JP2000350576A

JP2000350576A - 植物の培養細胞の凍結保存方法

Info

Publication number: JP2000350576A
Application number: JP2000102391A
Authority: JP
Inventors: Koichi Matsubara; 浩一松原; Atsuko Miyake; 篤子三宅
Original assignee: Mitsui Chemicals Inc
Current assignee: Mitsui Chemicals Inc
Priority date: 1999-04-06
Filing date: 2000-04-04
Publication date: 2000-12-19

Abstract

(57)【要約】【構成】植物の培養細胞を培地の糖濃度を特定の条件に
制御しつつ前培養した後に凍結保存することを特徴とす
る凍結保存方法。【効果】本発明の方法により植物の培養細胞を凍結保存
すると、細胞生存率を高く維持できる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、植物の培養細胞の
凍結保存方法に関する。

【０００２】

【発明の技術的背景と課題】卵巣癌、乳癌、肺癌等の治
療薬として有用であるタキソール(Taxol)は、イチイ科
イチイ属植物であるタイヘイヨウイチイ(Taxus brevifo
lia NUTT) より単離同定されたタキサン型ジテルペンで
あり、活性と関連する複雑なエステルグループを有して
いる。タキソールはタイヘイヨウイチイ植物体中のどの
部位にも存在し、その含量は樹皮で最も高いことが報告
されている。現在、タキソールは天然のまたは栽培され
た植物体中から採取されているが、イチイ属植物は地上
20 cmの高さに成長するのに10年以上かかる生育の遅い
植物であり、また樹皮を剥ぐと木が枯れてしまうことか
ら容易に大量のタキソールを得ることは困難である。

【０００３】近年、イチイ属植物細胞の培養により、タ
キソールおよびタキソールの前駆物質であるバッカチン
III 等のタキサン型ジテルペンを生産することが研究さ
れているが、商業的な規模で大量培養・生産を行うため
には、細胞株の能力を維持することが重要である。

【０００４】一般に、植物細胞（カルス）は通常、一定
期間毎に定期的な植え替え作業を繰り返す継代培養法で
培養しながら維持保存されている。しかしながら、この
方法での保存は植物体への再分化能や物質生産能の低
下、細胞自体の変化が起こることが既に知られている。
一方、植物細胞や組織を−１５０℃以下（液体窒素中）
で超低温保存することが長期保存の有効な方法であり、
遺伝的変化がほとんど起きないことが明らかにされつつ
ある。

【０００５】超低温保存法としては、緩速予備凍結
法、簡易予備凍結法、ガラス化法、乾燥法等の技
術が開発されている。これらの方法により超低温保存が
可能な植物の種類が増大したが、上記の保存過程での劇
的な環境の変化に適応しにくい植物種も多く存在する。
特にイチイ属植物の培養細胞を安定的に凍結保存するこ
とは非常に困難である。

【０００６】

【発明の目的】本発明者は、植物培養細胞を安定に保存
する方法を鋭意検討し、その結果、特定の方法で前培養
した後に凍結保存することにより、上記課題が解決でき
ることを見出したのでこれを提供する。

【０００７】

【発明の概要】本発明の凍結保存方法は、植物の培養細
胞を下記〜を満たす条件で前培養した後に凍結保存
することを特徴とする。Ｃ_S＜Ｃ_E、０．４Ｍ≦Ｃ_E≦０．８Ｍ、０Ｍ≦Ｃ_N+1−Ｃ_N≦０．２Ｍ（Ｃ_Sは前培養開始時における培地の糖濃度、Ｃ_Eは前培
養終了時における培地の糖濃度、Ｃ_Nは前培養開始から
Ｎ日後における培地の糖濃度、Ｃ_N+1は前培養開始から
Ｎ＋１日後における培地の糖濃度とする。）上記方法
は、特にイチイ属植物の培養細胞を凍結保存する方法と
して好適である。

【０００８】

【発明の具体的説明】以下、本発明の凍結保存方法につ
いて具体的に説明する。（植物）本発明に用いられる植物は特に限定されるもの
ではないが、例えば、イチイ科植物、ナス科植物、キン
ポウゲ科植物、セリ科植物等が挙げられる。特にイチイ
属植物に適用した場合好ましい結果が得られる。本発明
が適用されるイチイ属植物としては、例えば、セイヨウ
イチイ(Taxus baccata LINN)、イチイ(T. cuspidata SI
EB.et ZUCC) 、キャラボク(T. cuspidataSIEB.et ZUCC
var. nana REHDER)、タイヘイヨウイチイ(T. brevifoli
a NUTT)、カナダイチイ(T. canadiensis MARSH)、中国
イチイ(T. chinensis)、ヒマラヤイチイ(T. wallichian
a ZUCC) 、T.media 等が挙げられる。これらの中でもセ
イヨウイチイおよびT.media が特に好ましい。

【０００９】（培養細胞の取得）先ず植物の植物体、例
えば根、生長点、葉、茎、種子などから採取される植物
片を殺菌処理後、ゲランガムで固めたウッディー・プラ
ント・メディウム（以下、WPＭと略記する）等の固体培
地上に置床し、10〜35℃で14〜60日程度経過させて組織
片の一部をカルス化させる。このようにして得られたカ
ルスを継代培養すると生育速度が漸次高まり安定化した
カルスが得られる。ここで、安定化したカルスとは、培
養中にカルスの一部がシュートや根に分化しないでカル
スの状態を保持する性質をもち細胞の生育速度が均質で
あるものをいう。この安定化したカルスを増殖に適した
液体培地、例えば液体WPＭに移して増殖させると更に生
育速度が高められる。本発明ではこの段階で得られた培
養細胞を用いて前培養を行う。

【００１０】（前培養）前培養に使用される培地として
は、従来から知られている植物の細胞培養に用いられる
培地、例えばムラシゲ・スクーグ(1962年)〔Murashige
& Skoog〕の培地、リンスマイヤー・スクーグ(1965年)
〔Linsmaier Skoog〕の培地、ウッディー・プラント・
メディウム(1981年) 〔Woody Plant Medium〕、ガンボ
ルグ〔Gamborg〕のB-5培地、藤田らのM-9培地等が挙げ
られる。

【００１１】本発明の前培養は、下記〜の条件で前
培養することを特徴としている。Ｃ_S＜Ｃ_E、０．４Ｍ≦Ｃ_E≦０．８Ｍ、０Ｍ≦Ｃ_N+1−Ｃ_N≦０．２Ｍ（Ｃ_Sは前培養開始時における培地の糖濃度、Ｃ_Eは前培
養終了時における培地の糖濃度、Ｃ_Nは前培養開始から
Ｎ日後における培地の糖濃度、Ｃ_N+1は前培養開始から
Ｎ＋１日後における培地の糖濃度とする。）

【００１２】Ｃ_SはＣ_Eよりも小さければ特に限定される
ものではないが、０．０５〜０．２５Ｍ、特に０．０８
〜０．２Ｍが好ましい。前培養終了時の糖濃度Ｃ_Eは
０．４Ｍ〜０．８Ｍであり、特に０．４Ｍ〜０．６Ｍが
好ましい。Ｃ_N+1−Ｃ_Nは０〜０．２Ｍであり、特に０〜
０．１３Ｍが好ましい。本発明では、培地に糖を連続的
に添加しても、間欠的に添加してよい。本発明では、最
終糖濃度に達した後、その糖濃度で０．５〜２日間、好
ましくは１〜２日間培養を継続するのが好ましい。ま
た、前培養の期間（トータル）は、特に限定されるもの
ではないが、通常２〜２０日、好ましくは７〜１４日程
度である。

【００１３】糖としては、シュクロース（ショ糖）、マ
ルトース、ラクトース、トレハロース等の二糖類、グル
コース、フルクトース、ガラクトース等の単糖類あるい
はこれら糖源の２種類以上を適当な比率で混合したもの
を使用できる。

【００１４】これら培地には、必要に応じて無機成分、
植物ホルモン、ビタミン類、アミノ酸等を添加すること
ができる。無機成分としては、例えばリン、窒素、カリ
ウム、カルシウム、マグネシウム、イオウ、鉄、マンガ
ン、亜鉛、ホウ素、銅、モリブデン、塩素、ナトリウ
ム、ヨウ素、コバルト等が挙げられ、これらの成分は例
えば硝酸カリウム、硝酸ナトリウム、硝酸カルシウム、
塩化カリウム、リン酸一水素カリウム、リン酸二水素カ
リウム、塩化カルシウム、硫酸マグネシウム、硫酸ナト
リウム、硫酸第一鉄、硫酸第二鉄、硫酸マンガン、硫酸
亜鉛、ホウ酸、硫酸銅、モリブデン酸ナトリウム、三酸
化モリブデン、ヨウ化カリウム、塩化コバルト等の化合
物として添加できる。

【００１５】植物ホルモンとしては、例えばインドール
酢酸(IAA)、ナフタレン酢酸(NAA)、2,4-ジクロロフェノ
キシ酢酸(2,4-D)等のオーキシン類、カイネチン、ゼア
チン、ジヒドロゼアチン等のサイトカイニン類が用いら
れる。

【００１６】ビタミン類としては、例えばビオチン、チ
アミン（ビタミンB1）、ピリドキシン（ビタミンB6）、
パントテン酸、イノシトール、ニコチン酸等が用いられ
る。

【００１７】アミノ酸類としては、例えばグリシン、フ
ェニルアラニン、ロイシン、グルタミン、システイン等
を添加できる。

【００１８】一般に前記の各成分は、無機成分が約0.1
μM〜100 mM、植物ホルモン類が約0.01〜約10μM、ビタ
ミン類およびアミノ酸類がそれぞれ約0.1〜約100 mg/l
の濃度で用いられる。

【００１９】（凍結保存）前培養した細胞にあらかじめ
凍結防止剤を添加して凍結する。凍結防止剤としては、
ジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）、エチレングリコー
ル、グリセリン、ブドウ糖、プロリン、ポリビニルピロ
リドン等を挙げられる。中でもＰＶＳ２液（30％(W/V)
グリセリン、15%(W/V)エチレングリコール、15%(W/V)DM
SOを0.4Mショ糖の基本培地に溶解したもの）が好まし
い。

【００２０】凍結方法としては、（１）細胞を比較的高
濃度の凍結防止剤で処理した後、液体窒素で急速に冷却
する方法（ガラス化法）、（２）細胞を凍結防止剤で処
理した後、必要に応じプログラムフリーザーなどを用い
て、−３０〜−４０℃まで凍結し、その後液体窒素で急
冷する方法（予備凍結法）が挙げられる。凍結方法は植
物の種類に応じて適当な方法を選択すればよいが、イチ
イ属植物の培養細胞の場合は、ガラス化法、中でも低温
で徐々に凍結防止剤の濃度を上げながら脱水処理した後
で急冷することが好ましい。

【００２１】ガラス化法の詳細は、例えば下記文献に記
載されている。 Sakai,A., S.Kobayashi, I.Oiyama, 1990. Plant C
ell Reports, 9: 30-33. Sakai,A., S.Kobayashi, I.Oiyama, 1991. J.Plant
Physiol., 137: 465-470. Reinhould,P.J., E.W.M.Schrijnemakers, Fv.Iren,
J.W.Kijne, 1 995.Plant Cell,Tissue and Organ Cul
ture, 42: 261-267. Matsumoto,T., A.Sakai, K.Yamada, 1994. Plant C
ell Reports, 13: 442-446.

【００２２】保存期間は特に限定されるものではない。
本発明者らの検討によれば、例えばイチイ属植物細胞の
場合、短期保存（３０分〜数時間）と長期保存（６０
日）の凍結後の細胞生存率は同等であり、また、どちら
の方法でも、凍結後の細胞のタキソール生産性は、非凍
結細胞の場合とほぼ同等であった。

【００２３】（融解〜再培養）凍結保存した培養細胞
は、融解、吸水した後に再培養に使用できる。液体窒素
中に保存した細胞は、例えば３５〜３７℃の温水で急速
に融解し、次いで、凍結防止剤を除去した後、好ましく
は１．０〜１．２Ｍの糖を含有する培地を加えて吸水さ
せる。その後、従来から知られている植物の細胞培養に
用いられる培地を用いて再培養する。

【００２４】

【実施例】以下、実施例および比較例により本発明を更
に具体的に説明するが本発明の範囲はこれらの実施例に
限定されるものではない。

【００２５】（実施例１）イチイ細胞の凍結保存１）培養細胞の調製タキサス・メディア（Taxus media）の懸濁培養細胞を
実験材料として用いた。細胞は80mlの改変ウッディー・
プラント・メディア基本培地に3%ショ糖、10^-5Mナフタ
レン酢酸を加えた培地（WPM培地）の入った300mlフラス
コ中で培養した。850μM以下のメッシュで篩った細胞塊
を100 x gで 1分間遠心し、見かけの容積（packed cell
volume、以下PCV。）で6mlを２週間毎に植え継いだ。
フラスコは120rpmのロータリーシェイカーで25℃、暗所
で培養した。このようにして生育速度が高められた標準
細胞を前培養に使用した。

【００２６】２）前培養 WPM培地を用いて、６％ショ糖培地で10日間培養後、1.2
Mショ糖基本培地を添加してショ糖濃度を高め、0.3Mで
２日間、0.4Mで２日間培養した。

【００２７】３）ガラス化法による凍結保存多段階法による脱水処理 PCV 1ml の細胞に、0℃の20%ＰＶＳ２液（ＰＶＳ２液を
0.4Mショ糖の基本培地で20%に希釈した）4mlを加えて攪
拌し、氷水中に5分間置いた。次にＰＶＳ２液1mlを1分
間隔で５回加えて、徐々にＰＶＳ２液濃度を上げていっ
た。総容量が10mlになったら100 x gで1分間遠心した
後、上清を除去した。再びＰＶＳ２液を1分間隔で、0.5
mlを２回、1mlを３回加えた。操作中細胞は常に氷水中
に置いた。

【００２８】凍結保存脱水処理した細胞は1mlずつ2ml容クライオチューブに移
した後、直接、液体窒素中で急速冷却し、そこに30分間
以上保存した。

【００２９】４）融解〜再培養液体窒素中に保存した細胞は、36℃の温水中で急速加温
（1分間）して融解させた後氷水中に置いた。ＰＶＳ２
液を直ちに除去し、1.2Mショ糖を含む基本培地1mlを加
えて懸濁し、室温で30分間置いた。途中1度液を交換し
た。非凍結コントロールは液体窒素に浸けることなく、
直ちに液の交換を行った。その後細胞は、濾紙2枚と中
央に1cm角の穴をあけた濾紙を重ねたものを敷いた0.8%
寒天のWPM培地上に置床した。翌日新しい濾紙１枚を敷
いた新しい培地に濾紙1枚を残して移し、再培養した。

【００３０】５）細胞の生存率の測定細胞をWidholm et al. 1972. Stain Technology,47(7):
189-194の方法により、0.01%のフルオレセインジアセテ
ート（FDA）および0.1%のフェノサフラニン（PS）の染
色液で染色し、5〜30分後に蛍光顕微鏡上で観察した。
生存率は、次式により算出した。

【００３１】

【式１】細胞の生存率（％）＝［蛍光を発する細胞数
（生細胞数）／可視光で見える細胞数（全細胞数）］×
100

【００３２】コントロールの細胞の生存率は、前培養
後、凍結保存前に測定した。凍結後の細胞の生存率は、
融解後４日目に計測した。結果を表１に示す。

【００３３】実施例２〜３、比較例１〜３は、前培養の
条件を下記の通り変更した以外は実施例１と同様に行っ
た。結果を表１に示す。（実施例２）６％ショ糖培地で10日間培養後、1.2Mショ
糖基本培地を添加してショ糖濃度を高め、0.3Mで２日
間、さらに0.4Mで１日、0.5Mで１日培養した。（実施例３）６％ショ糖培地で10日間培養後、1.2Mショ
糖基本培地を添加してショ糖濃度を高め、0.3Mで１日、
さらに0.4M、0.5M、0.6Mで各１日培養した。（比較例１）６％ショ糖培地で10日間培養後、1.2Mショ
糖基本培地を添加してショ糖濃度を高め、0.3Mで４日間
培養した。（比較例２）６％ショ糖培地で10日間培養した後、1.2M
ショ糖基本培地を添加してショ糖を0.6Mにした後、４日
間培養した。（比較例３）６％ショ糖培地で14日間培養した。

【００３４】

【表１】

【００３５】タバコ細胞（ＢＹ−２）の凍結保存（比較例４）３００mlフラスコに６０ｍｌの液体培地
（ＬＳ培地、３％ショ糖、１μＭ２，４−Ｄ、ｐＨ５．
７）を入れ、１週間毎に懸濁培養液２ｍｌを植え継い
で、１００ｒｐｍ、２５℃、暗所で培養し、標準細胞を
取得した。次いで、前培養を行うことなく、イチイ培養
細胞と同様の方法で、多段階法による脱水処理を行い、
０℃で２０分間放置した。その後、実施例１と同様の方
法で、凍結、融解、再培養、生存率の測定を行った。結
果を表２に示す。

【００３６】（実施例４）標準細胞を取得後、下記の方
法で前培養、脱水処理した以外は、比較例４と同様の方
法で行った。結果を表２に示す。前培養３％ショ糖培地で４日間培養後、１．２Ｍショ糖基本培
地を添加してショ糖濃度を高め、０．３Ｍで１日間、さ
らに０．４Ｍで１日間培養した。脱水処理タバコ細胞にグリセロール２Ｍ、ショ糖０，４Ｍを含有
するＬＳ培地を加えて撹拌し、２５℃で１０分放置し
た。次にＰＶＳ２液を加え、０℃で４０分放置した。

【００３７】

【表２】

【００３８】

【発明の効果】本発明の方法により植物の培養細胞を凍
結保存すると、細胞生存率を高く維持でき、そのことに
より該細胞を安定して工業的に利用することが可能とな
る。

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】植物の培養細胞を下記〜を満たす条件
で前培養した後に凍結保存することを特徴とする凍結保
存方法。Ｃ_S＜Ｃ_E、０．４Ｍ≦Ｃ_E≦０．８Ｍ、０Ｍ≦Ｃ_N+1−Ｃ_N≦０．２Ｍ（Ｃ_Sは前培養開始時における培地の糖濃度、Ｃ_Eは前培
養終了時における培地の糖濃度、Ｃ_Nは前培養開始から
Ｎ日後における培地の糖濃度、Ｃ_N+1は前培養開始から
Ｎ＋１日後における培地の糖濃度とする。）
【請求項２】植物の培養細胞がイチイ属植物の培養細胞
であることを特徴とする請求項１に記載の凍結保存方
法。