JPH02255097A - 単クローン抗体ｎｎｙ１２８ - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 産業上の利用分野 本発明は、癌細胞表面および一部分泌されるムチン型糖
タンパク質の、Ｎ−アセチルガラクトサミン　（Ｇａｌ
ＮＡｃ）を含む糖ペプチド構造を認識する基クローン抗
体およびそれを分泌するハイブリドーマに関する。さら
に詳しくは、本発明はヒト腸瘍および主として消化管系
上皮細胞と反応し、また上皮性癌細胞の８０に以上に発
現しているＩｎ抗原と反応し、特に次の構造を有する糖
ペプチドと反応する基クローン抗体ＮＮＹ１２８および
ラット腹腔内で安定に成育しＮＮＹ１２８を分泌するハ
イブリドーマに関する。

（式中ＲはＧａ１ＮＡｃを示す。） きらに、本発明は上記抗体に認識され、以下の構造を有
する糖ペプチドに関する。

（式中ＹはＡｌａまたは水素、ＲはＧａ１ＮＡｃを示す
。）本糖ペプチドは、上記の抗体のようなＩｎ抗原を認
識するモノクローナル抗体の選択・調製に有用である。

従】ぎｌ支京 細胞表面には複合糖質、すなわち糖タンパク質、糖脂質
、プロテオグリカンが存在しており、正常細胞が癌細胞
へと形質転換を行なう際に、これらの物質の糖鎖に変異
が生じることが知られている。糖鎖の変異は従来は主と
して糖鎖の単離・分析によって研究されてきた。しかし
、１９７５年にケーラーとミルシュタインによって基ク
ローン抗体を作成する技術が開発されてから、癌細胞表
面上で変異を受けた糖鎖と特異的に反応する単クローン
抗体を作成する試みが盛んに行なわれるようになった。

また、癌関連抗原を認識する基クローン抗体の多くが糖
鎖を識別しているという実験結果が報告きれてからは、
糖鎖抗原を認識する基クローン抗体の重要性が指摘され
ている。これらの抗体が認識する糖鎖抗原のいくつかの
糖鎖構造も決定きれている。このような基クローン抗体
は、癌の研究上は勿論、癌の診断、検査、治療などの臨
床的な分野においても極めて重要な役割を果たすと考え
られる。特に、本発明の抗体が認識する構造は、従来か
らＩｎ抗原と呼ばれていたが、その構造は不明であった
。Ｉｎ抗原は、消化器癌、乳癌、肺癌などの上皮性細胞
の癌で極めて高頻度に検出されることが知られている（
　Ｇ、　Ｆ、　Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄ
ｒ、　Ｒｅｓ、　　１７８．２７１　（１９８８））。

また、極めて稀に赤血球表面にも存在することがあり、
Ｔｎ症候群と呼ばれている。ｆｆｎ抗原は、α−Ｎ−ア
セチルガラクトサミニダーゼ処理によって消失すること
から、Ｇａ１ＮＡｃα→Ｓｅｒ／Ｔｂｒで示される構造
を有すると考えられてきたが（Ｇ、　Ｆ、　Ｓｐｒｉｎ
ｇｅｒら、Ｃａｒｂｏｈｙｄｒ、　Ｒｅｓ、　１７８．
２７１　（１９８８））、これはエピトープの部分構造
に過ぎず、完全構造の決定には優れた抗体の作成が望ま
れていた。抗体を用いることによってＩｎ抗原のエピト
ープが決定されれば、有力な癌関連抗原の構造が決定さ
れる。

発明が解決しようとする課題 現在までに得られている単クローン抗体は、癌細胞を免
疫原とし、生成する抗体を癌細胞と結合させ、対応する
正常細胞とは結合しないことを指標にして選別作成する
か、あるいは癌細胞から抽出した糖脂質を適当な免疫助
剤と混合して免疫原として作成するのが通常であった。

しかし、癌細胞表面に存在し、さらに一部は分泌されて
いる糖タンパク質の糖鎖を認識する抗体を作成するには
、偶然に期待する以外には無かった。なぜなら、糖タン
パク質に対する抗体の多くはペプチド部分を認識するか
らである。

本発明者は先に、糖タンパク質糖鎖に対する抗体の力価
測定のための、固相化糖ペプチドを用いる方法を発明し
た（特開昭６ｌ−２１２５６８）。

この方法を用いることにより、癌細胞を免疫原として作
成される多数の単クローン抗体のうちから糖鎖を識別す
るものを効率的に選別することができる。これらの単ク
ローン抗体のうち、ムチン型糖タンパク質糖鎖のみを識
別し、先に作成したＭＬＳ１０２（特開昭６３−３３３
９８）とはシアル酸が関与しない点で異なるものを選出
作成したところ、Ｔｎ抗原を認識する抗体が得られたも
のである。

課題を解決する為の手段 単クローン抗体ＮＮＹ１２８は、このような観点から、
ＬＳ１８０細胞（ＡＴＣＣＣＬ−１８０）から調製した
ムチン型糖ペプチドと反応性を有する単クローンを産生
ずるハイプリドーマを、免疫マウスの肺細胞とミエロー
マ細胞を融合して得られる多くのハイプリドーマの中か
ら選択することによって得られたものである。即ち、本
発明の第１の特徴は、該抗体が従来は得難いときれてい
た糖タンパク質糖鎖、特にムチン型糖タンパク質糖鎖と
反応する単クローン抗体であることである。第２の特徴
は、後述するように、プロティンＡと反応する抗体、即
ちＩｇＧ抗体であるという点である。ＩｇＧ抗体のＩｇ
Ｈ抗体に対する優位性は、エピトープの決定の際の最も
有力な手段である、免疫親和性クロマトグラフィー（抗
体をカラム上に不溶化し、抗原となる物質を捕捉する手
段）を行なうことができること、および、ｉｎ　ｖｉｖ
ｏの癌診断に好適なＦ（ａｂ’）、断片を作成し得るこ
とである。

本発明の抗体は、ヒト腸癌組織およびその周辺部と良く
反応し、完全に正常な組織とは反応しない。また、Ｔｎ
抗原を有するＩｎ赤血球を強く凝集する。きらに、５Ｗ
１１１６　（ＡＩＣＣＣＣＬ　２３３）、ＬＳ１８０　
（ＡＴＣＣＣＬ−１８０）および牛、豚の脳から抽出し
た糖脂質とは全く反応しない。

また、本発明の抗体は、ＭＬＳ１０２　（Ａ、　Ｋｕｒ
ｏｓａｋａら、　ＦＥＢＳ　Ｌｅｔｔｅｒｓ　２１５．
１３７　（１９８７）、　Ｊ、　Ｂｉｏｌ。

Ｃｈｅｍ、　２６３．８７２４　（１９８８））、ＮＣ
Ｃ−Ｌｔｄ−８１（ＳＨｉｒｏｈａｓｈｉら、　Ｐｒｏ
ｃ、　Ｎａｔｌ、　　Ａｃａｄ、　　Ｓｃｉ、　　Ｕ、
Ｓ、Ａｇ３、　７０３９　（１９８５））、ＣＵ−１（
Ｈ，Ｋ、　Ｔａｋａｈａｓｈｉら。

Ｃａｎｃｅｒ　Ｒｅｓ、　４８．４３６１　（１９８８
））など、ムチン反応性の他の抗体とはその性質を異に
する。

本発明の抗体は、ＬＳ１８０　（ＡＩＣＣＣＬ−１８０
）、ヒツジ顎下腺ムチン（０５Ｍ）、シアリダーゼとβ
−ガラクトシダーゼ（ウシ重文）で処理したヒト赤血球
グリコホリンＡと反応する。

さらに本発明の抗体は、実施例および第１図に示す各種
ペプチドとの反応性から、次式；（式中ＲはＧａ１ＮＡ
ｃを示す。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識し、好ましく
は次式； （式中Ａはアミノ酸残基、ＲはＧａ１ＮＡＣを示す。）
で示される構造を有する糖ペプチドを認識することが判
明した。式中のＡとしては、Ｇｌｕ。

ＳｅｒまたはＬｅｕなどが挙げられる。きらに詳細には
、本発明の抗体は、次式； （式中Ａはアミノ酸残基、Ｂはアミノ酸配列、ＲはＧａ
１ＮＡｃを示す。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識する。

具体的には、次式； （式中ＡはＧｌｕ、ＳｅｒまたはＬｅｕ。

ＢはＧｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、 Ｇ　Ｉ　ｙ−Ｖａ　Ｉ　−Ａ　Ｉ　ａまたはＧ　ｌ　　
ｕ−Ｖａ　　ｌ　−Ａ　　ｌ　　ａ、ＲはＧａ１ＮＡｃ
を示す。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識した。

但し、上記式中のＡおよびＢは、上記に限定されるもの
ではない。

該抗体を分泌するハイプリドーマは、ヒト結腸癌細胞Ｌ
５１８０を腹腔内に免疫したーマウスから得た牌細胞と
、ミエローマ細胞とを常法に従い細胞融合し、予めＬＳ
１８０細胞から調製したムチン型糖ペプチドの糖鎖と反
応性を有する抗体を産生ずるりｏ−ンヲ選択することに
よって得たものである。

該ハイプリドーマは、１０にジメチルスルホキシド、９
０％牛脂児血清（Ｆｅ２）中で液体窒素下（−１９８°
Ｃ）で安定な状態で長期間保存が可能である。必要に応
じて該ハイプリドーマは一部解凍し、２０にのＦｅ２を
含むＲＰＭＩ−１６４０もしくはダルベツコの最少必須
培地（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　ＭＥＭ）中で培養して増
殖させた後に、予めブリステンを２週間から３ケ月前に
腹腔内に一匹あたり約０．５ｍｌ投与しておいたマウス
の腹腔に投与することにより、１０日から２週間後に腹
水から大量に単クローン抗体ＮＮＹ１２８を得る事がで
きる。この時マウスー匹あたり約５ｍｌの腹水から７〜
１４ｍｇの該抗体を安定して得る事が可能である。この
腹水中の抗体は、硫酸アンモニウムで分画したのち透析
し、プロティンＡ−セファロース４Ｂなどのアフィニテ
ィーカラムに通すことにより容易に均一な単クローン抗
体にまで精製することができる。さらには、該バイブ１
）ドーマの培養液中□にも単クローン抗体ＮＮＹ１２８
は約３日間の培養で２０〜４０μ８７ｍ１の濃度で分泌
されており、この培養液中の抗体を使用することも可能
である。

本発明のハイプリドーマは、１９８９年３月９日から、
茨城県つくば南東１−１−３の微生物工業技術研究所に
、ブダペスト条約に基づき、）１ｙｂｒｉｄｏｍａ　Ｎ
ＮＹ１２８として、微工研条寄第２３３０号（ＦＥＲＭ
　　ＢＰ−２３３０）として寄託きれている。

さらに、本発明は実施例および第１図に示すとおり、上
記抗体に認識され、以下の構造を有する糖ペプチドＧＰ
−２およびＧＰ−３に関する。

（式中ＹはＡｌａまたは水素、ＲはＧａ１ＮＡｃを示す
。）本糖ペプチドは、上記の抗体のようなＩｎ抗原を認
識するモノクローナル抗体の選択・調製に有用である。

特に、前記の通り特開昭６１−２１２５６８に記載の方
法に従い、プレートなどに固相化し固相化糖ペプチドと
して用いれば、Ｉｎ抗原などを認識する抗体を効率よく
選択できる。

［実施例］ 以下に、該抗体につき実施例により更に具体的に説明す
るが、本発明の範囲を限定するものではない。

（実施例１）ハイプリドーマの作製性 免疫原としてはＬＳ１８０細胞、免疫マウスとしてはＢ
ａ１ｂ／ｃを用いた。Ｂａ１ｂ／ｃに、１０％牛脂児血
清を含むイーグル培地中で培養されたＬＳ１８０細胞を
１回につき１匹あたり１〜ｚｘｔｏ’個の細胞を０．５
ｍｌの生理食塩水に懸濁し、３ケ月にわたり９回腹腔内
に投与した。次に１匹あたり１〜ｚｘｔｏｓ個の細胞を
０、５ｍｌの生理食塩水に懸濁し同じマウスに静脈注射
し、３日後に同マウスから牌細胞を得る。１．５×１０
８個の牌細胞と２刈０７個のミエローマ細胞（ＳＰ２１
０−Ａｇ１４　）を胎児血清を含まないダルベツコ培養
液中で混和し、遠心（１，ＯＯＯｒｐｍ　、　５分間）
により細胞を洗浄した後に、牛胎児血清を含まないダル
ベツコ培養液にポリエチレングリコール（ＰＥＧ、　＃
１０００）を３５に含む溶液を０５ｍ１加え、混和後１
．ＯＯＯｒｐｍで約５分間の遠心を行い、牌細胞とミエ
ローマ細胞を融合させた。融合に用いられたＰＥＧは牛
胎児血清を含まないダルベツコ培養液５ｍｌと２０Ｘ牛
脂児血清を含むダルベツコ培養液５ｍｌによって希釈し
、遠心（１，ＯＯＯｒｐｍ、　５分間）によって除去し
た。ＰＥＧを除去した細胞は７２％ダルベツコ培養液、
８％ＮＣＩＣ１０９培養液（ＩＩ培地）　５０ｍ１に懸
濁し、９６大の組織培養プレートに１滴ずつ（約０．１
ｍｌ　）分注し、２４時間培養する。２４時間後アミノ
プテリンを０．８μＨ含む）ＩＴ培地を各人に１滴ずつ
添加しＨＡＩ培地とした。融合により得られたハイブリ
ドーマはＩＡＩ培地中で培養することにより融合しなか
った肺細胞およびミエローマ細胞から選別した。細胞融
合から約１０日後に、各ウェルから培養上清をとり実施
例４に示す方法により、ウェルに吸着しているＧ−５０
１（参考側参照）との反応性を調べた。

Ｇ−５０Ｉと反応したクローンを含むウェルはさらに引
き続き希釈法によるクローニングを２回繰り返して最終
的に、Ｇ−５０１と強く反応し、Ｇ−５０１Ｆや糖脂質
とは全く反応せず、さらに、Ｇ−５０Ｉからシアル酸を
除去したものとも同様に反応する抗体を産生するクロー
ンを選択し、その抗体をＮＮＹ１２８と命名した。

（実施例２）基クローン抗体の作製と精製法Ｂａ１ｂ／
ｃマウス１匹あたり０．５ｍｌのブリステンを腹腔内に
投与する。およそ１ケ月後に、１ｏｚダルベツコ培養液
、１０ＸＮＣＴＣ１０９培養液、２０に牛胎児血清から
成るハイプリドーマ増殖用培養液で培養された、ＮＮＹ
１２８を分泌するハイブリドーマを１匹あたり１０７個
の細胞を０．５ｍｌのハンクスの生理的塩溶液　（ＩＬ
当りＮａＣ１８ｇ、　ＫＣＩ　０．４ｇ、　ＣａＣ１，
０，１４ｇ、Ｍｇ５Ｏａ’７ＨｔＯＯ，１ｇ、　ＭｇＣ
１ｔ’６ＨｚＯＯ，１ｇ、　ＫＨｔＰＯａｏ、０６ｇ、
　ＮａＪＰＯｔ’１２ＨｚＯｏ、ｏａｇ、　Ｇｌｕｃｏ
ｓｅ　Ｉｇ、ＮａＨＣＯ，０，３５ｇを含む〉に懸濁し
、同マウスの腹腔内に投与する。約１０日後にマウスか
ら腹水を得る。この時マウス１匹あたり約５〜７＋ｎｌ
の腹水中に約１０ｍｇのＮＮＹ１２８が含まれている。

この腹水に硫酸アンモニウムを加えて最終的に５０％飽
和とする。

これを遠心し、沈殿物を０．１Ｍホウ酸緩衝液（ｐＨ８
，２）（緩衝液Ａ）に溶かし、さらに同緩衝液に対して
透析する。次に試料を数回に分けてブロチインＡ−セフ
ァロースＣＬ−４Ｂのカラムにかけ、緩衝液Ａでカラム
を洗浄する。このカラムは予め緩衝液Ａで平衡化したも
ので、６ｍｌの樹脂を含んでいる。このカラムには約３
０ｍｇのＩｇＧが結合できる。カラムに結合した抗体は
０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含む０．１Ｍ酢酸で溶出す
る。溶出液は１Ｍトリスで中和する。溶出液に硫酸アン
モニウムを５０に飽和になるように加え、遠心して得た
沈殿を緩衝液Ａに溶かし、緩衝液Ａに対して透析して基
クローン抗体ＮＮＹ１２８を得る。

（実施例３）基クローン抗体ＮＮＹ１２８とヒト腸癌組
織との反応性 ポルマリン固定したヒト腸癌組織を脱水し、パラフィン
中に包埋する。次にその組織から薄い切片を切り出した
後、キシレンを用いて切片からパラフィンを除く。さら
にアルコールで洗浄してキシレンを除き、最後に組織切
片をリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）で洗浄して切片をＰＢ
Ｓに浸す。その切片に基クローン抗体ＮＮＹ１２８を１
晩反応させる。切片を洗浄後フルオレセインイソチオシ
アネート（Ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｉｎ　１ｓｏｔｈｉｏｃ
ｙａｎａｔｅ　（ＦＩＩＣ）　）で螢光標識した抗マウ
スＩｇＧ抗体を反応させ、結合していないＦＩＴＣ−Ｉ
ｇＧを洗浄除去した後、ＮＮＹ１２８が反応した部分を
螢光顕微鏡により観察する。ＮＮＹ１２８は癌の部分お
よびその周辺部と反応し、完全に正常な部分とは反応し
なかった。

（実施例４）基クローン抗体ＮＮＹ１２８とムチン型糖
ペプチドとの反応性 ヒト腸癌細胞ＬＳ１８０から単離したムチン型糖ペプチ
ド（Ｇ−５０Ｉ）をポリリジン及びグルタルアルデヒド
を介して結合させたポリ塩化ビニルのウェルに、１χ牛
血清アルブミンを加え１時間放置後ウェルを洗浄し、さ
らに基クローン抗体ＮＮＹ１２８を加えて１晩反応させ
る。ウェルを洗浄後＋！ｆｉ　工で標識したプロティン
Ａを加えて２時間反応させ、ウェルを洗浄後ウェルに結
合した１１６１の放射活性を指標としてＮＮＹ１２８の
結合活性を測定したところＮＮＹ１２８はＧ−５０Ｉと
結合した。Ｇ−５０Ｉからシフ　ル酸を除いたものを用
いて同様な操作を行ってもＮＮＹＩ２８は同様な結合活
性を示したことから、ＮＮＹ１２８はムチン型糖ペプチ
ドのシアル酸を含まない糖鎖と反応することが明らかと
なった。

ＮＮＹ１２８の結合活性はＮＮＹ１２８を結合させたポ
リスチレンのビーズを用いた方法でも測定可能である。

ポリスチレンビーズ（ＥＰ−０３、＃８０、セキスイ）
を０．１５Ｍ塩化ナトリウムを含むリン酸緩衝生理食塩
水（ｐＨ７，４）　（ＰＢＳ）で洗浄する。ビーズを０
、２ｍｇ／ｍｌの濃度でＮＮＹ１２８を含むＰＢＳ中に
４℃で１晩放置してビーズに抗体をコートする。ビーズ
を５に牛血清アルブミン（ＢＳＡ）を含むＰＢＳ溶液で
３回洗浄し、さらに同溶液に浸し１時間放置する。溶液
を吸引除去後、ビーズに１００μｍの試料水溶液（ＬＳ
１８０　Ｇ−５０Ｉを含む）、５０μ１（７）０．２Ｘ
％ツイーン２０を含むＰＢＳ、５０μｍの１２．５ｎｇ
の”　’　Ｉ　−ＮＮＹ１２８と０．１にＢＳＡを含む
ＰＢＳ溶液（約２０万カウント）を加えて良く混和した
後、４°Ｃで１晩放置する。次にビスをＰＢＳで３回洗
浄し、ビーズに結合した放射活性を７−カウンターにて
測定する。

（実施例５）単クローン抗体ＮＮＹ１２８と０５Ｍとの
反応性 ０５Ｍをシアリダーゼ処理してアシアロＯ５Ｍとしても
ＮＮＹ１２８　ａの反応性は変化せず、α−Ｎ−アセチ
ルガラクトサミニダーゼ処理によって反応性が失われた
ことから、０５Ｍより、Ｇａ１ＮＡｃを含む抗原決定基
を単離すべく以下のような実験を行なった。

０５Ｍをプロナーゼ処理すると反応性が顕著に低下する
ことから、特異性の狭いトリプシンを用いることによっ
て抗原決定基を単離することにした。トリプシン消化を
効果的にするため、先ずＣＮよりアシアロＯ５Ｍを調製
した。その２０ｍｇを２０ｍ１の緩衝液（５０ｍＭトリ
ス塩酸、２０ｍＭ塩化カルシウム、ｐ）１８．０）に溶
かし、６００μｇのトリプシンを加え、３７℃で２４時
間インキュベートし、これをＮＮＹ１２８−プロティン
Ａ−セファロース４Ｂ　（プロティンＡ−セファロース
４Ｂ（ファルマシア社製）　６ｍｌにＮＮＹ１２８抗体
６０ｍｇを結合させたもの）のカラムに注入し、１）Ｈ
７，２の５０ｍＭリン酸緩衝液３０ｍ１で充分に洗浄し
た後、ｐＨ１１，５の５０ｍＭジエチルアミン３０ｍ１
を加えて吸着物質を溶出した。これを凍結乾燥したのち
少量のＯ，ｔＸ　トリフルオロ酢酸に溶かし、ＨＰＬＣ
のカラム（ウォーターズ社製、μボンダバックｃ、３）
に添加してクロマトを行ない、２１０ｎｍの紫外吸収で
モニターし、溶出時間約２７分の位置に単一のピーク（
ＧＰ−１＞を得た。その約１　ｎｍｏｌを用いて気相プ
ロティンシーケンサ−（アプライド・サイエンス社、４
７７Ａ）によるアミノ酸配列の決定を行なった。結果を
第１図に示す。５１残基の配列を決定したが、このうち
Ｘで示した部分は糖の結合のために、アミノ酸としては
検出されなかったものである。参考ノタメニ、Ｒ，Ｌ、
　Ｈｉｌｌうが、アポＯ５Ｍ（０５Ｍから化学的に完全
に糖鎖を除去したもの）をトリプシンで消化して得たペ
プチドＴ１のアミノ酸配列を示す（Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　
Ｃｈｅｍ、　２５２．３７９９−３８０４．　（１９７
７））。Ｘの部分を除けば両者のアミノ酸配列は完全に
一致し、Ｘのアミノ酸（セリンまたはトレオニン）も同
定することができた。

ＧＰ−１は抗原としては巨大すぎるため、これをさらに
断片化して抗原決定基を明らかにする必要があり、グル
タミン酸が１個含まれていることを利用して、これに特
異的な■８プロテアーゼ（ベーリンガー・マンハイム社
製）による消化を行なった。ＨＰＬＣで調へるとＧＰ−
１はＧＰ−ＩＡとＧＰ−ＩＢの２つの断片に分解されて
いた。ＮＮＹ１２８−プロティンＡ−セファロース４Ｂ
によるアフィニティークロマトを行なうと、ＧＰ−ＩＡ
は素通り画分に、ＧＰ−ＩＢも抗体との結合力は弱く、
やや遅れた両分に溶出された。

ＧＰ−ＩＡＸＧＰ−ＩＢのそれぞれのアミノ酸配列を第
１図に示す。図から明らかなように、Ｎ−末端のグルタ
ミン酸の脱離により、抗体との結合力を著しく失ったも
のと判断される。グルタミン酸とそれに続＜　Ｘ−Ｘ−
Ｘの部分を保持するために、改めてアシアロＯ５Ｍをサ
ーモリシン消化した。アシアロ０５Ｍ２００μｇを２０
０μｍの緩衝液（２０ｍＭ　ｈリス塩酸、５０ｍＨ食塩
、２．５ｎｎＭ塩化カリウム、ｐＨ７，６）に溶かし、
６μｇのサーモリシン（生化学工業社製）を加え、２４
時間インキュベートした。これをＮＮＹ１２８−プロテ
ィンＡ−セファロース４Ｂカラムによってアフィニティ
ークロマトを行ない、充分に洗浄した後、吸着物をｐＨ
１１，５の５０ｍＭジエチルアミン３０ｍ１で溶出した
。ＨＰＬＣで分析すると、溶出画分に２つのビーり、Ｇ
Ｐ−２とＧＰ−３がそれぞれ溶出時間約１７分と１８分
の位置に検出されたので、これらを分取した。それらの
アミノ酸配列を第１図に示す。ＧＰ−２はアミノ酸９個
、ＧＰ−３は１０個からなり、Ｇｌｕ−Ｘ−Ｘ−Ｘ　（
ＧｌｕＳｅｒ−Ｔｈｒ（ｈｒ　）の配列が保存されてい
た。ＱａＩＮｋの結合位置は第１７位（Ｓｅｔ）にも存
在するが、後述のように赤血球のグリコホリンＡの構造
との比較により、抗原決定基はＧａ１ＮＡｃと結合した
５ｅｒ−Ｔｈｒ−Ｔｈｒを含む糖ペプチドであると思わ
れる。

（実施例６）単クローン抗体ＮＮＹ１２８とグリコホリ
ンＡとの反応性 グリフホリンＡのＮ末端部分のアミノ酸配列を第１図に
示す。２．３．４位および１０．１１．１２．１３．１
４．１５位のセリンおよびトレオニンには、これらのア
ミノ酸に結合したにａｌＮＡｃに対してガラクトース、
シアル酸などが結合している。従って、このままの形で
はＮＮＹ１２８および従来から抗Ｔｎ抗体といわれるも
のとは全く反応しない。グリコホリンＡを次のように処
理するとＮＮＹ１２８と強い反応性を示した。

グリコホリンＡ（シグマ社製）を５０ｍＭリン酸緩衝液
（０，１４Ｍ、ｐｉ（７，４）に溶かしく１μｇ７１０
０μｍ）、ポリ塩化ビニル製プレートに同相化しく特開
昭６２２１２５６８）、これに１００μｍの０．２Ｍ酢
酸緩衝液に溶かしたシアリダーゼ（牛丼化学社製）を５
ｍＵ加え、３７℃で２時間インキュベートしたのち、同
じ緩衝液でよく洗浄した。次いで、牛皐丸β−ガラクト
シダーゼ（ベーリンガー・マンハイム社製）を１０ｍｕ
加え、３７℃で２４時間インキュベートし、さらに５ｍ
Ｌｌの酵素を追加した。ＮＮＹ１２８を加え、次いで１
１１−プロティンＡを加えてＮＮＹ１２８の結合量を測
定すると、未処理のグリコホリンＡでは１．０００カウ
ントであるのに対し、酵素処理後では５０，０００カウ
ントが認められた。

グリコホリンＡの１０〜１５位に連続して結合している
にａｌＮＡｃがエピトープであるか否かについては現在
のところ不明である。

（実施例７）エピトープの決定 上記の実施例から明らかな様に、本発明の抗体は、ＧＰ
−１、ＧＰ−２、ＧＰ−３、シアリダーゼおよびβ−ガ
ラクトシダーゼで処理したグリコホリンＡ（Ｍ型および
Ｎ型）と強く反応した。第１図に示すとおりこれらのペ
プチドに共通する構造は、（式中ＲはにａｌＮＡｃを示
す。） である。しかし、この構造を有するＧＰ−ＩＢとは弱く
しか反応しない。また、この構造のペプチド鎖のＮ端に
１個のアミノ酸残基が付加した構造を有する、シアリダ
ーゼおよびガラクトシダーゼで処理したグリコホリンＡ
（Ｍ型およびＮ型）とは強く反応した。即ち、本発明の
抗体は、 れらのいずれでも強く反応することから、これらに限定
諮れるものではなく、Ａはどのようなアミノ酸残基であ
っても本発明の抗体に強く認識きれるものと推定され、
本発明の範囲に含まれる。

ただし、本発明の抗体は、上記式■中のＡを有さない式
Ｉの構造だけを有するＧＰ−ＩＢとも弱く反応すること
から、式Ｉの構造を有する糖ペプチドを認識する抗体も
本発明の範囲に含まれる。

また、本発明の抗体が認識する構造は、上式■のペプチ
ド鎖のＣ端にアミノ酸配列を有していることが、必須で
はないが、重要であると考えられる。即ち、本発明の抗
体は、 （式中Ａはアミノ酸残基、ＲはＧａ１ＮＡｃを示す。）
で示される構造を有する糖ペプチドを認識する。

式中のＡとしては、第１図から明らかな様に、Ｇｌｕ、
ＳｅｔまたはＬｅｕが挙げられるが、こ（式中Ａはアミ
ノ酸残基、Ｂはアミノ酸配列、ＲはＧａ１ＮＡＣを示す
。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識する。

第１図に示すとおり上記式■中のＢとしては、Ｇｌｎ−
Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｖａｔ　−ＡｌａまたはＧ　
１　ｕ　−Ｖａ　ｌ　−Ａ　１　ａが挙げられる。しか
し、Ｂとしてはこれら特に共通性の無いアミノ酸配列の
いずれでもよいことから、上記アミノ酸配列に限定され
るものではなく、どのようなアミノ酸配列であっても、
本発明の抗体に強く認識されるものと推定され、本発明
の範囲に含まれる。

（実施例８）単クローン抗体ＮＮＹ１２８とｆｆｎ赤血
球との反応性 採血した新鮮血液を抗血液凝固剤を含むＡｌ５ｅｖｅｒ
溶液で２倍、希釈し、保存血液とする。この保存血液は
約２０％　（２，ＯＯＯｒｐｍ、１０分間遠心後のパッ
ク容量）の赤血球を含んでいる。これを原液として赤血
球液を作製する。

５に赤血球浮遊液をＰＢＳで３回洗浄し、最後に２″ｌ
血球浮遊液とする。

あらかじめマイクロプレートを用いて調製しておいた抗
体希釈系列液（２“希釈、２５μｍ）に２ｘ血球浮遊液
２５μｍを添加する。振盪攪拌後、室温で２時間放置し
、凝集を判定する。

Ｉｎ赤血球は、ＮＮＹ１２８抗体により凝集したのに対
し、正常赤血球（Ａ型、Ｂ型、０型）は全く凝集しなか
った。

凝集反応陽性の最大希釈は、２“倍（２’　：ｈｙｂｒ
ｉ−ｄｏｍａ　５ｐｅｎｔ　ｍｅｄｉｕｍ原液〉であっ
た。

他の抗Ｔｎモノクローナル抗体（ＮＣＣ−ＬＵ３５（Ｉ
ｇＭ）とＣＡ３２３９（ＩｇＭ））に比べＮＮＹ１２８
によるＩｎ赤血球の凝集価ハ弱い。これは、抗体のクラ
スの違い、即ちＩｇＧと１１の違いによるものと考えら
れる。

（実施例９）単クローン抗体ＮＮＹ１２８と各種糖脂質
との反応性 牛、豚の脳、Ｓ賢１１１６細胞、ＬＳ１８０細胞は水中
で４℃にてダウンス型ホモジナイザーでホモジナイズす
る。ホモジネートにメタノールとクロロホルムを加えて
最終濃度がクロロホルム／メタノール／水（２，７：５
．４：２、ｖ／ｖ　）になるようにし、室温で３０分間
攪拌して糖脂質を抽出後遠心する。沈殿に２容量の水を
加えてホモジナイズ後、８容量のクロロホルム／メタノ
ール混液（１：２、ｖ／ｖ）　ヲ７１１１え、攪拌下糖
脂質を抽出し、遠心して抽出物を得る。２つの抽出物を
セライト５３５で濾過した後、分液ロート中で混合し、
水を加えてクロロホルム／メタノール／水（１：２：２
．４、ｖ／ｖ　）となるようにする。ゆるやかに攪拌後
放置し上層を除き、下層は水の３倍量のメタノールを加
え良く攪拌後、下層の２倍量のＯ，００１Ｍ塩化カリウ
ム水溶液を加えゆるやかに攪拌後１晩放置し上層を得る
。先程の上層と合わせた後、イソブタノールを加えてか
ら減圧下で乾固きせる。乾燥標品をクロロホルム／メタ
ノール／水混液（６０：３０：４．５、ｖ／ｖ）中で１
晩攪拌後、遠心し不溶物を除いた上清を乾固させる。

乾燥標品を少量の水に対して透析する。透析後、乾固さ
せた標品をメタノールに溶かし遠心して不溶物を除いた
上清を糖脂質画分とした。

各々の糖脂質画分にメタノールを加え、１ｍｇの出発物
質（ｍ重量）中に含まれる糖脂質が２０μｍのメタノー
ルに溶解されているようにする。次にポリ塩化ビニルの
ウェルに２０μｍの該メタノール溶液を加える。減圧下
でメタノールを蒸発させ糖脂質をウェルの表面にコート
する。１に牛血清アルブミンを加えて３０分間インキュ
ベート後、ウェルを洗浄し、次に単クローン抗体ＮＮＹ
１２８を加えて室温で３時間反応させ、洗浄後１ｔＪプ
ロテインＡを加えて２時間反応きせた後にウェルを洗浄
し、ウェルに結合した放射活性により抗体結合活性を測
定した。その結果どの糖脂質とも全く反応しなかった。

参考例　Ｇ−５０Ｉの調製 Ｇ−５０Ｉはヒト腸癌細胞ＬＳ１８０　（ＡＴＣＣＣＬ
−１８７）の細胞膜（原形質膜）を構成し、同時に細胞
外にも分泌されるムチン製糖タンパク質より調製した糖
ペプチドであり、以下の方法によって調製される。

ヒト膓癌細胞ＬＳ１８０　（ＡＴＣＣＣＬ−１８７）を
Ｌｏｇ牛脂児血清を含むダルベツコ培養液で７日間培養
した後採集し、リン酸緩衝食塩水（塩化ナトリウム１３
７ｍＭ、塩化カリウム２．７ｍＬ　　リン酸−水素ナト
リウム８．１ｍＭ、リン酸二水素カリウム１．５ｍＭ、
塩化カリウム１．０ｍＭ、塩化マグネシウム０．５ｍＭ
、以下ＰＢＳと略記）で繰り返し洗浄した後、ＩＸトリ
トンＸ−１００（ロームアンドハース社製）を含むＰＢ
Ｓを加え氷冷下に攪拌し、遠心分離により得た上清を透
析の後凍結乾燥した。これをクロロホルム／メタツル（
２：１、ｖ／ｖ　）で脱脂し、０．　ＯＩＭの酢酸カル
シウムを含む酢酸緩衝液に懸濁して、プロナーゼＰ（科
研製薬社製）を乾燥体に対し１１５０を加え少量のトル
エンを加えてから３７°Ｃで３日間放置した後充分なタ
ンパク質分解を行った。はぼ透明になった可溶化細胞消
化液に等容の１０にトリクロロ酢酸水溶液を加えて攪拌
の後、放置して生成する不溶物を遠心分離し、得られた
上清に等容のエーテルを加えてよく混和した後、遠心分
離して上清を除いた。水層に更にエーテルを加えてトリ
クロロ酢酸を抽出、遠心する操作を３回繰り返し、水層
がｐＨ５になったことを確かめた後、予め０．５Ｍピリ
ジン−酢酸緩衝液（ｐＨ５，０）で平衡化したセファデ
ックスＧ−２５を充てんしたカラム（１，３ｘ６０ｃｍ
　）に注入し、同じ緩衝液により展開して流出液をフラ
クションコレクターで採取した。オルシノール−硫酸反
応に陽性の両分を集めて凍結乾燥した。得られた乾燥粉
末は０．５Ｍピリジン−酢酸緩衝液（ｐ）１５゜０）に
溶解した後セファデックスＧ−５０を用いて上記同様に
ゲル濾過し、フラクションコレクターで５ｍｌずつに分
画した。この時素通りした画分（Ｇ−５０Ｉ）はムチン
型（０−グリコシド型）糖タンパク質由来の糖ペプチド
を主成分とする。

フラクション番号２０〜２９までの画分を集め、凍結乾
燥により溶媒を除いて、ムチン型糖ペプチドＧ−５０Ｉ
を得た。

因みにフラクション番号３０〜５６までの画分は血清型
（Ｎ−グリコシド型）糖タンパク質に由来する糖ペプチ
ド画分で、これを血清型糖ペプチド）５０１［とした。

発明の効果 Ｉｎ抗原は癌のほとんど（〜９ｏｚ）を占める上皮性癌
細胞の８０に以上に発現していることが知られている。

従って、本発明の抗体は癌の組織化学的診断、ｉｎ　ｖ
ｉｖｏ画像診断、さらに適当な補助的試薬の付加による
治療などに有効である。さらに、本発明の糖ペプチドを
用いることにより、Ｉｎ抗原を認識する抗体を効率的に
選別できる。

【図面の簡単な説明】

第１図は各種ペプチドと、ＮＮＹ１２８との反応性を示
す。

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. （１）式 I ； 【遺伝子配列があります】　式 I （式中ＲはＧａ１ＮＡｃを示す。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識する単クロー
   ン抗体。
2. （２）式II； 【遺伝子配列があります】　式II （式中Ａはアミノ酸残基、ＲはＧａ１ＮＡｃを示す。）
   で示される構造を有する糖ペプチドを認識する単クロー
   ン抗体。
3. （３）上記式II中のＡがＧｌｕ、ＳｅｒまたはＬｅｕで
   ある請求項２に記載の単クローン抗体。
4. （４）式III； 【遺伝子配列があります】　式III （式中Ａはアミノ酸残基、Ｂはアミノ酸配列、ＲはＧａ
   １ＮＡｃを示す。） で示される構造を有する糖ペプチドを認識する単クロー
   ン抗体。
5. （５）上記式III中のＡがＧｌｕ、ＳｅｒまたはＬｅｕ
   、ＢがＧｌｎ−Ｌｅｕ−Ｐｒｏ、Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ａｌ
   ａまたはＧｌｕ−Ｖａｌ−Ａｌａである請求項４に記載
   の単クローン抗体。
6. （６）ＩｇＧに属することを特徴とする請求項１〜５の
   いずれかに記載の単クローン抗体。
7. （７）ハイブリドーマＮＮＹ１２８により産生される請
   求項１〜６のいずれかに記載の単クローン抗体。
8. （８）請求項１〜７のいずれかに記載の単クローン抗体
   を産生するハイブリドーマ。
9. （９）ハイブリドーマＮＮＹ１２８である請求項８に記
   載のハイブリドーマ。
10. （１０）式IV； 【遺伝子配列があります】 （式中ＹはＡ１ａまたは水素、ＲはＧａ１ＮＡｃを示す
    。）で示される糖ペプチド。