JP2000500032A

JP2000500032A - 細胞培養生成物

Info

Publication number: JP2000500032A
Application number: JP9509031A
Authority: JP
Inventors: マーククリストファーリチャードソン; パトリックルイスバロット; ジェーンブリジットマシュー; ジョージロバートドリューベリー
Original assignee: Smith and Nephew PLC
Current assignee: Smith and Nephew PLC
Priority date: 1995-08-12
Filing date: 1996-08-12
Publication date: 2000-01-11
Also published as: EP1019104A1; ZA966803B; GB9516556D0; AU6746296A; CA2226747A1; WO1997006835A1

Abstract

(57)【要約】親水性ポリマー層と培養されキャリアーの対創傷面に固定されている哺乳動物細胞の層からなるキャリアーからなる創傷用ドレッシング。そのようなドレッシングを作る方法も明らかにされている。

Description

【発明の詳細な説明】細胞培養生成物本発明は、適合性キャリアー上での哺乳動物の固定依存性細胞の培養に関する。さらに詳しくは、本発明は、熱傷、皮膚移植供与部位および静脈性潰瘍や臥位潰瘍のような潰瘍といった創傷を治療するに適切な創傷用ドレッシングの形成ならびにそのようなドレッシングを製造するために使用されるシステムに関する。懸濁した液体培養中で増殖させることはできないが、キャリアーの表面上で増殖させるようにすることができる哺乳動物の細胞は固定依存性と言われている。ケラチノサイトのような上皮細胞は固定依存性である。非阻害性で非細胞毒性なキャリアーの存在下培養されたそのような細胞は、重層化したコロニー中で増殖し、結局は集密性(confluent)の層を生産する。この型の細胞培養は、皮膚成長を調査するのに使用されたり植皮として使用されてきた。皮膚細胞を成長させる生体外技術やこれの全層性創傷の治療への使用について記載している、様々な技術論文が発行されている。例えば、Ｅ．ベル（Ｅ．Ｂｅｌｌ）ら（ＪＩｎｖｅｓｔＤｅｒｍ８１；２ｓ−１０ｓ１９８３）；Ｅ．ベルら（Ｓｃｉｅｎｃｅ２１１；１０５２−１０５４１９８１）；Ｄ．アセリネウ（Ｄ．Ａｓｓｅｌｉｎｅａｕ）およびＭ．プルニラス（Ｍ．Ｐｒｕｎｅｉｒａｓ）（ＢｒＪＤｅｒｍ１９８４ III，Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ２７，２１９−２２２）；およびＪ．Ｆ．バーク（Ｂｕｒｋｅ）ら（ＡｎｎＳｕｒｇ９４；４１３−４２８１９８１）。特有のキャリアーに固定する細胞の能力は、キャリアーの性質、温度といった培養条件および培地の成分によって左右される。培養は、成長培養液に対し実質的に不活性かつ細胞に対し非細胞毒性である材料から作られている硬質プラスチックのフラスコ中で一般に行なわれる。ポリスチレンは培養フラスコに一般的に使用されている材料である。植皮として使用される上皮細胞の培養のために硬質プラスチックのフラスコを使用する際の問題の一つには、細胞のシートが収集される前にそれらが一般に集密(confluence)に達しなければならないことがある。集密に達するのに時間がかかることがある。さらに、細胞の層が機械的に非常に強くはなく、支持されていない細胞が酵素ディスパーゼ(dispase)を使用して移動されたり支持されずに取り扱われた時に容易に傷めやすい。国際特許出願第ＷＯ８９／０３２２８号には、ヒト上皮細胞を付着して有しているコラーゲンで被覆された、合成外科的ドレッシングが記載されている。その複合物を製造する方法には、合成外科的ドレッシングをコラーゲンの溶液中でインキュベートすることおよび水を蒸発させ合成ドレッシングの表面にコラーゲンの被覆をすることが含まれている。蒸発工程は細菌の汚染を避けるため無菌状態で行なわれるのが好ましい。細胞のシートは、表面から移動された後、取り扱いを容易にし創傷表面へ移すために支持されることが知られている。しかしこの技術は、硬質な表面の培養に伴う問題や細胞の移動に伴う危険を克服していない。本発明の目的は、親水性で細胞生育に対し非阻害性で非細胞毒性なポリマーからなる、容易に操作しやすく適合性キャリアー上で細胞を成長させることにより上述の問題を克服することである。本発明のポリマーは、細胞が集密に達する前に細胞層を治療部位に運ぶことを可能にしている。本発明によれば、創傷用ドレッシングは、キャリアーが、少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有し非細胞毒性で細胞生育に非阻害性である合成ポリマー層からなる、培養哺乳動物細胞の層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーからなる。本発明は、また、キャリアーが培地の表深部位置に保持され、哺乳動物細胞を含有する水性培地をキャリアーの対創傷面と接触して保持する手段とで、キャリアーが細胞生育に非阻害性で非細胞毒性でありかつ少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有する合成ポリマーからなり、対創傷面に培養哺乳動物細胞の層が固定される適合性キャリアーとからなる創傷用ドレッシングを製造するシステムを提供するものである。さらに本発明は、キャリアーが、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有する合成ポリマー層からなる、培養哺乳動物細胞の層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーからなる創傷用ドレッシングを、治療すべき領域に貼付することからなる創傷治療の方法を提供する。本発明の更なる具体例には、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有している合成ポリマーからなり創傷表面に面している適合性キャリアーと、栄養溶液または成長する哺乳動物の細胞からなるコンテナーと、キャリアーおよび栄養溶液を収容する容器とからなるキットが提供される。キットはそのうえ哺乳動物の細胞のサンプルを含んでもよい。本発明で利用する哺乳動物の細胞は固定依存性であり、すなわち増殖できる前にそれらの細胞が結合できる表面を必要とする。用語「適合性」により、ドレッシングが貼付される体の部分の輪郭における変化にドレッシングが従うことを意味している。合成ポリマー層は、合成ポリマーフィルムが好ましい。一つの形としては、キャリアーは単一のポリマー層からなる。別の形としては、キャリアーは、二層の合成ポリマー層の積層品からなり、その少なくとも二層の少なくとも一層のポリマーは、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有している。親水性ポリマーが膨張するかまたはさもなければ培地に暴露された後に壊れやすくなったり取り扱いが困難になる場合、積層品を使用するのは有益である。創傷のドレッシングが１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有しているポリマー層からなる場合には、細胞層はこのポリマー層に固定されてもよい。代わりに、細胞層は少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層に固定されてもよい。キャリアーが、細胞の固定を可能にするような望ましい表面の特性を持つために、表面を処理してもよい。表面処理の適切な形態は、コロナ放電処理がある。コロナ放電処理は、材料の表面エネルギーを増大させ、細胞固定のための改良した状態を提供しうる。コロナ放電処理の効果は、処理した材料上の水の接触角を測定することにより判断できる。接触角を測定する方法は、以後に述べる。適切には、接触角は少なくとも１０％だけ、望ましくは少なくとも１５％だけ、好ましくは少なくとも２０％だけ減少さすべきである。キャリアーに適用できる他の適切な処理には、ゴロー放電またはプラズマ処理、化学的エッチングおよび火炎処理がある。それ故、本発明の一つの具体例としては、創傷用ドレッシングは、少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層と疎水性ポリマー層の積層からなり、そのポリマーは細胞生育に非阻害性で非細胞毒性である適合性キャリアーからなっている。疎水性ポリマーとは、ポリマーが１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有していることを意味する。ポリマー層のパーセンテージ吸水性は、以下の方法で評価される。ポリマー層のサンプルは乾燥状態でその重量を測定する。その後、サンプルは過剰の蒸留水中に浸され、２４時間の間２０℃で放置される。水和したサンプルはその後除き、過剰の水をサンプルの表面から除き、サンプルは再び重量を測定する。得られた重量における増加パーセンテージがパーセンテージ吸水性ｗ／ｗ％である。以下の式はパーセンテージ吸水性（ｗ／ｗ％）を計算するのに使用される。ｗ／ｗ％吸水性＝（サンプルの集まり＋水）−サンプルの集まり）×１００サンプルの集まりキャリアーのパーセンテージ吸水性ｗ／ｗ％は、上述の方法でポリマー層のサンプルよりむしろキャリアーのサンプルをとることにより評価される。キャリアーは透明性で表面の細胞を顕微鏡で検査させうるものか好ましい。しかし、細胞は細胞培養の間見える必要はなく、それ故非透明または不透明なキャリアーも本発明のドレッシングに使用できる。親水性ポリマーはヒドロゲルまたはヒドロコロイドでもよい。ヒドロゲルは、透明であるため好ましい。キャリアーは、細胞生育に阻害性であるべきではない。そのような阻害の程度は、以下に述べるように試験キャリアーなしに成長させた細胞に対し測定して、パーセンテージ細胞成長減少として表される。適切には、キャリアーは細胞成長において５０％より多く減少すべきではない。より適切には、キャリアーは細胞成長において４０％より多く減少すべきではない。望ましくは、キャリアーは細胞成長において３０％より多く減少すべきではなく、好ましくはキャリアーは細胞成長において２０％より多く減少すべきではない。キャリアーは、非細胞毒性であるべきである。細胞毒性は、以下に述べるような方法で非細胞毒性な対照材料に対して測定される。適切には、キャリアーの細胞毒性は３０％を超えない。より適切には、キャリアーの細胞毒性は２０％を超えない。好ましくは、キャリアーの細胞毒性は１５％を超えない。キャリアーは、少なくとも二枚のフィルムまたは少なくとも二枚のシートからなる積層品でも、一枚のフィルムおよび一枚のシートからなる積層品でもよい。適切な合成ポリマーには、親水性のポリウレタン、例えばＨＹＴＲＥＬ（商標）のようなポリエーテルポリエステル（熱可塑性エーテルエステルエラストマーまたはコポリエステルコポリマーとしても知られている）、例えはＰＥＢＡＸ（商標）のようなポリエーテルポリアミド、ポリアクリルアミドおよびポリエチレンオキシドが含まれる。それ故、適切な積層品は、エチレン酢酸ビニルのような、固定依存性の哺乳動物細胞が付着できる材料で被覆されたポリウレタンフィルムからなってもよい。キャリアーは、ヒドロゲル、ヒドロコロイドまたは他の適切なポリマーからなっていてもよい。適切なヒドロゲルの例としては、ポリヒドロキシエチルメタクリル酸（ポリＨＥＭＡ）、架橋したポリビニルアクリル酸（ＰＶＡ）、トリアリルスクロースで架橋されたポリアクリル酸（カルボポール）およびポリビニルピロリドンが挙げられる。適切なヒドロコロイド材料の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウムのようなカルボキシメチルセルロースが挙げられる。カルボキシウレチルセルロースは、架橋されていても架橋されていなくてもよい。ヒドロコロイドは、さらにヒドロコロイドを共に保持するポリイソブチレンを含んでいてもよい。ヒドロゲルは、フィルムまたはシートの形でもよい。シートは、自立性でもよい。代わりにシートは適切な支持層、例えばポリマーフィルムまたはポリマーネットで支持されてもよい。シートが支持層により支持されている場合には、シートおよび支持層がキャリアーを構成する。キャリアーが疎水性ポリマー層からなる場合、特に高度に滲出性の創傷において、貼付する場所から滲出物を取り扱うことができるように開口していることが望ましい。それ故、連続ポリマー層は、細胞層が望ましい程度の集密に達した後に、穿孔されるように適合できる。そのようなフィルムの例としては、例えはＥＰ−０１４１５９２号、ＧＢ−１０５５９６３号およびＧＢ−９１４４８９号に記載の二軸延伸フィルムが挙げられる。滲出物が開口を経て容易に排出でき、ドレッシングの下には蓄積しないことから、上述のようにキャリアーを開口させることは、例えば高度に滲出性の創傷での滲出物の蓄積がないことを確実にする。キャリアーを穿孔するのは、熱ピン穿孔またはスリットすることなどのいずれかの適切な方法を使用して、細胞層を固定する前または後に行なわれてもよい。細胞成長の後の穿孔は、細胞の破裂や損失を最小にして行なわれるべきである。穿孔は創傷の滲出物の排出中の適当な開放領域を与えるようにすべきである。開放領域の最小限度は、フィルムまたは積層品の透湿性に左右される。必要な柔軟性と適合性を有するようにするためにキャリアーが二層のポリマーフィルムまたはネットの積層品の場合、０．０７５ｍｍを超えない厚さが適当である。より適当には、０．０５ｍｍを超えない厚さであり、望ましくは０．０４ｍｍを超えない厚さであり、より望ましくは０．００５から０．０３ｍｍの厚さであり、好ましくは０．０１から０．０２５ｍｍの厚さであり、例えは０．０１５ｍｍまたは０．０２０ｍｍである。キャリアーがシートおよびポリマーフィルムまたはネットからなる場合、０．０７５ｍｍから約５ｍｍまでの範囲の厚さでもよいが、そのポリマーフィルムまたはネットは上述の限定された寸法を有している。網目状にすることは、慣習的に植皮の移植の前に行なわれ、移植の表面積を増加させる。同様に、本発明の創傷用ドレッシングがポリマーフィルムからなる場合、従来の網目−移植装置によって輸送することができる。キャリアーとして利用できる適切なフイルムは、平らかまたは輪郭を描かれたものでもよい。輪郭は、例えば型押で製造される。適切には、輪郭付フィルムは、開口を有していてもよい。そのようなフィルムは、ＷＯ９０／００３９８号に記載されている。キャリアーは水蒸気、酸素および二酸化炭素の透過性なものが適切である。創傷の場所にあるドレッシングは創傷が治る間、細胞が生きていられるように湿った状態を提供する。キャリアーは、好ましくは液体の水に不浸透性であるが、少なくとも３００ｇｍ^-2２４時間^-1の垂直(upright)透湿度（ＭＶＴＲ）を有すべきである。キャリアーは、２０００ｇｍ^-2２４時間^-1未満の垂直透湿度（ＭＶＴＲ）を有するのが適切である。キャリアーは、少なくとも２５００ｇｍ^-2２４時間^-1の逆(inverted)透湿度（ＭＶＴＲ）を有するべきである。逆透湿度（ＭＶＴＲ）は、２５０００ｇｍ^-2２４時間^-1を超えないのが適当である。支持体の垂直および逆ＭＶＴＲを決定する方法は、以下の通りである：透湿度（ＭＶＴＲ）はペイン・カップ法により測定される。この方法は、フランジ付き蓋を有する１．５ｃｍの深さのカップを使用する。フランジの内径は水蒸気が通過する試験材料の１０ｃｍ²の面積を提供するものである。この方法では、１０ｍｌの蒸留水をカップに加え、フランジを完全に覆うように充分大きい試験材料のサンプルをカップの上部に固定する。試験材料が接着性の表面を有している場合、その接着性表面がカップの中に面するように固定する。完全な組み立てられた品は、次いで重量を測定され、温度と相対湿度がそれぞれ３７℃および１０％に維持されている送風機付電気オーブン中に置く。オーブンの床に３−８メッシュの無水塩化カルシウムを１ｋｇ置くことにより、オーブン中の相対湿度は１０％に保たれている。適切な時間、例えば１７時間の後、カップはオーブンから移され、２０分間室温に達するまで放置する。再び重量を測定した後、蒸気透過による水の損失量を計算する。透湿性（ＭＶＰ）は、ｇｍ^-2２４時間^-1３７℃、１００％から１０％の相対湿度の違いの単位で表現される。試験材料が水蒸気に接している時、これはＭＶＰである。ＭＶＴＲを計算するために、読み取ったものを試験材料の標準の厚さ、すなわち１ミルの厚さに訂正する。材料が水に接触している時のＭＶＰは、オーブン中に位置を逆にしたパインコップを単に置くことにより液体の水（水蒸気ではなく）が試験材料に接触でき、そのことにより同じ器具を使用し、試験材料の厚さに必要な調節を行い測定することができる。本発明の改良としては、キャリアーは小さいメッシュサイズの目のつんだ織物を形成するために、編物、織物または不織物の合成ポリマーから作られていてもよい。細胞培養の後、織物は細胞の損失なしにより大きなメッシュサイズを有する織物を形成するために伸はされてもよい。自己培養上皮細胞を用いることか、宿主（患者）に貼付した際に免疫学的拒絶問題が少ないか全くないため、好ましい。しかし、非自己細胞も例えは同種移植または異種移植をするのに使用しうる可能性がある。細胞はケラチノサイトが好ましい。我々は、創傷用ドレッシングを創傷部位に移動する前に、細胞層が集密に達しないようにし、それにより適当な創傷用ドレッシングが２、３時間内で生じるようにさせることが好ましいことを見出した。細胞層が亜集密性(s ub-confluent)なため、創傷用ドレッシングは一層の細胞からなることが考えられる。キャリアーは、適切な公知の滅菌方法の何れかを使用して滅菌してもよい。滅菌の適切な形態としては、エチレンオキシド（ガス抜きに必要な時間をみておく）、ガンマ照射または蒸気滅菌が含まれる。滅菌の後低分子量の汚染物質をすべて除くため、例えば重合していないモノマーは細胞毒性なので、キャリアーが合成ポリマーの場合、重合していないモノマーを除くため、キャリアーは洗浄される。洗浄工程は連続ステップにおいて脱イオン化した滅菌水を使用して、幾つかの連続洗浄を含んでいてもよい。代わりに、キャリアーは無菌的に製造されてもよい。本発明のシステムによると、細胞がその上で成長しているキャリアーは、そのシステムの他の部分すなわち細胞を含有する水性培地をキャリアーの対創傷面と接触して保持させる手段から、容易に除去できることが好ましい。例えば、キャリアーが培地を含んでいる容器の壁を形成している場合、キャリアーは容器の他の部分から容易に除かれるべきである。キャリアーは、細胞培養が成長した容器の全部分の一部を形成してもよい。容器または培養器の他の部分は、従来組織培養器の製造に使用されている適当な材料から形成される。耐衝撃性ポリスチレンが好ましい。代わりの具体例では、基質を移動させることかできるように適合させた適当なデザインのフラスコ中に、キャリアーを置いてもよい。キャリアーが培養フラスコの一体部分である場合、キャリアーはフラスコの他の部分に除去できるように例えばヒートシールまたは接着剤により封止されてもよい。キャリアーは平らな表面を形成するのが好ましく、フラスコの基底を形成するのが適切である。キャリアーがフラスコ中に含まれる場合、フラスコはそれに固定されている細胞を破壊することなく、キャリアーを容易に除くことができるのに十分な直径を有している閉鎖可能な開口部を備えていてもよい。開口したキャリアーが培養フラスコの一体部分を形成するのに使用されている場合、フラスコの水を密に保ち殺菌性を維持するためにそれらは連続フィルムなどにより覆われてもよい。キャリアーがフラスコ中に置かれている場合、例えば予備殺菌されたステンレスの輪により、または代わりとして組織培地の存在下に粘性を維持することができる非細胞毒性な接着剤層でキャリアーの片側を被覆することにより、キャリアーは保持されてもよい。栄養素、成長因子または抗生物質もしくは抗炎症剤のような薬剤は、細胞培養が行なわれる水性培養液中に含まれてもよい。そのような添加成分の性質および重量および／または容量は従来よく知られている。本発明の創傷用ドレッシングは、様々な創傷に使用してもよい。本発明のドレッシングは特に、表皮およびおそらく真皮の一部のみが失われた場所である、部分的に厚い創傷を治療するのに適している。そのような創傷は例えば植皮移植供与部位、第１度またはおそらく第２度のやけど、浅い脚潰瘍または床づれが含まれる。ドレッシングはまた、静脈性の潰瘍等の全部深部(full thickness)創傷を治療するのに適している。連続したポリマーフィルムキャリアーは、望ましい速度で創傷が治るような、水蒸気、酸素および二酸化炭素に対し充分に透過性であると同時に、バクテリアに対しバリアーとして機能することが適切である。基質が穿孔された時、水蒸気、酸素および二酸化炭素の透過性を望ましい程度に保つために第二のドレッシングを適用することができる。適当な材料は、同じ状態を作るために創傷の上に置くことができるＯＰＳＩＴＥ（商標）のようなポリウレタンフィルムのドレッシングである。ドレッシングは、特定の創傷の性質および患者の状態により、創傷が３０−９０％再上皮化される（治る）のに適切な期間の間、創傷の上に置かれているのが適当である。この時、ドレッシングは除去して、従来の創傷用ドレッシングと置き換えることができる。１９７５年、グリーン（Ｇｒｅｅｎ）らは、皮膚培養を拡大するために、供給層システムとしてマウス由来の転換された細胞ライン３Ｔ３細胞の使用を提案した。３Ｔ３細胞は、非常に低密度で接種されたケラチノサイトの成長のために必須な因子を製造する。さらに３Ｔ３細胞は好ましくない線維芽細胞の成長を阻害する。３Ｔ３細胞を含む皮膚細胞の製造法は、細胞を殺すためでなく細胞分裂を抑制するために、まずガンマ線照射（典型的には約６０００ラド）でなければならない。そのように照射された細胞は幾日か生き続け、その間宿主のケラチノサイト細胞のために材料を合成し供給するであろう。結局、３Ｔ３細胞は皮膚細胞層から吐出される。しかし、必然的にいくらかのマウス細胞は残り、それ故宿主ケラチノサイトに移植される。本発明のドレッシングでは、３Ｔ３のような供給細胞はキャリアーの逆側と接触している培養液に接種されてもよい。これらの細胞は、その後宿主細胞のために材料を合成するであろう。供給細胞が宿主細胞と接触しないので、それらを照射する必要はない。キャリアーが培養フラスコから除かれた時、逆の側は洗浄され、浮動的な供給細胞を取り除いてもよい。供給細胞層が開口されたキャリアーとともに用いられる場合、開口は培地の交換が自由にできうるのに充分な大きさで、細胞が通過することはできない大きさを有しているべきである。開口の大きさは、一番大きな開口で半径５μを超えないものが適切である。適切には開口の大きさは０．５から２μである。本発明のドレッシングは、それらが宿主に適用される場所で、適切に資格を受けた人員により製造されてもよい。それ故、ドレッシングは病院細胞培養製造所で細胞培養者により先に記載の方法により製造されるのが適当である。代わりとして、ドレッシングはそれが適用される病院などの場所から離れた場所で製造されてもよい。後者の場合では、ドレッシングは適当な状態のもと、例えば正確に管理された温度のもと輸送されてもよい。それ故、ドレッシングは低温保存すなわち−１９０℃で維持され、その後使用直前に室温に戻されてもよい。代わりに、ドレッシングは使用可の状態で輸送されてもよい。したがって、ドレッシングは望ましい温度で適当な細菌培養器中で輸送されてもよい。接触角は、カーン（Ｃａｈｎ）ＤＣＡ−３２２動的接触角分析機を使用し、ウイルヘルミー・プレート（ＷｉｌｈｅｍｙＰｌａｔｅ）動的接触角測定システムにより測定する。前進接触角および後退接触角の両方を測定する。使用された試験液体は水でもよい（ＨＰＬＣ等級）。１５０ミクロン／秒の浸漬／抜き取り速度を使用してもよい。フィルムのサンプルはフィルムを約２４ｍｍ×３０ｍｍのカバーガラスの上に貼り付けるか溶液からスライドを浸漬被覆してもよい。試験は２３℃／５０％ＲＨで行なわれてもよい。細胞成長減少を測定する適切な方法はＷＯ９１／１３６３８号に記載してある。基質の細胞毒性のパーセンテージを測定する方法は、ＷＯ９１／１３６３８号に記載してある。本発明のドレッシングシステムの具体例は以下の図を参考にして説明する。図１に関しては、培養フラスコ１の基底の壁は一枚の開口されたフィルム２および一枚の連続したフィルム３の積層品からなる。積層品の端はフラスコ３の他の壁部分５に除去可能に結合している。培地４および供与細胞は、頚６を経てフラスコ３の中に挿入されて、栓７によりその中に封止される。システムは適当な細胞培養状態下でインキュベートされた後、積層品２および３は、はがすことによりフラスコ１から移動することができる。図２は、第一のフィルム２を第二のフィルム３に注型することにより形成された構造２および３を図示している。フィルム３は多数の凸部８を有している。その結果のフィルム２は、多数の薄い９および厚い１０領域を有している。フィルム３からフィルム２を分離する際に、薄い領域９が破れ図３に示すように開口１２が形成する。それにより形成した開口した形状は、その後ポリマー層に積層され、本発明のドレッシング中のキャリアーとして使用するのに適当な積層品を形成する。図３に関しては、培養フラスコ１は親水性ポリマー層１４および穿孔した疎水性フィルム２からなるキャリアーにより、区画２１および３１に分割される。培地４はフラスコ中に挿入され、区画２１および３１の両方を占める。３Ｔ３のような供給細胞は通路口１１を経て区画３１に接種され、一方皮膚細胞は頚６を経て区画２１に接種される。栄養素、成長因子または抗生物質または抗炎症剤のような薬剤は細胞培養が成長する水性培地に含まれてもよい。そのような添加成分の重量の性質および／または容量は従来よく知られている。皮膚細胞の層が必要な程度集密に達した後、キャリアーはフラスコの壁部分５から分離され、通路口１３から移動される。細胞層は亜集密性なのが好ましい。代わりに、集密性でもよい。本発明は、以下の表中のポリマーのいずれかを使用することにより説明される。実施例ヒト上皮細胞（ケラチノサイト）は１６％より大なる吸水性を有するポリマーのフィルムおよび積層品上で生育させた。使用した材料および方法は以下に詳しく述べる。使用した細胞はＳｃａＢＥＲ細胞ラインから由来し、米国メリーランドのＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎにより提供された。細胞は光学顕微鏡で検出しやすくするために、染料マーカーでラベルを貼り付けた。これはあるサンプルの非均質な表面に対し細胞を検出するのが困難なため、必要であった。米国セントルイスのシグマケミカル社（ＳｉｇｍａＣｈｅｍｉｃａｌＣｏｍｐａｎｙ）により供給されているシグマイムノケミカルズ（ＳｉｇｍａＩｍｍｕｎｏＣｈｅｍｉｃａｌｓ）ＰＫＨ２６赤色蛍光性の一般的な細胞リンカーキットを使用してそのキットに与えられている指示にしたがい、細胞はラベルを貼り付けられた。サンプル上の培養のための新鮮な培養液中に再懸濁される前に、細胞はその後血清が含まれていない培地で洗浄した。対照実験は蛍光性の染料マーカーがポリマー基質により取り込まれているかどうか決定するために行なった。その結果は、染料がポリマーに吸収されておらず細胞に特定的であり、それにより実験サンプルに観察される蛍光はポリマー表面に接着した細胞に由来することが示された。使用した培地はアールズ（Ｅａｒｌｅ’ｓ）最低必須培地（ＭＥＭ）＋１０％胎児の子牛血清であり、以下のように作製した：３４８ｍｌアールズＭＥＭ（Ｌ−グルタミン抜き）、ギブコ（Ｇｉｂｃｏ）ＢＲＬ提供。４０ｍｌ熱−不活性化された胎児の子牛血清４ｍｌペニシリン／ストレプトマイシン（５０００ＩＵ／ｍｌ−５０００ μｇ／ｍｌ）、ギブコＢＲＬ提供。４ｍｌ非必須アミノ酸類４ｍｌＬ−グルタミン（１００ｘ）２００ｍＭ、ギブコＢＲＬ提供。細胞は培養液３ｍｌにつき１０⁶細胞の密度で接種した。先の濃度で細胞を含んでいる培地は、試験されるサンプルフィルムに接触してペトリ皿中に置かれ、３７℃で最初２４時間、ついでさらに２４時間から最大３日間の間、インキュベートした。ポリマー基質は、その後ペトリ皿から移動され、注意深く洗浄され、そして紫外線光の下でラベルをつけられた赤色蛍光性細胞を検出するようにロジウムフィルターで調節されたニコン逆転顕微鏡を使用して、接着した細胞の存在を検出された。使用したポリマー層はすべて薄いフィルムであり、フィルムが平らになりその後の取り扱いが容易になるように金属の輪を使用し、ペトリ皿の底に置かれた。キャリアーに使用されたポリマー層は、創傷用ドレッシング構成に使用され医療目的で皮膚に貼付するに適していると知られている親水性フィルムのサンプルであった。実施例１押出成形され、約２０μｍの厚さかつ上述の方法で測定した時６４％の吸水性を有するフィルムを形成した熱可塑性ポリエーテル−ポリウレタンが、キャリアー層として使用された。フィルムはペトリ皿の基底に置かれ、細胞を含んでいる培地をフィルムの上部表面上に挿入した。２４時間のインキュベーションの後、キャリアーは除かれ、洗浄された。ｕ．ｖ．ライトの下での観察により細胞がフィルム表面に接着していることが示された。フィルムは培地の吸収により膨れ上がった。実施例２約２０μｍの厚さの熱可塑性ポリエーテル−ポリウレタンのフィルムは、５０ μｍのエチレン酢酸ビニル（ＥＶＡ）のフィルムに積層されキャリアー層を形成した。ＥＶＡ材料は約０．３％の吸水性を有していた。培地および細胞は積層品のポリエーテル−ポリウレタン側の上に置いた。いくつかの細胞は２４時間後に接着しており、２、３日後にはさらに多くの数の細胞が接着していることが確認された。サンプルは広く平らを保っているように見え、おそらく培地中で親水性フィルムが膨らんだことによる隆起がフィルムの表面に見られた。実施例３実施例２で記載した積層品はキャリアー層として使用され、細胞は積層品のＥＶＡ側に成長した。細胞は２４時間後にはフィルムに接着し生育していることが観察された。実施例４使用したキャリアーは，スミス＆ネフューヘルスケア（Ｓｍｉｔｈ＆ＮｅｐｈｅｗＨｅａｌｔｈｃａｒｅ）Ｌｔｄにより商標「ＯＰＳＩＴＥＩＶ３０００」の名で販売されている、市販のドレッシングであった。そのキャリアーは、親水性ポリウレタンフィルムの裏打ち層と、その対創傷面に接着したアクリリック圧力感受性接着剤の層からなる。ドレッシングの吸水性は測定すると約６８％であった。細胞は非接着性のドレッシングのポリウレタン側にコロニーを作っていることが観察された。実施例５キャリアーは、細胞運搬層として使用されたドレッシングの接着性側を有する実施例４のドレッシングであった。細胞は接着剤に接着し増殖したことが観察された。実施例６使用したキャリアーは、実施例１で使用した二層の２０マイクロメーターの熱可塑性ポリエーテル−ポリウレタンフィルムの積層品であった。予想されたように、細胞は培地に接触しているフィルム範囲上によく分散して、フィルム表面に接着していることが観察された。サンプルは培養液と接触した後泡だった外観を有し、しかしこれが表面への細胞の接着にはなはだしく影響しているようではなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者マシュージェーンブリジットイギリス、ヨークワイオー２１デイーピー、サウスバンクアベニュー 84 (72)発明者ドリューベリージョージロバートイギリス、ノースハンバーサイドワイオー４３エッチティー、マーケットウェイグトン、グッドマンハンロード 13、ハイフィールド

Claims

【特許請求の範囲】１．キャリアーが、少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有し非細胞毒性で細胞生育に非阻害性である合成ポリマー層からなる、培養哺乳動物細胞の層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーからなる創傷用ドレッシング。２．ポリマー層が合成ポリマーフィルムである請求項１の創傷用ドレッシング。３．ポリマー層が編物、織物または不織物である請求項１の創傷用ドレッシング。４．キャリアーが少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有している一層の合成ポリマーからなる請求項１から３の何れかの創傷用ドレッシング。５．キャリアーが二層の合成ポリマー層の積層品からなり、その少なくとも二層の少なくとも一層のポリマーが細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有している請求項１から３の何れかの創傷用ドレッシング。６．少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層と１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有しているポリマー層の積層である適合性キャリアーからなり、そのポリマーは細胞生育に非阻害性で非細胞毒性である請求項５の創傷用ドレッシング。７．細胞が少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有しているポリマー層に固定されている請求項６の創傷用ドレッシング。８．細胞が１６ｗ／ｗ％未満の吸水性を有しているポリマー層に固定されている請求項６の創傷用ドレッシング。９．キャリアーの対創傷面が、表面処理されている何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１０．表面処理がその表面の接触角を少なくとも１０％だけ減少させる請求項９の創傷用ドレッシング。１１．ポリマー層が、親水性のポリウレタン、ポリエーテル−ポリエステル、ポリエーテル−ポリアミド、ポリアクリルアミドまたはポリエチレンオキシドのフィルムからなる何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１２．キャリアーが開口したポリマー層からなる何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１３．細胞が上皮細胞である何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１４．細胞層が亜集密性の層である何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１５．細胞層が４０％から７０％集密性である何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１６．細胞層が一層である何れかの先の請求項の創傷用ドレッシング。１７．キャリアーが培地の表深部位置に保持され、哺乳動物細胞を含有する水性培地をキャリアーの対創傷面と接触して保持する手段とで、キャリアーが少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有し非細胞毒性で細胞生育に非阻害性である合成ポリマーからなり、対創傷面に培養哺乳動物細胞の層が固定される適合性キャリアーとからなる創傷用ドレッシングを製造するシステム。１８．手段が培養容器からなり、キャリアー層がその容器の一体部分を形成する請求項１７のシステム。１９．手段が、キャリアー層が配置され支持されている容器からなる請求項１７のシステム。２０．キャリアーが、含有する手段の一部を形成している液体不透性のさらなる層で支持されている請求項１７から１９の何れかのシステム。２１．キャリアー層がさらなる層で支持されており、そのさらなる層が突出を有しており、そのキャリアー層がさらなる層の突出の領域に対応して多数の薄層を有している請求項１７から２０の何れかのシステム。２２．キャリアーが、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性で少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有する合成ポリマー層からなる、培養哺乳動物細胞の層が固定される対創傷面を有する適合性キャリアーからなる創傷用ドレッシングを、治療すべき領域に貼付することからなる創傷治療の方法。２３．少なくとも１６ｗ／ｗ％の吸水性を有し非細胞毒性で細胞生育に非阻害性である合成ポリマーからなり対創傷面を有している適合性キャリアーと、哺乳動物細胞を成長させる栄養溶液からなるコンテナーと、キャリアーおよび栄養溶液を収容する容器とからなるキット。２４．さらに哺乳動物の細胞のサンプルを含んでいる請求項２３のキット。