JP2000500120A

JP2000500120A - ポリ（エチレングリコール）と抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の結合体の膵島細胞指向ターゲット化

Info

Publication number: JP2000500120A
Application number: JP9512964A
Authority: JP
Inventors: ジェイコブズ，ハーベイ; キム，サン・ワン; メナード，バージニー
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・ユタ・リサーチ・ファウンデーション
Priority date: 1995-09-21
Filing date: 1996-09-20
Publication date: 2000-01-11
Also published as: AU7369096A; WO1997010847A1; KR19990063648A; CA2232834A1; EP0869815A1; US5853723A; US20010010820A1

Abstract

(57)【要約】インスリン依存型糖尿病（ＩＤＤＭ）の発生する素因をもったヒトにおいて、ＩＤＤＭの開始を遅延するための方法を開示する。この方法は、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（ＧＡＤ）に対するモノクローナル抗体またはその断片、およびそれに結合してそのモノクローナル抗体の周囲にその免疫認識を阻害するための水和性殻を提供する非免疫原性親水性ポリマーから成る組成物を投与することを含む。ポリ（エチレングリコール）が好ましいポリマーである。ＩＤＤＭの患者においてインスリン症（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）を軽減する方法およびそのための組成物についても記載する。

Description

【発明の詳細な説明】ポリ（エチレングリコール）と抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体の結合体の膵島細胞指向ターゲット化関連出願の相互参照本出願は1995年９月21日出願の米国仮出願第60/004109号の利益を主張する。発明の背景本発明はインスリン依存型糖尿病（IDDM）の治療方法に関する。より詳細には、本発明は修飾した抗グルタミン酸デカルボキシラーゼ抗体を必要とする個体にこれを含む組成物を全身投与することによりIDDMの発症を遅延させる方法に関する。膵臓は、十二指腸に消化液を分泌する腺房と血液中にインスリンとグルカゴンを分泌するランゲルハンス島細胞との二大組織から成る。インスリンは余剰エネルギー源を貯蔵する役目を果たす。例えばインスリンは（ａ）筋肉及び肝臓中のグリコーゲンの形での炭水化物の貯蔵、（ｂ）脂肪組織での脂肪の貯蔵、（ｃ）細胞内タンパク質としてのアミノ酸の取り込みと貯蔵などを促進する。しかしながら、インスリンの主な役割は、筋肉細胞への取り込みを促進することを通じて血中グルコースの恒常性を調節することにある。約100ｍｇ／ｄｌの正常な血中グルコース濃度では、インスリンの分泌速度は約25ｎｇ／分／ｋｇである。食後にグルコース濃度が上昇すると、グルコースがβ細胞受容体を刺激してインスリンを分泌させる結果、分泌速度は基底速度の10〜25倍に上昇する。いったん血中グルコース濃度が低下すると、β細胞はインスリンの産生を急速に停止して基底レベルに戻らせる。インスリン依存型糖尿病（Ｉ型、IDDM）はβ細胞によるインスリン分泌の減少に起因する。糖尿病は様々な段階の疾患進行、即ち不可避的な遺伝的素因とその後の促進事象、即ち遺伝的変異または環境的な傷害の原因を含む過程であり、それらは全て膵島細胞／β細胞の自己免疫性の破壊に導く。糖尿病の発症の数年前に及んで70％を超える病状発現前のIDDM患者に膵島細胞／β細胞の抗原に対する血中抗体が見られることが示されている(例えばI．Deschampsの論文「膵島細胞抗体及びＨＬＡマーカーによる家族（siblings）における１型（インスリン依存型）糖尿病のリスクの生命統計表解析」35 Diabetologia 951-57(1992年) )。 IDDMはβ細胞の細胞免疫性破壊を特徴とし、結果としてインスリン分泌欠如をおこし、そしてこの疾患の重度の病因となる(例えばL．C．Harrison等の論文「膵島細胞反応性Ｔ細胞は病状発現前のインスリン依存型糖尿病のマーカーである」89 J．Clin．Invest．1161-65(1992年))。遺伝的素因(例えばI．Deschamps，3 5 Diabetologia，951-57(前掲))、静脈間グルコース耐容性（ＩＶＧＴ）、及び抗体の存在（T．J．Wilkin等「自己免疫性糖尿病及び疾患の細菌説」35 Diabeto logia 187-89(1992年)）などを含む様々なパラメータが糖尿病の進行における原因因子として示されてきた。自己免疫疾患としての糖尿病の進行に抗体が寄与していることは多くの研究者が明らかにしている。インスリン、インスリン受容体、膵島細胞表面抗原、カルボキシペプチダーゼＨに対する抗体を含む、病状発現前の抗体マーカーのいくつかが単離、確認され、IDDMとの相関が調べられた。統計的検討（例えばU．Roll 等「一親等のＩ型糖尿病患者における抗GAD市抗体と膵島細胞抗体及びインスリン自己抗体との関連」43 Diabetes 154-60(1994年)）により、特にインスリン抗体（ＩＡＡ）と膵島細胞抗体（ＩＣＡ）に関連した抗体の発現パターンは糖尿病の発症と高い相関があることが示される。ＩＡＡとＩＣＡの両方に対する抗体が検出される患者は６年以内に糖尿病が進行する確率が90％を超える。糖尿病前の抗体の原因的性質の内では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GA D）に対するＩＣＡサブセットを特定することが特に重要である。抗GAD抗体はＩＣＡ及びＩＡＡの抗体価を示す血族の約70％に存在することが明らかにされた( 例えばU．Roll等(前掲))。この個体群のうち、患者の約66％でなおも糖尿病が進行する。さらに、GADの持続注入を通じて若いマウスの免疫系に抗GAD抗体に対する寛容性を生じさせ、IDDMが進行しないようにしうることが研究によって立証された(P．Z．Zimmet等「成人における潜在的自己免疫性糖尿病（ＬＡＤＡ）：インスリン依存の診断と予測におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体の役割」11 Diabetic Medicine 299-303(1994年))。この方法では、酵素GADは異種タンパク質としては認識されない。従って、自己免疫性の認識は起きず、β 細胞の破壊はなく、正常血糖が示される。自己免疫反応の初期段階は非特異的認識、食作用および、抗原提示細胞(ＡＰＣ)、即ちランゲルハンス細胞（皮膚）、樹状細胞（脾臓、リンパ節）、単球（血液）による外来抗原であるタンパク質又はその他の分子のプロセシングである。食作用の後、部分分解された抗原断片は主要組織適合複合体クラスＩＩ（ＭＨＣＩＩ）として知られている細胞表面の糖タンパク質に運ばれる。Ｂ細胞も特異抗原の同化、プロセシングを行なう。ＡＰＣと同様に、抗原はＢ細胞表面の抗体と結合し、同化され、プロセシングされ、ＭＨＣＩＩタンパク質により発現される。プロセシングされた抗原はヘルパーＴ細胞のＣＤ４Ｔ細胞受容体を通じてヘルパーＴ細胞により認識される。Ｂ細胞が主要な抗体分泌細胞であるため、ヘルパーＴ細胞の接触を介したＢ細胞の認識、相互作用、細胞増殖は強い免疫反応に必須である。Ｂ記憶細胞には可溶性抗体が存在しない、表面に結合した特異抗原受容体を保持している。後の抗原曝露に反応するため、これらの長命細胞が用意されている(D.P．Stites等「免疫学の基礎と臨床」(1987年)、E．Harlow & D．L ane「抗体：研究室マニュアル」(1988年))。ＣＤ８細胞傷害性Ｔ細胞受容体は抗原エピトープとヘルパーＴ細胞の表面受容体の両方を認識する(例えばB.J．Brad1ey等「ＣＤ８Ｔ細胞はＣＤ４膵島特異性Ｔ細胞クローンにより誘導される膵島破壊に必要とされない」41 Diabetes 1603 -08(1992年))。細胞傷害性Ｔ細胞による抗原感作細胞の浸潤、相互作用、融合及び溶解こそが、細胞破壊をもたらす。これに加え、抗原感作細胞の破壊は体液性免疫プロセスを通じて起こりうる。簡単にいうと、抗原と結合したIgG抗体はそのFc断片を通して補体結合経路を活性化し、それによって細胞死がもたらされる (D.P．Stites等「免疫学の基礎と臨床」(1987年))。膵島細胞／β細胞抗原に対する血中抗体（膵島細胞抗体(ＩＣＡ)）はG.F．Bot azzo等（「自己免疫性多腺性内分泌不全を伴う糖尿病における膵島細胞抗体」Lanc et 1279-83(1974年)）により初めて観察された。これに関連する抗原の特定及び細胞上の局在は依然として知られていない。初期の研究はＩＣＡ標的（抗原）がガングリオシドの生化学的特性を有することを提唱した(F．Dotta等「非肥満型糖尿病マウスにおける膵島ガングリオシドの発現−C57Bl/10マウスとの比較および自己免疫性B細胞破壊後の変化」130 Endocrinology 37-42(1992年))。ＩＣＡは蛍光抗体法により視覚化しうる。即ち、新たに診断されたIDDM患者の血清を凍結糖尿病膵臓細胞と共にインキュベートした後、蛍光標識二次抗体を用いて膵島ＩＣＡを視覚化しうる(例えば第４回糖尿病血清交換の免疫学国際研究会におけるC．J．Greenbaum等の発表「ＩＣΛアッセイの特異性改善」41 Diab etes 1570-74(1992年)、第５回インスリン自己抗体（ＩＡＡ）標準化のための血清交換国際研究会におけるC.J．Greenbaum等の発表35 Diabetologia 798-800（1 992年）など)。この方法はＩＣＡを抗体の一群として特定するが、膵島細胞又は β細胞の特異性は識別しない。抗体の一群としては、ＩＣＡ抗体は平均的な母集団には極めて低レベルで検出されたが(M．Landin-Olsson等「新たに診断された糖尿病患児及び対応させた対照小児の母集団に基づく研究における１型（インスリン依存型）糖尿病に対する膵島細胞及びインスリン自己抗体の予測値」35 Dia betologia 1068-73(1992年)、C．Levy-Marshal等「正常なフランスの学童における膵島細胞抗体」35 Diabetologia 577-82(1992年))、高い抗体価からは進行性I DDMの可能性が高いことが予測される(例えばA．Gottsater等「成人年齢で糖尿病と診断された患者において診断後の10年間の膵島細胞抗体及び空腹時血漿Ｃペプチド」5 Diab．Nutr．Metab．243-48（1992年）など)。さらに、ＩＣＡと主要組織適合複合体（ＭＨＣ：ＤＲ３＋ＤＲ４＋）の遺伝的特性が関連すると、結果として進行性IDDMになる確率が84％となる(I．Deschamps，35 Diabetologia 951-5 7(前掲))。最近の研究では、グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）として知られているβ細胞抗体に対する抗体が確認された(例えばM．R．Christie等「１型糖尿病患者由来血清中抗体のラット組織由来グルタミン酸デカルボキシラーゼとの結合 −酵素の抗原型及び非抗原型についての証拠」35 Diabetologia 380-84(1992年) 、M.R．Christie等「IDDM進行の明瞭なマーカーとしてのGADに対する抗体及び膵島64K抗原のトリプシン消化断片−１卵性双生児における研究」41 Diabetes 782 -87（1992年）など)。GADは神経伝達物質であるＧＡＢＡの生成と関連する酵素である(H．J．DeAizpurua及びL．C．Harrison「インスリン依存型糖尿病におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼ」8 Diabetes/Metabolism Reviews 133-47(1 992年))。GADは分子量が約64,000であり、GAD−６５やGAD−６７などの様々な異性体の形で存在することが明らかにされた。GAD−６７エピトープに対する血中抗体はスティッフマン症候群にも発見された(E．Bjork等「IDDM、スティッフマン症候群、及び自己免疫多腺性内分泌症候群Ｉ型における GAD自己抗体は異なるエヒトープを認識する」43 Diabetes 161-65(1994年))。 IDDMの場合、抗GAD抗体が塘尿病進行の有意な予測因子として認識されつつあり、抗GAD抗体を作る患者の60〜70％で糖尿病が進行しうる(例えばC.H. Thivole t等「グルタミン酸デカルボキシラーゼ（GAD）自己抗体はハイリスク個体における１型(インスリン依存型)糖尿病のもう一つの予測マーカーである」35 Diabeto logia 570-76(1992年))。ＩＣＡ同様、抗GAD抗体の存在はＭＨＣの遺伝的特性と関連し、それによってIDDMである確率が高くなる(S.W．Serjeantson等「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する抗体は１型（インスリン依存型）糖尿病のオーストラリア人とアジア人の両方でＨＬＡ−ＤＲ遺伝子型と関連する」35 Diabe tologia 996-1001(1992年))。抗GAD抗体の存在がＴ細胞の活性化及びインスリン症（insulitis）の進行と相関することを他の研究者が明らかにした(R．Tisch等「グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫反応は非肥満型糖尿病マウスのインスリン症と相関する」366 Nature 72-75(1993年))。関係のある別の研究において、GADを若齢（前糖尿病）NODマウスに注入し、そしてGADがＴ細胞のβ細胞抗原に対する反応性の進展を阻害し、それによってインスリン症と糖尿病が予防されることが見いだされた(D.L．Kaufman等「マウスのインスリン依存型糖尿病におけるグルタミン酸デカルボキシラーゼに対するＴ細胞耐容性の自然喪失」 344 Nature 69-72(1993年))。前糖尿病患者及び糖尿病患者の血清中に他の種類の抗体が見いだされた。診断に最も重要な抗体はＩＣＡ抗体である。しかし、重要性はまだ定まっていないものではあるが、他の種類の抗体が数多く研究されている。インスリン治療の前に前糖尿病患者の血清中にインスリン自己抗体が見られることは、糖尿病の進行度と相関がある。ＩＣＡ抗体と同様に国際研究会でＩＡＡ抗体価が標準化された(C .J．Greenbaum等、35 Diabetologia 798-800(前掲))。一方、インスリン受容体と関連のある特定遺伝子のトランスフェクションにより、NODマウスに糖尿病を誘発することができる(例えばM.A．Lipes等「トランスジェニックＴ細胞受容体をもつ非肥満型糖尿病（NOD）マウスにおける糖尿病への進行」259 Science 116 5-69(1993年))。これらの抗体はいくつかの研究で報告されているが、その役割と重要性は明らかにされていない(例えばC.R，Kohn及びG．Weiz編「Josli n's Diabetes Mellitus」216-39（13版、1994年）収載のG.S．Eisenbarth等「インスリン依存型（Ｉ型）糖尿病の病因」など)。研究の中には膵島細胞表面抗体の役割を検討したものもあるが、これら抗体の測定が困難であることと前糖尿病患者に存在するという真の証拠が無いことから、糖尿病発症を推定するためのツールとするのは難しい(例えばM．Vives等「IDDMにおける膵島細胞膜に対する自己抗体の再評価−ヒト膵島細胞を基質とした膵島細胞表面抗体検出の失敗」41 D iabetes 1624-31（1992年）など)。最後に、糖尿病が進行しうる前糖尿病患者の 30％にカルボキシペプチダーゼＨ（ＣＰＨ）が見いだされた(Joslin's Diabetes Mellitus 216-39収載のG.S．Eisenbarth等(前掲))。これらの統計とこのＣＰＨ抗体の現在の知見から、これらの自己抗体を抗GAD抗体及びICA抗体に比較されるマーカーとして評価することが可能である。現在認められている唯一のIDDM治療法は外来性のインスリンを毎日投与することである(例えばR.B．Tattersall及びE．Gale「血中グルコースの自己モニタリングと従来のインスリン治療法の改良」70 Am．J．Med．177-80(1981年)など)。その他の実験プロトコルとしては、血中グルコースに応じてインスリンを送達するコンピュータ制御注入ポンプ(例えばF.J．Fogt等「グルコース制御インスリン注入システム（Biostator）用グルコース分析装置の開発と評価」24Clin．Chem ．1366-81（1978年）など)、コンカナバリンＡ−グリコシル化インスリンによるバイオフィードバック機構(例えばS.W．Kim等「自己調節インスリン送達系」Exc erpta Medica 25-32（1990年）など)、グルコースオキシダーゼを利用したインスリン送達装置（K．Ishihara等「固定化グルコースオキシダーゼ及びポリ（アミン）から成る複合膜を介したグルコース誘発性浸透」16 Polymer J．625-42(1 984年)）などが含まれる。これらの治療法では、β細胞機能がそれ以前に全て破壊されているため、外来性のインスリンを投与しなければならない。IDDM治療の別のアプローチは、機能性の膵島細胞／β細胞を糖尿病患者に移植することである(例えばE．Reich等「自己反応性Ｔリンパ球の注入によるNODマウスにおける糖尿病の予防」38 Diabetes 1647-51（1989年）など)。理論上、このアプローチは患者に正常血糖をもたらす。しかしながら、通常、膵島細胞は異種由来であり、移植関連の拒絶反応が見られる場合が多い(例えばR.P. Lanza等「免疫抑制を行なっていない糖尿病ラットにおけるイヌ、ウシ及びブタ膵島の異種移植」88 Proc．Nat'l Acad．Sci．USA 11100-03（1991年）など)。糖尿病の進行を予防又は遅延させるための別のアプローチがある。いくつかの研究では、IDDMマーカー（遺伝マーカー、ＩＣＡ、ＩＡＡ、GAD）の検出後に免疫抑制治療が開始された(例えばP.J．Bingley等「IDDMは本当に予測できるか」4 2 Diabetes 213-20（1993年）など)。コルチコステロイド、アザチオプリン、サイクロスポリンＡなどの免疫抑制因子を用いて糖尿病の治療が行なわれた(例えばA．Lernmark「免疫介入は良いが、何のために、誰に、いつ、どうやって行なうか」35 Diabetologia 1096-98（1992年）など)。β細胞がすべて破壊される前に投与したところ、これらの試薬は細胞の免疫活性を特異的に阻害した。β細胞はそれ以上の破壊から守られ、生細胞の再生と正常血糖への一時回復が可能となった(例えばG.S．Eisenbarth編「糖尿病および選択された自己免疫疾患の免疫療法」111-23（1989年）に収載のH．Kolb等「Ｉ型糖尿病における免疫調節薬」)。しかしながら、これらの薬剤の副作用は、特に糖尿病の小児においては、有用性に対して強すぎた(A．Lernmark，35 Diabetologia 1096-98(前掲))。免疫治療的アプローチから、Ｔ細胞上の活性受容体をモノクローナル抗体で遮断することにより顕性早期糖尿病の治療が行なわれた。このような研究の一つでは、抗リンパ球血清（ＡＬＳ）及びＣＤ４及びＣＤ８Ｔ細胞受容体に対する抗体がマウスに投与された(T．Maki等「抗リンパ球血清を使用した免疫療法による非肥満型糖尿病マウスにおける自己免疫性糖尿病の長期排除」89 Proc．Nat'l Ac ad．Sci USA 3434-38(1992年))。この研究では、発症後14日以内にＡＬＳ又は抗ＣＤ４及び抗ＣＤ８治療を施した結果、寛解率（正常血糖）はそれぞれ75％及び 65％であった。正常血糖は治療後30日以内に出現し、約200日間持続した。糖尿病の自己免疫に関していくつかの重大な点が観察された。リンパ球性抗体は免疫反応の終結に寄与し、それにより膵島の回復が可能になった。また、発症14日後以前に抗体治療を開始したところ、再生して正常血糖状態に回復しうるのに十分な数の生きた膵島が存在した。残念ながら、この方法によると重症の免疫力の低下した患者になる可能性があり、ヒトへの適用に実用的ではない可能性がある。同様に、抗ＣＤ３をNODマウスに注入しても糖尿病を予防しうることを他の研究が立証している。上記を考慮すれば、IDDMの素因のある個体においてIDDMの発症を遅延させる方法を提供することは、当技術分野における重要な進歩であると理解されよう。発明の概要本発明の目的は、インスリン依存型糖尿病（IDDM）の治療する方法を提供することである。また、本発明の目的は、IDDMが発現する素因のある人においてIDDMの発症を遅延させる方法を提供することである。本発明の他の目的は、IDDMが発現する素因のある人に修飾した抗GAD抗体を投与することによりIDDMを治療し、かつその発症を遅延させる方法を提供することである。さらに、本発明の目的は、IDDMが発現する素因のある人にIDDMの発症を遅延させるために投与する組成物を提供することである。上記及びその他の目的は、（ａ）免疫学的に活性な抗グルタミン酸デカルボキシラーゼモノクローナル抗体又はその断片であって（ｂ）このモノクローナル抗体又はその断片の周囲にそれらの免疫的認識を阻害する水和性殻を提供する非免疫原性親水性ポリマーと結合したものを含む有効量の組成物を、この疾患が進行する素因を有する個体に投与する段階を含む、そのヒトにおけるインスリン依存型糖尿病の発症を遅延させる方法を提供することにより達成する事ができる。このポリマーはポリ（エチレングリコール）であることが好ましく、分子量が約200〜8,000であることがより好ましいが、より高分子量のポリマー、分枝状ポリマー、星型分子、PEGブロック共重合体も本発明の範囲内にある。メトキシ−P EGは特に好ましいポリマーである。また、モノクローナル抗体又はその断片がF( ab')断片であることも好ましい。モノクローナル抗体又はその断片はグルタミン酸デカルボキシラーゼのGAD−６５異性体に対するものであることが好ましい。好ましい一実施態様では、モノクローナル抗体及びポリマーは架橋剤により互いに共有結合している。インスリン依存型糖尿病が発現する素因のある個体のβ細胞におけるインスリン症を軽減する方法は（ａ）免疫学的に活性な抗グルタミン酸デカルボキシラーゼモノクローナル抗体又はその断片であって（ｂ）このモノクローナル抗体又はその断片の周囲にそれらの免疫的認識を阻害する水和性殼を提供する非免疫原性親水性ポリマーと結合したものを含む有効量の組成物を該個体に投与する段階を含む。インスリン依存型糖尿病が発現する素因のある個体においてインスリン依存型塘尿病の発症を遅延させる組成物は（ａ）免疫学的に活性な抗グルタミン酸デカルボキシラーゼモノクローナル抗体又はその断片であって（ｂ）このモノクローナル抗体又はその断片の周囲にそれらの免疫的認識を阻害する水和性殻を提供する非免疫原性親水性ポリマーと結合したものを含む。図面の簡単な説明図１は、ヘテロ２官能架橋剤によりメトキシ−PEG−アミンをF(ab')断片と結合させるための反応を示す。図２は、ヘテロ２官能架橋剤によりジアミノPEGをF(ab')断片と結合させ、PEG 成分をBolton-Hunter試薬やイソチオシアン酸フルオレヤインなどの標識Ｒで標識するための反応を示す。図３は、週あたり0.3ｍｇの抗GADモノクローナル抗体(●)、0.1ｍｇの抗GADモノクローナル抗体(○)を注入したNODマウス、或いは注入しなかったNODマウス( □)について糖尿病の発現率を時間の関数としたプロットを示す。図４は、週あたり0.3ｍｇの抗GADモノクローナル抗体（斜線つき）、0.1ｍｇの抗GADモノクローナル抗体（影つき）を注入したNODマウス、或いは注入しなかったNODマウス（影なし）について相対膵島インスリン症スコアを表す膵島の百分率のヒストグラムを示す。図５は、種々のモノクローナル抗体濃度での抗GADモノクローナル抗体（影なし）及びポリクローナルマウスIgG（影つき）による脾細胞のインビトロ活性化のヒストグラムを示す。発明の詳細な説明 IDDMの治療、特にその発症の遅延のための本方法を開示及び説明する前に、構成、工程段階、材料は幾分か異なってもよいものであることから、本明細書中に開示した特定の構成、工程段階、材料に限定されないと理解すべきである。また本明細書中に用いた用語は、特定の実施態様を説明する目的にのみ使用されるものであって、本発明の範囲は添付の請求の範囲及びその等価物によってのみ限定されるものであるために、限定しようとするものではないと理解すべきである。本明細書及び添付の請求の範囲中に用いたように単数形「a」、「an」、「the」は、文脈に明らかに特別な指示が無い限り、複数の指示対象を含むことに注意しなければならない。従って、例えば「″an antibody''(抗体)」を含む組成物についての言及は、複数のこのような抗体についての言及を含み、「″apolymer″(ポリマー)」についての言及は、複数のこのようなポリマーについての言及を含む。本発明を説明、請求するにおいて、次の用語は下記の定義に従って使用しうる。本明細書中に使用した「有効量」は、あらゆる治療に伴って選択された効果及び性能を妥当な損益比で提供する本請求の範囲の組成物の量を意味する。本明細書中に提供した手引きは、当業者が必要以上の実験を行なうことなく適正薬用量を決定しうるのに十分である。本明細書中に使用した「投与する」及び類似の語は、組成物が全身を循環して組成物の抗体部分がその同種抗原、例えば膵島細胞と結合しうる個体の場所に到達することができるように、組成物を治療対照の個体に送達する意味である。従って、この組成物は、典型的な場合では皮下、筋肉内又は静脈内投与、若しくは腹腔内投与による、全身投与によりこの個体に投与することが好ましい。このような使用のための注射剤は、液体溶液、懸濁液、注射前に液体の溶液又は懸濁液とするのに適した固体、或いは乳液等のいずれかの従来の剤形としても調製しうる。適当な賦形剤としては、例えば水、塩類溶液、グリセロール、エタノール等があり、望むならば湿潤剤又は乳化剤、緩衝剤等の少量の補助剤を添加しうる。本明細書中に使用したIDDMの「発症を遅延させる」及び類似の語は、IDDMの素因のある個体がこの疾患の臨床症状を表す日付を遅らせる意味であり、IDDMを十分に進展しない程度に遅延させることを含む。本明細書中に使用した「ポリ(エチレングリコール)」、「PEG」及び類似の語は、ポリ（エチレングリコール）及びその様々な誘導体（メトキシ−PEG−アミン、ジアミンPEG等）の意味である。好ましいポリ（エチレングリコール）は分子量約200〜8,000のポリマーを含むが、それより高分子量のポリマーも本発明の範囲内にある。PEGは直鎖状ポリマー及び分枝状ポリマー、星形分子、及び少なくとも二種類のPEGポリマーをカップリングしてより高分子量のポリマーとしたP EGブロック共重合体を含む。本発明では、抗GADモノクローナル抗体（Ｍａｂ）を修飾してＭａｂの同種抗原との結合を維持させる一方で、この免疫系の他の側面による認識を阻害させる。一実施態様では、抗GAD抗体をプロテアーゼによる消化と還元剤による化学的還元とにより修飾してF(ab')断片が得られ、次いでこの断片を種々のポリ（エチレングリコール）ポリマー（PEG）と結合させる。F(ab')断片は抗原特異性Fab結合断片を保持するが、免疫及び補体活性化Fc断片は取り去られる。その上、ポリ（エチレングリコール）成分はタンパク質と細胞の相互作用を妨げる拡大された水和性殼と動的な可動性をもたらす。従って、本抗GAD−F(ab')−PEG組成物は同時にGADと結合し、かつ免疫系によるそれ以上の認識を阻害する。現代の免疫技術は抗原特異性Ｍａｂの生合成、単離、精製をありふれた実験法にした(E．Harlow及びD．Lane著「抗体：研究室マニュアル」(1988年)、参照文献として本明細書中に引用する)。動物を特異性抗原で免疫処理して、高い血漿中力価の選択された抗原を生じさせる。同時に、特異性抗原を合成する、初回抗原刺激を受けたＢ細胞を作成する。次いで初回抗原刺激を受けたＢ細胞（血漿細胞）を骨髄腫細胞株と融合して大量の抗体を産生させる。細胞スクリーニング法を通してこの融合細胞を所望の特異性Ｍａｂについて選択することができ、細胞培養中又は宿主動物に注入後のいずれかで特異性Ｍａｂが作成される。当技術分野で周知のように、IgGクラスの抗体は２価の分子である。いわゆるF ab部分が抗原と結合し、Fc部分が補体系タンパク質と、或いはＴ細胞やマクロファージなどのその他の免疫関連細胞と結合することができ、それによってもう一つの抗原様成分を誘発する。しかしながら、無傷のIgG分子は再現性良くパパインにより消化されて単一Fab断片を生成し、或いはペプシンによりF(ab')2断片が得られ、その両方ともFcドメインが欠損している。ペプシン消化はF(ab')2断片をジスルフィドヒンジ領域の下で切断する。従って、F(ab')2断片のヒンジ領域間のジスルフィドを化学的に還元すると二個のF(ab')断片が得られ、各々に未結合の反応性スルフヒドリル基が備わっている。抗原結合領域はF(ab)ドメインのＶ（可変）領域と関連するため、F(ab')断片は無傷のIgG分子と同じ抗原結合特性を維持する。このようなF(ab')断片は、その後の蛍光標識、抗癌薬、ポリマー等との共有化学結合の形成に未結合スルフヒドリル基を利用できるので、有利である。さらに、Ｍａｂとその断片は標的化薬物送達に使用されてきた(P．Tyle及びB. P．Ram編「標的化治療システム」3-24（1990年）収載のP．Tyler及びB.P．Ram「標的化治療システムとしてのモノクローナル抗体、免疫結合体及びリポソーム」) 。実験動物及びヒトに投与した抗体は腫瘍細胞の表面にある細胞表面抗原に対して標的化される。Ｍａｂは代謝活動に関与するこれらの表面受容体を通して、或いはシグナリング系を通して腫瘍細胞を破壊しうる。増強された抗腫瘍剤の治療活性は細胞毒性薬剤がＭａｂと結合して薬剤を腫瘍塊に対して直接指向させることにより達成される(P．Tyle及びB.P．Ram編「標的化治療システム」189-215(19 90年)収載のS．Ramakrishnan「腫瘍治療用抗体一毒素結合体の現状」)。また、Ｍａｂ−F(ab')断片と結合したリポソームも抗腫瘍治療に使用される。このリポソームはＭａｂ／Fab')断片の標的化又は帰巣性を通じて腫瘍塊近傍に沈着、蓄積しうる薬剤保有体として作用する。従って、Ｍａｂは、Ｍａｂが選択された標的抗原と結合若しくはそれに蓄積するように個体に投与しうる。特定のβ細胞抗原に対するＭａｂ、即ちGADは、当技術分野で周知の方法に従って調製できる(G．Kohler及びC．Milstein「特異性をあらかじめ定めた抗体を分泌する融合細胞の連続培養」256 Nature 495-97(1975年)、Wunderlich等、17 Eur．J．Cancer Clin，Oncol．719(1981年)、Schlom等、77 Proc，Nat'I Acad． Sci．USA 6841(1980年)、E．Harlow及びO．Lane「Antibodies:A Laboratory Man ual」(1988年)、参照により本明細書の一部とする。抗GAD−IgGを生成する融合細胞株もＡＴＣＣから得られる(受入れ番号HB184)。 GADに対して作成されたＭａｂは、当技術分野で周知の方法に従って消化してF (ab')断片が得られる(J．Rousseaux等「種々のラットIgGサブクラスの単クローンIgGからのタンパク質分解断片調製の至適条件」121 Meth．Enzymol．663-69(1 986年)、S.I．Wie等、「ウシ初乳IgG¹のタンパク質分解断片の特性決定」121 J ．Immunol．98-104(1978年)、参照により本明細書の一部とする)。F(ab')断片の免疫活性をさらに増強するため、ポリ(エチレングリコール)(PEG)をF(ab')分子と結合させる。PEGは広範囲の分子量のものが利用できる直鎖状又は分枝状の中性ポリマーであり、水及びほとんどの有機溶媒に溶ける。PEGは、主に高度に動的な鎖の可動性と疎水性を通して、それが存在する場所からその他のポリマーやペプチドを排除するのに有効であり、他のタンパク質又はポリマーの表面に付着すると、それにより水殻又は水和性殻が生成する。PEGは無毒、非免疫原性であり、米国食品薬品局により体内摂取が認められている。 PEGと結合したポリマー、タンパク質、酵素は、動物に投与すると生物活性、非抗原性、及び低いクリアランス率を示した(J.M．Harris編「Poly（Ethylene G lycol）Chemistry--Biotechnical and Biomedical Applications」127-36（1992 年）収載のF．M．Veronese等「治療用モノメトキシボリ（エチレングリコール）修飾酵素の調製及び特性」)。これは免疫系による認識を阻害するPEGの排除性による。さらに、PEGはタンパク質吸着を軽減して血液の適合性を向上させる表面修飾法に広く用いられる(S.W．Kim等「抗血栓性生物活性表面」516 Ann．N.Y．A cad．Sci．116-30(1987年)、H．Jacobs等「血液適合性改善のための表面修飾」1 2 Artif．Organs 500-01(1983年)、K.D．Park等「ＳＰＵＵ−ＰＥＯ−ヘパリングラフト共重合体の合成及び特性決定」J．Poly．Sci，Part A 1725-31(1991年) 。ポリウレタンやポリスチレンなどの疎水性ボリマーの表面がPEG（分子量3,400 ）のグラフトにより修飾され、抗血栓性表面として用いられた。これらの研究では、PEGの水和作用により表面特性（接触角）が疎水表面よりもばらつきがなかった。さらに重要なのは、高度の鎖の可動性、水和性殻、及びPEGのタンパク質排除性からタンパク質（アルブミンその他の血漿タンパク質）吸着が大きく軽減したことである。表面固定化の研究において分子量3,400のPEGが至適サイズと決定され(K.D. Pa rk等「ＳＰＵＵ−ＰＥＯ−ヘパリングラフト共重合体の血液適合性」26 J．Biom ed．Mat．Res．739-45(1992年)、一方で分子量5,000のPEGがタンパク質の抗原性を低減するのに最も有益であった(J.M Harris編「Poly(ethylene G1ycol)Chemist ry--Biotechnical and Biomedical Applications 127-36（前掲）収載のF.M．Ve ronese等の章)。実施例１細胞培養液からの抗体の精製抗GAD-IgG(IgG1),ATCC番号HB184を生産するハイブリドーマ細胞系列を凍結させて保存した（-20℃）。凍らせた細胞溶液を溶解して、4.5g/lグルコースおよび10％胎児ウシ血清（Hyclone,ローガン、ユタ州）を含む90% Dulbeccoの改変イーグル培地を含む組織培養フラスコに懸濁した。細胞密度を1mlあたり10⁵から10⁶ 細胞となるように、培地を2-3日ごとに新鮮な培地で希釈して取り替えた。コロニーは37℃、6.5% CO₂雰囲気で維持した。細胞懸濁液の抗GAD-IgGを分泌する能力は、ELISAを使用して継続的にモニターした。この測定において、GAD（Sigma Chemical Co.,セントルイス、ミズーリ州）をコート緩衝液（50mMリン酸ナトリウム、1.2M塩化ナトリウム,pH 7.5）に溶解し、溶液（0.5mg/ml）をマイクロプレートのウェルに移して（50μl/ウェル）、37℃で1時間インキュベートした。ウェルを200μlのブロッキング緩衝液(10mM Tris，1mM EDTA，150mM NaCl,0.02% Tween 20，1%ウシ血清アルブミン，pH7.3) で洗浄し、それから37℃で1時間250μlのブロッキング緩衝液中でインキュベートした。インキュベートした後、ブロッキング緩衝液を除去してマイクロプレートを乾燥させた。抗GAD（IgG，F(ab')、またはF(ab')-PEG）を含む試料の倍数希釈系列（50μl）（クロマトグラフィーを行った画分の血清または希釈）をウェルに入れて37℃で2時間インキュベートし、それから洗浄緩衝液（BSAの含まれないブロッキング緩衝液）で3回洗浄した。ブロッキング緩衝液中で1/200の濃度のアルカリホスファターゼに結合しているウサギの抗IgG1マウス免疫グロブリンを、すべてのウェルに添加し、37℃で2時間インキュベートし、それから洗浄緩衝液で3回洗浄した。それからウェルを、1Mジエチルエタノールアミンに1mg/mlのp -ニトロフェノールホスフェートが発色剤として溶解している溶液で室温で40分間インキュベートした。それからマイクロプレート自動読み取り器（EL311，Bio -Tek Instruments）を使用して405nmの吸光度を決定した。これらの値は抗GAD抗体の濃度を推定するために既知の抗GAD濃度を基に作成した標準曲線と比較した。 IgGを含む細胞培養液は、細胞懸濁液を1400gで10分間遠心して細胞の沈澱を除去して単離した。それから抗GAD-IgGを含む上清を濃縮機（Centriprep，MWCO=10 0,000）でリン酸ナトリウム緩衝液に対して10から15倍に濃縮した。それから濃縮した培地を0.2μmフィルター（Sterile Acrodisc，Gelman Scien ces）でフィルトレーションし、あらかじめ25mMリン酸緩衝液pH 7.3で平衡化しておいたDEAEセルロースカラムにのせた。結合したタンパク質はpH 7.3のPBS緩衝液（40mMリン酸二ナトリウム、10mMリン酸一ナトリウム、1.5M NaCl）で流速1 ml/分で溶出される。溶出するごとに、カラムを2倍量の0.1M HCl、それから2倍量の0.1M NaOHで洗浄し、pH 7.3の25mMリン酸ナトリウムで再び平衡化した。典型的に、抗体は結合しない画分に溶出された。画分の精製度はそのままおよび変性条件下で電気泳動（Ohastgel 8/25，Pharmacia）によって調べた。抗GAD-IgG 画分の活性は上述したようにELISAで見積もった。この手法により、典型的に当初の抗GAD-IgG濃度のおよそ70-80%の収量が得られた。実施例２腹水液由来の抗体の精製腹水は、腹膜腫瘍のあるマウスから採取された腹膜内液である。腹水は、ハイブリドーマ細胞の増殖およびMabの生産のためにマウスの腹膜内に注入されたハイブリドーマ細胞に由来する。ハイブリドーマ細胞は腹膜腔で高密度に増殖し、ハイブリドーマ細胞系列に特異的な抗体を継続的に分泌する。典型的に、この方法で生産される抗体は一匹のマウス当たり、粗抗体力価で90-98%を示す5から10m g/mlのIgGを含む腹水およそ3mlである。使用されなくなった種マウスのBALB/cマウスをJackson Laboratoryより購入した。マウスには、栄養、単球、リンパ球を腹膜に補給し、それによってハイブリドーマ細胞に好ましい増殖環境が作り出される腹膜内刺激薬として機能するプリスタンを与えた。以下の時間的計画に基づいてマウスにハイブリドーマ細胞（AT CC番号HB184）を注入した。0日目は単離期間の最終日で、マウスにそれぞれ0.5m lのプリスタンを腹膜内注射した。3日目には、それぞれのマウスに前と同じように再びプリスタンを注射した。10日目には、それぞれのマウスに1mlあたり10⁶細胞含まれている0.5mlのハイブリドーマ細胞懸濁液（ATCC番号HB184）を腹膜内注射した。20日から25日の間に、二酸化炭素による窒息により安楽死させ、腹膜腔から腹水を抽出した。25日後に、動物をCO₂ガスで安楽死させ、腹膜腔から腹水を抽出した。液体を遠心にかけ、赤血球およびフィブリンのクロットを含む沈殿を除去した。腹水は精製する前に-20℃で保存した。腹水から得られた抗-GAD抗体は、飽和硫酸アンモニウム(SAS)による沈澱、およびそれに続く陰イオン交換クロマトグラフィーおよびプロテインA-セファロースクロマトグラフィーによって精製された。10匹のマウスより得られた腹水は等量のSASに4℃で振動を加えつつゆっくりと加えられた。溶液は遠心分離され、上清は沈澱から分離され、両方とも保存された。沈澱はPBSに再び溶かされ、等量のSASによって再び沈澱させられ、上清は0.5容積のSASによって再沈澱させられ、そして2つの混合物は4℃で一晩保存された。保存後2つの溶液は遠心分離され、それぞれの上清は捨てられ、沈澱は初めの腹水の体積の0.25倍の体積のPBSに再び溶かされた。溶液は実施例1に記載されたように、4℃で一晩透析され、0.2 μmフィルターを通して漉過され、DEAE-セルロースカラムに溶出された。純度によってはプロテインA-セファロースカラム上での2度目のクロマトグラフィー精製が必要かも知れない。Mabを含む分画は等量の結合緩衝液(1.5Mグリシン、3M NaCl、pH 8.9)によって希釈された。結合したタンパク質はプロテインA カラムからpH6.0の0.1Mクエン酸ナトリウム、および続いてpH3.0の0.1Mクエン酸ナトリウムとともに溶出された。それぞれの精製の後で、カラムは2倍量の6Mグアニジンで濯がれた。典型的には抗-GAD抗体はpH6.0の0.1Mクエン酸ナトリウム中に溶出された鋭いピークとして現れた。腹水からの抗-GAD-IgGの収量は典型的には30-40%であった。前の手順の間に単離された抗体は抗-GADおよび内在性のマウス抗体の混合物であることが予想された。最終的な精製の段階として、抗-GAD-IgGにのみ結合する GADを固定した親和性カラムが調製された。CDI-活性化セファロースビーズ（Pie rce Chemical Co.）がGADとリジン残基のイプシロン-アミノ基を介して共有結合された。ビーズは調製され、GADは制作者の仕様書に従ってビーズに結合された。Mab調製物は0.1Mホウ酸緩衝液（pH8.5）に溶解され、CDI-活性化ビーズ懸濁液（約2mg GAD/mlビーズ）に加えられ、4℃で一晩穏やかに混合された。ビーズは漉過され、2Mトリス（pH8.0）で洗浄され、残ったCDI基をブロックされた。PBS 中のMab溶液はカラムにつめられたビーズに結合された。カラムは10倍量のPBSで洗浄され、遊離のIgGが除かれた。抗-GAD抗体はイオン強度勾配によって除かれ、溶出された。精製された。分画は貯められ、透析され、凍結乾燥され、-20℃ で保存された。実施例3 抗-GAD-F(ab')断片の調製実施例1または実施例2の手順に従って調製された抗-GAD-IgGは、F(ab')断片を得るために酵素によって消化され化学的に還元され、それはPEGに結合された。この手順の根拠は、GAD抗原に結合できFC領域を欠いた抗体断片を得、さらなるタンパク質および細胞との相互作用を減少させるためPEGに結合することである。 F(ab')₂領域を得るための完全なIgGの消化は一般的な研究手順である。抗-GAD -IgGはPBSに1-2mg/mlの濃度で溶解され、1mlの100mMクエン酸ナトリウム(pH4.2) が加えられた。溶液のpHは0.1M酢酸を加えることでpH4.2に保たれた。ペプシン( 1mg/ml)が33mgの抗-GAD-IgGに対して6mgのペプシンの割合でMab溶液に加えられ、37℃で12時間保存された。当該技術分野において通常の技能を持つ人物は保存時間およびペプシンと抗体の割合をF(ab')₂断片の最適な収量を得るために必要ならば修正し得る。消化反応は溶液のpHを0.1M炭酸緩衝液(pH9.5)によってpH6.5 に変えることで終了された。反応混合物はすぐに容積排除クロマトグラフィーカラム(HILOAD 16/60，Pharmacia)にかけられた。F(ab')₂断片のさらなる精製がプロテインAカラムにおいて行われた。FC断片および完全なIgG分子はプロテインA に結合するがF(ab')₂断片は結合しない。F(ab')のピークは280nMの紫外分光によって同定され、F(ab')分画は集められ、凍結乾燥されて-20℃で保存された。 F(ab')の2つの重鎖断片をつないでいるジスルフィド結合はジチオスレイトール(DTT)によって還元され、それぞれが結合していない反応性のスルフヒドリル基を持ったF(ab')断片がF(ab')断片あたり2つ得られた。F(ab')₂断片の一部（3m g/mlで0.67ml）が0.23mlの緩衝液(100mM酢酸ナトリウム、88mM NaCl、pH5.5)および0.1mlの200mM DTTに加えられ、室温で90分間穏やかに混合された。反応しなかったF(ab')断片および試薬の分離はPD10 GPCカラム上で100mM酢酸ナトリウム、88mM NaCl、pH5.5を溶出緩衝液として用いて行われた。クロマトグラフィーは全ての試薬および緩衝液は全て脱気され、窒素によって洗浄された状態で、窒素環境内で（グローブボックス中で）行われた。F(ab')断片を含む溶出体積は280nmの紫外分光によって決定された。実施例4 メトキシ-PEG-アミンの活性化前に論じたように分子量約2,000から8,000の間のポリエチレングリコール(PEG s)が、血漿タンパク質が血液に接触している面に粘着して外来免疫源タンパク質および酵素の抗原性を減少させることを防ぐために用いられた。従って様々な分子量のPEGsがF(ab')断片とそのスルフィドリル基を介して結合される。これらの抗-GAD-F(ab')-PEG構成物はislet/beta細胞に対する結合能は維持するがPEGの部分が残りのF(ab')分子が余分な免疫学的現象を起こすのを防ぐ。 F(ab')断片へのPEGの結合にはスルフォスクシニミジル4-(N-マレイミドメチル )シクロヘキサン-1-カルボキシレート(sulfo-SMCC; Pierce Chmical Co.)のような異種2機能性架橋試薬を用い得る。この試薬ははじめメトキシ-PEG-アミン(CH₃ -[O-CH₂-CH₂]n-NH₂)のアミノ基に結合し、次いでF(ab')断片とそのスルフィドリル基によって結合される（図1）。分子量200から8,000までのメトキシ-PEG-アミン(2x10-^-4モル)が0.1リン酸ナトリウム、pH9.0に溶解された。0.5モル等量のsulfo-SMCC(0.044 mg,1x10^-4モル )が加えられ、反応は4℃で24時間進行した。陽イオン交換カラムが反応混合液を置換されたおよび置換されていないSMCC-P EG誘導体に分けるために用いられた。100mgのPEG誘導体を含む反応混合液が高速タンパク質液体クロマトグラフィーシステム(FPLC;Pharmacia)と接続されたMONO S クロマトグラフィーカラム(Pharmacia)にかけられる。置換されたおよび置換されなかった誘導体が異なったイオン強度において溶出するようなNaClの直線勾配がPEG誘導体の溶出に用いられた。溶出はマレイミド基の最大吸光度においてU V検出機で監視された。純粋な置換されたSMCC-PEGに対応するピークが集められ、蒸留水に対して透析され、凍結乾燥され、-20℃で保存された。実施例5 ジアミノ-PEGの活性化細胞染色および全身還流（薬理動態）評価のために、抗-GAD-F(ab')-PEGを例えば放射性または蛍光標識で標識することは有用である。抗-GAD-F(ab')-PEGの生体における治療への応用はこのような標識を必要としない。抗体標識の最近の方法はアミノ基を介した（蛍光または¹²⁵I標識）またはチロシン残基の酸化を介した（¹²⁵I標識）結合物の形成を含む。これらの標識法は抗体の活性部位への反応によって抗体の結合に干渉し得る。従って本実施例は標識のPEG部分への結合を示す。標識されたPEG部分は後にF(ab')断片に結合される。この手順は標識されたおよび標識されていない構成物が抗原に対し類似した親和性を持つことを保証する。ジアミノPEG(H₂N-[O-CH₂-CH₂]-NH₂)がメトキシ-PEG-アミンのかわりに用いられる以外は実施例4の手順の通りに行われる。目的はジアミノPEGの一つのアミン基を、もう一つのアミン基を標識との反応に使えるように残したまま標識することである(図2)。ジアミノPEGとスルフォSMCCの反応は1および2置換型および標識されていないSMCC-PEG誘導体を生ずる。この混合物は実施例4の手順に従って分離される。低イオン強度緩衝液による溶出は2置換型SMCC-PEG誘導体(両方のアミン基が結合されており、イオン結合しない)の溶出をもたらす。1置換型および置換されていないPEGはより高いイオン強度において溶出する。純粋な1つ置換されたSMCC-PEGが集められ、蒸留水に対して透析され、凍結乾燥され、-20℃で保存された。実施例6 活性化したPEGの¹²⁵I標識本実施例においては実施例5の1置換型SMCC-PEGアミンがヨウ素化によって標識される。SMCC-PEGアミン(0.5g)が0.1Mホウ酸ナトリウム(pH8.5)に終濃度0.1mg/m lになるように溶解され、氷槽に移された。約1mCiの¹²⁵I標識Bolton-Hunter試薬が1.5mlチューブに0℃で加えられ、溶媒は窒素ガスによって蒸発させられる。SM CC-PEGアミン溶液が乾燥したBolton-Hunter試薬に加えられ、氷上で15分間反応される。等量の”終止”溶液(0.5Mエタノールアミン、10%グリセロール、0.1%キシレンシアノール、0.1Mリン酸ナトリウム、pH8.5)が加えられ、室温で5分間置かれた。精製は蒸留水に対する透析(MWCO 3,500)によってなされる。精製された生成物は凍結乾燥され、-20℃で保存される。実施例7 活性化したPEGのフルオレセイン標識本実施例においては実施例5の1置換型SMCC-PEG-アミンがフルオレセインイソチオシアネート(FITC)によって標識される。SMCC-PEG-アミン(2mg/ml)は0.1M炭酸ナトリウム(pH9.0)に溶解される。FITCは1mg/mlの濃度でジメチルスルフォキシドに溶解される。FITC溶液はSMCC-PEG-アミン溶液にSMCC-PEG-アミンの濃度が 0.05ml/mgに到達するまでかき混ぜられながらゆっくり加えられ、反応は4℃で8 時間暗所において行われる。終止溶液(50mM塩化アンモニウム、0.1%キシレンシアノール、および5%グリセロール)が加えられ、4℃で2時間置かれる。生じたSMC C-PEG-FITCは暗所における4℃での蒸留水に対する透析によって精製される。最終生成物は凍結乾燥され、-20℃に保存された。実施例8 抗-GAD-F(ab')の活性化したPEGへの結合本実施例においては実施例4、6、または7の手順で調製されたPEG中間体が、実施例3の手順によって調製された抗-GAD-F(ab')に結合される。記載された全ての PEG中間体はF(ab')断片のスルフィドリル基に結合できるマレイミド基を持つ。精製された抗-GAD-F(ab')断片は選択されたPEG中間体の100mM酢酸ナトリウム、8 8mM NaCl、pH5.5溶液にモル比でPEG中間体3に対しF(ab')断片2の割合で加えられる。反応は窒素中で4℃で24時間行われた。抗-GAD-F(ab')-PEGの精製は4℃での平衡透析によって成された。適切な注意が FITC標識(暗所)および放射能標識された化合物には払われる。反応生成物は酢酸セルロース透析バッグ(MWCO<14,000)中に入れられ、PBSに対して48時間頻繁な液交換を伴って透析される。高分子量の抗-GAD-F(ab')-PEGがバッグ中に残り、反応しなかったPEG中間体は除かれる。精製された構成物のタンパク質含量は標準的なタンパク質試験、すなわちM.Br adford,A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Qu antities of Protein Uti1izing the Principle of Protein Dye Bibding,72 An al.Biochem.248-54(1976)によって決定される。標識された構成物は例えばFITC- 標識された構成物であれば蛍光によって、または¹²⁵I-標識された構成物であればガンマ計数によって試験される。実施例9.抗GAD単クローン抗体によるNODマウスの生体処理非肥満性糖尿病(NOD)マウスは、ヒトとの関係においてI型糖尿病を研究するための優れたモデルである(H.Ikegami et al.,Immunogenetics and Immunopathoge nesis of the NOD Mouse,Immunotherapy of Disbetes and Selected Autoimmune Diseases 24-31(1980,G.S.Eisenbarth編集);S.Makino et al.,Breeding ofa No n-obese,Diabetic Strain of Mice,12 Exp.Anim.1-15(1980))。NODマウスは生後 16週間以内に糖尿病を自然発症し、ヒトに類似の細胞病理および器官不全を示す。一般的に、明白な糖尿病は生後約12週間で始まり、16週間以内に90%の雌および20%の雄で観察される。これらの個体はヒトで見られるように、病状発現前抗体価を示し、4から6週間以内にインシュリン炎を、β細胞破壊前の細胞浸潤(マクロファージ、T細胞およびB細胞)を示す。多尿症、糖尿、および体重減少、さらに高血糖症、ヘモグロビンA1の増加(グリコシル化ヘモグロビン)、および内在性インシュリン生産の欠損のような症状を呈する。遺伝子操作、免疫治療、およびリンパ球阻害の広範な研究によって、NODマウスとヒトのIDDMの類似性が確立されてきた。即ち、NODマウスは、当業者によってヒトにおけるIDDMの治療に資する可能性が高いとみなされるモデル動物である。本実施例においては、NODマウスの1グループが、生後7週間から0.1または0.3m gの単クローン抗体を週毎に腹腔内注射されることによって、実施例2の方法によって調製された抗GAD単クローン抗体を投与された。対照は注射されなかった。これらの個体は週毎に升量され、血糖値が決定された。血糖レベルは尾を切り、血液サンプルを毛細管に回収する(約150μl)ことによって決定された。血液の一部は商業用グルコース試験紙に搭載され、血糖レベルが決定された。実験測定に先立ち、高血糖症個体は毎日二回、0.3から0.5IUの50:50規格/NPHインシュリンを投与された。血糖レベルが200mg/dlの場合、個体は糖尿病であると見做された。図3は、抗GAD単クローン抗体を注射されたマウスが発症の実質的な減少を示したこと、糖尿病を発症した個体の発症も対照に比べて実質的に遅かったことを示す。これらの結果は、抗GAD単クローン抗体の投与は発症を減少させ、IDDMの開始を遅延させ得ることを示す。実施例10 本実施例では、実施例8の方法で調製された抗GAD-F(ab')-PEGがNODマウスに注射される以外は、単クローン抗体実施例9の方法が行われた。実施例11 本実施例においては、糖血症NODマウスは実施例9の方法に従って抗GAD単クローン抗体を0.3mgおよび0.1mgの投与量で(各グループ当たり5から6匹)注射された。これらの個体は生後32週間に屠殺され、対照の(注射されていない)マウスは生後約20週間で屠殺され、高血糖症を発症していた。膵臓が切除され、10％緩衝化ホルマリンで固定され、パラフィンに埋め込まれ、5μmの切片化され、ヘマトキシリンおよびイオシンで染色された。インシュリン炎の重度は以下の数値化法を用いて見積もられた:(0)正常な島;(1)25%以下の島における単核浸潤;(2)25から5 0%の島における浸潤;(3)50%以上の島における浸潤;(4)明白なβ細胞の損傷を伴う広範囲の島内浸潤。総数値を測定された島の数で割ることによって、各膵臓に対する平均値が計算された(図4)。これらの膵臓の組織学的研究によって、抗GAD単クローン抗体で処理されたマウスが対照のグループと比べて16週目までに低いレベルのインシュリン炎であることが示される。実施例12 本実施例では、実施例8の方法で調製された抗GAD-F(ab')-PEGが抗GAD単クローン抗体の代わりに用いられる以外は、実施例11の方法が反復される。実施例13 本実施例では、生後8週間のNODマウスは屠殺され、その脾臓は無菌的に切除され、氷冷RPMI1640培地中に置かれた。脾臓細胞は0.15M Tris、0.83%NH₄Clを含む溶液中で脾臓を破壊し、次に細胞を細糸メッシュを通すことによって抽出された。脾臓細胞(5×10⁶細胞/穴)は異なる抗GAD単クローン抗体濃度下(0から10μg/穴 )または異なるポリクローンマウスIgG濃度下(0から10μg/穴;Zymed)で4日間培養された。各穴の細胞増殖の度合いはミクロテトラゾリウム(MTT)を用いた比色定量法を用いて測定された。即ち、MTTは無菌PBS(pH7.3)に濃度5mg/mlに懸濁され、次に濾過滅菌された。この溶液(25μl)が各穴に加えられた。保温は4時間行われ、その後100μlの可溶化溶液(20%(w/v)SDS、50%ジメチルホルムアミド、50%H₂ O;酢酸およびHClの添加によってpH4.7に調整)が各穴に加えられ、さらに4時間保温された。次に各穴の吸光度が570nmで測定された。MTTは代謝が活発な細胞中の酵素と反応し、570nmで吸光する産物に変換される。即ち、各穴について測定された吸光度は穴当たりの生きている細胞数に比例する。図5は脾臓細胞に対する抗GAD単クローン抗体の効果を示す実験を示す。抗GAD 単クローン抗体による脾臓細胞の活性化の頻度は、抗GAD単クローン抗体のリンパ球活性化に与える直接的な効果を証明した。これから、抗GAD単クローン抗体による遺伝子型ネットワークの特異的な制御は免疫系の制御を引き起こし、NOD マウスにおける糖尿病を予防することが示唆される。この活性化は、低濃度(0から1μg/穴)ではほとんどまたは全く効果が観察されないが、高濃度(10μg/穴)の抗GAD単クローン抗体では有意な細胞増殖刺激が起きたことから、濃度依存的であると考えられる。。同一の条件下で多クローンマウスIgGで処理された細胞では有意な増殖は観察されなかった。実施例14 本実施例では、実施例8の方法で調製された抗GAD-F(ab')-PEGが抗GAD単クローン抗体の代わりに用いられる以外は、実施例13の方法が行われた。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者メナード，バージニーアメリカ合衆国ユタ州84102，ソルト・レイク・シティ，サウス 1300 イースト 130，ナンバー 503

Claims

【特許請求の範囲】１．インスリン依存型糖尿病の発生する素因をもったヒトに対して、（ａ）グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫学的に活性なモノクローナル抗体またはその断片、および（ｂ）前記モノクローナル抗体の周囲にその免疫認識を阻害するための水和性殻を提供する、（ａ）と結合した非免疫原性親水性ポリマーを含む、有効量の組成物を投与することを含む、前記ヒトにおいて、インスリン依存型糖尿病の開始を遅延させる方法。２．前記ポリマーがポリ（エチレングリコール）である、請求項１に記載の方法。３．前記ポリ（エチレングリコール）の分子量が、約２００から８０００の範囲である、請求項２に記載の方法。４．前記モノクローナル抗体またはその断片が、Ｆ（ａｂ'）断片である、請求項２に記載の方法。５．前記ポリ（エチレングリコール）が、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である、請求項２に記載の方法。６．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項５に記載の方法。７．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に共有結合している、請求項２の方法。８．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に架橋剤により共有結合している、請求項７の方法。９．前記架橋剤が、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸である、請求項８に記載の方法。１０．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項９に記載の方法。１１．前記モノクローナル抗体またはその断片が、グルタミン酸デカルボキシラーゼのＧＡＤ−６５異性体に対するものである、請求項１に記載の方法。１２．モノクローナル抗体またはその断片が、ＡＴＣＣのＮｏ．ＨＢ１８４由来のものである、請求項１１の方法。１３．インスリン依存型糖尿病の発生する素因をもったヒトに対して、（ａ）グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫学的に活性なモノクローナル抗体またはその断片、および（ｂ）前記モノクローナル抗体の周囲にその免疫認識を阻害するための水和性殻を提供する、（ａ）と結合した非免疫原性親水性ポリマーを含む、有効量の組成物を投与することを含む、前記ヒトのベータ細胞におけるインスリン症（ｉｎｓｕｌｉｔｉｓ）を軽減する方法。１４．前記ポリマーがポリ（エチレングリコール）である、請求項１３に記載の方法。１５．前記ポリ（エチレングリコール）の分子量が、約２００から８０００の範囲である、請求項１４に記載の方法。１６．前記モノクローナル抗体またはその断片が、Ｆ（ａｂ'）断片である、請求項１４に記載の方法。１７．前記ポリ（エチレングリコール）が、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である、請求項１４に記載の方法。１８．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項１７に記載の方法。１９．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に共有結合している、請求項１４の方法。２０．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に架橋剤により共有結合している、請求項１９の方法。２１．前記架橋剤が、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸である、請求項２０に記載の方法。２２．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項２１に記載の方法。２３．前記モノクローナル抗体またはその断片が、グルタミン酸デカルボキシラーゼのＧＡＤ−６５異性体に対するものである、請求項１３に記載の方法。２４．モノクローナル抗体またはその断片が、ＡＴＣＣのＮｏ．ＨＢ１８４由来のものである、請求項２３の方法。２５．（ａ）グルタミン酸デカルボキシラーゼに対する免疫学的に活性なモノクローナル抗体またはその断片、および（ｂ）前記モノクローナル抗体の周囲にその免疫認識を阻害するための水和性殻を提供する、（ａ）と結合した非免疫原性親水性ボリマーを含む、インスリン依存型糖尿病の発生する素因をもったヒトにおいて、インスリン依存型糖尿病の開始を遅延させる組成物。２６．前記ポリマーがポリ（エチレングリコール）である、請求項２５に記載の組成物。２７．前記ボリ（エチレングリコール）の分子量が、約２００から８０００の範囲である、請求項２６に記載の組成物。２８．前記モノクローナル抗体またはその断片が、Ｆ（ａｂ'）断片である、請求項２６に記載の組成物。２９．前記ポリ（エチレングリコール）が、メトキシ−ポリ（エチレングリコール）である、請求項２６に記載の組成物。３０．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項２９に記載の組成物。３１．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に共有結合している、請求項２６の組成物。３２．前記モノクローナル抗体またはその断片が、前記ポリ（エチレングリコール）に架橋剤により共有結合している、請求項３１の組成物。３３．前記架橋剤が、スルホスクシンイミジル４−（Ｎ−マレイミドメチル）シクロヘキサン−１−カルボン酸である、請求項３２に記載の組成物。３４．前記モノクローナル抗体またはその断片がＦ（ａｂ'）断片である、請求項３３に記載の組成物。３５．前記モノクローナル抗体またはその断片が、グルタミン酸デカルボキシラーゼのＧＡＤ−６５異性体に対するものである、請求項２５に記載の組成物。３６．モノクローナル抗体またはその断片が、ＡＴＣＣのＮｏ．ＨＢ１８４由来のものである、請求項３５の組成物。