JP2017515500A - 生体分子を精製するための方法および装置 - Google Patents

Abstract

生体分子、特に核酸またはタンパク質を精製するための方法および装置において、少なくとも１つのフィルター（５０）が使用される。プロセスの実行に必要な液体の少なくとも幾つかが、フィルター（５０）を介して循環路（５１）中を圧送される。ここでは、まず、生体細胞を含む液体が、フィルター（５０）を介して圧送される。このフィルターに捕捉された細胞が破砕される。生体分子をフィルターに結合するために、結合緩衝液がフィルター（５０）を介して循環路（５１）中を圧送される。このフィルターに結合された生体分子を洗浄するための洗浄緩衝液が、フィルター（５０）を介して圧送され、これによって、フィルターに結合されている生体分子が、後続処理に使用される。

Description

本発明は、少なくとも１つのフィルターが使用される、生体分子、特に核酸またはタンパク質を精製するための方法および装置に関する。

従来技術
生体分子、特に核酸またはタンパク質を精製する多くの種々の方法が存在する。通常、生体分子は、細胞材料、すなわち原核細胞または真核細胞から得られる。細胞内材料がさらに処理可能になる前に、通常、細胞自体を破砕することが必要である。このような細胞破砕は、一般的に細胞溶解とも称される。細胞破片を除去した後に、例えば、核酸、タンパク質またはペプチドをさらに、精製、処理および分析することができる。以降でタンパク質について述べる際には、これによってペプチドも意図されている。例えば特定の核酸の検出を可能にするために、ＰＣＲ（Polymerase Chain Reaction：ポリメラーゼ連鎖反応）によって、精製された核酸を選択的に増幅することができ、これによって、特定の塩基配列が検出可能になる。

細胞の破砕を、種々の方法で行うことができる。例えば、酵素プロテイナーゼＫまたはリゾチームを用いて処理が行われる、細胞の酵素消化が広く行われている。試料の加熱および／または凍結による、温度変化を用いた細胞破砕、または、化学的な試薬を用いた細胞破砕も可能である。さらに、細胞破砕を、超音波処理等によって、機械的に行うことができる。例えば、核酸のさらなる精製のための通常の方法では、細胞破砕により生じる、いわゆる溶解産物に結合緩衝液が混ぜられ、次に、溶解産物が固体マトリクス、例えば二酸化珪素フィルター若しくは二酸化珪素メンブレンと接触させられる。この際に、核酸がフィルターに吸着し、次に洗浄緩衝液で洗浄され、その後固体マトリクスから溶出され、後続処理に使用される。市販されている種々のキットや実験装置は、この原則に従って機能する。

しばしば、さらなる処理の前に細胞材料を濃縮する、若しくは、細胞を集積することが必要になる。このために例えば、細胞を含む試料の遠心分離が行われる。独国特許出願公開第１０２００５００９４７９号明細書（DE 10 2005 009 479 A1）は、細胞がろ過を用いて集積される方法を記載している。このようなフィルターメンブレン法によって、例えば、集積された細胞、例えば細菌を定量化することも可能である。これは例えば、Dufour、Alfred P.等による刊行物「Applied and Environmental Microbiology（1981年5月、1152頁から1158頁）」に記載されている。

独国特許出願公開第１０２０１００３０９６２号明細書（DE 10 2010 030 962 A1）は、マイクロアレイにおける核酸のハイブリダイゼーション法を記載している。ここでは、試料を最初に変性ユニット、次いで、不動化されたプローブを備えたマイクロアレイを有する隔離された反応領域を通して圧送する。ここで、このポンプ区間は、循環路あるいは回路として形成されている。

独国特許出願公開第１０２０１００４３０１５号明細書（DE 10 2010 043 015 A1）は、フィルター上の核酸を増幅させる、すなわち、数倍に増加させる方法を開示している。あらかじめ、核酸を含んでいる細胞の濃縮および溶解がフィルター上で行われる。

発明の開示
発明の利点
本発明の方法を用いて、生体分子、特に核酸またはタンパク質または他の生体分子が濃縮および精製される。精製は基本的に、マトリクス、特にメンブレンに生体分子が非特異的に吸着することによって行われる。以降で一般的に、フィルターについて言及するが、その際にはこれによって、特にメンブレンの形態または例えば床（Schuettung）の形態のマトリクスが意図される。ここで本発明の本質は、プロセスの実行に必要な液体の少なくとも幾つかを、フィルターを介して、循環路あるいは回路中に圧送する、ということである。詳細には、本発明の方法のステップは、はじめに生体細胞を含む液体、すなわち試料液を、フィルターを介して圧送することを含む。用語「生体細胞」は、一般的に、核酸またはタンパク質等の生体分子を調製若しくは精製する元となる細胞のことである。これは、例えば、細菌または菌類等の病原性微生物であり得る。しかし、本発明の方法はヒト細胞または他の細胞にも適しており、一般的に、原核細胞または真核細胞からのタンパク質または核酸の精製のために使用可能である。用語「試料液」は、一般的に、相当する細胞を含む液体のことであり、例えば細胞懸濁液または患者の試料、例えば血液、洗浄液、尿、分泌液、痰、または、洗浄処理された、綿棒で集めた標本や採取物である。用途に応じて、試料の体積は異なっていてよく、例えば、数μｌから１０ｍｌの間であり得る。試料を加えた後、フィルターに捕捉された細胞が破砕される。ここで、原理的に様々な手法が細胞破砕のために使用可能である。細胞溶解産物に含まれる生体分子は結合緩衝液を用いてフィルターに結合される。ここでこの結合緩衝液は、循環路中に、フィルターを介して圧送される。フィルターに結合されている生体分子は、次のステップにおいて、フィルターを介して圧送される洗浄緩衝液によって洗浄される。この結果、精製されるべき生体分子が、可逆的に不動化された形態で、フィルターに残る。通常、さらなる処理または分析のために、結合された生体分子は、フィルターから溶出される、または、可逆的に不動化された生体分子を伴うフィルター自体を直接的に、後続処理に使用することができる。

以前から知られている方法では、試料からの細胞の集積は、遠心分離によって行われる。しかし、マイクロ流体システムにおけるこの方法の実行、ひいては、低コストの自動化は不可能である。試料からの細胞集積を、フィルターを介した洗浄によって行う方法も公知である。ここでは溶解は、溶解緩衝液をフィルターに加えることによって行われる。しかしこの方法は、マイクロ流体システムに組み込む際には、次のような欠点を有する。すなわち、フィルター上での溶解緩衝液の正確な位置決めが困難である、若しくは、これに多大なコストがかかってしまう、という欠点である。これは手動で行われなければならない、または、例えば、カメラやライトバリアが必要になる。さらに、フィルターに溶解緩衝液を加える際に、細胞および既に解放されている核酸がフィルターから押し出されてしまう、という恐れがある。これらはその後、さらなる精製にはもはや供されず、従って、精製の効率が低下する。さらに、この方法では、例えば、フィルター上での溶解試薬、例えば酵素の拡散が困難であり、このことは、溶解の効力を低下させる。これは、特に、溶解が困難な細胞、例えば菌類の場合である。本発明は、これらの問題を解決し、これによって、自動化されたマイクロ流体システム（ラボオンチップシステム）における、記載された方法の容易な実現を可能にする。

本発明の精製方法の特別な効果は、液体の循環案内、特にフィルターでの生体分子の結合プロセスの間の液体の循環案内によって、この物質が複数回、フィルターを介して洗浄されることによって得られる。環状流路における液体のこのような案内によって、フィルター材料は複数回、液体と接触させられる。この際に、メンブレンの最大結合容量が利用し尽くされた状態である飽和均衡が生じる。従来の方法では、多くの場合、目的分子の一部しか実際に吸着されない。本発明の方法では、環状の液体案内によって、例えば、細胞破砕の間に解放された全ての核酸が結合ステップにおいて効果的にフィルターを介して圧送されることが保証される。核酸はほとんど失われないので、収量が増加する。この循環路形状の圧送によってさらに、試薬、すなわち例えば結合緩衝液と細胞溶解産物との最適な混合が行われることが保証される。特にマイクロ流体システムでの試薬の混合は、しばしば問題となる。本発明によって行われる環状の液体案内によって、種々の試薬と緩衝液との良好な混合が実現される。従って本発明の方法は、特に有利には、マイクロ流体システム内での実現に適している。これとは無関係に、混合効率を、特にマイクロ流体システムにおいて、マイクロ流体システムにおける別の措置によって、特にそれ自体公知の混合構造または混合チャンバによってさらに上げることもできる。

第１のステップでは、生体細胞の集積が行われる。ここでは、試料液がフィルターを介して圧送されると、細胞がサイズ排除法に従って、および／または、静電的相互作用によってフィルターに捕捉される。フィルターを介して圧送される試料液の量が増えるほど、集積される細胞の数が増える。本発明の装置の寸法に応じて、それ自体公知のこの種のフィルターの直径が異なっていてよく、これは例えば、１から２５ｍｍの間である。フィルターとしては、例えば、繊維フィルター、織布フィルター、および／または、特に二酸化珪素から成るメンブレンフィルターが適している。さらに、特に、例えば二酸化珪素粒子から成る、粒子床、特にマイクロ粒子床も適している。これらの材料の孔径は、有利には１００μｍを下回る。

フィルターへの試料液のセット時に、試料は環状に、繰り返し、フィルターを介して圧送される。これは、フィルターの初回通過時に場合によっては捕捉されなかった細胞も、再度のフィルター通過時に捕捉される、という利点を有する。静電気力も作用し、かつ、一般的に、二酸化珪素フィルターの孔の大きさ分布は均一であると仮定されないので、細胞が最初の通過時に捕捉されないことがある。さらに細胞は、システムの「袋小路」に陥ってしまうことがあるので、試料セット時の環状案内によって、効果を高めることができる。

細胞の破砕を、種々の方法で行うことができる。これは例えば、機械によって、または、熱によって行うことができる。有利には、例えば超音波処理が行われる。これは、相対的に低い装置コストで実施可能である。ここでは溶解若しくは細胞破砕のための付加的な試薬は必要ない。超音波を、フィルターにじかに入力することができる。このために、例えば、相応するフィルターチャンバの壁部はメンブレンとして構成され、この中に、ホーンによって超音波がカップリングされる。超音波処理の間、フィルターチャンバは、液体若しくは緩衝液または水によって満たされているべきである。超音波処理によって、フィルター材料が部分的に分解される恐れがある。これによって、一方では、フィルター内に集積された細胞が少なくとも部分的に解放され、超音波による溶解作用が得られる。他方では、ここで生じた粒子は付加的な研削作用を生じさせ、これによって、細胞破砕をさらに助成することができる。ここで、粒子は、プロセスがさらに進むと、フィルターの無損傷領域によって再び捕捉される。

酵素または他の溶解試薬、例えば化学的な試薬を用いた細胞破砕が特に有利である。溶解試薬によるこのような細胞破砕に対して、特に有利には、同様に、流体の循環路案内が行われる。このために、適切な溶解緩衝液が環状流路に供給され、フィルターを介して回路中を圧送される。この場合、特に、フィルターを介して試料も圧送された方向で、溶解緩衝液が圧送される。これによって、フィルターへの溶解緩衝液の最初のセット時に、細胞または既に解放されている核酸の損失が生じることが回避される。さらに、場合によってフィルターに達する気泡が、さらなる進行時に、再び、フィルターから除去される。これまでに既知の方法では、このような気泡はフィルターに残り、局所的に溶解を阻止していた。さらに、この際の細胞への溶解緩衝液の連続的な接近によって、フィルターでの細胞の溶解試薬の不足が回避され、フィルターでの特に効果的、および、完全な細胞溶解が実現される。驚くべきことに、溶解のために酵素を使用する場合には、その活性が、絶え間ない圧送と、この際に生じるせん断力とによって、低減されず、従って酵素分解も、記載されたスキームに従って、有利に行われることが判明している。生体細胞および使用されている試薬の種類に応じて、溶解は、例えば、２から３０分の時間を必要とし得る。溶解緩衝液とは、目的細胞の細胞破砕若しくは溶解に適している緩衝液のことである。緩衝液は、例えば、それ自体公知の分解酵素を含み得る。これは例えば、リゾチームおよび／またはプロテイナーゼである。択一的または付加的に、カオトロピック塩、界面活性剤および／または塩基性成分、例えばＮａＯＨが含まれていてよい。さらに、緩衝物質（例えばトリス−ＨＣＩ）、ヌクレアーゼ阻害剤（例えばＥＤＴＡまたはＥＧＴＡ）、および／または、還元剤（例えばβ−メルカプトエタノール）が含まれていてよい。

その後の結合ステップにおいて、結合緩衝液が環状流路に供給され、回路中を圧送される。ここで結合緩衝液と溶解産物とが混ざり、例えば核酸が、ここで設定された条件で、フィルターに結合する。

結合ステップの前、特に、核酸精製時に、さらなる変性ステップを行うことができる。これに適している緩衝液は、特にカオトロピック試薬、例えばＧＩＴ（グアニジン：グアニジニウムイソチオシアナート）を含み得る。このような試薬によって、溶解産物内に含まれているタンパク質がある程度「塩」になり、タンパク質が、容易に溶解して分離される。変性ステップの効果をさらに高めるために、変性緩衝液が有利には同様に、循環路中を圧送される。

結合ステップの前に、付加的な消化ステップを、特に、核酸精製時に行うことができる。適切な消化緩衝液は例えば種々の酵素、特にプロテイナーゼを含み得る。これは、溶解ステップにおいて解放されたタンパク質の消化を生起させる。これによって、核酸精製の効果、および、得られる核酸の純度がさらに改善される。このステップのために、適切な消化緩衝液が経路に供給され、有利には、同様に、回路中を圧送される。ここでも、驚くべきことに、絶え間ない圧送と、この際に生じるせん断力とによって、消化に使用される酵素の活性が低下しないことが判明している。

フィルターでの生体分子の結合後に、１回以上の洗浄ステップが行われる。この際に洗浄緩衝液がフィルターを介して案内される。適切な洗浄緩衝液の組成は次のように選択される。すなわち、このステップにおいて、例えば、核酸はフィルターに結合されたままであり、他方で、他の分子、特にタンパク質は吸着せずに、除去されるように選択される。洗浄緩衝液としては、例えば、アルコールを含有する洗浄緩衝液、例えば、７０％エタノールを使用することができる。

洗浄緩衝液で処理した後にフィルターを乾燥させるのは、多くの用途に対して有利である。これは例えば、空気または窒素がフィルターを通過することによって行われる。次に、吸着された目的分子が、フィルターから溶出される。ここでこのために、水または適切な溶出緩衝液が使用可能である。目的分子が吸着されているフィルター自体を後続処理に使用してもよい。それ自体、従来技術から既知であるように、例えば、フィルター上に可逆的に不動化された核酸でＰＣＲを行うことができる。

特定の試料を使用する場合、フィルターへのセット前に、この試料を前処理することが有利であり得る。例えば、血液のろ過時には、フィルターが血液細胞によって塞がれて、詰まってしまうという問題が生じ得る。これによって、ろ過の継続が不可能になる。

これに対して、血液細胞をまず、選択的に溶解することが有利であることが判明している。表現「選択的に溶解する」によって、ヒト細胞とも称される血液細胞は破砕されるが、試料に含まれている他の細胞、特に病原体は無傷のままである、ということが意図されている。これは、例えば、カオトロピック試薬または界面活性剤を用いて試料を処理することによって、または、浸透圧ショックによって行われ、フィルターが塞がれるのが回避されるという利点を有する。市販のキット（Molzym MolYsis Complete5）は、このような選択的な溶解の際に、付加的に、デオキシリボヌクレアーゼ（ＤＮＡ加水分解酵素）による、解放されたヒト核酸の消化を実行する。このような消化は、本発明の方法に統合可能であり、試料のろ過されやすさがさらに改善され、ヒトの核酸背景部分が部分的に試料から除去されるという利点を有し得る。例えば、試料はまずカオトロピック緩衝液と混ぜられ、次に、デオキシリボヌクレアーゼによって、例えば１０分間、試料をフィルターに加える前に、培養される。

本発明の方法の有利な構成では、１つまたは複数のステップが少なくとも部分的に、熱供給下で行われる。特に、細胞破砕および／または付加的な消化ステップおよび／またはフィルターの乾燥のためには、温度を上げることが有利であり得る。例えば、酵素による細胞破砕に用いられる酵素は、高い温度最適条件を有し得る。従って、例えば３５から６０℃の、特に３５から４５℃の温度への温度上昇時に、細胞の溶解がより迅速かつ効果的に進行し得る。同じことが、消化ステップまたは変性ステップに当てはまる。また、フィルターの乾燥を、温度を上げることによって、例えば、４０から６０℃の温度まで温度を上げることによって、加速することができる。一般的には熱供給のために、例えばそれ自体公知のペルチェ素子を介して、または、フィルターを含む機構に接触しているフィルムヒーターを介して、特にフィルターを直接的に加熱することができる。さらに、温度調節された液体を用いて動作させることも可能であり、例えば、使用される液体用の貯蔵容器および／または導管システムを少なくとも部分的に加熱するようにしてもよい。用途に応じて、冷却または一般的に温度調節も有利であり得る。

本発明の方法の特に有利な実施形態では、圧送方向を、１つまたは複数のステップにおいて、１回または複数回、反転させることができる。これによって特に、フィルターの目詰まり若しくはフィルターの塞がりを回避することができる、または、場合によっては、後退させることができる。さらに、循環路内に存在する液体の混合を改善することができ、場合によっては、沈殿した固体物質を、再び、溶かすことができる。一般的には、フィルターに目的分子が結合した後に圧送方向を反転することによって、フィルターから目的分子が剥離することはない。なぜなら、フィルターへの分子の吸着は、圧送方向とは無関係だからである。特に、結合ステップおよび／または洗浄ステップおよび／または溶出ステップの間の圧送方向の反転が有利である。細胞によるフィルターの塞がり、ひいては目詰まりを回避する、または、場合によっては後退させるために、試料セット中、若しくは、フィルターでの細胞集積中にも、圧送方向を繰り返し、短時間、反転させるのは有利であり得る。

特に有利には、本発明の方法は、マイクロ流体装置において実行される。一般的に、マイクロ流体装置は、自動化されたプロセスに特に適しているという利点を有している。自動化によって、分析の時間とコスト、並びに、混入の危険が低減される。さらに、自動化されたシステムは、必ずしも専門家によって操作される必要はない。なぜなら、一般的に、この操作は容易に学習可能だからである。マイクロ流体装置と相互作用する本発明の方法は、次のような特別な利点を提供する。すなわち、液体の循環案内によって、液体の特に良好な混合が実現されるという、特別な利点である。従って、多くの場合、混合用攪拌機等のさらなる構造体、および、能動的なコンポーネントを省くことができる。しかし、それにもかかわらず、混合効率をさらに高めるために、それ自体公知の付加的な混合構造体または混合チャンバが相応する装置に設けられていてもよい。

本発明はさらに、生体分子、特に核酸またはタンパク質の精製を実行するための装置を含む。この装置は、液体を圧送する、少なくとも１つのポンプを有している。さらに、この装置は、少なくとも１つのフィルターを固定するための少なくとも１つの機構を含んでいる。これによって実行可能な精製プロトコルは、精製されるべき生体分子がフィルターに吸着可能である、ということに基づいている。本発明では、この装置は、フィルターを介した液体の環状圧送のための導管システムを有している。この装置によって、特に上述した本発明の方法を有利に実行することができる。ここで、本発明の重要な観点は、フィルターを介した液体の環状圧送によって、精製方法の効率を大幅に改善することができる、ということである。

フィルターを固定するための機構は、特に、フィルター材料を収容するフィルターチャンバである。用語「フィルターチャンバ」は、特に、フィルターが入れられた液体用中空空間のことである。例えば、フィルターチャンバを、細いチューブとして、または、特に有利には、マイクロ流体要素として設計することができる。フィルターチャンバは、有利には、多層構造を有している。ここで、例えば、２つ以上のパターニングされたプレート、特にポリマープレートを設けることができる。プレートの１つに、平坦な凹部を設けることができ、この凹部内に、フィルター、例えばメンブレンまたは別のフィルター材料、例えば、マイクロ粒子床を入れることができる。ここで特に、フィルター直径が比較的大きい（＞３ｍｍ）場合には、フィルターの湾曲またはたわみを回避するために、支持構造体、例えば多孔性のポリマー支持体（フリット）によってフィルターを支持することが有利であることが判明している。液体を通すために、１つまたは複数の入口チャネルおよび出口チャネルが設けられている。さらに、２つのプレートの間に付加的なメンブレンが入れられており、これを介して、フィルターチャンバの付加的な機能を実現することができる。これは例えば、ダイヤフラム弁および／またはダイヤフラムポンプの空気圧による操作である。有利には、カバーフィルムまたはカバーメンブレンまたは他のポリマー層が、システムの側面の、外側の遮断部として設けられている。カバーフィルムを、さらに、超音波のカップリングのために使用することができる。特に、細胞溶解時の超音波処理用に構成されている装置の設計では、フィルターチャンバが、超音波を導入するための拡張部を有していてもよい。例えば環状である、または、部分的に環状である拡張部は、有利には、外部への突破口として実現されており、これは特に、カバーメンブレンによって閉じられていてよい。フィルターチャンバのこの拡張部はさらに、システムの通気機能を担うことができる。ここでは、拡張部に合流する通気チャネルを設けることができる。

特に有利な実施形態では、本発明の装置は、少なくとも１つの、通気されている容器を有し、これによって、液体がシステムに入れられる。特に、上方へ向かって通気されている容器を、フィルターを介して液体を環状圧送する流路若しくは導管システム内に構築することができる。通気されている容器のこのような構築は、これによって、循環路内に存在する、増大する量の液体が収容可能であり、かつ、循環路内の圧力が一定に保たれ、これによって、特に有利な方法で、マイクロ流体実装が可能になる、という利点を有している。液体は、例えば手で、特にピペットによって、または、システム内に統合された第２のポンプによる圧送によって容器内に入れられる。通気されている容器は、さらに、流路に達した気泡が、この容器内で上昇し、このシステムから出ることができる、という利点を有している。従って、循環路内に気泡が残り、泡が形成されてしまうことが回避される。このような容器は、例えば、細いチューブ、チャンバとして、または、例えば１００μｌと１０ｍｌとの間の容積を有する他の流体要素として構成され得る。特に有利にはさらに、特に、試薬用の貯蔵チャンバとして使用することができる複数の、通気されている容器をシステム内に設けることができる。

ポンプは、例えば、蠕動ポンプ（peristaltische Pumpe）またはマイクロダイヤフラムポンプであってよい。特に有利には、このポンプは、多かれ少なかれフィルターの直前または直後に接続されており、これによって、極めて高い正圧または負圧で液体を、フィルターを介して圧送することができる。ポンプとフィルターとの間のチャネル区間が比較的短いのは有利である。さらに有利には、試料液のための入口チャネルが、多かれ少なかれ、ポンプまたはフィルターの直前に合流する。これは、緩衝溶液のための他の貯蔵容器が試料液によって汚されないという利点を有している。また、複数の入口チャネルを、種々の流体に対して設けることもできる。

特に有利には、この装置の１つまたは複数の要素は加熱可能である。例えば、ポンプおよび／または導管システムまたは導管システムの一部および／またはフィルターおよび／または、液体の貯蔵または供給のために、場合によって設けられている容器が加熱可能である。このようにして、個々のステップを、温度調節して、実行することができる。例えば、溶解ステップを高い温度で実行することができる。これは、溶解緩衝液が事前に加熱される、および／または、フィルター自体が加熱されることによって行われる。

有利には、本発明の装置は、マイクロ流体システムとして設計されている。マイクロ流体構造の本発明の装置の利点に関しては、上述した利点を参照されたい。本発明の方法および本発明の装置は、例えば、分子診断、および／または、例えばラボオンアチップシステムにおいて、特に有利に使用される。

本発明のさらなる特徴および利点は、図面に関連した以下の実施例の説明から明らかになる。ここで各特徴はそれぞれ、個々に、または相互に組み合わせて実現可能である。

環状液体案内の概略的な原理図 本発明の方法を実行するための装置の例示的な実施形態のコンポーネントの概略図 本発明の方法を実行するための装置の別の例示的な実施形態の概略図 本発明の方法を実行するための装置の別の例示的な実施形態の概略図 本発明の方法を実行するための装置の別の例示的な実施形態の概略図 本発明の装置の構成部材である多層フィルターチャンバの概略図 本発明のマイクロ流体装置の平面図 図７に示されたマイクロ流体装置の多層構造の側面図 図７に示されたマイクロ流体装置の斜視図 本発明のマイクロ流体装置の例示的なフィルターチャンバの詳細な側面図 本発明のマイクロ流体装置の例示的なフィルターチャンバの詳細な平面図 本発明のマイクロ流体装置の別の例示的なフィルターチャンバの詳細な側面図 本発明のマイクロ流体装置の別の例示的なフィルターチャンバの詳細な平面図

実施例の説明
図１の概略図は、フィルター１０を介して延在する環状流路１１の原理を示している。流動接続ライン１１内の液体は、ポンプ１２を介して動かされる。流動接続ライン１１は、例えば、ゴム管またはチャネルによって形成可能である。ポンプ１２は、液体ポンプ、例えば、蠕動ポンプまたはダイヤフラムポンプである。装置のマイクロ流体構造のために、通常の組み込み可能なマイクロ流体ポンプが使用可能である。ここに示されたフィルター１０は、フィルターチャンバの形態で実現されている。以降に記載される用語「フィルター」は、多くの場合、フィルターチャンバの同義語であると理解されるべきである。フィルターチャンバは、マイクロ流体コンポーネントとして設計可能である。フィルター１０での流入および流出の様式は、場合によって正確に設定可能である。フィルターチャンバ自体を、例えば、パターニングされた複数のポリマー層から成る多層構造で実現することができる。このような構造様式によって、特に低コストの製造が可能になる。ポンプ１２がゴム管を介してフィルターチャンバ１０の入口および出口と接続されている場合、流路への供給は、例えば、ゴム管接続部を開け、ピペッティングすることによって行われ得る。

図２は、本発明の方法を実行するための装置の概略的な構成の有利な変形を示している。フィルター若しくはフィルターチャンバ２０、ポンプ２２、および流動接続ライン２１の他に、上方に向けて通気されている容器２４が、流路に組み込まれている。この容器２４を介して、環状流路に液体を入れることができる。必要な溶液または緩衝液は、例えば、容器２４内にピペッティングされ得る。これによって、有利には、プロセス中に、緩衝液または他の溶液を流路に供給することが可能になる。さらにこのような構造は、流路に達した気泡が容器２４内で上昇し、システムから出ることができる、という利点を供する。装置の構造に応じて、容器２４の容積を相応に選択することができ、これは例えば、１００μｌと１０ｍｌの間である。容器２４は例えば、細いチューブとして、またはマイクロ流体要素として構成され得る。有利には、システムの出口チャネルは、容器２４の下面に位置する。ここでは用語「下面」によって、重力に関して、最も深い箇所に位置する容器部分が意図されている。これは、液体を完全に容器から除去することができる、という利点を有している。有利には容器２４はここで、下方に向かって先細りするように構成されている。

図３は、本発明の方法を実行するための装置の別の変形を示している。このような構造は、特に、マイクロ流体システムとして適している。一般的に、マイクロ流体システムは、構築物の死容積を極めて低く抑えることができ、泡が形成される恐れが低い、という利点を有している。流動接続ライン３１における環状液体案内はポンプ３２によって駆動される。ポンプの上流には、フィルターチャンバ３０が位置する。さらに容器３４が設けられており、これは、開口部若しくは脱気チャネル３５を介して脱気可能である。開口部若しくは脱気チャネル３５は、有利には、重力に関して、容器の上方端部に位置している。これによって、試薬の、意図していない漏れを回避することができる。容器３４の上流には入口チャネル３６が設けられている。ここでこの入口チャネル３６が直接的に容器３４に合流してもよい。さらに、入口チャネル３６が複数存在してもよい。ポンプの下流には、出口チャネル３７が位置している。液体の流れは、システム内の様々な箇所に配置されている内蔵弁３８を介して制御される。ここでこれは例えばロータリーバルブまたはダイヤフラム弁であってよい。

このような装置を使用する場合、以下のように本発明の方法を実行することができる。試料、すなわち生体細胞を含む液体を、入口チャネル３６を介して、または容器３４の開口部３５を介して入れる（例えばピペッティング）。容器３４は例えば、マイクロ流体キャビティとして構成可能である。容器３４内に含まれている空気は、ここで、開口部または脱気チャネル３５を介して放出され、容器３４が脱気される。次に、ポンプ３２が、試料を、フィルター３０を介して、出口チャネル３７の方向に圧送する。ポンプ３２が入口チャネル３６を介して試料をじかに吸い込むことができるように、脱気チャネル３５が閉じられていてもよい。試料に含まれている細胞はフィルター３０に集まり、集積される。次に、例えば適切な溶解緩衝液で処置することによって細胞が破砕される。まずは溶解緩衝液が、例えば入口チャネル３６を介して容器３４に入れられる。次に、ポンプ３２によって溶解緩衝液が、環状流路３１を介して、循環路中を、フィルター３０を介して圧送される。これに対して択一的に、細胞溶解を、他の方法、例えば超音波で行うことが可能である。この場合には、フィルター３０に相応に、超音波が照射される。次に、目的分子がフィルター３０に吸着する、結合ステップが行われる。このために、適切な結合緩衝液が容器３４に入れられ、回路３１中を圧送される。後続の洗浄ステップでは、まずは、洗浄緩衝液が容器３４に入れられ、ポンプ３２によって、フィルター３０を介して出口チャネル３７の方向に圧送される。フィルター３０の乾燥が行われる場合には、例えば空気または窒素が、入口チャネル３６から、フィルター３０を介して、出口チャネル３７の方向に圧送される。ポンプ３２を、乾燥のために使用することも可能である。次に溶出ステップを行うことができる。ここでは、適切な溶出緩衝液が容器３４に入れられ、出口チャネルの方向に、フィルター３０を介してポンプ３２によって圧送される。

一般的には、例えば、別のポンプによって、または人によるピペッティング等によって、容器３４に試料および緩衝液を入れることができる。このために、容器３４に、再び閉じることができる開口部を設けてもよい。

図４は、このシステムの別の変形を示している。ここでは、容器３４に対して付加的に、１つまたは複数の別の容器４４、例えば、貯蔵容器が設けられている。この容器４４にも、開口部または脱気チャネル４５が設けられている。容器４４の中身は、別の弁４８を介して、残りの導管システムに入れられる。その他の点では、このシステムは、実質的に、図３に示した装置に相応する。従って、相応する要素には、同じ参照番号が付けられている。容器３４と別の容器４４からの供給線路との間に、別の弁４９が設けられている。１つまたは複数の容器４４に、異なる緩衝液、例えば溶解緩衝液、消化緩衝液、変性緩衝液、結合緩衝液、洗浄緩衝液または溶出緩衝液が貯蔵可能である。この変形は、自動実行が容易になる、という利点を有している。なぜなら、複数の緩衝液を個々に容器３４に入れる必要がなくなるからである。この方法では、特に試料が人によって容器３４に入れられ、その後、フィルター３０にこれが加えられる。その後のプロセスステップで必要な各種の緩衝液が自動的に、１つまたは複数の容器４４から入れられる。

図５は、例えばマイクロ流体システムにおいて実現可能な、本発明の方法を実行するための装置の別の有利な例を示している。このシステムでは、ポンプ５２は、フィルターチャンバ５０の上流に配置されている。これは、極めて高い圧力で液体がフィルター５０を介して圧送され得る、という利点を有している。このため、ポンプ５２とフィルター５０との間のチャネル区間またはゴム管区間が比較的短いのは、特に有利である。入口チャネル５６は、ポンプ５２の直前で合流する。これは、入口チャネル５６から入れられ、フィルター５０を介して圧送された液体、特に細胞材料を含んでいる試料が貯蔵容器５４を通過しないので、混入が回避される、という利点を有している。有利には、このシステムは部分的に加熱可能であり、例えば、フィルター５０および／またはポンプ５２および／または容器５４が加熱可能である。細胞破砕がより効率的に進行することを可能にするために、有利には溶解ステップの間に加熱を行うことができる。有利には、使用されている溶解酵素に対する最適な温度が設定され得る。この温度は例えば３５から５５℃の間の温度領域にあり、例えば４５℃である。溶解ステップ時のプロセスの実行は、有利には、環状流路５１を介して環状に行われる。これは、説明した他の実施例と同じである。変形として、別の入口チャネルが設けられていてよく、これを介して必要な試薬がこのシステムに圧送され得る。１つまたは複数の容器５４は、例えば、２ｍｌの容積を有し、フィルターは、例えば、２から１０ｍｍの直径を有している。液体の流れの制御は、弁５８を介して行われる。液体は、出口チャネル５７を介してシステムから出ることができる。

本発明のマイクロ流体システムにおける細胞の集積および溶解およびＤＮＡ精製のための実験は、例えば、以下のように行うことができる。入口チャネル５６を介した圧送またはピペッティングによって、１ｍｌあたり１０^５のブドウ球菌を含む生理食塩水がシステムの容器５４に入れられ、ポンプ５２によって、フィルター５０を介して圧送される。溶解のために、１００μｌの溶解緩衝液が容器５４にピペッティングされ、ポンプ５２によって１０分間、同時に４５℃に温度調節しながら、フィルター５０とチャネルシステム５１とを介して、循環路中を圧送される。次に、順次、消化緩衝液と結合緩衝液とが容器５４にピペッティングされ、同様に、循環させられる。これは、試薬の極めて良好な混合が行われ、核酸が効果的にフィルター５０に結合される、という利点を有している。次に、フィルター５０が洗浄される。これは、洗浄緩衝液を容器にピペッティングし、フィルター５０を介して出口チャネル５７へ圧送することによって行われる。結合されたＤＮＡは、水によって溶出される。これは、水を容器５４にピペッティングし、フィルター５０を介して、出口チャネル５７へ圧送することによって行われる。溶出液が捕らえられる。これと同時に、対照実験が行われる。１ｍｌあたり１０^５のブドウ球菌を含む生理食塩水が１３０００ｇで遠心分離によって集積され、上清がピペットで除去される。１００μｌの溶解緩衝液をピペットで加え、混合し、１０分間、４５℃で培養する。生じた溶解物に順次、消化緩衝液と結合緩衝液とを混ぜ、市販のカラムに加える。次にカラムが洗浄緩衝液で洗浄され、ＤＮＡが１００μｌの水で溶出される。試料の分析は、定量ＰＣＲによって行われる。実験結果は、本発明の方法によって、対照実験の場合と同等の結果が得られる、ということを示している。本発明の方法では、容易な自動化が可能であることによって、労力が大幅に削減可能である。

図６は、多層構造に基づいた、例示的なマイクロ流体フィルターチャンバ６０の断面を示している。パターニングされた２つのポリマープレート６１と、その間に位置しているポリマーメンブレン６２と、外側に載置されているカバーフィルム６３とで多層構造が形成されている。フィルター６４は、１つのポリマープレート６１の窪みに入れられている。液体供給および液体排出は、入口チャネル６５および出口チャネル６６を介して行われる。フィルター６４の前に接続されているメンブレン６２は、例えば弁機能等の付加的な機能を発揮し得る。このような構造は特に、マイクロ流体構造に適している。

図７から図９は、本発明の方法を実行するためのマイクロ流体システム７００の例示的な構成を示している。図７は前側の平面図を示し、図８は側面図であり、図９は前側の斜視図である。マイクロ流体システムは、２つのパターニングされたポリマープレート７５０および７６０（図８）と、構造体を覆うための、右側および左側に配置されたカバーフィルムまたは他のポリマー層（図示されていない）とから成る多層構造体として実現されている。このシステムは、ポンプ７０２と、通気開口部７２４を備えている容器７０４と、フィルター機構７１０と、複数の弁７０８、７１８、７２８とを含んでいる。液体案内は、矢印方向（図７、図９）において行われる。ここでこの流れ方向が、反転されてもよい。フィルター機構７１０は、ポリマープレート７５０における窪み７１３（フィルターチャンバ）と、フィルターの機械的支持のためのフリット７１１と、元来のフィルター７１２とによって形成される（図８）。システムの外側に、チャネル７０１が延在している。このチャネルは、カバーフィルムまたは別のポリマー層（図示されていない）によって覆われる。弁７０８、７１８、７２８は、マイクロ流体ダイヤフラム弁として構成されている。ポンプ７０２は、ポンプチャンバと入口弁７０８と２つの出口弁７１８、７２８とを有するマイクロ流体ダイヤフラムポンプとして構成されており、フィルター機構７１０の下流に位置している。出口弁７１８と７２８はＴ字交差を形成し、循環路７０１（弁７２８）と出口チャネル７０７（弁７１８）との間の流路の切り替えを可能にする。ポリマープレート７５０と７６０との間に、弁およびポンプの空気圧作動のために用いられる図示されていないポリマーメンブレンが存在する。極めて少ない量の液体も、容器の最下点に収束し、そこからチャネルシステム７０１に入ることができるように、容器７０４が成形されている。容器７０４は、このために、下方に向かって先細りしている。

図示されたシステム７００は、他の機能を含む大きいマイクロ流体システムの一部であってよい。これは例えば、ポンプ、および、混合チャンバ、試薬を貯蔵するためのチャンバ、生体分子のさらなる処理のためのチャンバ、例えば、ＰＣＲ等による、得られた核酸を増幅するためのチャンバ、および、生体分子、例えば核酸を検出するためのコンポーネントである。

マイクロ流体装置７００を使用する場合、以下のように、本発明の方法を実行することができる。はじめに試料が例えば、通気されている容器７０４に、例えばピペッティングおよび圧送によって入れられ、次に、下方から、フィルター機構７１０を介して、出口チャネル７０７へ圧送される。その後、溶解緩衝液が、通気されている容器７０４に入れられ、溶解の間、フィルター機構７１０を介してポンプ７０２によって循環される。択一的に、フィルターチャンバ７１３を液体によって確実に満たすために、溶解緩衝液を短時間だけ循環させてもよい。その後、例えば熱または超音波がフィルター７１２に加えられる。次に、通気されている容器７０４に結合緩衝液が加えられ、フィルター機構７１０を介してポンプ７０２によって循環される。ここで、溶解産物と結合緩衝液とが混合され、（精製されるべき分子の例である）核酸がフィルター７１２に結合する。この混合物は、次に、出口チャネル７０７へ圧送される。次に、洗浄緩衝液が、通気されている容器７０４に入れられ、フィルター機構７１０を介して出口チャネル７０７へ圧送される。最後に、溶出緩衝液が、通気されている容器７０４に入れられ、フィルター機構７１０を介して、出口チャネル７０７へ圧送される。択一的に、溶出緩衝液が、出口チャネル７０７を介して吸い込まれ、反転された方向で、フィルター機構７１０を介して、通気されている容器７０４へ圧送されてもよい。

この方法の変形では、最初に、試料内に存在するヒト細胞が選択的に溶解され得る。この方法の別の変形では、溶解の後に、タンパク質の消化が行われ得る。この方法の別の変形では、ＤＮＡの結合前に、変性ステップが行われ得る。この方法の別の変形では、フィルターが、溶出の前に乾燥され得る。この方法の別の変形では、圧送方向が、途中で、短時間、例えば５から６０秒間反転され得る。

図１０は、マイクロ流体装置のためのフィルターチャンバ８１３の実施例の側面図を示しており、図１１は、その平面図を示している。図１０では、２つのポリマープレート８５０と８６０とから成る多層構造体が見て取れる。ポリマープレート８５０における円形の窪み８１４は、フィルターメンブレンまたはフィルター材料床、場合によってはフリットを入れるための止り穴として設けられている。入れられるべきフィルターのすぐ上には、環状の拡張部８１５が設けられている。別のポリマープレート８６０には、環状の突破孔８１６が設けられており、これは、組み立てられた状態でカバーメンブレン（図示されていない）によって覆われている。チャネル８１７を介して、液体の供給または排出が行われ得る。環状の突破孔８１６は例えば、５から５０ｍｍの間の直径を有し、フィルターに対してほぼ同心に配置され得る。しかし、特に、重力方向に関して上方に、例えば、フィルターの半径と環状領域の半径との差だけずらしてもよい。この突破孔８１６と拡張部８１５とによって、発振器を用いて超音波をフィルターチャンバ８１３の内部に入れることが可能になり、これによって、超音波溶解が実行され得る。この変形は、特に効率的な超音波溶解が可能であるという利点を有する。択一的に、超音波を入れるために設けられた領域が、同等の寸法を有する、楕円形、正方形または縦長の形であってよい。さらに、この変形は、次のような利点を有している。すなわち、フィルターチャンバ８１３の拡張部８１５が同時に機能を満たすことができ、気泡がこの拡張部内で上昇し、これによって、液体循環路から除去され、処理の間に上昇する液体体積が収容され、これによって場合によっては、システムの別の容器の代わりになることができる、という利点である。この目的のために、付加的な脱気チャネル８１９を設けることができる。ここでは、拡張部が、例えば５００μｌから５ｍｌの間の容積を有するのは有利である。このために、付加的な拡張部８１８を設けることができる。フィルターとして、ここでは、例えば、二酸化珪素メンブレンが使用されるが、微粒子床も使用可能である。ある変形では、フィルター若しくは微粒子床が拡張部８１５および突破孔８１６内に延在し、この面で、カバーメンブレンと接触する。これは、カバーメンブレンへの超音波のカップリング時に、フィルター若しくは微粒子床が特に効率的に振動させられる、という利点を有している。これによって集積された細胞の溶解を大きい収量で行うことができる。

図１２および図１３は、フィルターチャンバ９１３に対する別の実施形態を示している。これは、フィルターチャンバ８１３と同様に、止り穴状の窪み９１４を、フィルターまたはフィルター材料床、および、場合によってはフリットを収容するために、ポリマープレート９５０内に有している。チャネル９１９を介して、液体供給または液体排出が行われ得る。ポリマープレート９５０内には、止り穴９１４の部分環状拡張部９１５が設けられている。別のポリマープレート９６０はこの領域に、突破孔９１６を有している。この突破孔９１６は、組み立てられた状態で、止り穴９１４と拡張部９１５との間の接続を形成し、カバーメンブレン（図示されていない）によって覆われている。拡張部９１５および突破孔９１６は実施形態８１３と同様に、超音波のカップリングに適している。

Claims (15)

1. 少なくとも１つのフィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を用いて生体分子、特に、核酸またはタンパク質を精製する方法において、
   前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を介して、プロセスの実行に必要な、少なくとも幾つかの液体を循環路（１１；２１；３１；５１；７０１）中に圧送し、
   少なくとも、
   生体細胞を含有する液体を、フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を介して圧送するステップと、
   前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）に捕捉された前記細胞を破砕するステップと、
   前記フィルターに前記生体分子を結合するための結合緩衝液を前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を介して前記循環路（１１；２１；３１；５１；７０１）中に圧送するステップと、
   前記フィルターに結合されている前記生体分子を洗浄するための洗浄緩衝液を前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を介して圧送するステップと
   が実行される、
   ことを特徴とする、生体分子を精製する方法。
2. 前記細胞の破砕のために、
   溶解緩衝液を前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を介して前記循環路（１１；２１；３１；５１；７０１）中に圧送するか、または、
   前記細胞を機械的に、特に超音波処理によって破砕する、請求項１記載の方法。
3. 結合緩衝液による前記処理の前に、変性ステップを実行する、請求項１または２記載の方法。
4. 結合緩衝液による前記処理の前に、付加的な消化ステップを実行する、請求項１から３までのいずれか１項記載の方法。
5. 洗浄緩衝液による前記処理の後に、前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を乾燥させる、請求項１から４までのいずれか１項記載の方法。
6. 前記生体細胞を含有する液体の前記フィルターを介した前記圧送の前に当該液体の前処理を行い、
   有利には、当該液体内に存在しているヒト細胞を選択的に溶解する、請求項１から５までのいずれか１項記載の方法。
7. 前記ステップのうちの少なくとも幾つかを、熱供給下で行い、
   特に、前記細胞溶解および／または場合によって行われる前記消化ステップおよび／または場合によって行われる前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）の乾燥を、熱供給下で行う、請求項１から６までのいずれか１項記載の方法。
8. 圧送方向を、１つまたは複数の前記ステップにおいて、１回または複数回、反転させる、請求項１から７までのいずれか１項記載の方法。
9. 前記方法を、マイクロ流体装置（７００）において実行する、請求項１から８までのいずれか１項記載の方法。
10. 生体分子、特に、核酸またはタンパク質の精製を実行するための装置であって、
    液体を圧送するための少なくとも１つのポンプ（１２；２２；３２；５２；７０２）と、
    少なくとも１つのフィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）を固定する少なくとも１つの機構とを有している装置において、
    前記装置は、前記フィルターを介して液体を環状に圧送する導管システム（１１；２１；３１；５１；７０１）を含んでいる、
    ことを特徴とする、生体分子の精製を実行するための装置。
11. 前記フィルター（６４；７１２）を固定する前記機構は、フィルターチャンバ（６０；７１３；８１３；９１３）であり、
    前記フィルターチャンバは、有利には、多層構造を有しており、
    前記フィルターチャンバ（６０；７１３；８１３；９１３）は、特にフィルターメンブレン（６４）または他のフィルター材料、特に粒子床が入れられるように構成されている、請求項１０記載の装置。
12. 前記フィルターチャンバ（８１３；９１３）は、超音波をカップリングするための拡張部（８１５；９１５）を有しており、
    有利には、前記拡張部は、カバーメンブレンによって閉じられている突破孔（８１６；９１６）を含んでいる、請求項１１記載の装置。
13. 前記装置は、前記システムに液体を入れるための、少なくとも１つの、通気されている容器（２４；３４；４４；７０４）を含んでいる、請求項１０から１２までのいずれか１項記載の装置。
14. 前記フィルター（１０；２０；３０；５０；６４；７１０）および／または前記ポンプ（１２；２２；３２；５２；７０２）および／または場合によって設けられている前記容器（２４；３４；４４；７０４）および／または前記導管システム（１１；２１；３１；５１；７０１）は加熱可能である、請求項１０から１３までのいずれか１項記載の装置。
15. 前記装置は、マイクロ流体システム（７００）として設計されている、請求項１０から１４までのいずれか１項記載の装置。

Images