JP2000325090A - 新規アミノペプチダーゼをコードするｄｎａ及び該アミノペプチダーゼの製造方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 ダイズタンパク質に由来するペプチドを効率
よく分解し、グルタミン酸、アスパラギン酸に富む呈味
性に優れた分解物を製造しうるアミノペプチダーゼを高
効率で生産することを可能にする。 【解決手段】 発芽ダイズに由来する新規なアミノペプ
チダーゼをコードするｃＤＮＡ、該ＤＮＡを含有する組
換え発現ベクター、該発現ベクターによって形質転換さ
れた形質転換体を取得し、該形質転換体を培養してアミ
ノペプチダーゼを製造する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、ダイズ由来の新規
なアミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ、該ＤＮＡを
含有する組換え発現ベクター、該組換え発現ベクターに
より形質転換された形質転換体並びに形質転換体を用い
たアミノペプチダーゼの製造方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】ダイズタンパク質のアミノ酸への分解
は、塩酸や硫酸による酸分解、あるいは麹菌等の微生物
由来酵素をはじめとする既存のプロテアーゼによる分解
などにより行われている。

【０００３】しかしながら、酸による分解を行った場
合、天然調味料になり得るようなダイズタンパク質分解
物を得ようとすると、１００℃、１〜２日間の反応が必
要であり、高温かつ長時間反応の為、エネルギー消費量
が大きいという問題がある。さらに酸によるタンパク質
の加水分解法は簡便である反面、アミノ酸の過剰（破
壊）分解、中和の為に高塩分となることなどの問題があ
る。

【０００４】そこで上記問題を解決すべく、既存のプロ
テアーゼによる穏和な反応条件での分解が考えられた。
特にタンパク質分解酵素（プロテアーゼ）によるダイズ
タンパク質のアミノ酸への分解は、生物反応を利用する
穏やかな反応条件で進行するため、化学反応を利用する
酸加水分解に代わる方法として実現が期待された。

【０００５】しかしながら、一般にマメ科植物の貯蔵タ
ンパク質は、未変性の状態では、既存のプロテアーゼに
対してかなりの耐性を有している。また、パパイン、サ
チライシンに代表される既存のプロテアーゼはエンドペ
プチダーゼの為、タンパク質をペプチドに分解するが、
これだけでアミノ酸に完全分解することは困難であり、
また得られた製品は苦味を呈するために、調味料として
は使用できないのが実状である。

【０００６】さて、このような問題を解決するために、
ペプチドをアミノ酸に分解する酵素であるアミノペプチ
ダーゼ、カルボキシペプチダーゼなどのエキソペプチダ
ーゼの併用が有効と考えられた。

【０００７】一方、醤油の醸造に代表される麹菌を用い
たダイズタンパク質の分解において、遊離アミノ酸の増
加にはロイシンアミノペプチダーゼと酸性カルボキシペ
プチダーゼの重要性が示されている（中代忠信、醤研 V
ol.11, No.2, (1985))。しかしながら、同文献に示され
たように、醤油中には酸性アミノ酸を配列に含んだジペ
プチド、トリペプチドが残存し、これらの難分解性が指
摘されている。当該ジペプチド、トリペプチドには、Ｎ
末端にグルタミン酸あるいはアスパラギン酸を有したペ
プチドも含まれる。ペプチドの難分解性とは、分解反応
を触媒する酵素、すなわちペプチダーゼの基質特異性が
そのペプチドに対して低いことを意味する。このような
醤油醸造での麹菌由来ペプチダーゼに対する難分解性ペ
プチドの問題のみならず、市販のペプチダーゼ製剤にお
いても、麹菌由来酵素を代表とする微生物酵素では同様
に酸性アミノ酸を配列に含んだジペプチダーゼ、トリペ
プチドに対する分解力は低い。

【０００８】そこで、本発明者らは上記課題の解決法を
ダイズ子葉中に求めた。すなわち、ダイズは、その発芽
過程に於いて、種子中の貯蔵タンパク質を非常に短時間
にアミノ酸にまで分解する。この現象より、発芽ダイズ
中に貯蔵タンパク質由来の難分解性ペプチドを容易に分
解しうるペプチダーゼが存在することが予想される。本
発明者らは、このようなペプチダーゼ類（酸性アミノ酸
含有ペプチドを効率的に分解するアミノペプチダーゼＧ
Ｘ、及びロイシンアミノペプチダーゼ群）を発芽ダイズ
子葉中より見いだし、ダイズタンパク質の効率的な加水
分解を行うことに成功した（特開平9-294583号）。

【０００９】しかしながら、ダイズアミノペプチダーゼ
ＧＸの発芽ダイズ子葉中での含量は微量であるため、当
酵素を発芽ダイズ子葉抽出液より大量に調製することは
困難であった。

【００１０】

【発明が解決しようとする問題】上述の問題点を解決す
る方法の１つとしては、該アミノペプチダーゼ遺伝子を
ダイズ以外の系で遺伝子組換え技術を用いて大量生産さ
せることにより、大量の当該アミノペプチダーゼを取得
する方法が挙げられる。この方法を実現する為には、ま
ず、当該アミノペプチダーゼをコードするｃＤＮＡを取
得し、塩基配列を解析し、該アミノペプチダーゼの全ア
ミノ酸配列に関する情報を得ることが必須である。

【００１１】次に、該アミノペプチダーゼをコードする
ＤＮＡを適当な発現ベクターに組み込み、目的物を大量
に生産する形質転換体を得ることが必須である。

【００１２】本発明はこのような事情を鑑みてなされた
もので、発芽ダイズ子葉に由来するアミノペプチダーゼ
を天然から単離する方法に代えて、遺伝子組換え技術を
用いて効率的な遺伝子発現並びに該アミノペプチダーゼ
の大量生産を成しえる為の技術を提供する事を目的とす
る。

【００１３】

【課題を解決するための手段】本研究者らは上記課題を
解決するために鋭意研究を行い、アミノペプチダーゼＧ
Ｘの内部アミノ酸配列と相同性の高い、イネＥＳＴをプ
ローブに用いることにより、発芽ダイズshootｍＲＮＡ
より調製したｃＤＮＡライブラリーをスクリーニング
し、該アミノペプチダーゼをコードするｃＤＮＡを取得
した。

【００１４】本研究者らは更に研究を進め、この得られ
たｃＤＮＡを用いて、該アミノペプチダーゼを生産する
形質転換体を得、これにより該アミノペプチダーゼ活性
を有するタンパク質を得るに至った。

【００１５】すなわち本発明は、以下の通りである。 （１）配列表配列番号１に記載されるアミノ酸配列を有
する発芽ダイズ子葉由来の新規アミノペプチダーゼをコ
ードするＤＮＡ。 （２）配列表配列番号１に記載されるアミノ酸配列に於
いて、１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入、付加、欠
失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、かつ、アミ
ノペプチダーゼを活性を有するタンパク質をコードする
ＤＮＡ。 （３）配列表配列番号２に記載される塩基配列のうち、
塩基番号22から1482までの塩基配列を有する上記（１）
のＤＮＡ。 （４）上記（１）〜（３）のいずれかのＤＮＡを含有す
る組換えＤＮＡ。 （５）上記（４）の組換えＤＮＡで形質転換された形質
転換体。 （６）上記（５）の形質転換体を培養し、アミノペプチ
ダーゼ活性を有するタンパク質を生産させ、これを回収
することを特徴とするアミノペプチダーゼ活性を有する
タンパク質の製造方法。

【００１６】

【発明実施の形態】以下、本発明について詳述する。以
後、アミノペプチダーゼＧＸをＧＸと記す。

【００１７】＜１＞本発明のＤＮＡ 本発明のｃＤＮＡの取得方法の具体例としては、例え
ば、すでに決定されているＧＸのアミノ酸配列に基づい
てオリゴＤＮＡを合成し、発芽ダイズ子葉もしくは他の
部位から抽出したｍＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ法で遺
伝子断片を得、それをプローブに発芽ダイズ子葉もしく
は他の部位のｍＲＮＡを鋳型に作製したｃＤＮＡライブ
ラリーから、ハイブリダイゼーションによりＧＸのｃＤ
ＮＡを釣り上げるなど、従来、慣用的に行われている方
法が挙げられる。

【００１８】また、すでに決定されているＧＸのアミノ
酸配列と相同性の高い、塩基配列を適当なＤＮＡデータ
ベース、例えばＤＤＢＪ、ＥＭＢＬ、ＧｅｎＢａｎｋな
どが挙げられる、より検索し、当該する配列をプローブ
に、発芽ダイズ子葉もしくは他の部位から抽出したｍＲ
ＮＡを鋳型に作製したｃＤＮＡライブラリーをスクリー
ニングし、ＧＸのｃＤＮＡを取得する方法も考えられ
る。

【００１９】ＧＸのｍＲＮＡ抽出に用いる発芽ダイズは
そのダイズの種類を問わない。すなわち市販されている
ダイズ、搾油原料として用いられているダイズなど、そ
の栽培産地、品種を限定しない。また、発芽の方法、栽
培条件、発芽の有無、発芽の期間は問わないが、ダイズ
種子を吸水させ、７〜１０日間生長させた発芽ダイズを
用いるのが好ましい。

【００２０】また、ｃＤＮＡのプローブは、すでに決定
されているアミノ酸配列を基に、発芽ダイズ子葉もしく
は他の部位から抽出したｍＲＮＡを鋳型に、ＲＴ−ＰＣ
Ｒ法等によって作製してもよく、あるいはアミノ酸配列
を基に化学合成しても良い。アミノ酸配列と相同性の高
い塩基配列をプローブに用いる場合、その塩基配列の起
源、遺伝子産物の機能は問わない。すなわち、既知のア
ミノペプチダーゼである必要は無く、また、遺伝子産物
の機能がわかっていなくても良く、ＥＳＴ（Expression
Sequence Tag）でもかまわない。後述の実施例におい
ては、イネの根由来のＥＳＴをプローブとして用いた。
なお、ｃＤＮＡライブラリーの作製は、常法により行う
ことができる。

【００２１】かくして配列表配列番号１に記載されるア
ミノ酸配列を有する発芽ダイズ子葉由来の新規アミノペ
プチダーゼをコードするＤＮＡが得られる。なお、本発
明のＤＮＡは、それがコードする蛋白質がアミノペプチ
ダーゼ活性を有する限り、配列表配列番号１に記載され
るアミノ酸配列に於いて、１もしくは複数のアミノ酸残
基が挿入、付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列
を有するタンパク質をコードするＤＮＡであってもよ
い。

【００２２】＜２＞本発明の組換えＤＮＡ 次に、このようにして得たｃＤＮＡを発現ベクターに組
み込んで組換えＤＮＡを作製する。用いるベクターは、
特に限定されるものではないが、宿主細胞内で自立複製
可能なものでも、染色体に１コピーもしくは複数のコピ
ーが挿入されるものでも良く、上記ＤＮＡすなわちＧＸ
遺伝子を組み込みうる挿入部位を持ち、更にこの組み込
んだＤＮＡを宿主細胞内で発現せしめることを可能とす
る領域が必要である。

【００２３】なお、ベクターに組み込むＧＸ遺伝子とし
ては、ｃＤＮＡだけでなく、ｃＤＮＡから予想されるＧ
Ｘのアミノ酸配列をコードするように設計して合成され
たＤＮＡでも良い。このようなアミノ酸配列を基にした
遺伝子の合成は、ＤＮＡ自動合成機を利用して合成した
オリゴヌクレオチドをアニール後に連結することなどに
より、容易に行うことができる。

【００２４】また、ＧＸを発現、異種タンパク質との融
合タンパク質として生産させる方法もある。これは例え
ば、pGEXシステム（アマシャム・ファルマシアバイオテ
ック社製）などを用いることで、ＧＸをグルタチオン−
Ｓ−トランスフェラーゼとの融合タンパク質としてエシ
ェリヒア・コリ（E. coli）に生産させることが可能で
ある。

【００２５】ＧＸ遺伝子を発現させるプロモーターとし
ては、通常異種タンパク質の発現に用いられる強力なプ
ロモーターを用いることができる。また、ＧＸ遺伝子の
下流にはターミネーターを挿入することもできる。例え
ば、trp、tac、lac、trc、λPL、T7等のプロモーター、
tpA、lpp、T4等のターミネーターが挙げられる。

【００２６】また、翻訳の効率化のために、ＳＤ配列の
種類、数、ＳＤ配列と開始コドンの間の領域の塩基組
成、配列、長さをＧＸ遺伝子の発現に最適になるように
するとよい。

【００２７】ＧＸ発現に必要なプロモーターから翻訳開
始点までの領域は、従来公知のＰＣＲ法や化学合成法な
どにより調製することができる。この配列の一例を配列
番号３に示す。

【００２８】本発明の組換えＤＮＡは、所望の発現系に
応じた公知の発現ベクターに、前記ＧＸ遺伝子を含むＤ
ＮＡを従来公知の方法によって挿入することにより得る
ことが可能である。ここで用いる発現ベクターは多コピ
ーのものであることが望ましい。

【００２９】本発明の組換えＤＮＡの調製に用いること
のできる公知のベクターとしてはpUC18、pHSG299等が挙
げられる。pUC18に本発明のＤＮＡを組み込んで得られ
た本発明の組換えＤＮＡの一具体例としては、pUCTRPGX
1-8がある。

【００３０】＜３＞本発明の形質転換体 次に、前記組換えＤＮＡが挿入されて得られた種々の形
質転換体について説明する。

【００３１】該形質転換体となりうる細胞としては、E.
coli等の細菌が挙げられる。E.coliの一具体例として
は、JM109株（recA、endA1、gyrA96、thi、hsdR17、sup
E44、relA1、Δ(lac-proAB)/F' [traD36、proAB+、lacI
q、lacZΔM15])がある。

【００３２】この他の形質転換体となりうる細胞には、
枯草菌、酵母、麹菌等があり、これらのタンパク質分泌
能を利用して、ＧＸを培地中に生産させる方法も考えら
れる。上記のような微生物の他、カイコ培養細胞などの
培養細胞を用いてもよい。

【００３３】次いで、上記組換えベクターを宿主細胞内
に導入し、形質転換体を得る。組換え発現ベクターの宿
主細胞内への導入方法は、従来の慣用的に用いられてい
る方法により行うことができる。コンピテントセル法、
プロトプラスト法、リン酸カルシウム共沈法、エレクト
ロポレーション法、マイクロインジェクション法、リポ
ソーム融合法等、種々のものが挙げられる。

【００３４】＜４＞アミノペプチダーゼの製造法 このようにして得られた形質転換体を培養することによ
り、培養物中にＧＸを産生させる。これを公知の方法で
単離し、場合によっては精製することにより、目的とす
る酵素が得られる。

【００３５】E.coliを宿主とした場合には、不活性なＧ
Ｘ会合体、すなわちタンパク質封入体としてＧＸ遺伝子
産物を得た後、これを適当な方法で活性化することも可
能であり、活性再生後、活性型タンパク質を公知の方法
で分離精製することにより、目的の酵素を得てもよい。

【００３６】形質転換体を培養する為の培地は公知であ
り、例えば、E.coliではLB培地などの栄養培地や、M9培
地などの最小培地に炭素源、窒素源、ビタミン源等を添
加して用いることができる。形質転換体の培養は、宿主
に応じて、通常16〜42℃、好ましくは25〜37℃で5〜168
時間、好ましくは8〜72時間行う。振盪培養と静置培養
のいずれも可能であるが、必要に応じて攪拌、通気を行
ってもよい。また、ＧＸ発現のために誘導型プロモータ
ーを用いた場合は、培地にプロモーター誘導剤を添加し
て培養をおこなうこともできる。

【００３７】ＧＸの単離、精製方法としては、形質転換
体の抽出物より、公知の塩析、等電点沈殿法もしくは溶
媒沈殿法等の沈殿法、透析、限外濾過もしくはゲル濾過
等の分子量差を利用する方法、イオン交換クロマトグラ
フィー等の特異的親和性を利用する方法、疎水クロマト
グラフィー、逆相クロマトグラフィー等の疎水度の差を
利用する方法やその他アフィニティークロマトグラフィ
ー、ＳＤＳポリアクリルアミド電気泳動法、等電点電気
泳動法などが挙げられ、これらを組み合わせることによ
り精製が可能である。

【００３８】

【実施例】以下、本発明を実施例に基づいて説明する。

【００３９】[実施例１ ＧＸ ｃＤＮＡのクローニン
グ]以下に、本実施例について＜１＞ＧＸの内部アミノ
酸配列の決定、＜２＞ＧＸと相同性の高い塩基配列の検
索、＜３＞ダイズにおけるＧＸ発現部位の解析、＜４＞
イネＥＳＴ R2219_2Aをプローブにした発芽ダイズshoot
由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニングについて分
説する。

【００４０】＜１＞ＧＸの内部アミノ酸配列の決定 発芽ダイズ子葉より精製したＧＸタンパクを還元カルボ
キシメチル化後、リシルエンドペプチダーゼ（EC.3.4.2
1.50和光純薬）処理した。生じたペプチドフラグメント
をμRPC C2/C18 SC2.1/10カラム（ファルマシア社製）を用
いて分取した。各々のフラグメントにつきプロテインシ
ークエンサーでアミノ酸配列を解析したところ、計１０
ヶ所のアミノ酸配列を決定することに成功した。

【００４１】＜２＞ＧＸと相同性の高い塩基配列の検索 先に決定したアミノ酸配列をＤＤＢＪ（DNA DATA BASE
of JAPAN)のホモロジー検索にかけたところ、配列表配
列番号４記載のペプチドフラグメントNo.8に相同性の高
い、イネ根由来EST R2219_2Aが見つかった。この、イネ
のR2219_2AはイネのＧＸである可能性が高く、以後、こ
のイネR2219_2Aをプローブに、ダイズＧＸのクローニン
グを試みた。クローニングにあたり、ダイズのどの部位
で発現が顕著であるか検討した。

【００４２】＜３＞ダイズにおけるＧＸ発現部位の解析 プローブとするイネR2219_2AｃＤＮＡの部分断片はＲＴ
ーＰＣＲ法により、以下のように得た。R2219_2AｃＤＮ
Ａの一部を、イネ根総ＲＮＡを鋳型にＲＴ−ＰＣＲ法に
て増幅した。R2219_2A増幅用のプライマーはセンスプラ
イマーとしてR22192AU（配列表配列番号５）、アンチセ
ンスプライマーとしてR22192AD（配列表配列番号６）を
用いた。なお、増幅した領域はペプチドNo.8に対応する
部分を含んでなるものである。

【００４３】ＲＴ−ＰＣＲにはTakara RNA PCR kitを用
いた。このときのＰＣＲの条件は94℃、5min→55℃、1m
in→72℃、1minを1cycle行い、続いて、94℃、1min→55
℃、1min→72℃、1minを２５サイクル行うものであっ
た。

【００４４】次に上述のイネR2219_2AｃＤＮＡを用い
て、ノーザンハイブリダイゼーション法により、ダイズ
ＲＮＡにイネR2219_2Aと相同性のある配列があるか調べ
た。

【００４５】取得したR2219_2AｃＤＮＡをプローブに、
ダイズの各部位から抽出した総ＲＮＡに対して、ノーザ
ンブロッティングを行った。使用したダイズの部位は、
発芽３日目子葉、発芽７日目子葉、発芽７日目shoot、
未熟子葉、さや、本葉であった。

【００４６】その結果、ハイブリダイゼーションの温度
を55℃又は60℃、stringency washの洗浄液を0.5×ＳＳ
Ｃ、0.1%ＳＤＳでハイブリダイゼーションと同じ温度で
洗浄したとき、発芽７日目shootに明瞭にシグナルが検
出された。また、その大きさは約1.5kbpと算出された。

【００４７】この結果より、発芽ダイズshoot中には、
イネR2219_2Aとある程度の相同性を有するｍＲＮＡが存
在すると結論され、またそれが、ＧＸであることが強く
期待されたので、このイネR2219_2AｃＤＮＡをプローブ
に、60℃でのハイブリダイゼーション、及びstringency
washのハイブリダイゼーションの条件で発芽７日目ダ
イズshootｍＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリー
をスクリーニングし、ＧＸ ｃＤＮＡの取得を試みた。

【００４８】＜４＞イネＥＳＴ をプローブにした発芽
ダイズshoot由来ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニン
グ 常法に従い、調製した発芽７日目のダイズshoot poly A
ＲＮＡより調製したｃＤＮＡライブラリー7.2×104 pf
uを上記条件でスクリーニングしたところ、７個のハイ
ブリダイズするクローンを得た。各クローンの塩基配列
を決定したところ、クローンの１つに、配列表配列番号
４に記載のＧＸ内部アミノ酸配列を含み、配列表配列番
号１に記載の４８７残基のアミノ酸からなるポリペプチ
ドをコードする、配列表配列番号２に記載の全ＧＸ塩基
配列を含むクローンが見つかった。

【００４９】この塩基配列は、先に決定したＧＸ内部ア
ミノ酸配列１０ヶ所を、全てコードしていることから、
目的のＧＸ ｃＤＮＡであると考えられたので、次に、
このｃＤＮＡを用いて、E. coliによってＧＸタンパク
を生産させることとした。

【００５０】［実施例２ ＧＸのE. coliでの生産］実
施例１で得られたＧＸ ｃＤＮＡをE. coliで機能する発
現ベクターに組み込み、この発現プラスミドを保持する
形質転換体を培養し、菌体内にＧＸ活性を検出した。こ
の際、得られたＧＸ ｃＤＮＡの配列と同時に、E. coli
でのコドンの使用頻度を考慮して、Ｎ末端から２残基目
のAlaから５残基目のLeuまで、すなわち、Ala、Ala、Ly
s、Leuの４残基について、コドンを変更したものについ
ても発現プラスミドを作製し、その発現量を比較した。

【００５１】以下、本実施例について、＜１＞発現プラ
スミドの構築、＜２＞該発現プラスミドを用いたE. col
iの形質転換体の作製と培養、＜３＞ＧＸ活性測定につ
いて分説する。

【００５２】＜１＞発現プラスミドの構築 （１）ＧＸ ｃＤＮＡの配列そのままの発現プラスミド
の構築 ＧＸ遺伝子を転写するプロモーターは、培地中にトリプ
トファンの欠乏で容易に転写が誘導されるtrpプロモー
ターを用いることにした。マダイ・トランスグルタミナ
ーゼ（ＴＧ）遺伝子を高発現したプラスミドpTTG-22
（特開平6-225775号）は、trpプロモーターを用いてお
り、マダイＴＧ遺伝子の上流の配列は、E.coliにおいて
異種タンパク質が高発現するようにデザインされてい
る。また、微生物由来トランスグルタミナーゼ（ＭＴ
Ｇ）遺伝子を高発現させたプラスミドpUCTRPMTG(+)D2
（欧州特許出願公開0889133号）は、このマダイＴＧの
発現プラスミドのtrpプロモーターを含む上流配列を用
いており（配列表配列番号３）、更に、多コピープラス
ミドpUC19に組み込むことにより、ＭＴＧが高発現する
ようになっている。

【００５３】ＧＸ ｃＤＮＡの上流に、trpプロモーター
を結合させるために、ＰＣＲによりＤＮＡフラグメント
の結合を行った。まず、図１のように、ＭＴＧ発現プラ
スミドpUCTRPMTG(+)D2のtrpプロモーターを含む領域
（配列表配列番号３）と、ＧＸｃＤＮＡの部分領域をＰ
ＣＲで増幅した。trpプロモーター増幅用プライマーはT
RP-N2（配列表配列番号７）、TRP-C2（配列表配列番号
８）、またＧＸ部分増幅用プライマーはGX-N1（配列表
配列番号９）、GX-C（配列表配列番号１０）であり、TR
P-N2、GX-N1はセンスプライマー、TRP-C2、GX-Cはアン
チセンスプライマーである。また、GX-N1は、trpプロモ
ーターを含む配列と結合させるための１１塩基の配列を
ＧＸの開始コドンの直前に付加させるようにデザインし
てあり、この配列は、TRP-C2中の配列と相補的である。

【００５４】まず、プラスミドpUCTRPMTG(+)D2に対して
プライマーTRP-N2とTRP-C2、また、ＧＸ ｃＤＮＡ全長
を含むプラスミド、pR2219iに対してプライマーGX-N1と
GX-Cで、ＰＣＲをそれぞれ、94℃、2minの後に、94℃、
30sec→50℃、5sec→72℃、30secを25サイクル行った。
各ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホルム処理後エタノ
ール沈殿を行い、100μLのdH2Oに溶解した。

【００５５】各ＰＣＲ産物から１μLづつとって混ぜ、9
4℃で10minの熱変性後、プライマーTRP-N2とGX-Cで、Ｐ
ＣＲを94℃、30sec→55℃、5sec→72℃、1minの条件で2
5サイクル行った。

【００５６】２回目のＰＣＲ産物をフェノール／クロロ
ホルムで抽出後、エタノール沈殿下ものを、EcoRIとKpn
Iで消化し、pUC18にサブクローニングし、pUCTRPGXN1-8
を得（図１）、シークエンスを確認した。

【００５７】次に、pR2219iに含まれる、ＧＸ遺伝子の
Ｃ末端を、KpnI、XbaIで切り出し、上記pUCTRPGXN1-8へ
サブクローニングすることで、trpプロモーターによる
ＧＸ発現プラスミドpUCTRPGX1-8を完成させた（図
２）。

【００５８】（２）コドンを変更したＧＸ発現プラスミ
ドの構築 （１）と同様の方法でプラスミドを構築した。但しＧＸ
ｃＤＮＡのＮ末端部分断片をＰＣＲで増幅する際のセ
ンスプライマーに、GX-N2（配列表配列番号１１）を用
いた。GX-N2はＮ末端から２から５残基までのAla、Al
a、Lys、Leuに相当するコドンをGCG GCG AAG CTAからGC
T GCT AAA CTGへ変更してある。

【００５９】まず、プラスミドpUCTRPMTG(+)D2に対して
プライマーTRP-N2とTRP-C2、また、pR2219iに対してプ
ライマーGX-N2とGX-Cで、ＰＣＲをそれぞれ、94℃、2mi
nの後に、94℃、30sec→50℃、5sec→72℃、30secを25
サイクル行った。各ＰＣＲ産物をフェノール／クロロホ
ルム処理後エタノール沈殿を行い、100μLのdH2Oに溶解
した。

【００６０】各ＰＣＲ産物から１μLづつとって混ぜ、9
4℃で10minの熱変性後、プライマーTRP-N2とGX-Cで、Ｐ
ＣＲを94℃、30sec→55℃、5sec→72℃、1minの条件で2
5サイクル行った。

【００６１】２回目のＰＣＲ産物をフェノール／クロロ
ホルムで抽出後、エタノール沈殿したものを、EcoRIとK
pnIで消化し、pUC18にサブクローニングし、pUCTRPGXN2
-1を得（図３）、シークエンスを確認した。

【００６２】次に、pR2219iに含まれる、ＧＸ遺伝子の
Ｃ末端を、KpnI、XbaIで切り出し、上記pUCTRPGXN2-1へ
サブクローニングすることで、trpプロモーターによる
ＧＸ発現プラスミドpUCTRPGX2-1を完成させた（図
４）。

【００６３】＜２＞該発現プラスミドを用いたE. coli
の形質転換体の作製と培養 コンピテントセル法によりpUCTRPGX1-8、pUCTRPGX2-1及
びpUC19をE. coli JM109に導入し、形質転換体を150μg
/mLのアンピシリンを含む寒天培地で選択した。なお、p
UCTRPGX2-1で形質転換したE.coliをAJ13564と命名し
た。このE.coli株は工業技術院生命工学工業技術研究所
に受託番号FERM P-17131として寄託され、その後、平成
１２年2月１４日にブダペスト条約に基づく寄託へ移管
され、受託番号FERM BP-7027として同機関に寄託されて
いる。各形質転換体を150μg/mLのアンピシリンを含む2
×YT培地に接種し、37℃で5hr培養した。この前培養液1
mLを150μg/mLのアンピシリンを含む50mLのM9-カザミノ
酸培地に移し、本培養とした。本培養は37℃で18hr行っ
た。

【００６４】培養終了後、遠心により集菌した菌体を、
菌体破砕用バッファー（50mM Tris-HCl(pH8.0)、5mM EDT
A）に懸濁し、超音波破砕をBranson MODEL-Sonifier 25
0のマイクロチップを用い、output control 7,duty cyc
le 50%で約10min行った。この破砕処理液を、12000rpm
で10min遠心して、上清を菌体内可溶性画分とし、ま
た、沈殿を不溶性画分として、ＳＤＳ−ポリアクリルア
ミドゲル電気泳動を行った。その結果、pUCTRPGX1-8/JM
109の可溶性画分、及びpUCTRPGX2-1/JM109の可溶性画分
と不溶性画分に、ＧＸと同一分子量を有するタンパク質
の発現が認められた。特にコドンを変更したpUCTRPGX2-
1/JM109については高発現が観察され、コドン変更によ
る効果は明らかであった。なお、生産培地には、３−β
−インドールアクリル酸を加えなくとも十分な高発現が
得られた。

【００６５】＜３＞ＧＸ活性の測定 ＧＸ活性は、ジペプチドGlu-Gluの分解による、遊離グ
ルタミン酸量の増加で測定した。50mM HEPES(pH8.0)、5m
M Glu-Gluを含む活性測定溶液に、酵素溶液を加え、37
℃で5-10min反応させ、2%になるように酢酸を加えて反
応を止め、グルタミン酸アッセイｋｉｔ（生化学工業）
を用いて、遊離グルタミン酸量を測定した。活性は1分
間に１μmolのグルタミン酸を遊離する活性を1unitとし
た。pUCTRPGX1-8/JM109、pUCTRPGX2-1/JM109、pUC19/JM
109の可溶性画分、すなわち菌体破砕上清のＧＸ活性を
測定し、比活性を求めたところ、pUCTRPGX1-8/JM109で
は0.91U/mg、 pUCTRPGX2-1/JM109では2.88U/mg、 pUC19
/JM109では0.04U/mgとなり、菌体内に蓄積したＧＸタン
パクが活性を有することを確認した。また、コドンを変
更することにより約３倍のＧＸタンパクが蓄積すること
が確認された。

【００６６】

【発明の効果】本発明によれば、タンパク質及びペプチ
ドを含む原料から、酸性アミノ酸含量の高い、分解の進
んだ加水分解物を生産するのに適したアミノペプチダー
ゼＧＸのアミノ酸配列をコードするｃＤＮＡが得られ
る。このｃＤＮＡをもとに、E. coliなどで組換え体ア
ミノペプチダーゼを量産できる。また、上記ｃＤＮＡを
用いれば、E.coli以外の宿主でもアミノペプチダーゼＧ
Ｘを生産することが可能である。さらに、生産させたＧ
ＸをプロテアーゼFlavourzyme（登録商標）(Novo Nordi
sk A/S)およびProtease M（登録商標）（Amano Pharmac
eutical）のような商業的に入手可能なプロテアーゼと
組み合わせることにより、ダイズタンパク質より、グル
タミン酸ならびにアスパラギン酸含量の高い、呈味性の
優れた分解物を創出することが可能である。

【００６７】

【配列表】 Sequence Listing <110> 味の素株式会社(Ajinomoto Co., Inc.) <120> 新規アミノペプチダーゼをコードするＤＮＡ及び該アミノペプチダーゼの 製造方法 <130> Y1G0282 <150> JP 11-68255 <151> 1999-3-15 <160> 11 <210> 1 <211> 487 <212> PRT <213> Glycine max <400> 1 Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val Ala Ser Asp Leu Ile Asp 1 5 10 15 Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His Ala Val Asp Glu Ala Lys 20 25 30 Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val 35 40 45 Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe Phe Thr Arg Asn His Ser 50 55 60 Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys Tyr Val Ala Gly Asn Gly 65 70 75 80 Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser Pro Cys Leu Lys Leu Lys 85 90 95 Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ala Gly Ile Leu Glu Val Gly Val Gln 100 105 110 Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp Phe Asp Arg Asp Leu Thr 115 120 125 Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu Asn Ala Gly Ser Val Ser 130 135 140 Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu Pro Ile Met Arg Ile Pro 145 150 155 160 Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val Asn Asp Gly Phe Lys Phe 165 170 175 Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu Ala Thr Ser Leu Lys Gly 180 185 190 Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly Pro Val Glu Ser Gly Asn 195 200 205 Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys Thr Gly Thr Ser Asn Thr 210 215 220 Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu Ala Ser Lys Leu Gly Cys 225 230 235 240 Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu Gln Ala Cys Asp Thr Gln 245 250 255 Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu Phe Ile Phe Ser Gly Arg 260 265 270 Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser Leu Lys Ala Leu Ile Asp 275 280 285 Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu Glu Ser Gly Val Arg Met 290 295 300 Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly Ser Asn Ser Ala Gln Gly 305 310 315 320 Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val Thr Arg Val Thr Asn Ser 325 330 335 Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys Ala Ala Gln Leu Ser Tyr 340 345 350 Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu His Pro Asn Tyr Met Asp 355 360 365 Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu His Gly Gly Leu Val Ile 370 375 380 Lys Thr Asn Ala Ser Gln Arg Tyr Ala Thr Asn Val Val Thr Ser Phe 385 390 395 400 Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys Leu Pro Val Gln Asp Phe 405 410 415 Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser Thr Ile Gly Pro Ile Leu 420 425 430 Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp Val Gly Ala Pro Gln Leu 435 440 445 Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala Val Asp Asp Val Lys Tyr 450 455 460 Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln Glu Phe Ser His Val Asp 465 470 475 480 Gly Lys Met Val Val Asp Ile 485

【００６８】 <210> 2 <211> 1657 <212> DNA <213> Glycine max <220> <221> CDS <222> 22..1482 <400> 2 aaaattaaaa tctgaaaaac a atg gcg gcg aag cta gac acc cac gcc gtg 51 Met Ala Ala Lys Leu Asp Thr His Ala Val 1 5 10 gct tcc gat ctg atc gac ttc ctc aac gct tct cca acg gct ttc cac 99 Ala Ser Asp Leu Ile Asp Phe Leu Asn Ala Ser Pro Thr Ala Phe His 15 20 25 gcc gtc gac gag gca aag agg cgt ttg cgt agc gcg ggg tac cac caa 147 Ala Val Asp Glu Ala Lys Arg Arg Leu Arg Ser Ala Gly Tyr His Gln 30 35 40 ctc tct gag agg gaa gtg tgg gaa ctg caa ccg ggc aac aag tac ttc 195 Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly Asn Lys Tyr Phe 45 50 55 ttc acc aga aat cac tcc acc atc gtc gcc ttc gcc atc ggc aaa aag 243 Phe Thr Arg Asn His Ser Thr Ile Val Ala Phe Ala Ile Gly Lys Lys 60 65 70 tac gtt gct gga aat gga ttc tac ata att ggg gct cac acg gat agt 291 Tyr Val Ala Gly Asn Gly Phe Tyr Ile Ile Gly Ala His Thr Asp Ser 75 80 85 90 cct tgt ctc aaa ctc aag cct gtc acc aag gtt gtt aag gct ggg att 339 Pro Cys Leu Lys Leu Lys Pro Val Thr Lys Val Val Lys Ala Gly Ile 95 100 105 ttg gag gtt ggt gtc caa acc tat gga ggt ggt ctg tgg cac aca tgg 387 Leu Glu Val Gly Val Gln Thr Tyr Gly Gly Gly Leu Trp His Thr Trp 110 115 120 ttt gat cga gac ttg act gtg gcg ggg agg gtc atc gtg cgg gaa gag 435 Phe Asp Arg Asp Leu Thr Val Ala Gly Arg Val Ile Val Arg Glu Glu 125 130 135 aat gct ggt tct gtt tcg tac tca cat cgc ctt gtt aga att gag gaa 483 Asn Ala Gly Ser Val Ser Tyr Ser His Arg Leu Val Arg Ile Glu Glu 140 145 150 cct ata atg cga ata ccg act ttg gca att cac ttg gac aag act gtt 531 Pro Ile Met Arg Ile Pro Thr Leu Ala Ile His Leu Asp Lys Thr Val 155 160 165 170 aat gat gga ttc aaa ttt aac aac gag aat cac ctt att ccc atc ttg 579 Asn Asp Gly Phe Lys Phe Asn Asn Glu Asn His Leu Ile Pro Ile Leu 175 180 185 gca aca tcg ctg aag ggt gag ctc aat aaa gtg tcc tct gaa aat ggt 627 Ala Thr Ser Leu Lys Gly Glu Leu Asn Lys Val Ser Ser Glu Asn Gly 190 195 200 cct gtt gaa agt gga aat cag acc gat gga aag aaa gca aat gat aaa 675 Pro Val Glu Ser Gly Asn Gln Thr Asp Gly Lys Lys Ala Asn Asp Lys 205 210 215 aca ggc acc agc aat acg aag cat cac ctt ctt ctt cta cag ttg ctt 723 Thr Gly Thr Ser Asn Thr Lys His His Leu Leu Leu Leu Gln Leu Leu 220 225 230 gca agc aag ctt ggg tgt gaa cca gat gac ata tgt gat ttt gaa ttg 771 Ala Ser Lys Leu Gly Cys Glu Pro Asp Asp Ile Cys Asp Phe Glu Leu 235 240 245 250 caa gct tgc gat aca caa cca agt act att gct gga gct gca aag gaa 819 Gln Ala Cys Asp Thr Gln Pro Ser Thr Ile Ala Gly Ala Ala Lys Glu 255 260 265 ttc att ttt tca gga cgg ctt gat aat ctc tgc atg tca ttt tgc tcg 867 Phe Ile Phe Ser Gly Arg Leu Asp Asn Leu Cys Met Ser Phe Cys Ser 270 275 280 ctg aag gca tta ata gat gct aca tct tct gac agc agt ctt gag gaa 915 Leu Lys Ala Leu Ile Asp Ala Thr Ser Ser Asp Ser Ser Leu Glu Glu 285 290 295 gag tca ggt gtt aga atg gtg gct tta ttt gac cat gag gaa gtt gga 963 Glu Ser Gly Val Arg Met Val Ala Leu Phe Asp His Glu Glu Val Gly 300 305 310 tct aac tct gcc caa gga gct ggc tct cct gtt atg cta aat gct gtg 1011 Ser Asn Ser Ala Gln Gly Ala Gly Ser Pro Val Met Leu Asn Ala Val 315 320 325 330 act agg gtt acc aat tcc ttc agc tcc aat ccc aac ctt ctg gag aaa 1059 Thr Arg Val Thr Asn Ser Phe Ser Ser Asn Pro Asn Leu Leu Glu Lys 335 340 345 gca gca caa tta agc tac ctt gta tct gcc gac atg gca cat gca cta 1107 Ala Ala Gln Leu Ser Tyr Leu Val Ser Ala Asp Met Ala His Ala Leu 350 355 360 cac cca aat tac atg gac aag cat gaa gca aac cat cag ccc aaa cta 1155 His Pro Asn Tyr Met Asp Lys His Glu Ala Asn His Gln Pro Lys Leu 365 370 375 cat gga gga ctt gtc att aaa acc aat gca agc caa cgc tat gca acc 1203 His Gly Gly Leu Val Ile Lys Thr Asn Ala Ser Gln Arg Tyr Ala Thr 380 385 390 aat gtt gtc aca tcc ttc ata ttc agg gag ata gca tca aaa cat aaa 1251 Asn Val Val Thr Ser Phe Ile Phe Arg Glu Ile Ala Ser Lys His Lys 395 400 405 410 ctt ccc gtt cag gac ttt gtg gtg cgc aat gac atg tca tgt ggt tca 1299 Leu Pro Val Gln Asp Phe Val Val Arg Asn Asp Met Ser Cys Gly Ser 415 420 425 acc att ggt cct att ctt gct agt ggc gta ggt att cgc act gtt gat 1347 Thr Ile Gly Pro Ile Leu Ala Ser Gly Val Gly Ile Arg Thr Val Asp 430 435 440 gta ggt gca ccg cag ttg tca atg cat agc ata cga gaa att tgt gct 1395 Val Gly Ala Pro Gln Leu Ser Met His Ser Ile Arg Glu Ile Cys Ala 445 450 455 gtt gat gat gtg aag tat tca tat gag cac ttc aaa gca ttt tac caa 1443 Val Asp Asp Val Lys Tyr Ser Tyr Glu His Phe Lys Ala Phe Tyr Gln 460 465 470 gaa ttc tct cat gtt gat ggt aag atg gtc gtg gat ata tag gaatatctc 1494 Glu Phe Ser His Val Asp Gly Lys Met Val Val Asp Ile 475 480 485 taatcacgaa atcctcatta atcctttgct ctagaagctg ttgctgaaat ggtcgtgttt 1554 cgtaatttag taccattata atgccgacgt tattatgatg aaattttcaa taaaattaga 1614 ctccctgaat gaaatattag caactaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1657

【００６９】 <210> 3 <211> 357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <221> promoter <222> 0..357 <400> 3 cgcccaatac gcaaaccgcc tctccccgcg cgttggccgc ttcattaatg cagctggcac 60 gacaggtttc ccgactggaa agcgggcagt gagcgcaacg caattaatgt gagttagctc 120 actcattagg caccccaggc tttacacttt atgcttccgg atcgtatgtt gtgtggaatt 180 gtgagcggat aacaatttca cacaggaaac agctatgacc atgattacgc caagcttgca 240 tgcctgcagg tcgccctttc gtcttcaaga attcccctgt tgacaattaa tcatcgaact 300 agttaactag tacgcaagtt cacgtaaaaa gggtatcgat tagtaaggag gtttaaa 357

【００７０】 <210> 4 <211> 20 <212> PRT <213> Glycine max <400> 4 Ser Ala Gly Tyr His Gln Leu Ser Glu Arg Glu Val Trp Glu Leu Gln Pro Gly 1 5 10 15 Asn Lys 20

【００７１】 <210> 5 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 5 ctacacctga ctcatcgatc cacta 25

【００７２】 <210> 6 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 6 caggcttgag cttcagggat ggact 25

【００７３】 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 7 cgcccaatac gcaaaccgcc 20

【００７４】 <210> 8 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 8 tttaaacctc cttactaatc gataccc 27

【００７５】 <210> 9 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 9 ggaggtttaa aatggcggcg aagctagaca cc 32

【００７６】 <210> 10 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 10 gttgcagttc ccacaattcc c 21

【００７７】 <210> 11 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence : primer <400> 11 ggaggtttaa aatggctgct aaactggaca cc 32

【図面の簡単な説明】

【図１】 プラスミドpUCTRPGXN1-8の構築図である。

【図２】 ＧＸ発現プラスミドpUCTRPGX1-8の構築図で
ある。

【図３】 プラスミドpUCTRPGXN2-1の構築図である。

【図４】 ＧＸ発現プラスミドpUCTRPGX2-1の構築図で
ある。

フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ１２Ｎ 9/48 Ａ２３Ｌ 1/238 １０１Ｄ // Ａ２３Ｌ 1/238 １０１ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ (72)発明者 浅野 皆夫 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 中村 奈巳 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 (72)発明者 丹尾 式希 神奈川県川崎市川崎区鈴木町１−１ 味の 素株式会社食品総合研究所内 Ｆターム(参考） 4B024 AA05 BA14 CA04 DA06 EA04 GA11 GA19 HA01 HA12 4B039 LC06 LG26 4B050 CC03 DD13 FF13E LL02 4B065 AA26X AA88Y AB01 AC14 BA02 BA25 BB28 CA33 CA42

Claims (6)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 配列表配列番号１に記載されるアミノ酸
   配列を有する発芽ダイズ子葉由来の新規アミノペプチダ
   ーゼをコードするＤＮＡ。
2. 【請求項２】 配列表配列番号１に記載されるアミノ酸
   配列に於いて、１もしくは複数のアミノ酸残基が挿入、
   付加、欠失もしくは置換されたアミノ酸配列を有し、か
   つ、アミノペプチダーゼを活性を有するタンパク質をコ
   ードするＤＮＡ。
3. 【請求項３】 配列表配列番号２に記載される塩基配列
   のうち、塩基番号22から1482の塩基配列を有する請求項
   １に記載のＤＮＡ。
4. 【請求項４】 請求項１〜３のいずれかに記載のＤＮＡ
   を含有する組換えＤＮＡ。
5. 【請求項５】 請求項４に記載の組換えＤＮＡで形質転
   換された形質転換体。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の形質転換体を培養し、
   アミノペプチダーゼ活性を有するタンパク質を生産さ
   せ、これを回収することを特徴とするアミノペプチダー
   ゼ活性を有するタンパク質の製造方法。