JPH0542271B2 - - Google Patents

Description

【発明の詳細な説明】

本発明はNAD(P)Ｈ〔還元型ニコチンアミドアデ
ニンジヌクレオチド（ホスフエート）〕の定量方
法及び定量用組成物に関する。 従来NAD(P)ＨはNAD(P)Ｈの紫外部における
吸収を直接測定する方法NAD(P)Ｈをダイアホ
ラーゼを介して蛍光物質に導き、その蛍光を測定
する方法NAD(P)Ｈをダイアホラーゼを介して
テトラゾリウム塩からホルマザンに導き、これを
比色定量する方法が知られている。 これらの方法には、以下のような短所がある。
即ち、については、感度が低く、臨床検査に応
用した場合、紫外部での測定であるため、試料中
の生体成分の影響を受けやすい。については、
蛍光光度計が必要である。については、微量成
分の定量に際して感度が低く、生成するホルマザ
ンが水に難溶で、器具等に沈着し、落ちにくく、
テトラゾリウム塩、ホルマザンともに光に不安定
なものが多く、試薬保存面および測定時に注意を
要する。 より精度よくNAD(P)Ｈを定量する方法の開発
が望まれており、この目的のため検討の結果後述
の一般式（）に示す化合物とNAD(P)Ｈとを反
応させて生成する色素は極大吸収波長が600nｍ
前後にあり、試料中特に生体成分中の成分の影響
を受けにくいこと、可視部における測定が可能で
あること、感度が優れており、試料が少量で定量
できること、水溶性であるため器具への沈着が殆
どないこと等の優れた性質を有することが見出さ
れた。 本発明によればNAD(P)Ｈはダイアホラーゼ
もしくは電子キヤリアー及びペルオキシダーゼ
もしくはチオールオキシドリダクターゼの存在下
下記一般式（）で表される化合物〔以下、化合
物（）という〕と反応させて生成する色素を定
量することにより定量される。 一般式（） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、
R₁、R₂、R₃は同一もしくは異なつてよく、下記
一般式（）、（）又は（）で表される基を示
す。 Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミ
ノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリ
ール、置換アリール、アシル、ハロゲン原子、ニ
トロ、スルホ、カルボキシル、アルコキシを示
す。ｎは１、２又は３を示し、R₁、R₂、R₃の少
なくとも１つのＺはヒドロキシル、アミノ又は置
換アミノである。又、Znにおける各Ｚは同一も
しくは異なつてもよい。 上記各定義においてアルキルは炭素数１〜５の
アルキルを包含し、メチル、エチル、プロピル、
ブチル、ペンチル等を示し、アルケニルは炭素数
２〜５の基を包含し、ビニル、プロピレン、ブチ
レン等が例示される。アルコキシは炭素数１〜４
の基を包含し、メトキシ、エトキシ、プロポキ
シ、ブトキシ等が例示される。 アリールとしては、フエニル、ナフチルが例示
される。 アシルは炭素数２〜５のアシルを包含し、アセ
チル、プロピオニル、ブチリル等が例示される。
ハロゲンは塩素原子、臭素原子、フツ素原子を包
含する。 置換アミノ、置換アルキル、置換アリールにお
ける置換基としては、アルキル、アルケニル、ア
リール、アルコキシ、ヒドロキシル、カルボキシ
ル、スルホ、スルホニル、ハロゲン原子、アミ
ノ、アルコキシカルボニルアミノ、アルコキシカ
ルボニル、アミノアルキル、アシル、ニトロ等が
例示される。 該置換基中のアルキル、アルケニル、アリー
ル、アルコキシ、ハロゲン、アミノ等は前記と同
義を有する。 本発明を実施するに際しては一般に緩衝液例え
ばグツドバツフアー、リン酸バツフアー、ホウ酸
バツフアー、酢酸バツフアー、トリスバツフアー
等にダイアホラーゼ又は電子キヤリヤー例えばフ
エナジンメトサルフエート（PMS）、１−メトキ
シフエナジンメトサルフエート（MPMS）、メル
ドラブルー等及びパーオキシダーゼ又はチオール
オキシドリダクターゼ及び化合物（）を加えて
試薬液とする。 試料に試薬液を加え30〜50℃の酸素が失活しな
い温度で反応させ、生成した色素によつて着色し
た反応液の吸収を色素の極大吸収波長で試薬ブラ
ンクを対照として測定し、あらかじめ既知量につ
いてのテストから求めた検量線から試料中の
NAD(P)Ｈを定量することができる。 本発明方法は後述の如く反応によつてNAD(P)
Ｈを生成する反応系に係る反応物質あるいは酵素
活性を定量する方法に適用できる。定量されるべ
き因子が化合物である場合には一般に上記吸収測
定に際して反応を約５〜10分行わせた後反応液の
吸収を比色によつて測定することによつて目的因
子を定量できる。因子が酵素活性である場合には
一般に反応開始後の適当な時間における色素生成
速度を反応液の吸光度の変化から求めることによ
つて該活性が定量できる。 緩衝液は10ｍＭ〜1Mの濃度で用いられる。ペ
ルオキシダーゼ、チオールオキシドリダクター
ゼ、ダイアホラーゼは１〜500U／mlで電子キヤ
リヤーは0.0001〜0.01mg／mlで用いられる。化合
物（）は反応するNAD(P)Ｈと等モル以上、通
常0.001〜１mg／mlで用いられる。 反応に際してNAD(P)Ｈは通常試料中の濃度が
0.001〜１mg／mlとなる様に試薬液もしくは蒸留
水で調整される。 NAD(P)Ｈを生成する反応系で本発明が適用さ
れる場合には、反応に関与する基質のような反応
物質、酵素、NAD等は、測定すべき対象である
か否かによつて用いられる量が異なる場合が多い
が、一般にそれぞれ0.0001〜100mg／ml、10〜
1000U／ml、0.0001〜100mg／mlで用いられる。 又、必要に応じてTriton Ｘ−100等の界面活
性剤が用いられる。 ダイヤホラーゼ以外の電子キヤリアーが用いら
れる場合、電子キヤリヤーのダイヤホラーゼに対
する相対活性は下記のとおりであるから、これを
指標として用いれば個々に検量線を求めることな
く実施できる。 （測定方法） 100ｍＭ Goodの緩衝液（PH8.0）にペルオキ
シダーゼ10U／ml、Triton Ｘ−100 0.1％、化合
物No.41を0.1mg／ml、NADH 50ｍＭ／を溶解
し、試薬液とする。 37℃に保つた一定量の試薬液に対し、ダイア
ホラーゼ5U／mlPMS0.001mg／ml
MPMS0.001mg／mlメルドラブルー0.001mg／ml
をこの濃度となるようにそれぞれ溶解し、正確な
一定時間内の吸光度変化量を633nｍにて測定す
る。この吸光度変化量から、ダイアホラーゼを
100とした時の相対活性を算出する。

【表】 本発明で用いられる化合物（）の具体例とそ
の極大吸収波長（λmax）、感度、水への溶解性
が第１〜４表に示される。 表中の略号は下記基を示す。又第１〜３表にお
いて○内は位置を示し、基の表示のない位置はい
ずれも水素を示す。 感度の測定は次の方法により行われた。 NADH液： 0.1Mトリス−HCl緩衝液（PH8.0）にNADHを
加えて0.5ｍＭ／の溶液とする。 試薬液： Good緩衝液に10U／mlペルオキシダーゼ、
5U／mlダイアホラーゼ、0.1mg／mlトリトンＸ−
100及び0.1mg／ml化合物（）（又は0.01mg／ml
のニトロテトラゾリウムブルー）を含有する溶液
を調製する。 50μのNADH液に３mlの試薬液を加えて反応
させλmaxにおけるOD値を測定し、NTを用いた
場合を100としたときの相対値を示す。 溶解性は20℃の蒸留水に対する溶解度が0.05
mg／ml以下をＡ、0.2mg／ml以上をAAとして表さ
れる。

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】

【表】 ー
本発明で用いられる化合物（）は染料合成の
中間体として公知の化合物であるが第１〜３表に
記載の化合物は例えば以下の方法によつて合成で
きる。 下記表に記載の化合物No.の化合物については
４、4′−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロ
ールと目的化合物における下記に示される置換
ベンゼンもしくは置換ナフタレンとを等モルづ
つ約原料の２〜10倍量の60％硫酸中で反応させ
る。反応は50〜100℃で撹拌して行われ２〜３
時間で完了する。さらに反応液の５〜６倍の５
℃前後の冷水を加えて一夜撹拌を続ける。 反応物を濾過し、８％硫酸で洗浄後真空乾燥
して目的物を得る。アルカリ例えば水酸化ナト
リウムを反応液に加えることによつて沈澱が生
成し易くなるので必要に応じて加える。 A₁： A₂：

【表】

【表】 上記以外の位置はいずれも水素を示す。 下記表に掲げる各化合物No.に対応する公知の
色素を原料とし、原料色素を色素重量の80倍量
の蒸留水で溶解する。この色素溶液を撹拌しな
がら、原料色素の２倍mol量の水素化ホウ素ナ
トリウムを徐々に添加し、還元反応を行う。室
温で約２時間撹拌後、この反応液をロータリー
エバポレーターで濃縮乾固する。次にこの乾固
物を溶解しうる最低必要量の蒸留水にて溶解す
る。この溶解液の15〜20倍容量のレジンHP−
20をガラスカラムに充填し、コンデイシヨニン
グ後、前述の溶解液を充填し、使用レジンの３
〜４倍容量の蒸留水を流し、残存する水素化ホ
ウ素ナトリウムを除去する。この時目的物は
HP−20に吸着されている。次にメタノール／
蒸留水＝1/1の展開溶媒を流し、溶出液を適量
づつ分取する。溶出液中の目的物をUVモニタ
ーあるいはTLCにて確認後、必要なフラクシ
ヨンを集め、ロータリーエバポレーターで濃縮
乾固し、目的物を得る。

【表】 化合物No.９、10、67、68の製法 4.4′−ビス（ジメチルアミノ）ベンズヒドロ
ールとクロルベンゼン（化合物No.９、10）ある
いは１−ナフトール−3.5−ジスルホン酸（化
合物No.67.68）とを60％硫酸を用いて前述の
方法にて縮合させる。得られた化合物を適量の
酢酸に溶解し、酸化鉛を触媒として、ジメチル
アミノ基の２つのメチル基の一方を脱離させ、
目的物を得る。 化合物No.11、12の製法 ２−メチル−５−ニトロベンズアルデハイド
とα−（Ｎ−メチルアニリノ）−ｍ−トルエンス
ルホン酸とをモル比１：２で原料化合物総重量
の10倍量の硫酸に加え、100℃前後で120時間撹
拌する。沈澱を熱いままグラスフイルターにて
濾過し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い目的
物を得る。 化合物No.19、20の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ、Ｎ
−ジメチルアニリンおよびＮ−フエニル−ジベ
ンジルアミンとをモル比１：１：１で原料化合
物総重量の10倍量の80％硫酸に加え、190℃前
後で120時間撹拌する。沈殿を熱いままグラス
フイルターにて濾過し、５％硫酸で濾洗後真空
乾燥を行い、目的物を得る。 化合物No.21、22の製法 ２、５−ジクロロベンズアルデハイドとα−
（Ｎ−メチルアニリノ）−ｍ−トルエンスルホン
酸とをモル比１：２で原料化合物総重量の10倍
量の硫酸に加え、100℃前後で120時間撹拌す
る。沈殿を熱いままグラスフイルターにて濾過
し、５％硫酸で濾洗後真空乾燥を行い、目的物
を得る。 化合物No.23、24、25、26の製法 ２−ヒドロキシベンズアルデハイドとＮ−フ
エニルジベンジルアミン（No.23、24）あるいは
Ｎ−ブチル−Ｏ−トルイジン（No.25、26）とを
モル比１：２で原料化合物総重量の10倍量の硫
酸に加え、100℃前後で120時間撹拌する。沈殿
を熱いままグラスフイルターにて濾過し、５％
硫酸で濾洗後真空乾燥を行い目的物を得る。 上記以外の化合物についても、上記の方法にお
いて原料を目的化合物に応じて選ぶことによつて
あるいは公知文献例えばColor Index4巻に記載
の方法によつて製造できる。 本発明方法は、反応によつてNAD(P)Ｈを化学
量論的に生成する反応系における反応物質あるい
は酵素活性の測定に適用できる。かかる反応系は
NAD及びデヒドロゲナーゼを用いる多くの反応
系が知られている。かかる物質としてグルコー
ス、ガラクトース乳酸、アルコール、リンゴ酸、
アルデヒド、キサンチン、コレステロール、胆汁
酸、ラクテートデヒドロゲナーゼ（LDH）活性、
中性脂肪等があげられる。 これらの反応系が図式的に次に示され、反応系
における基質、酵素活性が測定できる。 １ グルコース他 グルコース＋ATPヘキソキナーゼ ――――――――→ グルコース−６−リン酸＋ADP グルコース−６−リン酸＋NAD⁺グルコー
ス−６− リン酸脱水素酵素 ―――――――――→ Ｄ−グルコノ−δ−ラクトン６−リン酸＋HA
DH＋N⁺ ２ ガラクトース ガラクトース＋NAD⁺ガラクトースデヒドロゲナー
ゼ ――――――――――――――――→ Ｄ−ガラクトノ−γ−ラクトン＋NADH＋
H⁺ ３ 乳酸 乳酸＋NADラクテート・デヒドロゲナーゼ（LDH） ――――――――――――――――――――――→ ピルビン酸＋NADH＋H⁺ ４ アルコール アルコール（エタノール）＋NAD⁺アルコール
デヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――→ アルデヒド（アセトアルデヒド）＋NADH＋H⁺ ５ リンゴ酸 リンゴ酸＋NAD⁺マラートデヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――→ オキザル酢酸＋NADH＋H⁺ ６ アルデヒド Ｒ−CHO＋NAD⁺＋H₂Oアルデヒドデヒドロゲナーゼ ――――――――――――――――→ Ｒ−COO^-＋HADH＋2H⁺ ７ キサンチン キサンチン＋NAD⁺＋H₂Oキサンチンデヒドロゲナーデ ――――――――――――――――→ 尿酸＋HADH＋H⁺ ８ 中性脂肪、グリセロール 中性脂肪＋3H₂Oリポプロテインリパーゼ ――――――――――――――→ グリセロール＋脂肪酸 グルセロール＋NADグリセロールデヒドロゲナーゼ ―――――――――――――――――→ ジヒドロキシアセトン＋HADH ９ 3α−ヒドロキシ胆汁酸＋HAD 3α−ヒドロキシステロイドデヒ ドロゲナーゼ（3α−HSD） ―――――――――――――――――→ ３−ケト胆汁酸＋HADH 本発明で用いられるNAD(P)Ｈ定量用組成物は
(イ)ペルオキシダーゼ又はチオールオキシドリダク
ターゼ(ロ)ダイアホラーゼ又は電子キヤリヤー及び
(ハ)化合物（）からなり、これらが前述の量比に
調製されたものは使用に便利である。さらに必要
に応じて緩衝剤をこの組成物に組合せることがで
きる。 測定されるべき因子によつて必要な基質あるい
は酵素を加えた組成物あるいは別に用意して組合
せたキツトは種々の物質もしくは酵素活性の定量
に極めて便利で有用である。 以下に本発明の態様を示す実施例を示す。 実施例 １ 総胆汁酸の測定 100ｍＭ Goodの緩衝液（PH6.5）100mlにペル
オキシダーゼ1000単位、ダイアホラーゼ500単位、
3α−HSD50単位、NAD660mg、Triton Ｘ−100
を100mgおよび発色化合物として化合物No.41を
10mg化合物No.59を10mg化合物No.61を10mgをそ
れぞれ溶解し、試薬液とする。 試験官に血清100μと上記試薬液３mlをとり、
37℃に10分間放置した後発色剤のλmaxにおける
吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め作成
した検量線より血清中の総胆汁酸濃度を算出す
る。 試薬液として、上記緩衝液に3α−HSD、
NAD、ダイアホラーゼ、トリトンＸ−100及び発
色化合物としてニトロテトラゾリウムブルー
（NT）を15mg用いる他は、前記と同様に実施す
る。 結果をガスクロマト法（GC）を用いて測定し
た数値と対比して第５表に併記する。

【表】 実施例 ２ LDH活性の測定 100ｍＭ Goodの緩衝液（PH8.2）100mlにペル
オキシダーゼ1000単位、MPMS1.5mg、Ｌ−乳酸
ナトリウム50mg、NAD100mg、Triton Ｘ−100
100mgおよび発色化合物として化合物No.53を10
mg化合物No.69を10mg化合物No.75を10mgをそれ
ぞれ溶解し、試薬液とする。 試薬液を予め37℃で10分間加温した後、血清
20μを添加し、正確に１分後と３分後の吸光度
を発色剤のλmaxにおいて試薬盲検を対照として
測定する。３分後と１分後の吸光度差を計算し、
予め作成した検量線より、血清中のLDH活性を
算出する。 試薬液として上記緩衝液にMPMS、Ｌ−乳酸
ナトリウム、トリトンＸ−100、NAD、10mgのニ
トロテトラゾリウムブルー（NT）を溶解した液
を用いる他は上記と同様に実施する。 結果をUV法を用いて測定した数値と対比して
第６表に併記する。

【表】 実施例 ３ 中性脂肪の測定 100ｍＭ Goodの緩衝液（PH6.75）100mlにペ
ルオキシダーゼ1000単位、ダイアホラーゼ500単
位、リポプロテインリパーゼ50000単位、グリセ
ロールデヒドロゲナーゼ5000単位NAD500mg、
Triton Ｘ−100を100mg、および発色化合物とし
て化合物No.71を10mg化合物No.63を10mg化合
物No.65を10mgを溶解して試薬液とする。 試験管に血清20μと上記試薬液３mlをとり、
37℃に10分間放置した後、発色剤のλmaxにおけ
る吸光度を試薬盲検を対照として測定し、予め作
成した検量線より血清中の中性脂肪濃度を算出す
る。 試薬液として上記緩衝液にダイアホラーゼ、リ
ポプロテインリパーゼ、グリセロールデヒドロゲ
ナーゼ、NAD、トリトンＸ−100及び15mgのニト
ロテトラゾリウムブルーを用いる他は上記と同様
に実施する。 結果をグリセロールオキシダーゼ、ペルオキシ
ダーゼを使用した系(A)で測定した数値を対比して
第７表に併記する。

【表】

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １ NAD(P)Ｈを含有する試料をペルオキシダ
   ーゼ、ダイアホラーゼ又は電子キヤリアー及び
   下記一般式（）で表される化合物と共に水性
   液中に保持し、着色した溶液の吸光度を測定する
   ことを特徴とするNAD(P)Ｈの定量方法。 一般式（） 式中Ｙは水素もしくはヒドロキシルを示し、
   R₁、R₂、R₃は同一もしくは異なつてよく下記一
   般式（）、（）または（）で表される基を示
   す。 Ｚは水素、ヒドロキシル、アミノ、置換アミ
   ノ、アルキル、置換アルキル、アルケニル、アリ
   ール、置換アリール、アシル、ハロゲン、ニト
   ロ、スルホ、カルボキシ、アルコキシを示す。ｎ
   は１、２又は３を示し、R₁、R₂、R₃の少なくと
   も１つのＺはヒドロキシル、アミノ又は置換アミ
   ノである。又、Znにおける各Ｚは同一もしくは
   異なつていてもよい。 ２ (イ) ペルオキシダーゼ (ロ) ダイアホラーゼ又は電子キヤリアー及び (ハ) 一般式（）で表される化合物 からなるNAD(P)Ｈ定量用組成物。