JP2000500028A - 核酸の精製方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 高度に精製された核酸の組成物を生成するための、正接流動限外濾過を用いた方法を提供する。遺伝子治療に有用な医薬品グレードのプラスミドＤＮＡを生成する調整可能なプロセスであって、効率的であり、かつ毒性有機化学物質の使用を回避できる方法が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】 核酸の精製方法発明の分野 本発明は高純度核酸を生成するための方法に関する。具体的には、本発明は医 薬品としての品質を備えた核酸の生成に関する。本発明は、特には、医薬品とし ての品質を有するプラスミドＤＮＡを調製するための方法に関する。発明の背景 組換えＤＮＡの出現以来、さらなる分子生物学の研究に向けてＤＮＡ及びＲＮ Ａを精製するための方法が開発され、改良されている。これらの方法は研究の場 における多くの核酸研究を可能にしているが、多くの現行の遺伝子治療プロトコ ルにおいて必要とされるもののような、精製核酸のヒト臨床使用に関連する問題 に取り組んではいない。 遺伝子治療は患者の細胞への核酸導入を含み、この核酸は発現したときに治療 上の効果をその患者に与えるものである。それらの例には、外来性の機能的遺伝 子を導入して、欠陥遺伝子を有する患者の遺伝的欠陥を矯正し、又は十分な水準 で発現することのない遺伝子を補償することが含まれる。他の例には、例えばウ イルス感染又は 癌の治療における、遺伝的機能を遮断するための変異体遺伝子、アンチセンス配 列又はリボザイムの導入が含まれる。 遺伝子治療においては、患者の細胞への外来性核酸の導入にウイルスベクター 、特にレトロウイルスベクターを用いることに多くの焦点が当てられている。現 在のところ、これらのプロトコルの大部分は、まず患者の細胞を患者から取り出 し、生体外で遺伝的に改変した後に患者に戻す生体外遺伝子治療のためのもので ある。生体外遺伝子治療に代わるものは、生体内（イン・ビボ）遺伝子治療であ る。イン・ビボ遺伝子治療は、外来性遺伝的能力を患者に直接導入し、それが標 的細胞によって取り込まれ、次いでその標的細胞が導入された遺伝子を発現させ て治療用生成物を産生することを指す。ウイルスベクターが、それらの使用には 多くの欠点、例えば、そのウイルスベクターの免疫原性及び挿入突然変異誘発も しくはウイルス混入のような安全性の懸念を伴うにも関わらず、イン・ビボ遺伝 子治療に用いられている。 イン・ビボ遺伝子デリバリーの他の手段としては、問題となっている標的組織 への裸のＤＮＡの導入、又は脂質介在ＤＮＡデリバリーの使用がある。典型的に は、裸のＤＮＡの導入は、外来性遺伝的能力を標的組織に直接導入しようとする 場合に用いられる。リポソーム又は脂質と複合体を形成させることによりＤＮＡ が小型化され、これにより関心のある様々な組織への脂質／ＤＮＡ複合 体の全身性のデリバリーが可能となる。ＰＣＴ特許出願ＷＯ９３／２５６７３号 を参照のこと。脂質／ＤＮＡ複合体は、脂質の組成、脂質／ＤＮＡ比、デリバリ ー様式等を変更することにより、特定の組織を標的とすることができる。 核酸が患者に導入されるあらゆる用途に対応できるよう、高度に精製された医 薬品級の核酸を生成する必要性がある。このような精製核酸は、安全性、薬効及 び有効性の点で、薬物品質基準を満たさなければならない。加えて、例えば数百 ミリグラムないし数百グラムの範囲の、大量のＤＮＡを生成するのに用いること ができる、増減可能なプロセスを有することが望ましい。したがって、毒性化学 物質、既知変異誘発物質、有機溶媒、又は生成される核酸の安全性もしくは有効 性を損なう他の試薬を用いることがなく、又はスケールアップを困難もしくは非 実用的にすることのない、高度に純粋な核酸を生成するための方法を有すること が望ましい。また、患者に投与した場合に毒性応答を誘起し得る内毒素が混入し ていない核酸を調製することも望ましい。高水準の内毒素を有するグラム陰性バ クテリア源、例えばプラスミドもしくはバクテリオファージＤＮＡから核酸が精 製される場合には、混入内毒素の除去は特に重要である。 以下に記載される本発明はこれらの要求を満たし、その上、他の関連する利点 をも提供する。関連文献 Ｌｉｓら，（１９７５）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２：３８３− ３８９には、ポリエチレングリコールベースのＤＮＡ精製方法が記述されている 。Ｚａｓｌｏｆｆら，（１９７８）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．５： １１３９−１１５３には、プラスミドＤＮＡの酸フェノール精製が記述されてい る。Ｓａｍｂｒｏｏｋら，（１９８９）分子クローニング：実験マニュアル（Ｍ ｏｌｅｃｕｌｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａ ｌ） ，第２版，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓには、プラスミドＤＮＡを精製するための比較的小規模なリサーチ グレードの方法に関し、幾つかの異なる方法が記述されている。Ａｕｓｕｂｅｌ ら編（１９８９）分子生物学における現在のプロトコル（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒ ｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ） ，Ｊｏｈｎ Ｗ ｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋにも、研究用のプラスミドＤＮＡを 精製するための比較的小規模の方法についての異なる方法が開示されている。 Ｃｈａｎｄｒａら（１９９２）Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．２０３：１６９− １７２には、プラスミドＤＮＡの調製へのハイロードＱセファロース（Ｈｉ−Ｌ ｏａｄ Ｑ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）カラムクロマトグラフィーの使用が記述され ている。Ｍａｒｑｕｅｔら，（１９９ ５）ＢｉｏＰｈａｒｍ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９９５：２６−３７及びＨｏｒ ｎら，（１９９５）Ｈｕｍ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ ６：５６５−５７３に は、プラスミドＤＮＡを調製するためにポリエチレングリコール及びゲル濾過／ サイズ排除クロマトグラフィーの使用を含む技術ならびにプロセス開発の問題が 論じられている。Ｄａｖｉｓら，（１９９６）ＢｉｏＴｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２ １：９２−９９では、塩化セシウム及び陰イオン交換精製プラスミドＤＮＡが、 遺伝子転移効率について比較されている。プラスミドＤＮＡの精製に陰イオン交 換クロマトグラフィー樹脂を用いる高速液体クロマトグラフィーが、Ｔｈｏｍｐ ｓｏｎ（１９８６）ＢｉｏＣｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ １（２）：６８−８ ０及びＣｏｐｐｅｌｌａら，（１９８７）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４０２：１８９−１９９に記述されている。 正接流動濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）に 用いられる原理、理論及び装置は、分離技術、医薬及びバイオテクノロジーの用 途（Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉ ｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ） ，Ｗ ．Ｐ．Ｏｌｓｏｎら編，Ｉｎｔｅｒｐｈａｒｍ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．，Ｂｕｆ ｆａｌｏ Ｇｒｏｖｅ，ＩＬ（１９９５）のＭｉｃｈａｅｌｓ，Ｓ．Ｌ．ら，“ 正接流動濾過（Ｔａｎｇ ｅｎｔｉａｌ Ｆｌｏｗ Ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）”に記述されている。生物学 的試料から内毒素を除去するためのプロセスは、Ｓｈａｒｍａ，（１９８６）Ｂ ｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｃｈｅｍ．８：５−２２；Ｖａ ｎｈａｅｃｋｅら，（１９８９）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．２７（１ ２）；２７１０−２７１２；Ｗｅｉｓｓら，Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｃｏｒｐｏｒ ａｔｉｏｎ，Ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇ Ｍｅｔｈｏｄｓ＃７，“内毒素除去（Ｅｎ ｄｏｔｏｘｉｎ Ｒｅｍｏｖａｌ）”Ｅｄｇｅｗｏｏｄ，ＮＹ；Ｔａｌｍａｄｇ ｅら，（１９８９）Ｊ．Ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ４７６；１７５−１８ ５；及びＨｏｕら，（１９９０）Ｂｉｏｔｅｃｈ．ａｎｄ Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂ ｉｏｃｈｅｍ．１２：３１５−３２４に記述されている。Ｍｏｎｔｂｒｉａｎｄ ら，（１９９６）Ｊ．Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ４４：４３−４６には、ポ リミキシンＢ樹脂を用いた、ＤＮＡからの内毒素の除去が記述されている。 ここで引用される全ての参考文献は、参照することによりそれらの全体がここ で説明されるものとしてここに組み込まれる。 発明の要約 本発明は、溶液から核酸を精製するための方法であっ て、ゲル層を有する限外濾過ユニットを通してその溶液を濾過して透過溶液及び 保持溶液を得、それにより核酸をその保持溶液中に保持し、その保持溶液を集め て精製核酸溶液を得ることを含む方法である。 好ましくは、核酸はＤＮＡであり、特にはウイルス又はプラスミドＤＮＡであ る。限外濾過ユニットは、好ましくは、開放チャンネルフラットプレート装置又 は中空ファイバー装置である。大部分の核酸に対して、限外濾過膜は１Ｋないし １，０００Ｋ、プラスミドＤＮＡに対しては好ましくは約５０Ｋないし５００Ｋ 、最も好ましくは約３００Ｋないし５００Ｋの分子量カットオフを有している。 ゲル層が形成される条件下で限外濾過が行われると、より高い純度が達成される 。このゲル層は、約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉ、好ましくは約１０ないし２０ ｐｓｉの圧力を用いて、約９０分まで形成させることができる。核酸溶液は、こ の限外濾過工程の間に、約２倍ないし約５０倍の範囲に濃縮させることができる 。 さらに好ましい態様においては、正接流動限外濾過の後、保持溶液を０．２μ ｍフィルターを通して濾過し、濾過したプラスミドＤＮＡ溶液を正に荷電したイ オン交換クロマトグラフィー樹脂にかけ、生理食塩水勾配でプラスミドＤＮＡを イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶離することにより、プラスミドＤＮＡ をさらに精製することができる。この精製プラスミドＤＮＡは、さらなるダイア フィルトレーション工程によりさらに精製し、 かつ、任意に、精製プラスミドＤＮＡの目的とする用途に適するバッファ中でさ らに濃縮及び／又は交換することができる。 本発明は、さらに、本発明の方法により調製された核酸を含む薬剤組成物を提 供する。この薬剤組成物は、好ましくはプラスミドＤＮＡであり、核酸のミリグ ラム当たり約１００未満の内毒素単位、約２％未満のＲＮＡ、約１％未満の一本 鎖ＤＮＡ、約０．１％未満のタンパク質、約１％未満のゲノムＤＮＡ及び９０％ を上回る閉じた環状プラスミドＤＮＡを含んでいる。 本発明の有利な点は、フェノール、クロロホルム、エーテル、エタノール、イ ソプロパノール、イソアミルアルコール、ｎ−ブタノール又は他の有機溶媒等の 有機溶媒を用いることなく核酸を調製できることである。このような溶媒の使用 は、最終生成物中に痕跡量が存在する可能性から、安全性及び調節・制御の懸念 を引き起こす。加えて、このような溶媒は有毒であって引火性を有するので、大 規模精製に必要とされる量で用いた場合には、重大な危険性及び廃棄の問題を引 き起こす。本発明の精製核酸はまた、実質的に内毒素が混入していない。 また、本発明の方法により調製される核酸が高度に精製されていることも、本 発明の利点である。高度に精製された核酸は、そのような核酸を用いるプロセス の再現性及び有効性を改善すると共に、安全性の点から有利である。特に、本発 明の高度に精製されたＤＮＡは、脂質 坦体を用いる遺伝子デリバリーに有利に用いられ、それにより再現性のある高い 形質移入効率が得られる。 本発明の特に好ましい態様は、以下の好ましい態様についてのより詳細な説明 及び請求の範囲から明らかとなるであろう。 図面の簡単な説明 図１は、正接流動限外濾過プロセスの模式図である。 図２は、実施例１に記載された大規模プラスミドＤＮＡ精製の模式図を示す。 図３は、プラスミドｐ４１１９の模式図である。 図４は、実施例１に記載されたＴＦＵ前のｐ４１１９調製品（パネルＡ）及び ＴＦＵ後に得られた保持画分（パネルＢ）のＨＰＬＣ分析のグラフである。 図５は、実施例１に記載されたｐ４１９９最終精製生成物のアガロースゲル電 気泳動の結果を示す。レーンは、左から右に、（ａ）分子量マーカー、（ｂ）４ 回切断したｐ４１９９、（ｃ）２回切断したｐ４１９９、（ｄ）１回切断したｐ ４１１９、及び（ｅ）非切断ｐ４１９９である。 図６は、実施例１に記載されたｐ４１９９精製の最終生成物のＨＰＬＣ分析の グラフである。 好ましい態様の詳細な説明定義： “ダイアフィルトレーション（ｄｉａｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）”は、保持物を 連続的に再循環し、かつ新鮮な洗浄液で希釈して、透過物として除去されたもの を置き換える限外濾過システムの稼働様式である。ダイアフィルトレーションは 、一般に、より小さい分子を濾液中に通過させながら保持試料中に保持されるマ クロ分子をより高純度で分離させる。また、同じ工程における溶媒の除去又はバ ッファの交換に用いることもできる。“連続ダイアフィルトレーション”は、濾 過を行いながら新鮮な洗浄バッファを連続的に添加することを指す。“不連続ダ イアフィルトレーション”は、限外濾過による試料の濃縮及びバッファでの再希 釈を反復させる工程を指す。 “ゲル層”は、限外濾過膜上又はその内部に形成され得る生体分子のゼラチン 状薄層を指す。このゲル層は、一般には、通常濃度分極とも呼ばれる一定の溶質 濃度を有する、粘着性接着層である。これは、通常、その層を形成する溶質の性 質に応じてある程度の水圧透過性（ｈｙｄｒａｕｌｉｃ ｐｅｒｍｅａｂｉｌｉ ｔｙ）を有する。“ゲル層制御”限外濾過は、ゲル層が濾液の流速に対する制限 因子になり、さらなる圧力の増加にほとんど、もしくは全く効果がない濾過条件 を指す。対照的に、“膜制御”条件は、膜の透過性及び加えられる圧力によって 濾液の流速が制御されるものである。 “開放チャンネル”フィルターは、供給チャンネル内 にスクリーン（篩）を持たないものである。対照的に、“スクリーンチャンネル ”もしくは“閉鎖チャンネル”は、供給チャンネル内に篩を備えるフィルターで ある。 “透過物”は、試料の限外濾過膜を通過する部分を指し、“濾液”とも呼ばれ る。 “保持物”は、試料の限外濾過膜を通過しない部分を指す。 “正接流動”もしくは“交差流動”濾過は、試料溶液が膜の頂部を横切って循 環し、その間に印加した圧力により溶質及び小分子が膜を通過する濾過プロセス を指す。 “限外濾過”は、約０．００１μｍないし約０．０５μｍの範囲の細孔サイズ を有する膜を通す濾過により粒子を分離する技術を指す。限外濾過膜は、典型的 には、１，０００ないし１，０００，０００ダルトンの範囲の分子量カットオフ （ＭＷＣＯ）を有する。このＭＷＣＯは、典型的には、その膜によって９０％が 保持される球状溶質の分子量として定義される。フィルトロン（Ｆｉｌｔｒｏｎ ）カタログ、１９９５／９６、第５頁を参照のこと。膜を通過し、もしくはそれ により保持される粒子の実際の分子量は、サイズはもちろんのこと、所定の分子 の形状（ｃｏｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ）及び電荷、性質もしくは膜の細孔あるいは マトリックス、及び溶液の導電率とｐＨにも依存する。 今では、タンパク質、細胞残滓、内毒素、小分解ヌクレオチド、およびその他 を含む物質の混合物から、正接 流動限外濾過（ＴＦＵ）により核酸を高度に精製することができることが見出さ れている。この技術は簡潔で効率的であり、かつ非常に高い純度の核酸を一工程 で、しばしばＨＰＬＣ分析で９５％ないし１００％のオーダーで生成する。また 、一工程でダイアフィルトレーションと適切に組み合わせ、それにより核酸溶液 を濃縮及び／又は異なるバッファ溶液中に交換して溶媒、塩等を除去することも できる。 ここに記述される方法により精製及び／又は濃縮することができる核酸には、 ＤＮＡ、ＲＮＡ及びキメラＤＮＡ／ＲＮＡ分子が含まれ、真核細胞及び原核細胞 を含むあらゆる生物学的な源に由来するものであっても、合成物であってもよい 。精製することができる核酸には、染色体ＤＮＡ断片、リボソームＲＮＡ、ｍＲ ＮＡ、ｓｎＲＮＡ、ｔＲＮＡ、プラスミドＤＮＡ、ウイルスＲＮＡもしくはＤＮ Ａ、合成オリゴヌクレオチド、リボザイム等が含まれる。好ましいものは、ウイ ルスの核酸及び染色体外ＤＮＡである。特に関心があるものは、治療用遺伝子を コードするプラスミドＤＮＡである。“治療用遺伝子”により、適切な宿主細胞 において発現してその宿主細胞中の欠陥もしくは発現不十分の遺伝子を補完する ことが可能な機能的遺伝子もしくは遺伝子断片はもちろん、例えば、アンチセン ス配列、リボザイム、トランス優性阻害物質等の、発現したときに宿主細胞中の 遺伝子の機能を阻害もしくは抑制する遺伝子又は遺伝子断片をも含 めることが意図されている。 したがって、例えば、ウイルスＤＮＡ又はＲＮＡを原核又は真核ウイルスから 精製することが可能であり、ここでは、まず最初に、ウイルス粒子をウイルス感 染を許容する培養物又は細胞から、例えば、細菌、昆虫、酵母、植物又は哺乳動 物細胞培養物から、通常の技術に従って精製する。染色体外ＤＮＡには、例えば 、哺乳動物細胞（例えば、Ｙａｔｅｓら，Ｎａｔｕｒｅ（１９８５）３１３：８ １２−８１５；Ｈｅｉｎｚｅｌら，Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．（１９９１） １１（４）：２２６３−２２７２）、植物細胞、酵母細胞（例えば、２μｍプラ スミド）、及び原核細胞を含む様々な源に由来する、自立的に複製するＤＮＡが 含まれる。原核細胞から単離されるプラスミドＤＮＡには、天然プラスミドはも ちろん、例えば、マーカー遺伝子又は治療用遺伝子等の、問題となる遺伝子をコ ードする組換えプラスミドが含まれる。 正接流動限外濾過の前の核酸試料の初期予備精製は、核酸の源及び所望の精製 水準に依存して行われる。理想的には、混入物の多くを正接流動限外濾過以前に １以上の粗精製工程により除去し、限外濾過膜を汚染して効率の妨げとなりうる 混入粒子の数を減少させ、かつ核酸と共に保持されるより大きな汚染物質の量を 低下させる。生物学的な源、例えば、細胞系、哺乳動物、酵母、植物又は細菌細 胞を含む組織及び細胞から得られる核酸に対 しては、細胞を溶解し、かつ細胞成分、例えば、タンパク質、細胞壁もしくは膜 を除去するための初期予備工程は、当該技術分野における通常の技術を有する者 に知られた通常の方法を用いて行うことができる。例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋら 、１９８９；Ａｕｓｕｂｅｌら、１９８９を参照のこと。プラスミドＤＮＡのよ うな染色体外ＤＮＡを精製するためには、染色体ＤＮＡを剪断しない方法を用い ることが望ましく、それにより、その除去をより容易にし、かつ最終プラスミド ＤＮＡ生成物との混入を回避することができる。したがって、例えば、アルカリ 及び／又は洗浄剤、例えば、ＳＤＳ、ＮＰ４０、ツィーン２０等で溶解した後に タンパク質、染色体ＤＮＡ及び細胞残滓を沈殿させることを含む通常の手順を用 いて、細胞源からプラスミドＤＮＡを単離することができる。哺乳動物細胞から 細胞外ＤＮＡを精製するには、例えば、従来のハート（Ｈｉｒｔ）抽出を用いる ことができる；Ｈｉｒｔ，Ｂ．，（１９６７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６：３ ６５−３６９。合成核酸については、ＴＦＵに先立つ予備処理は、ほとんど、も しくは全く必要ない。 医薬品グレードの核酸が望まれる場合には、安全性及び制御の懸念を引き起こ し得る有機溶媒又は毒性化学物質の使用を予備工程に含めないことが非常に好ま しい。下記実施例１には、有機化学物質もしくは毒性化学物質を用いることなく 、本発明の方法を用いて、高純度の医 薬品グレードのプラスミドＤＮＡを生成する方法が例示されている。 図１は、正接流動限外濾過プロセスの模式図である。簡単に述べると、供給タ ンク１０は濾過しようとする試料溶液を収容する。この溶液は、供給チャンネル 、すなわち供給ライン２０を介して濾過ユニット５０に入る。供給ライン２０に 位置する循環ポンプ３０は、溶液流を制御する。濾過ユニット５０は、限外濾過 膜を備えている。この限外濾過膜を通す濾過により、試料溶液が透過溶液及び保 持溶液に分離する。透過溶液は、透過チャンネル、すなわち透過ライン６０を介 してユニットから排出される。この透過チャンネルを介する流動は、透過チャン ネル６０に位置する透過弁により制御することができる。保持溶液は、循環して 供給タンク１０に戻る保持チャンネル、すなわち保持ライン９０に入る。限外濾 過膜を貫通する圧力（膜貫通圧、すなわちＴＭＰ）は、供給チャンネル４０及び 保持チャンネル８０の圧力検出器によって測定される。ＴＭＰは、保持弁１００ を調整することにより制御される。ＴＦＵがダイアフィルトレーションモードで 行われる場合には、供給タンク１０で、試料溶液にダイアフィルトレーションバ ッファ１１０を添加する。しかしながら、ＴＦＵが試料溶液の濃縮に用いられる 場合には、供給タンク１０にダイアフィルトレーションバッファ１１０を添加し ない。システムの制御は、圧力変換器、流量計、インライン導電率計、及び他 のフィードバックループを用いて手動で、又は自動で行うことができる。 限外濾過膜は、精製しようとする核酸のサイズ及び形状に基づいて選択し、典 型的には、１Ｋないし１，０００Ｋダルトンの範囲の分子量カットオフ（ＭＷＣ Ｏ）を有する。多くの高次コイルプラスミドＤＮＡに対しては、約３００Ｋない し５００ＫダルトンのＭＷＣＯを有する限外濾過膜を用いることができる。しか しながら、幾つかのより大きいプラスミドに対しては、より大きいＭＷＣＯ膜を 用いると、得られるＤＮＡの速度、純度及び品質が改善される。したがって、好 ましくは、約２Ｋｂないし１５Ｋｂの範囲のサイズを有するプラスミドＤＮＡは 、３００ＫダルトンのＭＷＣＯを有する限外濾過膜を用いて精製し；約１５Ｋｂ ないし約５０Ｋｂの範囲のプラスミドは５００ＫダルトンのＭＷＣＯを有する膜 を用いて精製することができ；約４０Ｋｂ以上のプラスミドは１，０００Ｋダル トンのＭＷＣＯを有する膜を用いて精製することができる。幾つかの中空ファイ バー限外濾過装置、例えば、対称性細孔を有するものを用いて、より大きな称呼 細孔サイズを用いることができる。例えば、約５ＫｂまでのプラスミドＤＮＡは 、中空ファイバー装置において、５００ＫダルトンまでのＭＷＣＯを有する膜を 用いて精製することができる。 これらの条件下で、プラスミドＤＮＡは保持物中に保持され、これに対して多 くのタンパク質、細胞膜残滓、 炭水化物、小分解ヌクレオチド等を含む混入物質は、膜を通過して濾液中に入る 。より小さい核酸、例えば、小合成オリゴヌクレオチドは、約１Ｋないし５Ｋダ ルトンのＭＷＣＯを有する限外濾過膜を用いて精製することができる。精製しよ うとするあらゆる核酸に対し、様々な製造業者から入手可能な小規模装置、例え ば、遠心装置、攪拌細胞装置、又は小規模中空ファイバーシステムを用いて、最 適膜細孔サイズを経験的に決定することができる。プロセス規模の開発における パラメータの最適化には、マニホールド系を用いることができる。限外濾過装置 の市販品としては、ポール−フィルトロン（Ｐａｌｌ−Ｆｉｌｔｒｏｎ）（ノー スバラ、ＭＡ）、ミリポア（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（ベッドフォード、ＭＡ）、 及びアミコン（Ａｍｉｃｏｎ）（ダンバース、ＭＡ）が含まれる。 例えば、平坦プレート装置、螺旋巻きカートリッジ、中空ファイバー、管状又 は単シート装置など、本発明において有用な多くの型の限外濾過装置が購入可能 である。Ｍｉｃｈａｅｌｓら、（１９９５）を参照のこと。限外濾過ユニットは 、平坦プレート装置又は中空ファイバー装置であることが好ましい。 ＴＦＵに用いられる濾過装置が開放チャンネル装置である場合、核酸の剪断が 最小化されることが見出されている。篩を備えたチャンネルは、ゲル層の形成を 妨げ、保持される核酸を剪断してその収量を減少させることが 見出されている。しかしながら、剪断及び核酸の損失を最小限にすることができ るように、篩の圧縮が最小であるようなスクリーンチャンネルを設計することは 可能である。 用いられる限外濾過膜の表面積は、精製しようとする核酸の量に依存する。一 般には、核酸のグラム当たり約１０平方フィートの膜が用いられる。したがって 、核酸２００ないし８００ｍｇ当たり約５平方フィートの膜が用いられ；より一 般的には、核酸４００ないし約６００ｍｇに対して約５平方フィートの膜が用い られる。 この膜は、吸着損失を最少化するために低結合性の材料のものにでき、用いよ うとするバッファに対して耐久性があり、それで清浄化することができて、かつ それに化学的に適合するものであるべきである。例えば、酢酸セルロース、ポリ スルホン、ポリエーテルスルホン及びポリビニリデン二フッ化物などの多くの適 切な膜が、商業的に入手可能である。好ましくは、この膜の材料はポリエーテル スルホンである。 ＴＦＵの開始前に膜表面にゲル層を形成させると、より高い収量及び純度が得 られることが見出されている。したがって、最初に、透過弁７０を開放し、かつ 透過溶液を供給タンク１０に再循環させながら、ゲル層を形成させるのに十分な 時間、限外濾過装置５０を通して試料溶液を循環させる。ゲル層形成に必要な時 間は、例えばＨＰＬＣ分析により、生成物の損失に対する透過溶液を、 監視することによって、経験的に決定することができる。ひとたび透過物に入る 生成物の損失が十分に低くなれば、そのゲル層は適切である。好ましい条件下に おいて、このゲル層は、通常はその膜を通過する核酸分子を保持することができ る第２膜障壁として作用する。しかしながら、例えば圧力及び供給等、完全にゲ ル層を制御する条件下で限外濾過を行う必要はない。したがって、ここで用いら れる場合、ゲル層存在下での濾過とは、限外濾過膜単独から生じるものを越えて 、さらなる溶質を保持するのに十分なゲル層が存在することを意味する。 一般的には、ゲル層は、装置及び核酸のサイズに応じて、約５ないし９０分間 、好ましくは約２０ないし６０分間形成させる。例えば、小プラスミドＤＮＡ（ 例えば、２Ｋｂ）を精製するのに、平坦プレート装置を用いて、ゲル層を約６０ ないし９０分間形成させる；より大きいプラスミドＤＮＡ（例えば、２〜７Ｋｂ ）に対しては、ゲル層を約３０分形成させる。中空ファイバー装置を用いると、 ほとんどのプラスミドＤＮＡに対して約５ないし３０分、約２Ｋｂ未満のプラス ミドＤＮＡに対しては４５分まで、それぞれゲル層を形成させることができる。 ゲル層が形成された後、透過ライン６０の内容物を廃棄物容器に流して空にし、 濾過を進行させる。 初期循環期間中にゲル層が形成されない場合、通常は、透過溶液への漏出によ り生成物が失われる。生成物の損失量は、用いられる装置の型、膜のＭＷＣＯ及 び試料中 の核酸の全量に依存する。したがって、生成物の収量が重要ではない状況におい ては、その間にゲル層が形成される初期循環期間を設けずに、濾過を行うことが できる。このような場合、濾過の初期期間にゲル層を形成させることが可能であ り、その後には透過溶液への生成物の漏出が減少し、生成物が保持溶液中に保持 される。例えば、中空ファイバー装置においては、短期間（例えば、約５Ｋｂの プラスミドＤＮＡ及び約１５０ｍｇＤＮＡ／平方フィートに対しては約５分）で ゲル層を形成することができるため、ゲル層形成の初期期間の生成物の損失は大 きいものではなく、したがって、その間にゲル層が形成される供給タンクへの透 過溶液の再循環は必要ない。 濾過は、正接流動を用いて行い、試料バッファを膜表面と交差するように循環 させる。正接流動濾過の間、膜を横切るように圧力を加え、これにより保持物が 再循環されながらより小さい分子がその膜を通過する。一般的には、一定の膜貫 通圧が維持されるように流速を調整する。通常、流速及び圧力は、ゲル層の形成 のために初めは変動する。一般には、圧力及び流速が高いほど濾過が早く進行す るが、高流速は核酸の剪断又は膜の通過による損失を引き起こすように思われる 。加えて、様々なＴＦＵ装置に、それらを稼働させる上での特定の圧力限界が存 在しうる。したがって、圧力は、製造者の仕様に従って調整することができる。 平坦プレート装置に対しては、圧力は好ましくは約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉ 、 最も好ましくは１０ｐｓｉないし２０ｐｓｉの範囲にある。大部分のプラスミド ＤＮＡに対しては、１５ｐｓｉないし２０ｐｓｉが好ましい。循環ポンプ３０は 、核酸の剪断を確実に最小限なものとするように選択される。一般的には、循環 ポンプ３０は、供給チャンネル２０内の蝙動ポンプ又はダイアフラムポンプであ り、その圧力は保持弁１００を調整することにより制御される。 濾過は、一般には、ダイアフィルトレーション様式で行われる。任意に、所望 の容積に濃縮されるまでバッファを添加することなく、最初に試料溶液を濾過す ることができる。ひとたび濃縮されたら、ダイアフィルトレーションバッファ１ １０を添加し、濾過を続けて小分子が混入する保持溶液を洗浄し、望ましくない 溶媒及び塩を除去する。ダイアフィルトレーションは、連続的であっても不連続 であってもよい。好ましくは、ダイアフィルトレーションは連続的であり、約５ ないし約５００容積に相当するもの、好ましくは約１０ないし１００容積に相当 するものが交換されるまで行う。一般には、必要とされる純度に応じて、核酸に 結合する混入物が増加するに従って、より多くのダイアフィルトレーションを行 う。 ＴＦＵの後の精製核酸の収量をさらに改善するため、透過弁７０を閉鎖し、濾 過ユニット５０を介して保持溶液を数分間再循環させて残留核酸を除去する。保 持溶液を回収し、ダイアフィルトレーションバッファ１１０をさらに添加して、 膜フィルターを洗浄する。典型的には、 １ないし２容積に相当するダイアフィルトレーションバッファ１１０を用いて膜 フィルターを洗浄する。保持物を再度集め、精製核酸を含む元の保持溶液と合わ せる。 正接流動限外濾過によって精製した核酸は、直接用いることができ、又は出発 試料における混入の水準及びタイプ、並びに所望の用途に応じて、さらに精製す ることができる。一般的には、正接流動濾過により精製される核酸は、ＨＰＬＣ による分析で、９０％を上回る純度であり、しばしば９５％ないし１００％の純 度である。このようにして精製された核酸は、多くの用途、例えば、クローン化 もしくは遺伝子発現のような分子生物学的用途、又は、例えばＰＣＲ、ＲＴ−Ｐ ＣＲ、デンドリマー形成等を用いる診断用途に用いることができる。 治療上の使用、例えば、遺伝子治療における使用については、正接流動濾過工 程から得られた核酸をさらに精製することが望ましい。本発明の好ましい態様に おいては、正接流動濾過から得られた核酸試料を、続けて０．２μｍフィルター を通して濾過し、イオン交換クロマトグラフィーを用いてさらに精製して、任意 に、再度０．２μｍフィルターを通して濾過する。望ましくは、この核酸を限外 濾過を用いてさらに濃縮してダイアフィルトレーションし、最終滅菌工程として 再度０．２μｍフィルターを通して濾過する。 ０．２μｍフィルターを通す濾過は、核酸の損失を最少に止めながら内毒素及 び微生物を除去するのに用いる ことができる。０．２μｍフィルターは、様々な市販品から入手することができ 、これらにはポール−フィルトロン（イースト・ヒルズ、ＮＹ）、サルトリウス （Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）（エッジウッド、ＮＹ）、及びゲルマン（Ｇｅｌｍａｎ ）（アナーバー、ＭＩ）が含まれる。理想的には、用いられるフィルターは、核 酸を通過させる一方で内毒素に結合するものである。ポール・ウルティポア（登 録商標）（Ｐａｌｌ Ｕｌｔｉｐｏｒ）Ｎ₆₆（登録商標）フィルターは、高収率 の核酸を生じさせながら相当量の内毒素を除去することが見出されている。好ま しくは、０．２μｍフィルターを通す濾過に先立ち、０．４５μｍフィルターを 通して核酸溶液を予備濾過する。内毒素の除去のために作製されたフィルター、 例えばイオン交換フィルターは、多くの場合において、核酸がそのフィルターに 結合してしまうため、核酸精製での使用には適していない。 イオン交換クロマトグラフィーを、特に混入内毒素、痕跡タンパク質、及び残 留細胞性混入物から核酸をさらに精製するのに用いることができる。クロマトグ ラフィーカラムに陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を充填する。カラムの最 適容積は、用いられる樹脂及び精製しようとする核酸のサイズに基づいて経験的 に決定する。 イオン交換クロマトグラフィー樹脂は、商業的に入手することができ、これら にはＥＭセパレーションズ（ＥＭ Ｓｅｐａｒａｔｉｏｎｓ）（ギブスタウン、 ＮＪ）、 バイオセプラ（ＢｉｏＳｅｐｒａ）（モールバラ、ＭＡ）、ポリマー・ラボラト リーズ（Ｐｏｌｙｍｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）（アマースト、ＭＡ）、 パーセプティブ・バイオシステムズ（Ｐｅｒｓｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅ ｍｓ）（ケンブリッジ、ＭＡ）、タソ・ハース（Ｔａｓｏ Ｈａｓｓ）（モント ゴメリビル、ＰＡ）及びファルマシア（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）（ウプサラ、スウ ェーデン）が含まれる。大部分のプラスミドＤＮＡに対して好ましい樹脂は、細 孔がないもの、又は、例えば１０００Åを上回り、好ましくは約３０００Åない し４０００Åの大細孔サイズを有し、例えば、約２０ないし５００μｍ径の中程 度ビーズサイズを有するもので、マトリックス成分を浸出させないものである。 この樹脂は、例えば水酸化ナトリウムで洗浄して反復使用が可能でもあることが 理想的である。 クロマトグラフィーカラムに、陰イオン交換クロマトグラフィー樹脂を充填す る。カラムの最適容積は、用いられる樹脂及び精製しようとする核酸のサイズに 基づいて経験的に決定する。カラムは、低圧下、一般的には約７バール未満で充 填する。この圧力は、用いられる樹脂に依存し、通常は製造者の仕様に従う。樹 脂の細孔サイズが小さくて樹脂細孔内での核酸の捕捉が制限される場合には、カ ラム圧はより低くてもよい。したがって、細孔を持たない樹脂に対しては、カラ ム圧を増加させることができる。カラムは、通常の技術に従い、予想される 流速の約２倍で充填する。 核酸試料を、その核酸がカラムから溶離する濃度を下回る塩濃度を有する添加 バッファーに含めてカラムに添加する。典型的には、塩濃度は、用いられる樹脂 に応じて約１０ないし５０ｍＳである。より弱い陰イオン交換樹脂に対してはよ り低い導電率の溶液が用いられ、それに対し、より強い陰イオン交換樹脂に対し てはより高い導電率の溶液が用いられる。その後、カラムを数カラム容積のバッ ファで洗浄して、樹脂に弱く結合する物質を除去する。次に、通常の方法による 浅い連続生理食塩水勾配を用いて、例えば、トリス−ＨＣｌバッファ中１．５Ｍ までのＮａＣｌを用いて、カラムから画分を溶離する。試料画分をカラムから回 収する。中規模調製（例えば、約１００ｍｇないし約３グラムの核酸）に対して は、核酸ピークが期待される画分は、典型的には少なくとも５０ｍｌないし２リ ットルであり、その後期待されるピークを越えてからは容積を増加させる。核酸 の収量及び純度の分析測定を、各々の画分に対して行う。加えて、カブトガニ血 球抽出物（ＬＡＬ）分析を各画分に対して行い、各画分中の残留内毒素の水準を 決定することができる。高水準の核酸及び低内毒素を含む画分をプールする。得 られた核酸試料を、内毒素の水準及び所望の純度に応じて、再度０．２μｍフィ ルターを通して濾過することができる。 多くの用途に対し、引き続く使用のため、さらに核酸 を精製し、生じる核酸試料の塩濃度を低下させ、試料を濃縮し、及び／又はバッ ファをより適切なバッファに交換することが望ましい。この結果を得るため、最 終ダイアフィルトレーション工程をこの段階で行うことができる。所望であれば 、それ以前の精製に用いられたものよりも小さいＭＷＣＯの限外濾過膜を、この 引き続くダイアフィルトレーション工程に用いることができるが、これは、核酸 がこの段階で高度に精製され、かつ小さいものが優勢な溶質分子が膜を通過して 濾液中に入るためである。多くのプラスミドＤＮＡに対して、１０Ｋないし１０ ０ＫのＭＷＣＯ膜を用いることができる。より小さい停滞容積、流動の増加、高 収量及びより短い処理時間のため、約１００ＫのＭＷＣＯ膜を備える中空ファイ バー装置が、この段階で、特には濃縮された核酸溶液を取り扱う場合に好ましい 。 上記プロトコルに従って精製されたＤＮＡを、遺伝子治療において用いるため に脂質坦体と複合体を形成させる場合には、好ましくはダイアフィルトレーショ ンにより、そのＤＮＡを低導電性バッファ中に交換することが望ましい。低導電 性バッファとは、約１０ｍＳ未満、好ましくは約１ｍＳ未満のあらゆるバッファ を含むことを意味する。 上記プロトコルの様々な箇所で、核酸の収量及び純度の分析測定が有益に行わ れる。典型的には、このような分析は、例えば予備イオン交換クロマトグラフィ ーから の核酸含有画分の各々に対して行う他に、各精製工程の前後に行う。これらの分 析測定を行うのに好ましい手段には、純度のＨＰＬＣ分析、収量の分光光学的評 価、タンパク質分析用の銀染色及びＳＤＳ−ＰＡＧＥ、並びにＤＮＡ分析用のア ガロースゲル電気泳動及びサザンブロッティングが含まれる。 以下の実施例は、上述の方法及び有利な結果についての特定のアスペクトを説 明する。以下の例は説明として示されるものであって、限定するものとして示さ れるものではない。 実施例１ ｐ４１１９ＤＮＡの調製 製薬品質のＤＮＡを、全ての細胞培養手順に無菌培養条件を用いて、以下のよ うに調製した。図２は手続工程の模式図である。 カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）を補い追加した１００ｍｌＴＢブロス（ Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９）を収容する５００ｍｌの泡栓（ｆｏａｍ−ｐｌ ｕｇｇｅｄ）フラスコに凍結（−８０℃）細菌培養物１ｍｌを添加することによ り、凍結貯蔵物から、プラスミドｐ４１１９（図３）を含む大腸菌の接種物を調 製した。培養物を約６時間、３７℃でインキュベートし、２２０ｒｐｍで振盪し た。培養物の成長を目視検査により、又はＯＤ₆₀₀を測定することにより決定し 、それにより０．５ない し５のＯＤ値が許容可能であると判断された。 この培養物５ｍｌを用いて、カルベニシリン（１００μｇ／ｍｌ）及び１ｍｌ ／１０Ｌメイズ（Ｍａｚｕ）ＤＦ２０４消泡剤を補った１０Ｌ ＴＢ培地を収容 する４つのバイオリアクターの各々に接種した。この培養物を３７℃でインキュ ベートし、最初に３００ｒｐｍで攪拌した。これらの培養物を曝気し、カスケー ド制御ループ、攪拌、空気流、及び平均で約４０％飽和度への酸素濃縮により、 溶解した酸素を制御した。培養物を約１０ないし１６時間インキュベートした。 インキュベーションの後、各培養物の細胞含有量をＯＤ₆₀₀により決定した：Ｏ Ｄ₆₀₀値は、１６〜１８の範囲であった。細胞を、冷却カール連続流動遠心で、 遠心により回収した。 細胞ペレットを薄いシートに広げ、さらなるプラスミド精製に用いるまで−８ ０℃で凍結した。３．２Ｋｇの細胞ペレットを、１６Ｌの溶液Ｉ（２５ｍＭトリ ス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭデキストロース）に、室温 で、１５０ｒｐｍで攪拌しながら１時間再懸濁させた。ＲＮＡ分解酵素（３０５ ｍｇＲＮＡ分解酵素／Ｋｇ細胞ペレット）を添加することによりＲＮＡ分解酵素 消化を行い、その溶液を氷上で２時間インキュベートした。それらの細胞を氷浴 中の溶液ＩＩ（０．２Ｎ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ）３２Ｌに添加して細胞を溶解 した。この溶液をバウ−タイ（Ｂｏｗ−Ｔｉｅ）攪拌機（コール・パーマー（Ｃ ｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）、 バーノン・ヒルズ、ＩＬ）を用いて２５分間攪拌した。次に、この溶液を中和し 、１６Ｌの氷冷溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム、５Ｍ酢酸塩、ｐＨ５．５）を添加し て細胞残滓及び染色体ＤＮＡを沈殿させた。この溶液を、バウ−タイ攪拌機を用 いて氷上で２５分間混合した。 沈殿した物質を、中和細胞溶解溶液から遠心により除去した。この溶液を１Ｌ 遠心ボトルに等分し、５３００ｒｐｍで２０分間２℃で遠心した。その後、上清 を、互いに９０°に配置された２層ミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）（カルバ イオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、ラ・ホーヤ、ＣＡ）を通して室温で容器に デカントした。次に、このデカントした上清を、連続的に配置された１．２及び ０．２μｍフィルターを通して濾過した。この段階での遠心の代わりとして、セ ライトメ ＨＹＦＬＯ ＳＵＰＥＲ ＣＥＬメ（セライト社（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏ ｒｐ．）、ロンポック、カリフォルニア）のような珪藻土物質に通す濾過により 、沈殿物質を除去することができる。米国特許第５，５７６，１９６号を参照の こと。 次に、濾過した物質を限外濾過ユニットに汲み入れ、３００ＫのＭＷＣＯを有 する２５ｆｔ²のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いるポール−フィルト ロンオメガ開放チャンネルセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｓｅｔｔｅ）ユニット を通す正接流動濾過により、ＤＮＡ溶液を濾過した。その溶液を、１０ｐｓｉの 圧力下で透過チャンネルを開放してユニットに導入し、この溶液を、ゲ ル層が形成されるまでユニットを通して約５０分間循環させた。その後、透過チ ャンネルを廃棄物容器に向け、ＤＮＡ溶液を、この溶液が約３．６Ｌの容積に濃 縮されるまで１０ｐｓｉの圧力で濾過した。次に、ダイアフィルトレーションバ ッファ（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を添加し、約５０容積の交換が行われる まで、１０ｐｓｉの圧力、約１Ｌ／分の流速で、連続的にダイアフィルトレーシ ョンを行った。 ダイアフィルトレーションの後、透過弁を閉鎖し、限外濾過膜を通して保持物 を１０分間再循環させた。保持物を除去し、透過弁を閉鎖して、洗浄当たりさら に１Ｌのダイアフィルトレーションバッファを添加して、各１０分間、計２回、 膜を洗浄した。その洗浄溶液を保持物に添加し、ＨＬＰＣ及びＯＤ_260/280分析 により分析した。 ＨＰＬＣ分析は、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＤＥＡＥ−ＮＰＲ樹脂を充填した４．６ｍ ｍ×３．５ｃｍＨＰＬＣカラムを用いて１ｍｌ／分の流速で行い、２５４ｎｍで モニターした。バッファＡ（２０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８）で試料を１：２ ０に希釈し、２５μｌの容積でカラムに注入した。０％バッファＢ（２０ｍＭト リス−ＨＣｌ、ｐＨ８／２Ｍ ＫＣｌ）：１００％バッファＡから６０％バッフ ァＢ：４０％バッファＡの勾配で、９分間にわたって試料を溶離した。透過物（ パネルＡ）及びプラスミドＤＮＡ生成物を含む保持物（パネルＢ）のＨＰＬＣ分 析を、図４に示す。プラスミドＤＮＡは、この段階で のＨＰＬＣによる測定で、一般的には９５％の純度であり、しばしば１００％の 純度である。 分光学的分析は、２５０、２６０及び２８０ｎｍの波長で行った。精製ＤＮＡ の一般的な比はｍＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₅₀＞１．１及びＤＯ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀＞１．９であ る。上記手順で、合計２．３０７ｇのプラスミドＤＮＡが単離及び精製され、１ ．１０４７のＯＤ₂₆₀／ＯＤ₂₅₀、１．９２９０のＤＯ₂₆₀／ＯＤ₂₈₀を有していた 。 回収されたプラスミドＤＮＡを、ゲルマン・グランド・ウォーター・カプセル （Ｇｅｌｍａｎ Ｇｒｏｕｎｄ Ｗａｔｅｒ Ｃａｐｓｕｌｅ）０．４５μｍフ ィルターを通して２回濾過した後、ポール−フィルトロン・カプセルＮ₆₆０．２ ２μｍフィルターを通して２回濾過した。 プラスミドＤＮＡを、イオン交換クロマトグラフィーによりさらに精製した。 ＤＮＡを、総容積４７４０ｍｌで、総容積２．５ＬのＴＭＡＥ−６５０（Ｍ）（ トリメチルアミノエチル）フラクトゲル（Ｆｒａｃｔｏｇｅｌ）（ＥＭセパレー ションズ、ギブスタウン、ＮＪ）を充填したアミコン・バンテージＡ（Ａｍｉｃ ｏｎ Ｖａｎｔａｇｅ Ａ）カラムに添加した。このカラムを、平衡化バッファ （５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５）を用いて、ＬＦＶ（直線流速）８０−１５０ｃ ｍ／時、カラム圧０．７バールで平衡化した。ＤＮＡを流速２２５ｍｌ／分、カ ラム圧０．７バールで添加した。このカラムを、３な いし５カラム容積の平衡化バッファを用いて、３２−３５ｍＳで洗浄した。ＤＮ Ａを、３２ｍＳないし５９ｍＳ、又は５０ｍＭトリス、ｐＨ８．５中の０．５Ｍ ＮａＣｌないし１．５Ｍ ＮａＣｌの溶出勾配を用いて、流速２２５ｍｌ／分 及びカラム圧０．５５バールでカラムから溶離した。Ａ₂₆₀が０．２を上回った 時点から１３０ないし１６５０ｍｌの容積で画分を回収し始め、Ａ₂₆₀が０．２ 未満となった時点で終了した。 全ての画分を、ＨＰＬＣ及びＬＡＬ内毒素検定により分析した。それらの結果 を表１に示す。合計で２０４４ｍｇのＤＮＡをカラムに添加して、１９４６ｍｇ を６０７９ｍｌの総容積で回収し、収率は９５．２２％であった。カラム画分２ −１０をプールした（５９４１ｍｌ中１９０５ｍｇのＤＮＡ及び３．７３×１０⁵ ＥＵ ＬＰＳ）。プールする画分は、調製品中の混入リポ多糖（ＬＰＳ）の量 を最小にしながら、最大収量の回収ＤＮＡが得られるように選択した。 回収されたＤＮＡ溶液を、ポール・ウルティポアＮ₆₆０．２μｍフィルターを 通して濾過した。塩含量を減少させるため、このＤＮＡ溶液を、ポール−フィル トロン・セントラーネート（Ｃｅｎｔｒａｒｎａｔｅ）開放チャンネル１００Ｋ ＭＷＣＯ膜（２．０平方フィート）を用いた最終ダイアフィルトレーション工 程にかけた。濾過ユニット及び膜を、まず１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．０ の溶液１Ｌで平衡化した。このバッファを、ポンプ及び無菌の貯留ボトルを用い て、膜を横切らせて循環させた。透過チャンネルを完全に解放してＤＮＡ溶液を 添加し、この溶液を１０ｐｓｉで約３０分間循環させた。次に、このＤＮＡ溶液 を、約１００ｍｌの容積に濃縮されるまで限外濾過した。次いで、濃縮した溶液 を、連続ダイアフィルトレーションを用い、１０ｍＭトリス−ＨＣｌ、ｐＨ８に 対して、１０ｐｓｉ及び透過流速１２０ml／分で、溶液の導電率が初期値３５ｍ Ｓから１ｍＳ（０．６０）未満（バッファの導電率＝０．５３ｍＳ）に減少する までダイアフィルトレーションを行った。その後、透過弁を閉鎖し、限外濾過膜 を通して保持物を１０分間再循環した。次に、保持物を回収し、１０ｍＭトリス −ＨＣｌ、ｐＨ８．０の洗浄液１００ｍｌで３回、膜を洗浄した。 ダイアフィルトレーション済みのＤＮＡ溶液及び各々の洗浄液のＤＮＡ及び内 毒素濃度を、上述のようにして決定した。保持物及び第１洗浄液をプールし、１ ．３６ ６ｇのＤＮＡを５．５６４ｍｇ／ｍｌ及び９０．３５ＥＵ／ｍｌ、すなわち１６ ．２４ＥＵ／ｍｇＤＮＡの濃度で得た。このＤＮＡ溶液を、ミリポア・ミリパク （Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ Ｍｉｌｉｐａｋ）４０ ０．２２μｍフィルターを通し て濾過した後、さらに２５ｍｌの最終ダイアフィルトレーションバッファーを濾 過し、この２つの溶液をプールして最終生成物を得た。 最終限外濾過からの最終プラスミドＤＮＡ生成物の収率は、８０％であった。 次に、この最終生成物を等分し、使用時まで−２０℃で保存した。この最終生成 物は以下の品質管理規格を満たすことが測定された。 色 透明から僅かに曇り 内毒素 ＜１００ＥＵ／ｍｌ 純度 ＨＰＬＣで＞９５％ ＤＮＡ均一性 ＞９０％ｃｃｃ（共有結合的に 閉じた環状） ＲＮＡ 分析ＨＰＬＣで＜２％ ｓｓＤＮＡ 分析ＨＰＬＣで＜１％ タンパク質 分析ＨＰＬＣ、銀染色及びＳＤ Ｓ−ＰＡＧＥで＜０．１％ ゲノムＤＮＡ 分析ＨＰＬＣ及びサザンブロッ トで＜１％ 導電率 ＜１ｍＳ ｐＨ ７−８．５ 無菌性は、第２１日目のトリプトースブロス培養物に よって検定し、これはコロニーを示さなかった。同一性は、制限エンドヌクレア ーゼ消化及びアガロースゲル電気泳動による分析によって測定した。ｐ４１１９ の分析の結果を、図５に示す。最終生成物のＨＰＬＣ分析を、図６に示す。 本発明の方法を用いて達成される純度が精製核酸の用途に依ることは、当該技 術分野における熟練者によって理解されるであろう。したがって、本発明は、こ こでの例によって説明される純度を含む、あらゆる純度を達成することができる 態様を含むことを意図する。そこで、本発明の範囲は、本発明の方法の最も最適 な態様におけるそれらの使用、又は獲得可能な最大純度の核酸の生成に限定され るものではない。 前述の開示が本発明の特定の態様を強調するものであり、それらと等価の変形 及び代替物の全てが添付の請求の範囲に説明される本発明の精神及び範囲内にあ ることが理解されるであろう。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年９月７日（１９９８．９．７） 【補正内容】 （４頁；補正後） ここで引用される全ての参考文献は、参照することによりそれらの全体がここ で説明されるものとして、ここに組み込まれる。 発明の要約 本発明は、溶液から核酸を精製するための方法であって、ゲル層を有する限外 濾過ユニットを通してその溶液を濾過して透過溶液及び保持溶液を得、それによ り核酸をその保持溶液中に保持し、かつその保持溶液を回収して精製核酸溶液を 得ることを含む方法である。 好ましくは、核酸はＤＮＡであり、特にはウイルス又はプラスミドＤＮＡであ る。限外濾過ユニットは、好ましくは、開放チャンネル平坦プレート装置又は中 空ファイバー装置である。限外濾過膜は、大部分の核酸に対して１Ｋないし１， ０００Ｋ、プラスミドＤＮＡに対しては好ましくは約５０Ｋないし５００Ｋ、最 も好ましくは約３００Ｋないし５００Ｋの分子量カットオフを有している。ゲル 層が形成される条件下で限外濾過が行われると、より高い純度が得られる。この ゲル層は、約５ｐｓｉ（３４．５キロパスカル）ないし約３０ｐｓｉ（２０６． ８キロパスカル）、好ましくは約１０ｐｓｉ（６８．９キロパスカル）ないし２ ０ｐｓｉ（１３７．９キロパスカル）の圧力を用いて、約９０分まで形成させる こと ができる。この限外濾過工程の間に、約２倍ないし約５０倍に核酸溶液を濃縮す ることができる。 さらに好ましい態様においては、正接流動限外濾過の後、保持溶液を０．２μ ｍフィルターを通して濾過し、濾過したプラスミドＤＮＡ溶液を正に荷電したイ オン交換クロマトグラフィー樹脂にかけ、生理食塩水勾配でプラスミドＤＮＡを イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶離することにより、プラスミドＤＮＡ をさらに精製する。この精製プラスミドＤＮＡを、さらなるダイアフィルトレー ション工程によりさらに精製し、かつ、任意に、精製プラスミドＤＮＡの用途に 適するバッファ中で、さらに濃縮及び／又は交換することができる。 本発明は、さらに、本発明の方法により調製された核酸を含む製剤組成物を提 供する。この製剤組成物は、好ましくはプラスミドＤＮＡであり、核酸のミリグ ラム当たり約１００未満の内毒素単位、約２％未満のＲＮＡ、約１％未満の一本 鎖ＤＮＡ、約０．１％未満のタンパク質、約１％未満のゲノムＤＮＡ及び９０％ を上回る閉じた環状プラスミドＤＮＡを含む。 （１２頁；補正後） ４５分まで、それぞれゲル層を形成させることができる。ゲル層が形成された後 、透過ライン６０の内容物を廃棄物容器に流して空にし、濾過を進行させる。 初期循環期間中にゲル層が形成されない場合、通常は、透過溶液への漏出によ り生成物が失われる。生成物損失の量は、用いられる装置の型、膜のＭＷＣＯ及 び試料中の核酸の全量に依存する。したがって、生成物の収量が重要ではない状 況においては、その間にゲル層が形成される初期循環期間を設けずに濾過を行う ことができる。このような場合、濾過の初期期間にゲル層を形成させることが可 能であり、その後には透過溶液への生成物の漏出が減少し、生成物が保持溶液中 に保持される。例えば、中空ファイバー装置においては、短期間（例えば、約５ ＫｂのプラスミドＤＮＡ及び約１５０ｍｇＤＮＡ／平方フィートに対しては約５ 分）でゲル層を形成することができるため、ゲル層形成の初期期間の生成物の損 失は大きいものではなく、したがって、その間にゲル層が形成される供給タンク への透過溶液の再循環は必要ない。 濾過は正接流動を用いて行い、試料バッファを膜表面と交差するように循環さ せる。正接流動濾過の間、膜を横切って圧力を加え、これにより保持物が再循環 しながらより小さい分子がその膜を通過する。一般的には、一定の膜貫通圧が維 持されるように流速を調整する。通常、 流速及び圧力は、ゲル層の形成のために初めは変動する。一般には、圧力及び流 速が高いほど濾過が早く進行するが、高流速は核酸の剪断又は膜の通過による損 失をもたらすように思われる。加えて、様々なＴＦＵ装置に、それらを稼働させ る上での特定の圧力限界が存在しうる。したがって、製造者の仕様に従って圧力 を調整することができる。平坦プレート装置では、圧力は、好ましくは約５ｐｓ ｉ（３４．５キロパスカル）ないし約３０ｐｓｉ（２０６．８キロパスカル）、 最も好ましくは１０ｐｓｉ（６８．９キロパスカル）ないし２０ｐｓｉ（１３７ ．９キロパスカル）の範囲にある。大部分のプラスミドＤＮＡに対しては、１５ ｐｓｉ（１０３．４キロパスカル）ないし２０ｐｓｉ（１３７．９キロパスカル ）が好ましい。循環ポンプ３０は、核酸剪断を確実に最小限なものとするように 選択される。典型的には、循環ポンプ３０は供給チャンネル２０内の蠕動ポンプ 又はダイアフラムポンプであり、その圧力は保持弁１００を調整することにより 制御される。 （１７頁；補正後） ３７℃でインキュベートし、最初に３００ｒｐｍで攪拌した。これらの培養物を 曝気し、カスケード制御ループ、攪拌、反対流、及び平均で約４０％飽和への酸 素濃縮により、溶解した酸素を制御した。培養物を、約１０ないし１６時間イン キュベートした。インキュベーションの後、各培養物の細胞含有量をＯＤ₆₀₀に より決定した：ＯＤ₆₀₀値は、１６ないし１８の範囲であった。細胞を、冷却カ ール連続流動遠心で、遠心により回収した。 細胞ペレットを薄いシートに広げ、さらなるプラスミドの精製に用いるまで− ８０℃で凍結した。３．２Ｋｇの細胞ペレットを、１６Ｌの溶液Ｉ（２５ｍＭト リス−ＨＣｌ、ｐＨ８、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、５０ｍＭデキストロース）に、室 温で、１５０ｒｐｍで攪拌しながら１時間再懸濁させた。ＲＮＡ分解酵素（３０ ５ｍｇＲＮＡ分解酵素／Ｋｇ細胞ペレット）を添加することによりＲＮＡ分解酵 素消化を行い、その溶液を氷上で２時間インキュベートした。それらの細胞を、 氷浴中溶液ＩＩ（０．２ ＮａＯＨ／１％ＳＤＳ）３２Ｌに添加することにより 溶解した。この溶液を、バウ−タイ（Ｂｏｗ−Ｔｉｅ）攪拌機（コール・パーマ ー（Ｃｏｌｅ Ｐａｒｍｅｒ）、バーノン・ヒルズ、ＩＬ）を用いて２５分間攪 拌した。次に、この溶液を中和し、１６Ｌの氷冷溶液ＩＩＩ（３Ｍカリウム、５ Ｍ酢酸塩、ｐＨ５．５）を添加すること により、細胞残滓及び染色体ＤＮＡを沈殿させた。この溶液を、バウ−タイ攪拌 機を用いて氷上で２５分間混合した。 沈殿した物質を、遠心により中和細胞溶解溶液から除去した。この溶液を、１ Ｌ遠心ボトルに等分し、５３００ｒｐｍで２０分間２℃で遠心した。その後、上 清を、互いに９０°に配置された２層ミラクロス（Ｍｉｒａｃｌｏｔｈ）（カル バイオケム（ＣａｌＢｉｏｃｈｅｍ）、ラ・ホーヤ、ＣＡ）を通して室温で容器 にデカントした。次に、このデカントした上清を、連続的に配置された１．２及 び０．２μｍフィルターを通して濾過した。この段階での遠心の代わりとして、 セライトメ ＨＹＦＬＯ ＳＵＰＥＲ ＣＥＬＬ（セライト社（Ｃｅｌｉｔｅ Ｃｏｒｐ．）、ロンポック、カリフォルニア）のような珪藻土物質に通す濾過に より、沈殿物質を除去することができる。米国特許第５，５７６，１９６号を参 照のこと。 次に、濾過した物質を限外濾過ユニットに汲み入れ、ＭＷＣＯが３００Ｋの２ ５ｆｔ²（２．３×１０⁴ｃｍ²）のポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を用いた ポール−フィルトロンオメガ開放チャンネルセントラセット（Ｃｅｎｔｒａｓｅ ｔｔｅ）ユニットを通す正接流動濾過により、ＤＮＡ溶液を濾過した。その溶液 を、１０ｐｓｉ（６８．９キロパスカル）の圧力下で透過チャンネルを開放して ユニットに導入し、ゲル層が形成されるまで、約５０分間ユニットを通して循環 させた。その後、透過 チャンネルを廃棄物容器に向け、ＤＮＡ溶液を、約３．６Ｌの容積に濃縮される まで１０ｐｓｉ（６８．９キロパスカル）の圧力で濾過した。次に、ダイアフィ ルトレーションバッファ（トリス−ＨＣｌ、ｐＨ８．５）を添加し、 （２４−２５頁；補正後） ２０．前記濾過がゲル層の存在下で行なわれる請求項１９に記載の方法。 ２１．前記限外濾過膜が約３００Ｋダルトンの分子量カットオフを有する請求項 １９に記載の方法。 ２２．前記プラスミドＤＮＡを含む溶液が、洗浄剤含有バッファを用いて細菌細 胞を溶解し、細胞残滓及びタンパク質を実質的に除去することにより得られる請 求項１９に記載の方法。 ２３．前記溶液に対してダイアフィルトレーションを行い、約１０ないし約１０ ０容積に相当する保持溶液の容積交換を行う工程をさらに含む請求項１９に記載 の方法。 ２４．前記ゲル層が約５ｐｓｉ（３４．５キロパスカル）ないし約３０ｐｓｉ（ ２０６．８キロパスカル）の圧力を用いて形成される請求項２０に記載の方法。 ２５．前記精製プラスミドＤＮＡ溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過する 工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。 ２６．前記精製核酸溶液を正に荷電したイオン交換クロマトグラフィー樹脂に適 用する工程であって、生理食塩水勾配を用いて前記核酸を前記イオン交換クロマ トグラフィー樹脂から溶離して溶離核酸溶液を得る工程をさらに含む請求項１９ に記載の方法。 ２７．低導電率バッファに対して前記溶離核酸溶液のダ イアフィルトレーションを行う工程をさらに含む請求項２６に記載の方法。 ２８．精製プラスミドＤＮＡを、核酸を含む溶液から調製するための方法であっ て、 ａ）前記溶液を、分子量カットオフが約３００Ｋダルトンないし約５００Ｋダ ルトンの範囲の膜を備えた開放チャンネル限外濾過ユニットを通して、約５ｐｓ ｉ（３４．５キロパスカル）ないし約３０ｐｓｉ（２０６．８キロパスカル）の 圧力の下で、ゲル層を形成させるのに十分な時間循環させる工程； ｂ）前記溶液をゲル層を備えた前記限外濾過ユニットを通して濾過して保持溶 液及び透過溶液を得、それにより前記プラスミドＤＮＡを前記保持溶液中に保持 する工程； ｃ）ダイアフィルトレーションバッファを用いて前記保持溶液に対してダイア フィルトレーションを行う工程； ｄ）前記保持溶液を回収する工程； ｅ）合わせた前記保持溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過し、実質的に 精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を得る工程； ｆ）前記実質的に精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を正に荷電したイオン交換 クロマトグラフィー樹脂に適用する工程であって、生理食塩水勾配を用いて前記 プラスミドＤＮＡを前記イオン交換クロマトグラフィー樹脂か ら溶離して溶離プラスミドＤＮＡ溶液を得る工程； を含み、それにより精製プラスミドＤＮＡ溶液を得る方法。 ２９．前記プラスミドＤＮＡを含む溶液が、洗浄剤含有バッファを用いて細菌細 胞を溶解し、細胞残滓及びタンパク質を実質的に除去することにより得られる請 求項２８に記載の方法。 （２７−２９頁；補正後） ３８．核酸を含む溶液を濾過するための方法であって、 ａ）ゲル層を具備する限外濾過ユニットを通して前記溶液を濾過して透過溶液 及び保持溶液を得、前記核酸を前記保持溶液中に保持する工程；および ｂ）前記保持溶液を回収して濾過された核酸溶液を得る工程； を含む方法。 ３９．前記核酸がＤＮＡである請求項３８に記載の方法。 ４０．前記核酸がＲＮＡである請求項３８に記載の方法。 ４１．前記ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項３９に記載の方法。 ４２．前記ＤＮＡがウイルスＤＮＡである請求項３９に記載の方法。 ４３．前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである請求項４０に記載の方法。 ４４．前記限外濾過ユニットが、分子量カットオフが約５０Ｋないし約５００Ｋ ダルトンの膜を備えたものである請求項４１に記載の方法。 ４５．前記限外濾過ユニットが開放チャンネル装置である請求項３８に記載の方 法。 ４６．前記限外濾過ユニットが平坦プレート装置である請求項４５に記載の方法 。 ４７．前記限外濾過ユニットが中空ファイバー装置であ る請求項４５に記載の方法。 ４８．前記ゲル層が約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉの圧力下で形成される請求項 ３８に記載の方法。 ４９．前記濾過がダイアフィルトレーションバッファの存在下で行なわれる請求 項３８に記載の方法。 ５０．前記限外濾過ユニットが正接流動装置である請求項３８に記載の方法。 ５１．プラスミドＤＮＡを含む溶液を濾過するための方法であって、 ａ）分子量カットオフが約５０Ｋないし約５００Ｋダルトンの範囲の膜を備え た開放チャンネル限外濾過ユニットを通して前記溶液を濾過して透過溶液及び保 持溶液を得、それにより前記プラスミドＤＮＡを前記保持溶液中に保持する工程 ； ｂ）前記保持溶液を回収して濾過ＤＮＡ溶液を得る工程； を含む方法。 ５２．前記濾過がゲル層の存在下において行なわれる請求項５１に記載の方法。 ５３．前記限外濾過膜が約３００Ｋダルトンの分子量カットオフを有する請求項 ５１に記載の方法。 ５４．前記プラスミドＤＮＡを含む溶液が、洗浄剤含有バッファを用いて細菌細 胞を溶解し、細胞残滓及びタンパク質を実質的に除去することにより得られる請 求項５１に記載の方法。 ５５．前記溶液に対してダイアフィルトレーションを行い、約１０ないし約１０ ０容積に相当する保持溶液の容積交換を行う工程をさらに含む請求項５１に記載 の方法。 ５６．前記ゲル層が約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉの圧力を用いて形成される請 求項５２に記載の方法。 ５７．前記精製がダイアフィルトレーションバッファの存在下で行われる請求項 ５１に記載の方法。 ５８．前記限外濾過ユニットが正接流動装置である請求項５１に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ， ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，Ｎ Ｏ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ， ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 アッチレイ、アラン アメリカ合衆国 94110 カリフォルニア 州 サンフランシスコ フォルサム スト リート 3643

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．核酸を含む溶液から前記核酸を精製するための方法であって、 ａ）ゲル層を備えた限外濾過ユニットを通して前記溶液を濾過して透過溶液及 び保持溶液を得、それにより前記核酸を前記保持溶液に保持する工程；および ｂ）前記保持溶液を回収し、それにより精製核酸溶液を得る工程； を含む方法。 ２．前記核酸がＤＮＡである請求項１に記載の方法。 ３．前記核酸がＲＮＡである請求項１に記載の方法。 ４．前記ＤＮＡがプラスミドＤＮＡである請求項２に記載の方法。 ５．前記ＤＮＡがウイルスＤＮＡである請求項２に記載の方法。 ６．前記ＲＮＡがウイルスＲＮＡである請求項３に記載の方法。 ７．前記限外濾過ユニットが分子量カットオフ約５０Ｋないし約５００Ｋダルト ンの膜を備えたものである請求項４に記載の方法。 ８．前記限外濾過ユニットが開放チャンネル装置である請求項１に記載の方法。 ９．前記限外濾過ユニットが平坦プレート装置である請求項８に記載の方法。 １０．前記限外濾過ユニットが中空ファイバー装置であ る請求項８に記載の方法。 １１．前記ゲル層が約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉの圧力下で形成される請求項 １に記載の方法。 １２．前記溶液を濃縮して濃縮核酸溶液を得、前記濃縮核酸溶液をダイアフィル トレーションバッファでダイアフィルトレーションする工程をさらに含む請求項 １に記載の方法。 １３．前記保持溶液を回収した後、前記ダイアフィルトレーションバッファを前 記限外濾過ユニットを通して循環させて洗浄溶液を得、前記洗浄溶液を前記保持 溶液と合わせる工程をさらに含む請求項１０に記載の方法。 １４．前記精製核酸溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過する工程をさらに 含む請求項１に記載の方法。 １５．前記精製核酸溶液を正に荷電したイオン交換クロマトグラフィー樹脂に適 用する工程であって、生理食塩水勾配を用いて前記核酸を前記イオン交換クロマ トグラフィー樹脂から溶離して溶離核酸溶液を得る工程をさらに含む請求項１４ に記載の方法。 １６．前記溶離核酸溶液に対してダイアフィルトレーションを行う工程をさらに 含む請求項１５に記載の方法。 １７．前記精製核酸溶液が少なくとも約９０％の純度の核酸を含む請求項１に記 載の方法。 １８．前記精製核酸が少なくとも約９０％の閉鎖した環状プラスミドＤＮＡを含 む請求項４に記載の方法。 １９．プラスミドＤＮＡを含む溶液から前記プラスミド ＤＮＡを精製するための方法であって、 ａ）前記溶液を、分子量カットオフが約５０Ｋないし約５００Ｋダルトンの範囲 の膜を備えた開放チャンネル限外濾過ユニットを通して濾過して透過溶液及び保 持溶液を得、それによりプラスミドＤＮＡを前記保持溶液中に保持する工程；お よび ｂ）前記保持溶液を回収して精製プラスミドＤＮＡ溶液を得る工程； を含む方法。 ２０．前記濾過がゲル層の存在下において行なわれる請求項１９に記載の方法。 ２１．前記限外濾過膜が約３００Ｋダルトンの分子量カットオフを有する請求項 １９に記載の方法。 ２２．前記プラスミドＤＮＡを含む溶液が、洗浄剤含有バッファを用いて細菌細 胞を溶解し、細胞残滓及びタンパク質を実質的に除去することにより得られる請 求項１９に記載の方法。 ２３．前記溶液に対してダイアフィルトレーションを行い、約１０ないし約１０ ０容積に相当する保持溶液の容積交換を行う工程をさらに含む請求項１９に記載 の方法。 ２４．前記ゲル層が約５ｐｓｉないし約３０ｐｓｉの圧力を用いて形成される請 求項２０に記載の方法。 ２５．前記精製プラスミドＤＮＡ溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過する 工程をさらに含む請求項１９に記載の方法。 ２６．前記精製核酸溶液を正に荷電したイオン交換クロマトグラフィー樹脂に適 用する工程であって、生理食塩水勾配を用いて前記核酸を前記イオン交換クロマ トグラフィー樹脂から溶離して溶離核酸溶液を得る工程をさらに含む請求項１９ に記載の方法。 ２７．低導電率バッファに対して前記溶離核酸溶液のダイアフィルトレーション を行う工程をさらに含む請求項２６に記載の方法。 ２８．プラスミドＤＮＡ含む溶液から精製プラスミドＤＮＡを調製するための方 法であって、 ａ）前記溶液を、分子量カットオフが約３００Ｋダルトンないし約５００Ｋダル トンの範囲の膜を備えた開放チャンネル限外濾過ユニットを通して、約５ｐｓｉ ないし約３０ｐｓｉの圧力下で、ゲル層を形成させるのに十分な時間循環させる 工程； ｂ）前記溶液をゲル層を備えた前記限外濾過ユニットを通して濾過して保持溶液 及び透過溶液を得、それにより前記プラスミドＤＮＡを前記保持溶液中に保持す る工程； ｃ）ダイアフィルトレーションバッファを用いて前記保持溶液に対するダイアフ ィルトレーションを行う工程； ｄ）前記保持溶液を回収する工程； ｅ）合わせた前記保持溶液を０．２μｍフィルターを通して濾過し、実質的に精 製されたプラスミドＤＮＡ溶液を得る工程； ｆ）前記実質的に精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を正に荷電したイオン交換ク ロマトグラフィー樹脂に適用する工程であって、生理食塩水勾配を用いて前記プ ラスミドＤＮＡを前記イオン交換クロマトグラフィー樹脂から溶離して溶離プラ スミドＤＮＡ溶液を得る工程； を含み、それにより精製プラスミドＤＮＡ溶液を得る方法。 ２９．前記プラスミドＤＮＡを含む溶液が、洗浄剤含有バッファを用いて細菌細 胞を溶解し、細胞残滓及びタンパク質を実質的に除去することにより得られる請 求項２８に記載の方法。 ３０．請求項２８に記載の方法に従って調製された精製プラスミドＤＮＡを含む 製剤組成物。 ３１．プラスミドＤＮＡのミリグラム当たり約１００未満の内毒素単位を含む請 求項３０に記載の製剤組成物。 ３２．少なくとも約９０％の閉じた環状プラスミドＤＮＡを含む請求項３０に記 載の製剤組成物。 ３３．約２％未満のＲＮＡを含む請求項３０に記載の製剤組成物。 ３４．約１％未満の一本鎖ＤＮＡを含む請求項３０に記載の製剤組成物。 ３５．約０．１％未満のタンパク質を含む請求項３０に記載の製剤組成物。 ３６．約１％未満のゲノムＤＮＡを含む請求項３０に記載の製剤組成物。 ３７．細胞の混合物からプラスミドＤＮＡを精製するための方法であって、 ａ）前記細胞の混合物を構成する細胞の完全性を洗浄剤含有バッファ溶液中で 破壊して可溶化細胞溶液を得る工程； ｂ）細胞性ＲＮＡを酵素的に消化する工程； ｃ）前記可溶化細胞溶液中の細胞残滓及びタンパク質を核酸から区別して沈殿 させ、前記核酸を含む上清溶液を得る工程； ｄ）前記沈殿した細胞残滓及びタンパク質を前記上清溶液から除去して実質的 に精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を得る工程； ｅ）前記実質的に精製されたプラスミドＤＮＡ溶液を正接流動限外濾過で濾過 して透過溶液及び保持溶液を得、前記プラスミドＤＮＡを前記保持溶液中に保持 することによって前記プラスミドＤＮＡをさらに精製する工程； ｆ）前記保持溶液を回収する工程； を含み、それにより精製プラスミドＤＮＡ組成物を得る方法。