JP2000500158A

JP2000500158A - ユニバーサルな固体支持体およびその使用方法

Info

Publication number: JP2000500158A
Application number: JP9538250A
Authority: JP
Inventors: パラメスワラレディー、エム; エイマイケル、メイジド; ファルーキ、ファーダス
Original assignee: ベックマンインスツルメンツインコーポレーテッド
Priority date: 1996-04-22
Filing date: 1997-04-21
Publication date: 2000-01-11
Also published as: DE69724218D1; WO1997040458A2; EP0843684A2; WO1997040458A3; US5869696A; DE69724218T2; EP0843684B1

Abstract

(57)【要約】ユニバーサルな固体支持体オリゴヌクレオチド合成試薬類、オリゴヌクレオチド合成プロセス、およびオリゴヌクレオチドを固体支持体から開裂するための試薬類が開示されている。オリゴヌクレオチド合成試薬は次の一般式であらわされる。ＳＳ−Ｒ⁶−Ｏ−Ｒ³（式中、ＳＳは固体支持体であり、Ｒ⁶は（ａ）、（ｂ）または（ｃ）であり、ここでＲ⁵は水素またはアルキルであり、Ｒ⁴はホスフェート保護基であり、Ｒ³はビシナル基−ＸＲ¹および−ＹＲ²を有する環状部分であり、ここでＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、およびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方はブロッキング部分であり、他方は水素、またはヒドロキシ保護基である。オリゴヌクレオチド開裂試薬はメチルアミンおよび／または水酸化アンモニウムおよびトリメチルアミンを含む。

Description

【発明の詳細な説明】ユニバーサルな固体支持体およびその使用方法発明の背景本発明は一般的には化学および生物学の分野に関するものである。より詳細には、本発明はオリゴヌクレオチド類（例えばＤＮＡおよびＲＮＡ配列）の合成に使用する組成物および方法に関する。オリゴヌクレオチド配列の作成のために種々の合成法が開発された。典型的にはオリゴヌクレオチドは、固体支持体（担体）に固定した成長するオリゴヌクレオチド鎖にヌクレオチドを逐次付加することを含んでなるビルディングブロック法を用いて合成される。あらゆるＤＮＡオリゴヌクレオチドは４つの異なる最初のヌクレオチドのいずれかを有するから、４つの異なるヌクレオシド（Ａ，Ｃ，ＧおよびＴ）を担う固体支持体を供給し、所与のＤＮＡ配列の合成を維持することが必要である。ＤＮＡ合成の場合は、ＤＮＡ配列の３’末端からの最初のヌクレオシドをエステル結合を介して固体支持体にあらかじめ担持させるのが普通である。例えば、合成すべき配列が３’末端にＴヌクレオシドを含む場合、Ｔ支持体を用い、ＤＮＡ配列中のヌクレオチド類の残りをそれに加える（例えば、自動ＤＮＡ合成機を用いる）。全ＤＮＡ合成が終わったとき、エステル結合を加水分解してオリゴヌクレオチドを固体支持体から離脱させる。ＲＮＡ合成法を考慮すると、使用者はもう一つの４種類ヌクレオシドを担持する固体支持体を使用できなければならない。もしも特別に改質したいずれかのヌクレオシドが３’末端に所望である場合、同様な考慮が払われる。少なくとも８種類のあらかじめ誘導体化された固体支持体の供給を維持することは不便であり、費用がかかる。もう一つの考慮はヌクレオシド誘導体化固体支持体の比較的短い保存寿命である。典型的には貯蔵１年後には、そのような固体支持体はもはや使用できない。誤って良くない支持体で合成を開始し、そのオリゴヌクレオチドの最終使用において悲惨な結果に導くという可能性もある。これらの問題を軽減するために、若干の研究者は幾つかのタイプのユニバーサルな固体支持体を開発すべく研究を行っている。例えばデベア（deBear）らは、２’（３’）−Ｏ−ベンゾイルウリジン５’−Ｏ−スクシニルでガラス支持体を誘導体化し、その際ウリジン部分がエステル（スクシネート）結合によってガラスに結合するようにした。［デベアら、ヌクレオシド類およびヌクレオチド類、６巻、８２１−８３０ページ（１９８７）］。オリゴヌクレオチド合成はヌクレオチドモノマーをウリジンの２’または３’位置に付加することによって行われる。その合成後、１つの反応で、新しいオリゴヌクレオチドをそのガラスから離し、保護を除去し、ウリジリル末端から開裂する。ウリジル官能性はこの開裂反応で固体支持体から引き離されるから、その支持体はその後のオリゴヌクレオチド合成には使用できない。クレア（Crea）およびホーン（Horn）は、二量体５’−Ｏ−ｐ−クロロフェニルホスフォ−２’（３’）−Ｏ−アセチルウリジリル−［２’（３’）−３’］ −５’−Ｏ−ジメトキシトリチルチミジンｐ−クロロフェニルエステルを作り、その二量体をホスフェート結合によってセルロースに付着結合させることを含む同様なアプローチを示唆した。［クレア（R.Crea）及びホーン（T.Horn）、核酸研究、８巻、２３３１ページ（１９８０）］。その後の濃アンモニア水の使用は、合成オリゴヌクレオチドをセルロースから放出し、そのセルロースに付着結合した二量体のウリジン部分を残す。クレアおよびホーンがウリジンからオリゴヌクレオチドが分離する部位としてウリジンの反応性ビシナル基を用いたとはいえ、この文献に示唆される固体支持体はユニバーサルな固体支持体ではない、なぜならば最初のオリゴヌクレオチドが固体支持体試薬に挿入され、別の第１のヌクレオシドを挿入するオリゴヌクレオチドには別の支持体が必要だからである。より最近になって、シュワルツ（Schwartz）らは、アダプター、２’（３’） - Ｏ−ジメトキシトリチル−３’（２’）−Ｏ−ベンゾイルウリジン−５’−Ｏ −（２−シアノエチルＮ、Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト、をチミジン誘導体化ポリスチレンに付着結合し、ウリジンのＯ−ジメトキシトリチル位置からオリゴヌクレオチドを合成した。［シュワルツ（M.E.Schwartz）、ブリーカー（R.R.Breaker）、アステリアディス（G.T.Asteriadis）およびゴー（G.R.G ough）、テトラヘドロンレターズ（Tetrahedron Letters）、３６巻、１号、２７−３０ページ、１９９５］。このアプローチはオリゴヌクレオチド合成のためのユニバーサルな固体支持体を提供する一方、開裂段階はアダプターおよびチミジンを支持体から放出し、その後合成されたオリゴヌクレオチドをウリジンから切り離した。こうして精製過程はチミジンリンカーの除去を必要とし、その開裂プロセスはその後の固体支持体の使用を不可能にする。上記の固体支持体およびそれらの使用法は、その後のオリゴヌクレオチド開裂工程の好適性および効率の点で不都合である。ＤＮＡ合成の安全な試薬として広く受け入れられているアンモニアを、デベアの教示により、開裂のために使用するとき、開裂時間は６５℃で２４時間にもなる。オリゴヌクレオチドをできるだけ速く生成しようとする傾向が増えていることを考慮すると、これは許容できないほど長時間である。ウリジリルをオリゴヌクレオチドからウリジン３’位置で開裂するために必要な時間を減らすためには、普通は鉛（ＩＩ）イオン触媒系または強アルカリ水酸化物の作用を用いる。必然的にこれらのプロセスは鉛イオンを除去するための別個の分離工程を必要とする。その上、強アルカリ塩基を開裂工程に用いるとき、シトシン脱アミノ反応の形のかなりの副反応がおきる。同時複数オリゴヌクレオチド合成（数種類のオリゴヌクレオチドを同時に合成する）の自動化の最近の進歩は、オリゴヌクレオチド類の合成のために単一のユニバーサルな固体支持体を用いる好適性をさらに強調する。ＤＮＡ合成機に幾つかの異なるヌクレオシド予備的担持固体支持体を供給する要求はすべて合成自動化を複雑にする。そのため、どんな核酸でも合成できるユニバーサルな固体支持体を提供することが非常に望まれる。本発明の目的は、先行技術の方法および組成物において遭遇する諸問題の幾つかを軽減するオリゴヌクレオチド合成に使用するための方法および組成物を提供することである。より詳細に述べるならば、最初のヌクレオシドの如何にかかわらず種々のオリゴヌクレオチドを合成するために使用できる再利用可能オリゴヌクレオチド合成試薬を提供することが本発明の目的である。合成後のオリゴヌクレオチドを離脱させるために必要な時間を実質的に短縮する開裂試薬および開裂方法を提供することがもう一つの目的である。発明の概要本発明はオリゴヌクレオチド類の固体支持体合成に関連する先行技術の諸問題を克服する方法および組成物を提供する。本発明の方法および組成物は段階的オリゴヌクレオチド合成およびその後の合成されたオリゴヌクレオチドの単一工程の開裂および脱保護に使用するのに適した単一の再利用可能なユニバーサルな固体支持体を提供する。他の一面において、本発明はオリゴヌクレオチド類を、それらを合成した固体支持体から離脱させるのに適した開裂試薬を提供する。本発明の開裂試薬は揮発性で、したがってその後試薬除去プロセスに時間を消費する必要がない。その上、本発明の開裂試薬は合成したオリゴヌクレオチドを実質的により短い時間で取り出す。より詳細に述べるならば、本発明は下記の一般式を有するオリゴヌクレオチド合成試薬を提供する： SS - R⁶ - O -R³ I はホスフェート保護基；およびＲ³はビシナル基−ＸＲ¹および− ＹＲ²を有する環状部分であり、ここでＸおよびＹはそれぞれ、Ｏ、Ｓ、およびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の１方はブロッキング（遮断）部分であり、他方は水素、またはヒドロキシ保護基である。）Ｒ³は糖環の第２および第３炭素位置を占める−ＸＲ¹および−ＹＲ²を有する糖部分であるのが好ましい。最も好ましいのはＲ³が以下の構造をもつことである（式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基であり、ＸおよびＹ並びにＲ¹およびＲ²はそれぞれ上記のようである。好ましいＲ¹またはＲ²ブロッキング部分は、２つのビシナルヒドロキシ官能基の１つにエステルブロッキング基を形成することによって作ることができるアルキルカルボニルまたはアリールカルボニルである。Ｒ⁶の好ましい態様はホスフォルアミダイト結合および酸化型、ホスフォ分であることである。）好都合なことに、これらの試薬はオリゴヌクレオチド合成におけるユニバーサルな固体支持体として有用であり、この場合合成はヒドロキシ保護基を有するビシナルＲ¹またはＲ²の位置で起きる。他方のＲ¹またはＲ² 位置はアリールカルボニルまたはアルキルカルボニルブロッキング部分でブロックされる。驚くべきことに、本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬を用いて合成したオリゴヌクレオチドの合成後の放出は、従来技術の固体支持体試薬を用いたオリゴヌクレオチドの放出よりも実質的に速い。その上、それらのオリゴヌクレオチドは環状部分のビシナル基の位置で分離する。環状部分と固体支持体との結合がホスフォルアミデートまたはホスフォルアミダイトであるとき、その分離は固体支持体接着をおこさず、オリゴヌクレオチド試薬は合成操作の反復に適する。本発明のもう一つの面において、オリゴヌクレオチドを固体支持体から離脱させるための開裂方法および開裂試薬が提供される。ここに記載される開裂試薬および開裂法は、種々の固体支持体に付着結合したオリゴヌクレオチド類、例えばエステル結合オリゴヌクレオチド、ホスフェート結合オリゴヌクレオチド、およびホスフォルアミデートまたはホスフォルアミダイト結合オリゴヌクレオチド類に適用できる。本発明の開裂方法は、オリゴヌクレオチドを担う固体支持体を、メチルアミンおよび／または水酸化アンモニウムを含む第１の化合物と第二アミンおよび／または第三アミンである第２の化合物との混合物とを含む本発明の開裂試薬と接触させることを含む。開裂試薬は４０ｗｔ％メチルアミン水：２３〜２５ｗｔ％トリメチルアミン水、約１：９（ｖ／ｖ）から、４０ｗｔ％メチルアミン水：２３〜２５ｗｔ％トリメチルアミン水溶液、約９：１（ｖ／ｖ）の範囲であるのが好ましい。これらのおよびその他の利点は、当業者には下記に示す本発明のより完全な理解によって十分明らかになる。発明の詳細な説明本発明は固体支持体に基づくオリゴヌクレオチド合成の組成物および方法の改良を提供する。より詳細に述べるならば、本発明は、環状部分がホスフォルアミデート結合を介して固体支持体に結合しているオリゴヌクレオチド合成試薬を提供する。環状部分はビシナル位置の官能基を有し、その一方はオリゴヌクレオチドの段階的合成のための部位であり、他方は、合成中はブロッキングされるが開裂プロセス中は脱ブロックして活性になる。本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬はユニバーサルな固体支持体であり、この支持体においては単一のオリゴヌクレオチド試薬がいかなる最初のヌクレオシドを有するいかなるオリゴヌクレオチドの合成にも有用であり、そのため種々の異なる適切に誘導体化された固体支持体を維持する必要がない。その上典型的開裂プロセス中、本発明のホスフォルアミデート結合は安定のままであるから、本発明の合成試薬をその後のオリゴヌクレオチド合成に使用することができる。このような系において、２つのヒドロキシル（または以下に定義するような、これらの同等物）が好ましくはｃｉｓ型配置で隣接する炭素原子に結合している。オリゴヌクレオチド合成のためには２つのヒドロキシルまたはヒドロキシル同等物の１つがブロッキングされ、好ましくはヒドロキシルがヒドロキシルまたはヒドロキシル同等物のエステル誘導体の形でブロッキングされる。ヒドロキシルまたは同等物または両ヒドロキシルまたは同等物の混合物のいずれか１つを適切に使用すればよい。残るブロッキングされていないビシナル位置を用いてオリゴヌクレオチド鎖を延長する。典型的にはこの部位は適した保護基、例えばＤＭＴ（ジメトキシトリチル）で保護され、その後その合成に最初のヌクレオシドを加える直前に脱保護する。合成終了時にブロックされたビシナル部位を脱ブロックするか、加水分解してヒドロキシルまたは同等物を遊離させる。ヒドロキシルなどはその後オリゴヌクレオチド鎖の第１のヌクレオチドの隣接ホスフェート基を分子内攻撃して、環状ホスフェートを形成する。これは固体支持体からオリゴヌクレオチド分子を放出させる。オリゴヌクレオチド合成中にどんなヌクレオシドが最初に固体支持体に加えられても、そのヌクレオシドが合成分子の３’−末端ヌクレオシドになる（そのオリゴヌクレオチドが一般的な３’から５’への方向に合成される場合）。本発明の第一の面により、一般式Ｉを有するオリゴヌクレオチド合成試薬が提供される SS - R⁶ - O -R³ I スフェート保護基であり、Ｒ³はビシナル基−ＸＲ¹および−ＹＲ²を有する環状部分であり、ここでＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、およびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方はブロッキング部分であり、他方は水素、または−ＯＨ、−ＳＨ、もしくはＮＨ₂の保護に適したヒドロキシ保護基である。）Ｒ⁶がホスフォルアミダイトまたはその酸化型、ホスフォルアミデートである場合、当業者はＲ⁵が好ましくは水素であることを認める。これは、これらのオリゴヌクレオチド合成試薬が一般に第一アミンを用いて作られるからである。しかし当業者は、ホスフォルアミデートは第二アミン類を用いて作られるから、Ｒ⁵はアルキルでもよいことを理解する。ホスフェート保護基Ｒ⁴は、オリゴヌクレオチド合成中、ホスフォルアミデートまたはホスフォルアミダイトのリンを切断または反応から保護することのできるいかなる適した基でもよい。当業者は、シアノエチル部分が、オリゴヌクレオチド合成条件下で安定であり、アンモニアまたはメチルアミンで除去しやすいため、好ましいホスフェート保護基であることを認めている。しかし、本発明に利用されるホスフォルアミデートまたはホスフォルアミダイト結合は脱保護の必要がなく、したがってアルキル部分は一般的に、またはアリール含有部分も、適したホスフェート保護基Ｒ⁴であることは理解される。下記の理由により、ビシナル基−ＸＲ¹および−ＹＲ²は、それらが相互にｃｉｓ型に位置する場合に最も有効である。環部分に結合した隣接官能基はｃｉｓ型に存在し得るから、Ｒ³は好ましくは環部分であり、−ＸＲ¹および−ＹＲ²は空間で固定されたｃｉｓ位置をとる。しかしＲ³は適切なビシナル構成成分を有する直鎖部分、例えばグリセロールであることも可能である。多くの糖はビシナル位ヒドロキシ官能基を有する環系であるから、Ｒ³は、−ＸＲ¹および−ＹＲ²が糖環の第２およ第３の炭素位置を占めている糖であることが好ましい。下記の理由により、ヌクレオシド類、または付加プリンまたピリミジン塩基を有する糖類が特に好ましい環部分である。最も好ましいＲ³は下記の構造を有する（式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基であり、ＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、およびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方はアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基であり、Ｒ¹およびＲ²の他方は水素、または−Ｏ、−Ｓ、もしくは−ＮＨを保護するために適した保護基である。）利用可能性および使用しやすさの点から、Ｂがウリジンであるのが好ましい。当業者は、糖類およびグリセロール型ジオール類に利用でき、それらの保護に適した公知の保護基であることから、ＸおよびＹは好ましくはＯ（酸素）であることを認めている。しかし、当業者にとって、本発明の目的のためにこのような位置にＮＨおよびＳを利用することも本発明の範囲内であることは当然である。ビシナル位置の１つをオリゴヌクレオチド合成参加からブロックするために、Ｒ¹またはＲ²は適切なブロッキング基である。下記のように、ブロックされないＸまたはＹは最終的オリゴヌクレオチド開裂工程において活性であるから、ブロッキング基は開裂反応条件下では容易に除去されなければならないとはいえ、オリゴヌクレオチド合成に一般的に認められる条件下では安定でなければならない。この理由により、Ｒ¹またはＲ²の１つは好ましくはアルキルカルボニルまたはアリールカルボニルである。アルキルカルボニル部分はＣ＝Ｏに終わる脂肪族基であり、その脂肪族成分は１（すなわちアセチル）〜約１０個の炭素原子を含む。アリールカルボニル基とは少なくとも１つのホモ芳香族環またはヘテロ芳香族環を含み、Ｃ＝Ｏに終わる残基を意味する（例えばＣ₆Ｈ₅ＣＯ）。ブロッキング基ではないＲ¹またはＲ²と結合するヒドロキシル保護基は、容易に除去される基であるのが適切であり、その結果保護された基はオリゴヌクレオチド合成開始中に第１のヌクレオシド導入のための部位として使用できるようになる。本発明の目的のためには、４，４’−ジメトキシトリチル（ＤＭＴ）基が特に好ましい。その他の適した基としては下記のものが含まれるが、これらに制限するものではない：４，４’，４”−トリス−（ベンジルオキシ）トリチル（ＴＢＴｒ）、４，４’，４”−トリス−（４，５−ジクロロフタルイミド）トリチル（ＣＰＴｒ）、４，４’，４”−トリス−（レブリニルオキシ）トリチル（ＴＬＴｒ）、３−（イミダゾリルメチル）−４，４’−ジメトキシトリチル（ＩＤＴｒ）、ピキシル（９−フェニルキサンテン−９−イル）、９−（ｐ−メトキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｍｏｘ）、４−デシロキシトリチル（Ｃ₁₀ Ｔｒ）、４−ヘキサデシロキシトリチル（Ｃ₁₆Ｔｒ）、９−（４−オクタデシロキシフェニル）キサンテン−９−イル（Ｃ₁₈Ｐｘ）、１，１−ビス−（４−メトキシフェニル）−１’−ピレニルメチル（ＢＭＰＭ）、ｐ−フェニルアゾフェニロキシカルボニル（ＰＡＰｏｃ）、９−フルオレニルメトキシカルボニル（Ｆｍｏｃ）、２，４−ジニトロフェニルエトキシカルボニル（ＤＮＰＥｏｃ）、４− （メチルチオメトキシ）ブチリル（ＭＴＭＢ）、２−（メチルチオメトキシメチル）−ベンゾイル（ＭＴＭＴ）、２− （イソプロピルチオメトキシメチル）ベンゾイル（ＰＴＭＴ）、２−（２，４− ジニトロベンゼンスルフェニルオキシメチル）ベンゾイル（ＤＮＢＳＢ）、およびレブリニル基。これらのおよびその他の適した保護基はビューケイジ（Beauca ge,S.L．）およびアイヤー（Iyer,R.P．）テトラヘドロン、４８巻、２２２３− ２３１１ページ（１９９２）に詳細に記載されている。この全開示は参照されてここに挿入される。本発明の目的のために、Ｂはピリミジンまたはプリン塩基である。本発明により使用するためには、グアニン、アデニン、チミジンおよびシトシンを特徴づける塩基が好ましいが、ヌクレオチド類似体の合成に用いられるその他のプリンまたはピリミジン塩基も代わりに基Ｂとして用いてもよい。ここに記載の例から明らかなように、本発明の好適オリゴヌクレオチド合成試薬は下記の構造を有するこの分野に従事する人々には容易に理解できるように、オリゴヌクレオチド合成には従来用いられている非常に種々様々の固体支持体を用いることができる。固体支持体は、適切なホスフォルアミダイトが結合するための官能基を含み、それに結合するホスフォルアミデート結合、置換ホスフォルアミダイト結合、または日常的方法によってそれに結合するエステル結合を形成し、一般的官能基はヒドロキシル、スルフヒドリルおよびアミノを含む。下記の典型的支持体が用いられる。ＣＰＧ［ポン（Pon,R.T.）ら、バイオテクニックス、６巻、７６８ページ、１９８８、アダムス（Adams,S.P.）ら、J.Amer.Chem.Soc.１０５巻、６６１ページ（１９８３）］、フラクトゲル［メルク社（E.Merck）、ダルムシュタット、ドイツ、から“フラクトゲル”の商品名で販売、およびトソハース社（TosoHa as）、フィラデルフィア、ペンシルバニア、から“トヨパール”の商品名で販売、レディー（Reddy,M.P.）ら、テトラヘドロンレターズ３５巻、５７７１−５７７４ページ（１９９４）］、およびテンタゲル［ラップポリマー社（Rapp Pol ymere）、チュービンゲン、ドイツ、アンドルス（Andrus）ら、テトラヘドロンレターズ、３４巻、３３７３−３３７６ページ（１９９３）］。固体支持体は、ビシナル反応基と結合を形成するための適した官能基を有するスペーサー結合で誘導体化できることは、当業者によって理解される。このようなスペーサー結合は若干の人々には好まれる、なぜならばそれらは固体支持体に距離を置く鎖として作用するからである。ＤＮＡ合成に一般に用いられるその他の支持体［例えばガイト（Gait,M.J．）著、オリゴヌクレオチド合成：実際的アプローチ、ＩＲＬプレス（１９８４）および米国特許第４，９２３，９０１号に記載されている］も本発明によって使用するのに適している。固体支持体は樹脂状または粒状型で、その他のあらゆるサイズの予備成形された形、繊維、フィルムなどの形で好適に用いられる。好都合なことに、本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬は保護されていない、または保護された−ＯＨ、−ＳＨ、−ＮＨ₂を使用することができるいかなるオリゴヌクレオチド合成法―オリゴヌクレオチド合成のために最も広く用いられるカップリング化学であるホスフォルアミダイトを用いる方法も含める―にも用いることができる。しかし、その他のカップリング化学、例えばＨ−ホスフォネート化学［米国特許第４，９５９，４６３号、フレーラー（Froehler,B.C．）ら、核酸研究１４巻、５３９９ページ（１９８６）］およびトリエステル化学［ステック（Stec,W.J．）ら、テトラヘドロンレターズ、２６巻、２１９１ページ（１９８５）、ガロ（Gallo,K.O.）ら、核酸研究１４巻、７４０６ページ（１９８６）、ガイト、オリゴヌクレオチド合成：実際的アプローチ、ＩＲＬプレス（１９８４）］も同様に使用に適する。こうして種々の種類の核酸がオリゴヌクレオチド合成に用いられる。ＤＮＡ、ＲＮＡ、オリゴヌクレオシドメチルホスフォネート類［アガルワル（Agarwal.S）＆グッドチャイルド（Goodchild,J）、テトラヘドロンレターズ２８巻、３５３９ページ（１９８７）］、オリゴヌクレオシドホスフォロチオエート類［ビューケイジら、J.Am.Chem.Soc.１１２巻、１２５３ページ（１９９０）］、オリゴヌクレオシドホスフォロジチオエート類［ダール（Dahr,O）＆ジャーゲイド（Bjergade.K．）核酸研究１９巻、５８４３ページ（１９９１）］、環状オリゴヌクレオチド類［クール（Koool,E.T.）およびワング（Wang S．）、核酸研究２２巻、２３２６ページ（１９９４）、クールら、J.Amer.Chem.Soc.１１５巻、３６０ページ、（１９９３）］、２’−ＯＭｅＲＮＡ［スプロート（Sproat,B.S．）ら、核酸研究１８巻、４１ページ（１９８９）］、およびペプチド核酸含有生成物［ニールセン（Nielsen,P.E.）ら、Bioconjugate Chem．５巻、３ページ（１９９４）］またはモルフォリン型バックボーン改質核酸［スターチャク（Stirchak）ら、核酸研究１７巻６１２９ページ（１９８９）、米国特許第５，０３４，５０６号］。ここに記載の方法による固体支持体上の合成は、固体支持体につながれたオリゴヌクレオチドを生成する選択を提供する。支持体につながれたオリゴヌクレオチドは種々の用途、例えばＤＮＡ親和性抽出および逆ブロットハイブリッド形成などに使用できる。一アプローチにおいてオリゴヌクレオチド合成の終了時に固体支持体を室温でメチルアミンで約１時間処理して、ヌクレオシドに含まれるプリンおよびピリミジンの複素環アミノ基から保護基を除去する。この処理はごく少量のオリゴヌクレオチドを固体支持体から解放し、大部分のオリゴヌクレオチドはそのままに固体支持体上に残る。これはまだ固体支持体に付着結合している生物学的活性オリゴヌクレオチドを提供する。もう一つのアプローチにおいて、隣接ヒドロキシルをシリルなどの基によって保護する。このような系においては、オリゴヌクレオチドは例えばＣＨ₃ＮＨ₂などで処理した後も支持体に結合したまま留まる。しかしシリル基は例えばテトラブチルアンモニウムフルオライドによっては除去され、ヒドロキシルを遊離することができる。塩基性条件下では離脱したヒドロキシルは隣接したホスフェートを攻撃し、こうしてＤＮＡを固体支持体から放出する。本発明のその他の面により、固体支持体からオリゴヌクレオチドを切り離す方法およびオリゴヌクレオチドの合成に用いられた固体支持体からそのオリゴヌクレオチドを離脱させるために有用な試薬が提供される。好ましくは本発明の開裂試薬および開裂方法は、ビシナルジオール対またはその官能基同等物の１つのヒドロキシル又はその同等物などからヌクレオシドの段階的付加によってオリゴヌクレオチドを合成する、オリゴヌクレオチド合成系に応用できる。最も好ましいのは、そのオリゴヌクレオチド試薬が、本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬を用いて合成したオリゴヌクレオチドの開裂に利用できることである。しかしながら、本発明の方法および開裂試薬は、エステル結合およびホスフェート結合によって固体支持体に付着したオリゴヌクレオチド類の開裂にも同様に有用である。特に、本発明の開裂方法は、オリゴヌクレオチドを担う固体支持体と、第三アミン類と第二アミン類とからなる群から選択されるアミンと、水酸化アンモニウムと第一アミンとからなる群から選択される塩基との混合物を含む本発明の開裂試薬、とを接触させることを含んでなる。最も好ましい開裂試薬はトリメチルアミンとメチルアミンとの溶液である。本発明の実施に適したその他の第二および第三アミン類は種々のアミン（高いｐＫａをもつ塩基）、例えばトリエチルアミン、ｎ −プロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジンおよびＮ−メチルピロリジンなどを含める。好ましい第三アミン類はトリメチルアミン、トリエチルアミン、Ｎ−メチルピロリジン、およびジイソプロピルエチルアミンを含める。下に示すように、開裂試薬中の水酸化アンモニウムまたは第一アミンの量、および第二アミンまた第三アミンの量はかなり変動し得る。例えば、好ましい開裂試薬において、第二アミンまたは第三アミンに対するメチルアミンまたは水酸化アンモニウムの比は約１：１００〜約１００：１の範囲内である。好ましい濃度比および構成成分は、メチルアミン水を少なくとも９部対アンモニアより大きい塩基性をもつ有機塩基１部、である。最も好ましい開裂試薬は、４０ｗｔ％メチルアミン水１部対３〜２５ｗｔ％トリメチルアミン１部、である。（当業者は、メチルアミンおよびトリメチルアミンが標準温度および圧力では気体であり、それらの典型的利用可能性は水溶液の形であることを認めている。典型的メチルアミン水は４０ｗｔ％メチルアミンで、トリメチルアミンの典型的濃度は２３〜２５ｗｔ％の範囲である。本発明の範囲で用いられる、メチルアミンおよびトリメチルアミンの１：１ｖ／ｖ溶液という言い方は、４０ｗｔ％メチルアミンと約２４ｗｔ％トリメチルアミン溶液の１：１ｖ／ｖ溶液を指す。）さらに開裂反応混合物中に無機塩を含み、開裂速度を高めることも本発明の範囲内と考えられる。そのような塩は典型的にはＬｉまたはＮａの塩であるが、その他のＭｎおよびＭｇなどのカチオン類も適する。０．５ＭＬｉＣｌを１：１メチルアミン：トリメチルアミンの開裂試薬に用いるとき、６５℃、１５分後に開裂されるオリゴヌクレオチド量は、約４５％（ＬｉＣｌの存在しないとき）から約６５分に増加することが認められている。本発明によると、固体支持体からのオリゴヌクレオチドの開裂速度は固体支持体とオリゴヌクレオチド合成部位との結合の性質によって影響を受ける。より詳細に述べるならば、固体支持体にエステル結合によって結合したビシナル部位で合成されたオリゴヌクレオチドに関係する開裂反応は、先ず最初のエステル結合の加水分解と、その後のビシナル部位からのオリゴヌクレオチドの開裂を含む。ビシナル−ジオール基を含む結合基を固体支持体に付着させる脂肪族エステル結合の使用に対して、ホスフォルアミデート結合の使用は開裂速度を容易により速くする。エステル結合の場合（デベアらが記載したように）、エステルは最初に約５分間で加水分解される。この結果オリゴヌクレオチドを結合基を含んで固体支持体から離脱する。結合基をオリゴヌクレオチドから分離するには、その後６５℃、約４時間のインキュベーションを必要とする。本発明によるホスフォルアミデート結合を有するオリゴヌクレオチド合成試薬を利用する場合、オリゴヌクレオチドはビシナル反応部位から離脱され、ホスフォルアミデート結合はその支持体にまだ付着しそのままである。この開裂反応は１：１ｖ／ｖメチルアミン／トリメチルアミン開裂試薬を用いて（上記のように）６５℃約９０分間で完了する。かなりの量のオリゴヌクレオチドが実質的に短時間内にその結合から離脱する。すなわち、約６０％のオリゴヌクレオチドが１５分間の反応時間後離脱する。これは、結合基のホスフォルアミデート基が核酸からのビシナル−ジオール系の開裂を促進することを示唆する。エステル結合を介して固体支持体に付着結合したビシナル−ジオール系からのオリゴヌクレオチドの開裂を調べると、濃アンモニアを６５℃で用いると、２４時間ものインキュベーション時間が必要であることが認められ、これは商業上は好ましくない長い時間である。メチルアミン／アンモニアを用いたとき、開裂時間は１２時間に短縮された。しかしその時間短縮は、メチルアミンの反応性に基づいて期待した程には大きくない。メチルアミンはその求核性のためにエステルを加水分解させるにはアンモニアより約１０倍も反応性であることが報告されている［レディー（Reddy,M.P.）ら、テトラヘドロンレターズ３５巻、４３１１（１９９４）；米国特許第５，３４８，８６８号］。メチルアミンは速度の約２倍の加速を示したに過ぎないから、メチルアミンは強い求核剤としてでなく、単にアンモニアより強い塩基として作用しているらしいと考えられる。これは、ビシナル−ジオール系の１つのヒドロキシルを活性化して隣接ヒドロキシルを攻撃するためには、より強い塩基が必要であることを示唆する。よって、種々の比較的強い有機塩基（高いｐＫａを有する塩基類）、例えばトリメチルアミン、トリエチルアミン、ｎ−プロピルアミン、ジイソプロピルアミン、ジイソプロピルエチルアミン、ジメチルアミン、ジエチルアミン、ピペリジン、Ｎ−メチルピペリジンおよびＮ−メチルピロリジンを、メチルアミンと１：１混合物として用いた。メチルアミンを用いてオリゴヌクレオチドの複素環アミノ基から保護基を除去し、合成されるオリゴヌクレオチドのヌクレオシドのホスフェート保護基を除去した。これらの典型的組成物を用いて、開裂時間をどうにか３時間〜７時間の間に減らすことができた。本発明の方法はオリゴヌクレオチド合成に用いられるほとんどすべての種類のビシナル−ジオールまたは同等の系からオリゴヌクレオチドを開裂するために適する。このような系は下記の一般式によって、表わされる（式中、Ｓは固体支持体であり、Ａは結合基、ＸおよびＹは−ＯＨ、−ＳＨ、および−ＮＨ₂からなる群から独立に選択され、Ｒ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹はオリゴヌクレオチド合成反応を妨害しない置換基である。当業者は、ある条件下のアミノまたはチオール基が、より大きい安定性を提供しおよび／または固体支持体から核酸をより速く遊離させる観点から好都合であることを認識している。好適系においてＲ⁹、Ｒ¹⁰およびＲ¹¹の２つが一緒になって、（ＸおよびＹ置換基を担う炭素と組合って）環系を形成する単一部分を構成する。例えば開裂速度はグリセロール系よりウリジン系の方が速い、それは多分グリセロールＣ−Ｃ結合周囲の自由回転（それは環状ホスフェートを形成しにくくする）によるものである。好適系（例えばウリジンを含むもの）の場合には、ヒドロキシルはｃｉｓ配置に固定されていて、それは環状ホスフェートに導きやすい。非常に種々様々のその他のビシナル−ジオール系（例えばジヒドロキシシクロペンタン、ジヒドロキシシクロヘキサンおよびアンヒドロエリトリトール）も適する。当業者は、本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬またはその他の有効な固体支持体系のビシナル位置のブロッキング部分は、本発明の試薬を用いる全体的開裂時間に影響しないことを認識している。すなわち、開裂時間はその基が例えばアセチル基で保護されるかまたはベンゾイル基で保護されるかには関係しない。これはさらに、エステル加水分解（すなわち保護基のヒドロキシルからの除去）が速度非制限的な速い段階であり、一方離脱したヒドロキシの、合成オリゴヌクレオチドの隣接リンへの攻撃は速度制限的なより緩徐な段階である。本発明は添付の例を参照してより良く理解される。これらの例は説明の目的で提供されるものであり、ここに添付のクレームにおいて定義される本発明の範囲を決して制限するものではない。例例１２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル −ホスフォルアミダイトの合成下記の例は本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬を製造するために適したホスフォルアミダイト試薬の合成を説明する。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４、４’− ジメトキシトリチル）−ウリジン（０．６５ｇ、１．１ｍｍｏｌ）をピリジン、トルエンおよびＴＨＦと共に次々と同時蒸発することによって乾燥した。乾燥残渣を乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解し、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８５ｍｌ、４ｍｍｏｌ）を加え、その後β−シアノ−エチルモノクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト（０．５ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を、室温でアルゴン下で一定に撹拌し、注射器を用いて５分間にわたって滴下して加える。さらに６０分撹拌後、反応混合物を蒸発乾固し、残渣を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し、１０％ＮａＨＣＯ₃溶液で洗い（２×５０ｍｌ）、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧下で除去した後、残渣をシリカゲル（あらかじめ１００〜１２０℃に加熱した）カラムクロマトグラフィーを用いて精製した。カラムに酢酸エチル／ジイソプロピルアミン（９５／５ｖ／ｖ）中予備加熱したシリカゲルを詰め、酢酸エチルで溶出した。生成物を含むフラクションを集め、減圧下で蒸発し、高真空を用いて乾燥すると標題の化合物が白色固体として得られた（０．６ｇ、６９％収率）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ、ＣＤＣｌ₃中、次のようである：δ１．１９（ｍ、１２Ｈ、２ＣＨ（ＣＨ ₃）₂）、１．９７（ｄ、３Ｈ、ＣＯＣＨ ₃）、２．４６（ｍ、４Ｈ、ＣＨ₂ＣＨ ₂ＣＮ）、３．６３（ｍ、４Ｈ、Ｃ₅、ＣＨ ₂および２×ＣＨ（ＣＨ ₃）₂）、３．７７（ｄ、６Ｈ、２×ＯＣＨ ₃）、４．１３（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・Ｈ）、４．２９（ｍ、１Ｈ、Ｃ₃・Ｈ）、５．０（ｍ、１Ｈ、Ｃ₂・Ｈ）、５．６９（ｍ、１Ｈ、Ｃ₁・Ｈ）、６．５０（ｍ、１Ｈ、Ｃ₅・Ｈ）および６．７５−７．７２（ｍ、１４Ｈ、Ｃ₆ ＨおよびＤＭＴの芳香族プロトン）。ＣＤＣｌ₃中の³¹ｐ−ＮＭＲデータは次のようであった：δ１４７．９８および１４８．５６ｐｐｍ。例２２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメキシトリチル） −２’−デオキシウリジン−５’−スクシネーヒドロキシル／アミノ類似体）の合成下記は、本発明の開裂試薬を用いて開裂することのできるオリゴヌクレオチドの作成のために利用できる固体支持体の製造に適したスクシネートの合成を説明する。文献の方法［モファット（J.Moffat）ら、J.Org.Chem.３６巻、２５０ページ（１９７１）；エクスタイン（F.Eckstein）ら、J.Org.Chem．４２巻、７１４ページ（１９７７）］により合成した２’−アミノ−２’−デオキシウリジン（３．１ｇ、１２．７６ｍｍｏｌ）を乾燥メタノール（２６０ｍｌ）中に懸濁し、Ｓ−エチルトリフルオロアセテート（２．５ｍｌ、１９．６７ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を室温で２時間撹拌し、それから室温で２４時間放置し、均質な透明溶液を得た。この溶液に窒素を１時間あわだてて通した。溶媒を減圧で除去すると２’−トリフルオロアセトアミド−２’−デオキシウリジン中間体が４ｇ得られ、それを精製せずに用いた。この中間体（１．５ｇ、４．６２ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンと共蒸発し（２×５０ｍｌ）、イミダゾール（０．３５ｇ、５ｍｍｏｌ）を含む乾燥ピリジン（５０ｍｌ）に溶解した。tert- ブチルジメチルシリルクロライド（０．７５ｇ、５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を減圧下で除去し、残渣をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、５％炭酸水素ナトリウム溶液（２×５０ｍｌ）で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を除去すると粗生成物が得られ、それをシリカゲル（６０ｇ）で精製した。ＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ（９８／２、ｖ／ｖ）で溶出すると５’−Ｏ−（tert- ブチルジメチルシリル）−２’−トリフルオロアセトアミド−２’−デオキシウリジンが得られた（１．６３ｇ、７８％収率）。５’−Ｏ−（tert- ブチルジメチルシリル）−２’−トリフルオロアセトアミド−２’−デオキシウリジン（１．５ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共蒸発によって（２×５０ｍｌ）乾燥し、乾燥ピリジン（５０ｍｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロライド（１．７２５ｇ、５．１ｍｍｏｌ）を撹拌下で加えた。生成した反応混合物を一晩撹拌した（１６時間）。反応混合物をメタノール（１０ｍｌ）で希釈し、溶媒を減圧下で除去した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、５％炭酸水素ナトリウム（１×１００ｍｌ）、ブライン（１×１００ｍｌ）で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去すると粗生成物が得られ、それをシリカゲルで、溶出溶媒としてＣＨ₂Ｃｌ₂−ＭｅＯＨ（９９：１、ｖ／ｖ）を用いて精製した。その生成物を含むフラクションを集め、蒸発すると２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５’−Ｏ−（tert- ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシウリジンが得られた（１．８ｇ、７２．２９％）。２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル−５’−Ｏ−（tert- ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシウリジン（１．５ｇ、１．９８ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド（２０ｍｌ）で室温で１５時間処理した。溶媒を除去し、残留物をＣＨ₂ Ｃｌ₂に溶解し、シリカゲルカラムに注入し、それをＣＨ₂Ｃｌ₂中０〜３％メタノールの４００ｍｌ部分で溶出した。所望フラクションを集め、蒸発乾固し、真空下で乾燥すると２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（０．９ｇ、７１％収率）が得られた。２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（０．６４ｇ、１ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（０．３２ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１５ｍｌ）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。ピリジンを減圧下で蒸発し、残留物を乾燥トルエンと共蒸発した（２×１０ｍｌ）。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に溶解し、室温で、速く撹拌しているヘキサン（１００ｍｌ）に入れて沈殿させた。生成物を濾取し、真空乾燥すると２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−５’−スクシネートが得られた。例３２’−トリフルオロアセタミド−３’−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル） −２’−デオキシウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトの合成下記は本発明のオリゴヌクレオチド試薬の製造に有用なホスフォルアミダイト試薬の合成を説明する。２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４ ’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（０．６４ｇ、１ｍｍｏｌ）を、ピリジン、トルエンで次々に共蒸発して乾燥し、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０．８５ｍｌ、４ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解した。この溶液に、β−シアノ−エチルモノクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト（０．５ｍｌ、２ｍｍｏｌ）を、アルゴン下で常に撹拌しながら注射器を用いて、室温で５分間にわたって滴下した。９０分間撹拌後、反応混合物を蒸発乾固し、残留物を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し、１０％ＮａＨＣＯ₃で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。減圧下で酢酸エチルを蒸発し、残留物をシリカゲル（１００〜１２０℃に予備加熱したもの）カラムクロマトグラフィーを用いて精製すると、２’−トリフルオロアセトアミド−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトが得られた。例４２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシリチル）−２’ −デオキシウリジン−５’−スクシネート（ヒドロキシル／チオール類似体）の合成下記は、本発明の開裂試薬および方法を用いてその後開裂できるオリゴヌクレオチドを合成するために用いる適したスクシネート試薬の合成を説明する。乾燥ピリジン（５０ｍｌ）中の、文献記載の方法［リース（B.Reese）ら、J.Chem.So c.、Perkin Trans １、９６９（１９９０）］によって製造した２’−デオキシ −２’−メルカプトウリジン（２．６ｇ、１０ｍｍｏｌ）を無水条件下で１，３ −ジクロロ−１，１，３，３−テトライソプロピルジシロキサン（３．１３ｍｌ、１０ｍｍｏｌ）で室温で処理した。ＴＬＣは４時間後には反応が完了することを示した。溶媒を真空除去し、残留シロップを酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解した。溶液を５％炭酸水素ナトリウム水で洗い（２×５０ｍｌ）、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、濾過した。溶媒を真空中で除去した。粗３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２’−デオキシ−２’−メルカプトウリジンを、シリカゲルカラムで、ＣＨ₂Ｃｌ₂を溶出溶媒として用いて精製した。３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２ ’−デオキシ−２’−メルカプト−ウリジン（５ｍｍｏｌ）をＤＭＡＰ（２５０ｇ、２ｍｍｏｌ）を含む乾燥ピリジン（２０ｍｌ）に溶解した。塩化ベンゾイル（１０ｍｍｏｌ）を加え、生成した混合物を室温で５時間撹拌した。溶媒を真空中で除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）に溶解し、５％炭酸水素ナトリウム水およびブラインで洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去し、粗生成物３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル） −２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジンをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。３’，５’−Ｏ−（テトライソプロピルジシロキサン−１，３−ジイル）−２ ’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジン（３．２５ｍｍｏｌ）をテトラヒドロフラン中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド２５ｍｌに溶解した。溶媒を減圧下で除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に取り、シリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製し、２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジンを得た。２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジン（２．７５ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共蒸発によって（２×２０ｍｌ）乾燥し、イミダゾール（５ｍｍｏｌ）を含む乾燥ピリジン（５０ｍｌ）に溶解した。tert−ブチルジメチルシリルクロライド（５ｍｍｏｌ）を撹拌しながら加えた。反応混合物を室温で１６時間撹拌した。溶媒を真空下で除去し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、５％炭酸水素ナトリウム溶液で洗い（２×５０ｍｌ）、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を除去すると粗生成物５’−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジンが得られ、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。５’−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジン（２．０９ｍｍｏｌ）を乾燥ピリジンとの共蒸発によって（２×２０ｍｌ）乾燥し、乾燥ピリジン（２５ｍｌ）に溶解した。ジメトキシトリチルクロライド（３ｍｍｏｌ）を撹拌下で加えた。反応混合物を室温で一晩（１６時間）撹拌し、それからメタノール（１０ｍｌ）で希釈した。溶媒を真空下で除去した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１００ｍｌ）に溶解し、５％炭酸水素ナトリウム（２×５０ｍｌ）およびブライン（５０ｍｌ）で洗い、無水硫酸ナトリウム上で乾燥した。溶媒を除去すると粗生成物５’−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシ−２’ −（ベンゾイルチオ）ウリジンが得られ、それをシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製した。５’−Ｏ−（tert−ブチルジメチルシリル）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシ−２’−（ベンゾイルチオ）ウリジン（１．４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド２０ｍｌで室温で１６時間処理した。溶媒を除去し、残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーで精製すると、２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’− ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジンが得られた。２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）− ２’−デオキシウリジン（１ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（２．５５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（２．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（２０ｍｌ）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。ピリジンを減圧下で蒸発し、残留物を乾燥トルエンで共蒸発した（２×１００ｍｌ）。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１５ｍｌ）に溶解し、室温で速やかに撹拌しているヘキサン（１００ｍｌ）中に入れて沈殿させた。生成物を濾取し、真空下で乾燥すると２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’− ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−５’−スクシネートが得られた。例５２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシリチル）−２’ −デオキシウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）−β−シアノエチルホスフォルアミダイトの合成下記は本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬の製造に有用なホスフォルアミダイト試薬の合成を説明する。２’−（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’ −ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン（１ｍｍｏｌ）をピリジンおよびトルエンとの連続共蒸発によって乾燥し、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルエチルアミン（４ｍｍｏｌ）を含む乾燥ＴＨＦ（５ｍｌ）に溶解した。この溶液にβ− シアノ−エチルモノクロロ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト（２ｍｍｏｌ）を注射器を用いて、アルゴン下、室温で常に撹拌しながら５分間にわたって滴下した。６０分間撹拌後、反応混合物を蒸発乾固し、残留物を酢酸エチル（５０ｍｌ）に溶解し１０％炭酸水素ナトリウム溶液で洗い（２×５０ｍｌ）、有機層をＮａ₂ＳＯ₄で乾燥した。酢酸エチルを減圧下で蒸発後、残留物をシリカゲル（１００〜１２０℃で予備加熱）カラムクロマトグラフィーによって精製し、２’ −（ベンゾイルチオ）−３’−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’−デオキシウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトを得た。例６２’（３’）−Ｏ−（４、４’−ジメトキシトリチル）−２’（３’）−Ｏ−アセチルウリジン−５’−スクシネートの合成ウリジン（１０ｇ、４１ｍｍｏｌ）、トルエン−ｐ−スルフォン酸１水和物（２ｇ、０．５ｍｍｏｌ）およびトリメチルオルトアセテートを一緒に２０℃で２０時間撹拌した。ＴＬＣは４：１の割合で２生成物を表わした。ウリジンは見いだされなかった。反応混合物をメタノール性ＭｅＯＮａでわずかに塩基性にし、濃縮して油状にし、ＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、アルミナカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物を（ＣＨ₂Ｃｌ₂：ＭｅＯＨ、９６：４、ｖ／ｖ）で溶出し、所望フラクションを集め、減圧下で蒸発すると、２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン（８．８ｇ、７１．８％収率）が無色ガラスとして得られた。ＩＲ（ＫＢｒ）：ｕ１６７０ｃｍ^-1（ｓ，環状アミドのＣ＝Ｏ）、２９００− ３６００ｃｍ^-1（ＮＨ，ＯＨ）。１Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ１．５１および１．５８（２ｓ、３Ｈ、−ＣＨ ₃ ）、３．１４および３．２９（２ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ ₃）、３．５８（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、４．０６（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・−Ｈ）、４．８９−５．１０（ｍ、２Ｈ、Ｃ₂・−ＨおよびＣ₃・−Ｈ）、５．６３（ｄ、１Ｈ、Ｃ₅−Ｈ）、５．８０および５．９５（２ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・−Ｈ）、７．７７（ｄ、１Ｈ、Ｃ₆−Ｈ）および１１．４２（ｓ、１Ｈ、−ＮＨ）。ＴＨＦ（１００ｍｌ）中２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン５．２ｇ（１８ｍｍｏｌ）にイミダゾール（４．９ｇ、４ｅｑ）を加え、その後ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリルクロライド（５．４ｇ、２ｅｑ）を加えた。生成した反応混合物を室温で一晩（１６時間）撹拌した。溶媒を除去した後、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（２００ｍｌ）に取り、ＮａＣｌ飽和溶液（２００ｍｌ）、水で洗い、Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥した。溶媒を減圧下で除去するとほぼ純粋な２’，３’−Ｏ− メトキシエチリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン（７．２ｇ、９９％収率）が半固体として得られ、それをそれ以上精製せずに次の工程に用いた。ＩＲ（Neat）：１６５０ｃｍ^-1（環状アミドのＣ＝Ｏ）、３４００−３６００ｃｍ^-1（ＮＨ，ＯＨ）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ−０．００５（ｓ、６Ｈ−Ｓｉ（ＣＨ ₃）₂）、０．８２（ｓ、９Ｈ、Ｓｉ−（ＣＨ ₃）₃）、１．５５および１．６（２ｓ、３Ｈ、ＣＨ ₃）、２．７９および２．８７（２ｓ，３Ｈ、−ＯＣＨ ₃）、３．８２（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、４．２２（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・Ｈ）、４．６５（ｍ、２Ｈ、Ｃ₂・Ｈ）、５．６４（ｄ、１Ｈ、Ｃ₅−Ｈ）、６．０（２ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・−Ｈ）、７．５０（ｄ、１Ｈ、Ｃ₆−Ｈ）および９．３５（ｂｒ、１Ｈ、ＮＨ）。２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデン−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）ウリジン８．０ｇ（２７．５８ｍｍｏｌ）に８０％酢酸水（２０ｍｌ）を加え、生成した混合物を室温で３０分間撹拌した。溶媒を蒸発後、粗残留物をシリカゲルカラムクロマトグラフィーにより、ＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（９７／３、ｖ／ｖ）を溶出溶媒として精製した。所望化合物を含むフラクションを集め、蒸発し、真空下で乾燥すると、２’，（３’）−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ウリジンが半固体として得られた（７．６ｇ、６８％収率）。ＩＲ（Neat）：ｕ１７０１ｃｍ-1（ｓ，ｂｒ，アセチル基および環状アミドのＣ＝Ｏ）。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ０．０７（ｓ、ｂｒ、６Ｈ、−Ｓｉ（ＣＨ ₃）₂ ）、０．８７（ｓ、９Ｈ、−Ｓｉ（ＣＨ ₃）₃）、２．０３および２．１０（２ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ ₃）、３．８７（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、４．３３（２ｍ、２Ｈ、Ｃ₃・ＨおよびＣ₄・Ｈ）、４．７（ｍ、１Ｈ、Ｃ₂、Ｈ）、５．６５（ｄ、１Ｈ、Ｃ₅ Ｈ）、６．０６（２ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・−Ｈ）、７．８５（ｄ、１Ｈ、Ｃ₆ Ｈ）および１０．１８（ｂｒ、ｓ１Ｈ、ＮＨ）。２’，（３’）−Ｏ−アセチル−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ウリジン（４ｇ、１０ｍｍｏｌ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）に溶解した。コリジン（４ｍｌ）を加え、その後テトラブチルアンモニウム過塩素酸（５．１３ｇ、１５ｅｑ）およびジメトキシトリチルクロライド（５．０７ｇ、１．５ｅｑ）を加えた。反応混合物を一晩撹拌し（１６時間）、５％ＮａＨＣＯ₃水２×５０ｍｌおよび水２ ×５０ｍｌで逐次洗った。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄で乾燥し、蒸発した。残留物をシリカゲルクロマトグラフィーで精製した。カラムに１％ＴＥＡ／ＣＨ₂Ｃｌ₂ を詰め、生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂で溶出した。所望フラクションを集め、蒸発すると２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ウリジン（４．８ｇ、６８％収率）が得られた。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ０．６（ｍ、６Ｈ、−Ｓｉ（ＣＨ ₃）₂）、０．８８（２ｓ、９Ｈ、Ｓｉ（ＣＨ ₃）₃）、２．２２（２ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ ₃）、３．５２（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、３．８５（２ｓ、６Ｈ、２×ＯＣＨ ₃）、４．０７（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・Ｈ）、４．２６（ｍ、１Ｈ、Ｃ₃・Ｈ）、５．０８（ｍ、１Ｈ、Ｃ₂・Ｈ）、５．７１（２ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・−Ｈ）、６．５９（２ｄ、１Ｈ、Ｃ₅ Ｈ）、６．８０−７．８３（ｍ、１３Ｈ、芳香族Ｈ）および８．７４（ｄ、１Ｈ、Ｃ₆ Ｈ）。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−５’−Ｏ−（ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル）−ウリジン（１．５ｇ、２．１４ｍｍｏｌ）をＴＨＦ中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライド（１５ｍｌ）に溶解し、反応混合物を室温で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発し、残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に取り、シリカゲルカラムに注入し、それをＣＨ₂Ｃｌ₂中０〜３％メタノール４００ｍｌ部分で溶出した。所望フラクションを集め、蒸発乾固し、真空下で乾燥すると、２ ’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン（１ｇ、７９．４％収率）が得られた。 ¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：ｄ２．０７（ｄ、３Ｈ、−ＣＯＣＨ ₃）、３．６１（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、３．８３（ｄ、６Ｈ、２×ＯＣＨ ₃）、３．８９（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・Ｈ）、４．４４（ｍ、１Ｈ、Ｃ₃・Ｈ）、４．９１（ｍ、１Ｈ、Ｃ₂・Ｈ）、５．６６（ｍ、Ｃ₁・Ｈ）、６．０３（ｍ、１Ｈ、Ｃ₅ Ｈ）、６．７５−７．４３（ｍ、１３Ｈ、芳香族Ｈ）および７．４９（ｍ、１Ｈ、Ｃ₆ Ｈ）。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン（０．５９ｇ、１ｍｍｏｌ）、無水コハク酸（０．３２ｇ、２．５５ｍｍｏｌ）およびＤＭＡＰ（０．７ｇ、２．５ｍｍｏｌ）を無水ピリジン（１０ｍｌ）に溶解し、室温で２４時間撹拌した。ピリジンを減圧下で蒸発し、残留物を乾燥トルエン（２×１０ｍｌ）で共蒸発した。ゴム状残留物をＣＨ₂ Ｃｌ₂（５０ｍｌ）に溶解し、飽和ＮａＣｌ溶液（２×４０ｍｌ）、および水（４０ｍｌ）で洗った。有機層を無水Ｎａ₂ＳＯ₄上で乾燥し、その後蒸発した。残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に溶解し、室温で、速やかな撹拌下のヘキサン（１００ｍｌ）に入れて沈殿させた。生成物を濾過し、真空下で乾燥すると２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’（３’）−Ｏ−アセチルウリジン−５’−スクシネート（０．４ｇ、６０％収率）が得られた。融点：１００−１１５℃（分解）。¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ ２．１０（ｄ、３Ｈ、ＣＯＣＨ ₃）、２．５０（ｍ、４Ｈ、ＣＯＣＨ ₂ＣＨ ₂ＣＯ）、２．９６（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・ＣＨ ₂）、３．７５（ｄ、６Ｈ、２×ＯＣＨ ₃）、４．１０（ｍ、２Ｈ、Ｃ₄・ＨおよびＣ₃・Ｈ）、４．２３（ｍ、１Ｈ、Ｃ₂・Ｈ）、５．６６（ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・Ｈ）、６．３２（ｄ、１Ｈ、Ｃ₅ Ｈ）、６．７４−７．４１（ｍ、１４Ｈ、ＤＭＴ基およびＣ₆ Ｈ）および９．５０（ｓ、１Ｈ、ＣＯＯＨ）。例７ヒドロキシ誘導体化固体支持体の作成下記は、オリゴヌクレオチド合成試薬の生成に適した試薬とその後反応するための固体支持体の製法を説明する。トヨパールＡＦ−アミノ樹脂（１ｇ、アミノ＝３００μｍｏｌｅｓ／ｇ、トーソーハース（TosoHaas）、フィラデルフィア、ＰＡ）の乾燥ＤＭＦ４ｍｌ懸濁液に文献記載の方法［ハラランビディス（J.Harala mbidis）ら、核酸研究１８巻、４９３ページ（１９８９）］によって製造したｐ −ニトロフェノール−４−［ジ−（ｐ−メトキシフェニル）フェニルメチロキシ］−ブチレート（２．０ｇ、０．４Ｍ）の４ｍｌジオキサン溶液を加え、その後ＴＥＡ（２ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で一晩（１６時間）振とうした。固体支持体を濾過し、ＤＭＦ（５ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×５ｍｌ）、ＣＨ₂Ｃｌ₂ （２×５ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）で洗い、真空下で３時間乾燥した。その樹脂を乾燥ピリジン１０ｍｌに懸濁した。ＤＭＡＰ（２５０ｍｇ、０．２Ｍ）を加え、その後Ａｃ₂Ｏ（２．５ｍｌ、２．５Ｍ）を加えて未反応アミノ基をキャップし、反応混合物を室温で５時間振とうした。樹脂を濾過し、乾燥ピリジン（１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗い、真空中で２時間乾燥した。固体支持体のヒドロキシ基担持は、測定（Ａ₅₀₀ｎｍ）し、放出されたジメトキシトリチルカチオン量を計算することによって、２００〜２５０μｍｏｌｅｓ／ｇの範囲であることがわかった。同様な方法を用いてＣＰＧ−ＬＣＡＡおよびアミノプロピル−ＣＰＧ［セリガー（H.Seliger）およびグロガー（Groger）、ヌクレオシドおよびヌクレオチド７巻、７７３ページ（１９８８）］樹脂をヒドロキシル基で官能性にした。例８ＣＰＧ−固体支持体のホスフェート結合を介するウリジン部分による誘導体化下記は本発明によって固体支持体から開裂されるオリゴヌクレオチドの合成に用いることができるＣＰＧ−固体支持体の製法を説明する。例７からのＣＰＧ− ＯＨ固体支持体（５００ｍｇ、遊離ＯＨ＝２７ｍｍｏｌｅｓ／ｇ）を乾燥アセトニトリル（３ｍｌ）に懸濁した。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）− Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−５’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスフォルアミダイト（３９．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）を加え、それからＣＨ₃ＣＮ中０．５Ｍテトラゾール溶液２ｍｌを加えた。反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、乾燥ＣＨ₃ＣＮ（２×３ｍｌ）で洗い、Ｉ₂溶液（ＴＨＦ／ピリジン／水−９３：５：２中０．３％Ｉ₂）３ｍｌに懸濁し、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。固体支持体を濾過し、ＴＨＦ（２×５ｍｌ）およびＣＨ₃ＣＮ（２×５ｍｌ）で洗い、１〜２時間真空乾燥した。その固体支持体にＴＨＦ中１７％Ｎ−メチルイミダゾール３ｍｌを加え、それから１０％Ａｃ₂Ｏ、１０％ルチジン、８０％ＴＨＦｖ／ｖを加えた。反応混合物を室温で３０分間撹拌した。固体支持体を濾過し、ＣＨ₃ＣＮ（２×５ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。ウリジン部分の担持は、遊離するジメトキシトリチルカチオン量の測定（Ａ₅₀₀ｎｍ）によって、２０．２μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例９トーヨーパール（フラクトゲル６５Ｍ）樹脂のホスフェート結合を介するウリジン部分による誘導体化例７からのトーヨーパール（フラクトゲル６５Ｍ）樹脂（１ｇ、遊離ＯＨ＝２００ｍｍｏｌｅｓ／ｇ）を乾燥ＣＨ₃ＣＮ（６ｍｌ）に懸濁し、２’（３’）− Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−５’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−ホスフォルアミダイト（３９．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）を加え、その後ＣＨ₃ＣＮ中０．５Ｍテトラゾール溶液２ｍｌを加え、反応混合物を室温で３０分間撹拌した。固体支持体を濾過し、乾燥ＣＨ₃ＣＮ（２×６ｍｌ）で洗い、それからＩ₂溶液（ＴＨＦ／ピリジン／水−９３：５：２中０．３％Ｉ₂）６ｍｌに懸濁し、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＴＨＦ（２×６ｍｌ）およびＣＨ₃ＣＮ（２×５ｍｌ）で洗い、２時間真空乾燥した。その固体支持体に（ＴＨＦ中１７％Ｎ−メチルイミダゾール）５ｍｌを加え、それから（１０％Ａｃ₂Ｏ、１０％ルチジン、８０％ＴＨＦ、ｖ／ｖ）５ｍｌを加え、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。ウリジン部分の担持は、遊離したジメトキシトリチルカチオン量の測定（Ａ₅₀₀ｎｍ）によって、４５〜５５μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１０テンタゲル樹脂の、ホスフェート結合を介するウリジン部分による誘導体化テンタゲル−ヒドロキシ樹脂（５００ｍｇ、遊離ＯＨ＝２００ｍｍｏｌｅｓ／ｇ）を例８および９に記載の方法により、ウリジン部分で誘導体化した。ウリジン部分の担持は遊離したジメトキシトリチルカチオン量の測定（Ａ₅₀₀ｎｍ）によって１７．６μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１１トーヨーパール（フラクトゲルＡＦ−アミノ６５Ｍ）樹脂の、ホスホルアミデートリンカーを介するるウリジンによる誘導体化トーヨーパール−ＡＦ−アミノ−６５−樹脂（１ｇ、３００ｍｍｏｌｅｓ／ｇアミノ基、トーソーハース、フィラデルフィア、ＰＡ）を乾燥ＣＨ₃ＣＮ（６ｍｌ）に懸濁した。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−５ ’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスフォルアミダイト（３９．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）を加え、その後ＣＨ₃ＣＮ中０．５Ｍテトラゾール溶液２ｍｌを加え、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、乾燥ＣＨ₃ＣＮ（２×６ｍｌ）で洗い、Ｉ₂溶液（ＴＨＦ／ピリジン／水−９３：５：２中０．３％Ｉ₂）６ｍｌに懸濁し、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＴＨＦ（２×６ｍｌ）およびＣＨ₃ ＣＮ（２×５ｍｌ）で洗い、２時間真空乾燥した。その固体支持体にＴＨＦ中１７％Ｎ−メチルイミダゾール５ｍｌを加え、それから１０％Ａｃ₂Ｏ、１０％ルチジン、８０％ＴＨＦ、ｖ／ｖ、を加え、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。樹脂のウリジン部分担持を、ジクロロメタン中２．５％ジクロロ酢酸溶液の少部分におけるトリチル放出を分光光度法で５００ｎｍで測定することによって算出した。この例では担持は４５μｍｏｌｅｓ／ｇであった。例１２ＣＰＧ−ＬＣＡＡ樹脂のホスフォルアミダイトリンカーを介するウリジン部分による誘導体化ＣＰＧ−ＬＣＡＡ樹脂（シグマ、５００ｍｇ、^〜６０μｍｏｌｅｓ／ｇアミノ基）を乾燥ＣＨ₃ＣＮ（３ｍｌ）に懸濁した。２’（３’）−Ｏ−アセチル−２ ’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−ウリジン−５’−Ｏ−（β−シアノエチル−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−ホスフォルアミダイト（３９．４ｍｇ、０．０５ｍｍｏｌｅ）を加え、その後ＣＨ₃ＣＮ中０．５Ｍテトラゾール溶液２ｍｌを加え、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、乾燥ＣＨ₃ＣＮ（２×３ｍｌ）で洗い、Ｉ₂溶液（ＴＨＦ／ピリジン／水−９３：５：２中０．３％Ｉ₂）５ｍｌに懸濁し、その反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＴＨＦ（２×５ｍｌ）およびＣＨ₃ＣＮ（２×５ｍｌ）で洗い、２時間真空乾燥した。その固体支持体に、ＴＨＦ中１７％Ｎ−メチルイミダゾール３ｍｌを加え、それから１０％Ａｃ₂Ｏ、１０％ルチジン、８０％ＴＨＦ、ｖ／ｖ、の溶液３ｍｌを加え、反応混合物を室温で３０分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＣＨ₃ ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。樹脂のウリジン部分の担持は、離脱したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍによって測定して８．１μｍｏｌｅｓ／ｇであった。例１３トーヨーパール（フラクトゲル）ＡＦ−アミノ−６５Ｍ樹脂のコハク酸エステル結合を介するウリジン部分による誘導体化トーヨーパール（フラクトゲル）ＡＦ−アミノ−６５０Ｍ（アミノ基＝３００ μｍｍｏｌｅｓ／ｇ）を、無水コハク酸（１ｇ、１Ｍ）およびＮ−メチルイミダゾール（１ｍｌ）を含む乾燥ピリジン１０ｍｌに懸濁した。混合物を室温で１６時間放置した。濾過後、支持体を水性ピリジン、乾燥ピリジン（１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。ニンヒドリン試験で遊離アミノ基は陰性であった。スクシニル化支持体（１ｇ）を、２’，３’−Ｏ−メトキシエチリジンウリジン（０．９ｇ、３．１２ｍｍｏｌｅ）、ＤＭＡＰ（０．３ｇ、２．４６ｍｍｏｌｅ）およびＤＣＣ（２．１４ｇ、１０．３７ｍｍｏｌｅ）を含む乾燥ピリジン（１０ｍｌ）に懸濁し、その反応混合物を室温で４８時間振とうした。この溶液にｐ−ニトロフェノール（１．８ｇ、１２．１８６ｍｍｏｌｅ）を加え、さらに２０時間振とうを続けた。モルフォリン（１ｍｌ）の添加によって反応を停止し、さらに２時間振とうを続けた。この工程は未反応カルボン酸のキャッピングに必要である。固体支持体を濾過し、ピリジン（１０ｍｌ）で洗い、ＭｅＯＨ（２× １０ｍｌ）およびジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。８０％酢酸水（１０ｍｌ）で室温で４時間処理することによって、２’，３’−オルトエステル中間体を加水分解して２’，３’−アセテート類の混合物を得た。濾過後、固体支持体をＭｅＯＨ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗い、３時間真空乾燥した。固体支持体（１ｇ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）、コリジン（０．６６ｍｌ、０．５Ｍ）を加え、その後テトラブチルアンモニウム過塩素酸塩（０．１７ｇ、０．０５Ｍ）およびジメトキシトリチルクロライド（０．１６９ｇ、０．０５Ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１時間撹拌した。固体支持体を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１０ｍｌ）、ＭｅＯＨ（２×１０ｍｌ）、ジエチルエーテル（２×１０ｍｌ）で洗い、真空下で３時間乾燥した。固体支持体のウリジン部分担持は、遊離したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍにおける測定により、２２．３５μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１４テンタゲル−アミノ樹脂のコハク酸エステルリンカーを介するウリジン部分による誘導体化例６からの２’（３’）−Ｏ−（４，４’−ジメトキシトリチル）−２’（３ ’）−Ｏ−アセチルウリジン−５’−スクシネート（６８．８ｍｇ、０．１ｍｍｏｌｅ）を、乾燥ピリジン（０．４ｍｌ）およびｐ−ニトロフェノール（１４ｍｇ、０．１ｍｍｏｌｅ）を含む乾燥ジオキサン（４ｍｌ）に溶解した。１、３ −ジシクロヘキシルカルボジイミド（ＤＣＣ）（５２ｍｇ、０．２５ｍｍｏｌｅ）を加え、その反応混合物を室温で３時間振とうした。ジシクロヘキシル尿素を濾去し、上澄液をテンタゲル−アミノ樹脂（１ｇ、ＮＨ₂基＝２２０ｍｍｏｌｅｓ／ｇ、ＲＡＰＰポリマーカンパニー、ドイツ）に加え、乾燥ＤＭＦ（４ｍｌ）に懸濁し、トリエチルアミン（２ｍｌ）を加えた。反応混合物を室温で６時間振とうした。固体支持体を濾過して取り、ＤＭＦ（２× １０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×５ｍｌ）でよく洗い、１時間真空乾燥した。固体支持体を乾燥ピリジン（１０ｍｌ）に再懸濁し、ＤＭＡＰ（２５０ｍｇ、０．２Ｍ）を加え、その後無水酢酸（２．５ｍｌ、２．５Ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１６時間振とうした。樹脂を濾取し、ＣＨ₃ＣＮ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×１０ｍｌ）で洗い、２時間真空乾燥した。樹脂のウリジン部分担持は、遊離したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍによる測定から、４８．８μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１５ＣＰＧ−ＬＣＡＡのコハク酸エーテルリンカーを介するウリジン部分による誘導体化ＣＰＧ（１ｇ、ＬＣＡＡ、シグマ、アミノ基＝６０ｍｍｏｌｅｓ／ｇ）を例１３および１４に記載の方法によってコハク酸エステルリンカーを介してウリジン部分で誘導体化した。固体支持体のウリジン担持は遊離したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍによる測定から、２０．２３μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１６トーヨーパール（フラクトゲル）６５Ｆ−樹脂の、コハク酸エステルリンカーを介するウリジン部分による誘導体化フラクトゲル６５Ｆ−樹脂（５ｇ乾燥重量、トーソーハース、フィラデルフィア、ＰＡ）を乾燥ＣＨ₃ＣＮ（５０ｍｌ）に懸濁した。１’，１’−カルボニルジイミダゾール（８．１ｇ、１Ｍ溶液を作るため）を加え、反応混合物を室温で４時間振とうした。固体支持体を焼結ガラス漏斗で濾過し、乾燥ＣＨ₃ＣＮ（２×５０ｍｌ）で洗い、それから乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（５０ｍｌ）に再懸濁した。１，１２−ジアミノドデカン（１０ｇ、１Ｍ溶液を作るため）を加え、生成した混合物を室温で一晩（１６〜２０時間）振とうした。ｎ−プロピルアミン（４．１ｍｌ、１Ｍ溶液を作るため）をその混合物に加え、溶液をさらに１時間振とうした。樹脂を濾過し、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（５×５０ｍｌ）、アセトン（５×５０ｍｌ）およびＣＨ₃ＣＮ（５×２０ｍｌ）で逐次洗浄し、最後の洗浄濾液は陰性のニンヒドリン試験を示した。樹脂をその後ジエチルエーテルで洗い（２×２０ｍｌ）、約３時間真空乾燥した。固体支持体のアミノ基含量は、ピクリン酸分析試験による測定によって３００〜４００μｍｏｌｅｓ／ｇの範囲であることがわかった。［スチュワート（J.M.Stewart）& ヤング（J.D.Young）、固相ペプチド合成、ピアース・ケミカル・カンパニー、１０７（１９８４）］。その後固体支持体（１ｇ）を例１３に記載の方法によって無水コハク酸と反応させた。その後スクシニル化樹脂（１ｇ）を例１３の方法によりウリジンで官能基にした。その固体支持体を例１３の方法によりジメトキシトリチルクロライドと反応させた。固体支持体のウリジン部分担持は、遊離したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍによって測定して２０〜２５ｍｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。例１７トーヨーパール（フラクトゲル）６５Ｆ−樹脂の、カルバメート（ウレタン）リンカーを介するウリジン部分による誘導体化例１６の方法により、フラクトゲル６５Ｆ樹脂（５ｇ、乾燥重量）を１，１２ −ジアミノドデカンで官能基にした。その固体支持体のアミノ基含量はピクリン酸分析試験によって測定して３３０μｍｏｌｅｓ／ｇであることがわかった。固体支持体（１ｇ）を乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（２０ｍｌ）に懸濁した。ｐ−ニトロフェニルクロロホルメート（４．０２ｇ、１Ｍ溶液を作るため）を加え、その後コリジン（３．９５ｍｌ、１．５Ｍ溶液を作るため）を加えた。反応混合物を室温で一晩（１６〜２０時間）振とうした。固体支持体を濾過し、乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（５×２０ｍｌ）で洗い、真空下で２時間乾燥した。固体支持体（１ｇ）をその後乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に懸濁した。２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデンウリジン（３ｇ、１Ｍ溶液を作るため）を加え、その後ＴＥＡ（１．５２ｍｌ、１Ｍ溶液を作るため）を加えた。反応混合物を室温で２４時間撹拌した。反応混合物をｎ−プロピルアミン（０．８２ｍｌ、１Ｍ溶液を作るため）の添加によって停止し、さらに１時間撹拌を続けた。固体支持体を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×１０ｍｌ）で洗い、真空下で２時間乾燥した。固体支持体を室温で４時間８０％酢酸水（１０ｍｌ）で処理することによって２’，３’ −オルトエステル中間体を加水分解すると２’，３’−アセテート類の混合物が得られた。固体支持体を濾過し、ＣＨ₃ＯＨ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（１０ｍｌ）で洗い、３時間真空乾燥した。固体支持体（１ｇ）をその後乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂（１０ｍｌ）に懸濁し、コリジン（０．６６ｍｌ、０．０５Ｍ）を加え、それからテトラブチルアンモニウム過塩素酸塩（０．１７ｇ、０．０５Ｍ）およびジメトキシトリチル塩化物（０．１６９ｇ、０．５Ｍ）を添加した。反応混合物は室温で１時間振とうした。固体支持体は濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（２×１０ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（２×１０ｍｌ）およびジエチルエーテル（２×１０ｍｌ）で洗い、真空下で３時間乾燥した。固体支持体のウリジン部分担持は遊離したジメトキシトリチルカチオンのＡ₅₀₀ｎｍによって測定して２０〜３０ｍｍｏｌｅｓ／ｇの範囲であることがわかった。例１８５１ｍｅｒの合成下記はオリゴヌクレオチドの合成および本発明の開裂試薬を用いるその後のオリゴヌクレオチド開裂を説明する。配列：（配列番号：１）のオリゴヌクレオチドを、オリゴ−１０００ＤＮＡ合成機（ベックマン・インスツルメント、ブレア、ＣＡ）および標準合成プロトコルを用いて、例１５の固体支持体上に組み立てた。最後のトリチル基を除去した後、固体支持体をＣＨ₃ＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎの溶液と室温で５分間接触させることによって、３’末端ウリジン部分を有するオリゴマーを固体支持体から開裂した。その溶液は１：１、ｖ／ｖ、の４０％メチルアミン水および２４ｗｔ％トリメチルアミン水であった。その開裂オリゴヌクレオチドを固体支持体から除去した後の、その開裂オリゴヌクレオチドを含むメチルアミン／トリメチルアミン溶液を６５℃で３時間加熱した。スピード真空濃縮器を用いて試薬を蒸発乾固した。残留物を二回蒸留水（２００ｍｌ）に溶解し、生成物を毛細管ゲル電気泳動法によって分析した。Ｐ／ＡＣＥ電気泳動図は高品質の生成物を表わした。それはその溶出時間を従来のＣＰＧ−Ａ支持体上で独立に合成した同一配列のそれと比較することによって同定された。例１９１０１ｍｅｒおよび３５ｍｅｒの合成下記は本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬および本発明の開裂試薬を用いるオリゴヌクレオチドの合成を説明する。配列（配列番号：２）のオリゴヌクレオチドを、オリゴ１０００ＤＮＡ合成機および標準合成プロトコルを用いて、例１１の固体支持体上に組み立てた。最後のトリチル基を除去した後、固体支持体を乾燥し、^〜３００ｍｌのＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（例１８に記載したように１：１、ｖ／ｖ）を含むスクリューキャップバイアルに入れ、６５℃（湯浴）で９０分間加熱した。試薬（ＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ）を他のバイアルに注意深くデカントし、スピード真空濃縮器を用いて蒸発乾固した。残留物を２回蒸留水（５００ｍｌ）に溶解し、総Ａ₂₆₀ｎｍを計算した。生成物を毛細管ゲル電気泳動法によって分析した。Ｐ／ＡＣＥ電気泳動図は良質の生成物を表わした。この生成物は、その溶出時間を、通常のＣＰＧ−Ｔ支持体上で独立に合成した同一配列のそれと比較することによって同定された。配列（配列番号：３）を有する３５ｍｅｒを例１１の固体支持体上で合成し、毛細管電気泳動法および逆相ＨＰＬＣによって、５’−ＤＭＴオリゴヌクレオチドとして分析した。例２０１０ｍｅｒオリゴリボヌクレオチド（ＲＮＡ）の合成例１５に記載のように誘導体化したＣＰＧ支持体０．２μｍｏｌｅ（２０μｍｏｌｓ／ｇを担持）をカラムに入れ、１０ｍｅｒの配列（配列番号：４）をオリゴ−１０００自動合成機でスカーリング（Scaringe）らの方法（核酸研究、１８巻、５４３３−５４１１ページ、１９９０）を用いて合成した。ＲＮＡ合成のカップリング時間は１２分であった。最後のＤＭＴ基はオリゴヌクレオチドに残った。合成後、ＲＮＡの保護基を除去し、ＣＨ₃ＮＨ₂／（ＣＨ₃）₃Ｎの１：１、ｖ／ｖ、溶液６５℃で４時間を用いて支持体から開裂した。１：１溶液は、４０％ｗ／ｖメチルアミン水と２３〜２５ｗｔ％トリメチルアミン水とを用いて作った。２’−保護基の除去は、ＴＨＦ中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを用いて室温で１５時間行った。オリゴリボヌクレオチドをＮａｐ−１０カラム（ファルマシアＬＫＢビオテクノロジー、ピスカタウェイ（Piscataway）、ＮＪ）を用いて脱塩した。ＨＰＬＣ精製後、まだＤＭＴ基が付いている生成物は、市販のＣＰＧ支持体を用いて合成した１０ｍｅｒとは化学的にも物理的にも区別できなかった。ＨＰＬＣ：保持時間２１．４０分。条件：Ｃ１８ミクロソーブＭＶ（Rainin）５ｍ粒子、４．６ｍｍ×２５ｃｍ。瓶Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム（ｐＨ６．９）、瓶Ｂ：アセトニトリル。流速：１ｍｌ／ｍｉｎ、５０％Ｂまでは０〜２５分勾配、５０％Ｂでは２５〜２７分。０％Ｂまでは２７０３０分勾配、０％Ｂでは３０〜３２分。例２１２１ｍｅｒＲＮＡの合成下記は、本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬および本発明の開裂試薬を用いるオリゴヌクレオチドＲＮＡの合成を説明する。例１２に記載したように誘導体化したＣＰＧ支持体０．２ｍｍｏｌｅｓ（８．０９ｍｍｏｌｅｓ／ｇ担持）をカラムに入れ、配列（配列番号：５）の２１ｍｅｒをオリゴ−１０００上で合成した。カップリング時間は１２分であった。開裂および脱保護は例２０に記載したＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃ Ｎ（１：１、ｖ／ｖ）を用いて室温で２時間行った。２’−保護基の除去は、ＴＨＦ中１．０Ｍテトラブチルアンモニウムフルオライドを用いて室温で１５時間行った。オリゴリボヌクレオチドをＳｅｐ−Ｐａｋ（ミリポア社のＣ１８カートリッジ）を用いて脱塩した。サンプルを凍結乾燥し、ベックマンＰ／ＡＣＥ２０００で毛細管電気泳動によって分析した。毛細管ゲルカラムは、全長３７ｃｍを有するベックマン・インスツルメントＵ１００Ｐウレアゲルカラムであった。ベックマントリス−ボレート、７Ｍウレア緩衝ゲル緩衝液キットをメーカーの使用説明書にしたがって使用した。オリゴリボヌクレオチドの吸光度は、オリゴリボヌクレオチドの質および長さに応じて１．０〜２ＯＤ２６０ｎｍ／ｍｌの範囲内であった。注入は１０ｋＶで５秒、分離は長さに応じて１１ｋＶで３０〜６０分であった。例２２ホスフォロチオエート類の合成下記は本発明によるホスフォロチオエートの合成およびそれらのその後の開裂を説明する。配列（配列番号：６）の２５ｍｅｒホスフォロチオエートを例１５で作成した固体支持体上で合成した。合成はオリゴ−１０００上で０．２μｍｏｌスケール（２０ μｍｏｌｅｓ／ｇ担持）を用いて行われた。合成後、オリゴを開裂し、脱保護を例２０で調製したＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（１：１）溶液を用いて６５℃で４時間行った。サンプルをＨＰＬＣおよびＣＥで分析した。最後のＤＭＴを有するホスフォロチオエートのＨＰＬＣ保留時間は例２０に記載した条件下では１７．２３分であった。ＣＥ保持時間は最終的ＤＭＴを除去したホスフォロチオエートでは２７．４０分であった。条件は例２１と同じであった。生成物は市販のＣＰＧ支持体上で合成した２５ｍｅｒとは化学的および物理的に区別できなかった。例２３ホスフォロチオエートの合成下記は本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬および本発明の開裂試薬を用いるホスフォロチオエートの合成を説明する。例２２に記載の方法にしたがい、配列（配列番号：６）のオリゴホスフォロチオエートを例１２で作成した固体支持体上で合成した。開裂および脱保護は例２０のＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（１：１ｖ／ｖ）試薬で室温で２時間行った。最終的ＤＭＴを有する開裂されたホスフォロチオエートのＨＰＬＣ保持時間は１７．２２分であった。最終的ＤＭＴを除去したホスフォロチオエートのＣＥ保持時間は２６．６４時間であった。条件はＨＰＬＣでは例２０と同じで、ＣＥでは例２１と同じであった。例２４ＣＰＧ−ユニバーサルな固体支持体上で合成した粗ヘテロ１５ｍｅｒの酵素消化配列（配列番号：７）の１５ｍｅｒを例１５からのＣＰＧ固体支持体上およびスクシニルリンカーを有する通常のＣＰＧ−Ａ支持体上で組み立てた。最後のＤＭＴ保護基を除去後、例１５の固体支持体上で合成したオリゴマーを、例２０で作ったＣＨ₃ＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（１：１、ｖ／ｖ）溶液で６５℃で４時間、開裂し脱保護を行った。通常のＣＰＧ−Ａ支持体上で合成したオリゴマーは、６５℃３時間アンモニアで、開裂し脱保護を行った。粗オリゴマー類を酵素消化にかけた。それには５ｍｌの４０ｍＭトリス、１０ｍＭＭｇＣｌ₂、ｐＨ７．５、で再構成したホスフォジエステラーゼＩ（シグマ）（１回の試験ごとに０．０１Ｕを用いる）および大腸菌（E.coli）からのアルカリホスファターゼ（シグマ）２００ｕ／１．８ｍｌ（１回の試験に０．２ｕを用いる）を用いた。１〜２ＯＤ₂₆₀ｎｍのオリゴヌクレオチドにホスフォジエステラーゼ２５ｍｌとアルカリホスファターゼ２ｍｌを加え、混合物を室温で３０分〜２時間インキュベートした。サンプルをそのまま逆相ＨＰＬＣＣ−１８カラムに注入した。ＨＰＬＣカラム：Ｃ−１８ウルトラスフェア（ベックマン）５ｍ粒子、４．６ｍｍ×２５ｃｍ。緩衝液Ａ：０．１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液Ｂ：アセトニトリルプログラム：流速１ｍｌ／分１５％Ｂまで０〜２０分勾配２５％Ｂまで２０〜２５分勾配５０％Ｂまで２５〜２７分勾配５０％Ｂで２７〜３０分０％Ｂで３０〜３５分表Ｉは、例１５の固体支持体（ユニバーサルなＣＰＧ）上および通常のＣＰＧ− Ａ−支持体上で合成したオリゴヌクレオチドの理論値および分析値がよく一致することを示す。例２５３５ｍｅｒのヌクレオシド組成分析配列（配列番号：３）の３５ｍｅｒを０．２μｍｏｌｅ（２０μｍｏｌｅｓ／ｇ担持）ＣＰＧ−Ｔ上で、例１５に記載の方法で合成した。オリゴ−１０００ＤＮＡ合成機を用いた。合成後、開裂および脱保護を例２０に記載のようにＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（１：１、ｖ／ｖ）を用いて６５℃、４時間行った。サンプルの１ＯＤ₂ ₆₀ ｎｍを取り、蛇毒ホスホジエステラーゼ２５ｍｌおよびアルカリホスファターゼ２ｍｌと混合した。混合物を３０分間室温に保ち、例２４に記載の条件を用いてＨＰＬＣカラムに注入した。結果を表 II に報告する。例２６オリゴデオキシリボヌクレオチド／オリゴリボヌクレオチド合成のための再利用可能支持体例１１に記載の方法によって合成した固体支持体上にオリゴヌクレオチドを組み立てた後、例２０に記載のように調製したＭｅＮＨ₂／Ｍｅ₃Ｎ（１：１、ｖ／ｖ）を用いて、そのオリゴヌクレオチドを６５℃で２時間かけて固体支持体から離脱させた。固体支持体を蒸留水（１ｍｌ）で洗い、マツモトらが報告したように（Chemistry Letters ４２７（１９９０））［Ｃｏ）トリエチレンテトラミン）（ＯＨ）Ｈ₂Ｏ］⁺²で処理した。文献記載の方法［チン（J.Chin）およびゾー（X.Zou）、Can.J.Chem.６５巻、１８８２ページ（１９８７）、チンおよびゾー、J.Amer.Chem.Soc.１１０巻、２２３ページ（１９８８）］により調製した０．０５Ｍ［Ｃｏ（トリエチレンテトラミン）Ｃｌ₂］Ｃｌ溶液（１５．５７ｍｇ／１ｍｌ水）に、１．５等量のＮａＯＨ（０．０７５Ｍ、３ｍｇ／ｍｌ水）を加えた。１０分後、１ＮＨＣl の添加により溶液のｐＨをｐＨ７．０に調整した。この溶液を上記の固体支持体に加え、室温で３０分間振とうした。この工程が環状ホスフェートを加水分解してｃｉｓ−ジオールにする。固体支持体を濾過し、蒸留水（２ｍｌ）、ＣＨ₃ＣＮ（２×２ｍｌ）およびジエチルエーテル（１ｍｌ）で洗い、真空乾燥した。固体支持体をその後乾燥ＣＨ₂Ｃｌ₂１ｍｌに懸濁した。コリジン（１．３ｍｌ、０．００１Ｍ）を加え、その後テトラブチルアンモニウム過塩素酸塩（０．３４ｍｇ、０．００１Ｍ）およびジメトキシトリチルクロライド（０．３３８ｍｇ、０．００１Ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１５分間振とうした。固体支持体を濾過し、ＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍｌ）、ＣＨ₃ＯＨ（１ｍｌ）、ジエチルエーテル（１ｍｌ）で洗い、真空下で１時間乾燥した。それから固体支持体を乾燥ピリジン（１ｍｌ）に懸濁した。ＤＭＡＰ（１．２５ｍｇ、０．００１Ｍ）を加え、それから無水酢酸（１２．５ｍｌ、０．０１２５Ｍ）を加えた。反応混合物を室温で１５分間振とうした。固体支持体を濾過しＣＨ₂Ｃｌ₂（１ｍｌ）およびジエチルエーテル（１ｍｌ）で洗い、真空下で３０分間乾燥した。例２７２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデン−ウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ，Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトの合成下記は試薬の合成、およびその試薬とアミノ官能基固体支持体とを反応させて本発明のオリゴヌクレオチド合成試薬を作ることを述べる。２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデン−ウリジン（０．５８ｇ、２ｍｍｏｌｅ）を無水ＴＨＦ（１０ｍｌ）に溶解した。ジイソプロピルアミン（１．４ｍｌ、８ｍｍｏｌ）を室温で加え、その後β−シアノエチルモノクロロ−Ｎ，Ｎ−ジイソプロピルホスフォルアミダイト（０．９ｍｌ、４ｍｍｏｌｅ）を磁気式撹拌下で加えた。１時間撹拌後、溶媒を３０℃で真空蒸発した。粗生成物を酢酸エチル（５０ｍｌ）に再溶解し、水で洗い、無水硫酸ナトリウムで乾燥した。溶媒を減圧下で除去した後、残留物を酢酸エチル（１０ｍｌ）に取り、酢酸エチル／ジイソプロピルアミン（９５／５、ｖ／ｖ）とともに充填したシリカゲル（１００〜１２０℃で予備的加熱）のカラムを通過させ、酢酸エチルで溶出した。所望フラクションを集め、蒸発し、高真空下で乾燥すると、２’，３’−Ｏ−メトキシエチリデン−ウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトが得られた（０．５５ｇ、５６％収率）。ＩＲ（Ｋｂｒペレット）：ｕ１７００ｃｍ^-1（環状アミドのＣ＝Ｏ）、２２５０ｃｍ^-1（Ｃ＝Ｎ）、および２９００ｃｍ^-1（ｓ，ＮＨ）。 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ１．１０−１．２８（ｍ、１２Ｈ、２×ＣＨ（ＣＨ ₃）₂）、１．６２および１．６８（２ｓ、３Ｈ、ＣＯＣＨ ₃）、２．６６および２．７６（２ｔ、４Ｈ、ＣＨ ₂ＣＨ ₂）、３．２７およ３．４０（２ｓ、３Ｈ、ＯＣＨ ₃）３．５５（ｍ、２Ｈ、２×Ｎ−ＣＨ（ＣＨ₃）₂）、３．８８（ｍ、２Ｈ、Ｃ₅・−ＣＨ ₂）、４．１５（ｍ、１Ｈ、Ｃ₄・−Ｈ）、４．９７（ｍ、２Ｈ、Ｃ₂・Ｈ、Ｃ₃・Ｈ）、５．７６（ｍ、１Ｈ、Ｃ₅−Ｈ）、６．０３（ｄ、１Ｈ、Ｃ₁・−Ｈ）および７．５４（ｄ、１Ｈ、Ｃ₆−Ｈ）。２’，３’−イソプロピリデンウリジン−５’−Ｏ−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピル）−β−シアノエチル−ホスフォルアミダイトも同様な方法によって作った。上で合成したホスフォルアミダイト化合物を用い、これらホスフォルアミダイトを種々の固体支持体に付着結合させてオリゴヌクレオチド合成部位と固体支持体間にホスフォルアミダイト結合を形成することによって、本発明のオリゴヌクレオチド試薬を作った。これを実現するために、表面アミノ基を有するＣＰＧおよびフラクトゲルをホスフォルアミダイトと反応させた。この反応生成物を８０％酢酸水で処理した後、２’，３’−Ｏ−環状オルトエステル官能基が開いて例１１のオリゴヌクレオチド合成試薬が提供された。例２８１，２−Ｏ−メトキシベンジリデングリセロールの合成下記は、合成後、本発明の開裂試薬で固体支持体から離脱されるオリゴヌクレオチドの合成に適したオリゴヌクレオチド試薬を製造するために用いるグリセロール型化合物の合成を説明する。グリセロール（５．６１ｇ、６１ｍｍｏｌｅ）を、トリメチルオルトベンゾエート（２２．８ｇ、１２５ｍｍｏｌｅ）および無水ベンゼンスルフォン酸（０．６ｇ）を含むＴＨＦ（２００ｍｌ）に懸濁した。湿気を排除しながら２５℃で１時間撹拌すると、溶液は透明になった。ＴＬＣは出発材料がより高いＲｆ値をもつ新しい化合物に完全に変換したことを示した。反応混合物の反応をメタノール性ＮａＯＣＨ₃（１Ｍ、５ｍｌ）の添加によって停止し、溶媒を減圧下で除去した。油状残留物をＣＨ₂Ｃｌ₂に溶解し、アルミナカラムクロマトグラフィーによって精製した。生成物をＣＨ₂Ｃｌ₂／ＭｅＯＨ（９９／１、ｖ／ｖ）で溶出し、所望フラクションを集め、減圧下で蒸発すると、標題化合物が無色油状物質として得られた（９．６ｇ、７４．９％収率）。 ¹ＨＮＭＲ（ＣＤＣｌ₃）：δ３．６９（ｍ、４Ｈ、２−ＣＨ ₂）、４．０（ｔ、１Ｈ、ＣＨ）、４．３（ｄ、３Ｈ、−ＯＣＨ ₃）、７．３７〜８．０（ｍ、５Ｈ、芳香族）。上で作った化合物を用いて、それを標準的スクリニル化ＣＰＧおよびフラクトゲル固体支持体と反応させることによってオリゴヌクレオチド合成試薬を作った。その後反応した固体支持体と８０％酢酸水とを室温で接触させると、エステル結合によって支持体に結合したグリセロール部分を有する試薬が得られた。例２９下記は本発明の種々の開裂試薬に関連する予想外の開裂特性を証明する。例２５に記載された固体支持体を用いて作成された３５−ｍｅｒを用いて、種々の開裂試薬の有効性を研究した。合成した３５−ｍｅｒを含む固体支持体を各開裂試薬と６５℃で３０分間接触させた。固体支持体から実際に離脱したオリゴヌクレオチドの％を測定した。開裂反応の結果を表III に示す。ＮＨ₄ＯＨ、ＣＨ₃ＮＨ₂、（ＣＨ₃）₃Ｎ、（ＣＨ₃）₂ＮＨ、を含む溶液は、それぞれ約２９ｗｔ％、４０ｗｔ％、約２４ｗｔ％、および４０ｗｔ％水溶液から作った。本発明によると、例えばトリメチルアミンおよびトリエチラミンなどの比較的強い塩基は少量でも開裂速度を促進する。これは、４０％メチルアミン水９９部と２４ｗｔ％トリメチルアミン水１部とから作られた溶液（３９．６％メチルアミンと０．２４％トリメチルアミン）で得られた開裂データと、４０ｗｔ％メチルアミンで得られたデータとの比較から証明される（３０分後に４４％開裂対３０分後に４１％開裂）。ＣＨ₃ＮＨ₂／（ＣＨ₃）₃Ｎ（９９：１）はＣＨ₃ＮＨ₂／（ＣＨ₃）₃Ｎ（１：９）よりはるかに速い速度を与えるという事実は、メチルアミンも開裂反応に顕著な役割を演ずることを説明するものである。上記のエチルアルコールは、溶液を混和可能にするために開裂試薬に用いられる。上記のように、アンモニア、メチルアミンおよびトリメチルアミンは標準温度および圧力では気体である。それらは容易に水溶液になり、この形を上記の溶液の調製に用いた。使用溶液は４０ｗｔ％メチルアミン水および２３〜２５ｗｔ％トリメチルアミンであった。すなわち１：１メチルアミン：トリメチルアミンは、約２０ｗｔ％メチルアミンおよび約１２ｗｔ％トリメチルアミンである。同様に、水酸化アンモニウムＮＨ₄ＯＨは濃水酸化ナトリウムまたは約２８ｗｔ％〜３０ｗｔ％を用いて作った。メチルアミンおよびトリメチルアミンを含む上記の開裂試薬は濃度が約０．４ｗｔ％〜３９．６ｗｔ％メチルアミンおよび約０．２４ｗｔ％〜２２．５ｗｔ％トリメチルアミンの間に変動する。本発明をその特別の実施態様と関連づけて説明したが、その他の変更が可能であることは当然であり、この出願は、概ね本発明の原理にしたがうあらゆる変形、使用または応用を網羅するものとし、また、本発明が関係する技術領域の公知のまたは慣習的実用の範囲に入り、これまでに示した本質的特徴にあてはまり、そして添付の請求の範囲内に入るような本発明を含めるものとする。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者マイケル、メイジドエイアメリカ合衆国 92870 カリフォルニア州プラセンティアラヴェンダーレイン 348 (72)発明者ファルーキ、ファーダスアメリカ合衆国 92821 カリフォルニア州ブリーアレグザンダーコート 1520

Claims

【特許請求の範囲】１．下記の式 SS - R⁶ - O -R³ I アルキルであり、Ｒ⁴はリン保護基であり、Ｒ³はビシナル基−ＸＲ¹および−ＹＲ²をもつ環状部分であり、ここで、ＸおよびＹはそれぞれ、Ｏ、ＳおよびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方は、水酸化アンモニウムおよびメチルアミンからなる群から選択される試薬によって除去できるブロッキング部分であり、他方は水素、または−ＯＨ、−ＳＨもしくは−ＮＨ₂を保護するために適したヒドロキシ保護基である。）を有する組成物を含んでなるオリゴヌクレオチド合成試薬。２．前記環状部分が下記の構造（式中、Ｂはプリンまたはピリミジン塩基である。）を有する請求項１記載のオリゴヌクレオチド試薬。３．Ｂがウリジルである請求項２記載のオリゴヌクレオチド試薬。４．Ｒ¹およびＲ²の一方がアセチル、ベンゾイルおよびＦＭＯＣからなる群から選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチド合成試薬。５．Ｒ¹およびＲ²の一方がジメトキシトリチルである請求項１記載のオリゴヌクレオチド合成試薬。６．固体支持体が、コントロールポアガラス、エチレンとアクリレートとのコポリマー類、エチレンとメタクリレートとのコポリマー類、ポリスチレン、およびナイロンからなる群から選択される請求項１記載のオリゴヌクレオチド合成試薬。７．下記の式（式中、ＳＳは固体支持体、ＸおよびＹはそれぞれＯ、Ｓ、およびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方はアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基であり、他方は水素、またはヒドロキシ保護基である。）を有する化合物を含んでなるオリゴヌクレオチド合成試薬。８．ＸおよびＹがそれぞれＯであり、Ｒ¹およびＲ²の一方がアセチルであり、他方がジメトキシトリチルである請求項７記載のオリゴヌクレオチド合成試薬。９．固体支持体がコントロールポアガラス、エチレンとアクリレートとのコポリマー類、エチレンとメタクリレートとのコポリマー類、ポリスチレン、ポリプロピレンおよびナイロンからなる群から選択される請求項７記載のオリゴヌクレオチド合成試薬。１０．下記の式（式中、ＳＳは固体支持体であり、ＸおよびＹはそれぞれＯであり、Ｒ¹およびＲ²の一方はアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基であり、他方はジメトキシトリチルである。）を含んでなるオリゴヌクレオチド合成試薬。１１．メチルアミンおよび水酸化アンモニウムからなる群から選択される第１の化合物と、第二アミン類および第三アミン類からなる群から選択される第２の化合物とを含んでなるオリゴヌクレオチド開裂試薬。１２．前記第１の化合物がメチルアミンである請求項１１記載のオリゴヌクレオチド開裂試薬。１３．前記第二アミンがジメチルアミン、ジイソプロピルアミンおよびジエチルアミンからなる群から選択される請求項１１記載のオリゴヌクレオチド開裂試薬。１４．前記第三アミンがトリメチルアミン水、Ｎ−メチルピロリジン水、トリエチルアミン水およびジイソプロピルエチルアミン水からなる群から選択される請求項１１記載のオリゴヌクレオチド開裂試薬。１５．メチルアミンと、トリメチルアミン、トリエチルアミンおよびＮ−メチルピロリジンからなる群から選択される第三アミンとを含んでなる水性オリゴヌクレオチド開裂試薬。１６．低級アルキルアルコールをさらに含んでなる請求項１５記載の水性オリゴヌクレオチド開裂試薬。１７．前記メチルアミンが約４ｗｔ％〜約３９．６ｗｔ％の濃度で存在し、かつ前記第三アミンが約０．２４ｗｔ％〜約２２ｗｔ％の濃度で存在する請求項１５記載の水性オリゴヌクレオチド開裂試薬。１８．前記第三アミンがトリメチルアミンである請求項１７記載のオリゴヌクレオチド開裂試薬。１９．前記メチルアミンが約８ｗｔ％〜約３９．６ｗｔ％で存在し、かつ前記トリメチルアミンが約０．２４ｗｔ％〜約１９．２ｗｔ％で存在する請求項１８記載のオリゴヌクレオチド開裂試薬。２０．固体支持体からオリゴヌクレオチドを開裂するための方法であって、環状部分を介して固体支持体に付着結合したオリゴヌクレオチドを用意し、そして前記オリゴヌクレオチドを、メチルアミン並びに第二アミン類および第三アミン類からなる群から選択される化合物を含む試薬と接触させる各工程を含んでなる方法。２１．前記オリゴヌクレオチドが、アルキルカルボニルおよびアリールカルボニルからなる群から選択されるブロックされた反応性基に隣接する前記環状部分に付着結合し、かつ前記接触工程が前記反応性基の脱ブロックを含む請求項２０記載の方法。２２．前記環状部分が、エステル部分、ホスフェート部分、ホスフォルアミデート部分およびカルバメート部分からなる群から選択される結合部を介して前記固体支持体に付着結合している請求項２１記載の方法。２３．前記試薬が約４ｗｔ％〜約３６ｗｔ％のメチルアミンを含み、かつ前記化合物が約２．４ｗｔ％〜約２２．５ｗｔ％の濃度で存在するトリメチルアミンである請求項２０記載の方法。２４．前記結合部がエステル、ホスフォルアミダイトおよびホスフォルアミデート部分からなる群から選択される請求項２２記載の方法。２５．オリゴヌクレオチドを合成する方法であって、 SS - R⁶ - O -R³ I アルキルであり、Ｒ⁴はホスフェート保護基であり、Ｒ³はビシナル基−ＸＲ¹および−ＹＲ²をもつ環状部分であり、ここで、ＸおよびＹはそれぞれ、Ｏ、ＳおよびＮＨからなる群から独立に選択され、Ｒ¹およびＲ²の一方は、水酸化アンモニウムおよびメチルアミンからなる群から選択される試薬によって除去できるブロッキング部分であり、かつ他方は水素、または−ＯＨ、−ＳＨもしくは−ＮＨ₂ を保護するために適したヒドロキシ保護基である。）のオリゴヌクレオチド合成試薬を用意し、保護されたヌクレオチドモノマー単位を次々にカップリングしてオリゴヌクレオチドを提供する各工程を含んでなる方法。２６．前記合成試薬が（式中、ＳＳは固体支持体であり、ＸおよびＹはそれぞれＯであり、Ｒ¹およびＲ²の一方はアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基であり、他方はヒドロキシ保護基である。）である請求項２５記載のオリゴヌクレオチドを合成する方法。２７．前記合成試薬が（式中、ＳＳは固体支持体であり、ＸおよびＹはそれぞれＯであり、Ｒ¹およびＲ²の一方はアルキルカルボニルまたはアリールカルボニル基であり、他方はジメトキシトリチルである。）である請求項２５記載の方法。２８．ＬｉＣｌをさらに含む請求項１７記載の試薬。