JP2000333675A - ヒト多形性上皮ムチンコアタンパク質およびそのタンパク質をコードする核酸 - Google Patents
ヒト多形性上皮ムチンコアタンパク質およびそのタンパク質をコードする核酸Info
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Abstract
(57)【要約】
【課題】 ヒト多形上皮ムチンコアタンパク質およびそ
れをコードする核酸。 【解決手段】 特定のモノクローナル抗体によって特異
的に認識されるヒト多形上皮ムチンコアタンパク質の特
定領域を含むポリペプチド、および該ポリペプチドをコ
ードする核酸断片。
れをコードする核酸。 【解決手段】 特定のモノクローナル抗体によって特異
的に認識されるヒト多形上皮ムチンコアタンパク質の特
定領域を含むポリペプチド、および該ポリペプチドをコ
ードする核酸断片。
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】本発明は、ヒト乳房上皮細胞
により発現されるムチン糖タンパク質をコードする遺伝
子中の縦列反復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）するヌ
クレオチド配列を検出するＤＮＡプローブ、診断および
個体の「フィンガープリンティング（ｆｉｎｇｅｒｐｒ
ｉｎｔｉｎｇ）」におけるプローブの使用、対応するム
チン遺伝子により発現されるポリペプチド、前記ポリペ
プチドに対する抗体、および癌の診断および治療的処置
におけるポリペプチドおよび抗体の使用に関する。
により発現されるムチン糖タンパク質をコードする遺伝
子中の縦列反復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）するヌ
クレオチド配列を検出するＤＮＡプローブ、診断および
個体の「フィンガープリンティング（ｆｉｎｇｅｒｐｒ
ｉｎｔｉｎｇ）」におけるプローブの使用、対応するム
チン遺伝子により発現されるポリペプチド、前記ポリペ
プチドに対する抗体、および癌の診断および治療的処置
におけるポリペプチドおよび抗体の使用に関する。
【０００２】
【従来の技術】正常および悪性のヒト乳房上皮細胞は高
分子量の糖タンパク質（ｇｐｓ）を発現し、前記糖タン
パク質は高度にグリコシル化されており、そして非常に
抗原性である。その結果、ヒト乳癌および他の癌との反
応性について選択されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ
ｓ）は、完全に分化したヒト乳房組織により豊富に産生
されかつ乳脂肪小球（ＭＦＧ）および乳中に見いだされ
る分子と反応することが発見された。しかしながら、特
定の抗原決定基の発現のレベルは，正常の分化した細胞
により産生されるｇｐｓおよび乳癌により産生される同
様な分子において異なることがある。これは、ある抗体
が腫瘍ｇｐｓとの反応についてある種の特異性を示しう
ることを意味する。
分子量の糖タンパク質（ｇｐｓ）を発現し、前記糖タン
パク質は高度にグリコシル化されており、そして非常に
抗原性である。その結果、ヒト乳癌および他の癌との反
応性について選択されるモノクローナル抗体（ＭＡｂ
ｓ）は、完全に分化したヒト乳房組織により豊富に産生
されかつ乳脂肪小球（ＭＦＧ）および乳中に見いだされ
る分子と反応することが発見された。しかしながら、特
定の抗原決定基の発現のレベルは，正常の分化した細胞
により産生されるｇｐｓおよび乳癌により産生される同
様な分子において異なることがある。これは、ある抗体
が腫瘍ｇｐｓとの反応についてある種の特異性を示しう
ることを意味する。
【０００３】これらの抗体により認識されるエピトープ
を有する分子は、複雑であり、そして分析が困難であ
り、なぜなら、それらは大きくかつ高度にグリコシル化
されており（＞２５０，０００ダルトン）およびまた発
現の複雑なパターをもつからである。ＭＡｂの２つＨＭ
ＦＧ−１および−２は４００，０００ダルトンより大き
いと思われるヒト乳中の成分と反応し、これに対して血
清および腫瘍中に見いだされる分子はより小さいが、主
要な成分はないイムノブロッティングで２００，０００
ダルトンより大きい。ヒト乳中にまたは乳脂肪小球中に
見いだされる分化した乳房上皮細胞により産生される大
きい糖タンパク質は、精製され、そしてムチンの特性の
いくつかをもつことが示された。この成分は糖のＮ−ア
セチルガラクトサミン結合を介してセリンおよびスレオ
ニンの残基へＯ−結合で結合した大量の炭水化物を含有
する。そのうえ、コアタンパク質は高いレベルのセリ
ン、スレオニンおよびプロリン、および低いレベルの芳
香族およびイオウ含有アミノ酸を含有する。
を有する分子は、複雑であり、そして分析が困難であ
り、なぜなら、それらは大きくかつ高度にグリコシル化
されており（＞２５０，０００ダルトン）およびまた発
現の複雑なパターをもつからである。ＭＡｂの２つＨＭ
ＦＧ−１および−２は４００，０００ダルトンより大き
いと思われるヒト乳中の成分と反応し、これに対して血
清および腫瘍中に見いだされる分子はより小さいが、主
要な成分はないイムノブロッティングで２００，０００
ダルトンより大きい。ヒト乳中にまたは乳脂肪小球中に
見いだされる分化した乳房上皮細胞により産生される大
きい糖タンパク質は、精製され、そしてムチンの特性の
いくつかをもつことが示された。この成分は糖のＮ−ア
セチルガラクトサミン結合を介してセリンおよびスレオ
ニンの残基へＯ−結合で結合した大量の炭水化物を含有
する。そのうえ、コアタンパク質は高いレベルのセリ
ン、スレオニンおよびプロリン、および低いレベルの芳
香族およびイオウ含有アミノ酸を含有する。
【０００４】これらのムチン様糖タンパク質は、また、
多数の他の正常上皮細胞により分泌される。モノクロー
ナル抗体ＨＭＦＧ−１は乳ムチンと高度に反応性であ
り、そして証拠はこの抗体により認識されるエピトープ
は完全に処理されたムチン上でより豊富に存在すること
を示唆し、これは正常の分化の特性である。
多数の他の正常上皮細胞により分泌される。モノクロー
ナル抗体ＨＭＦＧ−１は乳ムチンと高度に反応性であ
り、そして証拠はこの抗体により認識されるエピトープ
は完全に処理されたムチン上でより豊富に存在すること
を示唆し、これは正常の分化の特性である。
【０００５】腫瘍において、これらの抗原決定基を有す
る分子の分子量は個々の腫瘍の間で異なり、そして、Ｈ
ＭＦＧ−２により認識される成分の場合において、８０
〜４００Ｋダルトンの範囲でありうる。高分子量バンド
の移動度において観測される差は遺伝子の多形性に起因
するものと思われるが、この可能性はより低いバンドの
大きさの変動性を説明しない。これらは多分グリコシル
化経路内の腫瘍細胞において起こる異常な処理（プロセ
ッシング）の結果でありうることが示唆された。
る分子の分子量は個々の腫瘍の間で異なり、そして、Ｈ
ＭＦＧ−２により認識される成分の場合において、８０
〜４００Ｋダルトンの範囲でありうる。高分子量バンド
の移動度において観測される差は遺伝子の多形性に起因
するものと思われるが、この可能性はより低いバンドの
大きさの変動性を説明しない。これらは多分グリコシル
化経路内の腫瘍細胞において起こる異常な処理（プロセ
ッシング）の結果でありうることが示唆された。
【０００６】この群の分子と反応するモノクローナル抗
体の大部分について、抗原性エピトープの正確な性質は
不明瞭のままであるが、周囲の証拠は炭水化物が少なく
とも部分的にエピトープの多くの中に含まれ得ることを
示唆した。そのうえ、従来入手可能なデータから、正常
の分化した細胞中に見いだされるムチンと腫瘍中に観測
されるムチンが同一のコアタンパク質を含有するか、あ
るいは単に共通の炭水化物の決定基を有するどうか知ら
れていなかった。
体の大部分について、抗原性エピトープの正確な性質は
不明瞭のままであるが、周囲の証拠は炭水化物が少なく
とも部分的にエピトープの多くの中に含まれ得ることを
示唆した。そのうえ、従来入手可能なデータから、正常
の分化した細胞中に見いだされるムチンと腫瘍中に観測
されるムチンが同一のコアタンパク質を含有するか、あ
るいは単に共通の炭水化物の決定基を有するどうか知ら
れていなかった。
【０００７】ムチンは、今回、ヒト乳から、コアタンパ
ク質および前記タンパク質をコードする遺伝子の同定を
可能とすべく親和クロマトグラフィーにより分離され
た。これは落花生尿ムチン（ＰＵＭ）遺伝子座により規
定される高度に多形性の遺伝子であることが発見された
［参照、Ｓｗａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｍａｒｋｅｒｓ、４、２４７、（１９８６）および
Ｎａｔｕｒｅ，３２７，８２−８４（１９８７）］。こ
の遺伝子産物、これを以後ヒト多形性上皮ムチンまたは
ＨＰＥＭと呼ぶ、が乳癌および他の癌ならびにある正常
上皮組織において検出された。
ク質および前記タンパク質をコードする遺伝子の同定を
可能とすべく親和クロマトグラフィーにより分離され
た。これは落花生尿ムチン（ＰＵＭ）遺伝子座により規
定される高度に多形性の遺伝子であることが発見された
［参照、Ｓｗａｌｌｏｗ ｅｔ ａｌ．、Ｄｉｓｅａｓ
ｅ Ｍａｒｋｅｒｓ、４、２４７、（１９８６）および
Ｎａｔｕｒｅ，３２７，８２−８４（１９８７）］。こ
の遺伝子産物、これを以後ヒト多形性上皮ムチンまたは
ＨＰＥＭと呼ぶ、が乳癌および他の癌ならびにある正常
上皮組織において検出された。
【０００８】今回、ＨＰＥＭコアタンパク質は、腺癌細
胞により産生される異常に処理されたｇｐｓにおいて、
また、見いだされるエピトープを有することが発見され
た。これらのエピトープのあるものは、乳汁を出す乳腺
により産生される、完全に処理されたムチン糖タンパク
質において露出されなかった。
胞により産生される異常に処理されたｇｐｓにおいて、
また、見いだされるエピトープを有することが発見され
た。これらのエピトープのあるものは、乳汁を出す乳腺
により産生される、完全に処理されたムチン糖タンパク
質において露出されなかった。
【０００９】
【発明の構成】１つの面において、したがって、本発明
は、ヒトムチンコアタンパク質に対する抗体を提供し、
この抗体は完全に処理されたヒトムチン糖タンパク質と
実質的に反応しない。
は、ヒトムチンコアタンパク質に対する抗体を提供し、
この抗体は完全に処理されたヒトムチン糖タンパク質と
実質的に反応しない。
【００１０】ここで使用するとき、用語「抗体」は、抗
原結合部位、例えば、Ｆ（ａｂ’） 2断片を有する抗体
の断片を包含することを意図する。
原結合部位、例えば、Ｆ（ａｂ’） 2断片を有する抗体
の断片を包含することを意図する。
【００１１】本発明による抗体は、ことに結腸、肺、卵
巣および特定の乳癌により発現される、ＨＰＥＭコアタ
ンパク質と反応するが、対応する完全に処理されたＨＰ
ＥＭとの反応性が減少しているか、あるいはそれと反応
しない。特定の態様において、抗体はＨＰＥＭコアタン
パク質と反応するが、正常の乳汁を出すヒト乳腺により
産生されるような完全に処理されたＨＰＥＭ糖タンパク
質と反応しない。
巣および特定の乳癌により発現される、ＨＰＥＭコアタ
ンパク質と反応するが、対応する完全に処理されたＨＰ
ＥＭとの反応性が減少しているか、あるいはそれと反応
しない。特定の態様において、抗体はＨＰＥＭコアタン
パク質と反応するが、正常の乳汁を出すヒト乳腺により
産生されるような完全に処理されたＨＰＥＭ糖タンパク
質と反応しない。
【００１２】本発明による抗体は、妊娠のまたは乳汁を
出す乳房上皮組織により産生されるムチン糖タンパク質
と有意に反応しないが、乳房上皮腺癌細胞により発現さ
れるムチンタンパク質と反応する。これらの抗体は、良
性の乳腫瘍と非常に減少した反応性を示し、したがって
乳癌の診断および局在においてならびに治療法において
有用である。
出す乳房上皮組織により産生されるムチン糖タンパク質
と有意に反応しないが、乳房上皮腺癌細胞により発現さ
れるムチンタンパク質と反応する。これらの抗体は、良
性の乳腫瘍と非常に減少した反応性を示し、したがって
乳癌の診断および局在においてならびに治療法において
有用である。
【００１３】抗体は他の目的、例えば、細胞培養物をヒ
ト乳房上皮ムチン遺伝子のポリペプチド発現産生物、ま
たはその断片、とくに発生期の発現産生物についてのス
クリーニングに使用することができる。この場合におい
て、抗体は便利にはポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体であろう。 本発明による抗体は、適当な動
物にＨＰＥＭコアタンパク質またはその断片、例えば、
後述するペプチドを接種することによって産生すること
ができる。モノクローナル抗体はコーラーおよびミルス
テイン方法（Ｎａｒｕｅ ２５６，４９５−４９７／１
９７５）により、ムチンコアタンパク質またはその断片
を接種した動物からの脾細胞を不滅化することによっ
て、通常接種した動物と同一または異なる種の不死の細
胞系（好ましくは骨髄腫細胞系）との融合により、次い
で適当なクローニングおよびスクリーニング工程により
産生される。
ト乳房上皮ムチン遺伝子のポリペプチド発現産生物、ま
たはその断片、とくに発生期の発現産生物についてのス
クリーニングに使用することができる。この場合におい
て、抗体は便利にはポリクローナル抗体またはモノクロ
ーナル抗体であろう。 本発明による抗体は、適当な動
物にＨＰＥＭコアタンパク質またはその断片、例えば、
後述するペプチドを接種することによって産生すること
ができる。モノクローナル抗体はコーラーおよびミルス
テイン方法（Ｎａｒｕｅ ２５６，４９５−４９７／１
９７５）により、ムチンコアタンパク質またはその断片
を接種した動物からの脾細胞を不滅化することによっ
て、通常接種した動物と同一または異なる種の不死の細
胞系（好ましくは骨髄腫細胞系）との融合により、次い
で適当なクローニングおよびスクリーニング工程により
産生される。
【００１４】特定の態様において、本発明はＨＰＥＭコ
アタンパク質に対するモノクローナル抗体、ＳＭ３と表
示する、を提供する。他の態様において、本発明は抗体
ＳＭ３を分泌しそしてＨＳＭ３と表示した、ハイブリド
ーマ細胞系を提供する。ＨＳＭ３の試料はＥＣＡＣＣに
１９８７年１月７日に受託番号８７０１０７０１で受託
された。
アタンパク質に対するモノクローナル抗体、ＳＭ３と表
示する、を提供する。他の態様において、本発明は抗体
ＳＭ３を分泌しそしてＨＳＭ３と表示した、ハイブリド
ーマ細胞系を提供する。ＨＳＭ３の試料はＥＣＡＣＣに
１９８７年１月７日に受託番号８７０１０７０１で受託
された。
【００１５】本発明の抗体を使用すると、ヒト乳癌細胞
系から分離したｍＲＮＡから構成したファージのライブ
ラリーをスクリーニングして、ムチンコアタンパク質の
タンパク質をコードする配列を同定することができた。
相補的ＤＮＡ配列を構成しそして、これらから、驚くべ
きことには、コアタンパク質をコードする遺伝子は６０
塩基の配列の多数の縦列反復配列を含有することが発見
され、これらは反復配列に対応するｃＤＮＡ断片がＤＮ
Ａのフィンガープリンティングに有用であるように十分
に広範な、かなりの多形性に導く。こうして可能となっ
たフィンガープリンティングは、例えば、移植後の骨髄
の増殖が宿主または供与体からのものであるかどうかの
確認において、および法医学において体の組織または体
液を使用して個体を同定するために使用することができ
る。
系から分離したｍＲＮＡから構成したファージのライブ
ラリーをスクリーニングして、ムチンコアタンパク質の
タンパク質をコードする配列を同定することができた。
相補的ＤＮＡ配列を構成しそして、これらから、驚くべ
きことには、コアタンパク質をコードする遺伝子は６０
塩基の配列の多数の縦列反復配列を含有することが発見
され、これらは反復配列に対応するｃＤＮＡ断片がＤＮ
Ａのフィンガープリンティングに有用であるように十分
に広範な、かなりの多形性に導く。こうして可能となっ
たフィンガープリンティングは、例えば、移植後の骨髄
の増殖が宿主または供与体からのものであるかどうかの
確認において、および法医学において体の組織または体
液を使用して個体を同定するために使用することができ
る。
【００１６】したがって、本発明によれば、少なくとも
核酸配列 GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC を含んでなり、そしてヒト多形性上皮ムチンコアタンパ
ク質（ＨＰＥＭ）をコードする遺伝子に由来する縦列反
復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）配列に対応する部分
の核酸断片が提供される。
核酸配列 GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC を含んでなり、そしてヒト多形性上皮ムチンコアタンパ
ク質（ＨＰＥＭ）をコードする遺伝子に由来する縦列反
復（ｔａｎｄｅｍ ｒｅｐｅａｔ）配列に対応する部分
の核酸断片が提供される。
【００１７】より具体的には、本発明によれば、また、
少なくとも１７ヌクレオチド塩基からなり、 ａ）ＤＮＡ配列 5′ * ACC GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC CGG‐ GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC‐ * ACC GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC CGG‐ 3′ GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC ｂ）ａ）のＤＮＡに対して相補的なＤＮＡ、すなわち、配列 5′ GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC‐ * CCG GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT‐ GTC ACC TCG GCC CGG GAC ACC AGG CCG GCC‐ * 3′ CCG GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT のＤＮＡ、 ｃ）ａ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
および ｄ）ｂ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
の少なくとも１つとハイブリダイズ可能である核酸断片
が提供される。
少なくとも１７ヌクレオチド塩基からなり、 ａ）ＤＮＡ配列 5′ * ACC GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC CGG‐ GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC‐ * ACC GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC CGG‐ 3′ GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC ｂ）ａ）のＤＮＡに対して相補的なＤＮＡ、すなわち、配列 5′ GTC ACC TCG GCC CCG GAC ACC AGG CCG GCC‐ * CCG GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT‐ GTC ACC TCG GCC CGG GAC ACC AGG CCG GCC‐ * 3′ CCG GGC TCC ACC GCC CCC CCA GCC CAC GGT のＤＮＡ、 ｃ）ａ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
および ｄ）ｂ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
の少なくとも１つとハイブリダイズ可能である核酸断片
が提供される。
【００１８】（ａ）および（ｂ）における配列の各々
は、１２０塩基の二重の縦列反復配列を包含する。本発
明の断片は、反復の出発点を架橋する部分を含むこの配
列のいずれの部分にも対応することができる。
は、１２０塩基の二重の縦列反復配列を包含する。本発
明の断片は、反復の出発点を架橋する部分を含むこの配
列のいずれの部分にも対応することができる。
【００１９】本発明による断片は、低いストリンジェン
トな条件下に、上のＤＮＡおよびＲＮＡ配列（ａ）〜
（ｄ）とハイブリダイズするであろう。好ましい断片
は、高いストリンジェントな条件下にもハイブリダイズ
するものである。本発明の最も好ましい断片は、上の配
列（ａ）〜（ｄ）に正確に同一であるか、あるいはそれ
らに対して正確に相補的であるものである。
トな条件下に、上のＤＮＡおよびＲＮＡ配列（ａ）〜
（ｄ）とハイブリダイズするであろう。好ましい断片
は、高いストリンジェントな条件下にもハイブリダイズ
するものである。本発明の最も好ましい断片は、上の配
列（ａ）〜（ｄ）に正確に同一であるか、あるいはそれ
らに対して正確に相補的であるものである。
【００２０】通常、本発明による所定のＤＮＡまたはＲ
ＮＡは、上のａ）によるＤＮＡおよびｃ）によるＲＮＡ
の両者と、あるいはｂ）によるＤＮＡおよびｄ）による
ＲＮＡの両者とハイブリダイズすることができるであろ
う。
ＮＡは、上のａ）によるＤＮＡおよびｃ）によるＲＮＡ
の両者と、あるいはｂ）によるＤＮＡおよびｄ）による
ＲＮＡの両者とハイブリダイズすることができるであろ
う。
【００２１】好ましくは、本発明による核酸断片は、上
のａ）〜ｄ）の少なくとも１つとハイブリダイズするこ
とができる少なくとも３０のヌクレオチド塩基の部分、
より好ましくは少なくとも５０のこのような塩基からな
り、そして最も好ましくは断片は上のａ）、ｂ）、ｃ）
またはｄ）の反復配列の１つに対して正確に相補的な６
０塩基の配列を含有する。本発明の他の断片は、必要に
応じて構成により小さい変動をもつ、このような配列の
２またはそれ以上の反復からなることができる。好まし
くは、このような断片は整数のこのような反復配列を包
含する。本発明の他の断片は、縦列反復配列および、Ｈ
ＰＥＭ遺伝子またはその一部分に対応する解読または非
解読５′および／または３′フランキング配列からな
る。
のａ）〜ｄ）の少なくとも１つとハイブリダイズするこ
とができる少なくとも３０のヌクレオチド塩基の部分、
より好ましくは少なくとも５０のこのような塩基からな
り、そして最も好ましくは断片は上のａ）、ｂ）、ｃ）
またはｄ）の反復配列の１つに対して正確に相補的な６
０塩基の配列を含有する。本発明の他の断片は、必要に
応じて構成により小さい変動をもつ、このような配列の
２またはそれ以上の反復からなることができる。好まし
くは、このような断片は整数のこのような反復配列を包
含する。本発明の他の断片は、縦列反復配列および、Ｈ
ＰＥＭ遺伝子またはその一部分に対応する解読または非
解読５′および／または３′フランキング配列からな
る。
【００２２】縦列反復配列の存在は配列の予備的決定に
より、該配列が「＊」で示す塩基の欠如を除外して、上
の（ａ）および（ｂ）に示す配列に対応する５９塩基対
から成ると信じられた。
より、該配列が「＊」で示す塩基の欠如を除外して、上
の（ａ）および（ｂ）に示す配列に対応する５９塩基対
から成ると信じられた。
【００２３】本願の優先権主張の基礎となる英国特許出
願第８７００２６９号に最初に定義されたように本発明
の多くの断片は、また、ここに記載する断片の新しい定
義と一致し、そして「＊」でしるした塩基を含まない上
の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に定義する配列
の断片は、本発明の特定の態様を形成する。このような
断片は少なくとも次の配列の一部分に対応する配列を有
する： ａ′) GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC ａ″） CGG GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC
AC ｂ’）ａ’）またはａ”）の配列に対して相補的なＤＮ
Ａ、 ｃ’）ａ’）またはａ”）の配列に対応する配列を有す
るＲＮＡ、および ｄ’）ｂ’）の相補的ＤＮＡ配列の１つに対応する配列
を有するＲＮＡ。
願第８７００２６９号に最初に定義されたように本発明
の多くの断片は、また、ここに記載する断片の新しい定
義と一致し、そして「＊」でしるした塩基を含まない上
の（ａ）、（ｂ）、（ｃ）または（ｄ）に定義する配列
の断片は、本発明の特定の態様を形成する。このような
断片は少なくとも次の配列の一部分に対応する配列を有
する： ａ′) GTG GGC TGG GGG GGC GGT GGA GCC ａ″） CGG GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC
AC ｂ’）ａ’）またはａ”）の配列に対して相補的なＤＮ
Ａ、 ｃ’）ａ’）またはａ”）の配列に対応する配列を有す
るＲＮＡ、および ｄ’）ｂ’）の相補的ＤＮＡ配列の１つに対応する配列
を有するＲＮＡ。
【００２４】ヒトゲノムにおいて、ＤＮＡ縦列反復配列
は、逆平行の二本鎖ＤＮＡからなり、１つに鎖は配列
（ａ）を有し、そして配列（ｂ）を有する鎖と対をなし
ている。
は、逆平行の二本鎖ＤＮＡからなり、１つに鎖は配列
（ａ）を有し、そして配列（ｂ）を有する鎖と対をなし
ている。
【００２５】前述したように、本発明の核酸断片は、ヒ
トゲノムにおけるＤＮＡ縦列反復配列の一方または他方
の鎖、あるいはいずれかから転写されたＲＮＡを検出す
るための、それゆえヒトムチンコアタンパク質の１また
は２以上の遺伝子、それから転写されたｍＲＮＡおよび
相補的ＤＮＡおよびＲＮＡを同定するための、プローブ
として使用することができる。このような目的で、少な
くとも１つ縦列反復配列、またはそれから転写されたｍ
ＲＮＡからなる完全な正常遺伝子を使用すること、ある
いは非相補的断片を本発明による断片の５’および３’
末端のいずれかまたは双方に取り付けることおよび／ま
たは検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光性
または酵素の標識）をプローブに取り付けること、ある
いはプローブを固体の支持体に結合することは便利であ
ることがある。これらのすべては便利な方法により達成
することができ、そして本発明の核酸断片は普通の核酸
合成技術により新たに生成することができる。
トゲノムにおけるＤＮＡ縦列反復配列の一方または他方
の鎖、あるいはいずれかから転写されたＲＮＡを検出す
るための、それゆえヒトムチンコアタンパク質の１また
は２以上の遺伝子、それから転写されたｍＲＮＡおよび
相補的ＤＮＡおよびＲＮＡを同定するための、プローブ
として使用することができる。このような目的で、少な
くとも１つ縦列反復配列、またはそれから転写されたｍ
ＲＮＡからなる完全な正常遺伝子を使用すること、ある
いは非相補的断片を本発明による断片の５’および３’
末端のいずれかまたは双方に取り付けることおよび／ま
たは検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光性
または酵素の標識）をプローブに取り付けること、ある
いはプローブを固体の支持体に結合することは便利であ
ることがある。これらのすべては便利な方法により達成
することができ、そして本発明の核酸断片は普通の核酸
合成技術により新たに生成することができる。
【００２６】本発明の核酸断片は、また、能動免疫感作
技術において使用することができる。このような方法に
おいて、断片はムチンコアタンパク質の一部分と実質的
に同一のポリペプチド鎖をコードし、そして調節および
プロモーター配列、マーカー配列およびスプライシング
または連結部位を包含する他の解読または非解読核酸配
列で５’および３’末端のいずれかまたは双方において
伸長することができる。解読配列はムチンコアタンパク
質鎖の対応する部分または他のポリペプチド鎖をコード
することができる。本発明による断片は、必要なまたは
所望のフランキング配列と一緒に、適当なオープンリー
ディングフレームのレジスターにおいて、適当なベクタ
ー、例えば、プラスミドまたはウイルスゲノム（例え
ば、ワクシニアウイルスゲノム）中に挿入し、次いで普
通の技術によりポリペプチド産生物として発現される。
１つの面において、ポリペプチド産生物をベクターで形
質転換した適当な細胞を培養し、収穫し、そして免疫原
として使用してムチンコアタンパク質に対する能動免疫
を誘導することができる。他の面において、とくにウイ
ルスの形態の、ベクターは、免疫感作すべきヒトまたは
動物中に直接接種することができる。次いで、ベクター
は生体内のポリペプチドの発現を指令し、そしてこれは
順次に免疫原として働いてムチンコアタンパク質に対す
る能動免疫を誘導する。
技術において使用することができる。このような方法に
おいて、断片はムチンコアタンパク質の一部分と実質的
に同一のポリペプチド鎖をコードし、そして調節および
プロモーター配列、マーカー配列およびスプライシング
または連結部位を包含する他の解読または非解読核酸配
列で５’および３’末端のいずれかまたは双方において
伸長することができる。解読配列はムチンコアタンパク
質鎖の対応する部分または他のポリペプチド鎖をコード
することができる。本発明による断片は、必要なまたは
所望のフランキング配列と一緒に、適当なオープンリー
ディングフレームのレジスターにおいて、適当なベクタ
ー、例えば、プラスミドまたはウイルスゲノム（例え
ば、ワクシニアウイルスゲノム）中に挿入し、次いで普
通の技術によりポリペプチド産生物として発現される。
１つの面において、ポリペプチド産生物をベクターで形
質転換した適当な細胞を培養し、収穫し、そして免疫原
として使用してムチンコアタンパク質に対する能動免疫
を誘導することができる。他の面において、とくにウイ
ルスの形態の、ベクターは、免疫感作すべきヒトまたは
動物中に直接接種することができる。次いで、ベクター
は生体内のポリペプチドの発現を指令し、そしてこれは
順次に免疫原として働いてムチンコアタンパク質に対す
る能動免疫を誘導する。
【００２７】したがって、本発明は、外科または治療に
よりヒトまたは動物を処置する方法において、およびヒ
トまたは動物の体に実施する診断法において使用するた
めの、上に定義した核酸断片を提供する。本発明は、ま
た、外科または治療によりヒトまたは動物を処置するこ
のような方法および生体内ならびに生体外および試験管
内で実施する診断法を提供する。
よりヒトまたは動物を処置する方法において、およびヒ
トまたは動物の体に実施する診断法において使用するた
めの、上に定義した核酸断片を提供する。本発明は、ま
た、外科または治療によりヒトまたは動物を処置するこ
のような方法および生体内ならびに生体外および試験管
内で実施する診断法を提供する。
【００２８】本発明は、さらに、ＤＮＡ縦列反復配列に
よりコードされる１系列の残基からなるポリペプチドを
提供し、上の（ｂ）に示した配列は解読配列である。本
発明によるポリペプチドは、配列 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Se
r Thr Ala Pro Pro Ala His Gly*Val Thr Ser Ala Pro Asp Th
r Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly （「＊」はペプチドの反復の開始を示す）に相当する配
列中の５またはそれより多いアミノ酸残基を有するもの
から選択される。
よりコードされる１系列の残基からなるポリペプチドを
提供し、上の（ｂ）に示した配列は解読配列である。本
発明によるポリペプチドは、配列 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Se
r Thr Ala Pro Pro Ala His Gly*Val Thr Ser Ala Pro Asp Th
r Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly （「＊」はペプチドの反復の開始を示す）に相当する配
列中の５またはそれより多いアミノ酸残基を有するもの
から選択される。
【００２９】本発明によるポリペプチドは、４０の上の
残基配列の部分に対応する配列を有することができ、そ
して反復配列の開始点を含むことができる。
残基配列の部分に対応する配列を有することができ、そ
して反復配列の開始点を含むことができる。
【００３０】本発明による他のポリペプチドは、２０ア
ミノ酸反復配列の３またはそれ以上の反復を含む。この
ようなポリペプチドは個々のアミノ酸残基の置換による
小さい変動を含むことができる。
ミノ酸反復配列の３またはそれ以上の反復を含む。この
ようなポリペプチドは個々のアミノ酸残基の置換による
小さい変動を含むことができる。
【００３１】本発明は、さらに、セリンおよび／または
スレオニン残基上のＮ−アセチルガラクトサミン（結合
糖）の付加により、およびオリゴ糖部分のそれへのまた
は他の連結糖および／または担体タンパク質、例えば、
キーホールリンペットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、アルブメン
または甲状腺グロブリンへ結合した断片を経る付加によ
り、修飾された上に定義したポリペプチドを提供する。
スレオニン残基上のＮ−アセチルガラクトサミン（結合
糖）の付加により、およびオリゴ糖部分のそれへのまた
は他の連結糖および／または担体タンパク質、例えば、
キーホールリンペットのヘモシアニン（ｋｅｙｈｏｌｅ
ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）、アルブメン
または甲状腺グロブリンへ結合した断片を経る付加によ
り、修飾された上に定義したポリペプチドを提供する。
【００３２】好ましくは、ポリペプチドは上の配列の少
なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは２０残基
からなる。ポリペプチドは、上の完全な配列からなるこ
とができる。このようなポリペプチドは、さらに、追加
のアミノ酸残基、好ましくはＨＰＥＭコアタンパク質の
アミノ酸配列に一致する残基からなることができる。
なくとも１０のアミノ酸残基、より好ましくは２０残基
からなる。ポリペプチドは、上の完全な配列からなるこ
とができる。このようなポリペプチドは、さらに、追加
のアミノ酸残基、好ましくはＨＰＥＭコアタンパク質の
アミノ酸配列に一致する残基からなることができる。
【００３３】他の面において、本発明はＨＰＥＭコアタ
ンパク質を提供する。これはＰＵＭ遺伝子によりコード
され、そして組み換えＤＮＡ技術により産生され、そし
てヒトまたはヒト以外の細胞中でグリコシル化なしで発
現させることができる。あるいは、それは炭水化物を自
然ヒトムチン糖タンパク質からストリッピングすること
によって得ることができ、前記ヒトムチン糖タンパク質
は、それ自体、ヒト組織または体液からの分離により、
あるいはヒト細胞系中の発現および完全な処理により産
生することができる。ＨＰＥＭコアタンパク質は、受動
免疫において使用するために動物で抗体を誘発する目的
で、ならびに、診断試験および腫瘍の局在において、お
よびヒトの能動免疫感作において使用するために使用す
ることができる。
ンパク質を提供する。これはＰＵＭ遺伝子によりコード
され、そして組み換えＤＮＡ技術により産生され、そし
てヒトまたはヒト以外の細胞中でグリコシル化なしで発
現させることができる。あるいは、それは炭水化物を自
然ヒトムチン糖タンパク質からストリッピングすること
によって得ることができ、前記ヒトムチン糖タンパク質
は、それ自体、ヒト組織または体液からの分離により、
あるいはヒト細胞系中の発現および完全な処理により産
生することができる。ＨＰＥＭコアタンパク質は、受動
免疫において使用するために動物で抗体を誘発する目的
で、ならびに、診断試験および腫瘍の局在において、お
よびヒトの能動免疫感作において使用するために使用す
ることができる。
【００３４】本発明は、さらに、前述のペプチドに対す
る抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、およ
びそれらの断片を提供する。このような抗体は、普通の
方法により得ることができ、そして診断および治療の用
途において有用である。
る抗体（モノクローナルまたはポリクローナル）、およ
びそれらの断片を提供する。このような抗体は、普通の
方法により得ることができ、そして診断および治療の用
途において有用である。
【００３５】本発明は、さらに、治療学的または診断学
的に有効なリガンドに結合した、抗体（モノクローナル
またはポリクローナル）、およびそれらの断片を提供す
る。抗体の治療の使用のため、リガンドは癌の乳房また
は他の組織に投与されて形質転換された細胞を無能化ま
たは殺す致死因子である。致死因子は毒素、放射性同位
元素および「直接に殺す因子」、例えば、補体の成分な
らびに細胞障害性または他の薬物を包含する。抗体の他
の治療の用途は受動免疫感作を包含する。
的に有効なリガンドに結合した、抗体（モノクローナル
またはポリクローナル）、およびそれらの断片を提供す
る。抗体の治療の使用のため、リガンドは癌の乳房また
は他の組織に投与されて形質転換された細胞を無能化ま
たは殺す致死因子である。致死因子は毒素、放射性同位
元素および「直接に殺す因子」、例えば、補体の成分な
らびに細胞障害性または他の薬物を包含する。抗体の他
の治療の用途は受動免疫感作を包含する。
【００３６】本発明は、さらに、有効無毒量のこのよう
な抗体またはその断片を投与することからなる治療法、
およびヒトまたは動物の体の治療的処置において使用す
るための抗体またはその断片を提供する。ことに治療の
用途において、処置すべき種から誘導した抗体のＦｃ領
域にそのＦａｂ領域を結合することによって抗体を修飾
する（例えば、マウスモノクローナル抗体のＦａｂ領域
をヒトＦｃ領域とともに投与してヒト患者による免疫応
答を回避する）か、あるいは抗体のアイソタイプを変更
することが考えられる。
な抗体またはその断片を投与することからなる治療法、
およびヒトまたは動物の体の治療的処置において使用す
るための抗体またはその断片を提供する。ことに治療の
用途において、処置すべき種から誘導した抗体のＦｃ領
域にそのＦａｂ領域を結合することによって抗体を修飾
する（例えば、マウスモノクローナル抗体のＦａｂ領域
をヒトＦｃ領域とともに投与してヒト患者による免疫応
答を回避する）か、あるいは抗体のアイソタイプを変更
することが考えられる。
【００３７】診断の分野において、抗体はリガンド、例
えば、固体の支持体および検出可能な標識（例えば、酵
素の標識、発色体および蛍光体ならびに放射性同位元素
および他の直接または間接的に検出可能な標識）に結合
することができる。好ましくは、モノクローナル抗体ま
たはその断片は診断において使用する。
えば、固体の支持体および検出可能な標識（例えば、酵
素の標識、発色体および蛍光体ならびに放射性同位元素
および他の直接または間接的に検出可能な標識）に結合
することができる。好ましくは、モノクローナル抗体ま
たはその断片は診断において使用する。
【００３８】本発明は、さらに、異常なヒトムチン糖タ
ンパク質を含有することが疑われる試料を、上に定義し
た抗体と接触することからなる、診断アッセイ法を提供
する。このような方法は、患者に、検出可能な標識を有
する抗体またはその断片を投与するか、あるいは抗体ま
たはその断片および、抗体またはその断片に選択的に結
合できる標識の実在物を別に同時にあるいは順次に投与
することを包含する、腫瘍の局在化を包含する。本発明
は、また、ヒトまたは動物の体に実施する診断法におい
て使用する抗体またはその断片を提供する。
ンパク質を含有することが疑われる試料を、上に定義し
た抗体と接触することからなる、診断アッセイ法を提供
する。このような方法は、患者に、検出可能な標識を有
する抗体またはその断片を投与するか、あるいは抗体ま
たはその断片および、抗体またはその断片に選択的に結
合できる標識の実在物を別に同時にあるいは順次に投与
することを包含する、腫瘍の局在化を包含する。本発明
は、また、ヒトまたは動物の体に実施する診断法におい
て使用する抗体またはその断片を提供する。
【００３９】抗体の特定の使用は、乳房、卵巣および肺
の癌を検出および／またはアッセイするための診断アッ
セイを包含する。
の癌を検出および／またはアッセイするための診断アッ
セイを包含する。
【００４０】抗体またはその断片、必要に応じて適当な
標識および他の試薬および、ことに競合的アッセイに使
用するために、標準の血清、からなる、診断アッセイに
おける使用するための、診断試験キットが提供される。
標識および他の試薬および、ことに競合的アッセイに使
用するために、標準の血清、からなる、診断アッセイに
おける使用するための、診断試験キットが提供される。
【００４１】
【実施例】本発明を次の実施例により、そして添付図面
を参照しながら説明する。
を参照しながら説明する。
【００４２】実施例１ 乳ムチンの精製 乳ムチンをヒトスキムミルクからＨＭＦＧ−１親和性カ
ラムの通過、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによ
り精製した。ＨＭＦＧ−１モノクローナル抗体を組織培
養上澄み液からプロテインＡカラムにより精製した
（１）。精製した抗体を、製造業者の指示従い臭化シア
ン活性化セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合し
た。ヒトスキムミルクを１００ｍｌのバッチで抗体カラ
ムに通過させ、次いでＰＢＳでよく洗浄した。結合した
抗原をカラムから０．１モルのグリシンｐＨ２．５で溶
離し、２８０ｎｍにおける光学密度を記載する分画をプ
ールし、０．２５モルの酢酸に対して透析し、そして凍
結乾燥した。約２０ｍｇのバッチを０．２５モルの酢酸
に溶解し、そしてＧ７５セファデックスカラム（１×１
００ｃｍ）（これは前以て酢酸で平衡化してあった）に
通過させた。このカラム０．２５モルの酢酸で洗浄し、
そして１ｍｌの分画を集めた。空隙体積から溶離された
ピーク分画をプールし、凍結乾燥し、そして乾燥粉末を
４℃において貯蔵した。アミノ酸分析をベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）６５３００アミノ酸分析器で実施した。
ラムの通過、次いでサイズ排除クロマトグラフィーによ
り精製した。ＨＭＦＧ−１モノクローナル抗体を組織培
養上澄み液からプロテインＡカラムにより精製した
（１）。精製した抗体を、製造業者の指示従い臭化シア
ン活性化セファローズ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に結合し
た。ヒトスキムミルクを１００ｍｌのバッチで抗体カラ
ムに通過させ、次いでＰＢＳでよく洗浄した。結合した
抗原をカラムから０．１モルのグリシンｐＨ２．５で溶
離し、２８０ｎｍにおける光学密度を記載する分画をプ
ールし、０．２５モルの酢酸に対して透析し、そして凍
結乾燥した。約２０ｍｇのバッチを０．２５モルの酢酸
に溶解し、そしてＧ７５セファデックスカラム（１×１
００ｃｍ）（これは前以て酢酸で平衡化してあった）に
通過させた。このカラム０．２５モルの酢酸で洗浄し、
そして１ｍｌの分画を集めた。空隙体積から溶離された
ピーク分画をプールし、凍結乾燥し、そして乾燥粉末を
４℃において貯蔵した。アミノ酸分析をベックマン（Ｂ
ｅｃｋｍａｎ）６５３００アミノ酸分析器で実施した。
【００４３】乳ムチンの脱グリコシル化 乳ムチンからＯ−結合炭水化物を除去するため、分子を
モートおよびランパート（２１）に記載されているよう
に無水フッ化水素で、４℃において１時間（これは部分
的にストリッピングされた調製物を生成する）または室
温において３時間（これは高度にストリッピングされた
ムチンを生成する）処理した。
モートおよびランパート（２１）に記載されているよう
に無水フッ化水素で、４℃において１時間（これは部分
的にストリッピングされた調製物を生成する）または室
温において３時間（これは高度にストリッピングされた
ムチンを生成する）処理した。
【００４４】乳ムチンのヨウ素化 精製したムチン、部分的にまたは高度にストリッピング
したムチンのヨウ素化は、ボルトンおよびハンターの方
法（５１）により実施した。簡単に述べると、２０μｌ
の０．１モルのホウ酸塩緩衝液ｐＨ８．５中の２．５μ
ｇのムチンを乾燥したボルトンおよびハンター試薬（１
ｍＣｉ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｐｌｃ）に添加し、そして室温において１５分間イ
ンキュベーションした。この反応をホウ酸塩緩衝液中で
０．５ｍｌの０．２モルのグリシンの添加により停止
し、１５分間のインキュベーション後、遊離のボルトン
およびハンター試薬をＧ２５セファデックスカラム（Ｐ
Ｄ１０カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ］（前以てＰＢＳ中
で平衡化してある）に通過させて除去した。
したムチンのヨウ素化は、ボルトンおよびハンターの方
法（５１）により実施した。簡単に述べると、２０μｌ
の０．１モルのホウ酸塩緩衝液ｐＨ８．５中の２．５μ
ｇのムチンを乾燥したボルトンおよびハンター試薬（１
ｍＣｉ、Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａ
ｌ ｐｌｃ）に添加し、そして室温において１５分間イ
ンキュベーションした。この反応をホウ酸塩緩衝液中で
０．５ｍｌの０．２モルのグリシンの添加により停止
し、１５分間のインキュベーション後、遊離のボルトン
およびハンター試薬をＧ２５セファデックスカラム（Ｐ
Ｄ１０カラム、Ｐｈａｒｍａｃｉａ］（前以てＰＢＳ中
で平衡化してある）に通過させて除去した。
【００４５】レクチンのヨウ素化 胚芽凝集素（ＷＧＡ）、ピーナッツ凝集素（ＰＮＡ）
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）およびヘリックス・ポマチ
ア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）をカルッソンら（５２）に記
載されているようにクロラミンＴ法によりヨウ素化し
た。
（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｓ）およびヘリックス・ポマチ
ア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰＡ）
（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ）をカルッソンら（５２）に記
載されているようにクロラミンＴ法によりヨウ素化し
た。
【００４６】ポリアクリルアミドゲルおよびウェスタン
・ブロット ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッテ
ィングを前に記載した（１）ように実施した。簡単に述
べると、試料を５〜１５％のポリアクリルアミドゲルで
展開し、次いで電気泳動的にニトロセルロース紙（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に５０ボ
ルトで４℃において一夜移した。イムノブロッティング
実験において、ニトロセルロース紙をモノクローナル抗
体と反応させ、そして結合をＥＬＩＳＡ法で基質として
４−クロロ−１−ナフトールを使用して検出した。レク
チンの結合の研究のため、ウェスタン・ブロットをスワ
ローら（４８）に記載されているようにヨウ素化レクチ
ンと反応させた。
・ブロット ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびイムノブロッテ
ィングを前に記載した（１）ように実施した。簡単に述
べると、試料を５〜１５％のポリアクリルアミドゲルで
展開し、次いで電気泳動的にニトロセルロース紙（Ｓｃ
ｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に５０ボ
ルトで４℃において一夜移した。イムノブロッティング
実験において、ニトロセルロース紙をモノクローナル抗
体と反応させ、そして結合をＥＬＩＳＡ法で基質として
４−クロロ−１−ナフトールを使用して検出した。レク
チンの結合の研究のため、ウェスタン・ブロットをスワ
ローら（４８）に記載されているようにヨウ素化レクチ
ンと反応させた。
【００４７】モノクローナル抗体の産生 雌Ｂａｌｂ／ｃマウスをフロインド完全アジュバント中
の５μｇの部分的にストリッピングした乳ムチンで免疫
感作し、３月後さらにフロインド完全アジュバント中の
５μｇの同一の調製物で促進処理した。さらに２０日
後、５μｇのその炭水化物を高度にストリッピングした
ムチンを生理的塩類溶液中で静脈内投与した。脾臓を４
日後に取り出し、そしてＮＳ２マウス骨髄腫細胞系と融
合した（５３）。
の５μｇの部分的にストリッピングした乳ムチンで免疫
感作し、３月後さらにフロインド完全アジュバント中の
５μｇの同一の調製物で促進処理した。さらに２０日
後、５μｇのその炭水化物を高度にストリッピングした
ムチンを生理的塩類溶液中で静脈内投与した。脾臓を４
日後に取り出し、そしてＮＳ２マウス骨髄腫細胞系と融
合した（５３）。
【００４８】ハイブリドーマの上澄み液のスクリーニン
グおよび免疫沈澱 スクリーニングアッセイは、メレロおよびゴンザレズ−
ロドリグエウズ（５４）に記載されている方法の修正法
であった。マルチウェルプレートを５０μｌのＰＢＳ中
の０．１ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）で被覆し、そして３
７℃において一夜乾燥した。プレートを５％のウシ血清
アルブミンで３７℃において１時間遮断し、次いで５０
μｌのウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ、ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ＝ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：１０に希釈し
た）。３７℃において２時間インキュベーションした
後、プレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗
浄し、そして５０μｌのハイブリドーマ上澄み液を添加
した。プレートを一夜４℃においてインキュベーション
し、２回ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、そして１００，００
０ｃｐｍを含有する５０μｌのヨウ素化部分的ストリッ
ピングムチンをウェルの各々に添加した。次いで、プレ
ートを室温において４時間インキュベーションし、４回
ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、そして個々のウェルをガンマ
カウンターで計数した。免疫沈澱のため、ジチオスレイ
トールを含有する５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液をウェル
の各々に添加し、次いで３分間沸騰させ、そして緩衝液
を５〜１５％のポリアクリルアミドの勾配ゲル上へ適用
した。
グおよび免疫沈澱 スクリーニングアッセイは、メレロおよびゴンザレズ−
ロドリグエウズ（５４）に記載されている方法の修正法
であった。マルチウェルプレートを５０μｌのＰＢＳ中
の０．１ｍｇ／ｍｌのプロテインＡ（Ｐｈａｒｍａｃｉ
ａ ＦｉｎｅＣｈｅｍｉｃａｌｓ）で被覆し、そして３
７℃において一夜乾燥した。プレートを５％のウシ血清
アルブミンで３７℃において１時間遮断し、次いで５０
μｌのウサギ抗マウス免疫グロブリン（ＤＡＫＯ、ＰＢ
Ｓ／ＢＳＡ＝ＰＢＳ／ＢＳＡ中で１：１０に希釈し
た）。３７℃において２時間インキュベーションした
後、プレートを１％のＢＳＡを含有するＰＢＳで２回洗
浄し、そして５０μｌのハイブリドーマ上澄み液を添加
した。プレートを一夜４℃においてインキュベーション
し、２回ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、そして１００，００
０ｃｐｍを含有する５０μｌのヨウ素化部分的ストリッ
ピングムチンをウェルの各々に添加した。次いで、プレ
ートを室温において４時間インキュベーションし、４回
ＰＢＳ／ＢＳＡで洗浄し、そして個々のウェルをガンマ
カウンターで計数した。免疫沈澱のため、ジチオスレイ
トールを含有する５０μｌのＳＤＳ試料緩衝液をウェル
の各々に添加し、次いで３分間沸騰させ、そして緩衝液
を５〜１５％のポリアクリルアミドの勾配ゲル上へ適用
した。
【００４９】組織の切片の染色 一次乳癌、良性の乳房バイオプシー、正常乳房、および
悪性の乳汁を出す乳房組織からの組織をメタカルン（ｍ
ｅｔａｃａｒｎ）（メタノール、クロロホルムおよび酢
酸６０：３０：１０）中で固定し、そしてパラフィンワ
ックス中に埋め込んだ。切片を、前に記載したように、
間接ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法（４７）を
使用して抗体で染色した。
悪性の乳汁を出す乳房組織からの組織をメタカルン（ｍ
ｅｔａｃａｒｎ）（メタノール、クロロホルムおよび酢
酸６０：３０：１０）中で固定し、そしてパラフィンワ
ックス中に埋め込んだ。切片を、前に記載したように、
間接ペルオキシダーゼ抗ペルオキシダーゼ法（４７）を
使用して抗体で染色した。
【００５０】乳ムチンの精製 乳ムチンをヒトスキムミルクからＨＭＦＧ−１抗体親和
性カラムで精製した。溶離した物質のヨウ素化は、大き
い分子量の成分および６８ＫＤのバンドの存在を明らか
にした。親和性精製した物質を抗体ＨＭＦＧ−１および
ＨＭＦＧ−２（トラック２および５）で沈澱させ、次い
でゲル電気泳動にかけると、高分子量の成分および６８
ＫＤの成分の両者は両者の抗体（ＨＭＦＧ−２より有効
性が劣る）により沈澱した。６８ＫＤの成分は、また、
２つの無関係の抗体（図１、トラック３および４）によ
り沈澱し、そしてこの成分はＨＭＦＧ−１と反応した精
製物質のイムノブロッティングで明らかにされなかった
ので、６８ｋの成分はモレキュラーシーブのＧ７５カラ
ムのクロマトグラフィーにより除去した。最後の精製し
た生成物は高分子量のバンドを示し、ほんの微量の６８
ＫＤのカラムおよび少量の１４Ｋ付近の組み換え体を有
した（図２のＢ）。
性カラムで精製した。溶離した物質のヨウ素化は、大き
い分子量の成分および６８ＫＤのバンドの存在を明らか
にした。親和性精製した物質を抗体ＨＭＦＧ−１および
ＨＭＦＧ−２（トラック２および５）で沈澱させ、次い
でゲル電気泳動にかけると、高分子量の成分および６８
ＫＤの成分の両者は両者の抗体（ＨＭＦＧ−２より有効
性が劣る）により沈澱した。６８ＫＤの成分は、また、
２つの無関係の抗体（図１、トラック３および４）によ
り沈澱し、そしてこの成分はＨＭＦＧ−１と反応した精
製物質のイムノブロッティングで明らかにされなかった
ので、６８ｋの成分はモレキュラーシーブのＧ７５カラ
ムのクロマトグラフィーにより除去した。最後の精製し
た生成物は高分子量のバンドを示し、ほんの微量の６８
ＫＤのカラムおよび少量の１４Ｋ付近の組み換え体を有
した（図２のＢ）。
【００５１】Ｏ−結合の炭水化物の５０％より多くを含
有する高分子量のｇｐｒ（ＰＡＳ−Ｏ）を、シミズおよ
びイマウチ（８）によりヒト乳脂肪小球から精製した。
この成分がＨＭＦＧ−１親和性カラムの親和クロマトグ
ラフィーにより乳から分離されたムチンに類似するかど
うかを見るために、精製したＨＭＦＧ−１反応性ムチン
のアミノ酸組成を決定し、そして精製したＰＡＳ−Ｏ成
分のアミノ酸組成と比較した。表１が示すように、２組
のデータの間のすぐれた対応性が存在し、ＰＡＳ−Ｏの
コアタンパク質およびここで精製したムチンは同一であ
ることが示される。
有する高分子量のｇｐｒ（ＰＡＳ−Ｏ）を、シミズおよ
びイマウチ（８）によりヒト乳脂肪小球から精製した。
この成分がＨＭＦＧ−１親和性カラムの親和クロマトグ
ラフィーにより乳から分離されたムチンに類似するかど
うかを見るために、精製したＨＭＦＧ−１反応性ムチン
のアミノ酸組成を決定し、そして精製したＰＡＳ−Ｏ成
分のアミノ酸組成と比較した。表１が示すように、２組
のデータの間のすぐれた対応性が存在し、ＰＡＳ−Ｏの
コアタンパク質およびここで精製したムチンは同一であ
ることが示される。
【００５２】乳ムチンのコアタンパク質の分離 Ｏ−結合糖の除去に有効な容易に入手可能な酵素は存在
せず、そしてβ除去はしばしばコアタンパク質を損傷す
るので、無水フッ化水素でムチンを処理することによっ
てオリゴ糖を除去した。この処理は、モルトおよびラン
ポート（２１）により、タンパク質のコアを損傷しない
でブタ下顎ムチンからの糖の除去に有効であることが示
されている。乳ムチンのＨＦ処理後生成した物質のアミ
ノ酸分析は、タンパク質のコアは、また、この場合損傷
されないことを示唆した。なぜなら、組成は完全なムチ
ンにおいて見られるものと同一であったからである（表
１）。
せず、そしてβ除去はしばしばコアタンパク質を損傷す
るので、無水フッ化水素でムチンを処理することによっ
てオリゴ糖を除去した。この処理は、モルトおよびラン
ポート（２１）により、タンパク質のコアを損傷しない
でブタ下顎ムチンからの糖の除去に有効であることが示
されている。乳ムチンのＨＦ処理後生成した物質のアミ
ノ酸分析は、タンパク質のコアは、また、この場合損傷
されないことを示唆した。なぜなら、組成は完全なムチ
ンにおいて見られるものと同一であったからである（表
１）。
【００５３】最初に、乳ムチンをＨＦに４℃においてわ
ずかに１時間暴露したが、生成物の分析はこのような処
理により糖が部分的に除去されたことを示し、そしてレ
クチン結合能力を示さない分子を得るには、ムチンを室
温において３時間処理することが必要であった。図３は
４℃において１時間（トラック２）または室温において
３時間（トラック１）処理後のヨウ素化生成物のオート
ラジオグラフィーを示す。図３から理解されるように、
より穏やかな処理は完全なムチンより多少小さい、高分
子量の物質およびある数のより小さいバンドから構成さ
れた混合物を生ずる。室温においてＨＦにより長く暴露
すると、高分子量のバンドは消失し、約６８ＫＤおよび
７２ＫＤのポリペプチドのバンドを生成する。
ずかに１時間暴露したが、生成物の分析はこのような処
理により糖が部分的に除去されたことを示し、そしてレ
クチン結合能力を示さない分子を得るには、ムチンを室
温において３時間処理することが必要であった。図３は
４℃において１時間（トラック２）または室温において
３時間（トラック１）処理後のヨウ素化生成物のオート
ラジオグラフィーを示す。図３から理解されるように、
より穏やかな処理は完全なムチンより多少小さい、高分
子量の物質およびある数のより小さいバンドから構成さ
れた混合物を生ずる。室温においてＨＦにより長く暴露
すると、高分子量のバンドは消失し、約６８ＫＤおよび
７２ＫＤのポリペプチドのバンドを生成する。
【００５４】完全なムチンおよび異なるＨＦ処理後に生
成した生成物上の糖の存在について試験するために、調
製物の各々をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニ
トロセルロース紙に移し、そして125Ｉ標識レクチンと
反応させた。使用したレクチンは落花生レクチン（ＰＮ
Ａ）（Ｎ−アセチルガラクトサミンに結合したガラクト
ースと反応性である）、胚芽（ＷＧＡ）（Ｎ−アセチル
ガラクトサミンと反応性である）およびヘリックス・ポ
マチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰ
Ａ）（Ｏ−結合グリコシル化状態にある結合糖、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、と反応性である）であった。図
４は反応したブロットのオートラジオグラフィーを示
し、そして明らかなように、４℃で１時間のＨＦによる
処理（トラック２）はムチンのレクチン反応性を変更す
るが、炭水化物はなお存在する。しかしながら、興味あ
ることには、完全なムチン（トラック１）を使用して見
られるより、部分的にストリッピングされたムチンの高
分子量物質へ、非常に低いレベルのＰＮＡが結合する。
そのうえ、このＰＮＡ結合能力の損失は結合糖特異的レ
クチンＨＰＡの結合を伴う。このレクチンは完全なムチ
ンへまったく結合せず、そしてＨＦで制限して処理した
後のレクチンの結合のパターンの変化は、Ｏ−結合Ｎ−
アセチルガラクトサミンをマスキングする糖がストリッ
ピングされたことを示す。完全なムチン（トラック１）
および部分的にストリッピングされた調製物（トラック
２）の両者において見られる同様な成分は、ＷＧＡと反
応するが、ＰＮＡと反応しない糖タンパク質である。こ
れはムチンの親和クロマトグラフィー後に見られた同様
な分子量（約６８Ｋ）の成分に対応させることができ、
そして中間の前駆体分子を表しうる。
成した生成物上の糖の存在について試験するために、調
製物の各々をアクリルアミドゲルの電気泳動にかけ、ニ
トロセルロース紙に移し、そして125Ｉ標識レクチンと
反応させた。使用したレクチンは落花生レクチン（ＰＮ
Ａ）（Ｎ−アセチルガラクトサミンに結合したガラクト
ースと反応性である）、胚芽（ＷＧＡ）（Ｎ−アセチル
ガラクトサミンと反応性である）およびヘリックス・ポ
マチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素（ＨＰ
Ａ）（Ｏ−結合グリコシル化状態にある結合糖、Ｎ−ア
セチルガラクトサミン、と反応性である）であった。図
４は反応したブロットのオートラジオグラフィーを示
し、そして明らかなように、４℃で１時間のＨＦによる
処理（トラック２）はムチンのレクチン反応性を変更す
るが、炭水化物はなお存在する。しかしながら、興味あ
ることには、完全なムチン（トラック１）を使用して見
られるより、部分的にストリッピングされたムチンの高
分子量物質へ、非常に低いレベルのＰＮＡが結合する。
そのうえ、このＰＮＡ結合能力の損失は結合糖特異的レ
クチンＨＰＡの結合を伴う。このレクチンは完全なムチ
ンへまったく結合せず、そしてＨＦで制限して処理した
後のレクチンの結合のパターンの変化は、Ｏ−結合Ｎ−
アセチルガラクトサミンをマスキングする糖がストリッ
ピングされたことを示す。完全なムチン（トラック１）
および部分的にストリッピングされた調製物（トラック
２）の両者において見られる同様な成分は、ＷＧＡと反
応するが、ＰＮＡと反応しない糖タンパク質である。こ
れはムチンの親和クロマトグラフィー後に見られた同様
な分子量（約６８Ｋ）の成分に対応させることができ、
そして中間の前駆体分子を表しうる。
【００５５】図４が明瞭に示すように、ＨＦの高度の処
理（室温において３時間）後生成した６８Ｋおよび７２
Ｋの生成物は、Ｎ−アセチルガラクトサミン特異的レク
チンＨＰＡをはじめとする、レクチンとの反応性を示さ
ない（トラック３）。この観察は糖が少なくとも分子の
大部分から除去されているという強い証拠を構成し、そ
してわれわれはこの調製物を高度にストリッピングした
ムチンと呼ぶ。
理（室温において３時間）後生成した６８Ｋおよび７２
Ｋの生成物は、Ｎ−アセチルガラクトサミン特異的レク
チンＨＰＡをはじめとする、レクチンとの反応性を示さ
ない（トラック３）。この観察は糖が少なくとも分子の
大部分から除去されているという強い証拠を構成し、そ
してわれわれはこの調製物を高度にストリッピングした
ムチンと呼ぶ。
【００５６】乳ムチンのコアタンパク質に対するモノク
ローナル抗体の発生 部分的にストリッピングした乳ムチンで２回注射し、次
いで高度にストリッピングしたムチンで促進処理して免
疫感作したマウスの脾臓を使用して、融合を実施した。
クローンを最初に125Ｉ−部分的にストリッピングした
物質に対して、プロテインＡプレイト（参照、方法）を
使用してスクリーニングした。４つのハイブリドーマを
選択し、そしてクローニングし、そして表２は完全な、
部分的におよび高度にストリッピングしたムチンとの反
応性の、それらのスペクトルを示す。この表から理解で
きるように、分離したハイブリドーマの３つは部分的に
および高度にストリッピングしたムチンとの強い反応性
を示したが、完全なムチンと反応しなかった。これらは
タンパク質のコアに対するモノクローナル抗体のための
優れた候補であると思われ、そして２つ、すなわち、Ｓ
Ｍ−３およびＳＭ−４をさらに特徴づけるために選択し
た。
ローナル抗体の発生 部分的にストリッピングした乳ムチンで２回注射し、次
いで高度にストリッピングしたムチンで促進処理して免
疫感作したマウスの脾臓を使用して、融合を実施した。
クローンを最初に125Ｉ−部分的にストリッピングした
物質に対して、プロテインＡプレイト（参照、方法）を
使用してスクリーニングした。４つのハイブリドーマを
選択し、そしてクローニングし、そして表２は完全な、
部分的におよび高度にストリッピングしたムチンとの反
応性の、それらのスペクトルを示す。この表から理解で
きるように、分離したハイブリドーマの３つは部分的に
および高度にストリッピングしたムチンとの強い反応性
を示したが、完全なムチンと反応しなかった。これらは
タンパク質のコアに対するモノクローナル抗体のための
優れた候補であると思われ、そして２つ、すなわち、Ｓ
Ｍ−３およびＳＭ−４をさらに特徴づけるために選択し
た。
【００５７】また、表２から理解できるように、ＨＭＦ
Ｇ−１およびＨＭＦＧ−２抗体はその炭水化物をストリ
ッピング除去したムチンと非常に強く反応した。これら
の２つの抗体は、事実、完全なムチン（乳脂肪小球か
ら）が免疫原として使用して開発され、そして、ＨＭＦ
Ｇ−２の場合において、増殖する乳房上皮細胞が使用さ
れた（１４）。ストリッピングしたムチンとのそれらの
反応は予測されなかった。なぜなら、周囲の証拠は前以
て炭水化物がそれらの抗原性エピトープの少なくとも一
部分を形成するであろうという信念をもたらしていたか
らである。
Ｇ−１およびＨＭＦＧ−２抗体はその炭水化物をストリ
ッピング除去したムチンと非常に強く反応した。これら
の２つの抗体は、事実、完全なムチン（乳脂肪小球か
ら）が免疫原として使用して開発され、そして、ＨＭＦ
Ｇ−２の場合において、増殖する乳房上皮細胞が使用さ
れた（１４）。ストリッピングしたムチンとのそれらの
反応は予測されなかった。なぜなら、周囲の証拠は前以
て炭水化物がそれらの抗原性エピトープの少なくとも一
部分を形成するであろうという信念をもたらしていたか
らである。
【００５８】抗原決定基を有する分子の分子量 抗体ＳＭ−３はＩｇＧ１の亜属であることが示された
が、ＳＭ−４抗体はＩｇＭであることが発見された。し
たがって、ＩｇＭクラスの抗体はある用途において問題
を表すことがあるので、ＳＭ−３抗体を引き続く実験に
おいて使用ために選択した。ＳＭ−３と高度にストリッ
ピングした物質の免疫沈殿は、レクチン非反応性６８Ｋ
成分との反応性を示した（図５のＡ、トラック３）。モ
ノクローナル抗体ＨＭＦＧ−２は、また、レクチン非反
応性６８Ｋ成分を免疫沈澱させることを理解できる（ト
ラック２）。これらの抗体はイムノブロッティングで抗
原と反応性であり、そして図５のＢは抗体ＳＭ−３と高
度にストリッピングしたムチン優勢の６８Ｋバンドとの
反応性を示す（トラック２）。
が、ＳＭ−４抗体はＩｇＭであることが発見された。し
たがって、ＩｇＭクラスの抗体はある用途において問題
を表すことがあるので、ＳＭ−３抗体を引き続く実験に
おいて使用ために選択した。ＳＭ−３と高度にストリッ
ピングした物質の免疫沈殿は、レクチン非反応性６８Ｋ
成分との反応性を示した（図５のＡ、トラック３）。モ
ノクローナル抗体ＨＭＦＧ−２は、また、レクチン非反
応性６８Ｋ成分を免疫沈澱させることを理解できる（ト
ラック２）。これらの抗体はイムノブロッティングで抗
原と反応性であり、そして図５のＢは抗体ＳＭ−３と高
度にストリッピングしたムチン優勢の６８Ｋバンドとの
反応性を示す（トラック２）。
【００５９】われわれは前に示したように、乳ムチン上
に存在する決定基を有する乳癌細胞中の成分の分子量は
４００Ｋより低く、そして腫瘍毎に変化し得る（１）。
抗体ＳＭ−３と乳癌細胞のゲル分離抽出物のウェスタン
・ブロットとの反応性は、この抗体が抗体ＨＭＦＧ−２
と反応性のものに類似する分子量の成分と反応すること
を示す（データは示されていない）。抗体ＳＭ−３は抗
体ＨＭＦＧ−１および２と異なり、乳汁を出す乳腺によ
り処理された完全なムチンと反応せず、しかも乳癌細胞
により処理された分子と反応し、ＳＭ−３とある範囲の
乳癌との反応を検査するのに適していた。
に存在する決定基を有する乳癌細胞中の成分の分子量は
４００Ｋより低く、そして腫瘍毎に変化し得る（１）。
抗体ＳＭ−３と乳癌細胞のゲル分離抽出物のウェスタン
・ブロットとの反応性は、この抗体が抗体ＨＭＦＧ−２
と反応性のものに類似する分子量の成分と反応すること
を示す（データは示されていない）。抗体ＳＭ−３は抗
体ＨＭＦＧ−１および２と異なり、乳汁を出す乳腺によ
り処理された完全なムチンと反応せず、しかも乳癌細胞
により処理された分子と反応し、ＳＭ−３とある範囲の
乳癌との反応を検査するのに適していた。
【００６０】ＳＭ−３と乳房組織および腫瘍との反応性 抗体ＳＭ−３は、メタカル（正式の生理的食水ではな
い）中で固定されたパラフィン埋め込み組織と、反応し
た。組織の切片の調製にこの方法を使用して、抗体の反
応を乳房組織および腫瘍へのＨＭＦＧ−２のそれと、間
接イムノペルオキシダーゼ染色法により比較した。この
分析は、ＳＭ−３の染色パターンとＨＭＦＧ−２を使用
して見られるそれとの間の劇的な差を示した。こうし
て、強い陽性の反応はＳＭ−３で染色した２０／２２乳
癌（ＨＭＦＧ−２で染色した２２／２２に比較して）見
られ、正常休止乳房、妊娠または乳汁を出す組織および
殆の良性の病変は大体ＳＭ−３で染色されなかったが、
ＨＭＦＧ−２で染色された。乳房組織および腫瘍の染色
パターンのいくつかの例は図６〜９に示されている。
い）中で固定されたパラフィン埋め込み組織と、反応し
た。組織の切片の調製にこの方法を使用して、抗体の反
応を乳房組織および腫瘍へのＨＭＦＧ−２のそれと、間
接イムノペルオキシダーゼ染色法により比較した。この
分析は、ＳＭ−３の染色パターンとＨＭＦＧ−２を使用
して見られるそれとの間の劇的な差を示した。こうし
て、強い陽性の反応はＳＭ−３で染色した２０／２２乳
癌（ＨＭＦＧ−２で染色した２２／２２に比較して）見
られ、正常休止乳房、妊娠または乳汁を出す組織および
殆の良性の病変は大体ＳＭ−３で染色されなかったが、
ＨＭＦＧ−２で染色された。乳房組織および腫瘍の染色
パターンのいくつかの例は図６〜９に示されている。
【００６１】２２の一次（または原発性）癌および１４
の良性の病変を検査し、そして各場合においてＳＭ−３
の反応をＨＭＦＧ−２による染色と比較した。一次癌に
おいて、ＳＭ−３による染色は不均質であったが、一般
に非常に強く、常に腫瘍細胞に限られていた；結合組織
および支質は反応を示さなかった（参照、図６のａ、
ｂ）。検査した４種の線維腺腫において、ＨＭＦＧ−２
による上皮の染色は強かったが、不均質であった。比較
して、ＳＭ−３の染色は１つの場合において陰性であ
り、そして３つの他の場合において染色はただ１または
２つの腺要素に限定されていた。ＨＭＦＧ−２は研究し
た５つの乳頭腫および嚢胞性疾患の５つの場合について
強い反応性を示し、これに対してＳＭ−３を使用して観
測された染色は極めて弱くかつより不均質であった（図
９のｇ、Ｈ）。乳頭腫は１つの群としてＳＭ−３で最強
の染色を示し、そして染色は膜または細胞外であったこ
とが理解できる。
の良性の病変を検査し、そして各場合においてＳＭ−３
の反応をＨＭＦＧ−２による染色と比較した。一次癌に
おいて、ＳＭ−３による染色は不均質であったが、一般
に非常に強く、常に腫瘍細胞に限られていた；結合組織
および支質は反応を示さなかった（参照、図６のａ、
ｂ）。検査した４種の線維腺腫において、ＨＭＦＧ−２
による上皮の染色は強かったが、不均質であった。比較
して、ＳＭ−３の染色は１つの場合において陰性であ
り、そして３つの他の場合において染色はただ１または
２つの腺要素に限定されていた。ＨＭＦＧ−２は研究し
た５つの乳頭腫および嚢胞性疾患の５つの場合について
強い反応性を示し、これに対してＳＭ−３を使用して観
測された染色は極めて弱くかつより不均質であった（図
９のｇ、Ｈ）。乳頭腫は１つの群としてＳＭ−３で最強
の染色を示し、そして染色は膜または細胞外であったこ
とが理解できる。
【００６２】乳汁を出す乳房および妊娠の乳房を強く染
色するＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２と対照的に、Ｓ
Ｍ−３は妊娠または乳汁を出す乳房の６つの場合のうち
３つの完全に陰性であった（参照、図７のｃ、ｄ）。２
つの陽性の場合は、臨時の細胞の非常に弱い染色を示す
にすぎず、染色は１つの小葉の２つの領域に限定されて
いた。再び、正常の休止の乳房のいくつかの末端管の小
葉単位と反応するＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２と対
照的に、ＳＭ−３は試験した１３の場合のうち８つに対
して陰性であり、そして他の５つの場合において、染色
はきわめて弱くそしてしばしば組織切片の１または２つ
の腺房に限定されていた（図８のｅ、ｆ）。多分気が付
くように、メタカルン中に固定した正常乳房組織および
良性の病変を使用して見られたＨＭＦＧ−２による染色
の強度は、ホルマリン固定物質を使用して従来報告され
たものより多少高かった（５０、４７）。
色するＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２と対照的に、Ｓ
Ｍ−３は妊娠または乳汁を出す乳房の６つの場合のうち
３つの完全に陰性であった（参照、図７のｃ、ｄ）。２
つの陽性の場合は、臨時の細胞の非常に弱い染色を示す
にすぎず、染色は１つの小葉の２つの領域に限定されて
いた。再び、正常の休止の乳房のいくつかの末端管の小
葉単位と反応するＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２と対
照的に、ＳＭ−３は試験した１３の場合のうち８つに対
して陰性であり、そして他の５つの場合において、染色
はきわめて弱くそしてしばしば組織切片の１または２つ
の腺房に限定されていた（図８のｅ、ｆ）。多分気が付
くように、メタカルン中に固定した正常乳房組織および
良性の病変を使用して見られたＨＭＦＧ−２による染色
の強度は、ホルマリン固定物質を使用して従来報告され
たものより多少高かった（５０、４７）。
【００６３】ＳＭ−３は、また、正常肝臓、肺、胸腺、
汗腺、精巣上体、前立腺、膀胱、小腸、大腸、垂、甲状
腺および皮膚について陰性であることが示された。この
抗体は、腎臓の温度管、胃の臨時の主要な細胞、唾液腺
の臨時の導管細胞および皮脂性腺とのみ陽性の染色を示
すにすぎない。
汗腺、精巣上体、前立腺、膀胱、小腸、大腸、垂、甲状
腺および皮膚について陰性であることが示された。この
抗体は、腎臓の温度管、胃の臨時の主要な細胞、唾液腺
の臨時の導管細胞および皮脂性腺とのみ陽性の染色を示
すにすぎない。
【００６４】大きい分子量のムチン分子は多くの癌によ
り発現され、そしてモノクローナル抗体により認識され
る腫瘍関連抗原決定基の多くを有する。これらのエピト
ープは、また、ある正常上皮により発現され、そしてＨ
ＭＦＧ−１のようなあるモノクローナル抗体は正常ヒト
乳中で見いだされるムチンととくによく反応する（１、
１７）。ムチンの研究が未特定のエピトープと反応性の
抗体を使用するそれらの検出に限定されるかぎり、それ
らの構造、発現および処理の知識は、また、制限される
であろう。われわれはコアタンパク質を分離し、そして
コアタンパク質をコードする遺伝子の部分的ｃＤＮＡを
選択することを可能とする抗体を開発することによっ
て、乳房ムチンの構造および発現を研究し始めた。この
実施例は、これらの抗体の産生および特徴づけを記載す
る。
り発現され、そしてモノクローナル抗体により認識され
る腫瘍関連抗原決定基の多くを有する。これらのエピト
ープは、また、ある正常上皮により発現され、そしてＨ
ＭＦＧ−１のようなあるモノクローナル抗体は正常ヒト
乳中で見いだされるムチンととくによく反応する（１、
１７）。ムチンの研究が未特定のエピトープと反応性の
抗体を使用するそれらの検出に限定されるかぎり、それ
らの構造、発現および処理の知識は、また、制限される
であろう。われわれはコアタンパク質を分離し、そして
コアタンパク質をコードする遺伝子の部分的ｃＤＮＡを
選択することを可能とする抗体を開発することによっ
て、乳房ムチンの構造および発現を研究し始めた。この
実施例は、これらの抗体の産生および特徴づけを記載す
る。
【００６５】フッ化水素を使用するＨＭＦＧ−１親和性
精製した乳ムチンの処理は、約６８Ｋダルトンの優勢な
バンドおよび約７２ＫＤの小さい種をＳＤＳアクリルア
ミドゲル上に出現させた。これらのバンドは、Ｏ−結合
グリコシル化における第１糖であるＮ−アセチルガラク
トサミンに対して特異的であるヘリックス・ポマチア
（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素をはじめとす
る、レクチンとの反応性を示さなかった（５５）。した
がって、この６８ＫＤのポリペプチドはムチンのコアタ
ンパク質を表すと思われる。これを支持する証拠は、ス
トリッピングした６８Ｋ成分と反応性である前述の抗体
は、ムチンを発現する乳癌細胞から分離したｍＲＮＡの
生体外翻訳産生物から、この大きさの分子を沈澱させる
ことができるという観察から得られる。
精製した乳ムチンの処理は、約６８Ｋダルトンの優勢な
バンドおよび約７２ＫＤの小さい種をＳＤＳアクリルア
ミドゲル上に出現させた。これらのバンドは、Ｏ−結合
グリコシル化における第１糖であるＮ−アセチルガラク
トサミンに対して特異的であるヘリックス・ポマチア
（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素をはじめとす
る、レクチンとの反応性を示さなかった（５５）。した
がって、この６８ＫＤのポリペプチドはムチンのコアタ
ンパク質を表すと思われる。これを支持する証拠は、ス
トリッピングした６８Ｋ成分と反応性である前述の抗体
は、ムチンを発現する乳癌細胞から分離したｍＲＮＡの
生体外翻訳産生物から、この大きさの分子を沈澱させる
ことができるという観察から得られる。
【００６６】乳ムチンは少なくとも５０％の炭水化物を
含有するので（１６）、完全な分子が４００ＫＤより大
きい観測される分子量を有する場合、６８ＫＤのみのタ
ンパク質コアは小さすぎるように思われる。しかしなが
ら、ムチンは小さいサブユニットから構成されることが
でき、これらのサブユニットは、なお理解されないが、
凝集し、そしてある形態の非共有結合的な相互作用によ
り一緒に保持されている。例えば、ヒツジ下顎ムチンの
分子量は１×１０6ダルトンより大きいことが報告され
た（４５）が、それは５８，３００ダルトンの分子量の
わずかに６５０アミノ酸のタンパク質のコアを有するに
すぎない。
含有するので（１６）、完全な分子が４００ＫＤより大
きい観測される分子量を有する場合、６８ＫＤのみのタ
ンパク質コアは小さすぎるように思われる。しかしなが
ら、ムチンは小さいサブユニットから構成されることが
でき、これらのサブユニットは、なお理解されないが、
凝集し、そしてある形態の非共有結合的な相互作用によ
り一緒に保持されている。例えば、ヒツジ下顎ムチンの
分子量は１×１０6ダルトンより大きいことが報告され
た（４５）が、それは５８，３００ダルトンの分子量の
わずかに６５０アミノ酸のタンパク質のコアを有するに
すぎない。
【００６７】予期せざることには、乳ムチンと反応する
抗体ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２は、また、レクチ
ン結合能力を示さない、高度にストリッピングした物質
と陽性の反応を示すことが発見された。固定、沸騰およ
び還元に対する抵抗、それらのエピトープの反復的性
質、およびイムノブロッティング上のいくつかのバンド
の出現をはじめとする、従来の間接の証拠は、乳ムチン
上の炭水化物の存在がこれらのエピトープにおいて含ま
れるという信念に導いた。この考えはレクチンがＨＭＦ
Ｇ−１おおびＨＭＦＧ−２の結合を遮断することができ
るという観測により強化された（１）。レクチン結合の
実験により検出されない、ある糖が、本明細書に記載さ
れる高度にストリッピングしたムチン上に残存する可能
性を排除することは不可能であるが、これが抗体ＨＭＦ
Ｇ−１おおびＨＭＦＧ−２の反応性を説明するものと思
われない。これは次の理由で言うことができる。両抗体
は、乳房ムチンのコアタンパク質をコードするＤＮＡを
有するファージにより発現される、β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質と陽性反応することが最近示されたか
らである。したがって、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−
２により認識されるエピトープの各々の少なくとも一部
分はアミノ酸を含有するように思われるが、コアタンパ
ク質上のこれらのエピトープのあるものは露出される、
すなわち、完全にグリコシル化された分子中でマスキン
グされないに違いない。しかしながら、ＨＭＦＧ−２エ
ピトープはＨＭＦＧ−１エピトープより乳ムチン上で豊
富ではないが、それは腫瘍により発現されるムチン分子
上で容易に検出可能である（１）。これらの分子はより
小さい分子量を有し、そしてそれほど高度にグリコシル
化されないか、あるいは重合されていないかも知れな
い。
抗体ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２は、また、レクチ
ン結合能力を示さない、高度にストリッピングした物質
と陽性の反応を示すことが発見された。固定、沸騰およ
び還元に対する抵抗、それらのエピトープの反復的性
質、およびイムノブロッティング上のいくつかのバンド
の出現をはじめとする、従来の間接の証拠は、乳ムチン
上の炭水化物の存在がこれらのエピトープにおいて含ま
れるという信念に導いた。この考えはレクチンがＨＭＦ
Ｇ−１おおびＨＭＦＧ−２の結合を遮断することができ
るという観測により強化された（１）。レクチン結合の
実験により検出されない、ある糖が、本明細書に記載さ
れる高度にストリッピングしたムチン上に残存する可能
性を排除することは不可能であるが、これが抗体ＨＭＦ
Ｇ−１おおびＨＭＦＧ−２の反応性を説明するものと思
われない。これは次の理由で言うことができる。両抗体
は、乳房ムチンのコアタンパク質をコードするＤＮＡを
有するファージにより発現される、β−ガラクトシダー
ゼ融合タンパク質と陽性反応することが最近示されたか
らである。したがって、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−
２により認識されるエピトープの各々の少なくとも一部
分はアミノ酸を含有するように思われるが、コアタンパ
ク質上のこれらのエピトープのあるものは露出される、
すなわち、完全にグリコシル化された分子中でマスキン
グされないに違いない。しかしながら、ＨＭＦＧ−２エ
ピトープはＨＭＦＧ−１エピトープより乳ムチン上で豊
富ではないが、それは腫瘍により発現されるムチン分子
上で容易に検出可能である（１）。これらの分子はより
小さい分子量を有し、そしてそれほど高度にグリコシル
化されないか、あるいは重合されていないかも知れな
い。
【００６８】本明細書で、ムチンのコアタンパク質およ
び部分的にグリコシル化した分子と反応性であるが、乳
汁を出す乳腺により産生する完全に処理されたムチンと
反応性でない、新しい抗体の開発をわれわれは報告し
た。これらの抗体の１つでＩｇＧ１であるＳＭ−３、を
さらに詳しく研究した。それは、乳癌細胞により産生さ
れ、そして完全な乳ムチンに対して開発された多くの抗
体により認識されるムチン分子と反応することが示され
た。しかしながら、コアタンパク質上に存在しかつ腫瘍
細胞により処理されるときムチンにおいて露出されるＳ
Ｍ−３により認識されるエピトープは、通常処理される
乳ムチン上に露出されないことを強調する必要がある。
この特徴は、増大した腫瘍の特異性の可能性を与え、そ
して乳房の腫瘍および組織のパイロット免疫組織化学的
研究は、事実、ＳＭ−３抗体が、原発性乳癌の大部分
（９１％）と強く反応するが、良性の乳腫瘍、休止また
は乳汁を出す乳房、および大部分の正常組織とほとんど
あるいは全く反応しないことを示した。
び部分的にグリコシル化した分子と反応性であるが、乳
汁を出す乳腺により産生する完全に処理されたムチンと
反応性でない、新しい抗体の開発をわれわれは報告し
た。これらの抗体の１つでＩｇＧ１であるＳＭ−３、を
さらに詳しく研究した。それは、乳癌細胞により産生さ
れ、そして完全な乳ムチンに対して開発された多くの抗
体により認識されるムチン分子と反応することが示され
た。しかしながら、コアタンパク質上に存在しかつ腫瘍
細胞により処理されるときムチンにおいて露出されるＳ
Ｍ−３により認識されるエピトープは、通常処理される
乳ムチン上に露出されないことを強調する必要がある。
この特徴は、増大した腫瘍の特異性の可能性を与え、そ
して乳房の腫瘍および組織のパイロット免疫組織化学的
研究は、事実、ＳＭ−３抗体が、原発性乳癌の大部分
（９１％）と強く反応するが、良性の乳腫瘍、休止また
は乳汁を出す乳房、および大部分の正常組織とほとんど
あるいは全く反応しないことを示した。
【００６９】乳癌における基本的研究および臨床的研究
の両者にとって重要でありうる、ここに記載する研究の
いくつかの解釈が存在する。コアタンパク質の一部分
（抗体により検出可能な）が乳癌により処理されるとき
ムチン上に露出されるが、正常乳房および良性腫瘍によ
り処理されるときムチン上でマスキングされるという観
測は、悪性腫瘍におけるムチンの処理（プロセッシン
グ）における変更が存在するということを意味する。次
いで、正常および悪性の細胞におけるムチンの処理のよ
り詳しい研究は、悪性細胞を定義するための基本的情報
を与えることができるであろう。そのうえ、腫瘍に対す
る抗体ＳＭ−３の反応の特異性は完全なムチンに対して
開発された抗体のそれよりすぐれるので、この抗体は組
織切片、組織流体および細胞中の乳癌細胞の検出のため
に、より有効な診断の道具であることを実証するであろ
う。反応性成分は細胞間と同様に膜随伴性であるので腫
瘍の生体内局在化も可能であろう。
の両者にとって重要でありうる、ここに記載する研究の
いくつかの解釈が存在する。コアタンパク質の一部分
（抗体により検出可能な）が乳癌により処理されるとき
ムチン上に露出されるが、正常乳房および良性腫瘍によ
り処理されるときムチン上でマスキングされるという観
測は、悪性腫瘍におけるムチンの処理（プロセッシン
グ）における変更が存在するということを意味する。次
いで、正常および悪性の細胞におけるムチンの処理のよ
り詳しい研究は、悪性細胞を定義するための基本的情報
を与えることができるであろう。そのうえ、腫瘍に対す
る抗体ＳＭ−３の反応の特異性は完全なムチンに対して
開発された抗体のそれよりすぐれるので、この抗体は組
織切片、組織流体および細胞中の乳癌細胞の検出のため
に、より有効な診断の道具であることを実証するであろ
う。反応性成分は細胞間と同様に膜随伴性であるので腫
瘍の生体内局在化も可能であろう。
【００７０】なお、使用した略語は次の通りである：Ｈ
ＭＦＧ、ヒト乳脂肪小球；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食
塩液（１５３ミリモルのＮａＣｌ、３ミリモルのＮａ2
ＨＰＯ4、２ミリモルのＫＭ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）；Ｗ
ＧＡ、胚芽凝集素；ＰＮＡ、ピーナッツ凝集素；ＰＨ
Ａ、ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉ
ａ）凝集素；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＳＤＳ、ド
デシル硫酸ナトリウム。
ＭＦＧ、ヒト乳脂肪小球；ＰＢＳ、リン酸緩衝化生理食
塩液（１５３ミリモルのＮａＣｌ、３ミリモルのＮａ2
ＨＰＯ4、２ミリモルのＫＭ2ＰＯ4、ｐＨ７．４）；Ｗ
ＧＡ、胚芽凝集素；ＰＮＡ、ピーナッツ凝集素；ＰＨ
Ａ、ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ ｐｏｍａｔｉ
ａ）凝集素；ＢＳＡ、ウシ血清アルブミン；ＳＤＳ、ド
デシル硫酸ナトリウム。
【００７１】実施例２ ヒト乳ムチンの精製および脱グリコシル化を実施例１に
おけるように実施し、ムチンをＨＭＦＧ−１抗体で精製
した。
おけるように実施し、ムチンをＨＭＦＧ−１抗体で精製
した。
【００７２】ストリッピングしたムチン調製物をＮａＤ
ｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）の電気
泳動で精製し、そして２つの方法により銀染色し、それ
らの方法１つは高度にグリコシル化したタンパク質を染
色するために使用することができる（２２、２３）。
ｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）の電気
泳動で精製し、そして２つの方法により銀染色し、それ
らの方法１つは高度にグリコシル化したタンパク質を染
色するために使用することができる（２２、２３）。
【００７３】ストリッピングしたコアタンパク質に対す
るポリクローナルウサギ抗血清の調製 １匹のニュージーランド白ウサギを完全フロイントアジ
ュバント（Ｇｉｂｃｏ）中で１００μｇの部分的にスト
リッピングしたコアタンパク質で免疫感作した。５００
μｇの高度にストリッピングしたコアタンパク質の促進
処理注射を、最初の注射後３および４週後、完全フロイ
ントアジュバント（Ｇｉｂｃｏ）中で投与した。１０マ
イクロタイターの免疫血清（７５μｇ／ｍｌタンパク
質）は２００ｎｇの高度にストリッピングしたコアタン
パク質をプロテインＡアッセイ（２４）において沈澱さ
せ、そしてそれをイムノブロッティングにおいて検出し
た。ウサギ免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）の免疫グロブ
リンの分画およびウサギ抗ムチンタンパク質を、硫酸ア
ンモニウムを５０％飽和に添加することによって調製し
た。得られるペレットをもとのＰＢＳの血清体積の半分
中に再懸濁し、そして同一緩衝液に対して透析した。透
析後、唯一の残留沈澱を遠心により除去した。免疫グロ
ブリンの分画をアリコートで−２０℃において貯蔵し
た。
るポリクローナルウサギ抗血清の調製 １匹のニュージーランド白ウサギを完全フロイントアジ
ュバント（Ｇｉｂｃｏ）中で１００μｇの部分的にスト
リッピングしたコアタンパク質で免疫感作した。５００
μｇの高度にストリッピングしたコアタンパク質の促進
処理注射を、最初の注射後３および４週後、完全フロイ
ントアジュバント（Ｇｉｂｃｏ）中で投与した。１０マ
イクロタイターの免疫血清（７５μｇ／ｍｌタンパク
質）は２００ｎｇの高度にストリッピングしたコアタン
パク質をプロテインＡアッセイ（２４）において沈澱さ
せ、そしてそれをイムノブロッティングにおいて検出し
た。ウサギ免疫前（ｐｒｅｉｍｍｕｎｅ）の免疫グロブ
リンの分画およびウサギ抗ムチンタンパク質を、硫酸ア
ンモニウムを５０％飽和に添加することによって調製し
た。得られるペレットをもとのＰＢＳの血清体積の半分
中に再懸濁し、そして同一緩衝液に対して透析した。透
析後、唯一の残留沈澱を遠心により除去した。免疫グロ
ブリンの分画をアリコートで−２０℃において貯蔵し
た。
【００７４】使用したＭＡｂｓの説明 初期のスクリーニングのために使用したポリクローナル
抗血清に加えて、ムチンコアタンパク質（２０）を認識
する２つのＭＡｂｓ、ＳＭ−３およびＳＭ−４のカクテ
ル（実施例１参照）、ならびにＨＭＦＧ−１およびＨＭ
ＦＧ−２（１、１４）を、精製したプラーク、β−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク質をスクリーニングするため
および生体外翻訳タンパク質の免疫沈澱のために使用し
た［ＭＡｂｓ、ＳＭ−３およびＳＭ−４（ＳＭはストリ
ッピングしたムチンを意味する）は部分的におよび高度
にストリッピングしたコアタンパク質と強い反応性を示
したが、完全にグリコシル化したムチン（２０）と反応
性をしめさなかった］。使用した他のＭＡｂｓは、モノ
クローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体（２５）［Ｈ．
Ｄｕｒｂｉｎ（ＩＣＲＦ、ロンドン）からの贈り物であ
った］、抗インターフェロン抗体、ＳＴ２５４（２
４）、ＬＥ６１、ケラチン抗体（２６）およびＭ１８
（これは乳ムチン上の炭水化物構造を認識する）（２
７）であった。
抗血清に加えて、ムチンコアタンパク質（２０）を認識
する２つのＭＡｂｓ、ＳＭ−３およびＳＭ−４のカクテ
ル（実施例１参照）、ならびにＨＭＦＧ−１およびＨＭ
ＦＧ−２（１、１４）を、精製したプラーク、β−ガラ
クトシダーゼ融合タンパク質をスクリーニングするため
および生体外翻訳タンパク質の免疫沈澱のために使用し
た［ＭＡｂｓ、ＳＭ−３およびＳＭ−４（ＳＭはストリ
ッピングしたムチンを意味する）は部分的におよび高度
にストリッピングしたコアタンパク質と強い反応性を示
したが、完全にグリコシル化したムチン（２０）と反応
性をしめさなかった］。使用した他のＭＡｂｓは、モノ
クローナル抗β−ガラクトシダーゼ抗体（２５）［Ｈ．
Ｄｕｒｂｉｎ（ＩＣＲＦ、ロンドン）からの贈り物であ
った］、抗インターフェロン抗体、ＳＴ２５４（２
４）、ＬＥ６１、ケラチン抗体（２６）およびＭ１８
（これは乳ムチン上の炭水化物構造を認識する）（２
７）であった。
【００７５】タンパク質の生体外翻訳 ＲＮＡをヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７からチルグインらの
グアニジウムイソチオシアネート法（２８）を使用して
分離し、そしてｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
Ｌａｂｓ）を使用するクロマトグラフィーにより精製し
た。ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡは網状赤血球リゼイト系
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で［35Ｓ］メチオニン（１００
０Ｃｉ／ミリモル；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）の存在下に翻訳した。５×１０ 4酸不溶性ｃｐｍ
を含有する試料をプロテインＡアッセイ（２４）におい
てＳＭ−３、ＳＭ−４、ＨＭＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２お
よびヒトインターフェロンの対照抗体を使用して沈澱さ
せた。次いで、抗体選択したタンパク質をＮａＤｏｄＳ
Ｏ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で分離し、ア
ンプリファイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で含浸し、そしてＸ
ＡＲ−５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に−７０℃において露
出した。
グアニジウムイソチオシアネート法（２８）を使用して
分離し、そしてｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡをオリゴ（ｄ
Ｔ）−セルロース（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏ
Ｌａｂｓ）を使用するクロマトグラフィーにより精製し
た。ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡは網状赤血球リゼイト系
（Ａｍｅｒｓｈａｍ）中で［35Ｓ］メチオニン（１００
０Ｃｉ／ミリモル；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ、Ａｍｅｒｓｈ
ａｍ）の存在下に翻訳した。５×１０ 4酸不溶性ｃｐｍ
を含有する試料をプロテインＡアッセイ（２４）におい
てＳＭ−３、ＳＭ−４、ＨＭＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２お
よびヒトインターフェロンの対照抗体を使用して沈澱さ
せた。次いで、抗体選択したタンパク質をＮａＤｏｄＳ
Ｏ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で分離し、ア
ンプリファイ（Ａｍｅｒｓｈａｍ）で含浸し、そしてＸ
ＡＲ−５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に−７０℃において露
出した。
【００７６】λｇｔ１１ライブラリーの抗体スクリーニ
ングおよびタンパク質のブロッティング この研究において使用したλｇｔ１１ライブラリーは、
ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７から分離したｍＲＮＡから構
成し、そしてフィルップス・ワルター・アンド・ピアー
ズ（フランス国ストラスバーグ）により寛大にも提供さ
れた。ランダムにプライムされたライブラリーの調製に
使用したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡはｍＲＮＡから調製
し、このｍＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡより速く沈降し、そ
してエストロゲン受容体において濃縮した（２９）。こ
のライブラリーは本質的にフインらおよびヤングおよび
デイビス（３０〜３２）に記載されているようにつく
り、そしてほぼ１×１０6組み換え体／μｇのＲＮＡを
含有した。プラークの８５％〜９５％はインサートを含
有していた。
ングおよびタンパク質のブロッティング この研究において使用したλｇｔ１１ライブラリーは、
ヒト乳癌細胞系ＭＣＦ−７から分離したｍＲＮＡから構
成し、そしてフィルップス・ワルター・アンド・ピアー
ズ（フランス国ストラスバーグ）により寛大にも提供さ
れた。ランダムにプライムされたライブラリーの調製に
使用したｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡはｍＲＮＡから調製
し、このｍＲＮＡは２８ＳｒＲＮＡより速く沈降し、そ
してエストロゲン受容体において濃縮した（２９）。こ
のライブラリーは本質的にフインらおよびヤングおよび
デイビス（３０〜３２）に記載されているようにつく
り、そしてほぼ１×１０6組み換え体／μｇのＲＮＡを
含有した。プラークの８５％〜９５％はインサートを含
有していた。
【００７７】ファージのライブラリーをバクテリア菌株
Ｙ１０９０上に配置し、そして４２℃において３時間増
殖させた。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）誘導および３７℃における３時間の増殖後、フ
ィルターをプレートの各々から調製し、そしてヤングお
よびデイビス（３２）の方法により抗ムチンコアタンパ
ク質抗体でスクリーニングした。スクリーニングにおい
て使用した第１抗体は、前述したように調製したストリ
ッピングしたコアタンパク質に対してレイズしたウサギ
抗血清であった。スクリーニングにおいて使用する前、
抗血清を１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ
（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で１：２００に希釈した。Ｙ１０
９０バクテリア溶解物を使用する予備吸収は、不必要で
あることが分かった。ニトロセルロースフィルター（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を、５
％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で室温において撹拌しな
がら１時間インキュベーションすることにより遮断し
た。フィルターは、熱シールプラスチックバッグ内で抗
血清の１：２００希釈とともに室温において一夜インキ
ュベーションした。フィルターをＰＢＳ／ＢＳＡ中で５
×５分洗浄し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡで１：５００に希
釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ウ
サギ抗血清（Ｄａｋｏ）を使用して結合した抗体を検出
し、そしてフィルターとともに２時間インキュベーショ
ンした。フィルターをＰＢＳ／ＢＳＡ中で５×５分洗浄
し、そして１×１０分ＰＢＳ中で洗浄し、次いで４−ク
ロロ−１−ナフトールを使用して色を検出した（１）。
免疫活性バクテリオファージを取り上げ、そして２つの
追加のラウンドのスクリーニングで精製した。引き続い
て、バクテリオファージのインサートをｐＵＣ８のＥｃ
ｏＲＩ部位（３３）中にサブクローニングして、最も頻
繁に使用するプラスミド、ｐＭＵＣ１０を作成した。プ
ラスミドはＤＨ１細胞中で維持した。
Ｙ１０９０上に配置し、そして４２℃において３時間増
殖させた。イソプロピルβ−Ｄ−チオガラクトシド（Ｉ
ＰＴＧ）誘導および３７℃における３時間の増殖後、フ
ィルターをプレートの各々から調製し、そしてヤングお
よびデイビス（３２）の方法により抗ムチンコアタンパ
ク質抗体でスクリーニングした。スクリーニングにおい
て使用した第１抗体は、前述したように調製したストリ
ッピングしたコアタンパク質に対してレイズしたウサギ
抗血清であった。スクリーニングにおいて使用する前、
抗血清を１％のウシ血清アルブミンを含有するＰＢＳ
（ＰＢＳ／ＢＳＡ）中で１：２００に希釈した。Ｙ１０
９０バクテリア溶解物を使用する予備吸収は、不必要で
あることが分かった。ニトロセルロースフィルター（Ｓ
ｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）を、５
％のＢＳＡを含有するＰＢＳ中で室温において撹拌しな
がら１時間インキュベーションすることにより遮断し
た。フィルターは、熱シールプラスチックバッグ内で抗
血清の１：２００希釈とともに室温において一夜インキ
ュベーションした。フィルターをＰＢＳ／ＢＳＡ中で５
×５分洗浄し、そしてＰＢＳ／ＢＳＡで１：５００に希
釈したセイヨウワサビペルオキシダーゼ接合ヒツジ抗ウ
サギ抗血清（Ｄａｋｏ）を使用して結合した抗体を検出
し、そしてフィルターとともに２時間インキュベーショ
ンした。フィルターをＰＢＳ／ＢＳＡ中で５×５分洗浄
し、そして１×１０分ＰＢＳ中で洗浄し、次いで４−ク
ロロ−１−ナフトールを使用して色を検出した（１）。
免疫活性バクテリオファージを取り上げ、そして２つの
追加のラウンドのスクリーニングで精製した。引き続い
て、バクテリオファージのインサートをｐＵＣ８のＥｃ
ｏＲＩ部位（３３）中にサブクローニングして、最も頻
繁に使用するプラスミド、ｐＭＵＣ１０を作成した。プ
ラスミドはＤＨ１細胞中で維持した。
【００７８】β−ガラクトシダーゼｃＤＮＡ融合タンパ
ク質を免疫活性について検査するために、細胞リゼイト
を誘導した。溶原体をヤングおよびデイビス（３４）に
記載されているように調製した。細胞を沈澱させ、ラエ
ムリ試料緩衝液（３５）中に懸濁させ、そしてＮａＤｏ
ｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で電気泳
動により分離し、そして記載されているように（１、３
６）ニトロセルロース紙上に移した。フィルターを上の
ように抗体スクリーニングのために処理した。
ク質を免疫活性について検査するために、細胞リゼイト
を誘導した。溶原体をヤングおよびデイビス（３４）に
記載されているように調製した。細胞を沈澱させ、ラエ
ムリ試料緩衝液（３５）中に懸濁させ、そしてＮａＤｏ
ｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で電気泳
動により分離し、そして記載されているように（１、３
６）ニトロセルロース紙上に移した。フィルターを上の
ように抗体スクリーニングのために処理した。
【００７９】ノーザン分析 ＲＮＡを組織培養細胞から分離し、そしてチルグウイン
らのグアニジニウムイソチオシネート法（２８）により
組織を凍結した。合計のＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を
脱イオングリオキサール中で５５℃に１時間に加熱して
変性し、そして１．３％のグリオキサールゲルの電気泳
動により分画した（３８）。ＲＮＡをニトロセルロース
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に
移し、トーマス（３４）に記載されているように予備ハ
イブリダイズ、次いでハイブリダイズした。フィルター
を０．１×ＳＳＣに０．１％のＳＤＳで６５℃において
洗浄し、そして増感スクリーンで−７０℃においてＸＡ
Ｒ−５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露出した。
らのグアニジニウムイソチオシネート法（２８）により
組織を凍結した。合計のＲＮＡ（１０μｇ／レーン）を
脱イオングリオキサール中で５５℃に１時間に加熱して
変性し、そして１．３％のグリオキサールゲルの電気泳
動により分画した（３８）。ＲＮＡをニトロセルロース
（Ｓｃｈｌｅｉｃｈｅｒ ａｎｄ Ｓｃｈｕｅｌｌ）に
移し、トーマス（３４）に記載されているように予備ハ
イブリダイズ、次いでハイブリダイズした。フィルター
を０．１×ＳＳＣに０．１％のＳＤＳで６５℃において
洗浄し、そして増感スクリーンで−７０℃においてＸＡ
Ｒ−５フィルム（Ｋｏｄａｋ）に露出した。
【００８０】サザン分析 高分子量ゲノムＤＮＡを白血球および細胞系から調製し
た（３９、４０）。これらのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）
を制限酵素で製造業者の推奨する条件下に切断し、そし
て０．６％〜０．７％のアガロースゲルで分画した。ク
ローン化されたプラスミドＤＮＡを切断し、そして１．
３％のアガロースゲルで分画した。ゲルを、製造業者の
推奨する条件下に、変性し、中和し、そしてナイロン膜
に移した。ｐＭＵＣ１０からのＥｃｏＲＩインサートを
１％の低融点アガロース（Ｂｉｒａｄ）ゲルで分離し、
そして［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでランダムプライミングの
方法（４１）により標識し、そして４２℃においてフィ
ルターとハイブリダイズさせた。フィルターを０．１×
ＳＳＣに０．１％のＳＤＳで５５℃において洗浄し、そ
して増感スクリーンで−７０℃においてＸＡＲ−５フィ
ルム（Ｋｏｄａｋ）に露出した。
た（３９、４０）。これらのゲノムＤＮＡ（１０μｇ）
を制限酵素で製造業者の推奨する条件下に切断し、そし
て０．６％〜０．７％のアガロースゲルで分画した。ク
ローン化されたプラスミドＤＮＡを切断し、そして１．
３％のアガロースゲルで分画した。ゲルを、製造業者の
推奨する条件下に、変性し、中和し、そしてナイロン膜
に移した。ｐＭＵＣ１０からのＥｃｏＲＩインサートを
１％の低融点アガロース（Ｂｉｒａｄ）ゲルで分離し、
そして［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでランダムプライミングの
方法（４１）により標識し、そして４２℃においてフィ
ルターとハイブリダイズさせた。フィルターを０．１×
ＳＳＣに０．１％のＳＤＳで５５℃において洗浄し、そ
して増感スクリーンで−７０℃においてＸＡＲ−５フィ
ルム（Ｋｏｄａｋ）に露出した。
【００８１】ムチン糖タンパク質の精製および脱グリコ
シル化 モノクローナル抗体ＨＭＦＧ−１と反応性のムチン糖タ
ンパク質を、プールしたヒト乳房乳から、ＨＭＦＧ−１
抗体親和性カラムを使用して調製し、次いでＧ７５セフ
ァデックのモレキュラーシーブのクロマトグラフィーに
かけて低分子量の成分を除去した（図１０、レーン
１）。精製した分子の同質性を立証するために、４つの
別の調製物のアミノ酸分析を実施したところ、アミノ酸
の５８％を説明するセリン、スレオニン、プロリン、ア
ラニン、およびグリシンをもつかなり一定の組成が明ら
かにされた。過ヨウ素酸銀染色ゲルは、銀の染色前に、
ゲルを過ヨウ素酸で処理したときにのみ可視の４００，
０００ダルトンより大きい拡散バンドを明らかにした
（図１０、レーン２）。過ヨウ素酸による予備処理なし
の銀染色を使用すると、他の低分子量のバンドはゲル上
で可視化されなかった。
シル化 モノクローナル抗体ＨＭＦＧ−１と反応性のムチン糖タ
ンパク質を、プールしたヒト乳房乳から、ＨＭＦＧ−１
抗体親和性カラムを使用して調製し、次いでＧ７５セフ
ァデックのモレキュラーシーブのクロマトグラフィーに
かけて低分子量の成分を除去した（図１０、レーン
１）。精製した分子の同質性を立証するために、４つの
別の調製物のアミノ酸分析を実施したところ、アミノ酸
の５８％を説明するセリン、スレオニン、プロリン、ア
ラニン、およびグリシンをもつかなり一定の組成が明ら
かにされた。過ヨウ素酸銀染色ゲルは、銀の染色前に、
ゲルを過ヨウ素酸で処理したときにのみ可視の４００，
０００ダルトンより大きい拡散バンドを明らかにした
（図１０、レーン２）。過ヨウ素酸による予備処理なし
の銀染色を使用すると、他の低分子量のバンドはゲル上
で可視化されなかった。
【００８２】精製した物質をフッ化水素で処理して、ム
チン糖タンパク質に特徴的な、Ｏ−結合糖を除去した。
２つの異なる反応条件を使用した。これらの条件は部分
的に脱グリコシル化されたコアタンパク質（０℃におい
て１時間）および完全に脱グリコシル化されたコアタン
パク質（室温において３時間）を、ヨウ素化レクチン結
合、引き続くゲル電気泳動およびニトロセルロース紙へ
移すこと（２０）により決定して生成した。部分的に脱
グリコシル化されたコアタンパク質は胚芽凝集素、ピー
ナッツ凝集素およびヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ
ｐｏｍａｔｉａ）レクチン（これは結合糖Ｎ−アセチ
ルガラクトサミンを認識する）と反応性であるが、完全
に脱グリコシル化されたコアタンパク質はこれらはの３
つのレクチンとの反応性を示さなかった。
チン糖タンパク質に特徴的な、Ｏ−結合糖を除去した。
２つの異なる反応条件を使用した。これらの条件は部分
的に脱グリコシル化されたコアタンパク質（０℃におい
て１時間）および完全に脱グリコシル化されたコアタン
パク質（室温において３時間）を、ヨウ素化レクチン結
合、引き続くゲル電気泳動およびニトロセルロース紙へ
移すこと（２０）により決定して生成した。部分的に脱
グリコシル化されたコアタンパク質は胚芽凝集素、ピー
ナッツ凝集素およびヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌｉｘ
ｐｏｍａｔｉａ）レクチン（これは結合糖Ｎ−アセチ
ルガラクトサミンを認識する）と反応性であるが、完全
に脱グリコシル化されたコアタンパク質はこれらはの３
つのレクチンとの反応性を示さなかった。
【００８３】フッ化水素処理したコアタンパク質をＮａ
ＤｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）の電
気泳動により分離し、そして銀染色した。銀の染色によ
り、部分的にストリッピングしたムチンの主要成分は約
４００ｋｄの高分子量のバンドであるが、低分子量の淡
いバンドも観測されることが明らかにされた（図１１、
レーン１）。高分子量の物質はゲル中で多少増加した移
動度を示し、そして結合糖を認識するレクチンと反応し
たので、多少の糖が除去されたものと推測することがで
きる。完全にストリッピングされたムチンは約６８ｋｄ
および７２ｋｄから成っていた（図１１、レーン２）。
ＤｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）の電
気泳動により分離し、そして銀染色した。銀の染色によ
り、部分的にストリッピングしたムチンの主要成分は約
４００ｋｄの高分子量のバンドであるが、低分子量の淡
いバンドも観測されることが明らかにされた（図１１、
レーン１）。高分子量の物質はゲル中で多少増加した移
動度を示し、そして結合糖を認識するレクチンと反応し
たので、多少の糖が除去されたものと推測することがで
きる。完全にストリッピングされたムチンは約６８ｋｄ
および７２ｋｄから成っていた（図１１、レーン２）。
【００８４】ＭＣＦ−７細胞により産生された抗体反応
性タンパク質 ＭＣＦ−７乳癌細胞系は大量のＨＭＦＧ−１およびＨＭ
ＦＧ−２反応性物質をその細胞表面上に発現し、こうし
てｃＤＮＡライブラリーのためのｍＲＮＡの適当な源で
あると判定された。モノクローナル抗体でＭＣＦ−７の
ライブラリーをスクリーニングする前に、それらをＭＣ
Ｆ−７ ｍＲＮＡから産生された生体外翻訳産生物から
の成分を沈澱させる、それらの能力について試験した。
翻訳反応からのタンパク質を、モノクローナル抗体ＨＭ
ＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２、ＳＭ−３およびＳＭ−４を使
用して免疫沈澱させ、そしてアクリルアミドゲルの電気
泳動およびフルオログラフィーで表示した（図１２）。
約６８ｋｄおよび９２ｋｄの２つのタンパク質がＳＭ−
３（レーン２）およびＳＭ−４（レーン２）により免疫
沈澱された。また、ＨＭＦＧ−１（レーン４）およびＨ
ＭＦＧ−２（レーン３）もこれらのタンパク質を免疫沈
澱させた；しかしながら、これらの領域のバンドはヒト
インターフェロンに対する無関係の抗体（レーン５）に
より沈澱しなかった。ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２
がこれらのタンパク質を免疫沈澱させたという事実は、
従来これらのＭＡｂｓが炭水化物の決定基を認識すると
考えられていたので（１）、予期されざる発見であっ
た。しかしながら、われわれは、また、ＨＭＦＧ−１お
よびＨＭＦＧ−２が完全にストリッピングされ、ヨウ素
化されたコアタンパク質と非常に強く反応したことを発
見した（２０）。これらの結果はβ−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質へのＭＡｂの反応性と一緒になって（下
を参照）、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２のためのエ
ピトープは、少なくとも一部分、性質がタンパク質であ
ることを実証する。
性タンパク質 ＭＣＦ−７乳癌細胞系は大量のＨＭＦＧ−１およびＨＭ
ＦＧ−２反応性物質をその細胞表面上に発現し、こうし
てｃＤＮＡライブラリーのためのｍＲＮＡの適当な源で
あると判定された。モノクローナル抗体でＭＣＦ−７の
ライブラリーをスクリーニングする前に、それらをＭＣ
Ｆ−７ ｍＲＮＡから産生された生体外翻訳産生物から
の成分を沈澱させる、それらの能力について試験した。
翻訳反応からのタンパク質を、モノクローナル抗体ＨＭ
ＦＧ−１、ＨＭＦＧ−２、ＳＭ−３およびＳＭ−４を使
用して免疫沈澱させ、そしてアクリルアミドゲルの電気
泳動およびフルオログラフィーで表示した（図１２）。
約６８ｋｄおよび９２ｋｄの２つのタンパク質がＳＭ−
３（レーン２）およびＳＭ−４（レーン２）により免疫
沈澱された。また、ＨＭＦＧ−１（レーン４）およびＨ
ＭＦＧ−２（レーン３）もこれらのタンパク質を免疫沈
澱させた；しかしながら、これらの領域のバンドはヒト
インターフェロンに対する無関係の抗体（レーン５）に
より沈澱しなかった。ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２
がこれらのタンパク質を免疫沈澱させたという事実は、
従来これらのＭＡｂｓが炭水化物の決定基を認識すると
考えられていたので（１）、予期されざる発見であっ
た。しかしながら、われわれは、また、ＨＭＦＧ−１お
よびＨＭＦＧ−２が完全にストリッピングされ、ヨウ素
化されたコアタンパク質と非常に強く反応したことを発
見した（２０）。これらの結果はβ−ガラクトシダーゼ
融合タンパク質へのＭＡｂの反応性と一緒になって（下
を参照）、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２のためのエ
ピトープは、少なくとも一部分、性質がタンパク質であ
ることを実証する。
【００８５】合計の細胞のｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡ中の
コアタンパク質のｍＲＮＡの豊富さは、免疫沈澱した解
き存在する（35Ｓ）メチオニンの量を、生体外翻訳の間
に組み込まれたメチオニンの量と比較することによって
４％と推定された。
コアタンパク質のｍＲＮＡの豊富さは、免疫沈澱した解
き存在する（35Ｓ）メチオニンの量を、生体外翻訳の間
に組み込まれたメチオニンの量と比較することによって
４％と推定された。
【００８６】ｃＤＮＡライブラリーのスクリーニング 大きさで選択されたＭＣＦ−７のｍＲＮＡから作ったλ
ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（参照、方法）を、最
初に、その炭水化物を除去したムチンコアタンパク質に
対して作ったポリクローナル抗体でスクリーニングし
た。２×１０6プラークのスクリーニングは１１の陽性
のクローンを生成し、これらのうちの７つを２つの追加
のプラーク精製のラウンドで首尾よく採取した。
ｇｔ１１ ｃＤＮＡライブラリー（参照、方法）を、最
初に、その炭水化物を除去したムチンコアタンパク質に
対して作ったポリクローナル抗体でスクリーニングし
た。２×１０6プラークのスクリーニングは１１の陽性
のクローンを生成し、これらのうちの７つを２つの追加
のプラーク精製のラウンドで首尾よく採取した。
【００８７】ファージのクローンと抗体プローブとの反
応性はｃＤＮＡ翻訳産生物上の抗原決定基に起因するこ
とを立証するために、β−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質をすべての７つのクローンから作った。タンパク質
を電気泳動により分離し、ニトロセルロース紙に移し、
そしてストリッピングしたムチンに対する種々の抗体で
プロービングした。これらの抗体は、最初に、クローン
を選択するために使用したポリクローナル抗血清とＳＭ
−３およびＳＭ−４のカクテルを包含した。さらに、Ｈ
ＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２、すなわち、本来この分
化および腫瘍関連上皮ムチンを検出した２つのモノクロ
ーナル抗体（１、１４）を試験した。すべての７つのク
ローンは融合タンパク質を生じ、これらはポリクローナ
ル抗血清、モノクローナルカクテル、およびＨＭＦＧ−
２により特異的に認識された。ＨＭＦＧ−１抗体は７つ
の融合タンパク質のうちの６つと反応し、そして最小の
インサートを含有するクローン９からのタンパク質を認
識することはできなかった。すべての場合において、最
強の信号はＨＭＦＧ−２抗体により得られ、この反応は
図１３に示されている。ケラチンに対するおよびこの完
全にグリコシル化したムチン上の炭水化物エピトープに
対するモノクローナル抗体を、対照として使用したとこ
ろ、反応性は示さなかった。
応性はｃＤＮＡ翻訳産生物上の抗原決定基に起因するこ
とを立証するために、β−ガラクトシダーゼ融合タンパ
ク質をすべての７つのクローンから作った。タンパク質
を電気泳動により分離し、ニトロセルロース紙に移し、
そしてストリッピングしたムチンに対する種々の抗体で
プロービングした。これらの抗体は、最初に、クローン
を選択するために使用したポリクローナル抗血清とＳＭ
−３およびＳＭ−４のカクテルを包含した。さらに、Ｈ
ＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２、すなわち、本来この分
化および腫瘍関連上皮ムチンを検出した２つのモノクロ
ーナル抗体（１、１４）を試験した。すべての７つのク
ローンは融合タンパク質を生じ、これらはポリクローナ
ル抗血清、モノクローナルカクテル、およびＨＭＦＧ−
２により特異的に認識された。ＨＭＦＧ−１抗体は７つ
の融合タンパク質のうちの６つと反応し、そして最小の
インサートを含有するクローン９からのタンパク質を認
識することはできなかった。すべての場合において、最
強の信号はＨＭＦＧ−２抗体により得られ、この反応は
図１３に示されている。ケラチンに対するおよびこの完
全にグリコシル化したムチン上の炭水化物エピトープに
対するモノクローナル抗体を、対照として使用したとこ
ろ、反応性は示さなかった。
【００８８】β−ガラクトシダーゼに対するモノクロー
ナル抗体は陽性の対照であり、そして認識されたバンド
はすべての場合において特異的抗体により認識されるバ
ンドと相関関係を有した。融合タンパク質の大きさは、
バクテリオファージ中に見いだされるｃＤＮＡインサー
トの大きさに比例して変化した。
ナル抗体は陽性の対照であり、そして認識されたバンド
はすべての場合において特異的抗体により認識されるバ
ンドと相関関係を有した。融合タンパク質の大きさは、
バクテリオファージ中に見いだされるｃＤＮＡインサー
トの大きさに比例して変化した。
【００８９】ｃＤＮＡおよびＲＮＡブロット分析の特徴
づけ λクローンからのインサートをｐＭＵＣ３−１０（ｐＭ
ＵＣ５を省略する）と表示し、そして取り扱いを容易に
するためにベクターｐＵＣ８中にサブクローニングし
た。７つのクローンをお互いに配列の相同性について比
較した。プラスミドの各々をＥｃｏＲＩで消化し、そい
てインサートを１．４％のアガロースゲルで分離した。
ｐＭＵＣ１０からの最大のｃＤＮＡインサートを使用し
てインサートをプロービングし、そしてすべての６イン
サートにハイブリダイズさせた（図１４）。ｐＭＵＣ７
はＥｃｏＲＩで消化後２つのインサートを含有すること
が分かった；しかしながら、インサートの１つのみがｐ
ＭＵＣ１０プローブとハイブリダイズした。インサート
のバンドはファージＤＮＡからから誘導されなかった。
なぜなら、ｐＭＵＣ１０プローブはＨｉｎｄＩＩＩ消化
λファージＤＮＡにハイブリダイズしなかったからであ
る。
づけ λクローンからのインサートをｐＭＵＣ３−１０（ｐＭ
ＵＣ５を省略する）と表示し、そして取り扱いを容易に
するためにベクターｐＵＣ８中にサブクローニングし
た。７つのクローンをお互いに配列の相同性について比
較した。プラスミドの各々をＥｃｏＲＩで消化し、そい
てインサートを１．４％のアガロースゲルで分離した。
ｐＭＵＣ１０からの最大のｃＤＮＡインサートを使用し
てインサートをプロービングし、そしてすべての６イン
サートにハイブリダイズさせた（図１４）。ｐＭＵＣ７
はＥｃｏＲＩで消化後２つのインサートを含有すること
が分かった；しかしながら、インサートの１つのみがｐ
ＭＵＣ１０プローブとハイブリダイズした。インサート
のバンドはファージＤＮＡからから誘導されなかった。
なぜなら、ｐＭＵＣ１０プローブはＨｉｎｄＩＩＩ消化
λファージＤＮＡにハイブリダイズしなかったからであ
る。
【００９０】アガロースゲルの電気泳動により示される
ように（図１４）、インサートは大きさが約２００から
約１８００ｂｐまで変化した。ｐＭＵＣ１０からの最大
のインサートは、すべての引き続く実験におけるハイブ
リダイゼーションプローブとして使用した。
ように（図１４）、インサートは大きさが約２００から
約１８００ｂｐまで変化した。ｐＭＵＣ１０からの最大
のインサートは、すべての引き続く実験におけるハイブ
リダイゼーションプローブとして使用した。
【００９１】λＭＵＣクローンは抗体の結合によっての
み同定されたので、われわれはそれらが事実に乳房上皮
ムチンをコードするかどうかをさらに確認することが必
要であった。ｐＭＵＣ１０の真性さを決定するために、
われわれはクローンにハイブリダイズするｍＲＮＡの存
在を種々の細胞系におけるムチンの発現と関係付けた。
図１５に示すように、前にＨＭＦＧ−２抗原を発現する
ことを示した（１、１４）乳癌細胞系ＭＣＦ−７および
Ｔ４７ＤからのＲＮＡにおいて、ｃＤＮＡは４．７ｋｄ
および６．４ｋｄの２つの転写体とハイブリダイズし
た。重要なことは、ｐＭＵＣ１０プローブが乳から培養
した正常乳房上皮細胞から抽出したＲＮＡにおいて、ほ
ぼ同一の大きさの転写体にハイブリダイズすることであ
る（４２）。５．７ｋｄの第３バンドはこれらの正常細
胞からのＲＮＡにおいて見ることができる。対照的に、
ムチンを欠く３つのヒト細胞のタイプ、乳房線維芽、ダ
ウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞およびＨＳ５７８Ｔ、乳房組織
から誘導された癌肉腫系（４３）は、検出可能なｐＭＵ
Ｃ１０関連ｍＲＮＡを示さなかった。６．４ｋｂのバン
ドは最も豊富に発現されるように思われた。ＭＣＦ−７
細胞からのｍＲＮＡの少なくとも２つの大きさの存在
は、ＭＣＦ−７細胞からの生体外翻訳したｍＲＮＡから
の２つのタンパク質（分子量６８ｋｄおよび９２ｋｄ）
の免疫沈澱と相関関係をもつ。正常乳房上皮細胞をプー
ルした乳試料から誘導し、そして観測された追加の転写
は個体の間の多形性のためであろう。
み同定されたので、われわれはそれらが事実に乳房上皮
ムチンをコードするかどうかをさらに確認することが必
要であった。ｐＭＵＣ１０の真性さを決定するために、
われわれはクローンにハイブリダイズするｍＲＮＡの存
在を種々の細胞系におけるムチンの発現と関係付けた。
図１５に示すように、前にＨＭＦＧ−２抗原を発現する
ことを示した（１、１４）乳癌細胞系ＭＣＦ−７および
Ｔ４７ＤからのＲＮＡにおいて、ｃＤＮＡは４．７ｋｄ
および６．４ｋｄの２つの転写体とハイブリダイズし
た。重要なことは、ｐＭＵＣ１０プローブが乳から培養
した正常乳房上皮細胞から抽出したＲＮＡにおいて、ほ
ぼ同一の大きさの転写体にハイブリダイズすることであ
る（４２）。５．７ｋｄの第３バンドはこれらの正常細
胞からのＲＮＡにおいて見ることができる。対照的に、
ムチンを欠く３つのヒト細胞のタイプ、乳房線維芽、ダ
ウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞およびＨＳ５７８Ｔ、乳房組織
から誘導された癌肉腫系（４３）は、検出可能なｐＭＵ
Ｃ１０関連ｍＲＮＡを示さなかった。６．４ｋｂのバン
ドは最も豊富に発現されるように思われた。ＭＣＦ−７
細胞からのｍＲＮＡの少なくとも２つの大きさの存在
は、ＭＣＦ−７細胞からの生体外翻訳したｍＲＮＡから
の２つのタンパク質（分子量６８ｋｄおよび９２ｋｄ）
の免疫沈澱と相関関係をもつ。正常乳房上皮細胞をプー
ルした乳試料から誘導し、そして観測された追加の転写
は個体の間の多形性のためであろう。
【００９２】ゲノムＤＮＡブロット分析および制限断片
長さの多形性（ＲＦＬＰ）の検出 ６つの無関係の個体および４つの族から成る個体のパネ
ルから、および３つの細胞系から、ゲノムＤＮＡを調製
した。ＨｉｎｆＩまたはＥｃｏＲＩで消化し、そしてブ
ロッティングし、そして放射線標識したｐＭＵＣ１０イ
ンサートへハイブリダイズしたＤＮＡは、制限断片の長
さの多形性を示した。１０個体および２つの細胞系から
の制限断片を図１６に示す。パターンはＨｉｎｆＩ消化
における３４００ｂｐ〜６２００ｂｐ（３つのバンドを
示す図１６のＡ、レーン１２におけるＺＲ７５−１ＤＮ
Ａを除外する）あるいはＥｃｏＲＩ消化において８２０
０ｂｐ〜９６００ｂｐ（図１６のＢ）の範囲の単一のバ
ンドまたは二重から成る。遺伝子座における高い生体内
安定性を意味する断片大きさの連続的分布が存在するよ
うに思われた。４つの族（レーン１〜４）において観測
される断片のパターンは、これらの断片がアレルである
ことを示唆する。正常な関連する個体の白血球から作っ
たＤＮＡの予備的研究は、遺伝の常染色体の相互優性の
モードをもつ、ある数の独立のアレルの存在を示す。こ
れらの研究は別の研究の主題であろう。
長さの多形性（ＲＦＬＰ）の検出 ６つの無関係の個体および４つの族から成る個体のパネ
ルから、および３つの細胞系から、ゲノムＤＮＡを調製
した。ＨｉｎｆＩまたはＥｃｏＲＩで消化し、そしてブ
ロッティングし、そして放射線標識したｐＭＵＣ１０イ
ンサートへハイブリダイズしたＤＮＡは、制限断片の長
さの多形性を示した。１０個体および２つの細胞系から
の制限断片を図１６に示す。パターンはＨｉｎｆＩ消化
における３４００ｂｐ〜６２００ｂｐ（３つのバンドを
示す図１６のＡ、レーン１２におけるＺＲ７５−１ＤＮ
Ａを除外する）あるいはＥｃｏＲＩ消化において８２０
０ｂｐ〜９６００ｂｐ（図１６のＢ）の範囲の単一のバ
ンドまたは二重から成る。遺伝子座における高い生体内
安定性を意味する断片大きさの連続的分布が存在するよ
うに思われた。４つの族（レーン１〜４）において観測
される断片のパターンは、これらの断片がアレルである
ことを示唆する。正常な関連する個体の白血球から作っ
たＤＮＡの予備的研究は、遺伝の常染色体の相互優性の
モードをもつ、ある数の独立のアレルの存在を示す。こ
れらの研究は別の研究の主題であろう。
【００９３】ＭＣＦ−７ λｇｔ１１ライブラリーから
得られた、ここに記載するｃＤＮＡクローンは、正常細
胞産生物、その脱グリコシル化形態の乳ムチン、に対し
て調製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体を使用して選択した。これらは次の理由で実施し
た。乳癌細胞により発現される免疫学的に関連する糖タ
ンパク質の同様な量を調製することよりも、ストリッピ
ングのためのムチンを大量に得ることはより容易であっ
たからである（４４）。抗体がＭＣＦ−７細胞における
非グリコシル化コアタンパク質分子をコードするｃＤＮ
Ａを選択するという事実は、乳ムチンに対する抗体との
それらの反応性により本来検出された、これらの細胞に
おける糖タンパク質が、このムチンと同一のコアタンパ
ク質を含有することを強く示唆する。これは、ＭＣＦ−
７ライブラリーから分離されたプローブの１つをを使用
して、正常および悪性の細胞におけるほぼ同一の大きさ
のｍＲＮＡを検出することによって証される。したがっ
て、われわれは乳癌細胞上の抗体反応性糖タンパク質を
ムチンと呼び、ここでそれらの処理は異なり、分子量が
異なるが、乳ムチンのそれと同一のコアタンパク質をも
つことを考慮する。
得られた、ここに記載するｃＤＮＡクローンは、正常細
胞産生物、その脱グリコシル化形態の乳ムチン、に対し
て調製されたポリクローナル抗体およびモノクローナル
抗体を使用して選択した。これらは次の理由で実施し
た。乳癌細胞により発現される免疫学的に関連する糖タ
ンパク質の同様な量を調製することよりも、ストリッピ
ングのためのムチンを大量に得ることはより容易であっ
たからである（４４）。抗体がＭＣＦ−７細胞における
非グリコシル化コアタンパク質分子をコードするｃＤＮ
Ａを選択するという事実は、乳ムチンに対する抗体との
それらの反応性により本来検出された、これらの細胞に
おける糖タンパク質が、このムチンと同一のコアタンパ
ク質を含有することを強く示唆する。これは、ＭＣＦ−
７ライブラリーから分離されたプローブの１つをを使用
して、正常および悪性の細胞におけるほぼ同一の大きさ
のｍＲＮＡを検出することによって証される。したがっ
て、われわれは乳癌細胞上の抗体反応性糖タンパク質を
ムチンと呼び、ここでそれらの処理は異なり、分子量が
異なるが、乳ムチンのそれと同一のコアタンパク質をも
つことを考慮する。
【００９４】７つのクローンがＭＣＦ−７ライブラリー
から得られ、それらのうちの最大は１８００ｋｂであっ
た。このクローンを他の６つの小さいクローンと交差ハ
イブリダイズした。６つの交差ハイブリダイズしたラム
ダクローンにより発現されるβ−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質は、ムチンコアタンパク質に向けられたポリ
クローナル抗血清、ならびにストリッピングしたコアタ
ンパク質上の種々のエピトープに向けられ、よく特性決
定のされた４種のモノクローナル抗体、ＳＭ−３、ＳＭ
−４、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２（１４、２０）
と反応性であった。最小のラムダクローン、λＭＵＣ９
は、４種のモノクローナル抗体の３つと、およびポリク
ローナル抗血清と反応する、β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を産生した。
から得られ、それらのうちの最大は１８００ｋｂであっ
た。このクローンを他の６つの小さいクローンと交差ハ
イブリダイズした。６つの交差ハイブリダイズしたラム
ダクローンにより発現されるβ−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質は、ムチンコアタンパク質に向けられたポリ
クローナル抗血清、ならびにストリッピングしたコアタ
ンパク質上の種々のエピトープに向けられ、よく特性決
定のされた４種のモノクローナル抗体、ＳＭ−３、ＳＭ
−４、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２（１４、２０）
と反応性であった。最小のラムダクローン、λＭＵＣ９
は、４種のモノクローナル抗体の３つと、およびポリク
ローナル抗血清と反応する、β−ガラクトシダーゼ融合
タンパク質を産生した。
【００９５】広範に特徴づけられるＨＭＦＧ−１および
ＨＭＦＧ−２モノクローナル抗体はラムダプラークおよ
び融合タンパク質と強く反応し、そして生体外翻訳した
ｍＲＮＡからのタンパク質を免疫沈澱することが出来る
という、驚くべき結果は、これらのクローンが事実ムチ
ンコアタンパク質の一部をコードするという強い証拠を
提供する。従来の証拠、例えば、固定、沸騰、ジチオス
レイトールおよびＮａＤｏｄＳＯ4による処理に対する
抵抗性、および分子上の多数のエピトープの存在はこれ
らが炭水化物であることを示唆する（１）が、今回、Ｈ
ＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２のモノクローナル抗体の
エピトープは性質が明確にタンパク質であるということ
が確立された。炭水化物は、エピトープの一部分とし
て、あるいはタンパク質部分に対する多少のコンフォメ
ーションの変化を与えることにより、最強の結合を得る
ために要求されうるが、抗原決定基の一部分はアミノ酸
配列から成らねばならない。これらの２つのＭＡｂは完
全にグリコシル化された乳ムチンならびにストリッピン
グされたコアタンパク質と反応性であるので、このデー
タは完全な分子がこれらの２つの抗体のための抗原部位
に寄与する裸のペプチドの領域を含有することを意味す
る。
ＨＭＦＧ−２モノクローナル抗体はラムダプラークおよ
び融合タンパク質と強く反応し、そして生体外翻訳した
ｍＲＮＡからのタンパク質を免疫沈澱することが出来る
という、驚くべき結果は、これらのクローンが事実ムチ
ンコアタンパク質の一部をコードするという強い証拠を
提供する。従来の証拠、例えば、固定、沸騰、ジチオス
レイトールおよびＮａＤｏｄＳＯ4による処理に対する
抵抗性、および分子上の多数のエピトープの存在はこれ
らが炭水化物であることを示唆する（１）が、今回、Ｈ
ＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２のモノクローナル抗体の
エピトープは性質が明確にタンパク質であるということ
が確立された。炭水化物は、エピトープの一部分とし
て、あるいはタンパク質部分に対する多少のコンフォメ
ーションの変化を与えることにより、最強の結合を得る
ために要求されうるが、抗原決定基の一部分はアミノ酸
配列から成らねばならない。これらの２つのＭＡｂは完
全にグリコシル化された乳ムチンならびにストリッピン
グされたコアタンパク質と反応性であるので、このデー
タは完全な分子がこれらの２つの抗体のための抗原部位
に寄与する裸のペプチドの領域を含有することを意味す
る。
【００９６】ｐＭＵＣ１０が乳房ムチンコアタンパク質
をコードするという確認の証拠は、ＲＮＡブロットによ
り提供される。乳癌細胞系ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ
−７５−１におけるおよび正常乳房上皮細胞におけるｍ
ＲＮＡの相対的豊富さは、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ
−２モノクローナル抗体の結合により測定した、これら
の細胞による抗原の発現に相当する。抗原の発現に対し
て陰性の細胞のタイプ、例えば、ヒト線維芽、ダウジ細
胞およびＨＳ５７８Ｔ、乳房から誘導される癌肉腫（１
４）はＲＮＡブロットハイブリダゼーションにおいて陰
性である。ＺＲ−７５−１細胞を使用して実施した偶然
の観測は、ｐＭＵＣ１０が事実ムチン糖タンパク質のコ
アタンパク質をコードするという、間接の強い証拠を提
供した。この細胞系は、日常的にｍＲＮＡおよび抗原の
両者を大量に発現し、ブロットハイブリダイゼーション
により予期せざることには陰性である、ＲＮＡの１つの
調製物を生成した。驚くべきことには、ＲＮＡを調製す
るとき使用した、特定のＺＲ−７５−１細胞はこのとき
同様に抗原の発現を失っていた（ＨＭＦＧ−１およびＨ
ＭＦＧ−２との反応により決定して）。ＺＲ−７５−１
細胞の種々の継代の数は回復され、そしてもう一度抗原
およびメッセージの両者を発現することが示された。メ
ッセージの大きさ、４．７ｋｂおよび６．４ｋｂは非常
におおきい。なぜなら、６８ｋｄおよび９２ｋｄのタン
パク質はタンパク質の部分をコードするためにわずかに
３ｋｂを必要とするだけであるからである。これはｍＲ
ＮＡの大きい部分が翻訳されていない可能性があること
を示唆する。完全な長さのクローンを得る努力がなされ
ている。
をコードするという確認の証拠は、ＲＮＡブロットによ
り提供される。乳癌細胞系ＭＣＦ−７、Ｔ４７Ｄ、ＺＲ
−７５−１におけるおよび正常乳房上皮細胞におけるｍ
ＲＮＡの相対的豊富さは、ＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ
−２モノクローナル抗体の結合により測定した、これら
の細胞による抗原の発現に相当する。抗原の発現に対し
て陰性の細胞のタイプ、例えば、ヒト線維芽、ダウジ細
胞およびＨＳ５７８Ｔ、乳房から誘導される癌肉腫（１
４）はＲＮＡブロットハイブリダゼーションにおいて陰
性である。ＺＲ−７５−１細胞を使用して実施した偶然
の観測は、ｐＭＵＣ１０が事実ムチン糖タンパク質のコ
アタンパク質をコードするという、間接の強い証拠を提
供した。この細胞系は、日常的にｍＲＮＡおよび抗原の
両者を大量に発現し、ブロットハイブリダイゼーション
により予期せざることには陰性である、ＲＮＡの１つの
調製物を生成した。驚くべきことには、ＲＮＡを調製す
るとき使用した、特定のＺＲ−７５−１細胞はこのとき
同様に抗原の発現を失っていた（ＨＭＦＧ−１およびＨ
ＭＦＧ−２との反応により決定して）。ＺＲ−７５−１
細胞の種々の継代の数は回復され、そしてもう一度抗原
およびメッセージの両者を発現することが示された。メ
ッセージの大きさ、４．７ｋｂおよび６．４ｋｂは非常
におおきい。なぜなら、６８ｋｄおよび９２ｋｄのタン
パク質はタンパク質の部分をコードするためにわずかに
３ｋｂを必要とするだけであるからである。これはｍＲ
ＮＡの大きい部分が翻訳されていない可能性があること
を示唆する。完全な長さのクローンを得る努力がなされ
ている。
【００９７】こうして、本明細書に表したｃＤＮＡクロ
ーンは、分化した乳房組織ならびにほとんどの乳癌によ
り発現される、ヒト乳房ムチンをコードする遺伝子の部
分を表す。乳ムチンコアタンパク質に対する抗体により
ＭＣＦ−７細胞からのＲＮＡの生体外翻訳産生物から、
沈澱した主なタンパク質は、６８Ｋｄおよび９２Ｋｄの
見掛け分子量を有する。したがって、乳癌細胞により産
生されたタンパク質は、乳ムチンの６８Ｋｄコアタンパ
ク質とエピトープを共有する（２０）。同様な９２Ｋｄ
タンパク質が、また、正常乳房上皮細胞により産生さ
れ、そしてＨＦ処理により短縮または破壊されるかどう
かは、なお、明らかでない。１４Ｃアミノ酸で生物合成
的に標識されたＭＣＦ−７細胞は、ＨＭＦＧ−１および
ＨＭＦＧ−２抗体で免疫沈澱させると、３２０Ｋｄおよ
び４３０Ｋｄの２つのグリコシル化タンパク質を生成
し、そいてこれらの各々の糖タンパク質は６８Ｋｄまた
は９２Ｋｄの１つのコアタンパク質を利用することが可
能である。あるいは、糖タンパク質の各々は、９２Ｋｄ
および６８Ｋｄのタンパク質を異なる比率で、あるいは
可変的にグリコシル化されて、含有することができるあ
ろう。さらに、ライブラリーをスクリーニングすると、
両者の大きさの免疫学的に関連するコアタンパク質をコ
ードする、全長のｃＤＮＡを産生するであろう。単一の
遺伝子のみが存在するように思われる（部分的にｃＤＮ
Ａプローブを使用してえられたサザンブロットのデータ
に基づいて）ので、多数のメッセージが交互のＲＮＡの
スプライシングにより生ずることがあり、そしてこれは
それらが共通の配列を含有するという事実を説明するで
あろう。６８Ｋｄのコアタンパク質は小さくて５０％の
炭水化物を含有する３００Ｋｄより大きい完全にグリコ
シル化された分子を生成しないと思われるが、ムチンに
このような構造が可能であるという証拠が存在する。ヒ
ツジ下顎ムチンは１×１０6ダルトンの分子量を有する
ことが報告された（４５）が、しかもそのタンパク質の
コアは６５０アミノ酸から成り、５８ｋｄの分子を生成
する（４６）。
ーンは、分化した乳房組織ならびにほとんどの乳癌によ
り発現される、ヒト乳房ムチンをコードする遺伝子の部
分を表す。乳ムチンコアタンパク質に対する抗体により
ＭＣＦ−７細胞からのＲＮＡの生体外翻訳産生物から、
沈澱した主なタンパク質は、６８Ｋｄおよび９２Ｋｄの
見掛け分子量を有する。したがって、乳癌細胞により産
生されたタンパク質は、乳ムチンの６８Ｋｄコアタンパ
ク質とエピトープを共有する（２０）。同様な９２Ｋｄ
タンパク質が、また、正常乳房上皮細胞により産生さ
れ、そしてＨＦ処理により短縮または破壊されるかどう
かは、なお、明らかでない。１４Ｃアミノ酸で生物合成
的に標識されたＭＣＦ−７細胞は、ＨＭＦＧ−１および
ＨＭＦＧ−２抗体で免疫沈澱させると、３２０Ｋｄおよ
び４３０Ｋｄの２つのグリコシル化タンパク質を生成
し、そいてこれらの各々の糖タンパク質は６８Ｋｄまた
は９２Ｋｄの１つのコアタンパク質を利用することが可
能である。あるいは、糖タンパク質の各々は、９２Ｋｄ
および６８Ｋｄのタンパク質を異なる比率で、あるいは
可変的にグリコシル化されて、含有することができるあ
ろう。さらに、ライブラリーをスクリーニングすると、
両者の大きさの免疫学的に関連するコアタンパク質をコ
ードする、全長のｃＤＮＡを産生するであろう。単一の
遺伝子のみが存在するように思われる（部分的にｃＤＮ
Ａプローブを使用してえられたサザンブロットのデータ
に基づいて）ので、多数のメッセージが交互のＲＮＡの
スプライシングにより生ずることがあり、そしてこれは
それらが共通の配列を含有するという事実を説明するで
あろう。６８Ｋｄのコアタンパク質は小さくて５０％の
炭水化物を含有する３００Ｋｄより大きい完全にグリコ
シル化された分子を生成しないと思われるが、ムチンに
このような構造が可能であるという証拠が存在する。ヒ
ツジ下顎ムチンは１×１０6ダルトンの分子量を有する
ことが報告された（４５）が、しかもそのタンパク質の
コアは６５０アミノ酸から成り、５８ｋｄの分子を生成
する（４６）。
【００９８】腫瘍および乳癌細胞系のイムノブロッティ
ングでＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２で検出されるム
チンは、腫瘍ムチン分子の分子量における８０ｋｄ〜４
００ｋｄの大きさの変動を示す（１、１４）。正常尿中
に存在する高分子量のムチンを検出する、これらの同一
の抗体を使用すると、多形性が事実遺伝子的に決定され
ることが示された（４８）。非常に低い分子量の化合物
は、多くの腫瘍細胞における不完全に処理されると思わ
れる、ムチンの前駆体の形態を表すように思われる（２
０）が、高分子量成分における変動は遺伝的多形性のた
めのようである。しかしながら、多形性の構造的基準が
遺伝的に決定されるタンパク質のためであるか、あるい
はムチンの炭水化物部分のためであるかは、不明瞭であ
った。ムチンのプローブを使用するサザンブロッティン
グにおける制限断片の長さの多形性の検出は、ムチンの
多形性がタンパク質をコードするＤＮＡのレベルで起こ
ることを示唆している。予備的配列決定のデータは、こ
の多形性の基準がタンパク質解読配列中に存在する可変
縦列反復の領域であることを示唆している。この構造的
特徴は、ムチン部位における多くのアレル制限断片の発
生の原因となりうる。われわれは、現在、尿のムチンの
遺伝のパターンが決定されている、正常の関連する個体
の白血球からのＤＮＡのサザンブロットの検査により、
ムチン多形性の基準を研究している。さらに、われわれ
は、個体乳癌患者の白血球および腫瘍から作られたＤＮ
Ａ調製物を検査して、対になった試料中の遺伝子型の間
の不規則性が存在するかどうかを決定している。なぜな
ら、縦列反復するＤＮＡは、組み換えまたは増幅が起こ
りうる、不安定な部位を提供するからである。
ングでＨＭＦＧ−１およびＨＭＦＧ−２で検出されるム
チンは、腫瘍ムチン分子の分子量における８０ｋｄ〜４
００ｋｄの大きさの変動を示す（１、１４）。正常尿中
に存在する高分子量のムチンを検出する、これらの同一
の抗体を使用すると、多形性が事実遺伝子的に決定され
ることが示された（４８）。非常に低い分子量の化合物
は、多くの腫瘍細胞における不完全に処理されると思わ
れる、ムチンの前駆体の形態を表すように思われる（２
０）が、高分子量成分における変動は遺伝的多形性のた
めのようである。しかしながら、多形性の構造的基準が
遺伝的に決定されるタンパク質のためであるか、あるい
はムチンの炭水化物部分のためであるかは、不明瞭であ
った。ムチンのプローブを使用するサザンブロッティン
グにおける制限断片の長さの多形性の検出は、ムチンの
多形性がタンパク質をコードするＤＮＡのレベルで起こ
ることを示唆している。予備的配列決定のデータは、こ
の多形性の基準がタンパク質解読配列中に存在する可変
縦列反復の領域であることを示唆している。この構造的
特徴は、ムチン部位における多くのアレル制限断片の発
生の原因となりうる。われわれは、現在、尿のムチンの
遺伝のパターンが決定されている、正常の関連する個体
の白血球からのＤＮＡのサザンブロットの検査により、
ムチン多形性の基準を研究している。さらに、われわれ
は、個体乳癌患者の白血球および腫瘍から作られたＤＮ
Ａ調製物を検査して、対になった試料中の遺伝子型の間
の不規則性が存在するかどうかを決定している。なぜな
ら、縦列反復するＤＮＡは、組み換えまたは増幅が起こ
りうる、不安定な部位を提供するからである。
【００９９】癌の大部分におけるムチンの存在およびそ
れらの乳房上皮細胞の分化との関連性は、組織特異性お
よび遺伝子の発育の調節に関与する領域を同定するため
に特に重要である。そのうえ、細胞中への機能的ムチン
遺伝子の導入は、乳房上皮分化におけるこの分子の役割
への見識を提供し、そして多分ヒト乳房における悪性の
形質転換に関係する、ムチンの機能または発現における
変更の同定を可能とするであろう。
れらの乳房上皮細胞の分化との関連性は、組織特異性お
よび遺伝子の発育の調節に関与する領域を同定するため
に特に重要である。そのうえ、細胞中への機能的ムチン
遺伝子の導入は、乳房上皮分化におけるこの分子の役割
への見識を提供し、そして多分ヒト乳房における悪性の
形質転換に関係する、ムチンの機能または発現における
変更の同定を可能とするであろう。
【０１００】なお、略語は次の通りである：PBS、リン
酸塩緩衝液；MAb、モノクローナル抗体；IPTG、イソプ
ロピルβ‐D‐チオガラクトシド；bp、塩基対；kb、キ
ロ塩基。
酸塩緩衝液；MAb、モノクローナル抗体；IPTG、イソプ
ロピルβ‐D‐チオガラクトシド；bp、塩基対；kb、キ
ロ塩基。
【０１０１】 表 １ ヒト乳ムチンのアミノ酸組成‐PAS‐Oとの比較 アミノ酸 HMFG‐１ 精製 高度にストリッピ PAS‐O 乳ムチン ングした乳ムチン （シミズおよび ヤマウチ 1982） Asp 6.1 7.2 6.4 Thr 9.4 9.7 9.8 Ser 9.1 13.0 13.1 Glx 6.3 9.6 8.3 Pro 14.8 14.4 12.0 Gly 8.1 10.1 12.2 Ala 12.3 11.9 13.0 Cys 分析せず 分析せず 0.5 Val 6.0 6.3 5.3 Met 0.5 0.4 0.8 Ile 1.6 1.7 1.9 Leu 4.5 4.8 3.7 Tyr 2.0 0.9 1.6 Phe 2.0 1.6 1.7 His 3.2 2.3 3.8 Lys 2.8 3.3 2.2 Arg 4.0 4.0 3.9 表 ２ 完全な、部分的におよび完全に脱グリコシル化乳ムチンへの抗体の反応性 125I cpm結合 抗 体 完全な分子 部分的にストリッ 完全にストリッ ピングしたムチン ピングしたムチン 5.17 8,524 11,925 5,780 9.13 525 3,000 3,328 SM‐3 465 15,414 9,200 SM‐4 816 16,750 9,561 HMFG‐1 32,000 33,768 9,494 HMFG‐2 29,500 29,230 15,832 NS2 medium 397 845 650 ヨウ素化完全な、部分的および完全に脱グリコシル化乳
ムチンへの抗体の結合は、材料および方法において記載
するようにプロテインＡプレート法を用いてアツセイし
た。
ムチンへの抗体の結合は、材料および方法において記載
するようにプロテインＡプレート法を用いてアツセイし
た。
【０１０２】参考文献 １．Burchell, J.M., Durbin, H.およびTaylor-Papadim
itriou, J.(1983)J. Immunol. 131, 508-513. ２．Bramwell, M.E., Rhavanandan, V.P., Wiseman, G.
およびHarris, H.(1983)Br. J. Cancer 48, 177-183. ３．McIlhinney, R.A., Patel, S.およびGore, M.E.(19
85)Biochem. J. 227, 155-162. ４．Hilkens, J., Buijs, F., Hilgers, J., Hagemann,
Ph., Calafat, J., Sonnenberg, A.およびVan der Val
k, M.(1984)Int. J. Cancer 34, 197-206. ５．Tagliabue, E., Porro, G., Barbanti, P., Della-
Torre, G., Menard, S.,Rilke, F., Cerasoli, S.およ
びColnaghi, M.(1986)Hybridoma 5, 107-115. ６．Johnson, V.G., Schlom, J., Paterson, A.J., Ben
nett, J., Magnani, J.L.およびColcher, D.(1986)Canc
er Res. 46, 850-857.７．Sekine, H., Ohno, T.および
Kufe, D.W.(1985)J. Immunol. 135, 3610-3615. ８．Ormerod, M.G., Steele, K., Edwards, P.A.Wおよ
びTaylor-Papadimitriou,J.(1984)J. Expt. Path. 1, 2
63-271. ９．Wilkinson, M.J., Howell, A., Harris, J.,Taylor
-Papadimitriou, J., Swindell, R.およびSellwood, R.
A.(1984)Int. J. Cancer 33, 299-304. 10．Kufe, D., Inghirami, G., Abe, M., Hayes, D., J
usti-Wheeler, H.およびSchlom, J.(1984)Hybridoma 3,
223-232. 11. Price, M.R., Edwards, S., Robins, R.A., Hilgen
s, J., Hilkens, J.およびBaldwin, R.(1986)Eur．J. C
an. Clin. Oncol. 22, 115-117. 12. Johnston, W.W., Szpak, C.A., Lottick, S.C., Th
or, A.および Schlom,J.(1985)Cancer Res. 45, 1894-
1900. 13. Rasmussen, B.B., Pedersen, B.V., Thorpe, S.M.,
Hilkens, J., Hilgers,J.およびRose, C. (1986)Cance
r Res. 45, 1424-1427. 14. Taylor-Papadimitriou, J., Peterson, J.A., Arkl
ie, J., Burchell, J.,Ceriani, R.L.およびBodmer, W,
F.(1981)Int. J. Cancer 28, 17-21. 15. Burchell, J., Wang, D.およびTaylor-Papadimitri
ou, J.(1984)Int. J. Cancer 34, 763-768. 16. Shimizu, M.およびYamauchi, K.(1982)J. Biochem.
91, 515-519. 17. Ormerod, M.G., Steele, K., Westwood, J.H.およ
びMazzini, M.N. (1983)Br. J. Cancer 48, 533-541. 18. Taylor-Papadimitriou, J., Lane, E.B.およびChan
g, S.E.(1983) 乳癌の理解:臨床的および実験室的観念
(Understanding Breast Cancer: Clinical andLaborato
ry Concepts.)(Rich, M.A., Hager, J.C.およびFurmans
ki, P.編.)Marcel Dekker, Inc. New York および Base
l, pp. 215-246. 19. Chang, S.E.およびTaylor-Papadimitriou, J.(198
3)Cell Diff. 12, 143-154 20. 上の実施例１． 21. Mort, A.およびLamport, D.(1977)Anal. Biochem.
82, 289-309. 22. Wray, W., Boulikas, T., Wray, K.P.およびHancoc
k, R.(1981)Anal. Biochem. 118, 197-203. 23. Dubray, G.およびBezard, G.(1982)Anal. Biochem.
119, 325-329. 24. Shearer, M., Taylor-Papadimitriou, J., Griffi
n, D.およびBalkvill, F.(1984)J. Immunol. 133, 3096
-3101. 25. Durbin, H.およびBodmer, W.F.(1986)J. Innunol.
Meth., In Press. 26. Lane, E.B.(1982)J. Cell biol. 92, 665-673. 27. Gooi, H.C., Jones, N.J., Hounsell, E.F., Scudd
er, P., Hilkens, J., Hilgers, J.およびFeizi, T.(19
85)Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 543-550. 28. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.
J.およびRutter, W.J.(1979)Biochem. 18, 5194-5199. 29. Walter, P., Green, S., Greene, G., Krust, A.,
Bornert, J.-M., Heltsch, J.-M., Staub, A., Jensen,
E., Scrace, G., Waterfied, M.およびChambon,P.(198
5)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7889-7893. 30. Huynh, T.V., Young, R.A.およびDavis, R.W.(198
5)DNAクローニング:実際的アプローチ(DNA Cloning:A P
ractical Approach), Glover, D.M.編(IRL, Oxford), V
ol. 1, pp. 98-121. 31. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1983)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80, 1194-1198. 32. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1983)Science 222,
778-782. 33. Vieira, J.およびMessing, J.(1982)Gene 19, 259-
268. 34. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1985)遺伝子工学、
(Genetic Engineering),Setlow, J.K.およびHollaende
r, A.(Plenum, New York), Vol. 7. 35. Laemmli, U.K.(1970)Nature(Lond)227. 680-685. 36. Towbin, H., Staehelin, Y.およびGordon, J.(197
9) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 4350-4354. 37. Manistis, T., Fritsch, E.F.およびSambrook, J.
(1982)モレキユラークローニング:実験室のマニユアル
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(Coldspri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 38. Thomas, P.A (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
77, 5201-5205. 39. Woodhead, J.L., Fallon, R., Figueiredo, H., La
ngdale, J. およびMalcolm編, A.D.B.(1986), ヒト遺伝
病(Human Genetic Diseases), Davies, K.E.(IRL, Oxfo
rd), p. 56. 40. Old, J.M.(1986), ヒト遺伝病(Human Ganetic Dise
ases), Davies, K.E編.,(IRL, Oxford), p. 4. 41. Feinberg, A.P.およびVogelstein, B.(1984)Anal.
Biochem. 137, 266-267. 42. Taylor-Papadimitriou, J., Purkis, P.およびFent
iman, I.S. (1980)J. Cell. Physiol．102, 317-321. 43. Hackett, A.J., Smith, H.S., Springer, E.L., Ow
ens, R.B., Nelson-Rees, W.A., Riggs, J.L.およびGar
dner, M.B.(1977)J. Natl. Cancer Inst. 58, 1795-180
0. 44. Griffiths, A.B., Burchell, J., Taylor-Papadimi
triou, J., Gendler, S.J., Lewis, A.およびTilly, R.
(1987)Int. J. Cancer (submitted). 45. Gottschalk, A., Bhargava, S.およびMury, V. In
Gottschalk, A. (編)糖タンパク質、 それらの組成、 構
造および機能(Glycoproteins their composition, stru
cture and function), pp. 810-829, Elsevier, New Yo
rk. 46. Hill, M.D.Jr., Reynolds, J.A.およびHill, R.(19
77)J. Biol. Chem. 252,3791-3798. 47. Taylor-Papadimitriou, J., Millis, R., Burchel
l, J., Nash, R., Pang,L.およびGilbert, J.(1986)J.
Expt. Path. 2, 247-260. 48. Swallow, D., Griffiths, B., Bramwell, M., Wise
man, G.およびBurchell,J.(1986)Disease Markers 3,
刊行中。 49. Abe, M.およびKufe, D. MCF-7乳癌細胞における2つ
の部分的に特徴づけられた高分子量の乳関係糖タンパク
質の発現および分泌への成熟因子の作用(Effectsof mat
urational agents on expression and secretion of tw
o partially characterized high molecular weight mi
lk-related glycoproteins in MCF-7 breast carcinoma
cells.)J. Cell. Physiol. 126: 126-136, 1986. 50. Arklie, J., Taylor-Papadimitriou, J., Bodmer,
W.F., Egan, M. およびMillis, R．乳汁を分泌する乳房
における上皮細胞により発現された分化抗原は、また、
乳癌において検出されうる(Differentiation antigens
expressed by spithelial cells in the lactating bre
ast are also detectable in breast cancers.)Int. J.
Cancer 28:23-29, 1981. 51. Bolton, A.E.およびHunter, W.M．125Ｉ含有アシル
化因子への接合による高特異的放射能へのタンパク質の
標識付け(The labelling of proteins to high specifi
c radioactivities by conjugation to a 125I contain
ing acylating agent.) Biochem. J. 133:529-538, 197
3. 52. Karlsson, S., Swallow, D., Griffiths, B., Corn
ey, G.およびHoplinson,P．ヒト尿ムチンの遺伝的多形
性(A genetic polymorphism of a human urinarymuci
n.)Ann. Hum. Genet. 47:263-269, 1983. 53. Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B.およ
びRajewsky, K．免疫グロブリンの発現を失なっている
が、抗体分泌雑種細胞系の構成を可能とする、新しいマ
ウス骨髄種細胞系(A new mouse myeloma cell line tha
t has lost immunoglobulin expression but permits t
he construction fo antibody-secretinghybrid cell l
ines.)J. Immunol. 123:1548-1550, 1979. 54. Melero, J.およびGonzalez-Rodrigues, J．ヒト血
小板の糖タンパク質IIIaに対するモノクローナル抗体の
調製(Preparation of monoclonal antibodies against
glycoproteins IIIa of human platelets.)Eur. J. Bio
chem. 141:421-427, 1984. 55. Clamp, J.R., Allen, A., Gibbons, R.A. and Robe
rts, G．ムチンの化学的面(Chemical aspects of mucin
s.)Br. Med. Bull. 34:25-41, 1978.
itriou, J.(1983)J. Immunol. 131, 508-513. ２．Bramwell, M.E., Rhavanandan, V.P., Wiseman, G.
およびHarris, H.(1983)Br. J. Cancer 48, 177-183. ３．McIlhinney, R.A., Patel, S.およびGore, M.E.(19
85)Biochem. J. 227, 155-162. ４．Hilkens, J., Buijs, F., Hilgers, J., Hagemann,
Ph., Calafat, J., Sonnenberg, A.およびVan der Val
k, M.(1984)Int. J. Cancer 34, 197-206. ５．Tagliabue, E., Porro, G., Barbanti, P., Della-
Torre, G., Menard, S.,Rilke, F., Cerasoli, S.およ
びColnaghi, M.(1986)Hybridoma 5, 107-115. ６．Johnson, V.G., Schlom, J., Paterson, A.J., Ben
nett, J., Magnani, J.L.およびColcher, D.(1986)Canc
er Res. 46, 850-857.７．Sekine, H., Ohno, T.および
Kufe, D.W.(1985)J. Immunol. 135, 3610-3615. ８．Ormerod, M.G., Steele, K., Edwards, P.A.Wおよ
びTaylor-Papadimitriou,J.(1984)J. Expt. Path. 1, 2
63-271. ９．Wilkinson, M.J., Howell, A., Harris, J.,Taylor
-Papadimitriou, J., Swindell, R.およびSellwood, R.
A.(1984)Int. J. Cancer 33, 299-304. 10．Kufe, D., Inghirami, G., Abe, M., Hayes, D., J
usti-Wheeler, H.およびSchlom, J.(1984)Hybridoma 3,
223-232. 11. Price, M.R., Edwards, S., Robins, R.A., Hilgen
s, J., Hilkens, J.およびBaldwin, R.(1986)Eur．J. C
an. Clin. Oncol. 22, 115-117. 12. Johnston, W.W., Szpak, C.A., Lottick, S.C., Th
or, A.および Schlom,J.(1985)Cancer Res. 45, 1894-
1900. 13. Rasmussen, B.B., Pedersen, B.V., Thorpe, S.M.,
Hilkens, J., Hilgers,J.およびRose, C. (1986)Cance
r Res. 45, 1424-1427. 14. Taylor-Papadimitriou, J., Peterson, J.A., Arkl
ie, J., Burchell, J.,Ceriani, R.L.およびBodmer, W,
F.(1981)Int. J. Cancer 28, 17-21. 15. Burchell, J., Wang, D.およびTaylor-Papadimitri
ou, J.(1984)Int. J. Cancer 34, 763-768. 16. Shimizu, M.およびYamauchi, K.(1982)J. Biochem.
91, 515-519. 17. Ormerod, M.G., Steele, K., Westwood, J.H.およ
びMazzini, M.N. (1983)Br. J. Cancer 48, 533-541. 18. Taylor-Papadimitriou, J., Lane, E.B.およびChan
g, S.E.(1983) 乳癌の理解:臨床的および実験室的観念
(Understanding Breast Cancer: Clinical andLaborato
ry Concepts.)(Rich, M.A., Hager, J.C.およびFurmans
ki, P.編.)Marcel Dekker, Inc. New York および Base
l, pp. 215-246. 19. Chang, S.E.およびTaylor-Papadimitriou, J.(198
3)Cell Diff. 12, 143-154 20. 上の実施例１． 21. Mort, A.およびLamport, D.(1977)Anal. Biochem.
82, 289-309. 22. Wray, W., Boulikas, T., Wray, K.P.およびHancoc
k, R.(1981)Anal. Biochem. 118, 197-203. 23. Dubray, G.およびBezard, G.(1982)Anal. Biochem.
119, 325-329. 24. Shearer, M., Taylor-Papadimitriou, J., Griffi
n, D.およびBalkvill, F.(1984)J. Immunol. 133, 3096
-3101. 25. Durbin, H.およびBodmer, W.F.(1986)J. Innunol.
Meth., In Press. 26. Lane, E.B.(1982)J. Cell biol. 92, 665-673. 27. Gooi, H.C., Jones, N.J., Hounsell, E.F., Scudd
er, P., Hilkens, J., Hilgers, J.およびFeizi, T.(19
85)Biochem. Biophys. Res. Commun. 131, 543-550. 28. Chirgwin, J.M., Przybyla, A.E., MacDonald, R.
J.およびRutter, W.J.(1979)Biochem. 18, 5194-5199. 29. Walter, P., Green, S., Greene, G., Krust, A.,
Bornert, J.-M., Heltsch, J.-M., Staub, A., Jensen,
E., Scrace, G., Waterfied, M.およびChambon,P.(198
5)Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 82, 7889-7893. 30. Huynh, T.V., Young, R.A.およびDavis, R.W.(198
5)DNAクローニング:実際的アプローチ(DNA Cloning:A P
ractical Approach), Glover, D.M.編(IRL, Oxford), V
ol. 1, pp. 98-121. 31. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1983)Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 80, 1194-1198. 32. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1983)Science 222,
778-782. 33. Vieira, J.およびMessing, J.(1982)Gene 19, 259-
268. 34. Young, R.A.およびDavis, R.W.(1985)遺伝子工学、
(Genetic Engineering),Setlow, J.K.およびHollaende
r, A.(Plenum, New York), Vol. 7. 35. Laemmli, U.K.(1970)Nature(Lond)227. 680-685. 36. Towbin, H., Staehelin, Y.およびGordon, J.(197
9) Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 76, 4350-4354. 37. Manistis, T., Fritsch, E.F.およびSambrook, J.
(1982)モレキユラークローニング:実験室のマニユアル
(Molecular Cloning: A Laboratory Manual)(Coldspri
ng Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY). 38. Thomas, P.A (1980)Proc. Natl. Acad. Sci. USA.
77, 5201-5205. 39. Woodhead, J.L., Fallon, R., Figueiredo, H., La
ngdale, J. およびMalcolm編, A.D.B.(1986), ヒト遺伝
病(Human Genetic Diseases), Davies, K.E.(IRL, Oxfo
rd), p. 56. 40. Old, J.M.(1986), ヒト遺伝病(Human Ganetic Dise
ases), Davies, K.E編.,(IRL, Oxford), p. 4. 41. Feinberg, A.P.およびVogelstein, B.(1984)Anal.
Biochem. 137, 266-267. 42. Taylor-Papadimitriou, J., Purkis, P.およびFent
iman, I.S. (1980)J. Cell. Physiol．102, 317-321. 43. Hackett, A.J., Smith, H.S., Springer, E.L., Ow
ens, R.B., Nelson-Rees, W.A., Riggs, J.L.およびGar
dner, M.B.(1977)J. Natl. Cancer Inst. 58, 1795-180
0. 44. Griffiths, A.B., Burchell, J., Taylor-Papadimi
triou, J., Gendler, S.J., Lewis, A.およびTilly, R.
(1987)Int. J. Cancer (submitted). 45. Gottschalk, A., Bhargava, S.およびMury, V. In
Gottschalk, A. (編)糖タンパク質、 それらの組成、 構
造および機能(Glycoproteins their composition, stru
cture and function), pp. 810-829, Elsevier, New Yo
rk. 46. Hill, M.D.Jr., Reynolds, J.A.およびHill, R.(19
77)J. Biol. Chem. 252,3791-3798. 47. Taylor-Papadimitriou, J., Millis, R., Burchel
l, J., Nash, R., Pang,L.およびGilbert, J.(1986)J.
Expt. Path. 2, 247-260. 48. Swallow, D., Griffiths, B., Bramwell, M., Wise
man, G.およびBurchell,J.(1986)Disease Markers 3,
刊行中。 49. Abe, M.およびKufe, D. MCF-7乳癌細胞における2つ
の部分的に特徴づけられた高分子量の乳関係糖タンパク
質の発現および分泌への成熟因子の作用(Effectsof mat
urational agents on expression and secretion of tw
o partially characterized high molecular weight mi
lk-related glycoproteins in MCF-7 breast carcinoma
cells.)J. Cell. Physiol. 126: 126-136, 1986. 50. Arklie, J., Taylor-Papadimitriou, J., Bodmer,
W.F., Egan, M. およびMillis, R．乳汁を分泌する乳房
における上皮細胞により発現された分化抗原は、また、
乳癌において検出されうる(Differentiation antigens
expressed by spithelial cells in the lactating bre
ast are also detectable in breast cancers.)Int. J.
Cancer 28:23-29, 1981. 51. Bolton, A.E.およびHunter, W.M．125Ｉ含有アシル
化因子への接合による高特異的放射能へのタンパク質の
標識付け(The labelling of proteins to high specifi
c radioactivities by conjugation to a 125I contain
ing acylating agent.) Biochem. J. 133:529-538, 197
3. 52. Karlsson, S., Swallow, D., Griffiths, B., Corn
ey, G.およびHoplinson,P．ヒト尿ムチンの遺伝的多形
性(A genetic polymorphism of a human urinarymuci
n.)Ann. Hum. Genet. 47:263-269, 1983. 53. Kearney, J.F., Radbruch, A., Liesegang, B.およ
びRajewsky, K．免疫グロブリンの発現を失なっている
が、抗体分泌雑種細胞系の構成を可能とする、新しいマ
ウス骨髄種細胞系(A new mouse myeloma cell line tha
t has lost immunoglobulin expression but permits t
he construction fo antibody-secretinghybrid cell l
ines.)J. Immunol. 123:1548-1550, 1979. 54. Melero, J.およびGonzalez-Rodrigues, J．ヒト血
小板の糖タンパク質IIIaに対するモノクローナル抗体の
調製(Preparation of monoclonal antibodies against
glycoproteins IIIa of human platelets.)Eur. J. Bio
chem. 141:421-427, 1984. 55. Clamp, J.R., Allen, A., Gibbons, R.A. and Robe
rts, G．ムチンの化学的面(Chemical aspects of mucin
s.)Br. Med. Bull. 34:25-41, 1978.
【０１０３】
【配列表】 <110> インペリアル・キヤンサー・リサーチ・テクノロジー・リミテツド Imperial Cancer Research,Technology LTD <120> ヒト多形性上皮ムチンタンパク質およびそのタンパク質をコードする核 酸 <130> 200004079 <160> 6 <210> 1 <211> 30 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 1 ggccggcctg gtgtccgggg ccgaggtgac 30 <210> 2 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 accgtgggct gggggggcgg tggagcccgg ggccggcctg gtgtccgggg ccgaggtgac 60 accgtgggct gggggggcgg tggagcccgg ggccggcctg gtgtccgggg ccgaggtgac 120 <210> 3 <211> 120 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 3 gtcacctcgg ccccggacac caggccggcc ccgggctcca ccgccccccc agcccacggt 60 gtcacctcgg cccgggacac caggccggcc ccgggctcc accgccccccc agcccacggt 120 <210> 4 <211> 24 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gtgggctggg ggggcggtgg agcc 24 <210> 5 <211> 35 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 5 cggggccggc ctggtgtccg gggccgaggt gacac 35 <210> 6 <211> 40 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 6 Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly Ser Thr Ala Pro 1 5 10 15 Pro Ala His Gly Val Thr Ser Ala Pro Asp Thr Arg Pro Ala Pro Gly 20 25 30 Ser Thr Ala Pro Pro Ala His Gly 35 40
【図１】抗体ＨＭＦＧ−１を使用する免疫親和性クロマ
トグラフィーによる乳ムチンの精製の結果を示す図面に
代わる写真である。いくつかの個体からの乳を一緒に
し、そして方法に記載するようにＨＭＦＧ−１−セファ
ローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに吸着させた。低
いｐＨで溶離する物質をヨウ素化し、そしてＰＡＧＥ電
気泳動およびオートラジオグラフィーにかけた（トラッ
ク１）。ヨウ素化物質をプロテインＡ法により抗体ＨＭ
ＦＧ−１（トラック５）、ＨＭＦＧ−２（トラック
２）、ＳＴ２５４（トラック３）およびＲＰＭＩ；２０
％ＦＣＳ（トラック４）で沈澱させた。
トグラフィーによる乳ムチンの精製の結果を示す図面に
代わる写真である。いくつかの個体からの乳を一緒に
し、そして方法に記載するようにＨＭＦＧ−１−セファ
ローズ（Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムに吸着させた。低
いｐＨで溶離する物質をヨウ素化し、そしてＰＡＧＥ電
気泳動およびオートラジオグラフィーにかけた（トラッ
ク１）。ヨウ素化物質をプロテインＡ法により抗体ＨＭ
ＦＧ−１（トラック５）、ＨＭＦＧ−２（トラック
２）、ＳＴ２５４（トラック３）およびＲＰＭＩ；２０
％ＦＣＳ（トラック４）で沈澱させた。
【図２】125Ｉ標識精製乳ムチンとヒトスキムミルクの
イムノブロッティングとの比較をする電気泳動の結果を
示す図面に代わる写真である。Ａ、ヒトスキムミルクを
ＳＤＳポリアクリルアミドの電気泳動にかけニトロセル
ロース紙に移し、ブロットをモノクローナル抗体ＨＭＦ
Ｇ−１とプロービングし、そして結合をＥＬＩＳＡ法で
検出した。Ｂ、ＨＭＦＧ−１親和性カラムで精製し、次
いでＧ７５セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）クロマ
トグラフィー後、乳ムチンをボルトンおよびハンター法
によりヨウ素化し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドの
電気泳動およびオートラジオグラフィーにかけた。
イムノブロッティングとの比較をする電気泳動の結果を
示す図面に代わる写真である。Ａ、ヒトスキムミルクを
ＳＤＳポリアクリルアミドの電気泳動にかけニトロセル
ロース紙に移し、ブロットをモノクローナル抗体ＨＭＦ
Ｇ−１とプロービングし、そして結合をＥＬＩＳＡ法で
検出した。Ｂ、ＨＭＦＧ−１親和性カラムで精製し、次
いでＧ７５セファデックス（Ｓｅｐｈａｄｅｘ）クロマ
トグラフィー後、乳ムチンをボルトンおよびハンター法
によりヨウ素化し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドの
電気泳動およびオートラジオグラフィーにかけた。
【図３】フッ化水素の処理後におけるヨウ素化乳ムチン
の電気泳動後のオートラジオグラフィーの結果を示す図
面に代わる写真である。精製した乳ムチンをＨＦで室温
において３時間（トラック１）または４℃において１時
間（トラック２）処理し、次いで得られる調製物をヨウ
素化し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで展開し
た。
の電気泳動後のオートラジオグラフィーの結果を示す図
面に代わる写真である。精製した乳ムチンをＨＦで室温
において３時間（トラック１）または４℃において１時
間（トラック２）処理し、次いで得られる調製物をヨウ
素化し、そしてＳＤＳポリアクリルアミドゲルで展開し
た。
【図４】完全な、部分的にストリッピングまたは高度に
ストリッピングした乳ムチンの電気泳動後におけるヨウ
素化レクチンとの反応性を示す図面に代わる写真であ
る。精製した完全な乳ムチン（トラック１）、ＨＦで４
℃において１時間処理したムチン（トラック２）および
室温において３時間処理したムチン（トラック３）をＳ
ＤＳポリアクリルアミドの電気泳動にかけ、次いでニト
ロセルロース紙に移した。次いで、ニトロセルロース紙
を125Ｉ ＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）、125Ｉ（胚芽凝
集素）、または125Ｉ［ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌ
ｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素］でプロービングした。
ストリッピングした乳ムチンの電気泳動後におけるヨウ
素化レクチンとの反応性を示す図面に代わる写真であ
る。精製した完全な乳ムチン（トラック１）、ＨＦで４
℃において１時間処理したムチン（トラック２）および
室温において３時間処理したムチン（トラック３）をＳ
ＤＳポリアクリルアミドの電気泳動にかけ、次いでニト
ロセルロース紙に移した。次いで、ニトロセルロース紙
を125Ｉ ＰＮＡ（ピーナッツ凝集素）、125Ｉ（胚芽凝
集素）、または125Ｉ［ヘリックス・ポマチア（Ｈｅｌ
ｉｘ ｐｏｍａｔｉａ）凝集素］でプロービングした。
【図５】部分的におよび高度にストリッピングしたムチ
ンの免疫沈澱およびイムノブロッティングの結果を示す
図面に代わる写真である。Ａ、125Ｉ高度にストリッピ
ングムチンをＳＭ−３（トラック３）、ＨＭＦＧ−２
（トラック２）または対照としてＮＳ２培地（トラック
１）でプロテインＡプレイト法により免疫沈澱させた
（参照、材料および方法）。Ｂ、部分的にストリッピン
グしたムチン（トラック１）または高度にストリッピン
グしたムチン（トラック２）をＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲルで展開し、そしてニトロセルロース紙に移した。
次いで、ブロットをＳＭ−３およびＳＭ−４モノクロー
ナル抗体のカクテルと反応させ、そして結合をＥＬＩＳ
Ａ法で検出した。
ンの免疫沈澱およびイムノブロッティングの結果を示す
図面に代わる写真である。Ａ、125Ｉ高度にストリッピ
ングムチンをＳＭ−３（トラック３）、ＨＭＦＧ−２
（トラック２）または対照としてＮＳ２培地（トラック
１）でプロテインＡプレイト法により免疫沈澱させた
（参照、材料および方法）。Ｂ、部分的にストリッピン
グしたムチン（トラック１）または高度にストリッピン
グしたムチン（トラック２）をＳＤＳポリアクリルアミ
ドゲルで展開し、そしてニトロセルロース紙に移した。
次いで、ブロットをＳＭ−３およびＳＭ−４モノクロー
ナル抗体のカクテルと反応させ、そして結合をＥＬＩＳ
Ａ法で検出した。
【図６】モノクローナル抗体ＳＭ−３およびＨＭＦＧ−
２とメタカルン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）固定乳房組織お
よび腫瘍（細胞）切片との、間接イムノペルオキシダー
ゼ染色法による反応性を示す図面に代わる写真である。
浸潤する管癌はＳＭ−３（ａ）およびＨＭＦＧ−２
（ｂ）の両者と強い反応性を示す。
２とメタカルン（ｍｅｔｈａｃａｒｎ）固定乳房組織お
よび腫瘍（細胞）切片との、間接イムノペルオキシダー
ゼ染色法による反応性を示す図面に代わる写真である。
浸潤する管癌はＳＭ−３（ａ）およびＨＭＦＧ−２
（ｂ）の両者と強い反応性を示す。
【図７】図６と同様の図面に代わる写真である。線維腺
腫（細胞）はＳＭ−３（ｃ）との反応性を示さず、そし
てＨＭＦＧ−２（ｄ）による上皮の強い不均質の染色を
示す。
腫（細胞）はＳＭ−３（ｃ）との反応性を示さず、そし
てＨＭＦＧ−２（ｄ）による上皮の強い不均質の染色を
示す。
【図８】図６と同様の図面に代わる写真である。乳頭腫
（細胞）はＳＭ−３（ｅ）と非常に弱い反応性を示し、
そしてＨＭＦＧ−２（ｆ）と強い陽性を示す。
（細胞）はＳＭ−３（ｅ）と非常に弱い反応性を示し、
そしてＨＭＦＧ−２（ｆ）と強い陽性を示す。
【図９】図６と同様の図面に代わる写真である。正常乳
房（ｇ）および乳汁を出す乳房（ｉ）の両者は、ＳＭ−
３で染色したとき陰性であったが、両者の組織はＨＭＦ
Ｇ−２で陽性に染色し、乳汁を出す乳房（ｊ）は正常乳
房（ｈ）より非常に強い。
房（ｇ）および乳汁を出す乳房（ｉ）の両者は、ＳＭ−
３で染色したとき陰性であったが、両者の組織はＨＭＦ
Ｇ−２で陽性に染色し、乳汁を出す乳房（ｊ）は正常乳
房（ｈ）より非常に強い。
【図１０】抗体親和性カラムおよびゲル濾過カラム後の
過ヨウ素酸−銀染色した乳ムチン。乳ムチンをＨＭＦＧ
−１抗体親和性カラムで精製し（レーン１）、次いでＧ
７５セファデックスカラムに通過させ（レーン２）、Ｎ
ａＤｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
かけ、そして銀染色し、次いでゲルを０．２％の過ヨウ
素酸で処理した結果を示す図面に代わる写真である。
過ヨウ素酸−銀染色した乳ムチン。乳ムチンをＨＭＦＧ
−１抗体親和性カラムで精製し（レーン１）、次いでＧ
７５セファデックスカラムに通過させ（レーン２）、Ｎ
ａＤｏｄＳＯ4／ポリアクリルアミドゲルの電気泳動に
かけ、そして銀染色し、次いでゲルを０．２％の過ヨウ
素酸で処理した結果を示す図面に代わる写真である。
【図１１】ムチンから部分的におよび完全にストリッピ
ングしたコアタンパク質の銀染色。精製した乳ムチンを
無水フッ化水素で０℃において１時間（レーン１）およ
び室温において３時間（レーン２）処理し、ＮａＤｏｄ
ＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０５）で電気泳動
し、そして銀染色した結果を示す図面に代わる写真であ
る。
ングしたコアタンパク質の銀染色。精製した乳ムチンを
無水フッ化水素で０℃において１時間（レーン１）およ
び室温において３時間（レーン２）処理し、ＮａＤｏｄ
ＳＯ4／ポリアクリルアミドゲル（１０５）で電気泳動
し、そして銀染色した結果を示す図面に代わる写真であ
る。
【図１２】ＭＣＦ−７ｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡからの生
体外翻訳タンパク質生成物のＭＡｂｓによる免疫沈澱。
ＭＣＦ−７からのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを網状赤血球
リゼイト系中で［35Ｓ］メチオニン（１０００Ｃｉ／ミ
リモル；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）の存在下に製造業者の条
件下に翻訳した。５×１０4酸沈澱可能なｃｐｍを含有
する試料をＭＡｂｓ ＳＭ−４（レーンａ）、ＳＭ−３
（レーンｂ）、ＨＭＦＧ−２（レーン）、ＨＭＦＧ−１
（レーンｄ）およびインターフェロンに対する無関係の
ＭＡｂ（レーンｅ、２４）で沈澱させ、ＮａＤｏｄＳＯ
4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で分離し、アム
プリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ）で含浸し、そしてＸＡＲ
−５フィルムに−７０℃において２０日間露出した結果
を示す図面に代わる写真である。
体外翻訳タンパク質生成物のＭＡｂｓによる免疫沈澱。
ＭＣＦ−７からのｐｏｌｙ（Ａ）+ＲＮＡを網状赤血球
リゼイト系中で［35Ｓ］メチオニン（１０００Ｃｉ／ミ
リモル；１Ｃｉ＝３７ＧＢｑ）の存在下に製造業者の条
件下に翻訳した。５×１０4酸沈澱可能なｃｐｍを含有
する試料をＭＡｂｓ ＳＭ−４（レーンａ）、ＳＭ−３
（レーンｂ）、ＨＭＦＧ−２（レーン）、ＨＭＦＧ−１
（レーンｄ）およびインターフェロンに対する無関係の
ＭＡｂ（レーンｅ、２４）で沈澱させ、ＮａＤｏｄＳＯ
4／ポリアクリルアミドゲル（１０％）で分離し、アム
プリファイ（Ａｍｐｌｉｆｙ）で含浸し、そしてＸＡＲ
−５フィルムに−７０℃において２０日間露出した結果
を示す図面に代わる写真である。
【図１３】λｍｕｃクローンからの融合タンパク質のイ
ムノブロッティング分析。ファージのクローンλＭＵＣ
３、４、６、７、８、９および１０を使用して、バクテ
リア菌株Ｙ１０８９を溶原化した。溶原体を３２℃にお
いて増殖させ、４２℃にシフトし、次いでＩＰＴＧで誘
導した。溶原タンパク質を電気泳動によりＮａＤｏｄＳ
Ｏ4／ポリアクリルアミドゲル（７．５％）で分画し、
ニトロセルロース紙に移し、そしてＨＭＦＧ−２と反応
させた。結合をＥＬＩＳＡ法で４−クロロ−１−ナフト
ールを基質として使用して検出した結果を示す図面に代
わる写真である。数はλのクローンの数である。
ムノブロッティング分析。ファージのクローンλＭＵＣ
３、４、６、７、８、９および１０を使用して、バクテ
リア菌株Ｙ１０８９を溶原化した。溶原体を３２℃にお
いて増殖させ、４２℃にシフトし、次いでＩＰＴＧで誘
導した。溶原タンパク質を電気泳動によりＮａＤｏｄＳ
Ｏ4／ポリアクリルアミドゲル（７．５％）で分画し、
ニトロセルロース紙に移し、そしてＨＭＦＧ−２と反応
させた。結合をＥＬＩＳＡ法で４−クロロ−１−ナフト
ールを基質として使用して検出した結果を示す図面に代
わる写真である。数はλのクローンの数である。
【図１４】ｐＭＵＣクローンのｃＤＮＡインサートへの
ｐＭＵＣ１０のハイブリダイゼーション。プラスミドの
クローンからのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して
ｃＤＮＡを切除し、１．４％のアガロースの電気泳動に
より分離し、ビオジン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）ナイロン膜に
移した。フィルターを標準の条件下に（３４）にｐＭＵ
Ｃ１０からのインサートにハイブリダイズし、これを
［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでランダムプライミングの方法
（４１）により標識した結果を示す図面に代わる写真で
ある。レーン：３、４、６、７、８、９、１０。
ｐＭＵＣ１０のハイブリダイゼーション。プラスミドの
クローンからのＤＮＡを制限酵素ＥｃｏＲＩで消化して
ｃＤＮＡを切除し、１．４％のアガロースの電気泳動に
より分離し、ビオジン（Ｂｉｏｄｙｎｅ）ナイロン膜に
移した。フィルターを標準の条件下に（３４）にｐＭＵ
Ｃ１０からのインサートにハイブリダイズし、これを
［α−32Ｐ］ｄＣＴＰでランダムプライミングの方法
（４１）により標識した結果を示す図面に代わる写真で
ある。レーン：３、４、６、７、８、９、１０。
【図１５】乳房ムチンｍＲＮＡのＲＮＡブロットハイブ
リダイゼーション分析。ヒト乳房癌細胞ＭＣＦ−７から
の１０μｇの合計のＲＮＡ（レーン２）、正常ヒト乳房
上皮細胞ＨｕＭＥ（レーン３）、ヒト胚線維芽ＩＣＲＦ
２３（レーン４）、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞（レーン
５）および癌肉腫ＨＳ５７８Ｔ細胞（レーン６）を１．
３％のアガロース／グリオキサールゲルで分離し、ニト
ロセルロース上へブロッティングし、そしてｐＭＵＣ１
０ ＥｃｏＲＩインサートにハイブリダイズし、これを
ランダムプライミングの方法（４１）により［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した結果を示す図面に代わる写真
である。大きさマーカーは２８Ｓ（５．４ｋｂ）および
１８Ｓ（２．１ｋｂ）ｒＲＮＡであった。
リダイゼーション分析。ヒト乳房癌細胞ＭＣＦ−７から
の１０μｇの合計のＲＮＡ（レーン２）、正常ヒト乳房
上皮細胞ＨｕＭＥ（レーン３）、ヒト胚線維芽ＩＣＲＦ
２３（レーン４）、ダウジ（Ｄａｕｄｉ）細胞（レーン
５）および癌肉腫ＨＳ５７８Ｔ細胞（レーン６）を１．
３％のアガロース／グリオキサールゲルで分離し、ニト
ロセルロース上へブロッティングし、そしてｐＭＵＣ１
０ ＥｃｏＲＩインサートにハイブリダイズし、これを
ランダムプライミングの方法（４１）により［α−
32Ｐ］ｄＣＴＰで標識した結果を示す図面に代わる写真
である。大きさマーカーは２８Ｓ（５．４ｋｂ）および
１８Ｓ（２．１ｋｂ）ｒＲＮＡであった。
【図１６】ｐＭＵＣ１０プローブとのハイブリダイゼー
ションにより検出された多形性ヒトＤＮＡ断片。ゲノム
ＤＮＡ試料を１０の個体（６人無関係）からの全血細胞
から調製し、そしてこれらの細胞系をＨｉｎｆＩおよび
ＥｃｏＲＩで消化し、０．７％および０．６％のアガロ
ースの電気泳動により分画し、そしてビオジンナイロン
膜に移した。フィルターをｐＭＵＣ１０ ＤＮＡインサ
ートにハイブリダイズし、これをランダムプライミング
の方法（４１）により［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し
た。Ｘ線フィルムを−７０℃において強化スクリーンを
通して露出した結果を示す図面に代わる写真である。レ
ーン１〜４はより速く、２つは娘および母、レーン５〜
１０無関係の個体、レーン１１はＭＣＦ−７であり、レ
ーン１２はＩＣＲＦ−２３である。ＤＮＡの試料は大き
さの広い分布を示す。数はＤＮＡの長さ（ｋｂ）を示
す。２３Ｋｂにおける親のバンドはレーン１２に存在
し、そして１３はオートラジオグラフィーにおいて導入
した人工物である。
ションにより検出された多形性ヒトＤＮＡ断片。ゲノム
ＤＮＡ試料を１０の個体（６人無関係）からの全血細胞
から調製し、そしてこれらの細胞系をＨｉｎｆＩおよび
ＥｃｏＲＩで消化し、０．７％および０．６％のアガロ
ースの電気泳動により分画し、そしてビオジンナイロン
膜に移した。フィルターをｐＭＵＣ１０ ＤＮＡインサ
ートにハイブリダイズし、これをランダムプライミング
の方法（４１）により［α−32Ｐ］ｄＣＴＰで標識し
た。Ｘ線フィルムを−７０℃において強化スクリーンを
通して露出した結果を示す図面に代わる写真である。レ
ーン１〜４はより速く、２つは娘および母、レーン５〜
１０無関係の個体、レーン１１はＭＣＦ−７であり、レ
ーン１２はＩＣＲＦ−２３である。ＤＮＡの試料は大き
さの広い分布を示す。数はＤＮＡの長さ（ｋｂ）を示
す。２３Ｋｂにおける親のバンドはレーン１２に存在
し、そして１３はオートラジオグラフィーにおいて導入
した人工物である。
フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/44 16/44 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ａ６１Ｋ 37/02 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (31)優先権主張番号 ８７２６１７２ (32)優先日 昭和62年11月９日(1987．11．9) (33)優先権主張国 イギリス（ＧＢ） (72)発明者 サンドラ・ジエンドラー イギリス国ロンドン エヌダブリユー６・ ウエストハンプステツド・ウエストエンド レイン・セントジエイムズマンシヨンズ20 (72)発明者 ジヨイ・バーチエル イギリス国ウエストサセツクス・ウクフイ ールド・フレツチング・ホワイツコテツジ ーズ４
Claims (11)
- 【請求項１】 ハイブリドーマＨＳＭ３（ＥＣＡＣＣ
８７０１０７０１）によって分泌されるモノクローナル
抗体ＳＭ３により認識されるポリペプチドであって、ヒ
ト多形性上皮ムチンコアタンパク質（ＨＰＥＭ）遺伝子
に対応し、そしてヒトのがん細胞株ＭＣＦ−７から得る
ことのできるｍＲＮＡの縦列反復配列によりコードされ
るアミノ酸配列において連続する少なくとも５個のアミ
ノ酸残基を含んでなり、かつヒトおよび動物に対して実
施される治療法において使用されるが、但し、正常のお
よび悪性のヒト上皮細胞により発現される高分子量の糖
タンパク質は除かれる、ポリペプチド。 - 【請求項２】 前記縦列反復配列によりコードされるア
ミノ酸配列において連続する少なくとも１０個のアミノ
酸残基を含んでなる請求項１記載のポリペプチド。 - 【請求項３】 担体タンパク質と結合した請求項１また
は２記載のポリペプチド。 - 【請求項４】 ＨＰＥＭ遺伝子の縦列反復配列によりコ
ードされる完全なアミノ酸配列を有する請求項１〜３の
いずれかに記載のポリペプチド。 - 【請求項５】 少なくとも１つのアミノ酸残基が結合糖
置換基を担持する請求項３または４記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項６】 結合糖がオリゴ糖部分を担持する請求項
５記載のポリペプチド。 - 【請求項７】 置換基を担持する各アミノ酸がセリンま
たはスレオニンであり、そして結合糖がＮ−アセチルガ
ラクトサミンである請求項５または６記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項８】 検出可能な標識または治療上有効な成分
を担持する請求項１〜７のいずれかに記載のポリペプチ
ド。 - 【請求項９】 請求項１〜４のいずれかに記載のポリペ
プチドをコードする核酸断片。 - 【請求項１０】 少なくとも核酸配列 GGC CGG CCT GGT GTC CGG GGC CGA GGT GAC を含んでなり、そしてヒト多形性上皮ムチンコアタンパ
ク質（ＨＰＥＭ）をコードする遺伝子に由来する縦列反
復配列に対応する請求項９記載の核酸断片。 - 【請求項１１】 少なくとも１７ヌクレオチド塩基から
なり、 のＤＮＡ、 ｃ）ａ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
および ｄ）ｂ）のＤＮＡ配列に対応する配列を有するＲＮＡ、
の少なくとも１つと交雑可能である請求項９または１０
記載の核酸断片。
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|---|---|---|---|
| GB8700279 | 1987-01-07 | ||
| GB878700269A GB8700269D0 (en) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | Probe |
| GB878700279A GB8700279D0 (en) | 1987-01-07 | 1987-01-07 | Probe |
| GB8700269 | 1987-01-07 | ||
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| GB8726172 | 1987-11-09 | ||
| GB878726172A GB8726172D0 (en) | 1987-11-09 | 1987-11-09 | Probe |
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| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
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|---|---|
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| US6054438A (en) * | 1987-01-07 | 2000-04-25 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Nucleic acid fragments encoding portions of the core protein of the human mammary epithelial mucin |
| EP0442926A1 (en) * | 1988-11-10 | 1991-08-28 | Imperial Cancer Research Technology Limited | Polypeptides |
| CA2003211A1 (en) * | 1988-11-17 | 1990-05-17 | Pei-Xiang Xing | Monoclonal antibodies |
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| GB8929097D0 (en) * | 1989-12-22 | 1990-02-28 | Imp Cancer Res Tech | Mucin nucleotides |
| CA2040513A1 (en) * | 1990-04-16 | 1991-10-17 | Robert C. Bast, Jr. | Method of diagnosing cancer |
| GB9019553D0 (en) * | 1990-09-07 | 1990-10-24 | Unilever Plc | Specific binding agents |
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| AU685539B2 (en) * | 1993-12-24 | 1998-01-22 | The Macfarlane Burnet Institute For Medical Research And Public Health Ltd | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
| US6548643B1 (en) | 1994-11-16 | 2003-04-15 | Austin Research Institute | Antigen carbohydrate compounds and their use in immunotherapy |
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| GB9717946D0 (en) * | 1997-08-22 | 1997-10-29 | Imp Cancer Res Tech | Novel chemical entity |
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| US7824687B2 (en) | 1999-08-20 | 2010-11-02 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Clustered multi-antigenic carbohydrate constructs, methods for their preparation, and uses thereof |
| US7854934B2 (en) | 1999-08-20 | 2010-12-21 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Glycoconjugates, glycoamino acids, intermediates thereto, and uses thereof |
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-
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