JP2000336039A - タイプｉｉインターロイキン−１受容体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 タイプＩＩ ＩＬ−１受容体（タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ）タンパク質、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコ
ードするＤＮＡと発現ベクター、および組換え細胞培養
の生成物としてタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを生産する方
法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は一般的にサイトカイ
ン受容体に関し、特にインターロイキン−１受容体に関
する。

【０００２】

【従来の技術】インターロイキン−１α（ＩＬ−１α）
及びインターロイキン−１β（ＩＬ−１β）は免疫制御
及び、炎症反応において中心的役割を果たす、遠い関係
にあるポリペプチド性ホルモンである。これら２つのタ
ンパク質は各種の細胞に働き、複数の生物学的活性を持
っている。ＩＬ−１α及びＩＬ−１βに帰する生物学的
活性の相違は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βの両方に結合
する、特異的原形質膜受容体による。ＩＬ−１α及びＩ
Ｌ−１βによる広範囲に及ぶ生物学的活性のために、Ｉ
Ｌ−１受容体は様々な種の間で高度に保存され、多様な
細胞で発現されているに違いないと元来信じられてき
た。

【０００３】リガンド親和性クロス−リンキング技術に
よる構造評価の結果、配列上の顕著な相違にもかかわら
ず、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βは、Ｔ細胞と繊維芽細胞
の、同じ細胞表面受容体分子に結合することがわかった
（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄ
ｏｎ）３２４：２６６，１９８６；Ｂｉｒｄ ｅｔａ
ｌ．，Ｎａｔｕｒｅ（Ｌｏｎｄｏｎ）３２４：２６３，
１９８６；Ｄｏｗｅｒｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８３：１０６０，１９
８６）。ｃＤＮＡ発現クローニング及び、ＩＬ−１α及
びＩＬ−１βに結合し、８０，００ｋＤａの分子量を持
つ膜内在性糖タンパク質としてのＮ端側配列分析から、
ネズミとヒトのＴ細胞のＩＬ−１受容体が同定された
（シムズら（Ｓｉｍｓ ｅｔ ａｌ．）Ｓｃｉｅｎｃｅ
２４１：５８１，１９８８；シムズら，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６；８９４６，１９
８９）。

【０００４】しかしながら、現在では、この８０ｋＤａ
ＩＬ−１受容体タンパク質がＩＬ−１の種々の生物学
的効力のすべてを伝達しているわけではないことが明ら
かになっている。更なる親和クロス−リンキング解析
は、エプシュタインバーウイルス（Ｅｐｓｔｅｉｎ Ｂ
ａｒｒ ｖｉｒｕｓ）（ＥＢＶ）−形質転換ヒトＢ細胞
系ＶＤＳ−Ｏ及び３Ｂ６、ＥＢＶ−陽性バーキット（Ｂ
ｕｒｋｉｔｔ’ｓ）リンパ腫細胞系ラジ（Ｒａｊｉ）、
そしてネズミ前Ｂ細胞系７０Ｚ／３におけるＩＬ−１受
容体が６０，０００から６８，０００ｋＤａの分子量で
あるこおを示唆している（マツシマら（Ｍａｔｓｕｓｈ
ｉｍａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３６：
４９９６，１９８６；ベンシモンら（Ｂｅｎｓｉｍｏｎ
ｅｔ ａｌ．， Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４２：２２
９０，１９８９；ベンシモンら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．
１４３；１１６８，１９８９；ホルークら（Ｈｏｒｕｋ
ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１
６２７５，１９８７；チゾニッテ（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔ
ｅ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ８６：８０２９，１９８９；ボムスツィックら（Ｂ
ｏｍｓｚｔｙｋ ｅｔａｌ．， Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．
Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０３４，１９８
９）。さらに、ラジＢ細胞系と、ＥＬ−４ネズミＴリン
パ腫細胞系のＩＬ−１受容体の生物学的特性及び動的解
析を比較したところ、ラジ細胞は、ＥＬ−４Ｔ細胞のサ
ブクローンよりも、低い結合親和性を持つが、細胞あた
り、より高密度に受容体を持つことが分かった（ホール
ク（Ｈｏｒｕｋ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６
２：１６２７５，１９８７）。ラジ細胞はまた。ＩＬ−
１を吸収することができず、ＩＬ−１類似物に対して異
なった受容体結合親和力を示した（ホルクら．，Ｊ．Ｂ
ｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１６２７５，１９８７）。
これらのデータはＢ細胞上で発現されたＩＬ−１受容体
（ここではタイプＩＩＩＬ−１受容体と呼ぶ）は、Ｔ細
胞及びその他の細胞種で発見されたＩＬ−１受容体（こ
こではタイプIＩＬ−１受容体と呼ぶ）と異なっている
ことを示唆している。

【０００５】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの構造的及び生物
学的特性、そしてＩＬ−１刺激に対する様々な細胞母集
団の反応におけるタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの果たす役割
を解析するために、あるいは、治療、診断、分析におい
てタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを有効に用いるために、均質
な組成物が必要である。そのような組成物は、培養細胞
で発現している受容体の精製によって、あるいは、受容
体をコードしている遺伝子のクローニング及び発現によ
って理論的には得ることができる。しかしながら本発明
以前には、いくつかの障害があり、目的は達成されなか
った。

【０００６】まず、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを高いレベ
ルで構成的に、連続的に発現する細胞系が以前には知ら
れておらず、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現するとして
知られていた細胞系は少ない数（５００から２，０００
受容体／細胞）しか発現しなかったために、アミノ酸の
配列情報を得たり、モノクローナル抗体を作製するのに
充分な量の受容体の精製への努力が妨げられた。受容体
の数が少ないために、また、実用的な転写分析に基づい
たクローニング法も不可能であった。

【０００７】次に、タイプIＩＬ−ＲとタイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１ＲのＤＮＡ配列における顕著な相違のため、ネズ
ミタイプＩＬ−１ＲｃＤＮＡを用いたクロス−ハイブリ
ダイゼーションも不可能であった（ボムスチック（Ｂｏ
ｍｓｚｔｙｋ）ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ，Ｓ
ｃｉ．ＵＳＡ８６：８０３４，１９８９，及びチゾニッ
テ（Ｃｈｉｚｚｏｎｉｔｅ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔ
ｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：８０２９，１９８
９）。

【０００８】三番目として、仮に、Ｎ端側タンパク質配
列決定を行うことができるほど充分に精製されたタンパ
ク質組成物が得られたとしても、そこから得られる遺伝
コードの退歩（ｄｅｇｅｎｅｒａｃｙ）は、更にかなり
の実験をしなければ、適切なプローブを決定できないで
あろう。ｃＤＮＡライブラリーにおいてハイブリダイズ
する配列を決定するのに必要な特異性を持つプローブを
決定するのに、多くの反復する試行が要求されるだろ
う。直接的発現クローニング技術は、未知の特異性を持
つ異なったプローブを用いた反復したスクリーニングの
必要を避けており、他の受容体（例えばタイプIＩＬ−
１Ｒ）のクローニングにおいては有用であったが、少な
い数のタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現している細胞から
得られたｃＤＮＡライブラリーから、タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒクローンを固定するために用いるのにふさわしい
ほどに充分に感度が高くない。

【０００９】したがって、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを精
製したり、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコードする遺伝子
をクローニングしたり発現したりする努力は、精製した
受容体、受容体ｍＲＮＡの適切な供給源が欠落している
こと、そして、充分に感度のあるクローニング技術の欠
落によって著しく妨げられた。

【００１０】

【課題を解決するための手段】本発明は、精製した、均
質なタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質及び、タイプＩ
Ｉ ＩＬ−１Ｒタンパク質をコードする単離したＤＮＡ
配列、特に、ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ又はその類似
物（ａｎａｌｏｇｓ）を提供する。そのようなＤＮＡ配
列は、好ましくは、（ａ）クロ−ン７５のように、天然
タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ遺伝子のコード部分に由来する
ヌクレオチド配列を持つｃＤＮＡクローン；（ｂ）ゆる
やかなストリンジェント条件下で（ａ）のｃＤＮＡクロ
ーンとハイブリダイズでき、生物学的活性のあるＩＬ−
１Ｒ分子をコードするＤＮＡ配列；そして（ｃ）（ａ）
及び（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列の遺伝コードの結果
として退歩し、かつ生物学的活性のあるＩＬ−１Ｒ分子
をコードするＤＮＡ配列から成る群から選択される。本
発明はまた、上に定義されたＤＮＡ配列を含む組換え発
現ベクター、組換え発現ベクターを用いて産生された組
換えタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ分子、そして、発現ベクタ
ーを利用した組換えタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ分子の産生
方法を提供する。

【００１１】本発明はまた、実質的に精製され、均質な
タンパク質と、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを含む、タンパ
ク質組成物を提供する。

【００１２】本発明はまた、療法、診断、タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒの分析又は、タイプＩＩＩＬ−１Ｒに対する
抗体の作製において使用するための、上述の方法に従っ
て調製された可溶性天然又は組換え受容体タンパク質の
有効量を含む組成物を提供する。

【００１３】本発明のこれらの、また他の側面は、以下
の詳細な説明を参照すると明白になるであろう。

【００１４】定義 “ＩＬ−１”は、ＩＬ−１α及びＩＬ−１βをあわせて
指す。

【００１５】“タイプＩＩ インターロイキン−１受容
体”及び“タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ”はインターロイキ
ン−１（ＩＬ−１）分子を結合することができ、ホ乳類
原形質膜タンパク質のような本来の構造をとるとき、Ｉ
Ｌ−１から細胞への信号を伝達する役割を果たす分子を
指す。成熟した全長ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、み
かけの分子量が約６０−６８ｋＤａの糖タンパク質であ
る。タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質の具体例は、Ｓ
ＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２に
示されている。ここで用いられているように、上述の用
語は、ＩＬ−１結合活性又は信号伝達活性を持つ天然タ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質の類似物又はサブユニ
ットを含んでいる。特に、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタン
パク質の先端を欠いた形や、可溶性の形状のものも、下
記で定義するように、含まれている。種の指定がない場
合は、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、ヒト、ネズミ、ウシ
タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを含むがそれらに限定されな
い、ホ乳類タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを総称する。同様
に、欠損変異に対する特別な指定がない場合、タイプＩ
Ｉ ＩＬ−１Ｒという用語は、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
の生物学的活性を持つ変異体又は類似物を含むすべての
形態のタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを意味する。“インター
ロイキン−１受容体”又は“ＩＬ−１Ｒ”とは、タイプ
IＩＬ−１受容体及びタイプＩＩ ＩＬ−１受容体をあ
わせて指す。

【００１６】本発明の文脈で用いられている“可溶性タ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒ”はタンパク質、又は、実質的に
同等な類似物で、天然タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの細胞外
部分の全て又は一部と実質的に類似しており、細胞から
分泌されるが、ＩＬ−１と結合する能力を持っている
か、又は細胞表面に結合したＩＬ−１Ｒタンパク質を通
じたＩＬ−１の信号伝達を阻害する能力のあるものを指
している。可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質
は、細胞から分泌されることができるのなら、膜貫通領
域の一部を含んでいるかもしれない。可溶性タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒタンパク質の具体例は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１の１−３３０又は１−３３３アミノ酸配列を持つ
タンパク質、そして、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の１−
３４２及び１−３４５アミノ酸配列を持つタンパク質を
含んでいる。ＩＬ−１信号伝達活性の阻害は、初代細胞
又は、内在性ＩＬ−１Ｒを発現し、ＩＬ−１に生物学的
に反応するか、組換えＩＬ−１ＲＤＮＡを導入するとＩ
Ｌ−１に生物学的に反応するような細胞系を用いて決定
することができる。細胞は、ＩＬ−１と接触を受け、そ
れによって起きる代謝影響が解析される。もしリガンド
の働きによる影響が出れば、組換え受容体は信号伝達活
性を持つ。ポリペプチドが信号伝達活性を持つかどうか
を決定するための典型的な手法は、イゼルダ（Ｉｄｚｅ
ｒｄａ）ら．，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：８６１
（１９９０）；カーチス（Ｃｕｒｔｉｓ）ら．，Ｐｒｏ
ｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８６：３０４
５（１９８９）；プリウェス（Ｐｒｙｕｅｓ）ら．，Ｅ
ＭＢＯ Ｊ．５：２１７９（１９８６）及びコウ（Ｃｈ
ｏｕ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２：１８４
２（１９８７）によって明らかになった。

【００１７】“単離された”又は“精製された”という
用語は、本明細書の文脈中でタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタ
ンパク質又はタンパク質組成物の純度を定義するために
用いられている場合、タンパク質又はタンパク質組成物
が、実質的に、他の、天然の、又は内在性由来のタンパ
ク質の混入を受けておらず、生産過程の混入タンパク質
残余が１％以下であることを意味する。このような組成
物はしかし、安定剤、担体賦形剤または共治療剤として
他のタンパク質を含むことがある。タイプＩＩＩＬ−１
Ｒは、ポリアクリルアミドゲルを銀染色した時に、１本
のバンドとして検出可能ならば“単離されて”いる。

【００１８】“実質的に類似”という用語が、アミノ酸
もしくは核酸配列を定義する時に用いられる場合、特有
の従属配列、例えば、変異型配列が、もとの配列から、
１つ又はそれ以上の置換、欠失、付加を受けて変化して
おり、それらの全影響が、例えば、タイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒ結合分析において、実施例５で以下に記述したよう
に、決定された、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質の
生物学的活性を保っていることを意味している。あるい
は、核酸サブユニットまたは類似物は、もし、（ａ）Ｄ
ＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１又はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２のコード領域から得られたものなら、（ｂ）
ＤＮＡ配列が、ゆるやかなストリジェントな条件下（２
５％ ホルムアミド，４２℃，２×ＳＳＣ）で、もしく
はその代わりに、よりストリンジェントな条件下（５０
％ホルムアミド，５０℃，２×ＳＳＣ，又は５０％ホル
ムアミド４２℃，２×ＳＳＣ）で（ａ）のＤＮＡ配列と
ハイブリダイズすることができ、生物学的活性のあるＩ
Ｌ−１Ｒ分子をコードしているのなら、あるいは、
（ａ）又は（ｂ）で定義されたＤＮＡ配列に対する遺伝
コードの結果生じたＤＮＡ配列で、生物学的活性のある
ＩＬ−１Ｒ分子をコードするものなら、ここで明らかに
した特定のＤＮＡ配列に“実質的に類似”している。

【００１９】ここで用いられる“組換え”とは、タンパ
ク質が組換え（例えば微生物又はホ乳類の）発現系で得
られることを意味する。“微生物の”とは、細菌または
菌類（例えば酵母）の発現系で作製された組換えタンパ
ク質を指す。産生品として、“組換え微生物の”は、天
然の内在性物質を本質的に含まず、天然の糖鎖付加のな
いタンパク質を定義する。ほとんどの細菌培養、例えば
Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたタンパク質は、グリカンを含
まない。酵母で発現されたタンパク質は、ホ乳類細胞で
発現されたものとは異なるパターンの糖鎖付加を受ける
可能性がある。

【００２０】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの特性として本明
細書を通じて用いられている“生物学的活性”とは、測
定可能な量のＩＬ−１、できれば少なくともタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ１ナノモルあたり、０．０１ナノモルのＩ
Ｌ−１を結合できるだけの充分なアミノ酸配列類似性を
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２又はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３
との間に共有する特定の分子、又は、そのかわりに、例
えば、雑種受容体構造の一部のように、ＩＬ−１刺激を
細胞へ伝達できるだけの充分なアミノ酸配列類似性を共
有する特定の分子を意味する。さらに、できれば、本発
明の範囲では生物学的に活性のあるタイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒは、受容体１ナノモルあたり、０．１ナノモル以上
のＩＬ−１を結合する能力があり、最も望ましくは、受
容体１ナノモルあたり０．５ナノモルのＩＬ−１を結合
することができる。

【００２１】“ＤＮＡ配列”とは、ＤＮＡ重合体を指
し、１つの分離した断片状又は、より大きなＤＮＡ構造
の一部分であり、少なくとも１度は、実質的に純粋な形
状として、すなわち、内在性物質の汚染がなく、そし
て、配列の同定、操作、回収が可能なだけの量を持った
形状で単離されたＤＮＡ由来で、例えばクローニングベ
クターを用いた標準生物化学的手法で得たヌクレオチド
配列の部分である。このような配列は、真核生物遺伝子
に特徴的に存在する内在非翻訳領域すなわちイントロン
に中断されないオープンリーディングフレームをもつ形
状で供給されることが望ましい。しかし、適切な配列を
含むゲノムＤＮＡも使用され得ることは明らかである。
非翻訳ＤＮＡの配列は、オープンリーディングフレーム
の５′又は３′側に存在し、そこでは、操作又は、コー
ド領域の発現に干渉しない。

【００２２】“ヌクレオチド配列”は、デオキシリボヌ
クレオチドのヘチロ重合体を指している。本発明で供給
されたタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、ｃＤＮＡ
断片及び、短いオリゴヌクレオチドリンカー又は、組換
え転写単位で発現され得る合成遺伝子を供給するための
一連のオリゴヌクレオチドから集められた。

【００２３】“組換え発現ベクター”は、（１）例えば
プロモーター又はエンハンサーのような、遺伝子発現制
御をになう単一又は複数の遺伝因子、（２）ｍＲＮＡに
転写され、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、
コード配列、（３）適当な転写および翻訳開始及び終止
配列、の集まりを含む転写単位を含むプラスミドを指
す。酵母発現系で用いるための構造因子は、宿主細胞に
よって翻訳されたタンパク質が細胞外へ分泌されるよう
になるリーダー配列を含むことが望ましい。かわりに、
リーダー又は輸送配列を持たずに発現された組換えタン
パク質は、Ｎ端メチオニン残基を含むかもしれない。こ
の残基は、最終産物を供給するために、発現組換えタン
パク質から任意に、さらに切断されるかもしれない。

【００２４】“組換え微生物発現系”とは、例えばＥ．
ｃｏｌｉのような細菌や、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅの
ような酵母といった、宿主微小有機体の実質的に均質な
単一培養を意味し、それら宿主は、染色体ＤＮＡ中に組
換え転写単位を安定して組み込んでいるか、もしくは、
常在性プラスミドの構成物の１つとして組換え転写単位
を持っている。一般に、系を構成する細胞は、単独の祖
組換え体の子孫である。ここで定義される組換え発現系
は、ＤＮＡ配列又は、発現される合成遺伝子に連結した
制御因子の誘導によってヘテロなタンパク質を発現す
る。

【００２５】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質と類似
物 本発明は単離された組換えホ乳類タイプＩＩ ＩＬ−１
Ｒポリペプチドを提供する。本発明におけるタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒタンパク質は、例として、霊長類、ヒト、
ネズミ、イヌ、ネコ、ウシ、ヒツジ、ウマ、ヤギ及びブ
タタイプＩＩＩＬ−１Ｒを含んでいる。タイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１Ｒは、ヒト又はマウスタイプＩＩ ＩＬ−１ＲＤ
ＮＡ配列から得られた一本鎖ｃＤＮＡを用いた、種間ハ
イブリダイゼイションによって、例えば、ホ乳類のｃＤ
ＮＡライブラリーから、タイプＩＩ ＩＬ−１ＲｃＤＮ
Ａを単離するために、ヒトクローン７５を、ハイブリダ
イゼーションプローブとして用いて、得ることができ
る。多くのホ乳類遺伝子同様、ホ乳類タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒは、おそらく複数のエキソンにコードされてい
る。転写後の異なったｍＲＮＡスプライシングによって
生じ得る、本特許請求の範囲中にあるｃＤＮＡと同一又
は類似性のある広範囲を共有するオールタータティブｍ
ＲＮＡ構成物は、本発明の範囲に含まれるとみなされて
いる。ＩＬ−ＩＲ−ＩＩ をコードするＤＮＡ配列はお
そらく、別のスプライシング配置の形状にあるが、次の
細胞及び組織から単離され得る：Ｂリンホブラストイド
系（ＣＢ２３、ＣＢ３３，ラジ，ＲＰＭＩ１７８８，Ａ
ＲＨ７７のようなもの）、休止状態及び特に活性化状態
にある末梢血液Ｔ細胞、単球、単球細胞系ＴＨＰ１、好
中球、骨髄、胎盤、内皮細胞、角化細胞（特に活性化状
態）、及びＨｅｐＧ２細胞。

【００２６】本発明の範囲内のタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
の誘導物もまた、生物学的活性のある本来のタンパク質
の様々な構造物形状を含んでいる。例えば、イオン化可
能なアミノ及びカルボキシル基のためタイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒタンパク質は、酸性又は塩基性の塩として、ある
いは中性の形状をとる可能性がある。個々のアミノ酸残
基も酸化あるいは還元によって修飾を受ける可能性があ
る。

【００２７】アミノ酸の一次構造は糖鎖群、脂質、リン
酸、アセチル群、および同様のものといった他の化学的
部分と共有又は擬集結合を形成することで、あるいは変
異型アミノ酸配列を作成することで修飾される可能性が
ある。共有誘導物は特に機能的な群をタイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒのアミノ酸側鎖又は、Ｎ端又はＣ端に結合するこ
とで調製される。本発明の範囲内でのタイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒの他の誘導体は、Ｎ端又はＣ端の融合のような組
換え培養における合成によるような、タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒ又はその断片と、他のタンパク質又はポリペプチ
ドの共有又は擬集結合を含んでいる。例えば、結合した
ペプチドは、翻訳と同時に、あるいは翻訳後、タンパク
質を、その合成部位から機能部位へ、細胞膜又は壁の内
側あるいは外側へ輸送するような、タンパク質のＮ端部
分にあるシグナル（又はリーダー）ポリペプチド配列か
もしれない（例えば酵母のα−因子リーダー）。タイプ
ＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質融合は、タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒの精製と同定を促進するためのペプチド（例えば
ポリＨｉｓ）を含むこともできる。タイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒのアミノ酸配列はまた、ペプチドＡｓｐ−Ｔｙｒ−
Ｌｙｓ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ａｓｐ−Ｌｙｓ（Ｄ
ＹＫＤＤＤＤＫ）（ホップ（Ｈｏｐｐ）ら．，Ｂｉｏ／
Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ６：１２０４，１９８８）と結
合されることも可能である。後者の配列は、高い抗原性
があり、特異的なモノクローナル抗体が可逆的に結合す
る抗体認識部位を供給し、発現された組み換えタンパク
質の素速い分析と、容易な精製を可能にした。この配列
は、また、ウシムコサル エンテキロナーゼ（ｍｕｃｏ
ｓａｌ ｅｎｔｅｒｏｋｉｎａｓｅ）によって、Ａｓｐ
−Ｌｙｓ対の直後で特異的に切断される。この配列でキ
ャップされた融合タンパク質は、Ｅ．ｃｏｌｉ内で細胞
内消化に耐性になる可能性がある。

【００２８】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ誘導体は、また、
免疫原、受容体に基づいた免疫分析の試薬、あるいは、
ＩＬ−１又は他の結合リガンドの親和精製手法のための
結合試薬としても、使用することができる。タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ誘導体はまた、Ｍ−マレイミドベンゾイル
サクシニドエステル及びＮ−ヒドロキシサクシニドとい
ったシステイン及びリジン残基に働くクロス−リンキン
グ試薬を用いて得られる可能性もある。タイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１Ｒタンパク質は、また、シアノゲンブロマイド、
ビソキシレン、カルボニルジイミダゾール、又は、トシ
ルによって活性化されたアガロース構造といった、様々
な不溶性基質と、反応側基を通じて、あるいは、ポリオ
レフィン表面（グルタルアルデヒド クロスリンキング
の有無にかかわらず）に吸着することで、共有結合され
る可能性をもつ。いったん基質と結合するとタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒは（分析又は精製の目的で）抗−タイプＩ
ＩＩＬ−１Ｒ抗体又はＩＬ−１に選択的に結合するため
に用いることができるかもしれない。

【００２９】本発明は、また、天然型糖鎖付加のある、
あるいはない、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒも含んでいる。
酵母あるいは、例えばＣＯＳ−７細胞といったホ乳類発
現系で発現されたタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、その発現
系に依存して、天然の分子とは、分子量及び糖鎖付加の
型が類似するか、もしくはわずかに異なる可能性があ
る。Ｅ．ｃｏｌｉのような細菌でタイプＩＩ ＩＬ−１
ＲＤＮＡを発現すると、糖鎖付加されない分子が作られ
る。Ｎグリコシル化部位が不活性化された、ホ乳類タイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒの機能変異類似物は、オリゴヌクレ
オチド合成及びライゲーション又は、部位特異的変異導
入技術によって作製することができる。これらの類似タ
ンパク質は、酵母の発現系を用いて、よい収率で均質で
炭水化物還元型で作製されることが可能である。真核生
物タンパク質のＮ−グリコシル化部位は、３つのアミノ
酸、Ａｓｎ−Ａ₁−Ｚで特徴づけられており、ここでＡ₁
は、Ｐｒｏをのぞく任意のアミノ酸で、ＺはＳｅｒ又は
Ｔｈｒである。この配列中に、炭水化物の共有付加用の
側鎖アミノ酸を、アスパラギンが供給している。ヒトタ
イプＩＩ ＩＬ−１ＲのＮ−グリコシル化部位の例で
は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸６６−６８、７
２−７４、１１２−１１４、２１９−２２１及び２７７
−２７９である。このような部位は、Ａｓｎ又はＺ残基
を別のアミノ酸に置換したり、Ａｓｎ又はＺを削除した
り、Ａ₁とＺとの間にＺでないアミノ酸を挿入したり、
ＡｓｎとＡ₁の間にＡｓｎ以外のものを挿入することで
減少されることができる。

【００３０】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ誘導体はタイプＩ
Ｉ ＩＬ−１Ｒ又はそのサブユニットを変異型にするこ
とで得られる。ここで示されているように、タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ変異体は、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒとポリ
ペプチドは類似しているが、天然タイプＩＩ ＩＬ−１
Ｒとは欠失、挿入、置換のため、異なったアミノ酸配列
を持っている。

【００３１】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質の生物
学的に同等の類似物は、例えば、残基又は配列の様々な
置換、又は、末端又は内部の生物学的活性に不要な残基
又は配列の欠失、によって作成される可能性がある。例
えば、システイン残基は、再生にあたって、不必要もし
くは間違った分子内ジスルフィド架橋の形成を防ぐた
め、欠失又は他のアミノ酸と置換されうる。変異導入の
他の手段は、ＫＥＸ２プロテアーゼ活性が存在する酵母
の系での発現を強めるために、隣接した２価塩基性アミ
ノ酸残基の修飾も含んでいる。一般的に、置換は保存的
でなければならない。すなわち、最も好ましいアミノ酸
置換は、物理化学的性質の似かよった残基を置き換える
ものである。同様に欠失または挿入を行おうとすると
き、生物学的活性に対する欠失又は挿入の与え得る影響
を考慮しなければならない。実質的に類似したポリペプ
チド配列は、上で定義したように、一般に、同じくらい
の数のアミノ酸配列を含むが、可溶性タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒを作成するためにＣ端を切断したものは、より少
ないアミノ酸残基を含むことになる。タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒの生物学的活性を保存するために、欠失と置換は
類似した、あるいは保存した置換配列で行われること、
すなわち、当該の残基が生物学的に類似した残基と置換
されることが望ましい。保存した置換の例は、Ｉｌｅ，
Ｖａｌ，Ｌｅｕ，又はＡｌａを互換するといった、疎水
性残基どうしの置換や、ＬｙｓとＡｒｇ，ＧｌｕとＡｓ
ｎ，ＧｌｎとＡｓｎといった極性残基どうしの置換を含
んでいる。例えば類似した疎水性を持つ領域全体の置換
といった、その他の保存した置換もよく知られている。
さらに、ヒト、ネズミ、及びその他のホ乳類のタイプＩ
ＩＩＬ−１Ｒの間で異なっている特定のアミノ酸は、タ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒの本質的な生物学的特性を変える
ことのない、更なる保存した置換を示唆している。

【００３２】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒのサブユニット
は、末端あるいは内部の残基又は配列を欠失させて作製
できる。本発明は、例えば、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの
細胞外領域の全部又は一部に相当する可溶性タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒを生じるＣ端欠失を意図している。生じる
タンパク質はＩＬ−１に結合能があることが望ましい。
特に望ましい配列は、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの膜貫通
領域と細胞内領域が欠失しているか、親水性残基に置換
しており、受容体の細胞培養液への分泌を促進する配列
である。可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質は、
細胞から可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質が分
泌可能であるならば、膜貫通領域を一部含んでいる可能
性がある。例えば、可溶性ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
は、ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１のアミノ酸配列１−３３３又
は１−３３０を含み、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２のアミ
ノ酸配列１−３４５及び１−３４２を含んでいるかもし
れない。かわりに可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパ
ク質はＩＬ−１結合に必要でない細胞外領域中のタイプ
ＩＩ ＩＬ−１ＲのＣ端領域の欠失から得られたかもし
れない。例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２の配列で、それぞれ３１３、及び３２
５アミノ酸以降を持つようなタンパク質を作成するため
にＣ端欠失が行われたかもしれない。これらのアミノ酸
はシステインで、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ分子の３次構
造を保つのに必要であると信じられており、タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ分子がＩＬ−１に結合するのを許してい
る。可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ構造は、タイプＩＩ
ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡの３′領域を欠失さ
せ、適当な発現ベクターにＤＮＡを挿入し、発現させ
た。このような可溶性タンパク質の構築の典型的な方法
は実施例２及び４に述べている。生じたタイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１Ｒタンパク質は、実施例５で述べるように、ＩＬ
−１に結合する能力を測定される。このような、可溶性
タイプＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ配列及びこ
のような構造から生じる生物学的活性のある可溶性タイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質は、どちらも本発明の範
囲内に含まれるよう意図されている。

【００３３】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ類似物の発現用に
作製されたヌクレオチド配列中の変異は、当然、コード
配列の読み枠の相を保存しており、受容体ｍＲＮＡの翻
訳に負に影響するような、ループ、ヘアピンといったｍ
ＲＮＡの２次構造を生じるようにハイブリダイズ可能な
相補領域を生じないことが望ましい。変異を導入する部
位は前もって決定されるが、変異それ自体の性質が前も
って決定される必要はない。例えばある部位の変異の最
適の性質を選択するために、標的コドンに対するランダ
ムな変異導入が行われ、発現された変異型タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒは望ましい活性を持つものがスクリーニング
される。

【００３４】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコードするヌク
レオチド配列中のすべての変異が、最終産物として発現
されるわけではない。例えば、ヌクレオチドの置換は、
発現を強め、基本的に、転写されたｍＲＮＡ中のループ
等の２次構造を避けるように起きる（ＥＰＡ７５，４４
４Ａ参照、参考文献でここに含まれている）か、例えば
有名なＥ．ｃｏｌｉの発現用のＥ．ｃｏｌｉが好むコド
ンのような、選択された宿主によってより素早く翻訳さ
れるようなコドンを供給するように、起きる。

【００３５】変異は、本来の配列の断片とライゲーショ
ンできるような制限酵素部位を横に持った、変異配列を
含む合成オリゴヌクレオチドによって、意図した位置へ
導入することができる。ライゲーション後、生じた再構
築された配列は、目的のアミノ酸の挿入、置換、欠失を
持った類似物をコードする。

【００３６】そのかわりに、オリゴヌクレオチドを用い
た部位特異的変異導入法を用いて必要な置換、欠失、挿
入を持つように変化させた特別のコドンを持つ、改変遺
伝子を作製することもできる。上述した改変を作製する
典型的方法は、ワルダー（Ｗａｌｄｅｒ）ら、（Ｇｅｎ
ｅ４２：１３３，（１９８６）；ボイヤ−（Ｂａｕｅ
ｒ）ら，（Ｇｅｎｅ３７：７３，１９８５）；クレイク
（Ｃｒａｉｋ）（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｊａｎ
ｕａｒｙ１９８５，１２−１９）；スミス（Ｓｍｉｔ
ｈ）ら（Ｇｅｎｅｔｉｃ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ：ｐ
ｒｉｎｃｉｐｌｅｓａｎｄ Ｍｅｔｈｏｄｓ，Ｐｌｅｎ
ｕｍ Ｐｒｅｓｓ，１９８１）；によって明らかにさ
れ、そして米国特許４，５１８，５８４号及び４，７３
７，４６２号は適切な技術を開示し、参考文献中に編入
されている。

【００３７】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの単価型及び多価
型のどちらも、本発明における組成物及び方法の点で有
用である。多価型はＩＬ−１リガンドに対する複数のタ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒ結合部位を持っている。例えば２
価の可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、リンカー領域で
分離された、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの細胞外領域の２
つの縦方向くり返し構造をとっている。その他の多価型
も、例えば臨床用として使用可能な担体一般、フィコー
ル、ポリエチレングリコール、又はデキストランを含む
群から選択した重合体に、従来のカップリング技術を用
いて、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを化学的に結合させたも
のも作製される可能性がある。かわりに、タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒは、ビオチン化学的に結合されると、ビオチ
ン−タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは次にアビジンと結合し、
アビジン／ビオチン／タイプＩＩＩＬ−１Ｒ分子の４量
体が生じる。タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、またジニトロ
フェノール（ＤＮＰ）又は、トリニトロフェノール（Ｔ
ＮＰ）と共有結合し、生じる複合体は抗ＤＮＰ又は抗Ｔ
ＮＰ−ＩｇＭで沈降され、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ結合
サイトが１０価ある１０価複合体を形成する。

【００３８】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ配列を免疫ブロブ
リン分子の重鎖又は軽鎖のどちらか一方又は両方と置換
し、修飾を受けない不変領域を持つことで、組換えキメ
ラ抗体を作製可能である。例えば、タイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒ／ＩｇＧ₁キメラは、２つのキメラ遺伝子−タイプ
ＩＩ ＩＬ−１Ｒ／ヒトκ軽鎖キメラ（タイプＩＩＩＬ
−１Ｒ／Ｃκ）及びタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ／ヒトγ１
重鎖キメラ（タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ／Ｃγ_-1）−から
生じる。２つのキメラ遺伝子の転写及び翻訳の後、遺伝
子産物は、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを持つ１つキメラ抗
体分子に集合し、２価を示す。このようなタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒの多価型はＩＬ−１リガンドに対して強めら
れた結合親和性を持つであろう。このようなキメラ抗体
分子の構築に関する更なる詳細は、ＷＯ８９／０９６２
２及びＥＰ３１５０６２に開示されている。

【００３９】組換えタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの発現 本発明はタイプＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡを
増幅、又は、発現させるための組換え発現ベクターを提
供する。組換え発現ベクターはホ乳類タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒ又はその生物学的類似物をコードする、合成又は
ｃＤＮＡ由来のＤＮＡ断片を持ち、ホ乳類、微生物、ウ
イルス又は昆虫由来の適切な転写又は翻訳調節因子と、
実行可能なように結合した、複製可能なＤＮＡ構造物で
ある。転写単位は一般に、（１）例えば転写プロモータ
ー又はエンハンサーのように、遺伝子発現制御をにな
う、単一又は複数の遺伝因子、（２）ｍＲＮＡに転写さ
れ、タンパク質に翻訳される、構造的あるいは、コード
配列、（３）適当な転写および翻訳開始および終止配
列、の集まりを含むが、それについては以下で詳細に記
述する。そのような制御因子は、転写を制御するオペレ
ーター配列、すなわち、適切なｍＲＮＡリボソーム結合
部位をコードする配列を含むかもしれない。通常複製開
始点によって得られる宿主中での複製能、及び形質転換
体の認識を促進するための選択遺伝子も付加的に含まれ
ている。ＤＮＡ領域は、機能的に互いに関連している場
合は、実行可能に結合されている。例えば、シグナルペ
プチド（分泌リーダー）ＤＮＡは、もしポリペプチドの
分泌を担う前駆体として発現されるなら、ポリペプチド
のＤＮＡに実行可能に結合されている。プロモーター
は、もし、配列の転写を制御するなら、コード配列に、
実行可能に結合されている。あるいは、リボソーム結合
部位は、もし、翻訳を許すために加えられているなら、
コード配列に実行可能に結合されている。一般的に、実
行可能に結合されている、とは、連続的に、そして分泌
リーダーの場合は、連続的かつ読み枠に合って結合して
いることを意味する。酵母発現系において用いようとす
る構造因子は、宿主細胞によって翻訳されたタンパク質
が細胞外に分泌されることを可能にするリーダー配列を
含むことが望ましい。かわりに、組換えタンパク質がリ
ーダー又は輸送配列なしで発現した場合、Ｎ端メチオニ
ン部位を含むことになる。この残基は、最終産物を供給
するために発現された組換えタンパク質から続いて任意
に切断される。

【００４０】微小有機体で発現されることになる、ホ乳
類タイプＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ配列は、
ｍＲＮＡへのＤＮＡの転写を未熟なうちに停止させ得
る。しかし、転写の未熟な停止は、望ましい。例えば、
細胞膜に結合しない可溶性受容体を得るために、例えば
膜貫通部分を欠失した有利切断されたＣ端を持つ変異体
が得られる場合などである。コードが縮重しているた
め、同じアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列に
はかなりの変化が起こり得る。他の態様はゆるやかなス
トリンジェントな条件（５０°Ｃ，２×ＳＳＣ）下でク
ローン７５とハイブリダイズできる配列及び、生物学的
に活性のあるタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒポリペプチドをコ
ードするものとハイブリダイズするか、あるいは、縮重
している配列を含んでいる。

【００４１】組換えタイプＩＩ ＩＬ−１ＲＤＮＡは、
染色体ＤＮＡ中に組換え転写単位を（形質転換又は形質
導入によって）安定して組み込んでいるか、もしくは、
常在性プラスミドの構成物の１つとして組換え転写単位
を持っているような、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのような細
菌や、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのような酵母といっ
た、宿主微小有機体の実質的に均質な単一培養を含む組
換え発現系の中で発現されるか、増幅される。一般に、
系を構成する細胞は、単一の祖形質転換体の子孫であ
る。ここで定義された組換え発現系は、発現されるべき
ＤＮＡ配列または、合成遺伝子に結合した制御因子の誘
導によって異種タンパク質を発現するであろう。

【００４２】形質転換された宿主細胞は、組換えＤＮＡ
技術を用いて構築されたタイプＩＩＩＬ−１Ｒベクター
で形質転換または形質導入された細胞である。形質転換
された宿主細胞は通常、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現
するが、タイプＩＩ ＩＬ−１ＲＤＮＡをクローニング
又は増幅させるために形質転換された宿主細胞は、タイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現する必要がない。発現された
タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、選択されたタイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１ＲＤＮＡに依存して、細胞膜に置かれるが、培養
液上清に分泌される。ホ乳類タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの
発現用にふさわしい宿主細胞には、適切なプローモータ
ーの制御下にある原核生物、酵母あるいはより高等な真
核細胞が含まれる。原核生物は、例えばＥ．ｃｏｌｉ又
はバチルスといった、グラム陰性又はグラム陽性菌が含
まれる。高等真核細胞は、下に記述するような、ホ乳類
由来の確立された細胞系を含んでいる。本発明のＤＮＡ
構成物から得られたＲＮＡを用いて、無細胞系によって
ホ乳類タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを産生することも可能で
ある。細菌、菌類、酵母及びホ乳類宿主細胞は、ポウウ
エルス（Ｐｏｕｗｅｌｓ）らによって記述されており
（ＣｌｏｎｉｎｇＶｅｃｔｏｒｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎｅｗ Ｙ
ｏｒｋ，１９８５）、それに関連する開示はこの中で参
考文献中に含まれている。

【００４３】大規模なタンパク質分解及びジスルフィド
反応を必要としないタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの発現のた
めには、原核生物の発現宿主細胞が使用される。原核細
胞の発現ベクターは一般に、例えば、抗生物質耐性を賦
与するタンパク質をコードする遺伝子や、栄養要求性を
補う遺伝子、といった、１つまたはそれ以上の表現型を
持つ選択マーカーと、宿主内での増幅を保証する、宿主
が認識する複製開始点を含んでいる。形質転換にふさわ
しい原核宿主生物は、Ｅ．ｃｏｌｉ，Ｂａｃｉｌｌｕｓ
ｓｕｂｔｉｌｉｓ，Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｔｙｐｈ
ｉｍｕｒｉｕｍ及び、Ｐｓｅｕｄｏｍｏｎａｓ，Ｓｔｒ
ｅｐｔｏｍｙｃｅｓ及びＳｔａｐｈｙｏｌｏｃｏｃｃｕ
ｓ属に含まれる様々な種が含まれるが、その他のものも
選択の問題で用いられる。

【００４４】細菌用の有用な発現ベクターは、よく知ら
れたクローニングベクターｐＢＲ３２２（ＡＴＣＣ３７
０１７）の遺伝因子を含む市販の入手可能なプラスミド
由来の、選択マーカーと細菌の転写開始点を含みうる。
そのような市販されているベクターは例えば、ｐＫＫ２
２３−３（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｆｉｎｅ Ｃｈｅｍｉ
ｃａｌｓ，Ｕｐｐｓａｌａ，Ｓｗｅｄｅｎ）及びｐＧＥ
Ｍ１（ＰｒｏｍｅｇａＢｉｏｔｅｃ，Ｍａｄｉｓｏｎ，
ＷＩ，ＵＳＡ）を含んでいる。これらｐＢＲ３２２を
“背骨”とする種類は、適切なプロモーターと、発現さ
れるべき構造遺伝子が組合わさっている。Ｅ．ｃｏｌｉ
は、あるＥ．ｃｏｌｉ種から得られたプラスミドである
ｐＢＲ３２２の誘導体を用いて典型的に形質転換される
（ボリバー（Ｂｏｌｉｖａｒ）ら，Ｇｅｎｅ２：９５，
１９７７）。ｐＢＲ３２２はアンピシリン及びテトラサ
イクリン耐性遺伝子を含み、形質転換された細胞の同定
が容易になっている。

【００４５】組換え微生物発現ベクターで一般に用いら
れているプロモーターは、β−ラクタマ−ゼ（ペニシリ
ナ−ゼ）及びラクロースプロモーター系（チャンら（Ｃ
ｈａｎｇ），Ｎａｔｕｒｅ２７５：６１５，１９７８及
びゴッデル（Ｇｏｅｄｄｅｌ）ら，Ｎａｔｕｒｅ２８
１：５４４，１９７９）トリプトファン（ｔｒｐ）プロ
モーター系（マニアティス（Ｍａｎｉａｔｉｓ），Ｍｏ
ｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔ
ｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ ＳｐｒｉｎｇＨａｒ
ｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，ｐ．４１２，１９８
２）を含んでいる。特に便利な細菌の発現系は、λファ
ージＰ_Lプロモーター及びｃＩ８５７_ts温度依存リプレ
ッサーを利用している。λＰ_Lプロモーターの誘導体を
含む、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション
から入手可能なベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉＪＭＢ９（Ａ
ＴＣＣ３７０９２）株に常在するｐＨＵＢ２プラスミ
ド、及びＥ．ｃｏｌｉＲＲ１株（ＡＴＣＣ５３０８２）
に常在するｐＰＬｃ２８プラスミドを含んでいる。

【００４６】組換えタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質
は、酵母宿主細胞中、とりわけ、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉ
ａｅのような、Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ種において
も発現される。ＰｉｃｈｉａあるいはＫｌｕｙｖｅｒｏ
ｍｙｃｅｓといった他の属の酵母もまた、利用される。
酵母のベクターは一般に酵母２μプラスミド由来又は、
自律転写配列（ＡＳＲ）由来の複製開始点、プロモータ
ー、タイプＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡ、ポリ
アデニル化のための配列及び転写終結と、選択遺伝子を
含んでいる。好適には、酵母のベクターは複製開始点を
含み、酵母にも、Ｅ．ｃｏｌｉにも、形質転写できるよ
うな、例えば、Ｅ．ｃｏｌｉのアンピシリン耐性遺伝子
及び、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅのトリプトファン中で
は生育できない酵母の変異株の選択マーカーになる、Ｔ
ＲＰ１あるいはＵＲＡ３遺伝子、そして、下流の構造遺
伝子の転写を誘導するための、高発現の酵母の遺伝子由
来のプロモーターを含むことが望ましい。したがって、
酵母宿主細胞のゲノム中にＴＲＰ１又はＵＲＡ３の損傷
が存在すると、トリプトファンまたはウラシルの欠落し
た中での生育によって、形質転換を検出する効果的な環
境を与えることになる。

【００４７】酵母ベクター中の適切なプロモーター配列
は、メタロチオネイン、３−ホスフォグリセレートキナ
ーゼのプロモーター（ヒッツェマン（Ｈｉｔｚｅｍａ
ｎ）ら．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５５：２０７
３，１９８０）又は、他のエノラーゼ、グリセルアルデ
ヒド−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、ヘキソキナ
ーゼ、ピルベートデカルボキシラーゼ、ホスホフルクト
キナーゼ、グルコース−６−ホスフェートイソメラー
ゼ、３−ホスホグリセレートムターゼ、ピルベートキナ
ーゼ、トリオセホスフェイトイソメラーゼ、ホスホグル
コースイソメラーゼ及びグルコキナーゼといった解糖系
酵素のプロモーター（ヘス（Ｈｅｓｓ）ら，Ｊ．Ａｄ
ｖ．Ｅｎｚｙｍｅ Ｒｅｇ．７：１４９，１９６８；及
びホランド（Ｈｏｌｌａｎｄ）ら，Ｂｉｏｃｈｅｍ．１
７：４９００，１９７８）を含む。酵母発現系で用いる
のに適切なベクター及びプロモーターについて、Ｒ．ヒ
ッツェマン（Ｒ．Ｈｉｔｚｅｍａｎ）ら．，ＥＰＡ７
３、６５７に更に述べられている。

【００４８】望ましい酵母のベクターは、Ｅ．ｃｏｌｉ
における選択と複製のための（Ａｍｐγ遺伝子及び複製
開始点）ｐＵＣ１８由来のＤＮＡ配列と、グルコースで
抑制できるＡＤＨ２プロモーターと、α−因子分泌リー
ダー配列を含む酵母ＤＮＡから組み立てることができ
る。ＡＤＨ２プロモーターに関してはラッセル（Ｒｕｓ
ｓｅｌｌ）ら，（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５８：２
６７４，１９８２）及びベイヤー（Ｂｅｉｅｒ）ら，
（Ｎａｔｕｒｅ３００：７２４，１９８２）によって記
述されている。異種タンパク質の分泌を促す酵母α−因
子のリーダー配列は、プロモーターと発現するべき構造
遺伝子の間に挿入することができる。例えば、クルジャ
ン（Ｋｕｒｊａｎ）ら，Ｃｅｌｌ３０：９３３，１９８
２；及びビッテル（Ｂｉｔｔｅｒ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎ
ａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：５３３０，１
９８４を参照されたい。リーダー配列は、その３′端
に、リーダー配列と外来遺伝子の融合を促進する１つか
それ以上の制限酵素部位を持つように改変されるかもし
れない。 適切な酵母形質転換法は、当業者に知られて
いる；典型的な技法は、ハイネン（Ｈｅｉｎｎｅｎ）
ら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ７
５：１９２９，１９７８に記述されており、Ｔｒｐ⁺形
質転換体の選択に、０．６７％イーストナイトロジェン
ベース，０．５％カザミノ酸，２％グルコース，１０μ
ｇ／ｍｌアデニン及び２０μｇ／ｍｌウラシルを含む選
択培地；又は、ＵＲＡ⁺形質転換体用には、０．６７％
ＹＮＢと、シェルマン（Ｓｈｅｒｍａｎ）ら，Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ Ｃｏｕｒｓｅ Ｍａｎｕａｌ ｆｏｒ
Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｙｅａｓｔ Ｇｅｎｅｔｉｃ
ｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏ
ｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏ
ｒ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８６に記述されているよう
にアミノ酸と塩基を加えた培地を用いている。

【００４９】ＡＤＨ２プロモーターから成るベクターに
より形質転換された宿主の株は、発現のために、８０μ
ｇ／ｍｌアデニンと８０μｇ／ｍｌウラシルを補われ
た、１％酵母エキストラクト、２％ペプトンそして１％
または４％グルコースから成る富栄養培地で増殖される
こともあるだろう。粗酵母の上清を濾過より回収し、更
に精製するまで４℃に保持しておく。

【００５０】組換えタンパク質を発現させるために、様
々な哺乳類あるいは昆虫の培養細胞系も有利に用いられ
る。哺乳類の細胞における組換えタンパク質の発現は、
作られたタンパク質が一般的に正しく折りたたまれ、適
切に修飾され完全に機能的であるということから、特に
好まれる。適した哺乳類の細胞系の実施例は、グルツマ
ン（Ｇｌｕｚｍａｎ）により記述された（Ｃｅｌｌ２
３：１７５，１９８１）、サルの腎臓の細胞からのＣＯ
Ｓ−７系統、及び例えばＬ細胞、Ｃ１２７，３Ｔ３，チ
ャイニーズ ハムスター オバリー（ＣＨＯ），Ｈｅｌ
ａそしてＢＨＫ細胞系を含めた適当なベクターを発現す
ることのできる他の細胞系を含んでいる。哺乳類の発現
ベクターは、複製開始点、発現される遺伝子につながっ
た適当なプロモーター及びエンハンサー、そして５′ま
たは３′に隣接した非転写配列のような非転写要素とリ
ボゾーム結合サイト、ポリアデニル化サイト、スプライ
シングドナー及びアクセプターサイト、そして転写終了
配列のような５′または３′非翻訳配列を含むこともあ
るだろう。昆虫の細胞でヘテロなタンパク質を生産する
ためのバキュロウイルス（Ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）の
系についてはルカウ（Ｌｕｃｋｏｗ）とサマーズ（Ｓｕ
ｍｍｅｒｓ）によるレビューがある、Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈ
ｎｏｌｏｇｙ６：４７（１９８８）。

【００５１】セキツイ動物の細胞を形質転換するのに用
いられることになる発現ベクターでの転写及び翻訳制御
の配列は、ウイルスのソースから提供されることもある
だろう。例えば、最もよく用いられるプロモーター及び
エンハンサーは、ポリオーマ、アデノウイルス２、シミ
アンウイルス４０（ＳＶ４０）及びヒトサイトメガロウ
イルス由来である。ＳＶ４０ウイルスゲノム由来のＤＮ
Ａ配列、例えばＳＶ４０オリジン、初期及び後期プロモ
ーター、エンハンサー、スプライシングそしてポリアデ
ニル化サイトは、ヘテロなＤＮＡ配列の発現に要求され
る他の遺伝子要素を供給するために用いられることもあ
るだろう。初期及び後期プロモーターは、共にＳＶ４０
ウイルス複製オリジンも含んだ断片としてウイルスから
容易に得られるので、特に有用である（フィアーズ（Ｆ
ｉｅｒｓ）ら．，Ｎａｔｕｒｅ２７３：１１３，１９７
８）。ウイルス複製開始点に位置しているＨｉｎｄ３サ
イトからＢｇｌｌサイトへの約２５０ｂｐの塩基配列を
含んでいるならば、より小さなあるいはより大きなＳＶ
４０断片も用いられることがあると思われる。更に、哺
乳類のジェノミックタイプＩＩ のＩＬ−１Ｒプロモー
ター、コントロール、そして／またはシグナル配列が、
そうしたコントロール配列が、選択された宿主の細胞と
おりあうならば利用されることもあるだろう。組換えた
哺乳類タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを生産する哺乳類高発現
ベクターについての更なる詳細は、以下の実施例２で示
される。典型的なベクターは、オカヤマ及びバーグ（Ｂ
ｅｒｇ）により発表されたようにして構築することがで
きる（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２８０，１９
８３）。

【００５２】Ｃ１２７マウス乳腺上皮細胞において、哺
乳類のレセプターｃＤＮＡを安定に高レベルで発現させ
るのに有用な系は、実質的にコスマン（Ｃｏｓｍａｎ）
らにより記述されたようにして作製することができるだ
ろう（Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３：９３５，１９８
６）。

【００５３】本発明の利点においては、タイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１ＲｃＤＮＡを含む組換え発現ベクターが安定に宿
主細胞のＤＮＡにインテグレートされることである。発
現産物の上昇したレベルは、ベクターＤＮＡの数が増幅
された細胞系を選択することにより、達成される。ベク
ターＤＮＡの数が増幅された細胞系は、例えば、既知の
薬剤により阻害される酵素をコードしたＤＮＡ配列を含
むベクターで宿主の細胞を形質転換することにより選択
される。ベクターは、また、目的とするタンパク質をコ
ードしているＤＮＡ配列を含んでいてもよい。また、宿
主細胞を、目的とするタンパク質をコードしているＤＮ
Ａ配列を含む第２のベクターでコトランスフォーム（Ｃ
ｏｔｒａｎｓｆｏｒｍ）してもよい。トランスフォーム
あるいはコトランスフォームした宿主の細胞を、それか
ら、既知の薬剤の濃度を増やしながら培養し、それによ
り、薬剤耐性の細胞を選択する。そのような薬剤耐性の
細胞は、しばしば、酵素をコードしている遺伝子の増幅
の結果として、薬剤により阻害される酵素の過剰生産に
より毒性の薬剤の濃度が増加しても生き残る。阻害され
る酵素をコードしているベクターＤＮＡのコピー数の増
加により薬剤耐性が生じている場合は、宿主細胞のＤＮ
Ａで目的とするタンパク質（例：タイプＩＩＩＬ−１
Ｒ）をコードしているベクターＤＮＡの随伴性の共増幅
が存在している。

【００５４】そのような共増幅のためのより好ましい系
は、薬剤メトレキセート（ＭＴＸ）により阻害されうる
ジヒドロ葉酸レダクターゼ（ＤＨＦＲ）の遺伝子を用い
ている。共増幅を達成するため、ＤＨＦＲをコードして
いる活性のある遺伝子を欠いている宿主細胞を、ＤＨＦ
Ｒ及び目的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を
含むベクターでトランスフォームするか、もしくは、Ｄ
ＨＦＲをコードしているＤＮＡ配列を含むベクターと目
的とするタンパク質をコードするＤＮＡ配列を含むベク
ターとでコトランスフォームする。トランスフォームま
たはコトランスフォームした宿主細胞を、増加したレベ
ルのＭＴＸを含む培地で培養して、生き残った細胞系を
選択する。

【００５５】特に好ましい共増幅の系は、グルタミン酸
とアンモニアから、ＡＴＰをＡＤＰとリン酸に加水分解
して反応を進ませてグルタミンを合成するのにあずかっ
ているグルタミン合成酵素（ＧＳ）の遺伝子を用いてい
る。ＧＳは様々な阻害剤、例えばメチオニンスルフォキ
シイミン（ＭＳＸ）により阻害を受ける。従って、タイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒは、ＧＳと目的とするタンパク質の
ＤＮＡ配列から成るベクターでトランスフォーム、ある
いはＧＳをコードしたＤＮＡ配列を含むベクターと目的
とするタンパク質をコードしたＤＮＡ配列を含むベクタ
ーとでコトランスフォームした細胞を共増幅させ、増加
したレベルのＭＳＸを含む培地で宿主細胞を培養し、生
き残った細胞を選択することにより高濃度で発現される
ことができる。ＧＳ共増幅システム、適当な組換え発現
ベクター及び細胞系は以下のＰＣＴ出願に記述されてい
る：ＷＯ８７／０４４６２，ＷＯ８９／０１０３６，Ｗ
Ｏ８９／１０４０４及びＷＯ８６／０５８０７。

【００５６】組換えタンパク質は、チャイニーズハムス
ターオバリー（ＣＨＯ）細胞のような哺乳類細胞系統、
あるいはまたＳＰ２／Ｏ−Ａｇ１４がＮＳＯのようなマ
ウスミエローマ細胞系もしくはＹＢ２／３．０−Ａｇ２
０のようなラットミエローマ細胞系（ＰＣＴ出願ＷＯ／
８９／１０４０４及びＷＯ８６／０５８０７にて開示さ
れている）でも、ＤＨＦＲがＧＳの共増幅により好まし
く発現されている。

【００５７】タイプＩＩ ＩＬ−１ＲＤＮＡの発現のた
めのより好ましい真核細胞のベクターは以下の実施例２
で開示される。このベクターはｐＤＣ４０６と名づけら
れているが、哺乳類の高発現ベクターｐＤＣ２０１由来
で、ＳＶ４０、ＨＩＶ及びＥＢＶからの制御配列を含ん
でいる。

【００５８】組換え体タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの精製 本発明のＤＮＡの翻訳産物を発現する適当な宿主／ベク
ター系を培養し、その培地又は細胞抽出液から精製を行
うことにより、精製哺乳類タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ又は
そのアナログが調製される。

【００５９】例えば、組換え体可溶性タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒタンパク質を培地中に分泌する系での上澄は、初
めに商業的に入手可能なタンパク質濃縮フィルター、例
えば、アミコン（Ａｍｉｃｏｎ）又はミリポア ペリコ
ン（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｐｅｌｌｉｃｏｎ）限外濾過
ユニットを用いて濃縮され得る。濃縮に続き、濃縮液は
適当な精製担体にアプライされる。例えば、適当なアフ
ィニティー担体は、ＩＬ−１又はレクチンあるいは抗体
分子を適当な支持体にに結合させたものから成る。別法
として、例えば、ジエチルアミノエチル（ＤＥＡＥ）付
加を有する担体又は基質のような陰イオン交換樹脂も用
いられ得る。担体としては、アクリルアミド、アガロー
ス、デキストラン、セルロースあるいはタンパク質精製
に一般に用いられる他のタイプのものを使用できる。適
当な陽イオン交換体は、スルホプロピル基又はカルボキ
シメチル基を含む多様な不溶性担体を含む。スルホプロ
ピル基がより好ましい。

【００６０】最終的に、疎水性逆相高速液体クロマトグ
ラフィー（ＲＰ−ＨＰＬＣ）担体、例えば、メチル基あ
るいは他の脂肪族基の付加を有するシリカゲル、を用い
た１回あるいはそれ以上のＲＰ−ＨＰＬＣを行って、さ
らに、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ構成物を精製でき得る。
上述の精製操作のいくつか又はすべては、多様な組合わ
せにより、同種の組換えタンパク質の調製にも用いられ
得る。

【００６１】バクテリアの培養で作られた組換えタンパ
ク質は通常、初めに細胞ペレットからの抽出により分離
され、１回又はそれ以上の濃縮、塩析、水相イオン交換
あるいはサイズ排除クロマトグラフィー操作が行われ
る。最後に高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）が
最終精製操作として行われ得る。組換え哺乳類タイプＩ
Ｉ ＩＬ−１Ｒの発現に用いた微生物の細胞は、凍結−
融解サイクリング、ソニケーション、機械的破壊、又は
細胞溶菌試薬の利用を含むいかなる簡便な方法によって
も破壊され得る。

【００６２】分泌タンパク質として可溶性哺乳類タイプ
ＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現する酵母の発酵は精製を著しく
簡便化する。ラージスケールの発酵から生じた分泌組換
えタンパク質はアーダルら（Ｕｒｄａｌ ｅｔ ａ
ｌ．）（Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇ．２９６：１７１，１
９８４）により開示されたのと類似の手法により精製さ
れ得る。この引用文献は、調製用ＨＰＬＣカラムで、組
換えヒトＧＭ−ＣＳＦの精製を行うための、連続した２
回の逆相ＨＰＬＣ操作を記述している。

【００６３】組換え体培養中で合成されたヒトタイプＩ
Ｉ ＩＬ−１Ｒは、培養中からヒトタイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒを回収するための精製操作に依存する、タンパク質
を含む非ヒト細胞成分の量や性質によって格付けされ
る。これらの成分は通常、酵母、原核生物又は非ヒト高
等真核生物起源のもので、重量にして約１％未満の程度
で、存在が無害な夾雑物質量であることが望ましい。さ
らに、組換え体細胞培養は、例えば細胞内、細胞滲出液
又は体液中のような天然起源では通常タイプＩＩＩＬ−
１Ｒと結合しているタンパク質を含まない、タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒの製造を可能にする。

【００６４】組換え体可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの
治療投与 本発明は、有効量の可溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタン
パク質と適当な希釈液及びキャリアー（担体）から成る
治療用構成品を使用する方法、並びに有効量の可溶性タ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質の投与によって、ヒト
のＩＬ−１依存免疫反応で抑制する方法で提供する。

【００６５】治療用には、患者、望ましくはヒトに、精
製可溶液タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質を徴候に応
じた適切な処理により投与する。従って、可溶性タイプ
ＩＩＩＬ−１Ｒタンパク質構成品は丸薬注入、連続的点
滴、インプラントからの持続的放出又は他の適切な技法
により投与され得る。典型的には、可溶性タイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ治療薬は生理的に受容可能なキャリアー、賦
形剤又は希釈液と結合させた精製タンパク質から成る構
成品の形で投与される。このようなキャリアーは使用量
及び濃度で受容者に対し毒性の無いものである。一般
に、このような構成品の調製は、タイプＩＩ ＩＬ−１
Ｒをバッファー、アスコルビン酸のような酸化防止剤、
低分子量（約１０残基以下）のポリペプチド、タンパク
質、アミノ酸、ブドウ糖、ショ糖又はデキストリンを含
む炭水化物、ＥＤＴＡのようなキレート剤、グルタチオ
ン並びに他の安定剤及び賦形剤との組み合わせを伴う。
中性の緩衝塩水又は同種の血清アルブミンを混合させた
塩水が典型的な、適当な希釈液である。好ましくは、製
品は希釈液として適当な賦形剤液（例えばショ糖）を用
いた凍結乾燥品として定型化されるのが良い。適切な投
与量は試験により決定され得る。一般に、ｓｈｕＩＬ−
１Ｒ投与量は約１ｍｇ／ｋｇ／日から約１０ｍｇ／ｋｇ
／日で、好ましくは約５００μｇ／ｋｇ／日から約５ｍ
ｇ／ｋｇ／日で生理作用を誘導することが期待される。

【００６６】ＩＬ−１Ｒ−１とタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
タンパク質は双方ともＩＬ−１Ｒに結合するため、可溶
性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒタンパク質は同一ではないに
しても、同様の治療上の活性が期待される。例えば、可
溶性ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは例えばヒトの免疫反
応で抑制する目的に投与され得る。同種移植拒絶及び移
植片対被植者間の反応を含め、多様な病気及び症状がア
ロ抗原に対する免疫反応に起因する。アロ抗原で誘導さ
れる免疫反応では、ｓｈｕＩＬ−１ＲはＴ細胞活性化を
引き起こすリンパ球増殖及び炎症を抑制する。従ってｓ
ｈｕＩＬ−１Ｒは、例えば同種移植（皮膚、腎臓、心臓
移植のようなもの）並びに骨髄移植を受けた患者の移植
片−被植者間の反応などの臨床処置において、アロ抗原
によって誘導される免疫反応を有効に抑制するのに用い
られる。

【００６７】可溶性ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは、自
己固有のものとして認識されない抗原に対するＴ細胞の
活性化に依存するリウマチ様関節炎、糖尿病及び多発性
硬化症などの自己免疫機能不全の臨床処置にも用いられ
得る。

【００６８】以下の実施例は例証として示され、制限的
なものではない。

【００６９】

【実施例１】ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞内での活性タ
ンパク質の直接的発現によるヒトタイプＩＩ ＩＬ−１
ＲをコードするｃＤＮＡの単離 Ａ．ｒＩＬ−１βのラジオラベル 組換えヒトＩＬ−１
βを、クローンハイムら（Ｋｒｏｎｈｅｉｍ ｅｔ ａ
ｌ．）により記載されたように、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌ
ｉ）で発現し同室になるように精製して、調製した。
（Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ４：１０７８，１９８
６）ＩＬ−１βをジ−ヨード（¹²⁵Ｉ）ボルトン−ハン
ター（Ｂｏｌｔｏｎ−ｈｕｎｔｅｒ）試薬（Ｎｅｗ Ｅ
ｎｇｌａｎｄＮｕｃｌｅａｒ，Ｇｌｅｎｏｌｄｅｎ，Ｐ
Ａ）でラベルした。１０ｕｌのリン酸（０．０１５ｍｏ
ｌ／Ｌ）緩衝塩溶液（ＰＢＳ：０．１５ｍｏｌ／Ｌ），
ｐＨ７．２に懸濁した１０マイクログラム（０．５７ｎ
ｍｏｌ）のタンパク質をホウ酸ナトリウム（０．１ｍｏ
ｌ／Ｌ）−緩衝塩溶液（０．１５ｍｏｌ／Ｌ）、ｐＨ
８．５，１０ｕＬと混合し、ボルトン−ハンター試薬１
ｍＣｉ（０．２３ｎｍｏｌ）と製造業者の指示に従い、
８℃で１２時間反応した。次に、２％ゼラチン３０ｕＬ
と１ｍｏｌ／Ｌグリシン エチル エステルを加え、タ
ンパク質を１ｍＬ容量Ｂｉｏｇｅｌ^TMＰ６カラム（Ｂｉ
ｏ−Ｒａｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｒｉｃｈｍｏ
ｎｄ，ＣＡ）にかけて未反応のボルトン−ハンター試薬
から分離した。常に５０％から６０％のラベルの結合が
みられた。ヨードラベルは１×１０ ¹⁵から５×１０¹⁵ｃ
ｐｍ／ｍｍｏｌ−１（０．４から２原子Ｉタンパク質分
子あたり）の範囲の比活性を生じ、ドデシル硫酸ナトリ
ウム−ポリアクリルアミドゲル電気永動（ＳＤＳ−ＰＡ
ＧＥ）により、１７．５ｋＤの一種のラベルされたポリ
ペプチドが検出され、その分子量はＩＬ−１の既に報告
されている値と一致した。ラベルしたタンパク質は９８
％以上ＴＣＡ沈殿可能であり、これによりＩ^{12 5}はタン
パク質に共有結合していることが示唆された。

【００７０】Ｂ．ＣＢ２３ｃＤＮＡライブラリーの作成
とスクリーニング ＳＶ４０、ヒト免疫不全ウィルス
（ＨＩＶ）及びエプシュタイン−バー（Ｅｐｓｔｅｉｎ
−Ｂａｒｒ）ウィルス（ＥＢＶ）の調節配列を含む哺乳
類発現ベクター（ｐＤＣ４０６）を使用して、集めてお
いたｃＤＮＡクローンのサル腎臓細胞系ＣＶ−１／ＥＢ
ＮＡ−１（以下に示すようにＣＶ−１細胞系をＥＢＮＡ
−１をコードする遺伝子で形質転換したものに由来す
る）での直接的発現により、ＣＢ２３ライブラリーを作
成及びスクリーニングした。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細
胞系は、ヒトサイトメガロウイルス（ＣＭＶ）の直接初
期からきくエンハンサー／プロモーターによって制御を
うけてＥＢＶ核抗原−１を構造的に発現しており、従っ
てＥＢＶ複製起源を含むｐＤＣ４０６のような発現ベク
ターの自律複製を可能にする。使用した発現ベクターは
ｐＤＣ４０６で、ＨＡＶ−ＥＯ由来でドーワーら（Ｄｏ
ｗｅｒｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ，１４２：４
３１４，１９８９）に記載されており、それは今度はｐ
ＤＣ２０１由来で、ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞系中で
高レベル発現が可能である。ｐＤＣ４０６はＨＡＶ−Ｅ
Ｏ（ドーワーら、前出）とはＨＡＶ−ＥＯ中の２型アデ
ノウィルスの３部リーダー配列中のイントロンがないと
いう点が異なる。

【００７１】ＣＢ２３ｃＤＮＡライブラリーは、大体
は、アウスベルら（Ａｕｓｕｂｅｌｅｔ ａｌ．），ｅ
ｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ
Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１，１
９８７に記載してあるようにして、Ｂ細胞リンパ胸腺系
ＣＢ２３から抽出した全ＲＮＡより分離してポリ（Ａ）
⁺ｍＲＮＡを逆転写して作成した（ベンジャミンとドー
ワー（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ＆ Ｄｏｗｅｒ），Ｂｌｏｏ
ｄ７５：２０１７，１９９０）。ＣＢ２３細胞系はＥＢ
Ｖ感染索状血球（ＣＢ）リンパ細胞系であり、ベンジャ
ミンら（Ｂｅｎｊａｍｉｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．
Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８１：３５４７，
１９８４記載の方法を用いて派生された。ポリ（Ａ）⁺
ｍＲＮＡをオリゴｄＴセルロースクロマトグラフィーに
より分離し、大体、グブラーとホフマン（Ｇｕｂｌｅｒ
ａｎｄ Ｈｏｆｆｍａｎ），Ｇｅｎｅ２５：２６３、
１９８３の記述に従い、二重鎖ｃＤＮＡを作成した。簡
単に言うと、ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを、ランダム ６ヌ
クレチドをプライマーとして利用して逆転写酵素によ
り、ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドに変えた。その後Ｄ
ＮＡポリメラーゼＩと共同でＲＮＡアーゼＨを使用し、
ＲＮＡ−ｃＤＮＡハイブリッドを二重鎖ｃＤＮＡに変え
た。その結果生じた二重鎖ｃＤＮＡをＴ４ＤＮＡポリメ
ラーゼで平滑端にした。逆の２重のリン酸化していない
オリゴヌクレオチドをアニールし、生じた平滑端ｃＤＮ
Ａの末端とＤＮＡリガーゼで平滑端ライゲーションをハ
イメルら（Ｈａｙｍｅｒｌｅ ｅｔ ａｌ．）Ｎｕｃｌ
ｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１４：８６１
５，１９８６の記述に従い行った。

【００７２】

【化１】

【００７３】この場合２４マーのオリゴしかｃＤＮＡに
ライゲーションしないと予測される。ライゲーションし
ていないオリゴを６８℃でゲル濾過クロマトグラフィー
により除去し、ｃＤＮＡ上に２４ヌクレオチド非自己相
補的突出部分を残した。同様の方法を用いて、哺乳類発
現ベクターｐＤＣ４０６ＳａｌＩ切断５′端をｃＤＮＡ
に付加したものと相補的な２４ヌクレオチド突出部分に
変えた。アダプター付ベクターとｃＤＮＡをＴ４ポリヌ
クレオチドキナーゼ存在下で最適比率でライゲーション
した。ライゲーション混合物を透析しＥ．ｃｏｌｉ株Ｄ
Ｈ５αにエレクトロポレーションした。約３．９×１０
⁶クローンが生じ、約３０００個ずつの集団プレートし
た。各集団のサンプルを凍結グリセロール保存用に使用
し、プラスミドＤＮＡの集団を得るためにも使用した。
集められたＤＮＡをその後、ＤＥＡＥ−デキストランを
使用したサルＣＶ１／ＥＢＮＡ−１細胞擬集密的細胞層
にトランスフェクションし、ルースマンら（Ｌｕｔｈｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．
１１：１２９５（１９８３）及びマックカッチャンら
（ＭｃＣｕｔｃｈａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｎａｔｌ．
Ｃａｎｃｅｒ Ｉｎｓｔ，４１：３５１（１９８６）に
記載されているものに類似した、クロロキン（Ｃｈｌｏ
ｒｏｑｕｉｎｅ）処理を行った。ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−
１細胞は以下のようにして、派生した。ＣＶ−１／ＥＢ
ＮＡ−１細胞系は構造的に、ＣＨＶの即時初期のエンハ
ンサー／プロモーターにより制御されているＥＢＶ核抗
原−１を発現している。アフリカミドリザル腎臓細胞系
ＣＶ−１（ＡＴＣＣ ＣＣＬ７０）に、５μｇのｐＳＶ
ｇｐｔ［マリガンとバーグ（Ｍｕｌｌｉｇａｎ ＆ Ｂ
ｅｒｇ），Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ
ＳＡ７８：２０７２，１９８１］と２５μｇのｐＤＣ３
０３／ＥＢＮＡ−１をリン酸カルシウム共沈技術（アウ
ス−ベルら．ｅｄｓ．，Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃ
ｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，
Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９８７）をコトラン
スフェクションした。ｐＤＣ３０３／ＥＢＮＡ−１はｐ
ＤＣ３０２［モーズレイら（Ｍｏｓｌｅｙ ｅｔ ａ
ｌ．），Ｃｅｌｌ５９：３３５，１９８９］から２段落
で作成された。はじめにアテツウィルス３部リーダー配
列に存在するイントロンを、以下の合成オリゴヌクレオ
チドの一対で、イントロンをまたぐＰｖｕＩＩ からＳ
ｃａIの断片を入れかえることにより除去しプラスミド
ｐＤＣ３０３をつくった。

【００７４】

【化２】

【００７５】次に、エプシュタイン−バーウィルス核抗
原Ｉ（ＥＢＮＡ−１）をコードし、ＥＢＶ地図の１０
７，９３２から１０９，８９４から本来なるＨｉｎｄII
I−ＡｈａＩＩ 制限断片（バウルら（Ｂａｅｒ ｅｔ
ａｌ．），Ｎａｔｕｒｅ３１０：２０７，１９８４）
をその後ｐＤＣ３０３のマルチプルクローニングサイト
に挿入し、プラスミドｐＤＣ３０３／ＥＢＮＡ−１をつ
くった。標準的方法（オースベルら．，前出；マリガン
とバーク前出）に従い、ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン、キサンチン及びマイコフェノリン酸の存
在下でトランスフェクションした細胞を増殖し、トラン
スフェクトしたプラスミドを安定に混入した細胞を選択
した。得られた薬剤耐性コロニーを分離し、解析のため
各々細胞系に拡大した。細胞系を機能するＥＢＮＡ−１
の発現によりスクリーニングした。１つの細胞系クロー
ン６８がこのアッセイを用いて、ＥＢＮＡ−１を発現し
ていることがわかりＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１と選定され
た。

【００７６】ＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞にｃＤＮＡラ
イブラリーをトランスフェクトするため、細胞を完全培
地（ダルベッコ（Ｄｕｌｂｅｃｏｏ）改良イーグル（Ｅ
ａｇｌｅ）培地（ＤＭＥＭ）１０％（ｖ／ｖ）胎盤ウシ
血清（ＦＣＳ），５０Ｕ／ｍｌペニシリン、５０Ｕ／ｍ
ｌストレプトマイシン、２ｍＭＬ−グルタミンを含む）
で維持し、２×１０⁵細胞／ウェルの密度で６ウェル皿
（Ｆａｌｃｏｎ）又は１ウェルチェンバーつきスライド
（Ｌａｂ−Ｔｅｋ）にプレートした。皿及びスライドと
も、１ｍｌヒトフィブロネクチン（１０μｇ／ｍｌ Ｐ
ＢＳ中）で３０分前処理した後ＰＢＳで１回洗った。培
地を接着細胞層から除去し、６６．６μＭクロロキン硫
酸を含む１．５ｍｌ完全培地にかえた。０．２ｍｌのＤ
ＮＡ溶液（クロロキン入り完全培地中２μｇＤＮＡ，
０．５ｍｇ／ｍｌＤＥＡＥ−デキストラン）をその後細
胞に加え５時間インキュベートした。インキュベーショ
ン後、培地を除き、細胞を１０％ＤＭＳＯを含む完全培
地を２．５から２０分加えてショックを与え、次に、新
たな完全培地により溶液をとりかえた。細胞は培養中一
時的に挿入した配列が発現できるように増殖するように
した。これらの条件では生き残るＣＶ−１／ＥＢＮＡ−
１細胞の８０％のトラスフェクション効率を得た。

【００７７】４８から７２時間後、トランスフェクトし
たＣＶ−１／ＥＢＮＡ細胞単層を、前述のように調製し
たラジオヨード化したＩＬ−１βの結合を、スライドオ
ートラジオグラフィーによりみることでＩＬ−１結合タ
ンパク質の発現についてアッセイした。トランスフェク
トされたＣＶ−１／ＥＢＮＡ−１細胞を結合培地（ＲＰ
ＭＩ培地１６４０、２５ｍｇ／ｍｌウシ血清アルブミ
ン、２ｍｇ／ｍｌアジ化ナトリウム、２０ｍＭＨＥＰＥ
Ｓ，ｐＨ７．２と５０ｍｇ／ｍｌ無脂肪ドライミルク
（ＮＦＤＭ）を含む）で１回洗い、３×１０^-9Ｍ¹²⁵Ｉ
−ＩＬ−１βを含む１ｍｌ結合培地⁺ＮＦＤＭと４℃で
２時間インキュベートした。インキュベーション後チェ
ンバー付スライド中の細胞を結合バッファー＋ＮＦＤＭ
で３回洗い次にＰＢＳ，ｐＨ７．３で２回洗い、非結合
¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βを除いた。細胞をＰＢＳ，ｐＨ７．
３ １０％グルタルアルデヒド中室温で３０分インキュ
ベートして固定し、ＰＢＳで２回洗い、風乾した。スラ
イドをコダックＧＴＮＢ−２写真用乳剤（水で６倍希
釈）にひたし、遮光箱中で４８時間から７日暗所で露光
した。スライドをその後、コダックＤ１９現像液（４０
ｇ／５００ｍｌ水で約５分現像し、水でリンスし、Ａｇ
ｆａＧ４３３Ｃ定着液で固定した。スライドを各々顕微
鏡で２５ー４０×倍率で観察し、タイプＩＩ ＩＬ−１
Ｒを発現している陽性細胞を明るいバックグラウンドの
中のオートラジオグラフィー銀粒子の存在により固定し
た。

【００７８】６ウェル皿中の細胞を１度結合バッファー
＋ＮＦＤＭ中で洗い次にＰＢＳｐＨ７．３で３回洗い非
結合¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βを除いた。結合した細胞をその
後トリプシン分解してプレートから除き、結合した¹²⁵
Ｉ−ＩＬ−１βをベータ計数計により計数した。

【００７９】スライドオートラジオグラフィー法を使用
したところ、約３０００ｃＤＮＡの集団ずつ２５０，０
００ｃＤＮＡスクリーニングして初めてトランスフェク
タント集団のアッセイが明らかにＩＬ−１β結合陽性の
多くの細胞を示した。この集団をその後５００集団ずつ
に分け、再びスライドオートラジオグラフィによりスク
リーニングしたところ、陽性集団１つが同定された。こ
の集団をさらに７５ずつの集団に分け、６ウェルプレー
トにプレートし、結合した¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βの定量に
より解析するプレート結合アッセイによりスクリーニン
グした。細胞をプレートから削りとりどの７５の集団が
陽性か決めるため計数した。この７５の集団の個々のコ
ロニーをスクリーニングして、１つのクローン（クロー
ン７５）が、ＩＬ−１β結合アッセイで検出可能なタン
パク質の合成を行っていることを同定した。このクロー
ンを単離し、その挿入部分をシークエンスしてヒトタイ
プＩＩ ＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン７５の配列を決定
した。ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１ＲｃＤＮＡクローン７
５をもつｐＤＣ４０６クローニングベクターはｐＨｕＩ
Ｌ−１Ｒ−ＩＩ ７５と名付けられアメリカン・タイプ
・カルチャー・コレクション（ＡＴＣＣ）（Ｒｏｃｋｖ
ｉｌｌｅ ＭＤ，ＵＳＡ）に１９９０年６月５日寄託番
号ＣＲＬ１０４７８として寄託された。クローン７５の
核酸（ＳＥＱＩＤ ＮＯ：１）及び予想アミノ酸配列
（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１及びＳＥＱＩＤ ＮＯ：２）
及び関連情報を発表した配列表は本明細書の後半部に示
している。

【００８０】

【実施例２】ヒト溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコード
するｃＤＮＡの作成と発現 ベクターｐＤＣ４０６中の全長タイプＩＬ−１ＲｃＤＮ
Ａクローン７５（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）を鋳型とし
て使い、ポリメラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）増幅により、溶
性ヒトタイプＩＩ ＩＲ−１ＲをコードするｃＤＮＡ
（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１のアミノ酸１３〜３３３の配列
をもつ）を作成した。次の５′オリゴヌクレチドプライ
マー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７）及び３′オリゴヌクレ
オチドプライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８）を最初に
作成した。

【００８１】

【化３】

【００８２】５′プライマーはヒトタイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒクローン７５（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１）の非翻訳領
域の３１−５１ヌクレオチドに５′にＳａｌI制限酵素
部位を付したものに相当しているので、このヌクレオチ
ド配列は、ヒトクローン７５ヌクレオチド３１−５１に
相補的な（−）鎖にアニールすることができる。３′プ
ライマーはヌクレオチド１１９１−１１７２（ヒトタイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒクローン７５（ＳＥＱ ＩＤ Ｎ
Ｏ：１）の３アミノ酸をコードするアンチ−センスヌク
レオチドからなる）に相補的で、ＮｏｔI制限酵素部位
を５′に付加し終止コドンを持つ。

【００８３】次のＰＣＲ試薬を１．５ｍｌエッペンドル
フ微量遠心チューブに加えた：１０×ＰＣＲバッファー
（５００ｍＭＫＣｌ，１００ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐ
Ｈ８．３，２５℃で１５ｍＭ ＭｇＣｌ₂及び１ｍｇ／
ｍｌゼラチン）（パーキン−エルマーシータス；Ｐｅｒ
ｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ Ｃｅｔｕｓ，Ｎｏｒｗａｌｋ，Ｃ
Ｎ）１０μｌ，各ｄＮＴＰを含む２ｍＭ溶液（２ｍＭ
ｄＡＴＰ，２ｍＭｄｃＴＰ，２ｍＭｄＧＴＰ及び２ｍＭ
ｄＴＴＰ）１０μｌ，Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ２．
５ユニット（５００ユニット１ｍｌ溶液０．５μｌ）
（パーキン−エルマーシータス）、鋳型ＤＮＡ５０ｎｇ
及び各上記オリゴヌクレオチドプライマー２０μＭ溶液
５μｌに７４．５μｌの水を加え最終量１００μｌと
し、そして最終混合物に１００μｌのパラフィンオイル
を上からのせた。最初９４℃９０秒で鋳型を変性し、５
５°、７５秒で再アニールし、７２℃１５０秒でｃＤＮ
Ａを伸長させて、ＤＮＡ温度循環器（エリコンプ（Ｅｒ
ｉｃｏｍｐ）サン ディエゴＣＡ）を使用し、ＰＣＲを
行った。ステッププログラム（９４°、２５秒変性、５
５°、４５秒アニーリング、７２°１５０秒伸長）を使
用した増幅をさらに２０サイクルＰＣＲを行い、次に７
２°、５分間伸長した。

【００８４】試料を、フェノール−クロロホルム抽出及
びＧ−５０（ベーリンガーマンハイム）でのスパンカラ
ムクロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤ
ＮＡを抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％Ｓｅａ
Ｋｅｍ^TMアガロース（ＦＭＣＢｉｏＰｒｏｄｕｃｔｓ，
Ｒｏｃｋｌａｎｄ，ＭＥ）上で電気泳動で分離し、臭化
エチジウムで染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産
物と同一であることを確認した。

【００８５】そこで、２０μｌのＰＣＲ−増幅ｃＤＮＡ
産物を標準的方法を用いてＳａｌI及びＮｏｔI制限酵素
で消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後
１．２％ Ｓｅａｐｌａｑｕｅ^TM低温溶解（ＬＧＴ）ア
ガロース上で分離し、断片をあらわしているバンドを単
離した。断片を標準的なゲル内ライゲーション法により
ｐＤＣ４０６にライゲーションし、ベクターをＣＶ１−
ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトして実施例１に前述し
たように発現させた。

【００８６】

【実施例３】マウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコードす
るｃＤＮＡの単離 マウスタイプＩＩ ＩＬ−１ＲｃＤＮＡｓをマウス前駆
Ｂ細胞系統７ＯＺ／３（ＡＴＣＣＴＩＢ１５８）より作
成されたＣＤＮＡライブラリーから、ヒトタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒプローブを用いた種間ハイブリダイゼーショ
ンにより単離した。ｃＤＮＡライブラリーは製造業者の
指示に従ってλｇｔ１０アームを使用して、試験管内パ
ッケージ（登録商標ギガパック、ストラタジーン、サン
ディエゴ）を行ってλファージベクタ中に作成した。２
本鎖ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒプローブはヒトタイプ
ＩＩ ＩＬ−１Ｒクローン７５の約１．３５ｋｂ Ｓａ
ｌI制限酵素フラグメントを切りだして、ランダムプラ
イマー（ベーリンガーマンハイム）を使用してｃＤＮＡ
を³²Ｐラベルして作成した。マウスｃＤＮＡライブラリ
ーは１回増幅し、全部で５×１０⁵プラークをヒトプロ
ーブで３５％ホルムアミド（５×ＳＳＣ，４２℃）中で
スクリーニングした。いくつかのマウスタイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１ＲｃＤＮＡクローン（クローンλ２を含む）を単
離したが、どのクローンも全長のものではないようであ
った。部分的クローンから得た又クレオチド配列情報を
用いて、以下のように全長のマウスタイプＩＩ ＩＬ−
１ＲｃＤＮＡをクローン化した。

【００８７】マウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコードす
る全長ｃＤＮＡクローンを、フローマンら（Ｆｒｏｈｍ
ａｎ ｅｔ ａｌ．）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．
Ｓｃｉ．ＵＳＡ８５：８９９８に記載されているｃＤＮ
Ａ端の迅速増幅（ＲＡＣＥ）法によりマウス前駆Ｂ細胞
系統７０Ｚ／３を用いて単離した。簡単にいうとＲＡＣ
Ｅ法はＰＣＲを使用して、ｃＤＮＡ転写物の既知点（上
記で得られた核酸配列より決定）から３端の間の領域の
ｃＤＮＡのコピーを増幅するものである。１７ｄＴ塩基
対を含む配列と、３つのエンドヌクレアーゼ認識部位を
含むアダプター配列（便利な制限酵素部位をｃＤＮＡの
３端につける）をもつアダプタープライマーを、ｍＲＮ
Ａ集団の逆転写及び（−）鎖ｃＤＮＡの生成に使用す
る。上記のマウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒクローン２ｃ
ＤＮＡの５′非翻訳領域の配列の既知のストレッチに相
補的で３′方向を向いているプライマーを（−）鎖ｃＤ
ＮＡとアニールし、伸長して相補（＋）鎖ｃＤＮＡを生
成する。結果生じた二本鎖ｃＤＮＡを本来のままの５′
端と合成３′端ポリ（Ａ）尾部にアニールするプライマ
ーを使用してＰＣＲにより増幅する。ＲＡＣＥ法の詳細
は以下のとおりである。

【００８８】下記のＰＣＲオリゴヌクレオチドプライマ
ー（それぞれｄ（Ｔ）₁₇アダプター・プライマー、５′
増幅プライマーと３′増幅プライマーである）を最初に
作成した。

【００８９】

【化４】

【００９０】簡単に言うと、ｄ（Ｔ）₁₇アダプタープラ
イマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９）は集団のｍＲＮＡ転
写物のポリ（Ａ）⁺領域にアニールする核酸配列を含
み、ｍＲＮＡから（−）鎖ｃＤＮＡ逆転写物を生成する
ために使用される。またＰＣＲにより増幅されたＤＮＡ
に導入されるＰｓｔI，ＮａｔI及びＢａｍＨIに対する
エンドヌクレアーゼ制限酵素部位を含む。５′増幅プラ
イマー（ＳＥＱ ＩＤＮＯ：１０）はマウスタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒクローンλ２の５′非翻訳領域のヌクレオ
チド１５ー３４にＳａｌI制限酵素部位を５′付加した
ものに相当し、この塩基配列はｄ（Ｔ）₁₇アダプタープ
ライマーによる逆転写により生じた（−）鎖ｃＤＮＡに
アニールし、伸長して（＋）鎖ｃＤＮＡを生成する。
３’プライマー（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１）は上記エ
ンドヌクレアーゼ制限部位をもつ（＋）鎖ＤＮＡとアニ
ールし、伸長してマウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコー
ドする二本鎖全長ｃＤＮＡを生成し、それをそこで通常
のＰＣＲ反応で増幅することが可能である。ＰＣＲ法の
詳細は以下のとおりである。

【００９１】マニアティスら（Ｍａｎｉａｔｉｓ ｅｔ
ａｌ．）Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ（Ｃｏｌｄ Ｓｐ
ｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ １ａｂ．，ＮＹ，１９８２）
に記載されている標準的方法を用いて７０Ｚ／３細胞か
ら抽出した全ＲＮＡからオリゴｄＴセルロース クロマ
トグラフィーによりポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを単離し、以
下のように逆転写した。１６．５μｌ水中の約１μｇの
ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを６８℃で３分間熱してのち氷上
で冷まし、２μｌの１０×ＲＴＣバッファー（５００ｍ
Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ２２℃で、ｐＨ８．７ ６０ｍＭ
ＭｇＣｌ₂ ４００ｍＭ ＫＣｌ １０ｍＭＤＴＴ，
各ｄＮＴＰ１０ｍＭ）を１０ユニットのＲＮａｓｉｎ
（プロメガバイオテック；Ｐｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅ
ｃｈ）０．５μｇのｄ（Ｔ）₁₇−アダプタ プライマー
及び、１０ユニットのＡＭＶ逆転写酵素（ライフ サイ
エンス；Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）を全量２０μｌ
に加え、２時間で４２℃インキュベートしてｍＲＮＡを
逆転写し、ｃＤＮＡ集団を合成した。反応混合物はＴＥ
バッファー（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，ｐＨ７．
５，１ｍＭＥＤＴＡ）で希釈し、４℃で一晩置いた。

【００９２】約１又は５μｌのｃＤＮＡ集団を５μｌの
マウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒクローンλ２のヌクレオ
チド１５−３４配列に相当する配列を含む５′増幅プラ
イマーの２０μＭ溶液、３’増幅プライマー２０μＭ溶
液の５μｌ；１０μｌの１０×ＰＣＲバッファー（５０
０ｍＭ ＫＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ （ｐ
Ｈ８・４，２０℃），１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂と１ｍｇ／
ｍｌゼラチン）、４μｌの５ｍＭ各ｄＮＴＰ（５ｍＭｄ
ＡＴＰ，５ｍＭｄＣＴＰ，５ｍＭｄＧＴＰ ５ｍＭｄＴ
ＴＰを含む）、２．５ユニット（標準の５０００ユニッ
ト／ｍｌ溶液０．５μｌ）、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼ
（パーキンーエルマーシータス インストルメント（Ｉ
ｎｓｔｒｕｍｅｎｔ）と１００μｌの容量になるように
希釈して混合した。最終混合物は１００μｌパラフィン
オイルを上からのせた。最初９４℃９０秒で鋳型を変性
し、６４°、７５秒で再アニールし、７２°、１５０秒
でｃＤＮＡを伸長させてＤＮＡ温度循環器（パーキンー
エルマー／シータス）を使用しＰＣＲを行った。ステッ
ププログラム（９４°、２５秒変性、５５°、４５秒ア
ニーリング、７２°、１５０秒伸長）を使用した増幅を
さらに２５サイクル分、ＰＣＲを行い、次に７２°で７
分最終伸長をした。

【００９３】試料をフェノールクロロホルム抽出及びＧ
−５０（ベーリンガーマンハイム）でのスパンカラムク
ロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤＮＡ
を抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％ＳｅａＫｅ
ｍ^TMアガロース（ＦＭＣバイオプロダクト ロックラン
ド、ＭＥ）上で電気泳動により分離し、臭化エチジウム
で染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産物と同一で
あることを確認した。ゲルをその後ブロットし、上記の
マウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒクローンλ２の５６１０
ｂｐＥｃｏＲI断片をプローブにしてみて、マウスタイ
プＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするＤＮＡをそのバンドが
含むことを確認した。

【００９４】ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ産物をその後エッペン
ドルフ微量遠心で最高速度で２０分遠心して濃縮し、そ
の後１／１０容酢酸ナトリウム（３Ｍ）と２．５容量エ
タノール中でエタノール沈澱を行った。３０μｌの濃縮
物をＳａｌIとＮｏｔI制限酵素で標準的方法を使用して
消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後、
１．２％ＬＧＴアガロースゲルで分離し、断片にあたる
バンドを単離した。制限酵素断片はその後アガロースか
らＧｅｎｅ Ｃｌｅａｎ^TM（Ｂｉｏ−１０１，Ｌａ Ｊ
ｏｌｌａ，ＣＡ）から精製した。得られた精製制限酵素
断片を、ｐＤＣ４０６ベクターにライゲーションしそれ
をＣＶ−１ＥＢＮＡ細胞にトランスフェクトして、実施
例１中に前述されているように発現させた。拡散（ＳＥ
Ｑ ＩＤＮＯ：１２）及び予想アミノ酸配列（ＳＥＱ
ＩＤ ＮＯ：１２及びＳＥＱＩＤＮＯ：１３）と関連情
報を発表した配列表は本明細書の後半部分に示してあ
る。

【００９５】

【実施例４】マウス溶性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコー
ドするｃＤＮＡの作成と発現 ７０Ｚ／３ポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡを鋳型としたＰＣＲ増
幅及びマウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをコードする全長
クローンに対して記述されている以下の方法により、溶
性マウスタイプＩＩ ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡ
（ＳＥＱ ＩＤＮＯ．１２のアミノ酸１３ー３４５の配
列をもつ）を作成した。以下のＰＣＲオリゴヌクレオチ
ドプライマー（各々ｄ（Ｔ）₁₇アダプタープライマー、
５′増幅プライマー及び３′増幅プライマー）を作成し
た。

【００９６】

【化５】

【００９７】ｄ（Ｔ）₁₇アダプタープライマーと５′増
幅プライマーは実施例５に記述されていて、ＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：９とＳＥＱ ＩＤ ＮＯ；１０と同一であ
る。ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の３’端はＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１２のヌクレオチド１１４５−１１６６と相補
的であり、ＮｏｔI制限酵素部位の５’付加と終止コド
ンをもつ。

【００９８】実施例３に記述したようにｄ（Ｔ）₁₇アダ
プタープライマーを用いてポリ（Ａ）⁺ｍＲＮＡからｃ
ＤＮＡ集団を合成した。１．５ｍｌのエッペンドルフ微
量遠心チューブに、約１μｌのｃＤＮＡ集団、５μｌの
５′増幅プライマー２０μＭ溶液、５μｌの３′増幅プ
ライマー２０μＭ溶液、１０μｌの１０×ＰＣＲバッフ
ァー（５００ｍＭｋＣｌ，１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣ
ｌ（ｐＨ８．４ ２０℃で）、１４ｍＭ ＭｇＣｌ₂と
１ｍｇ／ｍｌゼラチン）１０μｌ ５ｍＭ各ｄＮＴＰ
（５ｍＭｄＡＴＰ，５ｍＭｄＣＴＰ，５ｍＭｄＧＴＰ及
び５ｍＭｄＴＴＰを含む）４μｌ２．５ユニット（標準
５００ユニット／ｍｌ 溶液を０．５μｌ）のＴａｑＤ
ＮＡ ポリメラーゼ（パーキンーエルマーシータス イ
ンストルメント）を混ぜて水７５．４μｌで希釈して容
量１００μｌにした。最終混合物に１００μｌパラフィ
ンオイルを上からのせた。最初９４℃９０秒鋳型を変性
し、５５°、７５秒で再アニールし、７２°、１５０秒
でｃＤＮＡを伸長させてＤＮＡ温度循環器（エリコッ
プ）を使用しＰＣＲを行った。ステッププログラム（９
４°、２５秒変性、５５°、４５秒アニーリング、７２
°、１５０秒伸長）を使用した増幅をさらに２５サイク
ル分ＰＣＲを行い、次に７２°で７分最終伸長をした。

【００９９】試料をフェノールークロロホルム抽出及び
Ｇ−５０（べーリンガーマンハイム）でのスパンカラム
クロマトグラフィーによりパラフィンオイルを除きＤＮ
Ａを抽出した。抽出ＤＮＡ１０μｌ画分を１％ Ｓｅａ
Ｋｅｍ^TMアガロース（ＦＭＣバイオプロダクト ロック
ランド、ＭＥ）上で電気泳動により分離し、臭化エチジ
ウムで染色し、ＤＮＡ断片サイズが予測された産物と同
一であることを確認した。

【０１００】ＰＣＲ増幅ｃＤＮＡ産物をその後エッペン
ドルフ微量遠心で、最高速度で２０分遠心して濃縮し、
その後１／１０容酢酸ナトリウム（３Ｍ）と２．５容量
エタノール中でエタノール沈澱を行った。５０μｌの濃
縮物をＳａｌIとＮｏｔI制限酵素で標準的方法を使用し
て消化した。ＳａｌI／ＮｏｔI制限酵素断片をその後、
１．２％ＬＧＴアガロースゲルで分離し、断片にあたる
バンドを単離した。制限酵素断片はその後単離したバン
ドから以下の凍結融解法を用いて精製した。ゲルからの
バンドを２つの１７５μｌの断片に分けて１．５ｍｌエ
ッペンドルフ微量遠心チューブにいれた。５００μｌの
分離バンド（０．１５Ｍ ＮａＣｌ １０ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ，ｐＨ８．０ １ｍＭ ＥＤＴＡ）を各チューブに加
え６８℃でゲルが溶けるまでチューブを熱した。そして
ドライアイスで１０分ゲルを凍結し、室温で融解し、４
℃で３０分遠心した。次に上清をとって新しいチューブ
に移し、２ｍＬエタノールに懸濁し、４℃でさらに３０
分遠心してＤＮＡ沈澱を生じさせた。ＤＮＡ沈澱を７０
％エタノールで洗い５分遠心チューブからエタノールを
除き、２０μｌＴＥバッファーに再び懸濁した。

【０１０１】得られた精製済制限酵素断片をその後ｐＤ
Ｃ４０６ベクターにライゲーションした。ライゲーショ
ン試料をＤＨ５αに形質転換し、コロニーを正しいプラ
スミドであるかチェックするために解析した。ベクター
はＣＯＳ−７細胞にトランスフェクトし、実施例１に前
述したように発現された。

【０１０２】

【実施例５】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ結合研究 上の実施例１で述べたように発現、及び精製された組換
えヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの結合阻害定数は、様々
な濃度の競合物質（ＩＲ−１β又はＩＬ−１α）を一定
量のラジオラベルしたＩＬ−１β又はＩＬ−１αとタイ
プＩＩ ＩＬ−１Ｒを発現している細胞とインキュベー
トする阻害結合アッセイによって決定された。競合物質
は受容体に結合し、ラジオラベルしたリガンドが受容体
に結合するのを阻害する。結合アッセイは、大体ドーハ
ーら（Ｄｏｗｅｒ ｅｔ ａｌ．），Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ
ｌ．１３２：７５１，１９８４とパークら（Ｐａｒｋ
ｅｔ ａｌ．）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１
７７，１９８６に記載されているようにフタル酸油分離
法により行われた。簡単にいうと、ＣＶ１／ＥＢＮＡ細
胞を６ーウェル皿（コスター（Ｃｏｓｔａｒ）ケンブリ
ッジ，ＭＡ）で４℃で２時間¹²⁵Ｉ−ＩＬー１βと１ｍ
ｌ・結合培地（ローズウェルパーク メモリアル イン
スティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地で、２％ＢＳ
Ａ，２０ｍＭＨｅｐｅｓ バッファー０．２％アジ化ナ
トリウムｐＨ７．２を含む）中でインキュベートした。
アジ化ナトリウムは３７℃で¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１が細胞に
より取り込まれて分解されることを阻害するために含ま
れる。プレートを回転振とう機で３７℃で１時間インキ
ュベートした。そしてインキュベーションした混合物の
複数の画分をジブチルフタル酸１．５，ビス（Ｓ−エチ
ルヘキサル）フタル酸１の割合からなるフタル酸油性混
合物を含むポリエチレン遠心チューブに移した。１００
×過剰モルの未ラベルＩＬ−１βを含むコントロールチ
ューブも、非特異的結合を決めるために含めた。結合
¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１のある細胞をエッペンドルフ微量遠心
で１５０００×ｇで５分遠心し結合していない¹²⁵Ｉ−
ＩＬ−１から分離した。細胞に結合した放射活性をガン
マ計数計で決定した。このアッセイ（タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒへの¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βの結合をラベルしないヒ
トＩＬ−１βを競合物として使用して阻害する）は、全
長ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１ＲはＫ_I1は約１９±８×１
０⁹、Ｋ_I2は約０．２±０．００２×１０⁹という２相的
なＩＬ−１βへの結合を示すことを示唆した。¹²⁵Ｉ−
ＩＬ−１αのタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒへの結合を阻害す
るのにラベルしていないヒトＩＬ−１βを使用すると、
全長ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１ＲはＫ_I1は約２．０±１
×１０⁹およびＫ₁₂は約０．０１３±０．００３×１０⁹
という２相的なＩＬ−１βへの結合を示した。

【０１０３】上の実施例２で述べたように発現及び精製
された溶解性ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの結合阻害定
数は、様々な濃度のＩＬ−１β競合物を一定量のラジオ
ラベルしたＩ−ＩＬ−１βとタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを
発現しているＣＢ２３細胞（エプシュタイン バーウィ
ルス トランスフォームド・コード・血球Ｂリンパ細胞
系統）とインキュベートする阻害結合アッセイによって
決定された。結合アッセイもまたドーワーら．，Ｊ．Ｉ
ｍｍｕｎｏｌ １３２：７５１，１９８４及びパークら
Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６１：４１７７に記載され
ているようにフタル酸油性分離法により行われた。簡単
にいうと、ＣＯＳ−７細胞を上記の溶解性ヒトタイプＩ
Ｉ ＩＬ−１ＲをコードするｃＤＮＡを含むｐＤＣ４０
６発現ベクターでトランスフェクトした。ＣＯＳ細胞か
らの上清をトランスフェクション後３日培養し、続けて
結合培地 （ローズウェル パーク メモリアルインス
ティチュート（ＲＰＭＩ）１６４０培地で２％ＢＳＡ，
２０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ バッファーと０．２％アジ化ナ
トリウム ｐＨ７．２を含む）で、６ウェル皿内で５０
μｌ／ウェルの容量になるように希釈した。上清を５０
μｌの９×１０^-10Ｍ¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βと２．５×１０
⁶ＣＢ２３細胞と共に、８℃で２時間振とうしながらイ
ンキュベートした。インキュベーション混合物の２つず
つとった６０μｌ画分を、ジブチルフタル酸１．５，ビ
ス（Ｓ−エチルヘキサル）フタル酸１の割合からなるフ
タル酸油性混合物を含むポリエチレン遠心チューブに移
した。３×１０^-6Ｍの未ラベルＩＬ−１βを含む陰性コ
ントロールチューブも非特異的結合を決めるために含み
（１００％阻害）ラジオラベルしたＩＬ−１βのみと共
に５０ｍｌ結合培地を含む陽性コントロールチューブ
は、最大限の結合を決めるために含めた。結合¹²⁵Ｉ−
ＩＬ−１のある細胞をエッペンドルフ微量遠心で１５，
０００Ｘｇで５分遠心し結合していない¹²⁵Ｉ−ＩＬ−
１から分離した。結合していない¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１βを
含む上清を捨て、細胞を注意深く、氷冷した結合培地で
リンスした。細胞をその後トリプシンーＥＤＴＡ１ｍｌ
中で３７℃１５分インキュベートし、細胞を培養した。
細胞の放射活性はガンマ計数計で決定した。このアッセ
イ（¹²⁵Ｉ−ＩＬー１βの結合を溶解性ヒトタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒを使って阻害する）は、溶解性ヒトタイプ
ＩＩ ＩＬ−１Ｒは約３．５×１０⁹Ｍ^-1のＫ_Iをもつこ
とを示した。同様の方法を用いて溶解性ヒトタイプＩＩ
ＩＬ−１ＲによるＩＬ−１αの結合の阻害により、溶解
性ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒは１．４×１０⁸Ｍ^-1の
Ｋ_Iをもつことが示された。

【０１０４】マウスタイプＩＩ ＩＬ−１ＲはＫ_I1０．
８×１０⁹およびＫ_I2０．０１×１０⁹未満の２相的ＩＬ
−１βへの結合を示した。

【０１０５】

【実施例６】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ アフィニィティ
ークロスリンキング研究 アフィニィティクロスリンキング研究を、パークら、Ｐ
ｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓａｉ．ＵＳＡ ８４：
１６６９ １９８７に記載してあるように行った。この
アッセインに用いられている組換えヒトＩＬ−１α及び
ＩＬ−１βは既に記載されているように発現精製し、ラ
ベルを行った。（ドーワーら，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１
６２：５０１，１９８５；ドーワーら，Ｎａｔｕｒｅ
３２４：２６６，１９８６），組換えヒトＩＬ−１受容
体アンタゴニスト（ＩＬ−１ｒａ）を、アイゼンバーグ
ら（Ｅｉｓｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．）Ｎａｔｕｒｅ
３４３：３４１，１９９０）に公表されているｃＤＮＡ
配列を用いてクローン化し、ＣＯＳ細胞に一時的にトラ
ンス・フェクションをして発現させ、ドーワーら，Ｊ．
Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３：４３１４，１９８９に記載さ
れているように、親和ゲルに結合した溶解性ヒトタイプ
I ＩＬ−１Ｒのカラムでのアフィニィティークロマト
グラフィーにより精製し、低ｐＨで溶出した。

【０１０６】簡単にいうと、組換えタイプＩＩ ＩＬ−
１Ｒを発現しているＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞（４×１０⁷
／ｍｌ）を¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１α又は¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１β
（１ｎＭ）と４℃で、特異性コントロールとして１μＭ
の過剰のラベルしていないＩＬ−１存在及び非存在下
で、２時間インキュベートした。細胞をその後洗って、
ビス（スルフォサクシニミジル）スベラートを最終濃度
０．１ｍｇ／ｍｌになるように加えた。３０分２５℃に
置いた後、細胞を洗い、２ｍＭロイペプチン、２ｍＭ０
−フェナントロリン、及び２ｍＭＥＧＴＡをタンパク分
解を防ぐために含む１００μｌのリン酸緩衝塩溶液（Ｐ
ＢＳ）／１％トライトンに再び懸濁した。等量（ＣＰ
Ｍ）の¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１と等容の特異性コントロールを
含む抽出上清画分を標準的技術を用いて１０％ゲルでＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥにより解析した。

【０１０７】第４図は、ラジオラベルしたＩＬ−１α及
びＩＬ−１βを用いて、上記されているように行われ
た、天然の対照物に対する、天然及び組換え型マウス及
びヒトタイプＩＩＬ−１受容体と、組換えマウス及びヒ
トタイプＩＩ ＩＬ−１受容体タンパク質の大きさ比較
のためのアフィニィティ クロスリンキング研究の結果
を示している。通常、組換えタンパク質は恐らくＣＶ１
／ＥＢＮＡ細胞で過剰発現したときの糖鎖型の違いの結
果として少し速く、少し広いバンドとして移動するが一
時的に発現した組換え受容体の大きさは天然の受容体に
類似している。この結果から、タイプＩＩ ＩＬ−１受
容体はタイプIＩＬ−１受容体より小さいことも示され
た。特定の組合せ（ＩＬー１βと天然ヒトタイプI受容
体）は特異的クロスリンキング産物を生じることがなか
った。約等量のラベルを各々の実験レーンにのせている
ので、ゲルの底部の未結合のリガンドバンドの強度によ
って示されているように、この組合せは比較的弱くクロ
スリンクしていると強く予想される。¹²⁵Ｉ−ＩＬ−１
αとクロスリンクした天然型ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１
受容体発現細胞を示しているレーンは、天然型と組換え
タイプI受容体との複合体のサイズ範囲（Ｍｒ＝１０
０，０００）に構成成分があらわれている。このような
複合体は、組換えタイプＩＩ ＩＬ−１受容体を含むレ
ーンでは検出されないが、恐らく、ＣＢ２３細胞は微量
のタイプIＩＬ−１受容体ｍＲＮＡを含んでいるので、
タイプIＩＬ−１受容体がＣＢ２３細胞で低いレベルに
発現している結果であると思われる。

【０１０８】

【実施例７】タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒのモノクローナル
抗体の調製 精製した組換えタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ、例えばヒトタ
イプＩＩ ＩＬ−１Ｒあるいは、タイプＩＩ ＩＬ−１
Ｒを高レベル発現するトランスフェクトしたＣＯＳ細胞
の調製を行い、通例の技術、例えば米国特許４，４１
１，９９３号明細書に開示されているような技術を用い
て、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒに対するモノクローナル抗
体を作成する。この抗体は、ＩＬ−１がタイプＩＩ Ｉ
Ｌ−１Ｒに結合するのを妨害する点、例えばＩＬ−１の
毒性や他の望ましくない効果を改良するという点、ＩＬ
ー１又は溶解性タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒの診断及び研究
用アッセイの成分として、有用であると予測される。

【０１０９】マウスを免疫するため、タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒ免疫源を完全フロイント（Ｆｒｅ，ｕｎｄ’ｓ）
アジュバント（ａｄｊｕｖａｎｔ）に懸濁し、１０〜１
００μｇの幅の量を皮下に腹膜間にＢａｌｂ／ｃマウス
に注射した。１０〜１２日後、免疫された動物に不完全
フロイントアドジュバントに懸濁した追加免疫源であと
押ししその後一週から２週の免疫化スケジュールで周期
的に、あと押しした。血清試料を周期的に、後方眼窩の
出血あるいは尾端切開によって採取し、ドットブロット
アッセイ（抗体サンドイッチ）又はＥＬＩＳＡ（酵素リ
ンクイムノソルベントアッセイ）又は受容体結合阻害に
より検査する。他のアッセイ法も適用できる。適当な抗
体価の検出に続き、陽性動物に塩水中の抗原の静脈注射
をする。３〜４日後、動物を犠牲にし、ヒ臓細胞を培養
し、マウスミエローマ細胞系統ＮＳ１又はＡｇ８．６５
３と融合する。この方法により得たハイブリドーマ細胞
系統をＨＡＴ選択培地（ヒポキサンチン、アミノプテリ
ン、チミジン）の複数マイクロタイタープレートにプレ
ートし、非融合細胞、ミエローマ ハイブリッド、ヒ臓
細胞ハイブリッドの増殖を阻止する。

【０１１０】このように作られたハイブリドーマクロー
ンを、タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒへの反応性を、例えばエ
ンバルら（Ｅｎｇｖａｌｌ ｅｔ ａｌ．）Ｉｍｍｕｎ
ｏｃｈｅｍ．８：８７１（１９７１）及び米国特許４，
７０３，００４号明細書に開示されている技術の適用に
よりＥＬＩＳＡでスクリーンすることが可能である。陽
性クローンをそして同系Ｂａｌｂ／ｃマウスの腹腔に注
射して高濃度（＞１ｍｇ／ｍｌ）の抗タイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒモノクローナル抗体を含む腹水を作成したり、フ
ラスコや、回転ボトルで増殖させる。生じたモノクロー
ナル抗体は、硫安沈澱後ゲルろ過クロマトグラフィー、
及び／又は、スタフィロコッカスアウレウス（Ｓｔａｐ
ｈｙｌｏｃｏｃｕｕｓ ａｕｒｅｕｓ）のプロテインＡ
又はストレプトコッカス属のプロテインＧへの抗体の結
合に基づくアフィニティークロマトグラフィーによって
精製することができる。

【０１１１】

【配列表の簡単な説明】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１とＳＥ
Ｑ ＩＤ ＮＯ：２はヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒのヌ
クレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配列に
コードされている成熟ペプチドはアミノ酸１ー３８５と
定められた。予想されるシグナルペプチドはアミノ酸−
１３から−１と定められている。予想される膜貫通領域
はアミノ酸３３１から３３５と示されている。

【０１１２】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３−ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：６は全長ヒトタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒをクローン
化するのに用いた様々なオリゴヌクレオチドである。

【０１１３】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７からＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：８は溶解性ヒトタイプＩＩＩＬ−１Ｒをポリメ
ラーゼ鎖反応（ＰＣＲ）により作成するのに用いたオリ
ゴヌクレオチドプライマーである。

【０１１４】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９−ＳＥＱ ＩＤ
ＮＯ：１１は全長の及び溶解性マウスタイプＩＩ ＩＬ
−１Ｒｓをクローン化するのに用いたオリゴヌクレオチ
ドプライマーである。

【０１１５】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２及びＳＥＱ Ｉ
Ｄ ＮＯ：１３は、全長マウスタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
のヌクレオチド配列と予想アミノ酸配列を示す。この配
列にコードされている成熟ペプチドは、アミノ酸１ー３
９７と定められた。予想されるシグナルペプチドはアミ
ノ酸−１３から−１と定められた。予想される膜貫通領
域はアミノ酸３４３ー３６８と示されている。

【０１１６】ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４は溶解性マウス
タイプＩＩ ＩＬ−１Ｒを作成するのに使用したオリゴ
ヌクレオチドプライマーである。

【０１１７】

【配列表】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の情報 （i）配列の性質 （Ａ）長さ：１３５７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：２本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ （iii）仮定：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （vi）根源的起源 （Ａ）生物：ホモ サピエンス （Ｇ）細胞タイプ：ヒトＢ細胞リンパ胸線 （Ｈ）細胞系統：ＣＢ２３ （vii）直接的起源 （Ａ）ライブラリー：ＣＢ２３ ｃＤＮＡ （Ｂ）クローン：ｐＨｕＩＬ−１ＲＩＩ７５ （ix）特徴 （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：１５４．．１３５０ （Ｄ）他の情報： （ix）特徴： （Ａ）名前／キー：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：１９３．．１３４７ （Ｄ）他の情報： （ix）特徴： （Ａ）名前／キー：ｓｉｇ ペプチド （Ｂ）位置：１５４．．１９２ （Ｄ）他の情報： （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１： 配列

【０１１８】

【化６】

【０１１９】

【化７】

【０１２０】

【化８】

【０１２１】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：３９８アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２： 配列

【０１２２】

【化９】

【０１２３】

【化１０】

【０１２４】 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：２４塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３： 配列 ＴＣＧＡＣＴＧＧＡＡ ＣＧＡＧＡＣＧＡＣＣ ＴＧＣＴ ２４ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｙ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４： 配列 ＧＡＣＣＴＴＧＣＴＣ ＴＧＣＴＧＧＡＣＧＡ ２０ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５： 配列 ＣＴＧＴＴＧＧＧＣＴ ＣＧＣＧＧＴＴＧＡＧ ＧＡＣＡＡＡＣＴＣＴ ＴＣＧＣＧＧＴＣＴＴ ＴＣＣＡＧＴ ４６ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：４６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｙ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６： 配列 ＧＡＣＡＡＣＣＣＧＡ ＧＣＧＣＣＡＡＣＴＣ ＣＴＧＴＴＴＧＡＧＡ ＡＧＣＧＣＣＡＧＡＡ ＡＧＧＴＣＡ ４６ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：２９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）仮定：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７： 配列 ＧＣＧＴＣＧＡＣＣＴ ＡＧＴＧＡＣＧＣＴＣ ＡＴＡＣＡＡＡＴＣ ２９ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：３３塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８： 配列 ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ ＴＣＡＧＧＡＧＧＡＧ ＧＣＴＴＣＣＴＴＧＡ ＣＴＧ ３３ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：３７塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９： 配列 ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ ＴＴＴＴＴＴＴ ３７ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：２８塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０： 配列 ＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧ ＣＡＡＧＡＡＧＣＡＧ ＣＡＡＧＧＴＡＣ ２８ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：２０塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１： 配列 ＣＴＧＣＡＧＧＣＧＧ ＣＣＧＣＧＧＡＴＣＣ ２０ （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：１３６６塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：２本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ｍＲＮＡに対するｃＤＮＡ （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （vi）根源的起源 （Ａ）生物：マウス （Ｈ）細胞系統：７０Ｚ／３ （vii）直接的起源 （Ａ）ライブラリー：７０Ｚ／３ （Ｂ）クローン：１２ （ix）特徴： （Ａ）名前／キー：ＣＤＳ （Ｂ）位置：８５．．１３１７ （Ｄ）他の情報： （ix）特徴： （Ａ）名前／キー：ｍａｔ ペプチド （Ｂ）位置：１２４．．１３１４ （Ｄ）他の情報： （ix）特徴： （Ａ）名前／キー：ｓｉｇ ペプチド （Ｂ）位置：８５．．１２３ （Ｄ）他の情報： （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２： 配列

【０１２５】

【化１１】

【０１２６】

【化１２】

【０１２７】

【化１３】

【０１２８】（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：４１０アミノ酸 （Ｂ）タイプ：アミノ酸 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：タンパク質 （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３： 配列

【０１２９】

【化１４】

【０１３０】

【化１５】

【０１３１】 （１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４の情報 （i）配列の性質： （Ａ）長さ：３９塩基対 （Ｂ）タイプ：核酸 （Ｃ）鎖：１本 （Ｄ）形態：線状 （ii）分子タイプ：ＤＮＡ（ゲノム） （iii）ハイポセティカル：Ｎ （iv）アンチーセンス：Ｎ （xi）配列の記載：ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４： 配列 ＧＣＧＣＧＧＣＣＧＣ ＣＴＡＧＧＡＡＧＡＧ ＡＣＴＴＣＴＴＴＧＡ ＣＴＧＴＧＧ ３６

【図面の簡単な説明】

【図１】図１は、発現プラスミドｐＤＣ４０６の概要図
である。Ｓａｌ部位に挿入されたｃＤＮＡ分子は、ＨＩ
Ｖ及びアデノウイルスから得られた制御因子を用いて転
写、翻訳される。ｐＤＣ４０６はＳＶ４０，エプシュタ
インーバー（Ｅｐｓｔｅｉｍ−Ｂａｒｒ）ウイルス及び
ｐＢＲ３２２由来の複製開始点を含む。

【図２】図２は、ヒト及びマウスタイプＩＩ ＩＬ−１
受容体と、配列決定に用いた様々なヒト及びマウスのク
ローンの概要図である。細い線は、非翻訳領域を示し、
コード領域は四角で描かれている。シグナルペプチドを
コードする部分は塗りつぶしてある。膜貫通部分は交差
斜線で網かけしてある。そして、細胞内タンパク質は点
描している。Ｎ結合糖鎖付加サイトの可能性がある部分
は、逆向き三角形で示している。イムノグロブリン様の
ジスルフィド結合は、２つのイオウ分子をつなぐ点線で
示している（Ｓ．．．．．Ｓ）。

【図３】図３は、ヒト及びマウスタイプＩＩ ＩＬ−１
受容体のアミノ酸配列（ｃＤＮＡクローンから得られた
もの）を、ヒト及びマウスタイプIＩＬ−１受容体のア
ミノ酸配列（シムス（Ｓｉｍｓ）ら．，Ｐｒｏｃ．Ｎａ
ｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：８９４６，１
９８９；シムスら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４１：５８５、
１９８８）およびＳＴ２細胞遺伝子のアミノ酸配列（ト
ミナガ，ＦＥＢＳＬｅｔｔ．２５８；３０１，１９８
９）及びヴァシニアウイルスのＢ１５Ｒオープンリーデ
ィングフレーム（スミスとチャン（Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ
Ｃｈａｎ），Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ ７２：
５１１，１９９１）と比較した図である。番号は開始メ
チオニンからつけている。各配列中のシグナルペプチド
切断予想位置は、フォンハイネ（ｖｏｎ Ｈｅｉｊｎ
ｅ），Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．１４：４６８
３，１９８６）で述べられた方法に従って決定されてお
り、シグナルペプチドと予想される部分と、タンパク質
の本体の間の空白で示している。タイプＩＩ ＩＬ−１
受容体の予想される膜貫通領域と細胞内領域は、最下段
に示しており、間に空白を入れて分離している。すべて
の４つのＩＬ−１受容体配列に保存されている残基は黒
地に白ヌキで示している。互いのタイプＩＩ受容体で保
存されている残基は影がつけてあり、互いのタイプIＩ
Ｌ−１受容体で保存されている残基は四角でかこんでい
る。イムノグロブリン構造に特徴的なジスルフィド結合
を形成すシステイン残基には、黒丸で印をつけており、
タイプIＩＬ−１受容体における２つの余分のシステイ
ンの組と、他の配列のいくつかのシステインは星印で示
している。ドメイン１、２及び３の適当な境界は各行の
上に示してある。タイプＩＩ ＩＬ−１受容体において
予想されるシグナルペプチド切断はＡｌａ１３の後ろで
あり、通常みられない短いシグナルペプチドを生じ、切
断後のヒトあるいはマウスタイプIＩＬ−１受容体のＮ
端の相当する位置よりも、１２（ヒト）又は２３（マウ
ス）アミノ酸だけ長いＮ端が生じる。マウスタイプＩＩ
ＩＬ−１受容体の、他の、より好ましくないが起こり
うる切断部位は、Ｔｈｒ１５又はＰｒｏ１７の後ろであ
る。この配列のならびは手で行っており、配列の客観的
に最適のならびは示していない。ヒト及びマウスタイプ
ＩＩ ＩＬ−１受容体ｃＤＮＡの全長と可溶性のヌクレ
オチドとアミノ酸配列もまた、この中で、配列表に示し
ている。

【図４】図４は、クロスリンクしたＩＬ−１受容体のＳ
ＤＳ／ＰＡＧＥゲルのオートラジオグラフである。ＩＬ
−１受容体を発現している細胞は、同種のラベルされて
いないＩＬ−１競合物の非存在下、又は存在下で¹²⁵Ｉ
−ＩＬ−１とクロスリンクされ、抽出、電気泳動され、
実施例６で述べたようにオートラジオグラフが行われ
た。組換え受容体はＣＶ１／ＥＢＮＡ細胞で一時的に発
現された。天然の受容体とのクロスリンキングのために
用いた細胞系は、ＫＢ（ＡＴＣＣＣＣＬ１７１７）（ヒ
トタイプIＩＬ−１Ｒ用）、ＣＢ２３（ヒトタイプＩＩ
ＩＬ−１Ｒ用）、ＥＬ４（ＡＴＣＣ ＴＩＢ３９）
（ネズミタイプIＩＬ−１Ｒ用）及び７０Ｚ／３（ＡＴ
ＣＣ ＴＩＢ１５８）（ネズミタイプＩＩ ＩＬ−１Ｒ
用）である。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 37/06 Ａ６１Ｐ 37/06 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/28 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ // Ｃ１２Ｐ 21/08 15/00 ＺＮＡＣ (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (Ｃ１２Ｎ 15/02 ＺＮＡ Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者 デービッド・ジョン・コスマン アメリカ合衆国ワシントン州98110，バイ ンブリッジ・アイランド，ノース・イース ト・エウィング・ストリート 10129 (72)発明者 スティーブン・ディー・ラプトン アメリカ合衆国ワシントン州98115，シア トル，サンドポイント・ウェイ・ノース・ イースト 7323，ナンバー 211 (72)発明者 ブルース・モスレイ アメリカ合衆国ワシントン州98125，シア トル，サーティシックスス・アベニュー・ ノース・イースト 11311 (72)発明者 スティーブン・ケイ・ドゥワー アメリカ合衆国ワシントン州98052，レッ ドモント，イースト・レイク・サマミッシ ュ・パークウェイ・ノース・イースト 2620

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経
   口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記
   ポリペプチドは以下の： ａ）配列番号２のアミノ酸１ないし３３３を含むポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ； ｂ）配列番号２のアミノ酸−１３ないし３３３を含むポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ； ｃ）配列番号２のアミノ酸−１３ないし３８５を含むポ
   リペプチドをコードするＤＮＡ； ｄ）配列番号２のアミノ酸１ないし３８５を含むポリペ
   プチドをコードするＤＮＡ； ｅ）配列番号１３のアミノ酸１ないし３４５を含むポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ； ｆ）配列番号１３のアミノ酸−１３ないし３４５を含む
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ； ｇ）配列番号１３のアミノ酸−１３ないし３９７を含む
   ポリペプチドをコードするＤＮＡ； ｈ）配列番号１３のアミノ酸１ないし３９７を含むポリ
   ペプチドをコードするＤＮＡ； ｉ） ａ）ないしｈ）のＤＮＡに中程度にストリンジェ
   ントな条件下（５０℃、２×ＳＳＣ）でハイブリダイゼ
   ーションすることが可能なＤＮＡの相補体であり、かつ
   生物学的に活性なポリペプチドをコードするＤＮＡ；お
   よび ｊ） ａ）ないしｉ）で定義されたＤＮＡに遺伝子コー
   ドの結果として縮重するＤＮＡ からなるグループから選択されるＤＮＡによってコード
   される、前記薬剤組成物。
2. 【請求項２】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経
   口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記
   ポリペプチドは配列番号２のｘないしｙの配列を含み、
   前記ｘは配列番号２のアミノ酸−１３又は１であり、そ
   してｙはアミノ酸３３０ないし３３３のいずれかであ
   る、前記薬剤組成物。
3. 【請求項３】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経
   口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記
   ポリペプチドは、以下の ａ）配列番号１のヌクレオチド１５４ないし１１９１ ｂ）配列番号１のヌクレオチド１９３ないし１１９１ ｃ）配列番号１のヌクレオチド１５４ないし１３４７ ｄ）配列番号１のヌクレオチド１９３ないし１３４７ ｅ）配列番号１２のヌクレオチド１２４ないし１１５８ ｆ） ａ）ないしｅ）で定義されたＤＮＡに遺伝子コー
   ドの結果として縮重するＤＮＡ からなるグループから選択されるＤＮＡによってコード
   される、前記薬剤組成物。
4. 【請求項４】配列番号２のアミノ酸１−３３３を含む、
   有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含
   む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経口適用に適
   した薬剤組成物。
5. 【請求項５】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経
   口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて、前
   記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１ないしｙを含
   み、ｙは配列番号２のアミノ酸３３０ないし３３３のい
   ずれかである、前記薬剤組成物。
6. 【請求項６】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、免疫反応制御のためのヒト患者への非経
   口適用に適した薬剤組成物であって、ここにおいて前記
   ポリペプチドは、配列番号１のヌクレオチド１５４ない
   し１１９１を含むＤＮＡに中程度にストリンジェントな
   条件下（５０℃、２×ＳＳＣ）でハイブリダイゼーショ
   ンすることが可能なＤＮＡの相補体であるＤＮＡによっ
   てコードされ、かつ、ＩＬ−１に結合することが可能で
   あるポリペプチドである、前記薬剤組成物。
7. 【請求項７】配列番号２のアミノ酸１−３３３を含む、
   有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又は担体を含
   む、リウマチ様関節炎治療のためのヒト患者への非経口
   適用に適した薬剤組成物。
8. 【請求項８】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、リウマチ様関節炎治療のためのヒト患者
   への非経口適用に適した薬剤組成物であって、ここにお
   いて、前記ポリペプチドは配列番号２のアミノ酸１ない
   しｙを含み、ｙは配列番号２のアミノ酸３３０ないし３
   ３３のいずれかである、前記薬剤組成物。
9. 【請求項９】有効量のポリペプチド及び適当な希釈剤又
   は担体を含む、リウマチ様関節炎治療のためのヒト患者
   への非経口適用に適した薬剤組成物であって、ここにお
   いて前記ポリペプチドは、配列番号１のヌクレオチド１
   ５４ないし１１９１を含むＤＮＡに中程度にストリンジ
   ェントな条件下（５０℃、２×ＳＳＣ）でハイブリダイ
   ゼーションすることが可能なＤＮＡの相補体であるＤＮ
   Ａによってコードされ、かつ、ＩＬ−１に結合すること
   が可能であるポリペプチドである、前記薬剤組成物。