BRPI0406855B1

BRPI0406855B1 - Métodos para produzir um beta-éster de alfa-l-aspartil-l-fenilalanina e para produzir um alfa-éster metílico de alfa-l-aspartil-l-fenilalanina

Info

Publication number: BRPI0406855B1
Application number: BRPI0406855-6A
Authority: BR
Inventors: Kenzo Yokozeki; Ayako Ohno; Seiichi Hara; Isao Abe
Priority date: 2003-01-24
Filing date: 2004-01-23
Publication date: 2014-02-25
Also published as: US8389240B2; US20100279343A1; US20120301918A1; US8034584B2; US20090191600A1; EP2180061B1; EP2166109A1; EP2180061A1; PL377835A1; US7361458B2; US8361748B2; EP2157188B1; US20050124035A1; US20120295304A1; US20120003692A1; EP2157188A1; CA2512442C; EP2180060A1; EP2180059A1; PL209701B1

Description

“MÉTODOS PARA PRODUZIR UM BETA-ÉSTER DE ALFA-L- ASPARTIL-L-FENILALANINA E PARA PRODUZIR UM ALFA-ÉSTER METÍLICO DE ALFA-L-ASPARTIL-L-FENILALANINA” Campo Técnico A presente invenção refere-se a um método para produzir β- éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (também chamado como “αΈ-φ-ο- aspartil substituído)-L-fenilalanina (abreviação: α-ARP)) e a um método para produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina (também chamado éster metílico de α-L-aspartil-L-fenilalanina (abreviação: a-APM). Mais particularmente, a presente invenção refere-se a um método para produzir β- éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina, que é um intermediário importante para produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina (nome do produto: aspartame) que tem uma grande demanda como um adoçante, e a um método para produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina utilizando o método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina. Técnica antecedente Os métodos convencionalmente conhecidos para produzir a- éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina (a seguir, “a-APM” para abreviar em alguns casos) incluem um método de síntese química e um método de síntese enzimática. Como o método de síntese química, conhece-se um método para condensar um anidrido de ácido N-protegido L-aspártico com éster metílico de L-fenilalanina para sintetizar um APM N-protegido e eliminar o grupo N-protetor para obter APM, e como um método de síntese enzimática, conhece-se um método para condensar um ácido N-protegido L- aspártico com Éster metílico de L-fenilalanina para sintetizar um APM N- protegido e eliminar o grupo de N- proteção para obter APM. Em ambos os métodos, no entanto, as etapas de introduzir um grupo de proteção e eliminar o grupo de proteção são necessárias e os processos são muitos complicados.

Por outro lado, um método APM de produção em que nenhum grupo de N- proteção é usado foi estudado (ver publicação de patente japonesa No. H02- 015196 Gazette). No entanto, este método não é apropriado para produção industrial devido ao rendimento muito baixo do produto. Assim, sob estas circunstâncias, o desenvolvimento de métodos de produção industrial para aspartame em um custo inferior tem sido desejado.

Descrição da invenção É um objeto da presente invenção prover um método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina, que é um intermediário de um α-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina, de modo barato, fácil e com elevado rendimento sem precisar passar através de um método de síntese complexo. Além disso, é um objeto da presente invenção prover um método para produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina de modo fácil, barato e com alto rendimento.

Como um resultado de conduzir uma pesquisa extensiva em consideração com os objetos acima, os inventores da presente invenção verificaram que uma nova enzima ou uma substância contendo enzima recentemente descoberta é capaz de produzir seletivamente β-éster de a-L- aspartil-L-fenilalanina a partir de α,β-diéster de ácido L-aspártico e L- fenilalanina, e realizaram a presente invenção.

Ou seja, a presente invenção é como descrita abaixo. Método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina), compreendendo formar o β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina a partir de α,β-diéster de ácido L- aspártico e L-fenilalanina usando uma enzima ou substância contendo enzima que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [1] acima, em que a enzima ou substância contendo enzima é um tipo ou dois ou mais tipos selecionados dentre o grupo consistindo de uma cultura de um micróbio que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, uma célula microbiana separada da cultura e um produto de célula microbiana tratado do micróbio. O método para produzir β-éster de α-L-aspartil- L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2] acima, em que o micróbio é um micróbio pertencendo a um gênero selecionado dentre o grupo consistindo de Áeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacíer, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacülus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira, e Haliscomenobacter. O método para produzir β-éster de α-L-aspartil -L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2] acima, em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (A) ou (B): (A) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (B) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 23 a 616 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (C) ou (D): (C) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 21 a 619 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (D) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 21 a 619 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (E) ou (F) abaixo: (E) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, (F) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 23 a 625 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. 0 método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2] acima, em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (G) ou (H) abaixo: (G) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, (H) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 23 a 645 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (I) ou (J) abaixo: (I) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (J) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 26 a 620 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. 0 método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2] acima, em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (K) ou (L) abaixo: (K) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 27 da Listagem de Seqüências, (L) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos 18 a 644 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (M) ou (N) abaixo: (M) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (N) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. 0 método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-(P-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (O) ou (P) abaixo: (O) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (P) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com a reivindicação 2, em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (Q) ou (R) abaixo: (Q) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, (R) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [3], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (S) ou (T) abaixo: (S) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 23 da Listagem de Seqüências, (T) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2], em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (U) ou (V) abaixo: (U) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (V) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [2] acima, em que o micróbio é um micróbio transformado que é capaz de expressar uma proteína (W) ou (X) abaixo: (W) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, (X) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. [16] O método para produzir β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina (isto é, a-L-^-o-aspartil substituído)-L-fenilalanina) de acordo com [1] acima, em que a enzima é pelo menos uma selecionada dentre o grupo consistindo (A) a (X) abaixo: (A) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (B) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido números 21 a 619 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (D) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido números 21 a 619 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (E) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 18 da Listagem de Seqüências, (F) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 625 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (G) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, (H) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 645 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (I) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (J) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 26 a 620 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Sequências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (K) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Sequências, (L) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 18 a 644 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (M) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (N) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (O) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (P) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (Q) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 18 da Listagem de Seqüências, (R) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (S) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, (T) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (U) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (V) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (W) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e (X) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo. O método de produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina (isto é, éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina), compreendendo: uma etapa de reação de síntese de éster β-metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina (também chamado a-L-^-o-metil aspartil)-L- fenilalanina (abreviação: α-AMP)) por um método de produzir β-éster de a- L-aspartil-L-fenilalanina de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16; e uma etapa de reação de conversão de éster β-metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina (isto é, a-L-^-o-metil aspartil)-L-fenilalanina) em a-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina.

Pela presente invenção, β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina pode ser facilmente produzida. Pelo método da presente invenção, β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina pode ser produzido facilmente e em elevado rendimento com uso reduzido de métodos sintéticos complicados como a introdução / eliminação de grupos de proteção.

Além disso, pela presente invenção, α-éster metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina pode ser produzido facilmente, em elevado rendimento, e de modo barato.

Os outros objetos, aspectos e vantagens da presente invenção são especificamente descritos ou se tomarão evidentes a partir da seguinte descrição detalhada da invenção quando lida em conjunto com os desenhos anexos.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A figura 1 é um diagrama mostrando quantidades de enzimas que existem na fração do citoplasma (Cy) e uma fração de periplasma (Pe).

MELHOR MODO PARA REALIZAR A INVENÇÃO A seguir, a presente invenção será descrita na ordem de <1> Método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina 1. Método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina 2. Micróbios usados na presente invenção 3. Enzimas usadas na presente invenção e <2> Método de produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina. <1> Método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina 1. Método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina No método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina da presente invenção (a seguir também chamado “o método de produção de um peptídeo da presente invenção”), L-fenilalanina e α,β-diéster de ácido L- aspártico são deixados reagir na presença de uma enzima tendo uma atividade de formação de peptídeo descrita. Isto é, no método de produção de um peptídeo da presente invenção, um β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina é formado a partir de um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina usando uma enzima ou substância contendo enzima capaz de ligar seletivamente L-fenilalanina no sítio α-éster de α,β-diéster de ácido L- aspártico através de uma ligação peptídeo. A enzima ou substância contendo enzima capaz de seletivamente ligar L-fenilalanina no sítio α-éster de um α,β-diéster de ácido L-aspártico refere-se a uma enzima ou substância contendo enzima tendo capacidade ou atividade para catalisar uma reação em que, substancialmente, L-fenilalanina é não é capaz de realizar um ataque nucleofílico a um sítio β-éster de um a, α,β-diéster de ácido L-aspártico mas realiza um ataque nucleofílico a um sítio α-éster do mesmo apenas. Como mostrado no exemplo de referência abaixo, no entanto, uma enzima ou substância contendo enzima precisa ser obtida que tenha a capacidade de catalisar uma reação em que, substancialmente, L-fenilalanina não é capaz de realizar um ataque ao sítio α-éster de um α,β-diéster de ácido L-aspártico mas realizar um ataque nucleofílico sobre o sítio β-éster do mesmo apenas, contrário à capacidade acima mencionada, e que produz um α-éster de β-L- aspartil-L-fenilalanina (também chamado P-L-(a-o-aspartil substituído)-L- fenilalanina (abreviação: β-ARP) a partir de α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina. A fórmula de reação em que L-fenilalanina realiza o ataque nucleofílico no sítio α-éster de α,β-diéster de ácido L-aspártico para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina (α-ARP) é mostrada na seguinte formula (I-a) (em que “Me” representa um grupo metila) por citação do caso em que éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico é usado como o α,β-diéster de ácido L-aspártico. Como mostrado na formula (I-a), no método de produção de peptídeo da presente invenção, o grupo amino de L-fenilalanina reage como o sítio do éster a- metílico do éster a, β dimetílico de ácido L- aspártico para formar uma ligação peptídeo. Por outro lado, a seguinte formula (Ι-β) indica uma reação em que o sítio de éster β- metílico de éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico sofre ataque nucleofílico para formar a- éster metílico de β-L-aspartil-L-fenilalanina (também chamado β-ί-(α-ο- metil aspartil)-L-fenilalanina (abreviação: β-ΑΜΡ)). A ligação peptídeo em β- AMP é formada no sítio éster β-metílico do éster α,β-dimetílico de ácido L- aspártico. A enzima ou substância contendo enzima usada na presente invenção acelera substancialmente somente uma reação como na fórmula (Ι- α) mas não causa substancialmente reação como na fórmula (Ι-β). α-ΑΡΜ pode ser produzido a partir de α-AMP através de uma etapa de reação simples (formula (Π)), mas α-APM não pode ser produzido diretamente a partir de β- ΑΜΡ. Isto é, o método da presente invenção é extremamente eficaz como um método para produzir intermediário de α-APM e é utilizável para produção industrial. Fórmula de reação I-a Fórmula de reação Ι-β Fórmula de reação II

Um método para permitir uma enzima ou substância contendo enzima atuar sobre α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina por ser realizado por misturação da enzima ou substância contendo enzima com α,β- diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina. Mais especificamente, pode-se usar um método em que a enzima ou substância contendo enzima é adicionada a uma solução contendo diéster de ácido L-aspártico e L- fenilalanina para efetuar a reação. Quando um micróbio que produz a enzima é usado como a substância contendo enzima, ou a reação pode ser realizada como descrito acima, ou um método que inclui o cultivo de um micróbio que produz a enzima para produzir e acumular a enzima no micróbio ou um líquido de cultura em que o micróbio foi cultivado, e adicionar um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina ao líquido de cultura, ou o método semelhante podem ser usados. O assim produzido β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina é recuperado de acordo com o método convencional e pode ser purificado, se necessário. A “substância contendo enzima” pode ser qualquer substância desde que ela contenha a enzima, e modos específicos incluem uma cultura de um micróbio que produz a enzima, uma célula microbiana separada da cultura e um produto de célula microbiana tratado do micróbio. A cultura de micróbio significa uma substância obtida por cultivo de um micróbio, e especificamente significa uma mistura de célula microbiana, um meio usado para cultivo do micróbio e uma substância produzida pelo micróbio cultivado, e assim em diante. Além disso, a célula microbiana pode ser lavada para usar como uma célula microbiana lavada. Além disso, o produto de célula microbiana tratado inclui as obtidas ao se submeter a célula microbiana a esmagamento, lise, ou secagem por congelamento e também uma enzima crua recuperada por tratamento da célula microbiana e uma enzima purificada obtida por outra purificação. Como a enzima tratada por purificação, uma enzima parcialmente purificada obtida por vários métodos de purificação e outros pode ser usada. Além disso, enzimas imobilizadas que foram imobilizadas por um método de ligação covalente, um método de adsorção, um método de aprisionamento, ou outros, podem ser usadas. Além disso, para usar alguns micróbios, uma porção das células microbianas pode sofrer lise durante o cultivo e, em tal caso, o sobrenadante do líquido de cultura pode ser usado como a substância contendo enzima também.

Além disso, como o micróbio que contém a enzima, uma cepa selvagem pode ser usada ou uma cepa recombinante de gene em que a enzima foi expressada, pode ser usada. Este micróbio não é limitado a uma célula microbiana de enzima mas os produtos de célula microbiana tratados como célula microbiana tratada com acetona e célula microbiana secada por congelamento podem ser usadas. Além disso, as células microbianas imobilizadas obtidas por imobilização do produto de célula microbiana tratado usando um método de ligação covalente, um método de adsorção, um método de aprisionamento, ou outros, ou um produto de célula microbiana tratado imobilizada pode ser usada. O uso de uma cepa selvagem que é capaz de produzir uma enzima formando peptídeo tendo uma atividade para formar o β-éster de a-L- aspartil-L-fenilalanina é preferido em que a produção de peptídeo pode ser realizada mais prontamente sem precisar passar através de uma etapa para fazer uma cepa recombinante de gene. Por outro lado, uma cepa recombinante de gene que foi transformada de modo a expressar uma enzima formadora de peptídeo tendo uma atividade para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina pode ser modificada de modo que a enzima formadora de peptídeo é produzida em uma maior quantidade. Assim, é possível sintetizar um β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina em uma maior quantidade e em uma taxa maior. O cultivo de um micróbio de cepa selvagem ou cepa recombinante de gene em um meio para acumular a enzima formadora de peptídeo no meio e/ou micróbio, e misturar o produto assim acumulado com um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina pode formar um β-éster de a-L-aspartil-L-fenilalanina.

Note-se que quando os produtos cultivados, células microbianas cultivadas, células microbianas lavadas e produtos com célula microbiana tratada obtidos submetendo-se as células microbianas a esmagamento ou lise são usados, é com freqüência o caso em que uma enzima existe que decompõe o β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina formado sem estar envolvido na formação d β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina. Em tal caso, prefere-se, em algumas ocasiões adicionar um inibidor de protease de metal como ácido etilenodiaminetetraacético (EDTA). A quantidade de adição está na faixa de 0,1 milimolares (mM) a 300 mM, preferivelmente 1 mM a 100 mM. A quantidade de enzima ou substância contendo enzima usada pode ser suficiente se uma quantidade em que o efeito de marcação é demonstrado (quantidade eficaz). Apesar do versado na técnica poder facilmente determinar esta quantidade eficaz através de uma experimentação preliminar simples, a quantidade de uso é, por exemplo, cerca de 0,01 a cerca de 100 unidades (“U”) no caso de usar enzima, e cerca de 0,1 a cerca de 500 g/L no caso de usar células microbianas lavadas. Note-se que 1 U é definido como sendo a quantidade de enzima que permite a produção de 1 micromol (pmole) de éster β-metílico de L-a-aspartil-L-fenilalanina a partir de 100 mM éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico e 200 mM L-fenilalanina a 25°C em um minuto. O α,β-diéster de ácido L-aspártico a ser usado na reação pode ser qualquer um que seja condensado com L-fenilalanina para produzir um β- éster de L-aspartil-L-fenilalanina. Exemplos do α,β-diéster de ácido L- aspártico incluem éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico e α, β éster dietílico de ácido L-aspártico. Quando o éster α,β-dimetílico de ácido L- aspártico e L-fenilalanina são deixados reagir, éster β-metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina (α-AMP) é produzido, e quando α, β éster dietílico de ácido L-aspártico e L-fenilalanina são reagidos, β- éster etílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina (também chamado a-L-^-o-etil aspartil)-L- fenilalanina (abreviação: α-AEP)) é produzido.

Apesar das concentrações de α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina servindo como materiais de partida serem cada 1 mM a 10 mM, e preferivelmente 0,05 M a 2 M, existem casos em que é preferível adicionar ou um dos substratos em uma quantidade equimolar ou mais com relação ao outro substrato, e a seleção é feita como necessário. Além disso, em casos onde elevadas concentrações de substratos inibem a reação, estas podem ser ajustadas a concentrações que não provocam inibição e são sucessivamente adicionadas durante a reação. A temperatura de reação que permite a produção de β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina é 0 a 60°C, e preferivelmente 5 a 40°C. Além disso, o pH da reação que permite a produção de β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina é 6,5 a 10,5, e preferivelmente 7,0 a 10,0, 2. Micróbios usados na presente invenção Como os micróbios a serem usados na presente invenção, os micróbios que tem uma capacidade de produzir β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina a partir de um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina pode ser usado sem particular limitação. Os micróbios que tem uma capacidade de produzir β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina a partir de um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina incluem, por exemplo, micróbios pertencendo aos gêneros Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marimlabilia, Lewinella, Saprospira, e Haliscomenobacter.

Especificamente os seguintes podem ser exemplificados Aeromonas hydrophila ATCC 13136 Azotobacter vinelandii IFO 3741 Alcaligenes faecalis FERM P-8460 Brevibacterium minutiferuna FERM BP-8277 Corynebacterium flavescens ATCC 10340 Escherichia coli FERM BP-8276 Empedobacter brevis ATCC 14234 Flavobacterium resinovorum ATCC 14231 Microbacterium arborescens ATCC 4348 Propionibacterium shermanii FERM BP-8100 Brevibacillus parabrevis ATCC 8185 Paenibacillus alvei IFO 14175 Pseudomonas fragi IFO 3458 Serratia grimesii ATCC 14460 Stenotrophomonas maltophilia ATCC 13270 Sphingobactemm sp. FERM BP-8124 Streptomyces griseolus NRRL B-1305 (Streptomyces lavendulae) Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568 Williopsis satumus IFO 0895 Candida magnoliae IFO 0705 Geotrichum fragrance CBS 152,25 (iGeotrichum amycelium) Geotrichum amycelium IFO 0905 Pichia ciferrii IFO 0905 Saccharomyces unisporus IFO 0724 Torulaspora delbrueckii IFO 0422 Cellulophaga lytica NBRC 14961 Weeksella virosa NBRC 16016 Pedobacter heparinus NBRC 12017 Persicobacter dijfluens NBRC 15940 Flexithrix dorotheae NBRC 15987 Chitinophaga pinensis NBRC 15968 Cyclobacterium marinum ATCC 25205 Runella slithyformis ATCC 29530 Thermonema lapsum ATCC 43542 Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 Gelidibacter algens ATCC 700364 Dyadobacter fermentam ATCC 700827 Flammeovirga aprica NBRC 15941 Spirosoma linguale DSMZ 74 Flectobacillus major DSMZ 103 Tenacibaculum maritimum ATCC 43398 Rhodotermus marinus DSMZ 4252 Zobellia galactanivorans DSMZ 12802 Muricauda ruestringensis DSMZ 13258 Salegentibacter salegens DSMZ 5424 Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 Cytophaga hutchinsonii NBRC 15051 Mannilabilia salmonicolor NBRC 15948 Lewinella cohaerens ATCC 23123 Saprospira grandisATCC 23119 Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 Dentre as cepas acima mencionadas de micróbios, os micróbios descritos com números FERM foram depositados junto à corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão), e podem ser fornecidos por referência a cada número.

Dentre as cepas acima mencionadas de micróbios, os micróbios descritos com números ATCC foram depositados junto ao American Type Culture Collection (P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), e podem ser fornecidos por referência a cada número.

Dentre as cepas acima mencionadas de micróbios, os micróbios descritos com números IFO foram depositados junto ao Institute of Fermentation, Osaka (2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão), e podem ser fornecidos por referência a cada número.

Dentre as cepas acima mencionadas de micróbios, os micróbios descritos com os números NBRC foram depositados junto ao NITE

Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation (5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão), e podem ser fornecidos por referência a cada número.

Dentre as cepas acima mencionadas de micróbios, os micróbios descritos com números DSMZ foram depositados junto ao Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células) (Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), e podem ser fornecidos por referência a cada número.

Como as cepas acima mencionadas, os micróbios descritos com números FERM são micróbios que foram depositados junto à corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566 Japão). Alcaligenes faecalis FERM P-8460 é um micróbio que foi depositado em 30 de setembro de 1985 e atribuído o número de depósito FERM P-8460, Propionibacterium shermanii FERM P-9737 é um micróbio que foi originalmente depositado em 4 de dezembro de 1987 e o controle deste organismo foi subsequentemente transferido para depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em Io. de julho de 2002 e foi atribuído o número de depósito of FERM BP-8100, Xanthomonas maltophilia FERM BP-5568 é um micróbio que foi originalmente depositado em 14 de junho de 1995 e o controle deste organismo foi subsequentemente transferido para depósito internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 14 de junho de 1996, Brevíbacterium minutiferuna FERM BP-8277 foi intemacionalmente depositado sob as provisões do Tratado de Budapeste em 20 de janeiro de 2002, Escherichia coli FERM BP-8276 foi depositado em uma instituição depositária internacional sob as provisões do Tratado de Budapeste em 22 de janeiro de 2002, Empedobacter brevis cepa ATCC 14234 (cepa FERM P- 18545, cepa FERM BP-8113) foi depositado junto ao Depositário do Organismo de Patente Internacional da corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) em 1 de outubro de 2001 e atribuído o número de depósito de FERM P-18545, O controle deste organismo foi subsequentemente transferido para depósito sob as provisões do Tratado de Budapeste junto ao Depositário do Organismo de Patente Internacional da corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology em 8 de julho de 8, 2002 e foi atribuído o número de depósito FERM BP-8113 (indicação de micróbio: Empedobacter brevis cepa AJ 13933).

Sphingobacterium sp. cepaAJ 110003 foi depositado junto ao Depositário do Organismo de Patente Internacional da corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1- 1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão) em 22 de julho de 2002, e foi atribuído o número de depósito FERM BP-8124.

Nota-se que a cepa AJ 110003 (FERM BP-8124) foi identificada para ser a acima mencionada Sphingobacterium sp. pela experiência de identificação descrita abaixo. A cepa FERM BP-8124 é um bastão Gram-negativo (0,7 a 0,8 x 1,5 a 2,0 μιη) que não forma esporo e não é mótil. Suas colônias são redondas com uma borda completamente lisa, contém poucas protuberâncias e tem uma cor amarelo claro, brilhante. O organismo cresce a 30°C e é positivo para catalase, positivo para oxidase e negativo para o teste OF (glucose), e foi identificado como uma bactéria pertencendo ao gênero Sphingobacterium com base nestas propriedades.

Além disso, devido às propriedades, ele é negativo para redução de nitrato, negativo para produção de indol, negativo para produção de ácido a partir de glucose, negativo para arginina dihidrolase, positivo parauréase, positivo para hidrólise de esculina, negativo para hidrólise de gelatina, positivo para β- galactosidase, positivo para assimilação de glucose, negativo para assimilação de L-arabinose, positivo para assimilação de D-manose, negativo para assimilação de D-manitol, positivo para assimilação de N-acetil-D- glucosamina, positivo para assimilação de maltose, negativo para assimilação de potássio, negativo para assimilação de ácido n-caprico, negativo para assimilação de ácido adípico, negativo para assimilação de ácido dl-málico, negativo para assimilação de citrato de sódio, negativo para assimilação de acetato de fenila e positivo para citocromo oxidase, e foi determinado como tendo propriedades que são similares às de Sphingobacterium multivorum ou Sphingobacterium spiritivorum. Além disso, apesar dos resultados de análise sobre a homologia da sequência de base do gene 16S rRNA indicarem, um maior grau de homologia foi demonstrado com Sphingobacterium multivorum (98,8%), não existiu nenhuma cepa que se igualou a uma cepa bactérias na completamente. Conseqüentemente, esta cepa bactérias na foi assim identificada como Sphingobacterium sp.

Como estes micróbios, ou cepas selvagens ou cepas mutantes podem ser usadas ou cepas recombinantes induzidas por fusão de células ou técnicas genéticas como manipulação genética podem ser usadas.

Para obter células microbianas destes micróbios, os micróbios podem ser cultivados e crescidos em um meio apropriado. Não se tem restrição particular ao meio usado para este fim, desde que ele deixe os micróbios crescerem. Este meio pode ser um meio comum contendo fontes de carbono comuns, fontes de nitrogênio, fontes de fósforo, fontes de enxofre, ions inorgânicos, e fontes de nutrientes orgânicos como necessário.

Por exemplo, qualquer fonte de carbono pode ser usada desde que os micróbios possam utilizar a mesma. Os exemplos específicos de fonte de carbono que pode ser usada incluem açúcares, como glucose, fructose, maltose e amilose, álcoois como sorbitol, etanol e glicerol, ácidos orgânicos, como ácido fumárico, ácido cítrico, ácido acético e ácido propiônico e seus sais, hidrocarbonetos como parafina, assim como misturas dos mesmos.

Exemplos de fontes de nitrogênio que podem ser usadas incluem sais de amônio de ácidos inorgânicos, como sulfato de amônio e cloreto de amônio, sais de amônio de ácidos orgânicos como fumarato de amônio e citrato de amônio, nitratos como nitrato de sódio e nitrato de potássio, compostos orgânicos de nitrogênio, como peptonas, extrato de levedura, extrato de carne, licor de milho, assim como misturas dos mesmos.

Além disso, as fontes de nutrientes usadas em meios comuns, como sais inorgânicos, sais de metal de traço, e vitaminas, podem ser misturadas de modo apropriado e usadas. Não se tem uma restrição particular sobre as condições de cultura, e a cultura pode ser realizada, por exemplo, durante cerca de 12 a cerca de 48 horas enquanto controlando de modo apropriado o pH, e a temperatura em uma faixa de pH de 5 a 8 e uma faixa de temperatura de 15 a 40°C, respectivamente, sob condições aeróbicas. 3. Enzimas usadas na presente invenção Em um método para produzir peptídeo de acordo com a presente invenção descrita acima, uma enzima que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina ao sítio α-éster de um α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo é usada. No método para produzir peptídeo de acordo com a presente invenção, a enzima não é limitada por sua origem e um método de procura, desde que ela tenha esta atividade. A seguir, purificação das enzimas usadas na presente invenção e utilização de técnicas de engenharia genética serão explicadas. 3-1) Micróbios tendo uma enzima que pode ser usada para o método de produção da presente invenção Como micróbios que produzem uma enzima da presente invenção, todos os micróbios que tem uma capacidade para produzir β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina a partir de um α,β-diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina podem ser usados. Os micróbios incluem bactérias e semelhantes que pertencem aos gêneros selecionados dentre o grupo consistindo de Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weéksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegeníibacíer, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira, e Haliscomenobacter. Mais especificamente, os micróbios incluem Empedobacter brevis ATCC 14234 (cepa FERM P-18545, cepa FERM BP- 8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002)), Sphingobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002), Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão), Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária;

American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O.

Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), e Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) e assim em diante.

Empedobacter brevis cepa ATCC 14234 (cepa FERM P-18545, cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002)) e Sphingobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002), Pedobacter heparinus cepa IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão), Taxeobacter gelupurpurascens cepa DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), Cyclobacterium marinum cepa ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; PO. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), e Psycloserpens burtonensis cepa ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) e semelhantes são micróbios selecionados pelos presentes inventores como um resultado da pesquisa de micróbios produzindo enzimas que produzem um β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina a partir de α,β- diéster de ácido L-aspártico e L-fenilalanina em elevado rendimento. (3-2) Purificação de enzimas Como foi previamente mencionado, a enzima formadora de peptídeo usada na presente invenção pode ser purificada a partir de bactérias pertencendo, por exemplo ao gênero Empedobacter. Um método para isolar e purificar uma enzima formadora de peptídeo a partir de Empedobacter brevis é explicada como um exemplo da purificação da enzima.

Primeiro, um extrato de célula microbiana é preparado a partir de células microbianas de Empedobacter brevis, por exemplo, a cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) por ruptura das células usando um método físico como esmagamento ultrassônico ou um método enzimático usando uma enzima dissolvendo a parede celular e removendo a fração insolúvel por separação por centrifugação e assim em diante. A enzima produtora de peptídeo pode ser então purificada por fracionamento do extrato de células obtido no modo acima por combinação de métodos de purificação de proteína comuns como cromatografia de troca de ânions, cromatografia de troca de cátions ou cromatografia de filtração de gel.

Um exemplo de um veículo para uso em cromatografia de troca aniônica é Q-Sepharose HP (fabricado por Amersham). A enzima é recuperada na fração não adsorvida sob condições de pH 8,5 quando o extrato de célula contendo uma enzima é deixado passar através de uma coluna compactada com o veículo.

Um exemplo de um veículo para uso em cromatografia de troca catiônica é MonoS HR (fabricado por Amersham). Após adsorver a enzima sobre a coluna ao deixar o extrato celular contendo a enzima passar através de uma coluna compactada com o veículo e então lavar a coluna, a enzima é eluída com uma solução de tampão tendo uma concentração de sal elevada. Neste momento, a concentração de sal pode ser sequencialmente aumentada ou uma gradiente de concentração pode ser aplicado. Por exemplo, no caso de usar MonoS HR, a enzima adsorvida sobre a coluna é eluída em uma concentração de NaCl de cerca de 0,2 a cerca de 0,5 M. A enzima purificada no modo descrito acima pode ser então ainda uniformemente purificada por cromatografia de filtragem de gel e assim em diante. Um exemplo do veículo para uso em cromatografia de filtragem de gel é Sephadex 200pg (fabricado por Amersham).

No procedimento de purificação acima mencionado, a fração contendo a enzima pode ser verificada por teste da atividade formadora de peptídeo de cada fração de acordo com o método indicado nos exemplos a ser descrito abaixo. A seqüência de aminoácido interna da enzima purificada no modo descrito acima é mostrada em SEQ ID NO: 1 e SEQ ID NO: 2 da Listagem de Sequências. (3-3) Isolamento de DNA, Produção de Transformante e Purificação de enzima formadora de peptídeo (3-3-1) Isolamento de DNA

Os inventores da presente invenção primeiro tiveram sucesso no isolamento de um tipo de DNA de uma enzima formadora de peptídeo que pode ser usada no método de produção de peptídeo da presente invenção de Empedobacier brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Cirno Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002).

Um DNA tendo uma seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1908 da seqüência de base descrita em SEQID NO: 5, que é um DNA da presente invenção, foi isolado de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002). O DNA tendo a seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1908 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1908 está contida uma região de seqüência de sinal e uma região de proteína madura. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 61 a 126, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 127 a 1908. Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 5 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumido como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 127 a 1908, ou seja o sítio de éster excluindo o peptídeo líder, é presumido como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo. O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1917 descrita em SEQ ID NO: 11, que é também um DNA da presente invenção, foi isolado de Sphingobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002). O DNA consistindo da sequência de base que consiste de números de bases 61 a 1917 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na sequência de base consistindo de números de bases 61 a 1917, uma região de seqüência de sinal e uma região de proteína madura estão contidas. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 61 a 120, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 121 a 1917. Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 11 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumido como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 121 a 1917, ou seja a porção excluindo o peptídeo líder, é presumido como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo. O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1935 descrita em SEQ ID NO: 17, que é também um DNA da presente invenção, foi isolado de Pedobacter heparinus cepa IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão). O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1935 descrita em SEQ ID NO: 17 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1935, uma região de sequência de sinal e uma região de proteína madura estão contidas. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 61 a 126, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 127 a 1935, Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 17 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumido como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 127 a 1935, ou seja a porção excluindo o peptídeo líder, é presumido como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo. O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1995 descrita em SEQ ID NO: 22, que é também um DNA da presente invenção, foi isolado de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1995 descrita em SEQ ID NO:22 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1995, uma região de seqüência de sinal e uma região de proteína madura estão contidas. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 61 a 126, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 127 a 1995, Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 22 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumido como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 127 a 1995, ou seja a porção excluindo o peptídeo líder, é presumida como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo. O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 29 a 1888 descrita em SEQ ID NO: 24, que é também um DNA da presente invenção, foi isolado de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 29 a 1888 descrita em SEQ ID NO:24 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na seqüência de base consistindo de números de bases 29 a 1888, uma região de seqüência de sinal e uma região de proteína madura estão contidas. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 29 a 103, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 104 a 1888. Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 24 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumida como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 104 a 1888, ou seja a porção excluindo o peptídeo líder, é presumido como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo. O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1992 descrita em SEQID NO: 26, que é também um DNA da presente invenção, foi isolado de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). O DNA consistindo da seqüência de base que consiste de números de bases 61 a 1992 descrita em SEQ ID NO:26 é uma porção da seqüência de código (CDS). Na seqüência de base consistindo de números de bases 61 a 1992, uma região de seqüência de sinal e uma região de proteína madura estão contidas. A região de seqüência de sinal é uma região que consiste de números de bases 61 a 111, enquanto a região de proteína madura é uma região que consiste de números de bases 112 a 1992, Ou seja, a presente invenção provê tanto um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo que contém uma seqüência de sinal, como um gene para uma proteína de enzima formadora de peptídeo na forma de uma proteína madura. A seqüência de sinal contida na seqüência descrita em SEQ ID NO: 26 é um tipo de seqüência líder. A função principal de um peptídeo líder codificado pela seqüência líder é presumida como sendo a excreção de dentro da membrana de célula para fora da membrana de célula. A proteína codificada por números de bases 112 a 1992, ou seja a porção excluindo o peptídeo líder, é presumido como sendo uma proteína madura e demonstra um alto grau de atividade formadora de peptídeo.

Além disso, as várias técnicas de recombinação de genes indicadas abaixo podem ser realizadas de acordo com as descrições em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989) e outras publicações.

Um DNA codificando uma enzima que pode ser usada na presente invenção pode ser adquirido por reação de cadeia polimerase (PCR, fazer referência a White, T.J. et al., Trends Genet., 5, 185 (1989)) ou hibridização de um DNA cromossômico ou uma coleção de DNA de Empedobacter brevis, Sphingobacterium sp., Pedobacter heparinus, Taxeobacter gelupurpurascens, Cyclobacterium marinum, ou Psychroserpens burtonensis. Iniciadores usados em PCR podem ser projetados com base nas seqüências de base de aminoácido internas determinadas com base em enzima formadora de peptídeo purificada como explicado na seção anterior (3). Além disso, porque as seqüências de bases dos genes de enzima formadora de peptídeo (SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO:22, SEQ ID NO:24, e SEQ ID NO:26) foram identificadas pela presente invenção, os iniciadores ou sondas de hibridização podem ser projetadas com base nestas seqüências de base, e o gene pode ser isolado usando as sondas.

Se os iniciadores tendo as seqüências correspondendo à região 5’ não traduzida e à região 3’ não traduzida, respectivamente, são usados como iniciadores de PCR, a região codificada de comprimento completo de uma enzima pode ser amplificada. Tomando como um exemplo o caso de amplificação de uma região contendo tanto a seqüência líder como uma região codificando uma proteína madura como descrito em SEQ ID NO: 5, exemplos específicos de iniciadores incluem um iniciador tendo uma seqüência de base da região a montante de número de base 61 em SEQ ID NO: 5 para o iniciador 5’ lateral, e um iniciador tendo uma seqüência complementar à seqüência de base da região a jusante de número de base 1908 para o iniciador 3’ lateral.

Os iniciadores podem ser sintetizados, por exemplo, de acordo com métodos comuns usando o método fosfoamidito (fazer referência a Tetrahedron Letters (1981), 22, 1859) pelo uso do sintetizador de DNA modelo 380B fabricado por Applied Biosystems. A reação PCR pode ser realizada, por exemplo, usando o sistema de PCR Gene Amp PCR 9600 (Perkin-Elmer) e o kit de clonagem in vitro PCR Takara LA (Takara Shuzo) de acordo com o método especificado pelo fornecedor como o fabricante.

Um DNA que codifica uma enzima que pode ser usada no método de produção de peptídeo da presente invenção, sem levar em conta se o DNA contém sequência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 5 da Listagem de Sequências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQ ID NO: 5 da Listagem de Seqüências ou com uma sonda preparada a partir de uma seqüência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA. O DNA da presente invenção, sem levar em conta se ele contém uma seqüência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 11 da Listagem de Seqüências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQ ID NO: 11 da Listagem de Seqüências ou com uma sonda preparada a partir de uma seqüência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA. O DNA da presente invenção, sem levar em conta se ele contém uma seqüência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 17 da Listagem de Seqüências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza com um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQID NO: 17 da Listagem de Sequências ou com uma sonda preparada a partir de uma sequência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA. O DNA da presente invenção, sem levar em conta se ele contém uma seqüência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 22 da Listagem de Seqüências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza com um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQ ID NO: 22 da Listagem de Seqüências ou com uma sonda preparada a partir de uma seqüência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA. O DNA da presente invenção, sem levar em conta se ele contém uma seqüência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 24 da Listagem de Seqüências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza com um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQ ID NO: 24 da Listagem de Seqüências ou com uma sonda preparada a partir de uma seqüência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA. O DNA da presente invenção, sem levar em conta se ele contém uma seqüência líder ou não, inclui um DNA que é substancialmente idêntico ao DNA consistindo do CDS descrito em SEQ ID NO: 26 da Listagem de Seqüências. Ou seja, um DNA substancialmente idêntico ao DNA da presente invenção pode ser obtido por isolamento de um DNA que hibridiza com um DNA consistindo de uma seqüência de base complementar ao CDS descrito em SEQID NO: 26 da Listagem de Seqüências ou com uma sonda preparada a partir de uma seqüência de base sob condições estringentes e codifica uma proteína tendo atividade formadora de peptídeo a partir de um DNA codificando a enzima mutante ou células que possuem este DNA.

Uma sonda pode ser produzida, por exemplo, de acordo com métodos estabelecidos com base em, por exemplo, a seqüência de base descrita em SEQ ID NO: 5 da Listagem de Seqüências. Além disso, um método para isolar um DNA de marcação por uso de uma sonda para encontrar um DNA que hibridiza com a sonda também pode ser realizado de acordo com métodos estabelecidos. Por exemplo, uma sonda de DNA pode ser produzida por amplificação de uma seqüência de base clonada em um vetor plasmídeo ou fago, clivando uma seqüência de base que se deseja usar como uma sonda com uma enzima de restrição e então extraindo a seqüência de base desejada. A porção a ser clivada pode ser ajustada dependendo do DNA de marcação. O termo "sob uma condição estringente" como usado aqui refere-se a uma condição em que um assim chamado híbrido específico é formado mas não é formado um híbrido não específico. É difícil expressar com precisão esta condição em valores numéricos. Por exemplo, menção pode ser feita de uma condição sob a qual os DNAs tendo homologias elevadas, por exemplo, 50% ou mais, preferivelmente 80% ou mais, mais preferivelmente 90% ou mais, hibridizam um com o outro e DNAs tendo homologias menores do que as que não hibridizam um com o outro, ou condições comuns para enxágüe em hibridização Southern em que a hibridização é realizada a 60°C em uma concentração de sal correspondendo a lxSSC e 0,1% SDS, preferivelmente 0,lxSSC e 0,1% SDS. Apesar dos genes que hibridizam sob estas condições incluírem estes genes nos códons de parada terem ocorrido em algumas localizações ao longo de suas seqüências ou que perderam atividade devido a uma mutação no centro ativo, estes podem ser facilmente removidos por ligação dos mesmos a um vetor de expressão comercialmente disponível, expressando os mesmos em um hospedeiro apropriado, e testando uma atividade de enzima do produto de expressão usando um método a ser descrito abaixo.

No entanto, no caso de uma seqüência de base que hibridiza sob condições estringentes como descrito acima, é preferível que a proteína codificada por esta seqüência de base retenha cerca de metade ou mais, preferivelmente 80% ou mais, e mais preferivelmente 90% ou mais, de atividade de enzima da proteína tendo a seqüência de aminoácidos codificada pela seqüência de base original servindo como a base a ser retida sob condições de 50°C e pH 8. Por exemplo, quando explicado para o caso de, por exemplo, uma seqüência de base que hibridiza sob condições estringentes com um DNA que tem uma seqüência de base complementar a uma seqüência de base consistindo de números de bases 127 a 1908 da seqüência de base descrita em SEQ ID NO: 5, é preferível que a proteína codificada por esta seqüência de base retenha cerca da metade ou mais, preferivelmente 80% ou mais, e mais preferivelmente 90% ou mais, da atividade de enzima da proteína tendo uma seqüência de aminoácidos que consiste de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 sob condições de 50°C e pH 8.

Uma seqüência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO: 5 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências. Uma seqüência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO: 11 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências. Uma seqüência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO.: 17 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências. Uma seqüência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO: 22 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências.

Uma sequência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO: 24 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências. Uma seqüência de aminoácidos codificada por CDS descrito em SEQ ID NO: 26 da Listagem de Seqüências é mostrada em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 6 contém peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 22 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 23 a 616 constituindo a região de proteína madura.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 11 inclui um peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 20 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 21 a 619 constituindo a região de proteína madura.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 18 contém peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 22 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 23 a 625 constituindo a região de proteína madura.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 23 contém peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 22 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 23 a 645 constituindo a região de proteína madura.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 25 contém peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 25 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 26 a 620 constituindo a região de proteína madura.

A seqüência de aminoácidos completa descrita em SEQ ID NO: 27 contém peptídeo líder e uma região de proteína madura, com resíduos de aminoácidos números 1 a 17 constituindo o peptídeo líder, e resíduos de aminoácidos números 18 a 644 constituindo a região de proteína madura. A proteína codificada pelo DNA da presente invenção é uma proteína em que a proteína madura tem atividade formadora de peptídeo, e um DNA que codifica uma proteína substancialmente idêntica a uma proteína tendo a sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 25, ou SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, sem levar em conta se contém peptídeo líder ou não, é também incluído no DNA da presente invenção. (Note-se que, seqüências de base são especificadas de seqüências de aminoácidos de acordo com os códigos de códons universais.) Ou seja, a presente invenção provê DNAs que codificam proteínas indicadas em (A) a (X) abaixo: (A) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (B) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 616 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (C) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido números 21 a 619 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (D) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácido números 21 a 619 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (E) uma proteína tendo a sequência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, (F) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 625 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (G) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ Π) NO: 23 da Listagem de Seqüências, (H) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 23 a 645 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (I) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (J) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 26 a 620 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (K) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, (L) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos consistindo de resíduos de aminoácidos números 18 a 644 da seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (M) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, (N) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (O) uma proteína tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, (P) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (Q) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 18 da Listagem de Sequências, (R) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (S) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, (T) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (U) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, (V) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25 da Listagem de Seqüências, e atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio a- éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo, (W) uma proteína tendo uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e (X) uma proteína contendo uma região de proteína madura, tendo uma seqüência de aminoácidos na seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27 da Listagem de Seqüências, e tendo atividade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídeo.

Aqui, apesar do significado do termo “uma pluralidade” variar dependendo dos locais e tipos de resíduos de aminoácido na estrutura tri- dimensional da proteína, está entro de uma faixa que não prejudica de modo significante a estrutura tri-dimensional e atividade da proteína dos resíduos de aminoácido, e é especificamente 2 a 50, preferivelmente 2 a 30 e mais preferivelmente 2 a 10, No entanto, no caso de seqüências de aminoácidos incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos nas seqüências de aminoácidos da proteínas of (B), (D), (F), (H), (J), (L), (N), (P), (R), (T), (V) ou (X), é preferível que as proteínas retenham cerca de metade ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, e ainda mais preferivelmente 90% ou mais da atividade de enzima da proteínas no estado onde nenhuma mutação é incluída, sob condições de 50°C e pH 8. Por exemplo, explicação será feita no caso de (B); no caso da seqüência de aminoácidos (B) incluindo substituição, deleção, inserção, adição, e/ou inversão de um ou uma pluralidade de aminoácidos em uma seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, é preferível que esta proteína retenha cerca de da metade ou mais, mais preferivelmente 80% ou mais, e ainda mais preferivelmente 90% ou mais da atividade de enzima da proteína tendo a seqüência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6 da Listagem de Seqüências, sob condições de 50°C epH 8.

Uma mutação de um aminoácido como o indicado no acima mencionado (B) e outros é obtida por modificação da seqüência de base de modo que um aminoácido de um sítio éster específico no presente gene de enzima é substituído, deletado, inserido ou adicionada por, por exemplo mutagenese dirigida ao sítio éster. Além disso, um DNA modificado como o descrito acima também pode ser adquirido por tratamento de mutagenese conhecido na técnica. O tratamento de mutagenese refere-se a, por exemplo, um método em que um DNA codificando a presente enzima é tratado in vitro com hidroxilamina e assim em diante, assim como um método em que as bactérias Escherichia que possuem um DNA codificando a presente enzima são tratados por um mutagene normalmente usado em mutagenese artificial, como irradiação ultra-violeta, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina(NTG) ou ácido nitroso.

Além disso, mutações de ocorrência natural como diferenças atribuíveis a uma espécie ou cepa de micróbios também estão incluídos na base de substituição, deleção, inserção, adição e/ou inversão descritos acima.

Por expressão de um DNA tendo esta mutação em células apropriadas e investigando a atividade de enzima do produto de expressão, um DNA pode ser obtido que codifica uma proteína substancialmente idêntica à proteína descrita em SEQID NO: 6,12,18,23,25 ou 27 da Listagem de Seqüências. (3-3-2) Preparação de Transformantes e produção de enzimas formadoras de peptídeos Enzimas formadoras de peptídeos que podem ser usadas no método de produzir um peptídeo de acordo com a presente invenção podem ser produzidas por introdução do DNA explicado em (3-3-1) acima em um hospedeiro apropriado e expressando o DNA neste hospedeiro.

Com relação aos hospedeiros para expressar uma proteína especificada pelo DNA, exemplos dos hospedeiros que podem ser usados incluem várias células procarióticas incluindo bactérias Escherichia como Escherichia coli, bactérias Empedobacter, bactérias Sphingobacterium, bactérias Flavobacterium e Bacillus subtilis, assim como várias células eucarióticas incluindo Saccharomyces cerevisiae, Pichia stipitis e Aspergillus oryzae.

Um DNA recombinante usado para introduzir um DNA em um hospedeiro pode ser preparado por inserção do DNA a ser introduzido em um vetor correspondendo ao tipo de hospedeiro em que o DNA deve ser expressado, em tal forma que a proteína codificada pelo DNA possa ser expressada. No caso onde um promotor singular para um gene de enzima formadora de peptídeo de Empedobacter brevis e outros funciona nas células hospedeiras, o promotor pode ser usado como um promotor para expressar o DNA da presente invenção. Além disso, outro promotor que atua nas células hospedeiras pode ser ligado ao DNA da presente invenção, e o DNA pode ser expressado sob o controle do promotor, como necessário.

Exemplos de métodos de transformação para introduzir um DNA recombinante em células hospedeiras incluem o método de D.M.

Morrison (ver Métodos in Enzymology, 68, 326 (1979)) ou o método em que a permeabilidade do DNA é aumentada por tratamento das células microbianas do receptor com cloreto de cálcio (ver Mandei, H. e Higa, A., J.

Mol.Biol, 53,159(1970)).

No caso de produção em massa de uma proteína usando tecnologia de DNA recombinante, a conjugação da proteína dentro de um transformante que produz a proteína para formar um corpo de inclusão de proteína é também um modo preferível para realizar a presente invenção.

Vantagens desta e expressão e método de produção incluem proteção da proteína de marcação da digestão por proteases presentes dentro das células microbianas, e uma purificação simples e fácil da proteína de marcação por ruptura das células microbianas seguido por separação centrífuga e outros. O corpo de inclusão de proteína obtido deste modo é solubilizado com um desnaturante de proteína e a proteína é convertida em uma proteína fisiologicamente ativa, duplicada de modo apropriado, através de um procedimento de regeneração de atividade que consiste primariamente da remoção do desnaturante. Existem numerosos exemplos disto, incluindo regeneração da atividade de interleucina humana-2 (ver Publicação acessível ao público de pedido de patente japonesa No. S61-257931).

Para obter uma proteína ativa a partir de corpos de inclusão de, uma série de processamento incluindo a solubilização de regeneração da atividade são requeridas, e o procedimento é mais complexo do que no caso de produção de proteína ativa diretamente. No entanto, no caso de produzir uma proteína que tem um efeito prejudicial sobre o crescimento microbiano em volumes grandes dentro das células microbianas, este efeito pode ser suprimido por acúmulo de proteínas na forma de corpos de inclusão de proteína inativa dentro das células microbianas.

Exemplos de métodos de produção em massa para produzir uma proteína de marcação na forma de corpos de inclusão incluem um método em que a proteína de marcação é expressada independentemente sob o controle de um promotor poderoso, e um método em que a proteína de marcação é expressada na forma de uma proteína fundida com uma proteína que é conhecida como sendo expressada em um volume grande. A seguir, a presente invenção será explicada mais especificamente tomando como exemplo um método para produzir Escherichia coli transformando e usando o micróbio acima transformado para produzir uma enzima formadora de peptídeo. Além disso, no caso de produzir enzima formadora de peptídeo em um micróbio como Escherichia coli, um DNA que codifica um precursor de proteína contendo uma seqüência líder pode ser incorporado ou um DNA que consiste apenas de uma região de proteína madura que não contém uma seqüência líder pode ser incorporado, e o DNA pode ser selecionado de modo apropriado para a seqüência codificando proteína dependendo das condições de produção, forma, condições de uso e outros de uma enzima a ser produzida.

Promotores normalmente usados na produção de proteínas heterogêneas em Escherichia. coli podem ser usados como um promotor para expressar um DNA codificando a enzima formadora de peptídeo. Exemplos destes promotores incluem promoter T7, promotor lac, promotor trp, promotor trc, promotor tac, promotor lambda fago PR, promotor PL e outros promotores poderosos. Além disso, exemplos de vetores que podem ser usados incluem pUC19, pUC18, pBR322, pHSG299, pHSG298, pHSG399, pHSG398, RSF1010, pMW119, pMW118, pMW219, e pMW218. além disso, vetores de fago DNA podem ser também usados. Além disso, vetores de expressão que contém promotores e são capazes de expressar uma seqüência de DNA inserida podem ser usados.

Para produzir uma enzima formadora de peptídeo na forma de corpo de inclusão de proteína fundida, a gene que codifica outra proteína, e preferivelmente um peptídeo hidrofílico, é ligado a montante ou a jusante do gene de enzima formadora de peptídeo para obter um gene de proteína fundida. O gene que codifica outra proteína deste modo pode ser qualquer gene que aumenta a quantidade de proteína fundida acumulada e melhora a solubilidade da proteína fundida após as etapas de desnaturação e regeneração. Os Exemplos de candidatos para estes genes incluem gene T7, gene 10, β-galactosidase, gene dehidrofolato redutase, gene γ-interferon, gene interleucina -2 e gene proquimosina.

Quando os genes são ligados a genes que codificam a enzima formadora de peptídeos, os genes são ligados de modo que matrizes de leitura de códons são consistentes. Recomenda-se que os genes sejam ligados a um sítio de éster- enzima de restrição apropriado ou a um DNA sintético tendo uma seqüência apropriada sendo utilizada.

Além disso, para aumentar a quantidade de produção da enzima formadora de peptídeo, é preferível em alguns casos que um terminador, que é uma seqüência de terminação de transcrição, seja ligado a jusante do gene de proteína de fusão. O terminador inclui, por exemplo, um terminador T7, terminador de fago fd, terminador T4, terminador de gene de resistência a tetraciclina, e um gene trpA de Escheriçhia coli.

Como os vetores para introduzir um gene que codifica a enzima formadora de peptídeo ou uma proteína fundida entre a enzima formadora de peptídeo e outra proteína em Escherichia coli são preferidos os assim chamados vetores do tipo de múltiplas cópias, cujos exemplos incluem um plasmídeo tendo um replicador derivado de ColEl, por exemplo, um plasmídeo à base de pUC- e um plasmídeo à base de pBR322 ou derivados dos mesmos. Os “derivado” como usado aqui fazer referência aos plasmídeos que são submetidos a modificação por substituição, deleção, inserção, adição e/ou inversão de bases. Note-se que a modificação como usada aqui inclui modificações por um tratamento de mutação com um mutagene ou irradiação de UV, ou modificações por mutação espontânea.

Para triar transformantes, é preferível que os vetores tenham marcadores como um gene resistente a ampicilina. Estes plasmídeos são vetores de expressão comercialmente disponíveis tendo promotores potentes (um vetor à base de pUC (fabricado por Takara Shuzo, Co., Ltd.), vetor à base de pRROK (fabricado por Clonetech Laboratories, Inc.), pKK233-2 (fabricado por Clonetech Laboratories, Inc.) e assim em diante.

Um DNA recombinante é obtido por ligação de um fragmento de DNA em um DNA vetor. Neste caso, um promotor, um gene codificando L-aminoácido amida hidrolase ou uma proteína fundida consistindo de L- aminoácido amida hidrolase e outra proteína e dependendo do caso, um terminador são ligados nesta ordem.

Quando Escherichia coli é transformado usando o DNA recombinante e o resultante Escherichia coli é cultivado, a enzima formadora de peptídeo ou uma proteína fundida consistindo da enzima formadora de peptídeo e outra proteína é expressada e produzida. Apesar da cepa que é normalmente usada na expressão de um gene heterogêneo poder ser usada como um hospedeiro a ser transformado, Escherichia coli cepa JM109, por exemplo, é preferível. Métodos para realizar a transformação e métodos para a triagem de transformantes são descritos em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989) e outras publicações.

No caso de expressar a enzima formadora de peptídeo na forma de proteína de fusão, a enzima formadora de peptídeo pode ser clivada usando uma protease de restrição que usa uma sequência não presente na enzima formadora de peptídeo, como fator de coagulação de sangue Xa ou calicreína, como a seqüência de reconhecimento.

Um meio normalmente usado para cultivar Escherichia coli, como meio ácido M9-casamino ou meio LB pode ser usado como o meio de produção. Além disso, as condições de cultura e condições de indução de produção são selecionadas de modo apropriado de acordo com o marcador do vetor usado, tipo de promotor de micróbio hospedeiro e assim em diante. O seguinte método pode ser usado para recuperar a enzima formadora de peptídeo ou proteína fundida consistindo da enzima formadora de peptídeo e outra proteína. Se a enzima formadora de peptídeo ou sua proteína fundida foi solubilizada dentro das células microbianas, após recuperação das células microbianas, as células microbianas são esmagadas ou lisadas de modo que elas podem ser usadas como um líquido de enzima bruto. Além disso, a enzima formadora de peptídeo ou sua proteína fundida podem ser purificadas antes do uso por técnicas comuns como precipitação, filtração ou cromatografia em coluna, como necessário. Neste caso, um método de purificação também pode ser usado que usa um anticorpo da enzima formadora de peptídeo ou sua proteína fundida.

No caso onde os corpos de inclusão são formados, os corpos de inclusão são solubilizados com um desnaturante. Eles podem ser solubilizados juntos com a proteína de célula microbiana. No entanto, em consideração ao seguinte procedimento de purificação, os corpos de inclusão são preferivelmente retirados e então solubilizados. Os métodos convencionalmente conhecidos podem ser usados para recuperar os corpos de inclusão das células microbianas. Por exemplo, corpos de inclusão podem ser recuperados por trituração das células microbianas seguido por separação centrífuga. Os Exemplos de desnaturantes capazes de solubilizar corpos de inclusão incluem cloridrato de guanidina (por exemplo, 6 M, pH 5 a 8) e uréia (por exemplo, 8 M).

Uma proteína tendo atividade é regenerada por remoção destes desnaturados por diálise. Uma solução de tampão Tris-HCl em uma solução de tampão fosfato e outras pode ser usada como solução de diálise a ser usada em diálise, e a concentração pode ser, por exemplo, 20 mM a 0,5 M, enquanto o pH pode ser, por exemplo, 5 a 8. A concentração de proteína durante a etapa de regeneração é preferivelmente mantida a cerca de 500 pg/ml ou menos. A temperatura de diálise é preferivelmente 5°C ou menor para inibir a enzima formadora de peptídeo regenerado de sofrer auto-reticulação. Além disso, além de diálise, diluição ou ultra-filtração podem ser usados para remover os desnaturantes e espera-se que a atividade pode ser regenerada sem levar em conta qual desnaturante é usado. <2> Método de produzir α-éster metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina O método de produzir α-APM de acordo com a presente invenção inclui uma primeira etapa de síntese de éster β-metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina de acordo com “<1> Método de produzir β-éster de a- L-aspartil-L-fenilalanina” e uma segunda etapa de converter éster β-metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina em α-éster metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina.

As condições preferidas na primeira etapa e semelhantes são como descritas em “<1> Método de produzir β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina”. Além disso, a segunda etapa pode ser realizada de acordo com o método conhecido e referência pode ser feita ao método e condições preferidas descritas em, por exemplo, publicação de patente japonesa No. H4- 41155, etc. Pelo método de produção de α-APM de acordo com a presente invenção, α-APM, que é importante como um adoçante, e semelhante, pode ser produzido de modo barato em elevado rendimento.

Exemplos A seguir, a presente invenção será explicada pelos exemplos.

No entanto, a presente invenção não é limitada a estes exemplos. Além de confirmação por coloração por ninidrina de cromatogramas de película fina, (qualitativo), determinações quantitativas foram feitas pela seguinte cromatografía de líquido de elevado desempenho a fim de testar os produtos.

Coluna InertsiL ODS-2 (fabricada por GL Science, Inc.), eluado: solução aquosa de fosfato contendo 5,0 mM 1-octanosulfonato de sódio (pH 2,1): metanol = 100:15 a 50, taxa de fluxo: 1,0 mL/min, detecção: 210 nanômetros (nm).

Exemplo 1 Micróbios aue produzem éster β-metílico de a-L-asnartil-L-fenilalanina 50 mililitros (“mL” ou “ml“) de um meio (pH 7,0) contendo 20 gramas (“g”) de glicerol, 5 g de sulfato de amônio, 1 g de di-hidrogeno- fosfato de potássio, 3 g de hidrogeno-fosfato de di-potássio, 0,5 g de sulfato de magnésio, 10 g de extrato de levedura e 10 g de peptona em 1 litro (L) que foram transferidos para um frasco Sakaguchi de 500 mL e esterilizados a 115°C durante 15 minutos (meio 1) foram usados para cultivar bactérias e actinomicetes mostrados na tabela 1-1. Um meio de agar inclinado (pH 7,0) contendo 5 g/L de glucose, 10 g/L de extrato de levedura, 10 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl e 20 g/L de agar no meio 1 foi preparado e um micróbio mostrado na tabela 1 foi cultivado neste meio de agar inclinado a 30°C durante 24 horas. Então, um conjunto dos micróbio foi cultivado no meio 1 a 30°C durante 24 horas, seguido por cultivo com agitação em 30°C e 120 batidas/min durante 17 horas. Após completar o cultivo, as células microbianas foram separadas destes líquidos de cultura por centrifugação, e colocadas em suspensão em 0,1 M tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA a 100 g/L como células microbianas úmidas.

Para cultivar levedura mostrada na tabela 1-1, 50 mL de um meio (pH 6,0) contendo 10 g de glucose, 10 g de glicerol, 5 g de sulfato de amônio, 1 g de di-hidrogeno-fosfato de potássio, 3 g de hidrogeno-fosfato de di-potássio, 0,5 g de sulfato de magnésio, 5 g de extrato de levedura, 5 g de extrato de malte e 10 g de peptona em 1 L transferidos a um frasco Sakaguchi de 500 mL e esterilizados a 115°C durante 15 minutos (meio 2) foram usados.

Um meio de agar inclinado (pH 6,0) contendo 5 g/L de glucose, 5 g/L de extrato de levedura, 5 g/L de extrato de malte, 10 g/L de peptona, 5 g/L de NaCl e 20 g/L agar no meio 2 foi preparado e uma levedura mostrada na tabela 1 foi cultivada no meio de agar inclinado a 30°C durante 24 horas.

Então, um conjunto da levedura foi cultivado com agitação a 30°C durante 24 horas no meio 2 a 25°C e 120 batidas/min durante 17 horas. Após completar o cultivo, as células microbianas foram separadas destes líquidos de cultura por centrifugação, e colocadas em suspensão em 0,1 M tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA a 100 g/L como células microbianas úmidas.

Os micróbios mostrados na tabela 1-2 foram cultivados como a seguir. Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 1 g de triptona, 1 g de extrato de levedura e 15 g de agar em 1 L de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Cellulophaga lytica NBRC 14961 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) ou Flexithrix dorotheae NBRC 15987 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Cellulophaga lytica NBRC 14961 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2- Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) ou Flexithrix dorotheae NBRC 15987 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio de agar de sangue de ovelha (Nissui Plate, Nissui Pharmaceutical) foi usado para cultivar Weeksella virosa NBRC 16016 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Weebella virosa NBRC 16016 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2- Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 10 g de peptona, 2 g de extrato de levedura, 1 g de MgS04'7H20 e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Pedobacter heparinus NBRC 12017 (Instituição Depositária; o NITE

Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2- Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Pedobacter heparinus NBRC 12017 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba- ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizados a 120°C durante 15 minutos) contendo 0,5 g de KN03, 0,1 g de glicerofosfato de sódio, 1 g de tris-hidroximetilaminometano, 5 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 15 g de agar e 1 ml de uma solução de elemento de traço em 1L de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Persicobacter diffluens NBRC 15940 ( (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) Note-se que a solução de elemento de traço continha 2,85 g de H3BO4,1,8 g de MnCl2-4H20,1,36 g de FeS04-7H20,26,9 mg de CuC12-2H20, 20,8 mg de ZnCl2, 40,4 mg de CoC12-6H20, 25,2 mg de Na2Mo04-2H20, e 1,77 g de tartarato de sódio). Células microbianas de Persicobacter diffluens NBRC 15940 (Instituição Depositária; 0 NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 3 g de bactocasitone, 1 g de extrato de levedura, 1,36 g de CaCl2-2H20 e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Chitinophaga pinensis NBRC 15968 (Instituição Depositária; 0 NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba- ken, Japão). Células microbianas de Chitinophaga pinensis NBRC 15968 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 5 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, 0,2 g de FeS04-7H20 e 15 g de agar em 1 L de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Células microbianas de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 25 °C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 1 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, 1 g de glucose e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Runella slithyformis ATCC 29530 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Células microbianas de Runella slithyformis ATCC 29530 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foram cultivadas em semente neste meio a 25 °C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 8,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 0,2 g de ácido nitriloacético, 2 ml de uma solução de 0,03% FeCl3, 0,12 g de CaS04-2H20, 0,2 g de MgS04-7H20, 0,016 g de NaCl, 0,21 g de KN03,1,4 g de NaN03,0,22 g de Na2HP04,2 ml de solução de elemento de traço e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Thermonema lapsum ATCC 43542 ((Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) deve ser notado que uma solução de elemento de traço continha 0,5 ml de H2S04, 2,2 g de MnS04, 0,5 g de ZnS04,0,5 g de H3B03,0,016 g de CuS04,0,025 g de Na2Mo04 e 0,046 g de CoCl2). Células microbianas de Thermonema lapsum ATCC 43542 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 60°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Agar marinho 2216 (fabricado por Difco) foi usado para cultivar Gelidibacter algens ATCC 700364 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), Lewinella cohaerens ATCC 23123 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), ou Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). No caso de Gelidibacter algens ATCC 700364 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) ou Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), células microbianas de Gelidibacter algens ATCC 700364, ou Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 10°C durante 72 horas foram aplicados, seguido por cultivo principal a 10°C durante 72 horas. No caso de Lewinella cohaerens ATCC 23123 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América), células microbianas de Lewinella cohaerens ATCC 23123 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas. No caso de Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha), células microbianas de Salegentibacter salegens DSMZ 5424 (Instituição Depositária;

Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 0,8 g de NH4C1, 0,25 g de KH2P04, 0,4 g de K2HP04, 0,505 g de KNO3, 15 mg de CaCl2-2H20, 20 mg de MgCl2-6H20, 7 mg de FeS04-7H20, 5 mg de Na2S04, 5 mg de MnCl2-4H20, 0,5 mg de H3BO3, 0,5 mg de ZnCl2, 0,5 mg de CoC12'6H20, 0,5 mg de NiS04-6H20, 0,3 mg de CuC12-2H20, 10 mg de Na2Mo04-2H20,0,5 g de extrato de levedura, 0,5 g de peptona, 0,5 g de ácido casamino, 0,5 g de dextrose, 0,5 g de amido solúvel, 0,5 g de piravato de sódio, e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Dyadobacter fermentans ATCC 700827 (Instituição Depositária;

American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O.

Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Células microbianas de Dyadobacter fermentans ATCC 700827 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas, seguido por cultivo principal a 25 °C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 2 g de triptona, 0,5 g de extrato de carne, 0,5 g de extrato de levedura, 0,2 g de acetato de sódio e 15 g de agar em 1 L de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Flammeovirga aprica NBRC 15941 (Instituição Depositária; 0 NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Flammeovirga aprica NBRC 15941 (Instituição Depositária; 0 NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 1 g de glucose, 1 g de peptona, 1 g de extrato de levedura, e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Spirosoma linguale DSMZ 74 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) ou Flectobacillus major DSMZ 103 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Células microbianas de Spirosoma linguale DSMZ 74 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) ou Flectobacillus major DSMZ 103 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) que foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 0,5 g de triptona, 0,5 g de extrato de levedura, 0,2 g de extrato de carne, 0,2 g de acetato de sódio e 15 g de agar em 300 ml de água destilada e 700 ml de água do mar artificial Dágo SP foi usado para cultivar Tenacibaculum maritimum ATCC 43398 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Células microbianas de Tenacibaculum maritimum ATCC 43398 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 2,5 g de extrato de levedura, 2,5 g de triptona, 100 mg de ácido nitriloacético, 40 mg de CaSO^B^O, 200 mg de MgCl2-6H20, 0,5 ml de 0,01M Fe citrato, 0,5 ml de uma solução de elemento de traço, 100 ml de tampão fosfato, 900 ml de água destilada, e 28 g de agar em 1 L foi usado para cultivar Rhodothermus marinus DSMZ 4252 (Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Note-se que a solução de elemento de traço continha 12,8 g de ácido nitriloacético, 1 g de FeCl2-4H20, 0,5 g de MnCl2-4H20, 0,3 g de CoC124H20, 50 mg de CuC12-2H20, 50 mg de Na2Mo04-2H20,20 mg de H3B03 e 20 mg de NiCl2'6H20). Células microbianas de Rhodothermus marinus DSMZ 4252 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) que foram cultivadas em semente neste meio a 60°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 60°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (1,5% agar, pH 7,6, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo BACTO MARINE BROTH (DIFCO 2216) foi usado para cultivar Zobellia galactanivorans DSMZ 12802 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Este meio foi aplicado com células microbianas de Zobellia galactanivorans DSMZ 12802 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 1,5 g de extrato de levedura, 2,5 g de peptona, 2 g de hexadecano, 17,7 g de NaCl, 0,48 g de KC1, 3,4 g de MgCl2-6H20, 4,46 g de MgS04-7H20,0,98 g de CaCl2 e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Muricauda ruestringenesis DSMZ 13258 (Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Células microbianas de Muricauda ruestringenesis DSMZ 13258 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária;

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 3 g de casitone, 1 g de extrato de levedura, 1,36 g de CaCl2-2H20 e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Células microbianas de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária;

Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 3 g de casitone, 1 g de extrato de levedura, 1,36 g de CaCl2-2H20, 5 g de celobiose e 15 g de agar em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Cyíophaga hutchinsonii NBRC 15051 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa- Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Cyíophaga hutchinsonii NBRC 15051 (Instituição Depositária; o NITE

Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2- Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,2, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 10 g de peptona, 2 g de extrato de levedura, 0,5 g de MgS04-7H20, e 15 g de agar em 250 ml de água destilada e 750 ml de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão). Células microbianas de Marinilabilia salmonicolor NBRC 15948 (Instituição Depositária; o NITE Biological Resource Center do National Institute of Technology and Evaluation, Endereço da Instituição Depositária; 5-8 Kazusa-Kamaashi 2-Chome, Kisarazu-shi, Chiba-ken, Japão) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,0, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 0,5 g de KN03, 0,1 g de glicerofosfato de sódio, 1 g de tris-hidroximetilaminometano, 2 g de triptona, 2 g de extrato de levedura, 15 g de agar e 1 ml de uma solução de elemento de traço em 1 L de água do mar artificial Daigo SP foi usado para cultivar Saprospira grandis ATCC 23119 ( (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Note-se que a solução de elemento de traço continha 2,85 g de H3BO4, 1,8 g de MnCl2-4H20, 1,36 g de FeS04-7H20, 26,9 mg de CuCl2-2H20, 20,8 mg de ZnCl2, 40,4 mg de CoC12-6H20, 25,2 mg de Na2Mo04-2H20 e 1,77 g de tartarato de sódio). Células microbianas de Saprospira grandis ATCC 23119 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) que foram cultivadas em semente neste meio a 30°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 30°C durante 48 horas.

Um meio sólido de agar (pH 7,5, esterilizado a 120°C durante 15 minutos) contendo 27 mg de KH2P04, 40 mg de K2HP04, 40 mg de Na2HP04-2H20, 50 mg de CaCl2-2H20, 75 mg de MgS04-7H20, 5 mg de FeCl3-6H20, 3 mg de MnS04-H20, 1,31 g de ácido glutâmico, 2,5 mg de caldo de soja Tripticase sem glucose, 0,4 mg de tiamina, 0,01 mg de vitamina B12, 2 g de glucose, e 1 ml de uma solução de elemento de traço em 1 L de água destilada foi usado para cultivar Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 ((Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Note-se que a solução de elemento de traço continha 0,1 g de ZnS04-7H20,0,03 g de MnCl2-4H20,0,3 g de H3B03, 0,2 g de CoCl2-6H20, 0,01 g de CuC12-2H20, 0,02 g de NiCl2-6H20 e 0,03 g de Na2Mo04-H20). Células microbianas de Haliscomenobacter hydrossis ATCC 27775 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foram cultivadas em semente neste meio a 25°C durante 48 horas foram aplicadas ao mesmo meio, seguido por cultivo principal a 25°C durante 48 horas.

As células microbianas assim obtidas foram cada coletadas do meio de agar, e colocadas em suspensão em 0,1 M tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA a 100 g/L como células microbianas úmidas. A 0,1 mL de cada uma das suspensões de célula microbiana destes micróbios foi adicionado 0,1 mL de 100 mM tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA, 100 mM éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico cloridrato e 200 mM L-fenilalanina para fazer uma quantidade total de 0,2 mL.

Então, a reação foi realizada a 20°C durante 3 horas quando o micróbio mostrado na tabela 1-1 foi usado ou durante 1 hora quando o micróbio mostrado na tabela 1-2 foi usado. A quantidade (mM) de éster β-metílico de a-L-aspartil- L-fenilalanina (a-AMP) produzida é mostrada nas Tabelas 1-1 e 1-2, Note-se que β-ΑΜΡ foi detectado em todos os casos onde os micróbios foram usados.

Tabela 1-1 Tabela 1-2 Exemplo de referência 1 Micróbio que produz -α-éster metílico de β- L-aspartil-L-fenilalanina Micróbios mostrados na tabela 2 foram cultivados similarmente ao procedimento em bactérias na tabela 1 do Exemplo 1. Após completar o cultivo, as células microbianas foram separadas destes caldos de cultura por centrifugação, e colocadas em suspensão em 0,1 M tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA a 100 g/L como células microbianas úmidas. A 0,1 mL de cada uma das suspensões de célula microbiana destes micróbios foi adicionado 0,1 mL de 100 mM tampão borato (pH 9,0) contendo 10 mM EDTA, 100 mM cloridrato de éster α,β-dimetílico de ácido L-aspártico e 200 mM L-fenilalanina para completar a quantidade total 0,2 ml, seguido por reação a 30°C durante 2 horas. A quantidade (mM) de α-éster metílico de β- L-aspartil-L-fenilalanina (β-ΑΜΡ) produzido neste caso é indicada na tabela 2, Note-se que nenhum α-AMP foi detectado em todos os micróbios.

Tabela 2 Exemplo 2 Purificação de enzima a partir de Emvedobacter brevis A 50 mL de meio (pH 6,2) contendo 5 gramas (g) de glucose, 5 g de sulfato de amônio, 1 g de fosfato de monopotássio, 3 g de fosfato de di- potássio, 0,5 g de sulfato de magnésio, 10 g de extrato de levedura e 10 g de peptona em 1 litro (L) foram transferidos para um frasco Sakaguchi de 500 mL e esterilizados a 115°C durante 15 minutos. Este meio foi então inoculado com 2 mililitros (ml ou mL) de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) que tinha sido cultivado a 30°C durante 16 horas no mesmo meio, seguido por cultivo agitado em 30°C e 120 batidas/min durante 16 horas.

Subsequentemente, o procedimento após separação centrífuga foi realizado ou em gelo ou a 4°C. O caldo de cultura obtido foi centrifugado para coletar células microbianas. Após lavagem 16 g das células microbianas com 50 mM Tris-HCl tampão (pH 8,0), elas foram colocadas em suspensão em 40 mililitros (ml ou mL) do mesmo tampão e submetidas a tratamento ultrassônico de esmagamento durante 45 minutos a 195 watts. Este líquido submetido a esmagamento ultrassônico foi então centrifugado (10.000 rpm, 30 minutos) para remover os fragmentos de células esmagadas e obter um sobrenadante líquido esmagado por ultrassônico. Este sobrenadante líquido esmagado por ultrassônico foi dialisado durante a noite contra 50 mM Tris- HC1 tampão (pH 8,0) seguido por remoção da fração insolúvel por ultracentrifugação (50.000 rpm, 30 minutos) para obter uma fração solúvel na forma do líquido sobrenadante. A fração solúvel resultante foi aplicada a uma coluna Q-Sepharose HP (fabricado por Amersham) pré-equilibrada com Tris- HC1 tampão (pH 8,0), e a fração ativa foi coletada da fração não adsorvida.

Esta fração ativa foi dialisada durante a noite contra 50 mM tampão acetato (pH 4,5) seguido por remoção da fração insolúvel por separação centrífuga (10.000 rpm, 30 minutos) para obter uma fração dialisada na forma do líquido sobrenadante. Esta fração dialisada foi então aplicada a uma coluna Mono S

(fabricado por Amersham) pré-equilibrada com 50 mM tampão acetato (pH 4,5) para eluir enzima a um gradiente de concentração linear do mesmo tampão contendo 0 a 1 M NaCl. A fração que tinha o menor nível de contaminação de proteína dentre as frações ativas foi aplicada a uma coluna Superdex 200pg (fabricada por Amersham) pré-equilibrada com 50 mM tampão acetato (pH 4,5) contendo 1 M NaCl, e filtração de gel foi realizada ao deixar o mesmo tampão (pH 4,5) contendo 1 M NaCl fluir através de uma coluna para obter uma solução de fração ativa. Como resultado da realização destes procedimentos, a enzima formadora de peptídeo usada na presente invenção foi confirmada como tendo purificado uniformemente com base nos resultados experimentais de eletroforese. A taxa de recuperação de enzima no processo de purificação acima mencionado foi 12,2% e o grau de purificação foi de 707 vezes.

Exemplo 3 Produção de éster β-metílico de q-L-asoartil-L-fenilalanina usando fração de enzima de Empedobacter brevis 10 microlitros (μΐ) de enzima de fração Mono S (cerca de 20 U/ml) obtido in Exemplo 2 foram adicionados a 190 μΐ of tampão borato (pH 9,0) contendo 105,3 mM de cloridrato de éster α,β-dimetílico de ácido L- aspártico, 210,5 mM L-fenilalanina e 10,51 mM EDTA e a reação foi realizada a 20°C. 0 curso de produção de éster β-raetílico de cc-L-aspartil-L- fenilalanina (α-AMP) é mostrado na tabela 3. Note-se que quase nenhuma formação de éster β-metílico de α-L-aspartil-L-fenilalanina foi confirmada no lote não adicionado de enzima.

Além disso, 10 μΐ de fração de enzima Mono S (cerca de 20 U/ml) obtidos no Exemplo 2 foram adicionados a 190 μΐ de tampão borato (pH 9,0) contendo cada 105,3 mM cloridrato de α-éster metílico de ácido L- aspártico e cloridrato de éster β-metílico de ácido L-aspártico, 210,5 mM L- fenilalanina e 10,51 mM EDTA foram adicionados e a reação foi realizada a 20°C. Como um resultado, nenhuma formação dos peptídeos correspondentes foi observada.

Tabela 3 Exemplo 4 Purificação de enzima a partir de SOhinzobacterium sp.

Sphíngobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002) foi cultivado do mesmo modo que no Exemplo 2 usando o meio mostrado no Exemplo 2. O seguinte procedimento após separação centrífuga foi realizado ou em gelo ou a 4°C. O caldo de cultura obtido foi centrifugado (10.000 rpm, 15 minutos) para coletar células microbianas. Após lavagem de 2 g das células microbianas com 20 mM Tris- HC1 tampão (pH 7,6), elas foram colocadas em suspensão em 8 ml do mesmo tampão e submetidas a tratamento ultrassônico de esmagamento durante 45 minutos a 195 W. Este líquido submetido a esmagamento ultrassônico foi então centrifugado (10.000 rpm, 30 minutos) para remover os fragmentos de células esmagadas para obter um sobrenadante líquido submetido a esmagamento ultrassônico. Este sobrenadante líquido submetido a esmagamento ultrassônico foi dialisado durante a noite contra 20 mM Tris- HC1 tampão (pH 7,6) seguido por remoção da fração insolúvel por ultracentrifugação (50.000 rpm, 30 minutos) para obter uma fração solúvel na forma do líquido sobrenadante. A fração solúvel resultante foi aplicada a uma coluna Q-Sepharose HP (fabricada por Amersham) pré-equilibrada com Tris- HC1 tampão (pH 7,6), e a fração ativa foi coletada da fração não adsorvida.

Esta fração ativa foi dialisada durante a noite contra 20 mM tampão acetato (pH 5,0) seguido por remoção da fração insolúvel por separação centrífuga (10.000 rpm, 30 minutos) para obter uma fração dialisada na forma do líquido sobrenadante. Esta fração dialisada foi então aplicada em um sítio de coluna SP-Sepharose HP (fabricada por Amersham) pré-equilibrada com 20 mM tampão acetato (pH 5,0) para obter a fração ativa em que a enzima foi eluída a um gradiente de concentração linear do mesmo tampão contendo 0 a 1 M

NaCl.

Exemplo 5 Produção de éster β-metílico de a-L-asnartil-L-fenilalanina e éster B-etílico de q-L-aspartil-L-fenilalanina usando a fração de enzima de Sphinsobacterium sp.

No caso de produção de éster β-metílico de a-L-aspartil-L- fenilalanina (a-AMP), 15 μΐ de solução concentrada de fração de SP- Sepharose HP (cerca de 15 U/ml) obtidos no Exemplo 4 foram adicionados a 185 μΐ of tampão borato (pH 9,0) contendo 108,1 mM de cloridrato de α,β- éster dimetílico de ácido L-aspártico, 216,2 mM L-fenilalanina e 10,8 mM EDTA e reação foi realizada a 20°C. Similarmente, no caso de produção de um β-éster etílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina (oc-AEP), 10 μΐ de uma solução concentrada de fração de SP-Sepharose HP (cerca de 15 UM) obtidos no Exemplo 4 foram adicionados a 190 μΐ de tampão borato (pH 9,0) contendo 52,6 mM de cloridrato de α,β- éster dietílico de ácido L-aspártico, 105,2 mM L-fenilalanina e 10,8 mM EDTA e reação foi realizada a 20°C. O curso da formação de AMP ou AEP é mostrado na tabela 4. Note-se que quase nenhuma formação de AMP ou AEP foi confirmada no lote não adicionado com enzima. Para a formação de AEP, valores numéricos obtidos por uso de um produto padrão de AMP são descritos.

Tabela 4 Exemplo 6 Isolamento de gene de enzima formadora de nentídeo derivado de Empedobacter brevis A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo será explicado. Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) foi usado como o micróbio. No isolamento do gene, Escherichia coli JM-109 foi usado como um hospedeiro enquanto pUCl 18 foi usado como um vetor. (1) Produção de iniciador PCR com base em seqüência de aminoácido interna determinada Um iniciador misto tendo as seqüências de base indicadas em SEQ ID NO.: 3 e SEQ ID NO: 4, respectivamente, foi produzido com base nas seqüências de aminoácidos (SEQ ID NOs: 1 e 2) determinado de acordo com o método de decomposição de Edman a partir do produto de digestão de lisil endopeptidase de uma enzima formadora de peptídeo derivada de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002). (2) Aquisição de células microbianas Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) foi cultivada a 30°C durante 24 horas em um meio CM2G agar (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio líquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 30°C. (3) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml de caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. Então, o DNA cromossômico foi adquirido a partir das células microbianas usando o sistema QIAGEN Genomic-Tip System (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. (4) Aquisição de fragmento de DNA contendo parte de gene de enzima formadora de peptídeo por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Empedobacíer brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo).

Uma reação PCR foi então realizada em DNA cromossômico adquirido de Empedobacíer brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) usando os iniciadores tendo as sequências de base de SEQID NOs: 3 e 4. A reação PCR foi realizada durante 30 ciclos sob as seguintes condições usando o ciclador térmico PCR Takara PERSONAL (fabricado por Takara Shuzo). 94°C 30 segundos 52°C 1 minuto 72°C 1 minuto Após completar a reação, 3 ml do líquido de reação foram aplicados a eletroforese a 0,8% de agarose. Como resultado, verificou-se que um fragmento de DNA de cerca de 1,5 kilobases (kb) foi amplificado. (5) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes A fim de adquirir o comprimento completo de gene de enzima formadora de peptídeo em comprimento completo, hibridização Southern foi realizada usando o fragmento de DNA amplificado no procedimento como uma sonda. O procedimento para hibridização Southern é explicado em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989). O fragmento de aproximadamente 1,5 kb de DNA amplificado pelo procedimento PCR foi isolado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada. Este fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim).

Após digerir completamente DNA cromossômico de Empedobacter brevis adquirido na etapa (3) do presente exemplo 6 por reação a 37°C durante 16 horas com enzima de restrição HindIII, o resultante foi submetido a eletroforese com 0,8% agarose gel. O DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics) a partir de agarose gel após a eletroforese, seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após a pré-hibridização do filho a 50°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e hibridização foi realizado a 50°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado durante 20 minutos em temperatura ambiente com 2 x SSC contendo 0,1% SDS. Além disso, o filtro foi adicionalmente lavado duas vezes a 65°C durante 15 minutos com 0,1 x SSC contendo 0,1% SDS.

Detecção de bandas que hibridizaram com a sonda foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim). Como um resultado, uma banda de grosseiramente 4 kb foi capaz de ser detectada que hibridizaram com a sonda.

Então, 5 mg de DNA cromossômico preparado na etapa (3) do presente exemplo 6 foram completamente digeridos com HindlII.

Grosseiramente 4 kb de DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose, seguido por purificação do DNA usando o kit Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi) e dissolvendo o DNA em 10 ml de TE. 4 ml deste produto foram então misturados com pUC118 HindlII/ΒΑΡ (fabricado por Takara Shuzo) e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml da mistura de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por Toyobo) foram misturados para transformar Escherichia coli.

Este foi então aplicado a um meio sólido apropriado para produzir a coleção do DNA cromossômico.

Para adquirir o comprimento completo de gene de enzima formadora de peptídeo, a coleção de DNA cromossômico foi tríada por hibridização em colônia usando a sonda acima mencionada. O procedimento para hibridização em colônia é explicado em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

As colônias de uma coleção de DNA cromossômico foram transferidas para um filtro de membrana de náilon (Nylon Membrane for Colony and Plaque Hybridization, (fabricada por Roche Diagnostics) seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após pré-hibridizar o filtro a 37°C durante 1 hora, a sonda acima mencionada rotulada com digoxinigen foi adicionada, seguido por hibridização a 50°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado durante 20 minutos em temperatura ambiente com 2 x SSC contendo 0,1% SDS. Além disso, o filtro foi adicionalmente lavado duas vezes a 65 °C durante 15 minutos com 0,1 x SSC contendo 0,1% SDS.

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Maimheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim). Como um resultado, duas cepas de colônias foram verificadas como hibridizando com a sonda rotulada. (6) Seqüência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Empedobacter brevis Plasmídeos possuídos por Escherichia coli JM109 foram preparados a partir das duas cepas acima mencionadas de células microbianas que foram verificadas como hibridizando com a sonda rotulada usando o sistema de purificação de DNA Wizard Plus Minipreps (fabricado por Promega) e a seqüência de base de uma porção onde hibridização com a sonda ocorreu e assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando o kit CEQ DTCS-Quick Start Kit (fabricado por Beckman- Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, verificou-se que uma matriz de leitura aberta que codifica uma proteína contendo as seqüências internas de aminoácidos da enzima formadora de peptídeo (SEQ ID NOs: 1 e 2) de fato existe, assim confirmando que a matriz de leitura aberta foi um gene codificando a enzima formadora de peptídeo. A seqüência de base do comprimento completo dos genes de enzima formadora de peptídeo junto com correspondentes seqüências de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 5 da Listagem de Seqüências. Como um resultado de análise sobre a homologia da matriz de leitura aberta resultante com o programa BLASTP, homologia foi descoberta entre as duas enzimas, e foi demonstrada com uma homologia de 34% porque no nível de seqüência de aminoácidos exibido com a hidrolase de éster de α-aminoácido de Acetobacter pasteurianus (ver Appl. Environ.

Microbiol., 68(1), 211-218 (2002), e uma homologia de 26% no nível de seqüência de aminoácidos exibido com glutaril-7ACA acilase de Brevibacillus laterosporum (ver J. BacterioL, 173(24), 7848-7855 (1991). (7) Expressão de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Empedobacter brevis em Escherichia coli Região de gene de marcação na região de promotor de trp operon no DNA cromossômico de Escherichia coli W3110 foi amplificado ao realizar PCR usando os oligonucleotídeos indicados em SEQ ID NOs: 7 e 8 como iniciadores, e o resultante fragmento de DNAs foi ligado a um vetor pGEM-Teasy (fabricado por Promega). E. coli JM109 foi então transformado nesta solução de ligação, e as cepas tendo o plasmídeo de marcação em cuja direção do promotor trp inserido é inserido em oposição à orientação do promotor lac foram selecionados a partir de cepas resistentes a ampicilina. A seguir, um fragmento de DNA contendo o promotor trt obtido por tratamento deste plasmídeo com EcoO109I/EcoRI foi ligado em um sítio EcoO109I/EcoRI produto de tratamento de pUC19 (fabricado por Takara).

Escherichia coli JM109 foi então transformado com esta solução de ligação e as cepas tendo o plasmídeo de marcação foram selecionados a partir de cepas resistentes a ampicilina. A seguir, um fragmento de DNA obtido por tratamento deste plasmídeo com HindIII/PvulI foi ligado com um fragmento de DNA contendo um terminador rmB obtido por tratamento pKK223-3 (fabricado por Amersham Pharmacia) com HindIII/HincII. E. coli JM109 foi então transformado com esta solução de ligação, cepas tendo o plasmídeo de marcação foram selecionados a partir de cepas resistentes a ampicilina, e o plasmídeo foi designado como pTrpT.

O gene de marcação foi amplificado por PCR usando DNA cromossômico de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) como um gabarito e os oligonucleotídeos indicados em SEQ ID NO: 9 e 10 como iniciadores. Este fragmento de DNA foi então tratado com Ndel/PstI, e o resultante fragmento de DNA foi ligado com o Ndel/PstI produto de tratamento de pTrpT.

Escherichia coli JM109 foi então transformado com esta solução de ligação, as cepas tendo o plasmídeo de marcação foram selecionados a partir de cepas resistentes a ampicilina, e este plasmídeo foi designado como pTrpT_Gtg2.

Escherichia coli JM109 tendo pTrpT_Gtg2 foi cultivado em semente a 30°C durante 24 horas em meio LB contendo 100 mg/1 de ampicilina. 1 ml do resultante caldo de cultura foi semeado em frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de um meio (D glucose a 2 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, casaminoácidos a 10 g/1, sulfato de amônio a 5 g/1, di- hidrogeno-fosfato de potássio a 3 g/1, hidrogeno-fosfato de di-potássio a 1 g/1, sulfato de magnésio heptaidratado a 0,5 g/1, e ampicilina a 100 mg/1), seguido por cultivo a 25°C durante 24 horas. O caldo de cultura tinha uma atividade formadora de éster β-metílico de α-L-aspartil-fenilalanina de 0,11 U per 1 ml de caldo de cultura e verificou-se que o gene clonado foi expressado por E. coli. Além disso, nenhuma atividade foi detectada para um transformante em que somente pTrpT foi introduzido como um controle.

Previsão de seqüência de sinal Quando a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 descrita na Listagem de Seqüências foi analisada com programa Signal P v 1.1 (ver Protein Engineering, Vol. 12, No. 1, pp. 3-9, 1999), foi previsto que aminoácidos números 1 a 22 funcionam como um sinal que é secretado no periplasma, enquanto a proteína madura foi estimada como estando a montante de aminoácido número 23.

Verificação de secreção Escherichia coli JM109, tendo pTrpT_Gtg2, foi cultivado em semente a 30°C durante 24 horas em meio LB contendo 100 mg/1 of ampicilina. 1 ml do resultante caldo de cultura foi semeado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio (glucose a 2 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, casaminoácidos a 10 g/1, sulfato de amônio a 5 g/1, di- hidrogeno-fosfato de potássio a 3 g/1, hidrogeno-fosfato de di-potássio a 1 g/1, sulfato de magnésio heptaidratado a 0,5 g/1, e ampicilina a 100 mg/1), seguido por final cultivo a 25 °C durante 24 horas para obter células microbianas cultivadas.

As células microbianas cultivada foram fracionadas em uma fração de periplasma e a fração de citoplasma por um método de choque de pressão osmótica, usando uma solução de sacarose de 20 gramas/decilitro (g/dl). As células microbianas imersas na solução de sacarose de 20 g/dl foram imersas em 5 mM solução aquosa MgS04. O sobrenadante centrifugado foi chamado uma fração de periplasma (“Pe”). Além disso, o sedimento centrifugado foi re-colocado em suspensão e submetido a esmagamento ultrassônico. O resultante foi chamado fração citoplasma (“Cy”). A atividade de glucose 6-fosfato desidrogenase, que se sabe está presente no citoplasma, foi usado como indicador para verificar que o citoplasma foi separado. Este medida foi realizada por adição de uma quantidade apropriada de enzima a uma solução de reação a 30°C contendo 1 mM glucose 6-fosfato, 0,4 mM NADP, 10 mM MgS04, e 50 mM Tris-Cl (pH 8), seguido por medida de absorbância a 340 nm para medir a produção de NADPH.

As quantidades de enzimas na fração de periplasma e a fração de citoplasma quando a atividade de um extrato isento de células preparado em separado receberam um valor de 100% como mostrado na Fig. 1. Esta atividade de glucose 6-fosfato desidrogenase não misturada na fração do periplasma indica que a fração do periplasma não mistura na fração do citoplasma. Cerca de 60% da atividade formadora de éster β-metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina (α-AMP) foi recuperada na fração do periplasma e verificou-se que a enzima formadora de Ala-Gln foi secretada no periplasma como previsto a partir da seqüência de aminoácido usando o programa Signal Pv 1.1.

Exemplo 7 Isolamento of gene de enzima formadora de nentideo derivada de Sphingobacterium sp. A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo é descrito O micróbio usado foi Sphingobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002). Para o isolamento do gene, Escherichia coli DH5a foi usado como um hospedeiro, e pUCl 18 foi usado como um vetor. (1) Aquisição de células microbianas Sphingobacterium sp. cepa FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002) foi cultivado durante 24 horas a 25°C em um CM2G agar meio (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio líquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 25°C. (2) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml de caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. DNA cromossômico foi então adquirido a partir das células microbianas usando o sistema Qiagen Genomic-Tip (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

(3) Aquisição de sonda de fragmento de DNA por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo).

Uma reação PCR foi então realizada no DNA cromossômico adquirido de Empedobacter brevis cepa FERM BP-8113 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6,1-1 Higashi 1- Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de transferência do depósito internacional: 8 de julho de 2002) usando iniciadores tendo as seqüências de base de SEQID NOs: 3 e 4.

A reação PCR foi realizada usando o ciclador térmico PCR

Takara - PERSONAL (Takara Shuzo) durante 30 ciclos sob as seguintes condições. 94°C 30 segundos 52°C 1 minuto 72°C 1 minuto Após completar a reação, 3 ml de líquido de reação foram aplicados a 0,8% eletroforese de agarose. Como um resultado, verificou-se que um fragmento de DNA of cerca de 1,5 kb foi amplificado. (4) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes A fim de adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, hibridização Southern foi realizada usando fragmento de DNA amplificado no procedimento PCR acima mencionado como uma sonda. As operações de hibridização Southern são explicadas em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989). O fragmento de aproximadamente 1,5 kb de DNA amplificado pelo procedimento PCR acima mencionado foi separado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada.

Este fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG

High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

Após deixar o DNA cromossômico de Sphingobacterium sp. adquirido na etapa (2) do presente exemplo 7 reagir com enzima de restrição Saci a 37°C durante 16 horas para digerir completamente o DNA, o resultante foi submetido a eletroforese em 0,8% agarose gel. A partir do gel agarose após a eletroforese, o DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após pré-hibridizar o filtro a 37°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e a hibridização foi realizada a 37°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com 1 x SSC contendo 0,1% SDS.

Detecção de bandas que hibridizaram com a sonda foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (Boehringer- Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

Como um resultado, uma banda de grosseiramente 3 kb foi detectada com sucesso que hibridizou com a sonda. 5 mg do DNA cromossômico preparado na etapa (2) do presente exemplo 7 foram completamente digeridos com Saci. Cerca de 3 kb de um DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose, o DNA foi purificado usando o kit Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi), e dissolvido em 10 ml de TE. 4 μΐ da solução resultante e pUC118 tratado com fosfatase alcalina (E. coli C75) a 37°C durante 30 minutos e a 50°C durante 30 minutos, após a reação com Saci a 37°C durante 16 horas para digerir completamente, foram misturados e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Yer. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml deste líquido de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli DH5a (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados para transformar Escherichia coli. Este foi então aplicado a um meio sólido apropriado para produzir a coleção do DNA cromossômico.

Para adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, a coleção de DNA cromossômico foi triada por hibridização em colônia usando a sonda acima mencionada. O procedimento para hibridização em colônia é explicado em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

As colônias de uma coleção de DNA cromossômico foram transferidas para um filtro de membrana de náilon (Nylon Membrane for Colony and Plaque Hybridization, fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos of desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização.

Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer- Maraiheim). Após pré-hibridizar o filtro a 37°C durante 1 hora, a acima mencionada sonda rotulada com digoxinigen foi adicionada, seguido por hibridização a 37°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com 1 x SSC contendo 0,1% SDS.

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo. Como um resultado, seis cepas de colônias foram verificadas como tendo hibridizado com a sonda rotulada. (5) Sequência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Sphingobacterium sp.

Plasmídeos possuídos por Escherichia coli DH5cc foram preparados a partir de seis cepas de células microbianas que foram verificadas como tendo hibridizado com a sonda rotulada usando o sistema de purificação de DNA Wizard Plus Minipreps (fabricado por Promega) para determinar a seqüência de base de uma porção onde a hibridização com a sonda ocorreu e assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando CEQ DTCS-Quick Start Kit (fabricado por Beckman-Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, foi revelado que uma matriz de leitura aberta que codifica enzima formadora de peptídeo de fato existe. A seqüência de base de comprimento completo do gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Sphingobacterium sp. junto com a correspondente seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQ ID NO: 11. Enzima formadora de peptídeo derivado de Sphingobacterium sp. demonstrou uma homologia de 63,5% no nível da seqüência de aminoácidos da enzima formadora de peptídeo derivada de Empedobacter brevis (como determinado usando o programa BLASTP). (6) Expressão de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Sphingobacterium sp. em Escherichia coli O gene de marcação foi amplificado por PCR nsando DNA cromossômico de Sphingobacterium sp. FERM BP-8124 (Instituição Depositária: a corporação administrativa independente, National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, Depositário do Organismo de Patente Internacional, Endereço da instituição depositária: Chuo Dai-6, 1-1 Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, Japão, Data de depósito internacional: 22 de julho de 2002) como um gabarito e os oligonucleotídeos mostrados em SEQ ID NOs: 13 e 14 como iniciadores. Este fragmento de DNA foi tratado com Ndel/Xbal. e o resultante fragmento de DNA e o produto de tratamento Ndel/Xbal de pTrpT foi ligado. Escherichia coli JM109 foi então transformado com esta solução de ligação, e cepas tendo o plasmídeo de marcação foram selecionadas a partir de cepas resistentes a ampicilina. O plasmídeo foi designado como pTrpT_Sm_aet.

Escherichia coli JM109 tendo pTrpT_Sm_aet foi cultivada a 25°C durante 20 horas por inoculação de uma porção do mesmo em um tubo de teste comum contendo 3 ml de um meio (glucose a 2 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, casaminoácidos a 10 g/1, sulfato de amônio a 5 g/1, di- hidrogeno-fosfato de potássio a 3 g/1, hidrogeno-fosfato de di-potássio a 1 g/1, sulfato de magnésio heptaidratado a 0,5 g/1 e ampicilina a 100 mg/1).

Verificou-se que um gene clonado tendo uma atividade de produção de a- AMP de 0,53 U per ml de caldo de cultura foi expressado por Escherichia coli. Além disso, nenhuma atividade foi detectada para um transformante contendo somente pTrpT usado como um controle.

Previsão de seqüência de sinal Quando a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 descrita na Listagem de Seqüências foi analisada com programa Signal P v 1.1 (Protein Engineering, Vol. 12, No. 1, pp. 3-9, 1999), foi previsto que aminoácidos números 1 a 20 funcionam como um sinal que é secretado no periplasma, enquanto a proteína madura foi estimada como estando a montante de aminoácido número 21.

Confirmação de seqüência de sinal Uma porção de Escherichia coli JM109, tendo pTrpT_Sm_aet, foi inoculada em tubos de teste comuns contendo 50 ml de um meio (glucose a 2 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, casaminoácidos a 10 g/1, sulfato de amônio a 5 g/1, di-hidrogeno-fosfato de potássio a 3 g/1, hidrogeno-fosfato de di-potássio a 1 g/1, sulfato de magnésio heptaidratado a 0,5 g/1 e ampicilina a 100 mg/1) e cultivo principal foi realizado a 25°C durante 20 horas. A seguir, procedimentos após separação centrífuga foram realizados em gelo ou a 4°C. Após completar o cultivo, as células microbianas foram separadas do caldo de cultura por centrifugação, lavadas com 100 mM tampão fosfato (pH 7), e então colocadas em suspensão no mesmo tampão. As células microbianas foram então submetidas a tratamento ultrassônico de esmagamento durante 20 minutos a 195 W, o líquido esmagado por ultrassons foi centrifugado (12.000 rpm, 30 minutos) para remover os fragmentos de células esmagadas e obter uma fração solúvel. A fração solúvel resultante foi aplicada a uma coluna CHT-II fabricada por Biorad) pré-equilibrada com 100 mM tampão fosfato (pH 7), e enzima foi eluída em um gradiente de concentração linear com 500 mM tampão fosfato. Uma solução obtida por misturação de um fração ativa com 5 vezes o volume de 2 M sulfato de amônio e 100 mM tampão fosfato foi aplicada a uma coluna Resource-PHE (fabricado por Amersham) pré-equilibrada com 2 M sulfato de amônio e 100 mM tampão fosfato, e uma enzima foi eluída a um gradiente de concentração linear por 2 a 0 M sulfato de amônio para obter uma solução de fração ativa.

Como um resultado destes procedimentos, verificou-se que a enzima formadora de peptídeo foi purificada de modo eletroforeticamente uniforme.

Quando a seqüência de aminoácidos da acima mencionada enzima formadora de peptídeo foi determinada por método de decomposição de Edman, a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 foi adquirida e a proteína madura foi verificada como estando a montante do aminoácido número 21 como foi previsto pelo programa SignalP v 1.1.

Exemplo 8 Isolamento de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Pedobacter heparinus IFO 12017 A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo é descrito. O micróbio usado é Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária; Institute of Fermentation, Osaka, endereço da instituição depositária; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão). Para o isolamento do gene, Escherichia coli JM109 foi usado como um hospedeiro, e pUC 118 foi usado como um vetor. (1) Aquisição de células microbianas Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) foi cultivado durante 24 horas a 25 °C em um meio agar CM2G (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio líquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 25°C. (2) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml do caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. Um DNA cromossômico foi então adquirido a partir das células microbianas usando Qiagen Genomic-Tip System (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

(3) Aquisição de fragmento de sonda de DNA por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon- cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo). Uma reação PCR foi então realizada no DNA cromossômico adquirido de Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon- cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) usando iniciadores tendo as sequências de base de SEQID NOs: 15 e 16. O fragmento de aproximadamente 1 kb de DNA amplificado por procedimento PCR foi isolado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada. O fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. (4) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes Para adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, hibridização Southern foi realizada usando fragmento de DNA amplificado pelo procedimento PCR acima mencionado como uma sonda. As operações de hibridização Southern são explicadas em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

Após deixar o DNA cromossômico de Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) reagir com enzima de restrição HindIII a 37°C durante 16 horas para digerir completamente o DNA, o resultante foi submetido a eletroforese em 0,8% agarose gel. Do gel agarose após a eletroforese, o DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização, e mobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boebringer-Mannheim). Após a pré-hibridização do filtro a 50°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e a hibridização foi realizado a 50°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com lxSSC contendo 0,1% SDS.

Como um resultado, uma banda de grosseiramente 5 kb foi detectada com sucesso que hibridizou com a sonda.

5 pg do DNA cromossômico de Pedobacter heparinus IFO 12017 foram completamente digeridos com HindIII. Cerca de 5 kb de um DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose, o DNA foi purificado usando Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi), e dissolvido em 10 ml de TE. 4 μΐ da solução resultante e pUCl 18 HindIII/ΒΑΡ foram misturados e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml de deste líquido de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados para transformar Escherichia coli. Este foi então aplicado em um meio sólido apropriado para produzir a coleção do DNA cromossômico.

Para adquirir um gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, a coleção de DNA cromossômico foi triada por hibridização em colônia usando a sonda acima mencionada. O procedimento para hibridização em colônia é explicado em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

As colônias de uma coleção de DNA cromossômico foram transferidas a um filtro de membrana de náilon, Nylon Membrane for Colony and Plaque Hibridização (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos de desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização.

Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer- Mannheim). Após pré-hibridizar o filtro a 37°C durante 1 hora, a acima mencionada sonda rotulada com digoxinigen foi adicionada, seguido por hibridização a 37°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com lxSSC contendo 0,1% SDS.

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo. Como um resultado, uma cepa cuja colônia hibridizou com a sonda rotulada foi observada. (5) Seqüência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Pedobacíer heparinus IFO 12017 Plasmídeos possuídos por Escherichia coli JM109 foram preparados a partir a cepa que foi verificada como tendo hibridizado com a sonda rotulada e a seqüência de base de uma porção onde hibridização com a sonda ocorreu e assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando CEQ DTCS-Quick Start Kit (fabricado por Beckman- Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, foi revelado que uma matriz de leitura aberta que codifica enzima formadora de peptídeo de fato existe. A seqüência de base de comprimento completo do gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Pedobacíer heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) junto com as correspondentes seqüências de aminoácido é mostrada em SEQID NO: 17.

Exemplo 9 Expressão de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Pedobacter heparinus IFO 12017 in Escherichia coli O gene de marcação foi amplificado por PCR usando o DNA cromossômico de Pedobacter heparinus IFO 12017 (Instituição Depositária: Institute of Fermentation, Osaka; 2-17-85 Jusanbon-cho, Yodogawa-ku, Osaka-shi, Japão) como um gabarito e os oligonucleotídeos mostrados em SEQID NOs: 19 e 20 como iniciadores. Este fragmento de DNA foi tratado com Ndel/HindlII, e o resultante fragmento de DNA e o produto de tratamento Ndel/HindlII de pTrpT foram ligados. Escherichia coli JM109 foi então transformado com esta solução de ligação, e cepas tendo o plasmídeo de marcação foram selecionadas a partir de cepas resistentes a ampicilina. O plasmídeo foi designado como pTrpT_Ph_aet.

Uma porção de Escherichia coli JM109 tendo pTrpT_Ph_aet foi inoculada em um tubo de teste comum contendo 3 ml de um meio (glucose a 2 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, casaminoácidos a 10 g/1, sulfato de amônio a 5 g/1, di-hidrogeno-fosfato de potássio a 3 g/1, hidrogeno-fosfato de di-potássio a 1 g/1, sulfato de magnésio heptaidratado a 0,5 g/1 e ampicilina a 100 mg/1) e o cultivo principal foi realizado a 25°C durante 20 horas.

Verificou-se que o caldo cultivado tinha uma atividade de produção de a- AMP de 0,01 U per ml de caldo de cultura, assim verificou-se que o gene clonado foi expressado em Escherichia coli. Além disso, nenhuma atividade foi detectada no transformante contendo somente pTrpT usado como um controle.

Exemplo 10 Isolamento de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Taxeobacter seluourpurascens DSMZ 11116 A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo é descrito. O micróbio usado é Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células); endereço da instituição depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha). Para o isolamento do gene, Escherichia coli JM109 foi usado como um hospedeiro, e pUC 118 foi usado como um vetor. (1) Aquisição de células microbianas Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) foi cultivado durante 24 horas a 25 °C em um meio agar CM2G (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio líquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 25°C. (2) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml do caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. DNA cromossômico foi então adquirido a partir das células microbianas usando Qiagen Genomic-Tip System (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

(3) Aquisição de fragmento de sonda de DNA por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo). Uma reação PCR foi então realizada no DNA cromossômico adquirido de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) usando iniciadores tendo a seqüência de base s of SEQ ID NOs: 21 e 16. O fragmento de aproximadamente 1 kb de DNA amplificado pelo procedimento PCR foi isolado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada. O fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. (4) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes Para adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, Southern hibridização foi realizada usando fragmento de DNA amplificado pelo procedimento PCR acima mencionado como uma sonda. As operações de Southern hibridização são explicadas em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

Após deixar o DNA cromossômico de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 38124 Braunschweig, Alemanha) reagir com a enzima de restrição PstI a 37°C durante 16 horas para completamente digerir o DNA, o resultante foi submetido a eletroforese em 0,8% agarose gel. A partir do gel agarose após a eletroforese, o DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após a pré-hibridização do filtro a 50°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e hibridização foi realizada a 50°C

durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com lxSSC contendo 0,1% SDS.

Como um resultado, uma banda de grosseiramente 5 kb foi detectada com sucesso, que hibridizou com sonda. 5 pg do DNA cromossômico de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 (Instituição Depositária; Deutche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Coleção alemã de micróbios e culturas de células, Endereço da Instituição Depositária; Mascheroder Weg lb, 3S124 Braunschweig, Alemanha) foram completamente digeridos com PstI. Cerca de 5 kb of um DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose, o DNA foi purificado usando Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi), e dissolvido em 10 ml de TE. 4 μΐ da solução resultante e pUC118 PstI/BAP (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml deste líquido de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados para transformar Escherichia coli. Isto foi então aplicado em um meio sólido apropriado para produzir uma coleção do DNA cromossômico.

Para adquirir um gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, a coleção de DNA cromossômico foi tríada por hibridização em colônia usando a sonda acima mencionada. O procedimento para hibridização em colônia é explicado em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo. Como um resultado, uma cepa cuja colônia hibridizou com a sonda rotulada foi observada. (5) Seqüência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 Plasmídeos possuídos por Escherichia coli JM109 foram preparados a partir a cepa que foi verificada como tendo hibridizado com a sonda rotulada e a seqüência de base de uma porção onde hibridização com a sonda ocorreu assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando kit CEQ DTCS-Quick Start (fabricado por Beckman- Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, foi revelado que uma matriz de leitura aberta que codifica enzima formadora de peptídeo de fato existe. A seqüência de base de comprimento completo do gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Taxeobacter gelupurpurascens DSMZ 11116 junto com a correspondente seqüência de aminoácidos é mostrada em SEQID NO: 22.

Exemplo 11 Isolamento of gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Cvclobacterium marinum ATCC 25205 A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo é descrito O micróbio usado é Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Para o isolamento do gene, Escherichia coli JM109 foi usado como um hospedeiro, e pUCl 18 foi usado como um vetor. (1) Aquisição de células microbianas Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foi cultivado durante 24 horas a 25 °C em um meio agar CM2G (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio liquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 25°C. (2) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml do caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. Um DNA cromossômico foi então adquirido a partir das células microbianas usando o sistema Qiagen Genomic-Tip (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

(3) Aquisição de fragmento de sonda de DNA por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo). Uma reação PCR foi então realizada no DNA cromossômico adquirido de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária;

American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O.

Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) usando iniciadores tendo as seqüências de base de SEQ ID NOs: 15 e 16. O fragmento de aproximadamente 1 kb de DNA amplificado pelo procedimento PCR foi isolado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada. O fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. (4) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes Para adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, Southern hibridização foi realizada usando fragmento de DNA amplificado pelo procedimento PCR acima mencionado como uma sonda. As operações de Southern hibridização são explicadas em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

Após deixar o DNA cromossômico de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) reagir com a enzima de restrição PstI ou HincII a 37°C durante 16 horas para digerir completamente o DNA, o resultante foi submetido a eletroforese em 0,8% agarose gel. A partir do gel agarose após a eletroforese, o DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após a pré-hibridização do filtro a 50°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e hibridização foi realizado a 50°C durante 16 horas. Subsequentemente, o filtro foi lavado duas vezes a 60°C com lxSSC contendo 0,1% SDS.

Como um resultado, uma banda de 7 kb que hibridizou com a sonda foi detectada com sucesso para o produto digerido com PstI e uma banda de 2 kb que hibridizou com a sonda foi detectada com sucesso para o produto digerido com HincII. 5 pg do DNA cromossômico de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foram completamente digeridos com PstI ou HincII. Cerca de 7 kb ou 2 kb DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose. O DNA foi purificado usando o kit Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi) e dissolvido em 10 ml de TE. 4 μΐ da solução resultante e pUCU8 PstI/BAP (fabricado por Takara Shuzo) ou pUC118 HincII/BAP (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml deste líquido de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados para transformar Escherichia coli. Este foi então aplicado em um meio sólido apropriado para produzir uma coleção do DNA cromossômico.

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo. Como um resultado, uma cepa de cada tal colônia hibridizada com a sonda rotulada foi observada. (5) Seqüência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 Plasmídeos possuídos por Escherichia coli JM109 foram preparados a partir de cada cepa que foi verificada como tendo hibridizado com a sonda rotulada e a seqüência de base de uma porção onde hibridização com a sonda ocorreu e assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando CEQ DTCS-Quick Start Kit (fabricado por Beckman-Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, foi revelado que uma matriz de leitura aberta que codifica enzima formadora de peptídeo de fato existe. A seqüência de base de comprimento completo do gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Cyclobacterium marinum ATCC 25205 (Instituição Depositária;

American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O.

Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) junto com a correspondente seqüência de aminoácidos são mostradas em SEQID NO: 24.

Exemplo 12 Isolamento de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Psvchroserpens burtonensis ATCC 700359 A seguir, isolamento de gene de uma enzima formadora de peptídeo é descrito. O micróbio usado é Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América). Para o isolamento do gene, Escherichia coli JM109 foi usado como um hospedeiro, e pUCl 18 foi usado como um vetor. (1) Aquisição de células microbianas Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foi cultivado durante 24 horas a 25°C em um meio agar CM2G (contendo glucose a 50 g/1, extrato de levedura a 10 g/1, peptona a 10 g/1, cloreto de sódio a 5 g/1, e agar a 20 g/1, pH 7,0). Um conjunto completo das células resultantes microbianas foi inoculado em um frasco Sakaguchi de 500 ml contendo 50 ml de meio líquido CM2G (o meio acima mencionado excluindo agar) seguido por cultivo com agitação em 10°C. (2) Aquisição de DNA cromossômico de células microbianas 50 ml do caldo de cultura foram centrifugados (12.000 rpm, 4°C, 15 minutos) para coletar as células microbianas. Um DNA cromossômico foi então adquirido a partir das células microbianas usando o sistema Qiagen Genomic-Tip (Qiagen) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo.

(3) Aquisição de fragmento de sonda de DNA por PCR

Um fragmento de DNA contendo uma porção de gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) foi adquirido pelo método PCR usando LA-Taq (fabricado por Takara Shuzo). Uma reação PCR foi então realizada no DNA cromossômico adquirido de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) usando iniciadores tendo as seqüências de base de SEQID NOs: 15 e 16. O fragmento de aproximadamente 1 kb de DNA amplificado pelo procedimento PCR foi isolado por 0,8% eletroforese de agarose. A banda de marcação foi então cortada e purificada. O fragmento de DNA foi rotulado com sonda digoxinigen usando DIG High Prime (fabricado por Boehringer- Mannheim) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. (4) Clonagem de gene de enzima formadora de peptídeo a partir da coleção de genes Para adquirir o gene de comprimento completo de enzima formadora de peptídeo, hibridização Southern foi realizada usando fragmento de DNA amplificado pelo procedimento PCR acima mencionado como uma sonda. As operações de hibridização Southern são explicadas em Molecular Cloning, 2a. ed., Cold Spring Harbor Press (1989).

Após deixar o DNA cromossômico de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 reagir com enzima de restrição EcoRI a 37°C durante 16 horas para completamente digerir o DNA, o resultante foi submetido a eletroforese em 0,8% agarose gel. A partir do gel agarose após a eletroforese, o DNA cromossômico submetido a eletroforese foi blotted sobre um filtro de membrana de náilon carregado positivamente (fabricado por Roche Diagnostics), seguido por tratamentos consistindo de desnaturação alcalina, neutralização, e imobilização. Hibridização foi realizada usando EASY HYB (fabricado por Boehringer-Mannheim). Após a pré-hibridização do filtro a 50°C durante 1 hora, a sonda rotulada com digoxinigen preparada como descrito acima foi adicionada e hibridização foi realizada a 50°C

Como um resultado, uma banda de grosseiramente 7 kb foi detectada com sucesso que hibridizou com sonda. 5 pg do DNA cromossômico de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 foram completamente digeridos com EcoRI. Cerca de 7 kb de um DNA foram separados por 0,8% eletroforese de gel agarose, o DNA foi purificado usando o kit Gene Clean II Kit (fabricado por Funakoshi), e dissolvido em 10 ml de TE. 4 μΐ da solução resultante e pUC118 EcoRI/BAP (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados e uma reação de ligação foi realizada usando o kit de ligação de DNA Ver. 2 (fabricado por Takara Shuzo). 5 ml deste líquido de reação de ligação e 100 ml de células competentes de Escherichia coli JM109 (fabricado por Takara Shuzo) foram misturados para transformar Escherichia coli. Este foi então aplicado em um meio sólido apropriado para produzir uma coleção do DNA cromossômico.

Detecção de colônias que hibridizaram com a sonda rotulada foi realizada usando o kit de detecção de nucleotídeos DIG (fabricado por Boehringer-Mannheim) com base na explicação descrita no manual do mesmo. Como um resultado, uma cepa cuja colônia hibridizou com a sonda rotulada foi observada. (5) Seqüência de base de gene de enzima formadora de peptídeo derivada de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 Plasmídeos possuídos por Escherichia coli JM109 foram preparados a partir a cepa que foi verificada como tendo hibridizado com a sonda rotulada e a seqüência de base de uma porção onde a hibridização com a sonda ocorreu e assim foi determinada. A reação de sequenciamento foi realizada usando CEQ DTCS-Quick Start Kit (fabricado por Beckman- Coulter) com base no procedimento descrito no manual para o mesmo. Além disso, eletroforese foi realizada usando CEQ 2000-XL (fabricado por Beckman-Coulter).

Como um resultado, foi revelado que uma matriz de leitura aberta que codifica enzima formadora de peptídeo de fato existe. A seqüência de base de comprimento completo do gene de enzima formadora de peptídeo derivado de Psychroserpens burtonensis ATCC 700359 (Instituição Depositária; American Type Culture Collection, Endereço da Instituição Depositária; P.O. Box 1549, Manassas, VA 20110, Estados Unidos da América) junto com a correspondente seqüência de aminoácidos são mostradas em SEQID NO: 26.

Apesar da invenção ter sido descrita com relação a uma forma de realização específica para uma descrição completa e clara, as reivindicações anexas não devem ser assim limitadas e devem ser construídas como englobando todas as modificações e construções alternativas que podem ocorrer a um versado na técnica que estão bem dentro do ensinamento básico aqui especificado.

Texto livre de Listagem de Seqüências SEQ ID NO: 3: iniciador sintético 1 SEQ ID NO: 4: iniciador sintético 2 SEQ ID NO: 5: Gene codificando uma enzima formadora de peptídeo SEQ ID NO: 7: iniciador sintético para preparar pTrpT

SEQ ID NO: 8: iniciador sintético para preparar pTrpT SEQ ID NO: 9: iniciador sintético para preparar pTrpT_Gtg2 SEQ ID NO: 10: iniciador sintético para preparar pTrpT_Gtg2 SEQ ID NO: 11: gene codificando uma enzima formadora de peptídeo SEQ ID NO: 13: iniciador sintético para preparar pTrpT_Sm_aet SEQ ID NO: 14: iniciador sintético para preparar pTrpT_Sm_aet SEQ ID NO: 15: iniciador Mix 1 para Aet SEQ ID NO: 16: iniciador Mix 2 para Aet SEQ ID NO: 19: iniciador 1 para construção de vetores de expressão aet derivados de pPedobacter SEQ ID NO: 20: iniciador 2 para construção de vetores de expressão aet derivados de pedobacterPedobacter SEQ ID NO: 21: iniciador Mix 3 para Aet LISTAGEM DE SEQUÊNCIA <110 > AJINOMOTO CO.,LTD. <120> MÉTODO PARA PRODUZIR BETOTéster DE ALFa-L-aspartil-L-FENILALANINA Ξ MÉTODO PARA PRODUZIR ALFcréster METÍLICO DE ALFCt-L-aspartil-L-FENILALANINA <130> PAMA-15899 <150> JP2003-01S764 <151> 24-01-2003 <1S0> JP2003-201819 <151> 15-07-2003 <150> US60/491,546 <151> 01-08-2003 <160> 27 <170> Patentln Ver. 2.1 <210> 1 <211> 9 <212> PRT <213> Empedobacter brevis <220> <223> Inventor: YOKOZEKI, Kenzo Inventor: OHNO, Ayako Inventor: HARA, Seiichi Inventor: ABE, Isao <400> 1 Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gin Pro Lys 1 5 <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Empedobacter brevis <400> 2 Thr Asn Vai Thr Tyr Thr Met Pro Asp 1 5 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Seqüência artificial <2 2 0 > <223> Descrição de seqüência artificial:iniciador sintetizado 1 <400> 3 ttyacngcna thtaycarcc 20 <210> 4 <211> 23 <212> DNA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial:iniciador sintetizado 2 <400> 4 tcnggcatng trtangtnac rtt 23 <210> 5 <211> 2024 <212> DNA <213> Empedobacter brevis <220>

<221> CDS <222> (Sl) .. (1908) <223> gene codificando enzima formadora de peptídeo <400> 5 atttcttaat aaaaactgaa atcttaatac atttatacta tcgtaaaatt tattgaacac 60 gtg aaa aaa tta aca tta aaa gta act cta ctt aca ctt ttg ttg gga 108 Vai Lys Lys Leu Thr Leu Lys Vai Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly 15 10 15 agt aca gtt gga ttt gcg caa gat gca aaa gca gat tct gct tat gtg 156 Ser Thr Vai Gly Phe Ala Gin Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Vai 20 25 30 cgc gac aat tac gaa aaa ata gaa caa gta att ccg atg cgc gat ggt 204 Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gin Vai Ile Pro Met Arg Asp Gly 35 40 45 aca aag tta ttt aca gct att tat cag cca aaa gat aaa aca aaa caa 252 Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gin Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gin 50 55 60 tat ccc gtt ttg tta aat cgt acg cct tat aca gtt gcg cct tat ggt 300 Tyr Pro Vai Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ala Pro Tyr Gly 65 70 75 80 gta aat gaa tac aag aaa tcg tta gga aat ttt cct aca gaa atg cgc 348 Vai Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg 85 90 95 gaa ggt ttt att ttt gtt tac caa gat gtg aga gga aaa tgg atg age 396 Glu Gly Phe Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser 100 105 110 gaa ggc gaa ttt gaa gat gtt cga cct ata aat cct tea aaa agt aaa 444 Glu Gly Glu Phe Glu Asp Vai Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys 115 120 125 aag gca att gac gaa age aca gat aca ttt gat acg cta gaa tgg ctt 492 Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu 130 135 140 gct aaa aac ttg aag aat tac acg aaa aaa gct gga att tat gga att 540 Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile 145 150 155 ISO tcg tat cct ggt ttt tat tcg aca atg agt ttg gtt aat tcg cat cca 588 Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Vai Asn Ser His Pro 165 170 175 act cta aaa gcc gtt tcg cca caa gcg ccc gtt acc aat tgg ttt tta 635 Thr Leu Lys Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asn Trp Phe Leu 180 185 190 ggt gac gat ttt cat cat aat gga gtt tta ttc ttg aat gat tct ttc 684 Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Vai Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe 195 200 205 tca ttt atg act ttt ttt ggt gta aaa cgt ccg caa cca att acg cca 732 Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Vai Lys Arg Pro Gin Pro Ile Thr Pro 210 215 220 gat aaa ggt ccg aaa cgt ttt gaa tat cca ata aaa gat aat tat aga 780 Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg 225 230 235 240 ttt tat gca agt ggc tct gta aaa gag ttg aaa gat aaa tat ttg caa 828 Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Vai Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gin 245 250 255 gat aat ate aag ttt tac aat gat tta ttt gcg cat cca gat tac gat 876 Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp 260 265 270 caa ttt tgg caa gat cgt aat gtt tta cca cat tta act aac gtg caa 924 Gin Phe Trp Gin Asp Arg Asn Vai Leu Pro His Leu Thr Asn Vai Gin 275 280 285 cct gct gta atg acg gtt gga ggt ttt ttt gat gca gaa gat gtc tac 972 Pro Ala Vai Met Thr Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Vai Tyr 290 295 300 ggc gct ttc gaa acg tat aaa gca att gag aaa caa aat ccg aaa gca 1020 Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gin Asn Pro Lys Ala 305 310 315 320 aca aat att atg gtt gcc gga cct tgg ttt cat ggt ggt tgg gtt cgt 1068 Thr Asn Ile Met Vai Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Vai Arg 325 330 335 age aac gga agt act ttt gga gat atg caa ttt gca tcg aat aca agt 1116 Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gin Phe Ala Ser Asn Thr Ser 340 345 350 gag cat tat cag caa gaa ata gaa ttg cct ttt ttt aat tat tac tta 1164 Glu His Tyr Gin Gin Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu 355 360 365 aaa gat aaa ggt aat ttt aaa cca acc gaa gct aca att ttt att acg 1212 Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr 370 375 380 gga tct aac gaa tgg aaa caa ttt gat gct tgg cca cca aaa aat gta 1260 Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gin Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Vai 385 390 395 400 aca aca caa aaa att tat ttg caa caa aat ggt aaa ata gct ttt aat 1308 Thr Thr Gin Lys Ile Tyr Leu Gin Gin Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn 405 410 415 aaa acc aat aca aca act act ttt gac gaa tat gtt gca gat cca aat 1355 Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Vai Ala Asp Pro Asn 420 425 430 tct cca gtt cct tat tca gga gga gtt tta gaa act cgt tca aga gaa 1404 Ser Pro Vai Pro Tyr Ser Gly Gly Vai Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu 435 440 445 tat atg gtc gat gat caa cgc ttt gct tct act cgt cct gat gtt atg 1452 Tyr Met Vai Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Vai Met 450 455 460 gtg tat caa tct gat att ttg aca gaa gat att acg ctt gct ggt cct 1500 Vai Tyr Gin Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro 465 470 475 480 gtt ate aat cat tta gtg gtt tct act acg gga aca gac gct gat tat 1548 Vai Ile Asn His Leu Vai Vai Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr 485 490 495 gtt gta aaa ttg att gat gtt tat cct gaa aac acg cca aaa ttt aat 1596 Vai Vai Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn 500 505 510 aac aaa tta atg gct gga tat caa aat ttg att cgt gca gaa att atg 1644 Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gin Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met 515 520 525 cgc gga aaa tat aga aat agt ttc tct aac ccc gaa gct atg gtt ccg 1692 Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Vai Pro 530 535 540 aat aaa gaa aca aat gta acg tac acg atg cca gat gtt gga cat aca 1740 Asn Lys Glu Thr Asn Vai Thr Tyr Thr Met Pro Asp Vai Gly His Thr 545 550 555 560 ttt aag aaa gga cat cgc att atg att caa gtt cag aac agt tgg ttt 1788 Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gin Vai Gin Asn Ser Trp Phe 565 570 575 cct tta gca gat cgc aat ccg caa caa ttt atg aat gtt tac gaa gca 1836 Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gin Gin Phe Met Asn Vai Tyr Glu Ala 580 585 590 act tct aaa gat tat tta aaa caa acg caa cga att tat cat act tct 1884 Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gin Thr Gin Arg Ile Tyr His Thr Ser 595 600 605 tat ate gaa att ccg gta ttg aaa taacaaaaaa atccagctaa ttagctggat 1938 Tyr Ile Glu Ile Pro Vai Leu Lys 610 615 tttttttata atgttacttt tcctattttt cctttatttc caactaaaat tacatatttt 1998 ttatcgggcg aaaccgtaca agtatg 2024 <210> 6 <211> 616 <212> ΡΕ.Τ <213 > Erapedobacter brevis <400> 6 Vai Lys Lys Leu Thr Leu Lys Vai Thr Leu Leu Thr Leu Leu Leu Gly 15 10 15 Ser Thr Vai Gly Phe Ala Gin Asp Ala Lys Ala Asp Ser Ala Tyr Vai 20 25 30 Arg Asp Asn Tyr Glu Lys Ile Glu Gin Vai Ile Pro Met Arg Asp Gly 35 40 45 Thr Lys Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Gin Pro Lys Asp Lys Thr Lys Gin 50 55 60 Tyr Pro Vai Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ala Pro Tyr Gly 65 70 75 80 Vai Asn Glu Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Thr Glu Met Arg 85 90 95 Glu Gly Phe Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser 100 105 110 Glu Gly Glu Phe Glu Asp Vai Arg Pro Ile Asn Pro Ser Lys Ser Lys 115 120 125 Lys Ala Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Phe Asp Thr Leu Glu Trp Leu 130 135 140 Ala Lys Asn Leu Lys Asn Tyr Thr Lys Lys Ala Gly Ile Tyr Gly Ile 145 150 155 160 Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Thr Met Ser Leu Vai Asn Ser His Pro 165 170 175 Thr Leu Lys Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asn Trp Phe Leu 180 185 190 Gly Asp Asp Phe His His Asn Gly Vai Leu Phe Leu Asn Asp Ser Phe 195 200 205 Ser Phe Met Thr Phe Phe Gly Vai Lys Arg Pro Gin Pro Ile Thr Pro 210 215 220 Asp Lys Gly Pro Lys Arg Phe Glu Tyr Pro Ile Lys Asp Asn Tyr Arg 225 230 235 240 Phe Tyr Ala Ser Gly Ser Vai Lys Glu Leu Lys Asp Lys Tyr Leu Gin 245 250 255 Asp Asn Ile Lys Phe Tyr Asn Asp Leu Phe Ala His Pro Asp Tyr Asp 260 265 270 Gin Phe Trp Gin Asp Arg Asn Vai Leu Pro His Leu Thr Asn Vai Gin 275 280 285 Pro Ala Vai Met Thr Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Vai Tyr 290 295 300 Gly Ala Phe Glu Thr Tyr Lys Ala Ile Glu Lys Gin Asn Pro Lys Ala 305 310 315 320 Thr Asn Ile Met Vai Ala Gly Pro Trp Phe His Gly Gly Trp Vai Arg 325 330 335 Ser Asn Gly Ser Thr Phe Gly Asp Met Gin Phe Ala Ser Asn Thr Ser 340 345 350 Glu His Tyr Gin Gin Glu Ile Glu Leu Pro Phe Phe Asn Tyr Tyr Leu 355 360 365 Lys Asp Lys Gly Asn Phe Lys Pro Thr Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr 370 375 380 Gly Ser Asn Glu Trp Lys Gin Phe Asp Ala Trp Pro Pro Lys Asn Vai 385 390 395 400 Thr Thr Gin Lys Ile Tyr Leu Gin Gin Asn Gly Lys Ile Ala Phe Asn 405 410 415 Lys Thr Asn Thr Thr Thr Thr Phe Asp Glu Tyr Vai Ala Asp Pro Asn 420 425 430 Ser Pro Vai Pro Tyr Ser Gly Gly Vai Leu Glu Thr Arg Ser Arg Glu 435 440 445 Tyr Met Vai Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Thr Arg Pro Asp Vai Met 450 455 460 Vai Tyr Gin Ser Asp Ile Leu Thr Glu Asp Ile Thr Leu Ala Gly Pro 465 470 475 480 Vai Ile Asn His Leu Vai Vai Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr 485 490 495 Vai Vai Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Glu Asn Thr Pro Lys Phe Asn 500 505 510 Asn Lys Leu Met Ala Gly Tyr Gin Asn Leu Ile Arg Ala Glu Ile Met 515 520 525 Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Ser Asn Pro Glu Ala Met Vai Pro 530 535 540 Asn Lys Glu Thr Asn Vai Thr Tyr Thr Met Pro Asp Vai Gly His Thr 545 550 555 560 Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gin Vai Gin Asn Ser Trp Phe 565 570 575 Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gin Gin Phe Met Asn Vai Tyr Glu Ala 580 585 590 Thr Ser Lys Asp Tyr Leu Lys Gin Thr Gin Arg Ile Tyr His Thr Ser 595 600 605 Tyr Ile Glu Ile Pro Vai Leu Lys 610 615 <210> 7 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de seqüência artificial:iniciador sintetizado para preparação de pTrpT <400> 7 gtatcacgag gccctagctg tggtgtcatg gtcggtgatc 40 <210> 8 <211> 40 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de seqüência artificial:iniciador sintetizado para preparação de pTrpT <400> 8 ttcggggatt ccatatgata ccctttttac gtgaacttgc 40 <210> 9 <211> 38 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de seqüência artificial: iniciador Sintetizado para preparação de pTrpT_Gtg2 <400> 9 gggaattcca tatgaaaaaa ttaacattaa aagtaact 38 <210> 10 <211> 36 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de seqüência artificial:iniciador sintetizado para preparação de pTrpT_Gtg2 <400> 10 gggggctgca gtacttgtac ggtttcgccc gataaa 36 <210> 11 <211> 1935 <212> DNA <213> Sphingobacterium sp. <220>

<221> CDS <222> (61) . . (1917) <223> gene de enzima formadora de peptídeo <400> 11 gaaaccaagt gtaaaattat aatttacacc aaagaatgta ctgaacaaat aattatctga 60 atg aaa aat aca att tcg tgc cta act tta gcg ctt tta age gea age 108 Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser 15 10 15 cag tta cat gct caa aca gct gcc gac tcg gct tat gtt aga gat cat 156 Gin Leu His Ala Gin Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Vai Arg Asp His 20 25 30 tat gaa aag acc gaa gta gea att cee atg cga gat ggg aaa aaa tta 204 Tyr Glu Lys Thr Glu Vai Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu 35 40 45 ttt act gcg ate tac agt cca aaa gac aaa tcc aag aaa tat cca gtt 252 Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Vai 50 55 60 ttg ctc aat aga acg ccc tac acg gtt tea cct tat ggg cag aac gaa 300 Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ser Pro Tyr Gly Gin Asn Glu 65 70 75 80 tat aaa aaa age ttg gga aac ttt ccc caa atg atg cgt gaa ggc tat 348 Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gin Met Met Arg Glu Gly Tyr 85 90 95 att ttc gtt tac cag gat gtc cgt ggc aag tgg atg age gaa ggt gat 396 Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp 100 105 110 ttt gaa gat ata cgt ccg acc acg tac age aaa gat aaa aaa gea ate 444 Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile 115 120 125 gat gaa agt acg gat acc tat gat gcg ctt gaa tgg tta cag aaa aat 492 Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gin Lys Asn 130 135 140 ctc aaa aac tat aat ggc aaa gcc ggg ctc tat ggg att tcc tat cca 540 Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro 145 150 155 160 ggc ttc tat tet acc gtc gga ttg gtc aaa aca cac ccg age ttg aag 588 Gly Phe Tyr Ser Thr Vai Gly Leu Vai Lys Thr His Pro Ser Leu Lys 165 170 175 gea gtc tcc cca cag gct ccc gta aca gac tgg tat ate ggc gac gac 636 Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp 180 185 190 ttc cac cat aat ggc gta ttg ttt ctt cag gat gea ttt aca ttc atg 684 Phe His His Asn Gly Vai Leu Phe Leu Gin Asp Ala Phe Thr Phe Met 195 200 205 tea acc ttt ggt gtc cct cgt cca aaa ccc att aca ccg gat caa ttt 732 Ser Thr Phe Gly Vai Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gin Phe 210 215 220 aag ggc aaa att cag ate aaa gaa gcc gat aaa tat aac ttt ttt gea 780 Lys Gly Lys Ile Gin Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala 225 230 235 240 gaa gca gga aca gcg cgg gaa ctc aaa gaa aag tat ttt ggt gac tcc 828 Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser 245 250 255 gta caa ttt tgg aat gac ctg ttt aag cat ccc gac tat gat gat ttt 876 Vai Gin Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe 260 265 270 tgg aaa tcg cgt gtg ate acg aat tet tta cag gag gta aaa cca gct 924 Trp Lys Ser Arg Vai Ile Thr Asn Ser Leu Gin Glu Vai Lys Pro Ala 275 280 285 gtg atg gtg gtt ggt ggt ttc ttt gac gcg gaa gat gct tat gga aca 972 Vai Met Vai Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr 290 295 300 ttt aag acc tac caa tcg att gag gat aaa age aaa aaa aac aac tcg 1020 Phe Lys Thr Tyr Gin Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser 305 310 315 320 att tta gtc gcg gga cct tgg tat cat ggc ggt tgg gtt cgt gca gaa 1068 Ile Leu Vai Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Vai Arg Ala Glu 325 330 335 gga aac tat tta ggt gat ate caa ttt gag aaa aaa acc agt att act 1116 Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gin Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr 340 345 350 tat cag gaa caa ttt gaa caa cca ttt ttc aaa tat tac cta aaa gat 1164 Tyr Gin Glu Gin Phe Glu Gin Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp 355 360 365 gaa gga aac ttc gcc cct tcc gaa gct aac att ttt gtt tea ggc age 1212 Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Vai Ser Gly Ser 370 375 380 aac gaa tgg aaa cat ttc gaa cag tgg cca cca aaa aat gta gag aca 1260 Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gin Trp Pro Pro Lys Asn Vai Glu Thr 385 390 395 400 aaa aaa cta tac ttc caa cct cag ggg aaa ctt gga ttt gac aaa gtt 1308 Lys Lys Leu Tyr Phe Gin Pro Gin Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Vai 405 410 415 caa cgt aca gat tcc tgg gat gaa tat gta aca gac cct aat aaa cct 1356 Gin Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Vai Thr Asp Pro Asn Lys Pro 420 425 430 gtt ccg cat caa ggt ggg gta att caa aac cga aca cgg gag tat atg 1404 Vai Pro His Gin Gly Gly Vai Ile Gin Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met 435 440 445 gta gat gat caa cgt ttc gcg gct agt cgc cct gat gtc atg gtt tat 1452 Vai Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Vai Met Vai Tyr 450 455 460 caa acg gaa ccg ttg acg gag gac ctg acg ata gta ggc cca ate aaa 1500 Gin Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Vai Gly Pro Ile Lys 465 470 475 480 aac ttt ctc aaa gtt tet tea aca gga aca gac gcg gac tat gtt gtc 1548 Asn Phe Leu Lys Vai Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Vai Vai 485 490 495 aaa ctg att gac gtt tat ccg aat gat gca gca agt tat caa gga aaa 159S

Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gin Gly Lys 500 505 510 aca atg gct gga tat caa atg atg gta cgt ggt gag ate atg gcg ggg 1644 Thr Met Ala Gly Tyr Gin Met Met Vai Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly 515 520 525 aaa tac cga aat ggt ttc gat aaa gcg cag gcc ttg act cca ggt atg 1692 Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gin Ala Leu Thr Pro Gly Met 530 535 540 gtc gaa aag gtg aat ttt gaa atg cca gac gtt gcg cat acc ttc aaa 1740 Vai Glu Lys Vai Asn Phe Glu Met Pro Asp Vai Ala His Thr Phe Lys 545 550 555 560 aaa gga cat cgc att atg gtt cag gta caa aac tea tgg ttt ccg ctg 1788 Lys Gly His Arg Ile Met Vai Gin Vai Gin Asn Ser Trp Phe Pro Leu 565 570 575 gca gaa cga aat cca cag gtg ttt tta gca cct tat aca gct acc aaa 1836 Ala Glu Arg Asn Pro Gin Vai Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys 580 585 590 gct gat ttc cgc aaa gct acc caa cgt att ttt cac gat gtg aac aat 1884 Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gin Arg Ile Phe His Asp Vai Asn Asn 595 600 605 gcc aca tac ate gaa ttt tet gtc ctc aaa gat tagcaggtaa attcgaaa 1935 Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Vai Leu Lys Asp 610 615 <210> 12 <211> 619 <212> PRT <213> Sphingobacteriuin sp. <400> 12 Met Lys Asn Thr Ile Ser Cys Leu Thr Leu Ala Leu Leu Ser Ala Ser 15 10 15 Gin Leu His Ala Gin Thr Ala Ala Asp Ser Ala Tyr Vai Arg Asp His 20 25 30 Tyr Glu Lys Thr Glu Vai Ala Ile Pro Met Arg Asp Gly Lys Lys Leu 35 40 45 Phe Thr Ala Ile Tyr Ser Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro Vai 50 55 60 Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ser Pro Tyr Gly Gin Asn Glu 65 70 75 80 Tyr Lys Lys Ser Leu Gly Asn Phe Pro Gin Met Met Arg Glu Gly Tyr 85 90 95 Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly Asp 100 105 110 Phe Glu Asp Ile Arg Pro Thr Thr Tyr Ser Lys Asp Lys Lys Ala Ile 115 120 125 Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Ala Leu Glu Trp Leu Gin Lys Asn 130 135 140 Leu Lys Asn Tyr Asn Gly Lys Ala Gly Leu Tyr Gly Ile Ser Tyr Pro 145 150 155 160 Gly Phe Tyr Ser Thr Vai Gly Leu Vai Lys Thr His Pro Ser Leu Lys 165 170 175 Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asp Trp Tyr Ile Gly Asp Asp 180 185 190 Phe His His Asn Gly Vai Leu Phe Leu Gin Asp Ala Phe Thr Phe Met 195 200 205 Ser Thr Phe Gly Vai Pro Arg Pro Lys Pro Ile Thr Pro Asp Gin Phe 210 215 220 Lys Gly Lys Ile Gin Ile Lys Glu Ala Asp Lys Tyr Asn Phe Phe Ala 225 230 235 240 Glu Ala Gly Thr Ala Arg Glu Leu Lys Glu Lys Tyr Phe Gly Asp Ser 245 250 255 Vai Gin Phe Trp Asn Asp Leu Phe Lys His Pro Asp Tyr Asp Asp Phe 260 265 270 Trp Lys Ser Arg Vai Ile Thr Asn Ser Leu Gin Glu Vai Lys Pro Ala 275 280 285 Vai Met Vai Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Ala Tyr Gly Thr 290 295 300 Phe Lys Thr Tyr Gin Ser Ile Glu Asp Lys Ser Lys Lys Asn Asn Ser 305 310 315 320 Ile Leu Vai Ala Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Vai Arg Ala Glu 325 330 335 Gly Asn Tyr Leu Gly Asp Ile Gin Phe Glu Lys Lys Thr Ser Ile Thr 340 345 350 Tyr Gin Glu Gin Phe Glu Gin Pro Phe Phe Lys Tyr Tyr Leu Lys Asp 355 360 365 Glu Gly Asn Phe Ala Pro Ser Glu Ala Asn Ile Phe Vai Ser Gly Ser 370 375 380 Asn Glu Trp Lys His Phe Glu Gin Trp Pro Pro Lys Asn Vai Glu Thr 385 390 395 400 Lys Lys Leu Tyr Phe Gin Pro Gin Gly Lys Leu Gly Phe Asp Lys Vai 405 410 415 Gin Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Vai Thr Asp Pro Asn Lys Pro 420 425 430 Vai Pro His Gin Gly Gly Vai Ile Gin Asn Arg Thr Arg Glu Tyr Met 435 440 445 Vai Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala Ser Arg Pro Asp Vai Met Vai Tyr 450 455 460 Gin Thr Glu Pro Leu Thr Glu Asp Leu Thr Ile Vai Gly Pro Ile Lys 465 470 475 480 Asn Phe Leu Lys Vai Ser Ser Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr Vai Vai 485 490 495 Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Asn Asp Ala Ala Ser Tyr Gin Gly Lys 500 505 510 Thr Met Ala Gly Tyr Gin Met Met Vai Arg Gly Glu Ile Met Ala Gly 515 520 525 Lys Tyr Arg Asn Gly Phe Asp Lys Ala Gin Ala Leu Thr Pro Gly Met 530 535 540 Vai Glu Lys Vai Asn Phe Glu Met Pro Asp Vai Ala His Thr Phe Lys 545 550 555 560 Lys Gly His Arg Ile Met Vai Gin Vai Gin Asn Ser Trp Phe Pro Leu 565 570 575 Ala Glu Arg Asn Pro Gin Vai Phe Leu Ala Pro Tyr Thr Ala Thr Lys 580 585 590 Ala Asp Phe Arg Lys Ala Thr Gin Arg Ile Phe His Asp Vai Asn Asn 595 600 605 Ala Thr Tyr Ile Glu Phe Ser Vai Leu Lys Asp 610 615 <210> 13 <211> 30 <212> DMA <213> Sequência artificial <220> <223> Descrição de sequência artificial:iniciador sintetizado para preparação de pTrpT_Sm_aet <400> 13 gggaattcca tatgaaaaat acaatttcgt 30 <210> 14 <211> 29 <212> DNA <213> Seqüência artificial <220> <223> Descrição de seqüência artificial:iniciador sintetizado para preparação de pTrpT_Sm_aet <400> 14 gctctagact aatctttgag gacagaaaa 29 < 210 > 15 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <2 2 Ο > <223> iniciador mix 1 para Aet <400> 15 gaygayttyc aycayaa 17 <210> 16 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador mix 2 para Aet <220> <221> misc_aspecto <222> (9)..(9) <223> qualquer base <400> 16 tgrtcrtcna ccatrtaytc 20 <210> 17 <211> 1974 <212> DNA <213> Pedobacter heparinus <220>

<221> CDS <222> (61) . . (1935) <223 > <400> 17 aaacctatcc cgtattcagc aatcaattcc atatatttat ccttaaaaaa accttcctct 60 atg act cct ttc aaa tcg ttc tcc ttc att ttt ctc ttt att ttt acc 108 Met Thr Pro Phe Lys Ser Phe Ser Phe Ile Phe Leu Phe Ile Phe Thr 15 10 15 agt ctt tct gct tct gca caa cag tcc gac tct gct tat ata cgt cag 156 Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gin Gin Ser Asp Ser Ala Tyr Ile Arg Gin 20 25 30 aac tat acc aaa ata gaa agg ctg ate cct atg cgg gat ggc att aag 204 Asn Tyr Thr Lys Ile Glu Arg Leu Ile Pro Met Arg Asp Gly Ile Lys 35 40 45 cta ttt aca gcc att tac ate ccc aaa gac aaa age aag aag tat cct 252 Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro 50 55 60 ttt atg ctc aac cgt act cct tat acc gtt tcg cct tat ggc gaa aac 300 Phe Met Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ser Pro Tyr Gly Glu Asn 65 70 75 80 aat tat aaa aca age ctt ggc ccc tet ccg etc ttt ata aaa gaa ggc 348 Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Gly Pro Ser Pro Leu Phe Ile Lys Glu Gly 85 90 95 ttt ate ttt gtt tat cag gat gta agg ggc aaa tgg atg agt gag gga 396 Phe Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly 100 105 110 aaa ttt gaa gac gta agg ccg caa ata gcc age aag aaa cgc aaa acg 444 Lys Phe Glu Asp Vai Arg Pro Gin Ile Ala Ser Lys Lys Arg Lys Thr 115 120 125 gat att gat gaa age tcc gat act tat gat acg ate gac tgg ctg ate 492 Asp Ile Asp Glu Ser Ser Asp Thr Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Ile 130 135 140 agg aac att cct gga aac aac cgt aaa acc ggt att tac ggt ate tea 540 Arg Asn Ile Pro Gly Asn Asn Arg Lys Thr Gly Ile Tyr Gly Ile Ser 145 150 155 160 tac cea ggc ttt tat gct act gct gcc cta cca gat gcg cat cca tet 588 Tyr Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ala Ala Leu Pro Asp Ala His Pro Ser 165 170 175 tta aag gea gta tcg ccc cag gct ccg gtt acc gac tgg ttt ata ggc 636 Leu Lys Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asp Trp Phe Ile Gly 180 185 190 gat gat ttt cat cac aat ggc acc ttg ttc ctt gea gat ate ttt age 684 Asp Asp Phe His His Asn Gly Thr Leu Phe Leu Ala Asp Ile Phe Ser 195 200 205 ttc tat tat acc ttc ggg gta ccg cga cct caa cca att acg ccc gac 732 Phe Tyr Tyr Thr Phe Gly Vai Pro Arg Pro Gin Pro Ile Thr Pro Asp 210 215 220 aaa cgt cca aaa ccc ttt gat ttc ccg gtt aaa gac aac tac cgt ttt 780 Lys Arg Pro Lys Pro Phe Asp Phe Pro Vai Lys Asp Asn Tyr Arg Phe 225 230 235 240 ttt ctt gaa ctg ggc ccc tta aaa aac ate acc aaa aaa tat tat ggc 828 Phe Leu Glu Leu Gly Pro Leu Lys Asn Ile Thr Lys Lys Tyr Tyr Gly 245 250 255 gat acc ata cga ttc tgg aat gat ate aat gcg cat acc aat tat gat 876 Asp Thr Ile Arg Phe Trp Asn Asp Ile Asn Ala His Thr Asn Tyr Asp 260 265 270 gcc ttc tgg aaa gcc cgt aac att acg ccg cat tta att ggt gta aaa 924 Ala Phe Trp Lys Ala Arg Asn Ile Thr Pro His Leu Ile Gly Vai Lys 275 280 285 cct gea gtt ttg gta gtt ggc ggc ttc ttt gat gea gaa gac ctt tac 972 Pro Ala Vai Leu Vai Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr 290 295 300 ggt acg ctt aaa acc tat cag gcc ate gaa aaa caa aat cca tcc tea 1020 Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Gin Ala Ile Glu Lys Gin Asn Pro Ser Ser 305 310 315 320 aaa aac aac ctc gtt atg ggc ccc tgg tac cat ggt ggc tgg gca aga 10S8 Lys Asn Asn Leu Vai Met Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Ala Arg 325 330 335 agt acg gga age agt ttc ggg gat att aat ttc gga cag cca acc agt 1116 Ser Thr Gly Ser Ser Phe Gly Asp Ile Asn Phe Gly Gin Pro Thr Ser 340 345 350 act tea tac cag caa aat gtt gag ttc cct ttc ttt atg caa tac ctc 1164 Thr Ser Tyr Gin Gin Asn Vai Glu Phe Pro Phe Phe Met Gin Tyr Leu 355 360 365 aaa gag gca ccg gat gca aaa att gca gag gca acc att ttt ate act 1212 Lys Glu Ala Pro Asp Ala Lys Ile Ala Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr 370 375 380 ggc age aat gaa tgg aag aaa ttt age tcc tgg cca cct cag gat aca 1260 Gly Ser Asn Glu Trp Lys Lys Phe Ser Ser Trp Pro Pro Gin Asp Thr 385 390 395 400 gaa gaa aga aca tta tac ctg cag ccc aat ggc aaa ctg age ttt gag 1308 Glu Glu Arg Thr Leu Tyr Leu Gin Pro Asn Gly Lys Leu Ser Phe Glu 405 410 415 aag gta cag cgg acc gac age tgg gat gaa tat gta agt gat ccc aat 1356 Lys Vai Gin Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Vai Ser Asp Pro Asn 420 425 430 tea cct gtc cct tat cag gat ggc ata caa acc age aga acc cgg gaa 1404 Ser Pro Vai Pro Tyr Gin Asp Gly Ile Gin Thr Ser Arg Thr Arg Glu 435 440 445 tat atg ate gat gac cag cgt ttt gcc tcg cgc aga ccg gat gta agg 1452 Tyr Met Ile Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Arg Arg Pro Asp Vai Arg 450 455 460 gta ttc caa aca gag ccc ctc agt tcc gac ctt aca ctt acc ggc ccg 1500 Vai Phe Gin Thr Glu Pro Leu Ser Ser Asp Leu Thr Leu Thr Gly Pro 465 470 475 480 gta ttg gcc aaa ctg gtg gta tea acc aca ggt acg gat gca gat tat 1548 Vai Leu Ala Lys Leu Vai Vai Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr 485 490 495 gtg gta aaa ctg ata gat gta tat ccg gaa gat aca cca aat cct gta 1596 Vai Vai Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Glu Asp Thr Pro Asn Pro Vai 500 505 510 cct aac cct aaa aac ctg ate atg ggt ggt tac cag atg ctg gta cgc 1644 Pro Asn Pro Lys Asn Leu Ile Met Gly Gly Tyr Gin Met Leu Vai Arg 515 520 525 ggc gag ate atg cgt gga aaa tac cgt aat age ttt gaa aaa ccc gag 1692 Gly Glu Ile Met Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Glu Lys Pro Glu 530 535 540 cct ttt gtt cct gga aca att aca aaa gta aac tat gcc ctt ccg gat 1740 Pro Phe Vai Pro Gly Thr Ile Thr Lys Vai Asn Tyr Ala Leu Pro Asp 545 550 555 560 gta gcc cat acc ttt aaa aaa ggc cac cgc ate atg ate cag gtc cag 1788 Vai Ala His Thr Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gin Vai Gin 565 570 575 aat tca tgg ttt ccc ctg gcc gac cgg aat cca cag cag ttt atg gac 1836 Asn Ser Trp Phe Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gin Gin Phe Met Asp 580 585 590 att tac cag gcc gaa cct ggc gat ttc aga aaa gct acg cat agg ate 1884 Ile Tyr Gin Ala Glu Pro Gly Asp Phe Arg Lys Ala Thr His Arg Ile 595 600 605 ttc cac gat gta cac aat gea tet gea att acg gta aac gta ctg aaa 1932 Phe His Asp Vai His Asn Ala Ser Ala Ile Thr Vai Asn Vai Leu Lys 610 615 620 cct taaaacggat gaaaccagta tattgtgcca tccttactt 1974 Pro 625 <210> 18 <211> 625 <212> PRT <213> Pedobacter heparinus <400> 18 Met Thr Pro Phe Lys Ser Phe Ser Phe Ile Phe Leu Phe Ile Phe Thr 15 10 15 Ser Leu Ser Ala Ser Ala Gin Gin Ser Asp Ser Ala Tyr Ile Arg Gin 20 25 30 Asn Tyr Thr Lys Ile Glu Arg Leu Ile Pro Met Arg Asp Gly Ile Lys 35 40 45 Leu Phe Thr Ala Ile Tyr Ile Pro Lys Asp Lys Ser Lys Lys Tyr Pro 50 55 60 Phe Met Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Thr Vai Ser Pro Tyr Gly Glu Asn 65 70 75 80 Asn Tyr Lys Thr Ser Leu Gly Pro Ser Pro Leu Phe Ile Lys Glu Gly 85 90 95 Phe Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Lys Trp Met Ser Glu Gly 100 105 110 Lys Phe Glu Asp Vai Arg Pro Gin Ile Ala Ser Lys Lys Arg Lys Thr 115 120 125 Asp Ile Asp Glu Ser Ser Asp Thr Tyr Asp Thr Ile Asp Trp Leu Ile 130 135 140 Arg Asn Ile Pro Gly Asn Asn Arg Lys Thr Gly Ile Tyr Gly Ile Ser 145 150 155 160 Tyr Pro Gly Phe Tyr Ala Thr Ala Ala Leu Pro Asp Ala His Pro Ser 165 170 175 Leu Lys Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Vai Thr Asp Trp Phe Ile Gly 180 185 190 Asp Asp Phe His His Asn Gly Thr Leu Phe Leu Ala Asp Ile Phe Ser 195 200 205 Phe Tyr Tyr Thr Phe Gly Vai Pro Arg Pro Gin Pro Ile Thr Pro Asp 210 215 220 Lys Arg Pro Lys Pro Phe Asp Phe Pro Vai Lys Asp Asn Tyr Arg Phe 225 230 235 240 Phe Leu Glu Leu Gly Pro Leu Lys Asn Ile Thr Lys Lys Tyr Tyr Gly 245 250 255 Asp Thr Ile Arg Phe Trp Asn Asp Ile Asn Ala His Thr Asn Tyr Asp 260 265 270 Ala Phe Trp Lys Ala Arg Asn Ile Thr Pro His Leu Ile Gly Vai Lys 275 280 285 Pro Ala Vai Leu Vai Vai Gly Gly Phe Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr 290 295 300 Gly Thr Leu Lys Thr Tyr Gin Ala Ile Glu Lys Gin Asn Pro Ser Ser 305 310 315 320 Lys Asn Asn Leu Vai Met Gly Pro Trp Tyr His Gly Gly Trp Ala Arg 325 330 335 Ser Thr Gly Ser Ser Phe Gly Asp Ile Asn Phe Gly Gin Pro Thr Ser 340 345 350 Thr Ser Tyr Gin Gin Asn Vai Glu Phe Pro Phe Phe Met Gin Tyr Leu 355 360 365 Lys Glu Ala Pro Asp Ala Lys Ile Ala Glu Ala Thr Ile Phe Ile Thr 370 375 380 Gly Ser Asn Glu Trp Lys Lys Phe Ser Ser Trp Pro Pro Gin Asp Thr 385 390 395 400 Glu Glu Arg Thr Leu Tyr Leu Gin Pro Asn Gly Lys Leu Ser Phe Glu 405 410 415 Lys Vai Gin Arg Thr Asp Ser Trp Asp Glu Tyr Vai Ser Asp Pro Asn 420 425 430 Ser Pro Vai Pro Tyr Gin Asp Gly Ile Gin Thr Ser Arg Thr Arg Glu 435 440 445 Tyr Met Ile Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Arg Arg Pro Asp Vai Arg 450 455 460 Vai Phe Gin Thr Glu Pro Leu Ser Ser Asp Leu Thr Leu Thr Gly Pro 465 470 475 480 Vai Leu Ala Lys Leu Vai Vai Ser Thr Thr Gly Thr Asp Ala Asp Tyr 485 490 495 Vai Vai Lys Leu Ile Asp Vai Tyr Pro Glu Asp Thr Pro Asn Pro Vai 500 505 510 Pro Asn Pro Lys Asn Leu Ile Met Gly Gly Tyr Gin Met Leu Vai Arg 515 520 525 Gly Glu Ile Met Arg Gly Lys Tyr Arg Asn Ser Phe Glu Lys Pro Glu 530 535 540 Pro Phe Vai Pro Gly Thr Ile Thr Lys Vai Asn Tyr Ala Leu Pro Asp 545 550 555 560 Vai Ala His Thr Phe Lys Lys Gly His Arg Ile Met Ile Gin Vai Gin 565 570 575 Asn Ser Trp Phe Pro Leu Ala Asp Arg Asn Pro Gin Gin Phe Met Asp 580 585 590 Ile Tyr Gin Ala Glu Pro Gly Asp Phe Arg Lys Ala Thr His Arg Ile 595 600 605 Phe His Asp Vai His Asn Ala Ser Ala Ile Thr Vai Asn Vai Leu Lys 610 615 620 Pro 625 <210> 19 <211> 38 <212> DNA <213> Artificial < 2 2 Ο > <223> iniciador 1 para construção de um vetor de expressão para aet derivado de Pedobacter <400> 19 gggaattcca tatgactcct ttcaaatcgt tctccttc 38 <210> 20 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador 1 para construção de um vetor de expressão para aet derivado de Pedobacter <400> 20 cccaagcttt taaggtttca gtacgtttac 30 <210> 21 <211> 17 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> iniciador mix 3 para Aet <220> <221> misc_aspecto <222> (9)..(9) <223> qualquer base <400> 21 athttygtnt aycarga 17 <210> 22 <211> 2018 <212> DNA <213> Taxeobacter gelupurpurascens <220>

<221> CDS <222> (61) .. (1995) <223> <400> 22 ctgaatgtct gctgacgaat tggaactaca ttaggctcgt tcttcaccta cccttccact 60 atg ccc tac tct ttc ccg aaa gtt gcc gcc ctg agt ggc cta ctg gtg 108 Met Pro Tyr Ser Phe Pro Lys Vai Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Vai 15 10 15 gcc ggt tta tcc ggt gcc cac gcc caa act cct gtt acc tat ccg ctg 156 Ala Gly Leu Ser Gly Ala His Ala Gin Thr Pro Vai Thr Tyr Pro Leu 20 25 30 gct tct gag gct gaa aaa gcg cag ctg gcg gtg gta cta gcc gat acg 204 Ala Ser Glu Ala Glu Lys Ala Gin Leu Ala Vai Vai Leu Ala Asp Thr 35 40 45 gct tac ate aag gag cgc tat acc aaa aca gaa tat cag att ccg atg 252 Ala Tyr Ile Lys Glu Arg Tyr Thr Lys Thr Glu Tyr Gin Ile Pro Met 50 55 60 cgc gat ggg gtg aag ttg tac acc att gtg tac gcg ccc aac gat gcc 300 Arg Asp Gly Vai Lys Leu Tyr Thr Ile Vai Tyr Ala Pro Asn Asp Ala 65 70 75 80 aac aag gta aag tac cct att ctg ctc aac cgt acc cct tac gct att 348 Asn Lys Vai Lys Tyr Pro Ile Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Ala Ile 85 90 95 ggc ccc tac ggc ccc ggc aaa tac aag ctc aac ctg ggc ccc age 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gcg ttc ttc ctg 732 Ala Asp Trp Phe Trp Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe Phe Leu 210 215 220 ccg cac gct ttc aac ttc ctg gcc tcc ttt ggg ctg gcc cgc ccc cag 780 Pro His Ala Phe Asn Phe Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Arg Pro Gin 225 230 235 240 ccc acg cct acc ggc aac ccc ggc ttc aag cac ggc acc ccc gat ggc 828 Pro Thr Pro Thr Gly Asn Pro Gly Phe Lys His Gly Thr Pro Asp Gly 245 250 255 tac gat ttt ttc ctg aag atg ggt ccg ctg aaa aac gct gat gcc aac 876 Tyr Asp Phe Phe Leu Lys Met Gly Pro Leu Lys Asn Ala Asp Ala Asn 260 265 270 tac tac aaa ggc aaa gtg gcc ttc tgg aac gaa atg gcc age cac ccc 924 Tyr Tyr Lys Gly Lys Vai Ala Phe Trp Asn Glu Met Ala Ser His Pro 275 280 285 aac tac gac gaa ttc tgg cag gcc cgt aac cta cgc ccc cac ctc aag 972 Asn Tyr Asp Glu Phe Trp Gin Ala Arg Asn Leu Arg Pro His Leu Lys 290 295 300 aac ctc aac aaa ggc acc gcg gtg ctc acg gtt ggt ggc ttc aat gat 1020 Asn Leu Asn Lys Gly Thr Ala Vai Leu Thr Vai Gly Gly Phe Asn Asp 305 310 315 320 gcc gag gac ctg ttt ggc gcc ctg aaa acc tac gaa age ate gag aag 1068 Ala Glu Asp Leu Phe Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Glu Ser Ile Glu Lys 325 330 335 caa aac ccc ggc atg cgc aac ggc ctc gtg atg ggg ccg tgg gta cac 1116 Gin Asn Pro Gly Met Arg Asn Gly Leu Vai Met Gly Pro Trp Vai His 340 345 350 ggt ggc tgg gcc cgc ggc act ggc gaa atg gta ggc aat gtg gcc tac 1164 Gly Gly Trp Ala Arg Gly Thr Gly Glu Met Vai Gly Asn Vai Ala Tyr 355 360 365 ggc gag tcg ccg tcg ttg tat tac cag aag cag att gaa gcg ccg ttc 1212 Gly Glu Ser Pro Ser Leu Tyr Tyr Gin Lys Gin Ile Glu Ala Pro Phe 370 375 380 ttc aaa tea tat ctg aag gat ggc aaa cct gcc gct acc ccc gag gct 1260 Phe Lys Ser Tyr Leu Lys Asp Gly Lys Pro Ala Ala Thr Pro Glu Ala 385 390 395 400 acc ate ttt gaa age ggc acc aac cgc tgg cgc age ttc gaa acc tgg 1308 Thr Ile Phe Glu Ser Gly Thr Asn Arg Trp Arg Ser Phe Glu Thr Trp 405 410 415 ccg ccc aaa gaa gcc aaa gag cgc act ttg tac ttt cag tcg gcc ggg 1356 Pro Pro Lys Glu Ala Lys Glu Arg Thr Leu Tyr Phe Gin Ser Ala Gly 420 425 430 aaa ate ggc ttc gag aag cct gcc agt ggc cta gag tac gac cag ttc 1404 Lys Ile Gly Phe Glu Lys Pro Ala Ser Gly Leu Glu Tyr Asp Gin Phe 435 440 445 ctc age gac ccg gct cac cca gtg cct ttc acc gaa gct acg gct acg 1452 Leu Ser Asp Pro Ala His Pro Vai Pro Phe Thr Glu Ala Thr Ala Thr 450 455 460 ggc atg acc cgc gag tac atg acc gac gac cag cgc ttc gcc age cgc 1500 Gly Met Thr Arg Glu Tyr Met Thr Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Arg 465 470 475 480 cgc ccc gac gtg ctg acc tac cag acc gaa gcg ctt acc gag gac atg 1548 Arg Pro Asp Vai Leu Thr Tyr Gin Thr Glu Ala Leu Thr Glu Asp Met 485 490 495 acg ctg gct ggc cct ate gag gcg ctg ttg cag gta gcc acc acc ggc 1596 Thr Leu Ala Gly Pro Ile Glu Ala Leu Leu Gin Vai Ala Thr Thr Gly 500 505 510 acc gat gcc gac tgg gta gtg aag att att gat gtg tac ccc gac gat 1644 Thr Asp Ala Asp Trp Vai Vai Lys Ile Ile Asp Vai Tyr Pro Asp Asp 515 520 525 acg ccc aac aac ccc age acg aac ccc gcc gtg aaa ctg ggc ggc tac 1692 Thr Pro Asn Asn Pro Ser Thr Asn Pro Ala Vai Lys Leu Gly Gly Tyr S30 535 540 cag cag atg gtt cgc tcc gag gtg atg cgc ggt cgt ttc cgc aac age 1740 Gin Gin Met Vai Arg Ser Glu Vai Met Arg Gly Arg Phe Arg Asn Ser 545 550 555 560 ttc tcc aag ccc gaa gcc ttt gta ccg gaa cag gta acg gcc gtg ccc 1788 Phe Ser Lys Pro Glu Ala Phe Vai Pro Glu Gin Vai Thr Ala Vai Pro 565 570 575 ttc acg gtg cag gac ctg tgc cac acc ttc cgg aaa gga cac cgc ctg 1836 Phe Thr Vai Gin Asp Leu Cys His Thr Phe Arg Lys Gly His Arg Leu 580 585 590 atg gtg cag gtg caa age age tgg ttc ccg att gtt gac cgc aac ccg 1884 Met Vai Gin Vai Gin Ser Ser Trp Phe Pro Ile Vai Asp Arg Asn Pro 595 600 605 cag acc ttc gta ccc aat att ttc gag gcc gat gag aag gat ttc cag 1932 Gin Thr Phe Vai Pro Asn Ile Phe Glu Ala Asp Glu Lys Asp Phe Gin 610 615 620 gcc gcc acg cat cgg ctg tac cat tcg ccg gcg cat age tcg cag ctc 1980 Ala Ala Thr His Arg Leu Tyr His Ser Pro Ala His Ser Ser Gin Leu 625 630 635 640 acg ttg cgc gtt ctg taggccactc taaacaggct cgg 2018 Thr Leu Arg Vai Leu 645 <210> 23 <211> 645 <212> PRT <213> Taxeobacter gelupurpurascens <400> 23 Met Pro Tyr Ser Phe Pro Lys Vai Ala Ala Leu Ser Gly Leu Leu Vai 15 10 15 Ala Gly Leu Ser Gly Ala His Ala Gin Thr Pro Vai Thr Tyr Pro Leu 20 25 30 Ala Ser Glu Ala Glu Lys Ala Gin Leu Ala Vai Vai Leu Ala Asp Thr 35 40 45 Ala Tyr Ile Lys Glu Arg Tyr Thr Lys Thr Glu Tyr Gin Ile Pro Met 50 55 60 Arg Asp Gly Vai Lys Leu Tyr Thr Ile Vai Tyr Ala Pro Asn Asp Ala 65 70 75 80 Asn Lys Vai Lys Tyr Pro Ile Leu Leu Asn Arg Thr Pro Tyr Ala Ile 85 90 95 Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Lys Tyr Lys Leu Asn Leu Gly Pro Ser Ser 100 105 110 Thr Met Met His Glu Gly Tyr Ile Phe Ala Tyr Gin Asp Vai Arg Gly 115 120 125 Arg Tyr Met Ser Glu Gly Glu Phe Vai Asp Vai Arg Pro Glu Lys Asp 130 135 140 Met His Lys Gly Lys Asn Asp Ile Asp Glu Gly Thr Asp Thr Tyr Asp 145 150 155 160 Thr Ile Glu Trp Leu Leu Lys His Gly Pro Lys Asn Asn Gly Arg Vai 165 170 175 Gly Gin Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Tyr Tyr Thr Ala Thr Gly Leu 180 185 190 Leu Ser Arg His Lys Ala Leu Lys Ala Ser Ser Pro Gin Ala Pro Ile 195 200 205 Ala Asp Trp Phe Trp Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Phe Phe Leu 210 215 220 Pro His Ala Phe Asn Phe Leu Ala Ser Phe Gly Leu Ala Arg Pro Gin 225 230 235 240 Pro Thr Pro Thr Gly Asn Pro Gly Phe Lys His Gly Thr Pro Asp Gly 245 250 255 Tyr Asp Phe Phe Leu Lys Met Gly Pro Leu Lys Asn Ala Asp Ala Asn 260 265 270 Tyr Tyr Lys Gly Lys Vai Ala Phe Trp Asn Glu Met Ala Ser His Pro 275 280 285 Asn Tyr Asp Glu Phe Trp Gin Ala Arg Asn Leu Arg Pro His Leu Lys 290 295 300 Asn Leu Asn Lys Gly Thr Ala Vai Leu Thr Vai Gly Gly Phe Asn Asp 305 310 315 320 Ala Glu Asp Leu Phe Gly Ala Leu Lys Thr Tyr Glu Ser Ile Glu Lys 325 330 335 Gin Asn Pro Gly Met Arg Asn Gly Leu Vai Met Gly Pro Trp Vai His 340 345 350 Gly Gly Trp Ala Arg Gly Thr Gly Glu Met Vai Gly Asn Vai Ala Tyr 355 360 365 Gly Glu Ser Pro Ser Leu Tyr Tyr Gin Lys Gin Ile Glu Ala Pro Phe 370 375 380 Phe Lys Ser Tyr Leu Lys Asp Gly Lys Pro Ala Ala Thr Pro Glu Ala 385 390 395 400 Thr Ile Phe Glu Ser Gly Thr Asn Arg Trp Arg Ser Phe Glu Thr Trp 405 410 415 Pro Pro Lys Glu Ala Lys Glu Arg Thr Leu Tyr Phe Gin Ser Ala Gly 420 425 430 Lys Ile Gly Phe Glu Lys Pro Ala Ser Gly Leu Glu Tyr Asp Gin Phe 435 440 445 Leu Ser Asp Pro Ala His Pro Vai Pro Phe Thr Glu Ala Thr Ala Thr 450 455 460 Gly Met Thr Arg Glu Tyr Met Thr Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ser Arg 465 470 475 480 Arg Pro Asp Vai Leu Thr Tyr Gin Thr Glu Ala Leu Thr Glu Asp Met 485 490 495 Thr Leu Ala Gly Pro Ile Glu Ala Leu Leu Gin Vai Ala Thr Thr Gly 500 505 510 Thr Asp Ala Asp Trp Vai Vai Lys Ile Ile Asp Vai Tyr Pro Asp Asp 515 520 525 Thr Pro Asn Asn Pro Ser Thr Asn Pro Ala Vai Lys Leu Gly Gly Tyr 530 535 540 Gin Gin Met Vai Arg Ser Glu Vai Met Arg Gly Arg Phe Arg Asn Ser 545 550 555 560 Phe Ser Lys Pro Glu Ala Phe Vai Pro Glu Gin Vai Thr Ala Vai Pro 565 570 575 Phe Thr Vai Gin Asp Leu Cys His Thr Phe Arg Lys Gly His Arg Leu 580 585 590 Met Vai Gin Vai Gin Ser Ser Trp Phe Pro Ile Vai Asp Arg Asn Pro 595 600 605 Gin Thr Phe Vai Pro Asn Ile Phe Glu Ala Asp Glu Lys Asp Phe Gin 610 615 620 Ala Ala Thr His Arg Leu Tyr His Ser Pro Ala His Ser Ser Gin Leu 625 630 635 640 Thr Leu Arg Vai Leu 645 <210> 24 <2U> 1931 <212> DNA <213> Cyclobacterium raarinum <220>

<221> CDS <222> (29) . . (1888) <223> <400> 24 cccaaagcat taacaaaata atttagtc atg aaa cac tgt tac aaa ctt ctg 52 Met Lys His Cys Tyr Lys Leu Leu 1 5 gtc ttt tac aca tta ttt ttg atg acc aca aac tgg gct tta tca caa 100 Vai Phe Tyr Thr Leu Phe Leu Met Thr Thr Asn Trp Ala Leu Ser Gin 10 15 20 gcc att aat gga tat gat aag gca gcc tat gac att cct atg cga gat 148 Ala Ile Asn Gly Tyr Asp Lys Ala Ala Tyr Asp Ile Pro Met Arg Asp 25 30 35 40 gga gtt cac ctt cac acc ate gtc tat age ccc aaa gat tta tcg cag 196 Gly Vai His Leu His Thr Ile Vai Tyr Ser Pro Lys Asp Leu Ser Gin 45 50 55 ccc tat cct ata ttg atg caa agg aca cct tac age gcc ggc cct tat 244 Pro Tyr Pro Ile Leu Met Gin Arg Thr Pro Tyr Ser Ala Gly Pro Tyr 60 65 70 ggt cct gga aat atg aaa aat aag ctt ggc cct tet cag ttt tta atg 292 Gly Pro Gly Asn Met Lys Asn Lys Leu Gly Pro Ser Gin Phe Leu Met 75 80 85 aac gat ggc tat ata ttt gtt tac cag gat gta aga ggg cgg tgg atg 340 Asn Asp Gly Tyr Ile Phe Vai Tyr Gin Asp Vai Arg Gly Arg Trp Met 90 95 100 tcg gaa gga tcc tat gac aac atg cgc cct acc cta tcc aaa tca gaa 388 Ser Glu Gly Ser Tyr Asp Asn Met Arg Pro Thr Leu Ser Lys Ser Glu 105 110 115 120 aga aat tcc aac caa ata gac gaa age aca gac acc tat gat acc ata 436 Arg Asn Ser Asn Gin Ile Asp Glu Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Thr Ile 125 130 135 gaa tgg ttg ctc gcc aat ate aaa aat cac aat gaa aaa gta ggc cta 484 Glu Trp Leu Leu Ala Asn Ile Lys Asn His Asn Glu Lys Vai Gly Leu 140 145 150 tgg gga ate age tat cee gga ttt tat agt gct gea gcc ctt cct ttt 532 Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe 155 160 165 gcc cat cca aac ctg aaa gcc gtt tcc cct caa gea ccc ata ggg gat 580 Ala His Pro Asn Leu Lys Ala Vai Ser Pro Gin Ala Pro Ile Gly Asp 170 175 180 ttt tac ttt gat gat ttt cat cat aac ggt gct tac tta tta agt tat 628 Phe Tyr Phe Asp Asp Phe His His Asn Gly Ala Tyr Leu Leu Ser Tyr 185 190 195 200 tgg ttg gcc act tet gtt ttc ggc tac caa aaa gac ggc cct aca cag 676 Trp Leu Ala Thr Ser Vai Phe Gly Tyr Gin Lys Asp Gly Pro Thr Gin 205 210 215 gaa gea tgg tat ggc atg gtg aat ccg gaa aca aat gac ggc tat cag 724 Glu Ala Trp Tyr Gly Met Vai Asn Pro Glu Thr Asn Asp Gly Tyr Gin 220 225 230 ttt ttt atg gat atg ggg cca tta aaa aat gcc gat aaa tgg tat ggt 772 Phe Phe Met Asp Met Gly Pro Leu Lys Asn Ala Asp Lys Trp Tyr Gly 235 240 245 gaa gac aat ttt ttc tgg caa caa ctt aaa aac aat cct gat tac aac 820 Glu Asp Asn Phe Phe Trp Gin Gin Leu Lys Asn Asn Pro Asp Tyr Asn 250 255 260 gct ttc tgg caa aag aga agt att att cct cac tta aaa gaa gtg aag 868 Ala Phe Trp Gin Lys Arg Ser Ile Ile Pro His Leu Lys Glu Vai Lys 265 270 275 280 cct gea gtt tta acc gtt ggg ggc tgg ttt gat gea gaa gat ctc tat 916 Pro Ala Vai Leu Thr Vai Gly Gly Trp Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr 285 290 295 gga cca ctt aca att tat aaa acc att gaa aaa aat aat cct gag acc 964 Gly Pro Leu Thr Ile Tyr Lys Thr Ile Glu Lys Asn Asn Pro Glu Thr 300 305 310 tac aat acc att gtc atg ggc cct tgg tcc cac gga gat tgg tea agg 1012 Tyr Asn Thr Ile Vai Met Gly Pro Trp Ser His Gly Asp Trp Ser Arg 315 320 325 gaa cct gga tea cag gtc att tea aat att tat ttt ggt gat tet ate 1060 Glu Pro Gly Ser Gin Vai Ile Ser Asn Ile Tyr Phe Gly Asp Ser Ile 330 335 340 tcc aca tgg tat caa aaa aat ata gaa cgt gtt ttt ttc aat cat ttt 1108 Ser Thr Trp Tyr Gin Lys Asn Ile Glu Arg Vai Phe Phe Asn His Phe 345 350 355 360 cta aaa gaa tcc gaa aat age aat cct gcc ctt cct gaa gcc tac atg 1156 Leu Lys Glu Ser Glu Asn Ser Asn Pro Ala Leu Pro Glu Ala Tyr Met 365 370 375 ttt gat acc gga aaa cat aaa tgg gaa aaa ttt gac gat tgg cct cct 1204 Phe Asp Thr Gly Lys His Lys Trp Glu Lys Phe Asp Asp Trp Pro Pro 380 385 390 aaa gaa age caa tgg aaa age ttt tac ttt caa gag aaa gga gag tta 1252 Lys Glu Ser Gin Trp Lys Ser Phe Tyr Phe Gin Glu Lys Gly Glu Leu 395 400 405 act gag gta aca cct gag gga aat agg ttt act acc tat gtc tea gac 1300 Thr Glu Vai Thr Pro Glu Gly Asn Arg Phe Thr Thr Tyr Vai Ser Asp 410 415 420 cee tet aat cct gtc ccc tat agt caa gat att aaa cta aac ttc act 1348 Pro Ser Asn Pro Vai Pro Tyr Ser Gin Asp Ile Lys Leu Asn Phe Thr 425 430 435 440 ccg aga aaa tac atg gcc gat gac cag cga ttt gea gcc aga aga ccg 1395 Pro Arg Lys Tyr Met Ala Asp Asp Gin Arg Phe Ala Ala Arg Arg Pro 445 450 455 gac gta ctg acc ttt acg age gaa gta tta agt caa gac atg acg ctt 1444 Asp Vai Leu Thr Phe Thr Ser Glu Vai Leu Ser Gin Asp Met Thr Leu 460 465 470 gcg ggg gaa gtc atg gea aac tta aaa gtt gcc act tea caa act gat 1492 Ala Gly Glu Vai Met Ala Asn Leu Lys Vai Ala Thr Ser Gin Thr Asp 475 480 485 gct gat tgg gta gtt aaa ate ate gat ata ttt ccc gga gat cag cca 1540 Ala Asp Trp Vai Vai Lys Ile Ile Asp Ile Phe Pro Gly Asp Gin Pro 490 495 500 aat cat gcc tat gtt tta gat ggg gtg gac atg ggc aat tac cac cta 1588 Asn His Ala Tyr Vai Leu Asp Gly Vai Asp Met Gly Asn Tyr His Leu 505 510 515 520 atg gtt cgt tea gag gta att aga ggg agg tat aga gaa agt ttt gag 1636 Met Vai Arg Ser Glu Vai Ile Arg Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu 525 530 535 ttt cct aaa ccc ttt gtt cct gat caa ate act gct gtt gat ttc agg 1684 Phe Pro Lys Pro Phe Vai Pro Asp Gin Ile Thr Ala Vai Asp Phe Arg 540 545 550 tta caa gat ctt ttc cat act ttc aaa aag ggg cat aaa att caa ata 1732 Leu Gin Asp Leu Phe His Thr Phe Lys Lys Gly His Lys Ile Gin Ile 555 560 565 caa ata caa agt act tgg ttt ccc cta att gat cga aat ccc caa aaa 1780 Gin Ile Gin Ser Thr Trp Phe Pro Leu Ile Asp Arg Asn Pro Gin Lys 570 575 580 tat gta caa aac ata ttt gaa gct gag gaa gcc gat ttt gtc aaa gcc 1828 Tyr Vai Gin Asn Ile Phe Glu Ala Glu Glu Ala Asp Phe Vai Lys Ala 585 590 595 600 acc cat agg gtt ttt cat aca gaa aag ttt gcc age aaa att gaa gta 1876 Thr His Arg Vai Phe His Thr Glu Lys Phe Ala Ser Lys Ile Glu Vai 605 610 615 atg gtt ctt cct tagaattaga atggtttaaa attactattt gtagcagaag ata 1931 Met Vai Leu Pro 620 <210> 25 <211> 620 <212> PRT <213> Cyclobacteriura marinura <400> 25 Met Lys His Cys Tyr Lys Leu Leu Vai Phe Tyr Thr Leu Phe Leu Met 15 10 15 Thr Thr Asn Trp Ala Leu Ser Gin Ala Ile Asn Gly Tyr Asp Lys Ala 20 25 30 Ala Tyr Asp Ile Pro Met Arg Asp Gly Vai His Leu His Thr Ile Vai 35 40 45 Tyr Ser Pro Lys Asp Leu Ser Gin Pro Tyr Pro Ile Leu Met Gin Arg 50 55 60 Thr Pro Tyr Ser Ala Gly Pro Tyr Gly Pro Gly Asn Met Lys Asn Lys 65 70 75 80 Leu Gly Pro Ser Gin Phe Leu Met Asn Asp Gly Tyr Ile Phe Vai Tyr 85 90 95 Gin Asp Vai Arg Gly Arg Trp Met Ser Glu Gly Ser Tyr Asp Asn Met 100 105 110 Arg Pro Thr Leu Ser Lys Ser Glu Arg Asn Ser Asn Gin Ile Asp Glu 115 120 125 Ser Thr Asp Thr Tyr Asp Thr Ile Glu Trp Leu Leu Ala Asn Ile Lys 130 135 140 Asn His Asn Glu Lys Vai Gly Leu Trp Gly Ile Ser Tyr Pro Gly Phe 145 150 155 160 Tyr Ser Ala Ala Ala Leu Pro Phe Ala His Pro Asn Leu Lys Ala Vai 165 170 175 Ser Pro Gin Ala Pro Ile Gly Asp Phe Tyr Phe Asp Asp Phe His His 180 185 190 Asn Gly Ala Tyr Leu Leu Ser Tyr Trp Leu Ala Thr Ser Vai Phe Gly 195 200 205 Tyr Gin Lys Asp Gly Pro Thr Gin Glu Ala Trp Tyr Gly Met Vai Asn 210 215 220 Pro Glu Thr Asn Asp Gly Tyr Gin Phe Phe Met Asp Met Gly Pro leu 225 230 235 240 Lys Asn Ala Asp Lys Trp Tyr Gly Glu Asp Asn Phe Phe Trp Gin Gin 245 250 255 Leu Lys Asn Asn Pro Asp Tyr Asn Ala Phe Trp Gin Lys Arg Ser Ile 260 265 270 Ile Pro His Leu Lys Glu Vai Lys Pro Ala Vai Leu Thr Vai Gly Gly 275 280 285 Trp Phe Asp Ala Glu Asp Leu Tyr Gly Pro Leu Thr Ile Tyr Lys Thr 290 295 300 Ile Glu Lys Asn Asn Pro Glu Thr Tyr Asn Thr Ile Vai Met Gly Pro 305 310 315 320 Trp Ser His Gly Asp Trp Ser Arg Glu Pro Gly Ser Gin Vai Ile Ser 325 330 335 Asn Ile Tyr Phe Gly Asp Ser Ile Ser Thr Trp Tyr Gin Lys Asn Ile 340 345 350 Glu Arg Vai Phe Phe Asn His Phe Leu Lys Glu Ser Glu Asn Ser Asn 355 360 365 Pro Ala Leu Pro Glu Ala Tyr Met Phe Asp Thr Gly Lys His Lys Trp 370 375 380 Glu Lys Phe Asp Asp Trp Pro Pro Lys Glu Ser Gin Trp Lys Ser Phe 385 390 395 400 Tyr Phe Gin Glu Lys Gly Glu Leu Thr Glu Vai Thr Pro Glu Gly Asn 405 410 415 Arg Phe Thr Thr Tyr Vai Ser Asp Pro Ser Asn Pro Vai Pro Tyr Ser 420 425 430 Gin Asp Ile Lys Leu Asn Phe Thr Pro Arg Lys Tyr Met Ala Asp Asp 435 440 445 Gin Arg Phe Ala Ala Arg Arg Pro Asp Vai Leu Thr Phe Thr Ser Glu 450 455 460 Vai Leu Ser Gin Asp Met Thr Leu Ala Gly Glu Vai Met Ala Asn Leu 465 470 475 480 Lys Vai Ala Thr Ser Gin Thr Asp Ala Asp Trp Vai Vai Lys Ile Ile 485 490 495 Asp Ile Phe Pro Gly Asp Gin Pro Asn His Ala Tyr Vai Leu Asp Gly 500 505 510 Vai Asp Met Gly Asn Tyr His Leu Met Vai Arg Ser Glu Vai Ile Arg 515 520 525 Gly Arg Tyr Arg Glu Ser Phe Glu Phe Pro Lys Pro Phe Vai Pro Asp 530 535 540 Gin Ile Thr Ala Vai Asp Phe Arg Leu Gin Asp Leu Phe His Thr Phe 545 550 555 560 Lys Lys Gly His Lys Ile Gin Ile Gin Ile Gin Ser Thr Trp Phe Pro 565 570 575 Leu Ile Asp Arg Asn Pro Gin Lys Tyr Vai Gin Asn Ile Phe Glu Ala 580 585 590 Glu Glu Ala Asp Phe Vai Lys Ala Thr His Arg Vai Phe His Thr Glu 595 600 605 Lys Phe Ala Ser Lys Ile Glu Vai Met Vai Leu Pro 610 615 620 <210> 26 <211> 2036 <212> DNA <213> Psycloserpens burtonensis <220>

Claims

1. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina, caracterizado pelo fato de compreender formar o β-éster de a-L- aspartil-L-fenilalanina a partir de α,β-diéster de ácido L-aspártico e L- fenilalanina usando uma enzima ou substância contendo enzima que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sitio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídica, em que a enzima ou substância contendo enzima é um tipo ou dois ou mais tipos selecionados dentre o grupo consistindo em uma cultura de um micróbio que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídica, uma célula microbiana separada da cultura e um produto de célula microbiana tratado do micróbio, em que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo que codifica uma proteína selecionada do grupo consistindo em (A), (C), (E), (G), (I), (K), (M), (O), (Q), (S), (U) e (W): (A) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6, (C) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 21 a 619 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12, (E) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18, (G) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23, (I) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 25, (K) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27, (M) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6, (O) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12, (Q) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18, (S) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23, (U) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25, e (W) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27.

2. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é um micróbio pertencendo a um gênero selecionado dentre o grupo consistindo em Aeromonas, Azotobacter, Alcaligenes, Brevibacterium, Corynebacterium, Escherichia, Empedobacter, Flavobacterium, Microbacterium, Propionibacterium, Brevibacillus, Paenibacillus, Pseudomonas, Serratia, Stenotrophomonas, Sphingobacterium, Streptomyces, Xanthomonas, Williopsis, Candida, Geotrichum, Pichia, Saccharomyces, Torulaspora, Cellulophaga, Weeksella, Pedobacter, Persicobacter, Flexithrix, Chitinophaga, Cyclobacterium, Runella, Thermonema, Psychroserpens, Gelidibacter, Dyadobacter, Flammeovirga, Spirosoma, Flectobacillus, Tenacibaculum, Rhodotermus, Zobellia, Muricauda, Salegentibacter, Taxeobacter, Cytophaga, Marinilabilia, Lewinella, Saprospira, e Haliscomenobacter.

3. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (A) abaixo: (A) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 6.

4. Método para produzir um β-éster de oc-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (C) abaixo: (C) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 21 a 619 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12.

5. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (E) abaixo: (E) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18.

6. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (G) abaixo: (G) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 23.

7. Método para produzir um β-éster de oc-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (I) abaixo: (I) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25.

8. Método para produzir um β-éster de oc-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (K) abaixo: (K) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27.

9. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (M) abaixo: (M) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6.

10. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (O) abaixo: (O) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12.

11. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (Q) abaixo: (Q) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 18.

12. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (S) abaixo: (S) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23.

13. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (U) abaixo: (U) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25.

14. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o micróbio é transformado com um vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo codificando uma proteína (W) abaixo: (W) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27.

15. Método para produzir um β-éster de a-L-aspartil-L- fenilalanina, caracterizado pelo fato de compreender formar o β-éster de a-L- aspartil-L-fenilalanina a partir de α,β-diéster de ácido L-aspártico e L- fenilalanina usando uma enzima ou substância contendo enzima que tem uma capacidade para seletivamente ligar L-fenilalanina em um sítio α-éster do α,β-diéster de ácido L-aspártico através de uma ligação peptídica, em que a enzima é pelo menos uma selecionada dentre o grupo consistindo em (A), (C), (E), (G), (I), (K), (M), (O), (Q), (S), (U) e (W) abaixo: (A) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 616 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 6, (C) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 21 a 619 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12, (E) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 625 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18, (G) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 23 a 645 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23, (I) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 26 a 620 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 25, (K) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos consistindo em resíduos de aminoácidos números 18 a 644 de uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27, (M) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 6, (O) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 12, (Q) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 18, (S) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 23, (U) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQID NO: 25, e (W) uma proteína tendo uma sequência de aminoácidos descrita em SEQ ID NO: 27.

16. Método para produzir um α-éster metílico de a-L-aspartil- L-fenilalanina, caracterizado pelo fato de compreender: uma etapa de reação de síntese de β-éster metílico de a-L-aspartil-L-fenilalanina por um método de produzir um β-éster de α-L-aspartil-L-fenilalanina como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15; e uma etapa de reação de conversão do β-éster metílico de α-L-aspartil-L-fenilalanina em α-éster metílico de a-L- aspartil-L-fenilalanina.