金属イオン等を含有させて
もよい。
【００３３】また、防腐剤としては、例えば、安息香
酸、合成抗菌剤又は抗生物質等を添加してもよい。
【００３４】本発明の測定方法及び測定試薬において、
酸化性物質とは、前記色原体及び前記カップラーととも
にペルオキシダーゼの作用を受け、色素を生成する物質
をいう。このような物質としては、例えば、過酸化水
素、過ヨウ素酸等を挙げることができる。
【００３５】本発明の３−アルコキシアニリン誘導体又
はその塩は、カップラーとの組み合わせにより、ペルオ
キシダーゼ様物質の測定にも用いることができる。ここ
で、ペルオキシダーゼ様物質とは、前記酸化性物質と前
記色原体と前記カップラーに作用して、色素を生成させ
る物質をいう。例えば、ペルオキシダーゼ、ヘモグロビ
ン、その他のヘム化合物等を挙げることができる。ま
た、本発明の３−アルコキシアニリン誘導体又はその塩
は、例えば、ペルオキシダーゼを標識化合物に用いた酵
素免疫測定法や、血清中のヘモグロビンを過酸化水素若
しくは過ヨウ素酸ナトリウムのような酸化性物質を用い
て測定する場合等にも用いることができる。
【００３６】本発明の測定試薬において、試薬の形状と
しては、液状試薬、凍結乾燥製剤、若しくは試験片又は
フィルム方式などの担体を用いるもの等、どのような形
状のものであってもよい。
【００３７】
【実施例】以下、実施例により本発明をより具体的に詳
述するが、本発明はこれらの実施例によって何ら限定さ
れるものではない。
【００３８】［実施例１］ Ｎ−（２−カルボキシエチ
ル）−Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン〔本発明化合
物〕の合成 ６０％水素化ナトリウム３４．１ｇを１，４−ジオキサ
ン７２０ｍＬに懸濁させ、８０℃になるまで加熱し、こ
れにｍ−アニシジン１００ｇを１時間かけて滴下し、次
いで臭化エチル９２．７ｇを１時間かけて滴下した後、
１００℃で８時間反応させた。反応終了後にこれを放冷
し、水５Ｌを加えた後、酢酸エチル３Ｌで抽出し、濃縮
を行った。
【００３９】次に、減圧蒸留し、油状のＮ−エチル−３
−メトキシアニリン９２ｇを得た。次いで、このＮ−エ
チル−３−メトキシアニリン９０ｇに、アクリル酸メチ
ル５９．２ｇと酢酸５．５ｇを加え、１１０℃で２０時
間還流した。濃縮後、シリカゲルカラム（酢酸エチル：
ヘキサン＝１：９の溶出溶媒を使用）により精製し、油
状のＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３−
メトキシアニリンメチルエステル９０ｇを得た。
【００４０】このＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−
エチル−３−メトキシアニリンメチルエステル９０ｇに
２Ｎ水酸化ナトリウム２８０ｍＬを加えた後、２時間還
流した。これを氷冷し、濃塩酸６０ｍＬを加えｐＨ４．
０とした。そして、酢酸エチル１Ｌを用いて抽出、濃縮
を行い、Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−
３−メトキシアニリン〔ＣＥＭＯ；本発明化合物〕２６
ｇを得た。
【００４１】［実施例２］ 尿酸測定試薬における呈色
の安定性の確認 実施例１にて合成したＮ−（２−カルボキシエチル）−
Ｎ−エチル−３−メトキシアニリン〔ＣＥＭＯ；本発明
化合物〕又は他のアニリン誘導体を色原体として含有す
る尿酸測定用の第１試薬、及びカップラーである４−ア
ミノアンチピリンを含有する尿酸測定用の第２試薬より
構成される尿酸測定試薬を調製し、測定時の呈色の安定
性を確認した。
【００４２】（１）試薬の調製 本発明・尿酸測定用第１試薬の調製：下記の測定試薬
成分をそれぞれ記載の濃度になるように純水に溶解し、
ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 ３−（Ｎ−モルホリン）プロパンスルホン酸〔ＭＯＰＳ〕 ５０ｍＭ Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル −３−メトキシアニリン〔ＣＥＭＯ・色原体〕 １ｍＭ ペルオキシダーゼ １０００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ １５００単位／Ｌ 界面活性剤 ０．２％
【００４３】対照１・尿酸測定用第１試薬の調製：色
原体をＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−３
−メチルアニリン〔略名：ＣＥＭＢ〕に変えること以外
は、前記の本発明の尿酸測定用第１試薬と同じ測定試
薬成分及び濃度で調製を行った。
【００４４】対照２・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−Ｎ−エチル−３，５−ジメチルアニリン〔略名：ＭＡ
ＯＳ〕に変えること以外は、前記の本発明の尿酸測定
用第１試薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行っ
た。
【００４５】対照３・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３−メチルアニリン〔略名：ＴＯＯＳ〕
に変えること以外は、前記の本発明の尿酸測定用第１
試薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００４６】対照４・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム〔略名：ＨＤ
ＡＯＳ〕に変えること以外は、前記の本発明の尿酸測
定用第１試薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行っ
た。
【００４７】対照５・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−（２−スルホプロピル）−Ｎ−エチル−３
−メトキシアニリン〔略名：ＡＤＰＳ〕に変えること以
外は、前記の本発明の尿酸測定用第１試薬と同じ測定
試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００４８】なお、本発明及び対照の尿酸測定用第１試
薬において色原体として用いた化合物を表１に示した。
【００４９】
【表１】
【００５０】尿酸測定用第２試薬の調製 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 ３−（Ｎ−モルホリン）プロパンスルホン酸〔ＭＯＰＳ〕 ５０ｍＭ ４−アミノアンチピリン（カップラー） ２．５ｍＭ ウリカーゼ １０００単位／Ｌ 界面活性剤 ０．２％
【００５１】（２）呈色の安定性の確認 純水９０ｍＬに炭酸リチウム６ｍｇを溶解し、さらに尿
酸１５ｍｇを添加して完全溶解した。これを純水で全量
を１００ｍＬにして、尿酸濃度１５ｍｇ／ｄＬの試料を
作製した。この試料中の尿酸値を、前記（１）で調製し
た、本発明及び対照１〜５の尿酸測定用第１試薬、並び
に第２試薬の各々の試薬にて測定し、各試薬を用いた場
合の呈色の安定性を確認した。
【００５２】この試料中の尿酸の測定は、日立製作所製
７１５０形自動分析装置にて行い、試料５μＬに尿酸測
定用第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間反応させ
た後、尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加して３７℃で
反応を開始させた。主波長６００ｎｍ及び副波長７００
ｎｍにおける第２試薬添加２分後（３５ポイント）の吸
光度と第２試薬添加５分後（５０ポイント）の吸光度を
測定した。
【００５３】（３）結果 各尿酸測定試薬における呈色の安定性に関する結果を表
２に示した。
【００５４】
【表２】
【００５５】この表より、本発明化合物を色原体として
用いた場合、吸光度は殆ど変化していない。これに対し
て、対照１〜３の尿酸測定用第１試薬を用いた場合は、
いずれも吸光度が低下してしまっていることが分かる。
これらのことにより、本発明化合物よりなる色原体及び
カップラーを被酸化性発色試薬として含有する尿酸測定
試薬は、呈色の安定性が極めて高いことが確かめられ
た。
【００５６】［実施例３］ 尿酸測定時における試料中
の共存物質の影響の確認 本発明化合物又は他のアニリン誘導体を色原体として含
有する尿酸測定用の第１試薬、及びカップラーである４
−アミノアンチピリンを含有する尿酸測定用の第２試薬
より構成される尿酸測定試薬を調製し、試料中に含まれ
る共存物質の影響について検討した。
【００５７】（１）試薬 本発明・尿酸測定用第１試薬：前記実施例２ので調
製した尿酸測定用第１試薬をそのまま用いた。
【００５８】対照１・尿酸測定用第１試薬の調製：前
記実施例２ので調製した尿酸測定用第１試薬をそのま
ま用いた。
【００５９】対照２・尿酸測定用第１試薬の調製 前記実施例２ので調製した尿酸測定用第１試薬をその
まま用いた。
【００６０】対照３・尿酸測定用第１試薬の調製 前記実施例２ので調製した尿酸測定用第１試薬をその
まま用いた。
【００６１】尿酸測定用第２試薬の調製 前記実施例２ので調製した尿酸測定用第２試薬をその
まま用いた。
【００６２】（２）試料の作製 ビリルビン添加試料 ヒト血清９ｍＬに、ビリルビン濃度が２００ｍｇ／ｄＬ
の干渉チェックＡ・ビリルビンＣ（国際試薬社製）１ｍ
Ｌを混合し、ビリルビン２０ｍｇ／ｄＬを添加したビリ
ルビン添加試料とした。 アスコルビン酸添加試料 ヒト血清９ｍＬに、アスコルビン酸濃度が２０００ｍｇ
／ｄＬのアスコルビン酸水溶液１ｍＬを混合し、アスコ
ルビン酸２００ｍｇ／ｄＬを添加したアスコルビン酸添
加試料とした。 ヘモグロビン添加試料 ヒト血清９ｍＬに、ヘモグロビン濃度が５０００ｍｇ／
ｄＬの干渉チェックＡ・ヘモグロビン（国際試薬社製）
１ｍＬを混合し、ヘモグロビン５００ｍｇ／ｄＬを添加
したヘモグロビン添加試料とした。 対照用試料 ヒト血清９ｍＬに、純水１ｍＬを混合し、対照用試料と
した。なお、この対照用試料中の尿酸濃度と、前記のビ
リルビン添加試料、アスコルビン酸添加試料、ヘモグロ
ビン添加試料中の尿酸濃度は同じである。 尿酸標準液 純水９０ｍＬに炭酸リチウム６ｍｇを溶解し、さらに尿
酸１５ｍｇを添加して完全溶解した。純水で全量を１０
０ｍＬにして、尿酸濃度１５ｍｇ／ｄＬの尿酸標準液と
した。
【００６３】（３）試料中の共存物質による測定値への
影響の確認 前記（２）で作製した４種類の試料（ビリルビン添加試
料、アスコルビン酸添加試料、ヘモグロビン添加試料、
対照用試料）中の尿酸値を、前記（１）で調製した、本
発明及び対照１〜３の尿酸測定用第１試薬、並びに第２
試薬の各々の試薬にて測定し、本発明試薬、対照１〜３
の試薬を用いた場合の試料中の共存物質による影響を確
認した。
【００６４】前記（２）の試料中の尿酸の測定は、日立
製作所製７１５０形自動分析装置にて行い、試料５μＬ
に尿酸測定用第１試薬を３２０μＬ加え３７℃で５分間
反応させた後、尿酸測定用第２試薬を８０μＬ添加して
３７℃で反応を開始させた。主波長６００ｎｍ及び副波
長は８００ｎｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイン
ト）、及び第２試薬添加５分後（５０ポイント）の吸光
度の増加分より、既知濃度の尿酸標準液を測定した時の
吸光度との比例計算によって尿酸値を求めた。なお、純
水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値として、第２試
薬添加直前の吸光度及び第２試薬添加５分後の吸光度よ
り試薬盲検値を差し引いた吸光度を尿酸値の算出に用い
た。
【００６５】（４）結果 本発明の尿酸測定用第１試薬及び対照１〜３の尿酸測定
用第１試薬並びに尿酸測定用第２試薬を用いて、前記し
た４種類の試料（ビリルビン添加試料、アスコルビン酸
添加試料、ヘモグロビン添加試料、対照用試料）中の尿
酸を測定した時の測定結果を表３に示した。なお、表中
の上段は測定で得られた尿酸測定値、下段はこの尿酸測
定値の対照用試料の測定値に対する百分率を示した。
【００６６】
【表３】
【００６７】この表より、対照１〜３の測定試薬では、
試料中の共存物質（ビリルビン、アスコルビン酸、ヘモ
グロビン）の影響があるのに対し、本発明の測定試薬で
は試料中の共存物質の影響を全く受けておらず、正確な
尿酸の測定値が得られることが確かめられた。
【００６８】［実施例４］ 総コレステロール測定試薬
における試料中の共存物質の影響の確認 本発明化合物又は他のアニリン誘導体を含有する総コレ
ステロール測定用の第１試薬、及びカップラーである４
−アミノアンチピリンを含有する総コレステロール測定
用の第２試薬より構成される総コレステロール測定試薬
を調製し、試料中に含まれる共存物質の影響について検
討した。
【００６９】（１）試薬の調製 総コレステロール測定用第１試薬の調製 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−アセトアミド）イミノ二酢酸〔ＡＤＡ〕 １００ｍＭ ４−アミノアンチピリン（カップラー） ０．４４ｍＭ コレステロールエステラーゼ ４００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３００単位／Ｌ 界面活性剤 ０．１％
【００７０】本発明・総コレステロール測定用第２試
薬の調製 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−トリス（ヒドロキシメチル）メチル −２−アミノエタンスルホン酸〔ＴＥＳ〕 ２０ｍＭ Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル −３−メトキシアニリン〔ＣＥＭＯ・色原体〕 １ｍＭ コレステロールオキシダーゼ ３００単位／Ｌ ペルオキシダーゼ １６００単位／Ｌ アジ化ナトリウム ０．０１％ 界面活性剤 ０．１％
【００７１】対照・総コレステロール測定用第２試薬
の調製 色原体をＮ−（２−スルホプロピル）−Ｎ−エチル−３
−メトキシアニリン〔略名：ＡＤＰＳ〕に変えること以
外は、前記の本発明の総コレステロール測定用第２試
薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００７２】（２）試料の作製 ビリルビン添加試料 ヒト血清９ｍＬに、ビリルビン濃度が５００ｍｇ／ｄＬ
の干渉チェックＡ・ビリルビンＣ（国際試薬社製）１ｍ
Ｌを混合し、ビリルビン５０ｍｇ／ｄＬを添加したビリ
ルビン添加試料とした。
【００７３】対照用試料 ヒト血清９ｍＬに、純水１ｍＬを混合し、対照用試料と
した。なお、この対照用試料中の総コレステロール濃度
も、前記のビリルビン添加試料中の総コレステロール濃
度は同じである。
【００７４】（３）試料中の共存物質による測定値への
影響の確認 前記（２）で作製した２種類の試料（ビリルビン添加試
料、対照用試料）中の総コレステロール値を、前記
（１）で調製した、総コレステロール測定用第１試薬並
びに、本発明及び対照の総コレステロール測定用第２試
薬の各々の試薬にて測定し、本発明の測定試薬、及び対
照の測定試薬を用いた場合の試料中の共存物質による影
響を確認した。
【００７５】前記（２）の試料中の総コレステロールの
測定は、日立製作所製７１５０形自動分析装置にて行
い、試料４μＬに総コレステロール測定用第１試薬を３
００μＬ加え３７℃で５分間反応させた後、総コレステ
ロール測定用第２試薬を１００μＬ添加して３７℃で反
応を開始させた。主波長６００ｎｍ及び副波長７００ｎ
ｍにおける第２試薬添加直前（２４ポイント）、第２試
薬添加５分後（５０ポイント）の吸光度の増加分より、
既知濃度の総コレステロール標準液を測定した時の吸光
度との比例計算によって総コレステロール値を求めた。
なお、純水を試料とした時の吸光度を試薬盲検値とし
て、第２試薬添加直前の吸光度及び第２試薬添加５分後
の吸光度より試薬盲検値を差し引いた吸光度を総コレス
テロール値の算出に用いた。
【００７６】（４）結果 総コレステロール測定用第１試薬及び本発明の総コレス
テロール測定用第２試薬並びに、対照の総コレステロー
ル測定用第２試薬を用いて、前記した２種類の試料中の
総コレステロールを測定した時の測定結果を表４に示し
た。なお、表中の上段は総コレステロールの測定で得ら
れた測定値、下段はこの総コレステロール測定値の対照
用試料の測定値に対する百分率を示した。
【００７７】
【表４】
【００７８】この表より、対照の測定試薬では、ビリル
ビンによる負誤差が５％もあるのに対し、本発明の測定
試薬では、２％にとどまっていることが分かる。
【００７９】このことより、総コレステロール測定用第
１試薬、及び本発明の総コレステロール測定用第２試薬
による総コレステロールの測定は、ビリルビンによる影
響をほとんど受けておらず、正確な総コレステロール値
が得られることが確かめられた。
【００８０】［実施例５］ 気体の溶け込みによる試薬
の劣化防止効果の実証 アジ化物を気化するアジ化ナトリウム含有試薬、本発明
の測定試薬の組み合わせにおける、本発明測定試薬への
気化したアジ化物の溶け込みによる発色、劣化の度合い
を確かめた。
【００８１】（１）試薬の調製 アジ化ナトリウム含有試薬 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ５．２（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ アジ化ナトリウム １０ｍＭ
【００８２】本発明・尿酸測定用第１試薬の調製 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調製した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸［ＨＥＰＥＳ］ １００ｍＭ Ｎ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル −３−メトキシアニリン〔ＣＥＭＯ・色原体〕 ２ｍＭ ペルオキシダーゼ ３０００単位／Ｌ アスコルビン酸オキシダーゼ ３０００単位／Ｌ 界面活性剤 ０．２％
【００８３】対照１・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−（２−ヒドロキシ−３−スルホプロピル）
−３，５−ジメトキシアニリンナトリウム〔略名：ＨＤ
ＡＯＳ〕に変えること以外は、前記の本発明の尿酸測
定用第１試薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行っ
た。
【００８４】対照２・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−エチル−Ｎ−（２−ヒドロキシ−３−スル
ホプロピル）−３，５−ジメトキシアニリン〔略名：Ｄ
ＡＯＳ〕に変えること以外は、前記の本発明の尿酸測
定用第１試薬と同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行っ
た。
【００８５】対照３・尿酸測定用第１試薬の調製 色原体をＮ−（２−カルボキシエチル）−Ｎ−エチル−
３，５−ジメトキシアニリン〔略名：ＣＥＤＢ〕に変え
ること以外は、前記の本発明の尿酸測定用第１試薬と
同じ測定試薬成分及び濃度で調製を行った。
【００８６】尿酸測定用第２試薬の調製 下記の測定試薬成分をそれぞれ記載の濃度になるように
純水に溶解し、ｐＨ７．０（２０℃）に調整した。 測定試薬成分 濃 度 Ｎ−（２−ヒドロキシエチルピペラジン） −Ｎ’−２−エタンスルホン酸〔ＨＥＰＥＳ〕 １００ｍＭ ４−アミノアンチピリン ２．５ｍＭ ウリカーゼ １０００単位／Ｌ 界面活性剤 ０．２％
【００８７】（２）安定性検討のための試薬の保存 前記（１）で調製した、アジ化ナトリウム含有試薬、本
発明及び対照１〜３の尿酸測定用第１試薬、並びに第２
試薬を、図１のようにそれぞれ試験管（容量１０ｍＬ、
長さ１０５ｍｍ、内径１３ｍｍ）に分注し、下記の組み
合わせでポリ袋（１３５ｍｍ×８５ｍｍ；チャック付
き）に入れ、チャックを閉めて密封し、２５℃にて３０
日間保存した。なお、各試験管の口に栓はしなかった。 １）本発明・尿酸測定用第１試薬、第２試薬及びアジ化
ナトリウム含有試薬 ２）対照１・尿酸測定用第１試薬、第２試薬及びアジ化
ナトリウム含有試薬 ３）対照２・尿酸測定用第１試薬、第２試薬及びアジ化
ナトリウム含有試薬 ４）対照３・尿酸測定用第１試薬、第２試薬及びアジ化
ナトリウム含有試薬
【００８８】（３）保存した試薬の安定性の判定 保存開始時及び、保存１日後、５日後、１２日後、１７
日後、並びに３０日後に、本発明及び対照１〜３の尿酸
測定用第１試薬が発色しているか否かを目視で判定し
た。
【００８９】（４）安定性の判定結果 試薬の安定性について、発色の判定結果を表５に示し
た。
【００９０】
【表５】
【００９１】この表より、対照１〜３の尿酸測定用第１
試薬は、保存５日後にして既に発色してしまっているの
に対して、本発明の尿酸測定用第１試薬は、保存３０日
後でさえも発色していないことが分かる。
【００９２】このことにより、本発明の化合物を色原体
として用いた、本発明の測定試薬では、アジ化ナトリウ
ム含有試薬から気化したアジ化物が本発明の測定試薬に
溶け込んでも試薬の劣化、機能の低下を防ぐことが出来
ることが確かめられた。
【００９３】
【発明の効果】本発明の、前記の化学式（１）で表わさ
れる３−アルコキシアニリン誘導体又はその塩を色原体
として使用し、カップラーと組み合わせて用いた測定方
法及び測定試薬では、生成する色素の呈色は極めて安定
である。また、生体試料中にビリルビン、ヘモグロビ
ン、及びアスコルビン酸等の共存物質が含まれることに
より生じる測定値への誤差の発生を抑制することがで
き、更に、アジ化物等の近傍の試薬に含まれる成分が試
薬に溶け込むことによる試薬の劣化及び機能の低下を防
ぐことができ、これにより酸化性物質又はペルオキシダ
ーゼ様物質を正確に測定することができるという効果を
有するものである。
【図面の簡単な説明】
【図１】安定性検討のための試薬の保存方法を示した図
面。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き Ｆターム(参考） 2G054 AA06 AA07 AB02 CA10 CA26 CA28 CE01 EA04 EB02 JA11 4B063 QA01 QA19 QQ02 QQ03 QQ08 QQ09 QQ22 QQ65 QQ76 QQ79 QQ89 QR41 QR66 QS02 QX01 4H006 AA01 AA03 AB20 AB80 BJ50 BP30 BS10 BU46

Claims (7)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】 下記の化学式（１） 【化１】 （式中、Ｒ１は炭素数１〜３のアルコキシ基を示し、Ｒ
    ２は水素原子、又は炭素数１〜３のアルキル基を示し、
    Ｒ３はカルボキシル基で置換された炭素数１〜３のアル
    キル基を示す。）で示される、３−アルコキシアニリン
    誘導体又はその塩。
  2. 【請求項２】 請求項１に記載の３−アルコキシアニリ
    ン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラーを被
    酸化性発色試薬として用いることを特徴とする酸化性物
    質の測定方法。
  3. 【請求項３】 請求項１に記載の３−アルコキシアニリ
    ン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラーを被
    酸化性発色試薬として用いることを特徴とするペルオキ
    シダーゼ様物質の測定方法。
  4. 【請求項４】 カップラーが４−アミノアンチピリンで
    ある、請求項２又は３に記載の測定方法。
  5. 【請求項５】 請求項１に記載の３−アルコキシアニリ
    ン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラーを被
    酸化性発色試薬として含有することを特徴とする酸化性
    物質の測定試薬。
  6. 【請求項６】 請求項１に記載の３−アルコキシアニリ
    ン誘導体又はその塩よりなる色原体及びカップラーを被
    酸化性発色試薬として含有することを特徴とするペルオ
    キシダーゼ様物質の測定試薬。
  7. 【請求項７】 カップラーが４−アミノアンチピリンで
    ある、請求項５又は６に記載の測定試薬。
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4300105A1 (en) * 2022-06-29 2024-01-03 ARKRAY, Inc. Method for stabilizing hemoglobin

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