JPH05504497A - 細胞培養製品 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞培養製品 この発明は、哺乳動物の足場依存性細胞の適合性基体への培養に関する。より詳 しくは、この発明は、例えば火傷のような部分厚みの創傷や皮膚移植ドナ一部位 のような治療に適する創傷ドレッシングの形成及びこのドレッシングの製造に使 用するシステムに関する。

懸濁した液体培養物中では増殖できないか基体の表面で増殖させることかできる 哺乳動物の細胞は足場依存性（ａｎｃｈｏｒａｇｅ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ）とい われる。

ケラチノサイトのような上皮細胞は足場依存性である。非阻害性で非細胞毒性の 基体の存在下で培養したこのような細胞は、音状のコロニーで繁殖し、時に融合 層を形成する。このタイプの細胞培養物か皮膚生育の研究に使用され、皮膚移植 片として使用されてきた。皮膚細胞を生体外で生育する技術や、これを完全厚み の創傷の治療に使用することを記述した各種の刊行物か発行さねている。例えば 、巳、　Ｂｅ１ｌ　ら（Ｊ、　Ｉｎｖｅｓｔ、　Ｄｅｒｍ、　８１、２ｓ−１０ ｓ、　１９８３）　：　Ｅ、　Ｂｅ１ｌら（ｓｃｉｅｎｃｅ　２１１．１０５２ 〜１０５４゜１９８１）：Ｄ、　Ａｓ５ｅｌｉｎｅａｕとＭ、　Ｐｕｒｎｅｉｒ ａｓ（Ｂｒ、Ｊ、Ｄｅｒｍ、１９８４．ｎ［。

Ｓｕｐｐｌｅｍｅｎｔ　２７．　２１９〜２２２）とＪ、　Ｆ、Ｂｕｒｋｅら（ Ａｎｎ、ｓｕｒｇ、　９４゜４１３〜４２８．１９８１）。

細胞の特定な基体への固定化能は、基体それ自体の性質ならびに培地の培養条件 や成分に依存する。培養は、通常、生育媒体に実質的に不活性で細胞に対して非 毒性である材料で作った硬質プラスチックのフラスコ中で行われる。培養フラス コ用の材料として普通用いられるのはポリスチレンである。

皮膚移植片として用いる上皮細胞の培養用の硬質プラスチックフラスコを利用す る際の１つの問題は、セルのシートか、通常収得する前に融合しかちなことであ る。融合までの時間は長いかも知れない。その上、細胞層は、機械的に強いもの ではなく、支持されない細胞か移動されたり不支持のまま取扱うと容易に損傷さ れる。

細胞のシートを、取扱しやすくし、創傷面へ移すため表面から除去した後に支持 できることが知られている。しかしこの技術は、硬質の表ｆ培養物に伴う問題や 細胞の除去に伴う危険を解決していない。

上皮細胞はコラーゲンのような天然材上で生育されており、これは皮膚代用物で 直接使用できる。この技術は、上記の刊行物に記載されている。上皮細胞はコラ ーゲン上でよく生育するがコラーゲンのような材料を用いるにはいくつかの欠点 がある。

コラーゲンは天然物であるため、十分に限定されておらず、ｌバッチごとに実質 的に変化し、これは皮膚移植片として使用するには臨床的に好ましくない。コラ ーゲンは、実験室で取扱うにはむづかしい材料であり、その単離は複雑で時間を 要するものであるため、作るのに高価となる。更に、コラーゲンは蛋白質である ため、蒸気浸漬のような方法では、変質するため滅菌できない欠点かある。従っ て、貯蔵し、滅菌を保のかむづかしい。

コラーゲンおよび硬質プラスチック面と細胞培養基体として使用するのに伴う問 題を解決する試みとして、細胞を水膨潤性の親水合成ポリマーの表面で生育する ことか提案されている。

細胞は、水性媒体に浸漬されず、基体・ガス界面で生育される。

得られるンートは比較的かさか大きく、そのために適合性に欠け、細胞１は、創 傷部位で例えば１４〜２１日というかなりの時を要する移植の前に完全に融合さ れる。この方法は、ＰＣＴ公開Ｎｏ、　ＷＯ３８１０８４４８に記載されている 。

我々は、細胞を取扱い容易で、柔軟性で適合性基体上で生育ができ、そこでは細 胞が水性媒体に浸漬されるため基体・ガス界面で生育した培養物に伴う問題かさ けられることを見出した。

その上、前の提案とはことなり、融合に達する前に細胞層を移行できる。その上 、この方法は、先の提案よりかなり速く、移行可能段階に達するまで７日より少 ない。そのため、このドレッシングは先行技術よりかなりの有利を提供する。

この発明の目的は、合成ポリマーフィルムで、疎水性で細胞生育に非阻害性で非 細胞毒性である適合性基体の１つの表面に固定される培養しだ哺乳動物細胞の層 からなる創傷用ドレッシングを提出するものである。

この発明の他の目的は、疎水性、細胞生育に非阻害性で非細胞毒性のポリマーフ ィルムからなる足場依存性哺乳動物を、前記フィルムの１つの表面と接触して細 胞を書斉する水性培養メカニズムを保持する手段と共に培養して、創傷用ドレッ シングを製造するシステムを提供することにある。

この発明によれば、疎水性、非細胞阻害性、非細胞毒性の合成ポリマーのフィル ムからなる基体の１つの表面に固定された培養哺乳動物細胞の層からなる適合性 創傷用ドレッシングか提供される。

また、この発明は、基体が疎水性、非細胞阻害性で非細胞毒性の合成ポリマー材 の適合性フィルムである足場依存性哺乳動物細胞培養用の基体と、培地をその基 体と接触保持する手段とからなる創傷用ドレッシング製造システムを提供する。

さらに、この発明は、足場依存性哺乳動物細胞をシステム内に含めた基体上で培 養して創傷用ドレッシングを製造する方法を提出する。

この発明に使用される哺乳動物細胞は、足場依存性である細胞である。すなわち 、この細胞は、基体に、増殖できる前に結合しうることを要求される。

適合性（ｃｏｎｆｏｒｍａｂｌｅ）とは、ドレッシングが付着される身体部分の 寸法変化に順応することを意味する。

基体（５ｕｂｓｔｒａｔｅ）に、細胞の固定（ａｎｃｈｏｒａｇｅ）をさせる望 ましい表面特性を持たすため、基体はコロナ放電処理フィルムであるのか好まし い。コロナ放電処理は、材料の表面エネルギーを増加し、細胞固定の状態を改良 する。コロナ放電処理の効果は、処理材料の水の接触角を測定することにより評 価できる。

接触角測定法は以後に記載する。接触角は、少なくとも１０％、望ましくは少な くとも１５％、好ましくは少なくとも２０％減少させるべきである。

基体は適合性合成ポリマーフィルムである。基体に、この発明の目的に要する柔 軟性と適合性を持たすため、０．０７５ｍｍを越えない厚みか適する。基体は、 ０．０５ｆｆｌ！ｌＩを越えない厚み力・より適する。基体は、０．００５−〜 ０．０３ｍｍの間の厚みか望ましく、０．０１０ｍｍと０．２５Ｂの間の厚みか 好ましく、例えば０．０１５−又は０．０２０ｍｍである。

基体は、疎水性材料で作られる。“疎水性”とは、水分吸収か、材料の１５重量 ％を越えないことを意味する。水分吸収は１０重量％以下が適し、７重量％以下 か望ましい。水分吸収は材料の５重量％を以下がより望ましい。基体は、水性媒 体と接触した際全く膨張しないのか好ましい。

基体の吸水率は、次の方法で評価される。基体の５ｃｍＸ５ａｎ片を乾燥状態で 秤量する。これを過剰の蒸留水に浸しく少なくとも１０Ｃ７’）　２０°Ｃで２ ４時間放置する。この基体片を取り出し、過剰の水を排水させ、基体を再秤量す る。得られた重量増加パーセントか吸水率である。

基体は細胞生育を阻害してはならない。阻害の測定は、テスト基体の存在下で細 胞を生育したものに対し、測定された細胞発育減少率として表わされる。これは 後述する。基体は、細胞発育で５０％以上の減少をしないことか適する。より適 するのは、細胞発育の４０％以上の減少をしない基体である。望ましいのは、細 胞発育の３０％以上の減少をせず、好ましくは細胞発育の２０％以上の減少をし ない基体である。

基体は、細胞発育に対し細胞毒であってはならない。細胞毒性は、後述のような 方法で、非細胞毒コントロール材に対し、測定できる。基体の細胞毒性は、３０ ％を越えないのか適し、２０％を越えないのかより適する。基体の細胞毒性は２ ０％を越えないのか望ましく、１５％を越えないのか好ましい。

基体は、連続フィルムまたは開口フィルムの形であることかできる。しかし、基 体は、細胞層か基体上に形成された後に開口されるよう適合されている連続フィ ルムが好ましい。

この発明の開口ドレッシングを使用すると、このドレッシングで覆れた創傷での 滲出物か開口を通して容易に逃すことかでき、薯用中に増加しない。フィルムの 開口は、細胞培養の前後の何れかで、熱ピン開口やスリット化のような適当な常 法で行うことかできる。細胞培養後の開口は、細胞破壊と損失が最少になるよう に行うべきである。開口は、少なくとも５％オーブン領域を有するのか適し、少 なくとも２０％のオープン領域を育するのが好ましい。開口は、５０％のオーブ ン領域以下であるのか適し、４０％オーブン領域以下で好ましい。２５％オーブ ン領域か１つの例である。

細胞培養後に開口させるよう適合する基体の特に好ましい形は、２軸延伸させた 連続フィルムで、例えば、フィルムが他方向に伸張したとき開口が形成されるよ うに、製造中に機械で又は逆方向に引張りと伸張をされることによって得られる 。このようなフィルムは、例えば英国特許第９１４４８９号、同第１０５５９６ ３号、ヨーロッパ特許’１１０１４１５９２号に記載されている。

基体を形成するフィルムは平板または等高線つき、例えばエムポスつきにするこ とかできる。好適には等高線つきフィルムはまた空隙かある。このような等高線 つき材料はＷＯ９０１００３９８に記載されており、遮蔽物（Ｃｏｖｅｒｓｔｏ ｃｋ）としての用途である。

好ましくは、基体を形成している連続フィルムは湿気、酸素、二酸化炭素に透過 性でなければならない。このようにして、ドレッシングを創傷上に置くと、湿潤 状態を与え、創傷か冶塗する間細胞を生存させる。連続フィルム基体は、液体の 水に不透過であるのか望ましい一方、２４時間当たり２５００ｇＦ”を超えない 透湿度（ＭＶＴＲ）を持たすことかできる。基体は２４時間当たり１５００ｇｍ 　−２を超えないＭＶＴＲであるのでより適する。さらに好ましくは、基体は２ ４時間当た引２００ｇｍ−２を超えない、もっとも好ましくは２４時間当たり１ ００１００Ｏ”を超えないＭＶＴＲでなければならない。

基体のＭＶＴＲの決定方法は次に記載する。

透湿度（ＭＶＴＲ’）はベインカップ法で測定できる。この方法は尖端にフラン ジのついた１、５０の深さのカップを利用する。クランプの内径は、湿気体か通 過できる材料のｌ０ＣｆＩ！の面積かある。

この方法では、１ｏｒｎＩ！の蒸留水がカップに加えられ、試験中は、フランジ を充分覆えるほど大きい材料サンプルかカップにクランプで留められる。テスト 材料が接着面をもっときは、接着面・をカップにむけてクランプで留める。それ から、完成されたアッセンブリーは、温度と相対湿度かそれぞれ３７°と１０％ に保持されるファン付の電気オーブン中で秤量し、設置される。

オーブン中の相対湿度は、オーブン床に１ｋｇの無水で３−８メソシユの塩化カ ルシウムをおいて、１０％に保持する。所望時間、例えば１７時間後、カップは オーブンより移動され、２０分冷却し、室温にする。再秤量後、気体透過によっ て失わｎた水の量が計算される。透湿度は１００％−１０％相対湿度差、３７° Ｃ１２４時間あたりｇｍ　”　２の単位で表現される。即ち、３７°Ｃに保持し 、２４時間で、１平方メートルの材料を通過する水の量であり、カップ内部の１ ００％と外部の１０％の材料の２表面で相対湿度の差かある。それは、フィルム やドレッシングが湿気と接触したときの、透湿度である。接着剤か水に接してい るときの透湿度も同じ装置で測定できる。カップがオーブン中に設置されたとき 、カップを逆転して液体水（湿気ではなく）をテスト材料に接するようにする。

この発明の変形として、基体は、！Ｉ織または正織ポリマーで、小さなメツシュ 目のつんた織布を作製することもできる。細胞培養では、網の中心は引き延ばす ことができ、細胞の損失なしにメツシュサイズの大きな織布ができる。

池の応用では、基体は連動重ねあわさった網よりできており、１つの肩の空隙部 か池の謂の余部と重ねあわさっている。そして、２つの網は培養後（Ｐｏｓｔ− Ｃｕｌｔｕｒｅ）、ひき剥がされ、２つか細胞を保持しているときは、これら２ つで、患者を処置する。

好適なコロナ放電処理ポリマーフィルムは、厚さで０．０７５ｍｍを超えず、水 分量で１５％を超えず、細胞成長の減少パーセントは５０％以上とならず、細胞 毒性は３０％以上とならず、湿気透過性は２４時間当たり２５００ｇｍ−’を超 えない。

この発明のポリマーは合成物であり、天然のポリマー材料またはその誘導物なら 出来ていない。このような合成ポリマーは、それゆえ、高度の類似性と同一性を もって作製されている。発明のドレッシングに採用される基体製造に利用される 好適なポリマーは、コポリマー、ブロックポリマー、ポリマーブレンドを含んで いる。

望ましくは、コポリマーはエチレン−ビニル　アセテートのようなビニル　アセ テートを含有している。好ましいエチレン−ビニル　アセテート　コポリマーは ２０％以上のビニル　アセテートを含有していない。好ましい材料はＥＶＡ５３ ８１５３９として知られ、１６％のビニル　アセテートを含有している。

他の好適なポリマーは本質的に、ポリブタジェン、ポリプロピレンやポリスチレ ンのような炭化水素である。ポリスチレンの好ましいグレードはスタイロン（Ｓ ＴＹＲＯＮ）の商標で売られている高衝撃性ポリスチレンを含んでいる。

この発明で使用される好ましいポリマーは硬い端ブロックと柔らかい中間ブロッ クをもつブロックコポリマーを含む。望ましいブロックコポリマーはスチレン− ブタジェン−スチレン（カリフレックス［ＣＡＲＩＦＬＥＸ　］またはクラトン ［ＣＲＡＴＯＮ］の商標でシェル石油化学（株）で製造されている）のようなゴ ムをベースとするスチレンを含んでいる。

この発明の目的にあった池のクラスのポリマーはポリエステルである。このクラ スの好ましい仲間はポリエチレンテレフタレート（アインーアイ［［Ｃ［ｌから メリ不７７ス［１，ｉＥＬ［ＮＥＸ］の商標で販売されている）である。

ポリマーブレンドもまたこの発明の基体に適用される。好ましい材料はエチレン −ビニル　アセテートとポリオレフィンや芳香族炭化水素のような炭化水素のブ レンドである。

ポリマーフィルム基体は包帯時に創傷を見られるように、透明であることか望ま しい。

宿主（患者）に適用したとき、免疫拒絶問題を全くまたは殆どおこさないので、 自己培養上皮細胞に使用するのが好ましい。

細胞かケラ千ノサイトであることか好ましい。創傷ドレッシングを創傷部分に移 植する前に、細胞層を交会に到達せしめるのは、望ましくないことは分かってい る。好ましくは、細胞は移植のまえに、少なくとも３０％の交合、さらに好まし くは少なくとも４０％の交合、最も好ましくは少なくとも５０％の交会に達して いる。迅速な処置か必要なとき、緊急分野のドレッシングの利用に、特に適用さ れるドレッシング作製のとき、好ましい創傷包帯か、数時間以内に遂行され得る 。

好ましくは、ドレッシングは２細胞層を超えない、さらに好ましくは単細胞層の 細胞層よりなる。

ポリマーフィルム基体はエチレン　オキシド（必要時間、除ガスする）またはγ 線照射で殺菌できる。重要なことは、ポリマーフィルムが洗浄され、低分子汚染 物、例えば未重合モノマーを除去することである。これら、モノマーは細胞毒性 であり、上記理由より、基体は本質的に、非細胞毒性である。洗浄工程は、連続 過程で、殺菌非イオン水を使用して、数回連続して洗浄される。

この発明のシステムでは、細胞か成育している基体は好ましくは容易にシステム 、すなわち、フィルムのある面に接触している前記細胞を含む水系培養媒を維持 する手段を、他の部分より除去されねばならない。例えば、基体が培養媒を含む 容器の１つの壁に形成されたとき、容器の他の壁から容易に除去されねばならな い。ポリマーフィルム基体は、細胞培養が成長している容器の一部または全部を 形成している。容器または培養器の他の部分は、組織培養器の製造に、通常用い られる好適な材料で作製される。高衝撃性ポリスチレンが好適である。

池の実施例では、基体は、基体を除去できるように適当に設計されたフラスコ中 で生成できる。基体か培養フラスコの全部分であるときは、フラスコの池の部分 か、例えば熱打止や接着手段で、除去できるように封止する。好ましくは、基体 はフラスコの平面や壁に形成する。

基体かフラスコ中に書斉されているときは、フラスコは断面開口する形態で、投 錨している細胞を破壊することなく、基体を除去しやすいようにする。

培養フラスコの全部分を形成している基体に空隙かあるときは、容器の水をきつ く保持し、殺菌性を維持するように、連続フィルムで被せることができる。もし 基体がフラスコや容器中に保持されたときは、例えば、前もって殺菌されたステ ンレススチールリングや、その代わりに、組織培養媒の存在下で、粘着性を保持 できる非細胞毒性接着剤の１で、基体の一方をコーチングすることで、保持でき る。

栄養源、成長因子、抗生物質のような薬物、炎症抑制剤か、細胞培養か成長して いる水溶媒に組み込まれる。そのような添加物の性質、重量かつ／または体積は 通常既知のものである。

この発明の創傷ドレッシングは、表皮または真皮のほんの一部が欠けた中間層創 傷の処置に、特に適している。それらの創傷は、例えば植皮供給側、１級または ２板径度の火傷、軽い脚の潰瘍および床づれを含む。連続ポリマーフィルム基体 は、望ましくはバクテリアのバリアーとして作用する。これは、望ましい速度で 、創傷治癒のため、湿気、酸素および二酸化炭素の透過が、充分できるからであ る。もし基体か多孔であるなら、２次ドレッシング必要程度の湿気体、酸素およ び二酸化炭素の透過性の保持のため適用される。同一条件を作るため、好ましい 材料はオブサイト（ＯＰＳＩＴＥ　開襟）のようなポリウレタンフィルムドレッ シングである。好ましくは、ドレッシングは創傷口に７日残り、それにより、創 傷の性質や患者の条件によるが、創傷の３９−９０％の回復（治癒）を許容する 。その後、このドレッシングは除去され、通常ドレッシングと交換される。

この発明のドレッシングは一連の従来物より種々の利へかある。それ故、細胞層 を取扱い操作するため、各種細胞の厚さを数１まで培養する必要がある。通常の 酵素採集技術では、シートは収縮する傾向があるので、細胞層は包帯に必要なも のより、大きな面積か必要である。創傷をカバーするのに充分大きく、取扱いに 充分強い細胞シートを再生する時間に加えて、さらに多層細胞シートを使う不利 益がある。供給シートの創傷への早９、な同化を得るために、最も望ましいのは 、細胞シートの基底の表面（活発に成長している細胞を含んで）か、創傷表面と 接触していることである。既知の多層細胞シートの操作中、基までない層（ここ では、細胞は最後に分離してしまう）か創傷と接触する表面かあってもよい。

この発明のドレッシングでは、交会を達成することは必要ではないか、望ましい 。細胞の亜交合単層よりできている、この発明のドレッシングは、容易に短時間 で作製でき、容易に操作でき、かつ創傷かあるときは、直接宿主（患者）の基体 と接して、活発に成長している基底細胞をもたらす。

前記の利点に加え、この発明のシステムでは、細胞補給技術か、その技術の欠点 なしに利用できる。

１９７５年に、グリーン達は、皮膚培養の拡大のため、補給層システムとして、 マウスから採った変換細胞ライン３Ｔ３細胞の利用を提案した。３Ｔ３細胞は、 本質的に最低密度で種になれるケラチノサイトの成長という因子を合成し、かつ 皮膚細胞製造で、有害な腺維芽細胞の成長を抑止する。３Ｔ３細胞を含む皮膚細 胞の製造は、始めにγ線放射しく典型的には約６０００ラド）、細胞を殺さずに 、細胞分化を抑制する。このような細胞は数日間生存し、この間宿主ケラ千ノサ イト細胞に、材料を合成、供給する。当然、３Ｔ３細胞は皮膚細胞層に変換され る。

しかし、ある程度のマウス細胞か残り、他の宿主ケラチノサイトと繋がるのはや むえない。

本発明のドレッシングにおいては、３Ｔ３のような補給細胞か、基体の反対側で 接触して、溶媒中で種となれる。それ故、これらの細胞は宿主細胞の材料を合成 する。補給細胞は宿主細胞と接触しないので、放射線照射は必要ない。基体か培 養フラスコから除去されるとき、浮動性補給細胞を反転させるため、反対側は洗 浄される。

補給細胞層か空隙つき基体のときは、空隙は培養媒か自由に交換できるほど大き く、細胞か通過するほどには大きくない。

望ましくは、空隙大きさは、その最大径で、５μより大きくあってはならない。

好ましくは、空隙大きさは０．５−２μである。

本発明によるドレッシングシステムの実施例を添付の図を参照しながら例証する 。図１を説明すると、培養フラスコ１のひとつの壁は、連続キャリヤ一層３上で の開口フィルム２の積層物からなる。該キャリヤー１の両端はフラスコ３の他方 の壁に取りはずし可能に結合されている。培地４とドナー細胞は、注入口６から フラスコ３に導入することかでき、栓７で封入される。

細胞培養後、積層物２及び３はフラスコ１から引きはかされ除去される。シート ２に固定された細胞からなる開口ドレッシングは、キャリヤ一層３から分離され 、患者に施用される。

図２において、積層物２及び３は、複数の突起部８を育するキャリヤーＩｉ３の 上面に基体フィルム２を注型することにより形成される。注型基体１１２は、複 数の薄部９と厚部１ｏを有する。

基体をキャリヤ一層から分離する際、薄部９は図３に示すように破裂して孔１２ を形成する。

図４について説明すると、培養フラスコｌは、基体を構成する開口フィルム２に よって２つの区画すなわち２１及び３１とに分離されている。栄養培地４かフラ スコ内に注がれて両区面内を専有することとなる。皮膚細胞か、注入口６から区 画２１に接種され、一方、３Ｔ３のような供給細胞が連絡部１１から区画３１に 接種される。皮膚細胞１１の層か所定の融合度に達したのち、フラスコの壁部５ から引き離し、連絡部１３から除去される。栄養分、成長因子あるいは抗生物質 や炎症抑制剤のような薬剤を、細胞を生育する液体培地内に混合してもよい。こ のような添加成分の量及び／あるいは容量については従来から周知である。

本発明を次の実施例に基づいて例証する。この中で接触角細胞成長減少及び細胞 毒性は次のようにして測定される。

接触角の測定−表面エネルギーの測定−接触角は、接触角ゴニオメータ−を用い て次のように測定される。

各フィルム基体は、ゴニオメータ−のステージに平らに重ねられる。用いる２つ の接触溶液は、蒸留水とデカリン・グリセロール溶液である。蒸留水をマイクロ メータースクリューシリンジに入れ、−滴を測定すべきフィルム基体に接触させ る。時間を０として、ゴニオメータ−の接眼レンズ上に設置したカメラで、水滴 の形を撮影する。さらに約１０分量定期的に（１分毎に）撮影する。接触用培地 としてグリセロール・デカリン溶液を用いて同様の方法を繰り返す。

次に撮影した写真を現像する。水滴か水平面に対してなす角（両側とも）を分度 器を用いて測定する。

時間と接触角についてのグラフを描き、次式に従って時間＝０のときの接触角を 決定した。

液体の表面張力＝表面自由エネルギー（γ）表面エネルギーの総計（γ）＝γ４ ＋γｐγ１＝分散成分 子′＝極性成分 Ｌ　＊　Ｃａ５ｅ　−Ｚ［Ｌｙ’ｓ＋ｊ　（ｙ’ｔｌ　＋　（ｙｓ１４　（ｙｓ ＩＩγＩ　ＹＬ 細胞成長減少率測定方法 ヒト上皮細胞（ケラチン細胞）を基体あるいは組織培養皿に、６ウ工ル皿の場合 では１ウエル当たり８ＸＩＯ’あるいはｌ、５×ｌＯｓの濃度になるように接種 する。細胞は１０％ウシ胎児血漿を含有する適当な培地（３−）内で培養し、約 ５０％融合されるまで３７°Ｃでインキュベートする。次に培地を吸引し、細胞 を、アマ−ジャム・インターナショナル社製トリチウムチミジン０．６６Ｃｉ　 ｍｌ−’　（比活性５．　ＱＣｉｍｍｏ　ｌ−’　）を含有する培地（３−）で 再び培養する。１８時面インキュベートしたのち、再び培養する。

１８時間インキュベートしたのち、再び培地を吸引し、プレートウニルから基体 を回収する。次に該基体から余分なトリチウムチミジンを除去するためにリン酸 緩衝液で充分に洗浄する。基体を抽出し、トリクロロ酢酸不溶解沈殿物中に存在 する放射活性を液体ノンチレーンヨンカウンターを用いて測定する。結果はトリ チウムチミジン取り込み量を、基体を含まないコントロールのウェルで得られた 量とて比較しその減少率として表し１、基体上澄液の回収 各基体を血漿を含まない培地あるいはｌＯ％ウシ胎児血漿を含む培地５イを入れ た６ウ工ル培養皿に２通りに配置する。３７°Ｃで１週間インキュベートしたの ち、“基体上澄液”を回収し、使用するまで一２０°Ｃで凍結保存した。

２、細胞毒性検定 ヒト上皮細胞を９６ウ工ル培養皿にｌウェル当たり細胞か２×１０″個の密度に なるように（１００１容量）接種し、細胞か融合するまで３７℃でインキュベー トする。そして培地を吸引し、細胞に５ｌ（ｒを含有するニクロム酸ナトリウム １０Ｃ１０Ｃ１’を含む培地を添加する。さらに２４時間インキュベートした後 、培地を吸引し１．細胞をカルシウムーマグネシウムを含まないハンクス平衡食 塩水で３回洗浄し生育した細胞か取り込まなかった余分な５ＩＣｒを除去する。

各基体上澄液を、血漿を含まない培地あるいは１０％ウシ胎児血漿のいずれかが 入った４つのウェルのそれぞれに添加する。さらに１０％ウシ胎児血漿を血漿を 含有しない培地であらかじめインキュベートしておいた基質上澄液に添加する。

３７°Ｃで２４時間インキュベートしたのち、上澄液を回収し、死んだあるいは 破壊した細胞から放出された”Ｃｒをガンマカウンターで測定する。生きた細胞 からの５１Ｃｒ放出の基準量を血漿を含有しない培地及び１０％血漿を含む培地 で測定した。

一方細胞の１１Ｃｒ最犬放出量は１％ドデンル硫酸ナトリウム内で測定した。細 胞毒性率は次式によりめられる：放出量の実験値−放出量の基準値 細胞毒性率（％）＝　Ｘ１００ 最大放出量　−放出量基準値 実施例１ ヒト上皮細胞（ケラチン細胞）を２３μ厚さのメリネックスフィルム１５Ｘ１２ ０のコロナ放電処理ディスクの上で５０％融合するまで培養した。培養に先だっ てジャーマンＣトリーターを用いてフィルム基体上でコロナ放電処理を行った。

該Ｃトリーターは手動で用いて基体表面に５０ダイン／ａｎ以上放出するように 設置した。基体はＣトリーターの上面の下に置かれ処理のレベルに達するまでゆ っくりと除去された。用いた培地は分子生物学（Ｈｕｍａｎａ　Ｐｒｅｓｓ）第 ５章にあるバーロー＆パイ（１９９０）による方法に基づいている。その培地は ３つのＤＭＥＭからなる。

第１はＦ１２で１０％ウシ胎児血漿を含有する。第２はＥＧＦ（１０μｇｍ７− ’）でインシュリン（５μｇｄ−’）、ハイドロコルチゾン（０，２μｇｄ−’ ）、コレラトキシン（１０−”Ｍ）　、トランスフェリン／トリイオドチロニン （５μｇ−−リ、（２Ｘ　１０−’Ｍ）を含有する。第３は、アデニン（１，８ Ｘ　１０−’Ｍ）濃縮物である。その他にも同様に使用可能な培地かあり例えば クロ不ティクス社製のケラ千ノサイト基礎培地やフローラボラトリーズ社製のバ イオリンチ培地かあげられる。１掲の培地はいずれも血漿を含有していない。細 胞成長阻害率は２８％であった。細胞毒性率は１５μ厚さのコロナ放電処理エチ ルビニル酢酸フィルムを用いて実施例１を繰り返した。細胞成長阻害率は４１． ５％、細胞毒性率は０％だった。接触角は無処理フィルムで７８°、コロナ放電 処理フィルムでは５５．５！′だった。

実施例３ 厚さ２０μのコロナ放電処理ポリイソブタジェンフィルムを用いて実施例１を繰 り返した。細胞成長阻害率は３３％、細胞毒性率は１％だった。接触角は非処理 フィルムでは９８°、コロナ処理剤フィルムでは７９．５°だった。

実施例４ ２０μ厚今のコロナ放電処理エチルビニル酢酸と耐衝撃ポリスチレン混合物を用 いて実施例１を繰り返した。以下に示す混合物において次のような結果が得られ た。

細胞成長阻害率　細胞毒性率 ＥＶＡ（２８−０５）／ＨＩＰＳ　８０：２０　２３％　１３％ＥＶＡ５３９／ ＨＩＰＳ　９０：１０　８％２９％実施例５ ２０μ厚さのコロナ放電処理ポリプロピレンフィルムを用いて実施例１を繰り返 した。細胞成長阻害率４７％、細胞毒性率８％２０μ厚さのコロナ放電処理耐衝 撃ポリスチレンフィルム（ＳＴＹＲＯＮ）を用いて実施例１を繰り返した。細胞 成長阻害￥３２％、細胞毒性率８％だった。

実施例７ 厚さ２０μのコロナ放電処理スチレンブタジェンスチレンゴムフィルム（ＣＡＲ ［ＦＬＥＸ　１１０１）を用いて実施例１を繰り返した。細胞成長阻害率４１． ５％、細胞毒性率１％だった。

実施例８ 厚さ２０μのコロナ放電処理ポリビニリデン塩化物（ＰＶＤＣ）フィルムを用い て実施例１を繰り返した。細胞成長阻害率２７％、細胞毒性率２５％だった。

実施例９−１６ 実施例１−８を繰り返した。但し、培養に先だってフィルムは２５％の開口面積 を得るためにホットピンパーホレイシコン手法を用いて穴を設けた。開口時の細 胞消失は最少で、すべての場合で細胞の成長は良好であった。

実施例１７−２４ 創傷用ドレッシングを作製するために図１によるシステムを用いた。予め開口し たフィルムは実施例９−１６で示したものと同じものを用いた。細胞は、２０％ 融合するまでに成長させた（約２４−３６時１！ｌ’ｌ）。キャリヤー（２）及 び細胞を保持した開口基体（１）は、培養？（３）から分離され、基体はギヤリ ヤーからひきはかされる。すべての場合において細胞成長は良好で実施例＋７− ２４を繰り返した。但し、フィルムは予め開口さす代りに図２のようにＩＭの断 端を含むフラスコの底部で生型される。

培養後基体は図３のように底部から引きはかされ、開口処理を行った。すべての 場合において細胞成長は良好であった。細胞損失はわずかであった。

実施例３３ 実施例４を繰り返した。基体はＥＰ　Ｎｏ、　０１４１５９２で開示さｎた方法 に従って伸張してから開口を施した。細胞成長は良好で、開口に伴う細胞損失は 見られなかった。

実施例３４ 実施例２０を繰り返した。但し、基体に前開口処理は行なわずに実施例３３と同 様に伸張させた状態で同時に開口を実施した。

旧胞成長は良好で、開口に伴う細胞損失はみられなかった。

実施例３５ 図１１こ示したシステムを、創傷用ドレッシングを作製する１こめに用いた。用 いたネットは、ＰＣＴ　ＮＯ，ＧＢＯ９０１００３９８に開示されているものと 同様である。細胞は約２４時間成長させキャリヤー（３）と細胞を保持するネッ ト（２）は培養管（５）から分離された。次にネットをキャリヤーからひきはか した。該不ノｈ上で良好な細胞成長が観察された。

実施例３６ 実施例３５を繰り返した。但し、２枚のネットは一列に並べてひとつのネットの 開口か他方ネットの連続部と一致するように配！した。それらを次に、培養管（ ５）の底部に封入し同様に細胞培養を行った。２４時間後、培養管か２枚のネッ トを取り出して分離した。その２枚ともで細胞の成長は良好だった。その２枚の ネットを続いて患者に施用した。治癒率とホスト適合性は良好であった。

実施例３７ 実施例１及び２を繰り返した。得られたドレッシングは同時に３歳の女児のやけ どの手当に用いられた。この患者は頭部、片腕、片足及び身体の片側を包む体表 約４０％にやけどを負ったものである。副木皮膚移植（ｓｐｌｉｔ　５ｋｉｎ　 ｇｒａｆｔｉｎｇ）及び培養細胞を含んだ創傷用ドレッシングとを組み合わせて 用いながら４回にわたって移植手術を実施した。この細胞培養物はやけど患者の 前面切除時に取り出した自己生検から得られたものである。

接種濃度は当初ｄ当たり２．５ＸＩＯ’から６ＸＩＯ’細胞であった。

培養物は細胞か接種されて約８０時間後に移植された。基体フィルムはクレープ 包帯で覆われている液体パラフィンチュールグラスＪＥＬＯＮＥＴ　（商ｆｆ） からなる２次ドレッシングで覆われていた。５日後２次ドレッシングを取り除き 、基体フィルムは特に目立った接着物や残存した細胞もなく切りはなされた。そ の下の創傷は治癒していた。２タイプのドレッシング面で特に太きな差は見られ なかった。

要　約　書 適合性創傷用ドレッシングは、合成ポリマーフィルムからなり、疎水性で、細胞 発育に非阻害性でかつ非佃、ｍ毒性である基体の１つの表面に固着された培養鴫 乳動物の１からなると記載されている。

更に、足場依存性の哺乳動物の細胞を培養する基体と培地をその基体と接触して 保持する手段とからなり、その基体か合成ポリマー材の適合性フィルムであり、 疎水性で細胞生育に非阻害性でかつ非細胞毒である創傷用ドレッシングの製造用 法システムが記載されている。創傷用ドレッシングとシステムの各種具体例が記 載されている。更に、足場依存性哺乳動物細胞を生体外で培養する方法と共にこ の発明のドレッシング又はシステムを利用した創傷処置方法が記載されている。

国際調査報告 ’ｍ−＋−−−＾−＋−ｗ−ｘ＊、ＧＢ　９１　／　ＯＯ３２９国際調査報告 ＧＢ　９１００３２９ ＳＡ　４５０５９

Claims (40)

【特許請求の範囲】
1. １．合成ポリマーフィルムからなり、疎水性で、細胞発育に非阻害性でかつ非細 胞毒性である基体の１つの表面に固着された培養哺乳動物細胞の層からなる適合 性創傷用ドレッシング。
2. ２．細胞が上皮細胞である請求項１のドレッシング。
3. ３．細胞の層が半融合層である請求項１又は２によるドレッシング。
4. ４．融合度合が４０〜７０％である請求項３によるドレッシング。
5. ５．細胞の層が単層である前記請求項の何れか１つによるドレッシング。
6. ６．基体が透湿性である前記請求項の何れか１つによるドレッシング。
7. ７．基体がポリマー材の連続フィルムである前記請求項の何れが１つによるドレ ッシング。
8. ８．フィルムが開口すべく適合されている請求項７によるドレッシング。
9. ９．フィルムが、伸張で破裂して開口する弱い領域を含む請求項７によるドレッ シング。
10. １０．フィルムが開口フィルムである請求項１〜６の何れか１つによるドレッシ ング。
11. １１．基体が合成ポリマー材のネットからなる請求項１〜６の何れか１つによる ドレッシング。
12. １２．ネットが■みまたは織り布地である請求項１１によるドレッシング。
13. １３．基体がコロナ放電処理ポリマーからなる前記請求項の何れか１つによるド レッシング。
14. １４．ポリマーがニチレン−ビニルアセテートコポリマーである前記請求項の何 れか１つによるドレッシング。
15. １５．ポリマーがエチレン−ビニルアセテートコポリマーとポリスチレンとのブ レンドである請求項１４によるドレッシング。
16. １６．足場依存性の哺乳動物の細胞を培養する基体と培地をその基体と接触して 保持する手段とからなり、その基体が合成ポリマー材の適合性フィルムであり、 疎水性で、細胞生育に非阻害性でかつ非細胞毒である創傷用ドレッシングの製造 用法システム。
17. １７．基体が培地を含有さす手段の１部を形成している請求項１６によるシステ ム。
18. １８．基体が連続ポリマーフィルムからなる請求項１６又は１７によるシステム 。
19. １９．気体が開口用に適合されている請求項１８によるシステム。
20. ２０．基体が２軸延伸フィルムである請求項１９によるシステム。
21. ２１．基体が開口フィルムである請求項１６によるシステム。
22. ２２．基体が合成ポリマー材のネットからなる請求項１６による変形システム。
23. ２３．基体が、含有手段の１部を形成する液体不透過キャリヤー層に剥離可能に 支持されている請求項１７，２１又は２２によるドレッシング。
24. ２４．キャリヤー層が、複数の凸部を有し、基体が、キャリャー層の突起領域に 対応する複数の薄い領域を有する請求項２３によるシステム。
25. ２５．基体がキャリヤー層に注型される請求項２４によるシステム。
26. ２６．基体が含有手段内に配置・支持され、これによって培地を基体の反対側に 接触させる請求項１６〜２２の何れか１つによるシステム。
27. ２７．含有手段が基体の両側にアクセスする別の手段を有する請求項２６による システム。
28. ２８．基体がコロナ放電処理されている請求項１６〜２７の何れか１つによるシ ステム。
29. ２９．合成ポリマーがエチレン−ビニルアセテートコポリマーである請求項１６ 〜２８の何れか１つによるシステム。
30. ３０．ポリマーがエチレン−ビニルアセテートコポリマーとポリスチレンのブレ ンドである請求項２９によるシステム。
31. ３１．合成ポリマー材のフィルムであり、疎水性で細胞発育に非阻害性で非細胞 毒である基体に、足場依存性哺乳動物細胞からなる培地を含有させることからな る足場依存性哺乳動物細胞を生体外で培養する方法。
32. ３２．基体が連続フィルムである請求項３１による方法。
33. ３３．基体が開口用に適合されている請求項３１又は３２による方法。
34. ３４．基体が開口フィルムである請求項３１による方法。
35. ３５．基体が合成ポリマー材のネットからなる請求項３１又は３４による変形方 法。
36. ３６．基体がコロナ放電処理ポリマー材である請求項３１〜３５の何れか１つに よる方法。
37. ３７．合成ポリマー材がエチレン−ビニルアセトートコポリマーである請求項３ １〜３６の何れか１つによる方法。
38. ３８．合成ポリマー材がエチレン−ビニルアセトートコポリマーとポリスチレン のブレンドである請求項３７による方法。
39. ３９．基体に、足場依存性哺乳動物細胞を含有する培養物を接触させて、基板に 定着した細胞層を形成させてドレッシングを適用し、その際の基体が合成ポリマ ー材のフィルムであって疎水性で、細胞生育に非阻害性で非細胞毒であることか らなる創傷の治療法。
40. ４０．ドレッシングが、請求項１６〜３０の何れか１つに記載のシステム、又は 請求項３１〜３８の何れか１つにクレームした方法で作られる請求項３９による 方法。