JP2000344800A - フルシトリネートの抗体及び測定方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】 本発明は、フルシトリネートに反応する新規
な抗体もしくはそのフラグメント、及びその製造方法を
提供することを課題とする。また、本発明は、フルシト
リネートの免疫学的測定方法を提供することを課題とす
る。 【解決手段】 本発明の抗体は、２−（４−ジフルオロ
メトキシフェニル）−３−メチル酪酸をハプテンとし
て、適当な高分子化合物又は標識物質と結合させたもの
を抗原として用いることによって得ることができる。こ
の抗体を用いてフルシトリネートを免疫学的に測定する
ことができる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、（ＲＳ）−α−シ
アノ−３−フェノキシベンジル （ｓ）−２−（４−ジ
フルオロメトキシフェニル）−３−メチルブチレート
（以下、「フルシトリネート」という）の抗原、抗体及
びそのフラグメントならびにそれらの製造方法に関す
る。また、本発明は、前記の抗原、抗体及びそのフラグ
メントを用いた免疫学的測定方法に関する。

【０００２】

【従来の技術】フルシトリネートは、式（２）

【０００３】

【化３】

【０００４】で表され、天然ピレスロイドの構造を改変
することにより得られた合成ピレスロイドの一つで、昆
虫の神経系のすべてに作用し、Ｎａチャンネルの働きを
乱すことにより神経刺激の軸索伝導が阻害され、殺虫力
が発揮される。その殺虫スペクトルは広範で、水田用、
家庭園芸、果樹、野菜などを害する、りんし目、半し
目、甲虫目、アザミウマなどの広範な害虫に対して有効
である。また、安定性、耐雨性に富み、天然ピレスロイ
ドの欠点であった残効性が高められている（農薬ハンド
ブック、第８２頁及び第９６頁、１９９４年版、日本植
物防疫協会）。

【０００５】近年、土壌、水、大気などの環境中での残
留農薬や、最近特に増加してきた輸入農産物に残留する
ポストハーベスト農薬に代表される食品における農薬残
留に、大きな社会的関心が寄せられている。フルシトリ
ネートについては、食品衛生法に基づく残留農薬基準値
が、米・そば・ライ麦を除く穀類（０．０５〜０．２０
ｐｐｍ）、豆類・果実・野菜（０．０５〜２．０ｐｐ
ｍ）、オイルシード（０．０５〜２．０ｐｐｍ）、ナッ
ツ類（２．０ｐｐｍ）、茶（２０ｐｐｍ）、ホップ（１
０ｐｐｍ）などに定められている（最新農薬の規制・基
準値便覧、第１４８頁、１９９５年版、日本植物防疫協
会）。従って、環境中やこれらの食品に残留するフルシ
トリネート量の迅速かつ正確な測定が望まれている。

【０００６】従来、例えば農産物中のフルシトリネート
は、抽出・精製後ガスクロマトグラフィー（ＧＣ）によ
り分析されてきた。即ち、例えば、対象農産物からアセ
トンで抽出し、多孔性ケイソウ土カラムクロマトグラフ
ィーやフロリジルカラムクロマトグラフィーを経て精製
後、ＧＣで測定する方法などが採用されてきた（最新農
薬の残留分析法、第３１１〜３１３頁、中央法規出
版）。ＧＣによる分析は、精度の点で問題ないものの、
試料の調製が煩雑で多くの手順と時間を要し、分析に熟
練が必要なこと、並びに測定装置や設備などに高額の費
用を必要とするなどの問題点があった。フルシトリネー
トの測定は、短時間で多数の農産物について行う必要が
あり、その精度ばかりでなく、簡便性、迅速性及び経済
性をも具備した新規測定方法が要望されてきた。

【０００７】一方、近年、このような農薬の測定に、高
価な設備を必要とせず簡便かつ迅速に測定可能な免疫学
的測定方法が応用されるようになってきた。フルシトリ
ネート以外のピレスロイド系殺虫剤については、すでに
例えばＳ−ビオアレスリン（Wing, K. D. et al,26, 13
28 - 33, J. Agric. Food Chem.1978)、ペルメトリン
（Stanker, L. H.. et al,37, 834 - 9, J. Agric. Foo
d Chem.1989)、ピレトリン（Miyake, S. et al, 54, 18
9 - 94, Pestic. Sci. 1998)などで免疫学的測定法の開
発が行われた。しかし、フルシトリネートについては、
その必要性が非常に高かったにもかかわらず、適切な免
疫学的測定法はもとより、そのような測定法を構成する
ための抗体も得られていなかった。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】本発明は、フルシトリ
ネートに反応する新規な抗体もしくはそのフラグメン
ト、及びその製造方法を提供することを課題とする。
尚、本明細書において抗体の「フラグメント」とは、抗
原と結合可能な抗体の一部分、例えばＦａｂ断片などを
意味する。

【０００９】本発明は、また、式（１）

【００１０】

【化４】

【００１１】で表される２−（４−ジフルオロメトキシ
フェニル）−３−メチル酪酸と高分子化合物又は標識物
質との結合体を提供することを課題とする。

【００１２】本発明は、さらに、前記抗体又はそのフラ
グメントを産生するハイブリドーマを提供することを課
題とする。

【００１３】本発明は、さらにまた、前記抗体もしくは
そのフラグメント及び／又は前記２−（４−ジフルオロ
メトキシフェニル）−３−メチル酪酸と高分子化合物又
は標識物質との結合体を使用することを含む、フルシト
リネートの免疫学的測定方法を提供することを課題とす
る。

【００１４】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決するために鋭意研究を重ねた結果、フルシトリネ
ートの製造原料化合物である２−（４−ジフルオロメト
キシフェニル）−３−メチル酪酸をハプテンとして使用
することにより、フルシトリネートに反応性を有する抗
体が得られることを見い出した。本発明は斯かる知見に
基づいて完成されたものである。ここでいう「ハプテ
ン」とは、抗体との結合能を有しているものの、それ単
独では免疫原性を有さず、高分子化合物と結合すること
によって免疫原性を発現する物質を意味する。

【００１５】本発明の抗体は、例えば、２−（４−ジフ
ルオロメトキシフェニル）−３−メチル酪酸をハプテン
とし、これを適当な高分子化合物又は標識物質と結合さ
せたものを抗原として用いることによって得ることがで
きる。本発明の抗体は、フルシトリネートに反応性を有
する。

【００１６】本発明によれば、２−（４−ジフルオロメ
トキシフェニル）−３−メチル酪酸と高分子化合物又は
標識物質との結合体、フルシトリネートに反応する抗体
及びその製造方法、ならびに該結合体又は該抗体を用い
るフルシトリネートの免疫学的測定方法が提供される。

【００１７】

【発明の実施の形態】以下、本発明による免疫抗原の作
製方法、抗体の調製方法、モノクローナル抗体を産生す
るハイブリドーマの作製方法とモノクローナル抗体の調
製方法、免疫学的測定方法の順に説明する。尚、これら
は公知の方法、例えば続生化学実験講座、免疫生化学研
究法（日本生化学会編）などに記載の方法に従って行う
ことができる。

【００１８】式（１）で表される２−（４−ジフルオロ
メトキシフェニル）−３−メチル酪酸と高分子化合物と
の結合体の作製 式（１）で表される２−（４−ジフルオロメトキシフェ
ニル）−３−メチル酪酸は、フルシトリネートを製造す
るための原料として既に公知の化合物である。

【００１９】本発明では、式（１）で表される２−（４
−ジフルオロメトキシフェニル）−３−メチル酪酸をハ
プテンとして使用する。即ち、２−（４−ジフルオロメ
トキシフェニル）−３−メチル酪酸を適当な高分子化合
物に結合させてから免疫用抗原もしくは固相化抗原とし
て使用する。

【００２０】好ましい高分子化合物の例としては、スカ
シガイヘモシアニン、卵白アルブミン、ウシ血清アルブ
ミン、ウサギ血清アルブミン、ヒトイムノグロブリンＧ
などがある。

【００２１】２−（４−ジフルオロメトキシフェニル）
−３−メチル酪酸（以下「フルシトリネートハプテン」
という）と高分子化合物との結合は、例えば、混合酸無
水物法（Erlanger, B. F. et al,234, 1090 - 1094, J.
Biol. chem. 1954）、又は活性化エステル法（Karu,
A. E. et al,42, 301 - 309, J. Agric. Food Chem.199
4）などの公知の方法によって行うことができる。

【００２２】混合酸無水物法は一般に以下のように行う
ことができる。まず、フルシトリネートハプテンを有機
溶媒に溶解し、塩基性化合物の存在下にてハロ蟻酸エス
テルと反応させ、ハプテンの酸無水物を得る。これを高
分子化合物と反応させることにより目的とするフルシト
リネートハプテン−高分子化合物結合体が作製できる。
ここで使用する塩基性化合物としては、本反応において
慣用されている化合物を使用でき、例えば、トリブチル
アミン、トリエチルアミン、トリメチルアミン、Ｎ−メ
チルモルホリン、ピリジン、Ｎ，Ｎ−ジメチルアニリン
などが挙げられる。ハロ蟻酸エステルとしては、例えば
クロロ蟻酸メチル、ブロモ蟻酸メチル、クロロ蟻酸エチ
ル、ブロモ蟻酸エチル、クロロ蟻酸イソブチルなどが挙
げられる。また、有機溶媒としては、本反応に慣用され
ているいずれの溶媒も使用可能であり、例えばジオキサ
ン、ジエチルエーテル、テトラヒドロフラン、ジメトキ
シエタンなどのエーテル類、ジクロロメタン、クロロホ
ルム、ジクロロエタンなどのハロゲン化炭化水素類、ベ
ンゼン、トルエン、キシレンなどの芳香族炭化水素類、
酢酸メチル、酢酸エチルなどのエステル類、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、ヘキサメ
チルリン酸トリアミドなどの非プロトン性極性溶媒など
が挙げられる。

【００２３】フルシトリネートハプテンの酸無水物化
は、通常−２０〜５０℃、好ましくは０〜２０℃におい
て行われ、通常1時間以内に終了する。生成した酸無水
物と高分子化合物との反応は、通常０〜５０℃、好まし
くは０〜２０℃において行われ、通常１０時間以内に終
了する。反応物を、透析脱塩用のゲル濾過カラムクロマ
トグラフィーなどによって精製して、フルシトリネート
ハプテンと高分子化合物との結合体を得ることができ
る。

【００２４】一方、活性化エステル法は、一般に以下の
ように行うことができる。まず、フルシトリネートハプ
テンを有機溶媒に溶解し、カップリング剤の存在下にて
Ｎ−ヒドロキシこはく酸イミドと反応させ、Ｎ−ヒドロ
キシこはく酸イミド活性化エステルを生成させる。これ
を高分子化合物と反応させることにより目的とするフル
シトリネートハプテン−高分子化合物結合体が作製でき
る。

【００２５】カップリング剤としては、縮合反応に慣用
されてる通常のカップリング剤を使用でき、例えば、ジ
シクロヘキシルカルボジイミド、カルボニルジイミダゾ
ール、水溶性カルボジイミドなどが含まれる。有機溶媒
としては、例えば、ジメチルスルホキシド、Ｎ，Ｎ−ジ
メチルホルムアミド、ジオキサンなどが使用できる。反
応に使用するフルシトリネートとＮ−ヒドロキシこはく
酸イミドのモル比は前者：後者＝１：１０〜１０：１、
好ましくは前者：後者＝１：１である。反応は室温でよ
く、通常４時間以内に終了する。

【００２６】得られる反応液を、高分子化合物を溶解し
た溶液に加え、反応させることにより、両者の間に酸ア
ミド結合が生成される。反応温度は室温でよく、通常４
時間以内に終了する。反応物を、透析や脱塩用のゲル濾
過カラムクロマトグラフィーなどによって精製して、フ
ルシトリネートハプテンと高分子化合物との結合体を得
ることができる。

【００２７】また、上記と同様の方法により、酵素など
の標識物質をフルシトリネートハプテンに結合させたも
のを、免疫学的測定方法において使用することができ
る。標識物質としては、西洋わさびペルオキシダーゼ、
アルカリホスファターゼなどの酵素、フルオレセインイ
ソシアネート、ローダミンなどの蛍光物質、³²Ｐ、¹²⁵
Ｉなどの放射性物質、化学発光物質などが挙げられる。

【００２８】ポリクローナル抗体の作製 フルシトリネートハプテンと高分子化合物との結合体を
使用して、公知の方法により本発明のポリクローナル抗
体を作製することができる。

【００２９】本発明のポリクローナル抗体の調製は、常
法、例えば、続生化学実験講座５（日本生化学改編）に
記載の方法に従って行うことができる。

【００３０】以下、本発明のフルシトリネートに対する
ポリクローナル抗体の調製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００３１】本発明のポリクローナル抗体は、例えば
（ａ）免疫用抗原として使用するフルシトリネートハプ
テンと高分子化合物との結合体を作製し、次に（ｂ）動
物への免疫を行い、さらに（ｃ）血液の採取と抗血清の
調製を行えばよい。

【００３２】（ａ）の工程は上記した混合酸無水物法、
活性化エステル法いずれの方法においても行うことがで
きる。

【００３３】（ｂ）の工程においては、具体的にはフル
シトリネートハプテンとウサギ血清アルブミンの結合体
を、適当な生理的塩溶液、例えばリン酸緩衝液にてｐＨ
を７．４に調整した生理食塩水（以下、「ＰＢＳ」とい
う）に溶解し、フロイント完全アジュバント又は不完全
アジュバント、あるいはミョウバンなどの補助剤と混合
後、対象動物に免疫する。その際の投与法は、皮下注
射、腹腔内注射、静脈内注射、皮内注射、筋肉内注射の
いずれでもよく、皮下注射又は腹腔内注射が好ましい。
免疫は１回又は適当な間隔で、好ましくは１週間から５
週間の間隔で複数回行うのがよい。

【００３４】（ｃ）の工程は通常の抗血清の調製法でよ
く、これをこのまま抗フルシトリネートポリクローナル
抗体として使用できるが、さらに透析、硫酸アンモニウ
ムによる塩析、ゲル濾過、凍結乾燥などを行い、抗体画
分を集めることにより濃縮・精製することができる。ま
た、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーク
ロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー（ＨＰ
ＬＣ）などの慣用されている方法を組み合わせることに
より、さらに精製することができる。

【００３５】モノクローナル抗体の作製 フルシトリネートハプテンと高分子化合物との結合体を
免疫した動物の内、マウスを使用して、公知の方法によ
り本発明のモノクローナル抗体を作製することができ
る。

【００３６】モノクローナル抗体の製造にあたっては、
少なくとも下記のような工程が必要である。 （ａ）免疫用抗原として使用するフルシトリネートハプ
テンと高分子化合物との結合体の作製 （ｂ）動物への免疫 （ｃ）血液の採取と抗血清の調製、アッセイ、及び抗体
産生細胞の調製 （ｄ）ミエローマ細胞の調製 （ｅ）抗体産生細胞とミエローマ細胞との細胞融合と、
ハイブリドーマの選択的培養 （ｆ）目的とする抗体を産生するハイブリドーマのスク
リーニングと、細胞クローニング （ｇ）ハイブリドーマの培養又は動物へのハイブリドー
マの移植による、モノクローナル抗体の調製 本発明のモノクローナル抗体の調製は、常法、例えば、
続生化学実験講座５（日本生化学改編）に記載の方法に
従って行うことができる。

【００３７】以下、本発明のフルシトリネートに対する
モノクローナル抗体の調製方法を説明するが、これに制
限されないことは当業者によって明らかであろう。

【００３８】（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）の工程における
血液の採取と抗血清の調製は、ポリクローナル抗体の場
合と同様に行うことができる。

【００３９】（ｃ）の工程におけるアッセイは、下記の
免疫学的測定法を用いて行える。抗体産生細胞はリンパ
球であり、これは一般には脾臓、胸腺、リンパ節、抹消
血液又はこれらの組み合わせから得ることができるが、
脾細胞が最も一般的に用いられる。従って、最終免疫
後、抗体産生が確認されたマウスより抗体産生細胞が存
在する部位、例えば脾臓を摘出し、リンパ球（脾細胞）
を調製する。

【００４０】（ｄ）の工程に用いることができるミエロ
ーマ細胞としては、例えば、Ｂａｌｂ／ｃマウス由来骨
髄腫細胞株のＰ３／Ｘ６３−Ａｇ８（Ｘ６３）（Ｎａｔ
ｕｒｅ，２５６，４９５−４９７（１９７５））、Ｐ３
／Ｘ６３−Ａｇ８．Ｕ１（Ｐ３Ｕ１）（Ｃｕｒｒｅｎｔ
Ｔｏｐｉｃｓ．ｉｎ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ ａｎ
ｄ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ，８１， １−７（１９８
７））、Ｐ３／ＮＳＩ１Ａｇ ４−１（ＮＳ−１）（Ｅ
ｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏ．Ｍｅｔｈ．，３５，１−２１
（１９８０））、ＭＰＣ−１１、Ｘ６３．６５３、Ｓ１
９４などの骨髄腫株化細胞、あるいはラット由来の２１
０、ＲＣＹ３．Ａｇ １．２．３．（Ｙ３）（Ｎａｔｕ
ｒｅ．２７７，１３１−１３３，（１９７９））などが
ある。

【００４１】上述したミエローマ細胞をウシ胎児血清
（ＦＢＳ）を含むダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥ
Ｍ）又はイスコフ改変ダルベッコ培地（ＩＭＤＭ）など
で継代培養し、融合当日に約３×１０⁴個以上の細胞数
を確保する。

【００４２】（ｅ）の工程の細胞融合は公知の方法、例
えばミルスタイン（Ｍｉｌｓｔｅｉｎ）らの方法（Ｍｅ
ｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，７３，３
（１９８１）などに準じて行うことができる。現在最も
一般的に行われているのはポリエチレングリコール（Ｐ
ＥＧ）を用いる方法である。別の融合方法としては、電
気処理（電気融合）による方法を採用することもできる
（大河内悦子ら、実験医学５．１３１５-１９、１９８
７）。その他の方法を適宜採用することもできる。ま
た、細胞の使用比率も公知の方法と同様でよく、例えば
ミエローマ細胞に対して脾細胞を３倍から１０倍程度用
いればよい。

【００４３】脾細胞とミエローマ細胞とが融合し、抗体
分泌能及び増殖能を獲得したハイブリドーマ群の選択
は、例えば、ミエローマ細胞株としてヒポキサンチング
アニンホスホリボシルトランスフェラーゼ欠損株を使用
した場合、例えば上述のＤＭＥＭやＩＭＤＭにＦＢＳ・
ヒポキサンチン・アミノプテリン・チミジンを添加して
調製したＨＡＴ培地を用いて、９６ウェルマイクロプレ
ート中で培養することにより行うことができる。

【００４４】（ｆ）の工程では、選択されたハイブリド
ーマ群を含む培養上清の一部をとり、例えば後述するＥ
ＬＩＳＡ法により、フルシトリネートに対する抗体活性
を測定する。その結果、測定によりフルシトリネートと
反応する抗体を産生することが判明したハイブリドーマ
の細胞クローニングを行う。この細胞クローニング法と
しては、限界希釈により９６ウェルマイクロプレートの
各ウェルに１個のハイブリドーマが含まれるように希釈
し培養する方法「限界希釈法」；軟寒天培地上に撒きコ
ロニーをとる方法；マイクロマニピュレーターによって
１個の細胞を取り出す方法；セルソーターによって１個
の細胞を分離する「ソータークローン法」などが挙げら
れる。これらの中でも限界希釈法が簡単であり、よく用
いられる。

【００４５】抗体価が認められたウェル中のハイブリド
ーマについて、例えば限界希釈法により細胞クローニン
グを１〜４回程度繰り返して安定した抗体価の得られた
ものを、抗フルシトリネートモノクローナル抗体産生ハ
イブリドーマ株として選択する。ハイブリドーマを培養
する培地としては、例えば、ＦＢＳを含むＤＭＥＭ又は
ＩＭＤＭなどが用いられる。ハイブリドーマの培養は、
例えば二酸化炭素濃度５〜７％程度及び３７℃（１００
％湿度の恒温器中）で培養するのが好ましい。

【００４６】（ｇ）の工程で抗体を調製するためには通
常以下の方法がある。即ち、ホローファイバー型の培養
装置を用いてハイブリドーマを培養し、その培養上清と
して抗体を得るか、又は同系統のマウス（例えば、上述
のＢａｌｂ／ｃ）あるいはＮｕ／Ｎｕマウスの腹腔内で
ハイブリドーマを増殖させ、腹水として抗体を得ること
によって行われる。

【００４７】得られた培養上清あるいは腹水は、そのま
ま抗フルシトリネートモノクローナル抗体として使用で
きるが、さらに透析、硫酸アンモニウムによる塩析、ゲ
ル濾過、凍結乾燥などを行い、抗体画分を集めることに
より抗フルシトリネートモノクローナル抗体を濃縮・精
製して使用することもできる。また、イオン交換クロマ
トグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、高
速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）などの慣用され
ている方法を組み合わせることにより、さらに精製する
こともできる。

【００４８】上記で調製されたモノクローナル抗体の検
証を行う。このためには、該モノクローナル抗体の反応
性を測定すればよい。

【００４９】フルシトリネートの免疫学的測定 本発明で使用する抗体によるフルシトリネートの免疫学
的測定法としては、放射性同位元素免疫測定法、酵素免
疫測定法などが挙げられる。感度、簡便性などの観点か
ら、酵素免疫測定法のうちＥＬＩＳＡ法が汎用されてい
る。

【００５０】フルシトリネートの測定は、各種ＥＬＩＳ
Ａ法のうち例えば間接競合ＥＬＩＳＡ法により行うこと
ができる。以下、その手順を説明するが、これに制限さ
れないことは当業者によって明らかであろう。 （ａ）まず、フルシトリネートハプテンと高分子化合物
との結合体を担体に固相化する。 （ｂ）固相化した結合体（以下「固相化抗原」という）
が吸着していない表面を、抗原と無関係なタンパク質な
どによりブロッキングする。 （ｃ）これに各種濃度のフルシトリネートを含む試料及
び抗体を加え、該抗体を前記固相化抗原及びフルシトリ
ネートに競合的に反応させて、固相化抗原−抗体複合体
及び、フルシトリネート−抗体複合体を生成させる。 （ｄ）固相化抗原−抗体複合体の量を測定することによ
り、予め作成した検量線から試料中のフルシトリネート
の量を決定することができる。

【００５１】（ａ）工程において、抗原を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。

【００５２】抗原を固相化させるには、例えば、その抗
原を含む緩衝液を担体上に分注し、静置すればよい。緩
衝液としては公知のものが使用でき、例えば、ＰＢＳを
挙げることができる。緩衝液中の抗原の濃度は広い範囲
から選択できるが、通常０．０１〜５０μｇ／ｍｌ程
度、好ましくは、０．０５〜５μｇ／ｍｌが適してい
る。また、担体として９６ウェルのマイクロタイタープ
レートを使用する場合には、３００μｌ／ウェル以下で
２０〜１５０μｌ／ウェル程度の分注量が望ましい。固
相化に必要な時間や温度も特に制限はないが、通常４℃
で一晩静置の条件がよく用いられている。

【００５３】（ｂ）工程のブロッキングは、抗原を固相
化した担体において、フルシトリネートハプテン部分以
外に、後で添加する抗体が吸着され得る部分の存在する
場合があり、もっぱらそれを防ぐ目的で行われる。ブロ
ッキング剤として、例えば、ＢＳＡやスキムミルク溶液
を使用できる。あるいは、ブロックエース（「Ｂｌｏｃ
ｋ・Ａｃｅ」、大日本製薬社製、コードＮｏ．ＵＫ−２
５Ｂ）などのブロッキング剤として市販されているもの
を使用することもできる。具体的には、限定されるわけ
ではないが、例えば抗原を固相化した部分に適当なブロ
ッキング剤、例えば４倍希釈したブロックエースを適量
加え、４℃から３７℃で、１時間以上静置した後、洗浄
液で洗浄することにより行われる。洗浄液としては特に
制限はないが、例えば、ＰＢＳを用いることができる。

【００５４】次いで（ｃ）工程において、既知濃度のフ
ルシトリネートを含む標準液、及び／もしくは、未知濃
度のフルシトリネートを含む試料と一定濃度の抗体を固
相化抗原と接触させ、抗体を固相化抗原及びフルシトリ
ネートと反応させることにより、固相化抗原−抗体複合
体及びフルシトリネート−抗体複合体が生成する。この
際、抗体としては、第一抗体として本発明のフルシトリ
ネートに対する抗体を加え、更に第二抗体として標識酵
素を結合した第一抗体に対する抗体を順次加えて反応さ
せる。

【００５５】第一抗体は適当な緩衝液、例えば、１０％
のブロックエースを含む２倍濃度のＰＢＳに溶解して一
定濃度を添加する。限定されるわけではないが、反応
は、４〜３７℃程度で1時間行えばよい。反応終了後、
例えばＰＢＳで担体を洗浄し、固相化抗原に結合しなか
った第一抗体を除去する。

【００５６】次いで一定濃度の第二抗体を添加する。例
えば第一抗体としてマウスモノクローナル抗体を用いる
場合、酵素（例えば、ペルオキシダーゼ又はアルカリフ
ォスファターゼなど）を結合した抗マウスＩｇＧ−ヤギ
抗体を用いるのが適当である。また、担体に結合した第
一抗体に、最終吸光度が４以下、好ましくは０．５〜
３．０となるように調整した第二抗体を反応させるのが
望ましい。第二抗体の希釈には、適当な緩衝液、例え
ば、１０％のブロックエースを含むＰＢＳを用いる。限
定されるわけではないが、反応は２５〜３７℃で１時間
行い、反応後、ＰＢＳなどで洗浄する。以上の反応によ
り、第二抗体が第一抗体に結合する。一方、標識した第
一抗体を用いてもよく、その場合、第二抗体は不要であ
る。

【００５７】次いで（ｄ）工程において担体に結合した
第二抗体の標識物質と反応する発色基質溶液を加え、吸
光度を測定することによって検量線からフルシトリネー
トの量を算出することができる。

【００５８】第二抗体に結合する酵素としてペルオキシ
ダーゼを使用する場合には、例えば、過酸化水素、並び
にｏ−フェニレンジアミン（以下、「ＯＰＤ」という）
又は３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジンを含
む発色基質溶液を使用することができる。限定されるわ
けではないが、発色基質溶液を加え室温で１０分間反応
させた後、４Ｎの硫酸を加えることにより酵素反応を停
止させる。ＯＰＤを使用する場合、４９２ｎｍの吸光度
を測定する。３，３’，５，５’−テトラメチルベンジ
ジンを使用する場合、４５０ｎｍの吸光度を測定する。
一方、第二抗体に結合する酵素としてアルカリフォスフ
ァターゼを使用する場合には、例えばｐ−ニトロフェニ
ルリン酸を基質として発色させ、２ＮのＮａＯＨを加え
て酵素反応を止め、４１５ｎｍでの吸光度を測定する方
法などがある。

【００５９】フルシトリネートを添加しない反応溶液の
吸光度に対して、それらを添加して抗体と反応させた溶
液の吸光度の減少率を阻害率として計算する。既知の濃
度のフルシトリネートを添加した反応液の阻害率により
予め作成しておいた検量線を用いて、試料中のフルシト
リネートの濃度を算出できる。

【００６０】フルシトリネートの測定は、例えば本発明
の抗体を用いた直接競合阻害ＥＬＩＳＡ法によって行う
こともできる。 （ａ）まず、本発明の抗体を、担体に固相化する。 （ｂ）抗体が固相化されていない担体表面を抗原と無関
係な、例えばタンパク質によりブロッキングする。 （ｃ）上記工程とは別に、フルシトリネートを含む試料
に、フルシトリネートハプテンと酵素を結合させた酵素
結合体を加えて混合する。 （ｄ）上記混合物を上記抗体固相化担体と反応させる。 （ｅ）固相化抗体−酵素結合体の量を測定することによ
り、予め作成した検量線から試料中のフルシトリネート
の量を決定することができる。

【００６１】（ａ）工程において、抗体を固相化する担
体としては、特別な制限はなく、ＥＬＩＳＡ法において
常用されるものをいずれも使用することができる。例え
ば、ポリスチレン製の９６ウェルのマイクロタイタープ
レートが挙げられる。抗体の固相化は、例えば、抗体を
含む緩衝液を担体上に載せ、４℃で一晩静置することに
よって行える。緩衝液の組成・濃度は前述の間接競合Ｅ
ＬＩＳＡ法と同様のものを採用できる。

【００６２】（ｂ）工程のブロッキングは、抗体を固相
化した担体において、後に添加する酵素結合体が吸着さ
れる部分の存在する場合があるので、それを防ぐ目的で
行う。ブロッキング剤及びその方法は、前述の間接競合
ＥＬＩＳＡ法と同様のものを使用できる。

【００６３】（ｃ）工程において用いる酵素結合体の調
製は、フルシトリネートハプテンを酵素に結合する方法
であれば特に制限はなく、いかなる方法で行ってもよ
い。例えば、前述した活性化エステル法を採用すること
ができる。調製した一定濃度の酵素結合体は、既知濃度
のフルシトリネートを含む標準液、及び／もしくは、未
知濃度のフルシトリネートを含む試料と混合する。

【００６４】（ｄ）工程においてフルシトリネート及び
酵素結合体の混合液を抗体固相化担体に接触させ、フル
シトリネートと酵素結合体との競合反応により、これら
と固相化抗体との複合体が生成する。限定されるわけで
はないが、反応は、例えば、４〜３７℃でおよそ１時間
行う。反応終了後、適当な緩衝液、例えばＰＢＳで洗浄
し、固相化抗体と結合しなかった酵素結合体を除去す
る。

【００６５】次いで（ｅ）工程において抗体に結合した
酵素に反応する発色基質溶液を前述の間接競合ＥＬＩＳ
Ａ法と同様に加え、吸光度を測定することにより検量線
からフルシトリネートの量を算出することができる。

【００６６】

【実施例】以下、実施例によって本発明を具体的に説明
するが、これらは本発明の技術的範囲を限定するための
ものではない。当業者は本明細書の記載に基づいて容易
に本発明に修飾、変更を加えることができ、それらは本
発明の技術的範囲に含まれる。

【００６７】実施例１：混合酸無水物法によるハプテン
とキャリアータンパク質との結合 まず、式（１）で表される２−（４−ジフルオロメトキ
シフェニル）−３−メチル酪酸（５０モル）を１，４−
ジオキサン１ｍｌに溶解した。この溶液に２５μｌのＮ
−メチルモルホリンを加え１０℃で２０分間撹拌後、さ
らに１０μｌのイソブチルクロロカーボネートを加えて
１０℃で２０分間撹拌した。一方、牛血清アルブミン
（以下ＢＳＡと略す）あるいは卵白アルブミン（以下Ｏ
ＶＡと略す）４０ｍｇを２ｍｌの蒸留水で溶解後、１．
３ｍｌの１，４−ジオキサンを加えて混合した。このタ
ンパク溶液を１Ｎ水酸化ナトリウム溶液でｐＨ９に調整
後４℃に冷やし、ｐＨを９に保ちながら先のハプテン溶
液を徐々に滴下した。滴下後、４℃で４時間保った後、
蒸留水で透析し、凍結乾燥した。この凍結乾燥品を各々
フルシトリネートハプテン−ＢＳＡ結合体及びフルシト
リネートハプテン−ＯＶＡ結合体として以降の実験に用
いた。

【００６８】実施例２：免疫 免疫には、Ｂａｌｂ／ｃマウスもしくはＡ／Ｊマウス
（５〜６週令、メス）を用いた。実施例１で調製したフ
ルシトリネートハプテン−ＢＳＡ結合体１００μｇをＰ
ＢＳの５０μｌに溶解し、等量のフロイント完全アジュ
バントと乳化混合した後、マウスの腹腔内に接種した。
１カ月後、初回免疫量の１／４量を追加免疫し、その１
週間後に尾静脈から採血後、抗血清を得た。また、さら
にその２週間後、追加免疫と同量を最終免疫した。

【００６９】実施例３：フルシトリネートと抗血清の反
応性 フルシトリネートと抗血清の反応性は、間接競合ＥＬＩ
ＳＡ法によって調べた。ＰＢＳに溶解したフルシトリネ
ートハプテン−ＯＶＡ結合体（０．１μｇ／ｍｌ）を、
９６ウエルのマイクロタイタープレートの各ウエルに１
００μｌ加え、４℃で１晩静置することにより固相化し
た。次に蒸留水で４倍に希釈したブロックエース（大日
本製薬株式会社製）２５０μｌに置き換え、２５℃で１
時間ブロッキングした。一方、１０％メタノールを含む
蒸留水で適当な濃度に希釈したフルシトリネートを、ブ
ロックエースを１０％含む２倍濃度のＰＢＳで適当な濃
度に希釈した抗血清（フルシトリネート未添加条件での
本ＥＬＩＳＡ法の吸光度が１．０を示し得る抗体濃度）
と等量混合し、ブロッキング後の各ウエルへ加え、２５
℃で１時間反応した。ＰＢＳで３回洗浄した後、ブロッ
クエースを１０％含むＰＢＳで２０００倍に希釈した西
洋ワサビペルオキシダーゼ（以下、ＨＲＰと略す）結合
抗マウスＩｇＧ抗体（ピアス社製）を１００μｌづつ各
ウエルへ添加し、２５℃で１時間反応した。再び３回洗
浄後、ＨＲＰの基質溶液（２ｍｇ／ｍｌのｏ−フェニレ
ンジアミン及び０．０３％の過酸化水素を添加した１０
０ｍＭリン酸クエン酸緩衝液；ｐＨ５．０）１００μｌ
を加え、２５℃で１０分間発色し、４Ｎ硫酸５０μｌで
反応停止後４９２ｎｍの吸光度を測定した。

【００７０】結果は、図１に示した通り、調製した５種
類の抗血清（Ｓｅｒａ １−１，Ｓｅｒａ １−２，Ｓ
ｅｒａ １−３，Ｓｅｒａ １−４，Ｓｅｒａ １−
５）はいずれもフルシトリネートと反応し、中でもＳｅ
ｒａ １−３は０．００５〜８０ｐｐｍと広い測定範囲
でフルシトリネートと反応した。また、Ｓｅｒａ １−
４はフルシトリネートによる５０％阻害濃度（ＩＣ
₅₀値）が２．４ｐｐｍと最も高い反応性を示した。この
ように、これらの抗血清は、フルシトリネートを測定す
るために有効であることが明らかとなった。

【００７１】実施例４：マウス脾臓細胞とマウスミエロ
ーマ細胞のハイブリドーマの作製 実施例２に示した免疫マウスの抗血清はフルシトリネー
トと高い反応性を示した。そこでこれらのマウスを用い
てマウスモノクローナル抗体の作製を試みた。

【００７２】モノクローナル抗体を産生するハイブリド
ーマを得るため、最終免疫後４日目のマウスの脾臓細胞
を用いて細胞融合を行った。摘出した脾臓から、ダルベ
コ改変イーグル培地（以下、ＤＭＥＭと略す）中に脾臓
細胞を取り出し、ＤＭＥＭにて３回洗浄した後、マウス
のミエロ−マ細胞Ｐ３−Ｘ６３−Ａｇ８．６５３と細胞
数の比で５：１（脾臓細胞：ミエローマ細胞）となるよ
うに混合し、遠心（１２００ｒｐｍ、５分間）して細胞
沈さを集めた。この細胞沈さに予め３７℃に加温してお
いた５０％ポリエチレングリコール（分子量１５００）
１ｍｌを加え、細胞を融合した。細胞の融合は、ＤＭＥ
Ｍの１０ｍｌを徐々に添加し、牛胎児血清（以下、ＦＢ
Ｓと略す）１ｍｌを更に添加することにより、停止し
た。融合した細胞は、ＤＭＥＭにインシュリン（８μｇ
／ｍｌ）、ＦＢＳ（２０％）、ヒポキサンチン（１００
ｍＭ）、アミノプテリン（０．４μＭ）、およびチミジ
ン（１６μＭ）を添加したＨＡＴ培地に懸濁後、９６ウ
エルのマイクロプレートの各ウエルに２〜３×１０⁵細
胞づつ分注した。３７℃、５％二酸化炭素存在下で１０
〜１４日間培養した結果、各ウエルにハイブリドーマの
コロニーが形成された。

【００７３】実施例５：フルシトリネートに反応するモ
ノクローナル抗体産生細胞のスクリーニング コロニーが形成された各ウエルの内、それらの培養上清
中にフルシトリネートに反応するモノクローナル抗体を
産生しているものを、実施例３に示した間接競合ＥＬＩ
ＳＡ法を用いてスクリーニングした。その結果、１ｐｐ
ｍのフルシトリネートと反応したウエルを５ウエル見い
だした。そこで、ウエル中のハイブリドーマを限界希釈
法によってクローニングし、５株のモノクローナル抗体
産生細胞（Ｆ１１−１，Ｆ１１−２，Ｆ１１−３，Ｆ１
４−３及びＦ１Ａ２７−４）を得た。これらのうち、Ｆ
１Ａ２７−４はＡ／Ｊマウス由来、その他の細胞はＢａ
ｌｂ／ｃ由来だった。これらのモノクローナル抗体産生
細胞は、ＦＢＳを１０％添加したＤＭＥＭ中で培養し、
その培養上清を各々モノクローナル抗体溶液とした。以
後、各モノクローナル抗体の名称は、これらを産生する
モノクローナル抗体産生細胞の名称にＭａｂを加え、Ｍ
ａｂＦ１１−１，ＭａｂＦ１１−２，ＭａｂＦ１１−
３，ＭａｂＦ１４−３及びＭａｂＦ１Ａ２７−４とし
た。また、これらのサブクラスは、ＭａｂＦ１１−１が
ＩｇＧ２ｂ、ＭａｂＦ１１−２がＩｇＧ、ＭａｂＦ１１
−３がＩｇＧ２ａ、ＭａｂＦ１４−３がＩｇＧ３及びＭ
ａｂＦ１Ａ２７−４がＩｇＧ２ａであった。

【００７４】実施例６：モノクローナル抗体のフルシト
リネートとの反応性 得られたモノクローナル抗体のフルシトリネートとの反
応性は、実施例３に示した間接競合ＥＬＩＳＡ法を用い
て調べた。また本ＥＬＩＳＡ法の抗原固相化濃度は、各
々ＭａｂＦ１１−１とＭａｂＦ１１−３が２５ｎｇ／ｍ
ｌ、ＭａｂＦ１１−２が５０ｎｇ／ｍｌ、ＭａｂＦ１４
−３が１００ｎｇ／ｍｌ及びＭａｂＦ１Ａ２７−４が４
μｇ／ｍｌで行った。

【００７５】結果は、図２に示すように、各抗体ともフ
ルシトリネートと高い反応性を示し、特にＭａｂＦ１Ａ
２７−４は測定範囲が１０〜３０００ｐｐｂ、ＩＣ₅₀値
が２００ｐｐｂと最も高い反応性を示した。そのほかの
モノクローナル抗体のＩＣ₅₀値は、各々ＭａｂＦ１１−
１が６７０ｐｐｂ、ＭａｂＦ１１−２が６５０ｐｐｂ、
ＭａｂＦ１１−３が４６０ｐｐｂ、ＭａｂＦ１４−３が
３５０ｐｐｂであった。

【００７６】実施例７：モノクローナル抗体のフルシト
リネートおよびその類縁化合物との交差反応性 得られたモノクローナル抗体が、各々フルシトリネート
と高い反応性を示したことから、それらの特異性を評価
するため、フルシトリネート及びその類縁化合物との交
差反応性を調べた。

【００７７】フルシトリネート及びその類縁化合物の化
学構造式を以下に示す。

【００７８】

【化５】

【００７９】これらの化合物の英名は、下記の通りであ
る。

【００８０】 フルシトリネート：ｆｌｕｃｙｔｈｒｉｎａｔｅ シクロプロスリン：ｃｙｃｌｏｐｒｏｔｈｒｉｎ フェンバレラート：ｆｅｎｖａｌｅｒａｔｅ フルバリネート：ｆｌｕｖａｌｉｎａｔｅ エトフェンプロックス：ｅｔｏｆｅｎｐｒｏｘ シラフルオフェン：ｓｉｌａｆｌｕｏｆｅｎ ｐ−エトキシ安息香酸：ｐ−ｅｔｈｏｘｙｂｅｎｚｏｉ
ｃ ａｃｉｄ 結果を、交差反応性率（フルシトリネートのＩＣ₅₀値／
各化合物のＩＣ₅₀値×１００）として表１に示した。

【００８１】

【表１】

【００８２】表１から明らかなとおり、各抗体の特異性
は各々異なっており、中でもＭａｂＦ１１−２はフルシ
トリネートばかりでなく類縁のピレスロイド系殺虫剤シ
クロプロトリン、フェンバレレート及びフルバリネート
とも高い反応性を示し、これらの農薬を包括的に測定す
るために有効と考えられた。一方、ＭａｂＦ１Ａ２７−
４は、他の化合物とほとんど交差反応性を示さず、フル
シトリネートを高感度かつ特異的に測定できた。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図１は、フルシトリネートと抗血清（Ｓｅｒ
ａ１−１〜５）の反応性を示すグラフである。

【図２】 図２は、フルシトリネートと本発明のモノク
ローナル抗体（ＭａｂＦ１１−１，ＭａｂＦ１１−２，
ＭａｂＦ１１−３，ＭａｂＦ１４−３及びＭａｂＦ１Ａ
２７−４）の反応性を示すグラフである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｇ 33/531 Ａ 33/531 33/532 Ａ 33/532 33/543 ５４５ 33/543 ５４５ 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 福嶋 あずさ 大阪府堺市高倉台２丁33−23 Ｆターム(参考） 4B064 AG27 CA10 CA20 CC24 DA10 DA11 DA13 DA16 4B065 AA91X AA92X AB05 AC14 AC15 BA08 BA24 BD14 CA25 CA41 CA46 CA47 4H045 AA11 AA20 AA30 DA76 DA86 EA01 EA50 FA72 GA06 GA21

Claims (9)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 式（１） 【化１】 で表される２−（４−ジフルオロメトキシフェニル）−
   ３−メチル酪酸であるフルシトリネートのハプテン化合
   物。
2. 【請求項２】 請求項１に記載の２−（４−ジフルオロ
   メトキシフェニル）−３−メチル酪酸と高分子化合物又
   は標識物質との結合体。
3. 【請求項３】 ２−（４−ジフルオロメトキシフェニ
   ル）−３−メチル酪酸と高分子化合物とを結合させるこ
   とにより抗原を作製し、当該抗原を用いることにより、
   式（２） 【化２】 で表される化合物に反応性を示す抗体を製造することを
   特徴とする、式（２）で表される化合物に反応性を示す
   抗体又はそのフラグメントの製造方法。
4. 【請求項４】 請求項２に記載の結合体を抗原として用
   いることにより製造された、式（２）で表される化合物
   に反応性を示す抗体又はそのフラグメント。
5. 【請求項５】 モノクローナル抗体である、請求項４に
   記載の抗体又はそのフラグメント。
6. 【請求項６】 モノクローナル抗体がＭａｂＦ１Ａ２７
   −４又はそのフラグメントである、請求項５に記載の抗
   体又はフラグメント。
7. 【請求項７】 請求項４、５及び６のいずれか１項に記
   載の抗体又はフラグメントを産生するハイブリドーマ。
8. 【請求項８】 請求項４、５及び６のいずれか１項に記
   載の抗体又はフラグメントを用いることを特徴とする、
   式（２）で表される化合物の免疫学的測定方法。
9. 【請求項９】 請求項２に記載の結合体を用いることを
   含む、請求項８に記載の免疫学的測定方法。