JPH05501418A

JPH05501418A - オリゴヌクレオチドの官能化方法

Info

Publication number: JPH05501418A
Application number: JP3511114A
Authority: JP
Inventors: アンバシュ，ジャン―ルイ; レネ，ベルナール; バサール，ジャン―ジャック
Original assignee: サントル、ナショナル、ド、ラ、ルシェルシュ、シアンティフィク（セエヌエルエス）
Priority date: 1990-06-26
Filing date: 1991-06-24
Publication date: 1993-03-18
Also published as: FR2663636B1; WO1992000315A1; FR2663636A1; EP0487694A1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】オリゴヌクレオチドの官能化方法本発明はアミン含有反応剤を用いてオリゴヌクレオチドをその５′ＯＨ末端で官能化するプロセスに関する。

本発明はそのプロセスで有用なジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体からなるシントン（ｓｙｎｔｈｏｎ）にも関する。

様々な反応剤と共有結合したオリゴヌクレオチドの合成は、生化学及び分子生物学におけるこれら分子の大量使用のために、並びに可能性のある治療剤としてのそれらの使用のために非常に興味がある。

特に、オリゴヌクレオチドへの挿入化剤の結合はこれらオリゴマーの相補的配列とで形成される二本鎖の安定性を増加させ（Ｕ、Ａｓ５ｅｌｉｎｅ　ｅｔ　ａｌ、、Ｐｒｏｃ、Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓｃｉ。

ＵＳＡ、８１．３２９７−３３０１．１９８４）、後者の細胞膜透過を改善する（Ｐ、Ｖｅｒｓｐｌｅｒｅｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ、６１．３０７−３１５．１９８７）ことが示された。

更に、ケイ光基又はビオチンに結合されたオリゴヌクレオチド（Ｓ、Ａｇｒａｖａｌ、Ｃ，Ｃｈｒｉｓｔｏｄｏｕｌｏｕ　ａｎｄ　Ｍ、Ｊ、Ｇａ１ｔ。

Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１４．６２２７−８２４５．１９８６；Ｐ、Ｒｉｃｈｔｅｒｉｃｈ。

Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１７．２１８１−２１８５．１９８９）は非常に感受的なケイ光測定又は酵素及び比色測定法を用いて各々容易に検出される。これらの化合物は冷分子プローブとして用いられ、しかも放射性プローブと有利に代わることができる。

最後に、化学的に活性化しつる（Ｃ，Ｂ、Ｃｈｅｎ　ａｎｄ　ＤＪ。

Ｓｉｇｍａｎ　、　Ｐｒｏｃ、ＮａＬ　ｌ　、Ａｃａｄ、Ｓｃ１　、ＵＳＡ　、　８３　、７１４７−７１５１　；Ｔ、ＬｅＤｏａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１５．８８４３−８６５９．１９８７；Ｊ、Ｃ，Ｆｒａｎｑｏｌｓ　ｅｔ　ａｌ、、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２７．２２７２−２２７８，１９８８　；Ｓ、Ａ、５ｔｒｏｂｅ１．Ｈ，Ｅ、Ｍｏ５ｅｒ　ａｎｄ　Ｐ、Ｂ、Ｄｅｒｖａｎ、Ｊ、Ａｓ、Ｃｈｅｍ。

Ｓｏｃ、、１１０．７９２７−７９２９．１９８８；Ｓ、Ｂ、Ｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ、。

Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２８．１０５４−１０Ｂ１．１９８９）又は光化学的に活性化しうる（Ｔ、Ｌｅ　Ｄｏａｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１５゜７７４９−７７６０．１９８７）反応基に結合されたオリゴヌクレオチドは相補的配列のレベルで核酸と結合して、不可逆的ダメージを局所的に誘導することができる。この化合物群は所定遺伝子の生物学的機能を選択的に阻害するために用いてもよい。オリゴマー配列の役割はその遺伝子で運搬される相補的配列のレベルで認識の特異性を保障することであり：その際に化学的アクチベーターはこのターゲットにダメージを与える。

本特許出願において、“オリゴヌクレオチド″はＤＮＡ系でオリゴデオキシヌクレオチド及びＲＮＡ系でオリゴリボヌクレオチドを意味すると理解されている。

更に、“オリゴヌクレオチド”はβ−アノマー配置又は非天然α−アノマー配置のオリゴヌクレオチドを意味するとも理解されている。

最後に、オリゴヌクレオチドを構成するヌクレオチドは真のヌクレオチド、即ち相当するヌクレオシドの５′にリン酸を有するヌクレオチド又は更にみられるような特にホスホロチオール酸もしくはメチルホスホン酸タイプの誘導体である。

本出願人は他の特許出願でアミン含有反応剤を用いてオリゴヌクレオチドをその５′ＯＨで官能化するプロセスについても既に記載してきた。このため本発明を更に良く理解するには、フランス特許出願ＦＲ第８３．０１゜２２３　（２，５４０，１２２）号及び第８４．１１７゜９５５　（２，５６８，２５４）号明細書を参照することが有用であるが、そこでは少なくとも１つの挿入化基が共有結合で結合された、任意に修正されたβ−アノマー天然ヌクレオチドの鎖を含むオリゴヌクレオチドからなる化合物が記載されていた。

活性化しうる化学基に結合されたオリゴヌクレオチド化合物の合成及び配列特異性人工ヌクレアーゼとしてのそれらの用法はフランス特許出願第８７．０３．３６６（２，５８６，７０７）号明細書で記載された。

オリゴヌクレオチドがホスホトリエステルの形で安定化される方法は国際特許出願ＰＣＴ　ＷＯ第８３１０１４５１号明細書で記載された。

天然ホスホジエステル結合をホスホン酸結合に代えることで安定化されたオリゴヌクレオチドは米国特許ＵＳ第４，４６９，８６３号明細書で記載されている。

α−アノマーオリゴヌクレオチドの製造及び挿入化剤又は化学的もしくは光化学的な活性「ヒ基を有するそれらのカップリングは国際出願ＰＣＴ　ＷＯ第８８１０４３０１号明細書で記載された。

本出願において、“反応剤”は挿入化剤とも称される挿入剤に相当する基、ヌクレオチド鎖と直接的もしくは間接的に反応する官能基を有した基のような化学的もしくは光活性化基又はその存在が容易かつ選択的な検出を可能にする基を意味すると理解されている。

α−オリゴデオキシリボヌクレオチド化合物を製造するために固体支持体上でホスホルアミダイト法を用いる合成はフランス特許出願第８７．０４，３３９号明細書で記載され、α−オリゴリボヌクレオチド化合物の固体支持体上でホスホルアミダイト法を用いる合成はフランス特許出願第８８．１２．２６４号明細書で記載されている。

現在まで、反応剤でオリゴヌクレオチドを官能化するプロセスにおいて、リンカ −で官能化された上記反応剤の誘導体、例えばホスホルアミダイト−固体支持体上における合成の場合ではホスホルアミダイトがオリゴヌクレオチド伸長の最終段階で用いられている。このため、５ｔｅｉｎ　ｅｔ　ａｌ、、Ｇｅｎｅ　７２（１９８８）３３３−３４１による論文はオリゴヌクレオチド、この場合ではアクリジン（ＡＣｒ）を官能化する慣用的方法に関する。

この方法は下記のように示すことができる：ａ）リンカ−（ｍ−３又は５）によるアクリジンの官能化ｂ）対応ホスホルアミダイトの形成Ｃ）機械的伸長の最終段階で１を用いる固体支持体上における合成ｄ）固体支持体の除去及びＣ６Ｈ５５Ｈを用いたオリゴマーの脱保護。これらの条件下において、副反応は脱保護に際して最終オリゴマーのアクリジンで観察される（ＣＩはＣ６Ｈｓ　Ｓで置換される）。

この論文で記載されたアプローチでは異なる反応剤を導入することが望まれる毎に対応ホスホルアミダイトが合成されることを要する：この欠点を克服するため、オリゴデオキシリボヌクレオチドのその３’　ＯＨ末端におけるアミノ試薬（Ｒ−ＮＨ２）との共有結合は下記経路に従いオリゴヌクレオチドで形成される非塩基性部位（ＡＰ）のアルデヒド官能基とアミノ誘導体との還元アミノ化反応により調べられた（Ｊ、−Ｊ、Ｖａｓｓｅｕｒ、Ｃ，Ｇａｕｔｈｉｅｒ、Ｂ、Ｒａｙｎｅｒ。

Ｊ、Ｐａｏｌｅｔｔｉ　ａｎｄ　Ｊ、−Ｌ、Ｉｍｂａｃｈ、Ｂｉｏｃｈｅａ、Ｂｉｏｐｈｙｓ、ｆ？ｅｓ。

Ｃｏｗｉｕｎ、　、　１５２　、５６−６１　、１９８８　；Ｊ　、−Ｒ，Ｂｅｒｔｒａｎｄ、　Ｊ　、−Ｊ　、Ｖａｓｓｅｕｒ。

Ａ、Ｇｏｕｙｅｔｔｅ、Ｂ、Ｒａｙｎｅｒ、Ｊ、−Ｌ、Ｉｍｂａｃｈ、Ｃ，Ｐａｏｌｅｔｔｉ　ａｎｄ　Ｃ。

Ｍａｌｖｙ、Ｊ、Ｂｉｏｌ、Ｃｈｅ＋ｇ、、２６４．１４１７２−１４１７８．１９８９）　：それにもかかわらず、それ自体非常に一般的であるこのアプローチは、多数のＲ−ＮＨ２反応剤が考えられることから、ＡＰ部位（２′　−デオキシリボース）の形成により制限されてしまう。

実際に、後者はデオキシアデノシン（ｄＡ）のグリコシド結合の酸加水分解により得られる。

その際にオリゴヌクレオチド鎖はｄＣ及びｄＴがｄＡ又はｄＧよりも酸加水分解に極めて感受的でないとすればピリミジンヌクレオシドのみを含むことになる。

したがって言い換えれば、アミン含有反応剤を用いてピリミジンヌクレオシドのみからなるオリゴデオキシリボヌクレオチドを官能化することはこの方法を用いると不可能である。

本発明は、固体支持体上で合成されて、このとき適切であればすべての通常ＤＮＡ及びＲＮＡ塩基（Ａ。

Ｃ，Ｇ、Ｔ又はＵ）並びに修正された塩基を含有した（ＤＮＡ系及びＲＮＡ系双方の）オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端で非塩基性部位を形成するための一般的なプロセスについて提案している。このためこのオリジナルなプロセスはアミン含有反応剤を用いていかなる配列のオリゴヌクレオチドも官能化することができる。

本発明による官能化方法の主な特徴はジデオキシリボヌクレオシドの使用であり、それは固体支持体上における自動合成によりいかなる配列のオリゴヌクレオチドもそれらの５′ＯＨ末端で官能化させることができる。

本発明によるプロセスはオリゴマー（β−配置の天然系、α−配置の非天然系、ホスホロチオ酸、メチルホスホン酸等）で実施された構造的修正にかかわらずＤＮＡ又はＲＮＡ系に適用できる。

更に詳しくは、本発明の主題は式ＲＮＨ２のアミン含有反応剤を用いてオリゴヌクレオチドをその５’　ＯＨ末端で官能化するためのプロセスであるが、それは下記段階からなることで特徴付けられる：ａ）上記オリゴヌクレオチドが合成される；ｂ）ジデオキシヌクレオチドが上記オリゴヌクレオチドの５’　ＯＨ末端にその５′末端で結合される；Ｃ）共有結合が、上記オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端においてジデオキシヌクレオチドのグリコシド環の酸加水分解による開環から誘導されるオリゴヌクレオチドの５ ′ＯＨ末端におけるアルデヒド官能基と上記アミノ試薬との還元アミノ化反応を用いて上記オリゴヌクレオチドと上記ＲＮＨ２アミノ試薬とで行われる。

したがって、本発明は、（天然又は修正と）考えられるオリゴヌクレオチド系にかかわらずいかなる塩基も含むことができるオリゴマーの５′ＯＨ末端において非塩基性ジデオキシリボース部位を形成するための新規アプローチを提供する。

これらの非塩基性（ａｂａｓｉｃ）オリゴヌクレオチドは、それらがアミン含有反応剤での還元アミノ化後それらの誘導された形に容易かつ定量的に導かれることから、単離されない。

段階ａ）及びｂ）に関する本発明によるプロセスの態様において、オリゴヌクレオチドの合成は固体支持体上におけるホスホルアミダイト結合合成（ｐｈｏｓｐｈｏｒａｍｉｄｔｔｅ−ａｕａｃｈｉｎｇ　ｓｙｒ＋ｔｈｅｓｉｓ）であって＼その最終段階ではホスホルアミダイト誘導体が上記オリゴヌクレオチドの５′末端に付加合成サイクルを用いて結合されるジデオキシヌクレオチドに対応したジデオキシヌクレオシドの５′で用いられる。

本発明によるジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体は対応ジデオキシリボヌクレオシド又はリボヌクレオシドよりも酸加水分解に非常に感受的であるらＩ７い。後者の中では、更にみられるように、ネブラリンのジデオキシヌクレオシド誘導体がより容易に加水分解される。

しかしながら、同様のことが他のジデオキシヌクレオシド誘導体、特に下記式の対応ヒドロゲノホスホン酸誘導体：にあてはまり、これはホスホルアミダイトを用いる合成から他のタイプの合成、特にホスホン酸水素誘導体を用いる合成に移行する可能性を有する（Ｎｕｃｌｅｉｃ　Ａｃ１ｄｓＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｖｏｌ、Ｒ４，Ｎｏ、１３．１９８８）。

ホスホルアミダイト法による固相プロセスは下記の主要な段階からなるニー５′においてその２′又は３′ヒドロキシル官能基の一方により保護されたヌクレオシド誘導体が固体支持体上に固定される；一５′及び２′で保護されたヌクレオシドからなるモノマーの縮合により保護されかつ３′においてホスホルアミダイト基で置換されたオリゴヌクレオチド鎖は手動又は自動合成反応器内でこの支持体に結合される；−オリゴヌクレオチドは得られたオリゴマーを支持体から除去して保護基を除去した後に得られる。

適切には、オリゴヌクレオチドの結合は、第一モノマーの場合では固定されたヌクレオシド化合物の又はその後のモノマーの場合では上記固定ヌクレオシド化合物に固定された保護中間ポリヌクレオチド化合物の５′ヒドロキシル官能基と上記モノマーの３′官能基との間における活性他剤存在下での縮合により行われる。

特に、上記モノマーの縮合に関する活性化剤はテトラゾール及びｐ−ニトロフェニルテトラゾールのようなその誘導体から選択される。

本発明によるプロセスにおいて、好ましくは段階ａ）及びｂ）の後かつ段階Ｃ）の前において、５′末端において上記ジデオキシヌクレオチドか結合された上記オリゴヌクレオチドからなる化合物は固体支持体から除去され、かつ保護基が除去される。

段階Ｃ）における還元アミノ化反応は、例えば酸媒体中で水素化シアノホウ素ナトリウム処理を用いて行われる。

本プロセスの態様において、ホスホルアミダイト合成では下記式のジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体を用いる：上記式中ニーＲ及びＲはＣＨＣＨ（ＣＨ３）２のような１　２　３′ 場合により置換されたＣ　−Ｃアルキルを表すか又はＲ及びＲ２は一緒になってモルホリノ基；を形成する； −Ｒは場合により置換されたＣ　−Ｃアルキル、特にＣＨ又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮを表す；−Ｂは核酸塩基、特にアデニン、グアニン又はネブラリンを表す。

核酸塩基Ｂの場合において、アデニン、グアニン又はネブラリンは他の核酸塩基と比べてそれらの酸加水分解が容易であれば選択されることが実際上好ましい。

更に好ましくは、Ｂがネブラリンを表す式■のホスホルアミダイト誘導体が用いられる。

本発明によるアプローチの独創性及び利点は、固体支持体上におけるオリゴヌクレオチド合成の最終段階に際して、導入が望まれる反応剤にかかわらず同様のジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体の使用にある。デオキシ糖環の開環後、ジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体は現実のオリゴヌクレオチドと反応剤との“リンカ−″を与える。更に本発明によれば、脱保護は副反応のリスクのために官能化オリゴマーでもはや実施されないが、但しオリゴマーは反応剤を導入する前に脱保護される。したがって、反応剤、即ち一般に非常に高価である物質の消費は、それが合成の最終段階で導入されるため本発明によるプロセスでは少ない。

５ｔｅｆｎらの論文のような従来の発表において、ホスホルアミダイトの製造ではリンカ−の事前導入を要し、固相合成において過剰量（化学量論の２０倍のホスホルアミダイト誘導体１）を用いる必要性があった。

具体的な態様において、本発明によるプロセスに従い下記式の化合物を製造することができるニー　ＲＮＨはアミン含有反応剤ＲＮＨ２の一価残基である； −Ｊ−Ｈ又はＯＨ。

一残基Ｂは互いに同一でも又は異なっていてもよく、各々α又はβ−アノマー配置てグリコシド環に結合された、任意に修正された核酸の塩基を表す；−基Ｘは互いに同一でも又は異なっていてもよく、オキソ陰イオンＯ−、チオ陰イオンｓ −、アルキル基、アルコキシもしくは了り−ルオキシ基又はアミノアルキル、アミノアルコキシもしくはチオアルキル基を表す；−ｎは１〜５０である。

更に詳しくは、ｘ−ｏ−１ｓ−又はｃＨ３である式１■の化合物が挙げられる。

Ｘ−８−の場合、脱トリチル化、付加及びキャッピング後における通常の酸化段階は硫化サイクルと代えてもよい（Ｇｅｎｅ、７２．３４３−３４７）（Ｗ、Ｊ、５ｔｅｃ、Ｇ、Ｚｏｎ、Ｖ、Ｅｇａｎ　ａｎｄ　Ｂ。

５ｔｅｃ　、　Ｊ　、Ａｍｅｒ、ＣｈｅＬＳｏｃ、　、　１０８　、６０７７− ６０７９　、１９８４　：　Ｒ，Ｐ、　Ｉ　ｙｅｒ　。

Ｗ、Ｅｇａｎ、Ｊ、Ｂ、Ｒｅｇａｎ　ａｎｄ　Ｓ、Ｌ、Ｂｅａｕｃａｇｅ、Ｊ、ＡＩＩｅｒ、Ｃｈｅｍ、Ｓｏｅ、。

１１２．１２５３−１２５４．１９９０）。Ｘ　””　ＣＨ３の場合、５′　− （ジメトキシトリチル）ヌクレオシド　３’　−（Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルメチルホスホルアミダイト）シントンが付加段階でホスホルアミダイトシントンの代わりに用いてもよい（Ｍ、Ａ、Ｄｏｒｓａｎ、Ｓ、Ａ、Ｎｏｂｌｅ、Ｌ、Ｊ、ＭｃＢｒｉｄｅ　ａｎｄ　Ｍ、Ｈ。

Ｃａｒｕｔｈｅｒｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ、４０．９５−１０２，１９８４；Ａ、Ｊｉｇｅｒ　ａｎｄＪ、Ｅｎｇｅｌｓ、Ｔｅｔｒａｈｅｄｒｏｎ　Ｌｅｔｔｅｒｓ、２５．１４３７−１４４０．１９８４）。

既に記載されたように、本発明による式ＲＮＨ−の反応基は核酸を伴う技術で公知の化合物である反応剤に対応する。それらは例えばＤＮＡ又はＲＮＡの構造中に“挿入”されうる化合物である。

これらの挿入剤は一般にアクリジン、フロクマリン、ダウノマイシン、１．１０ −フェナントロリン、フエナントリジニウム、プロフィリン類、（１＊　２−　ａ　：　３　’　。

２’−ｄ）ジビリドイミダゾールの誘導体、エリブチシン、エリブチジニウム又はＮＨ２官能基を有するそれらの誘導体のような平面配置を有する多環式化合物からなる。

これらの反応剤は化学基を開裂するような反応性化学基であってもよく、即ちこれらの基はヌクレオチド鎖を分割するように直接的に又は間接的に反応することができる。これらの反応性化学基は例えば化学的又は光化学的に活性化しうろことが好ましい。活性化しつる開裂反応基は例えば：エチレンジアミン四酢酸、ジエチレントリアミン五酢酸、ポルフィリン類、１．１０−フェナントロリン、ブソラレン、Ｕ、Ｖ、及び可視光付近を吸収する他の芳香族群のような化合物の誘導体である。

金属イオン、酸素及び還元剤の存在下で活性化しうるこれらの化学基はそれらに隣接して位置した核酸配列で切断を誘導する。

更に詳しくは、本発明によると、反応剤のＲＮＨ残基は下記を表すニー下記式のエチレンジアミン四酢酸誘導基ニージエチレントリアミン五酢酸誘導基 −下記式のメチルピロポルフィリン誘導基ニー下記式のフェナントロリン誘導基ニーアクリジン誘導基： −プロフラビン誘導基：ｌ〔Ｒはアミノ（ＮＨ）又はアジド（Ｎ３）基を表す〕−９−アミノエリブチシン：最後に、本発明の主題は本発明によるプロセスで有用なシントンであり、それが下記一般式に相当することで特徴付けられる：上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは請求項４で示された意味を有する。

既に記載されたように、好ましくは本発明によるシントンにおいて、Ｂは好ましくはアデニン、グアニン又はネブラリンを表す。

本発明の他の利点及び特徴は下記例から明らかになるオリゴヌクレオチドの５′ における２’　、３’　−ジデオキシリボース残基）を形成するためにジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイトの使用下記式のホスホルアミダイトを製造する：シンセサイザーで望ましいオリゴヌクレオチドを完全に組立てた後、ホスホルアミダイト１を組込むことができる付加サイクルを行う。

対応オリゴマー２を常法による脱保護後に得て、しかる後場合によりＨＰＬＣで精製する。酸媒体中における処理（３０ｇＭＨＣ１，３７°、１２−１５ｉｉｎ）からジデオキシリボース残基を選択的に加水分解し、こうしてオリゴマーの５ ′でジデオキシリボース末端、即ち３を後者を緩衝液中水素化シアノホウ素ナトリウムの存在下で望ましいアミンと反応させる。この段階の実験条件は用いられるアミンの性質（溶解性、反応性等）に依存しており、官能化されたオリゴマー４をＨＰＬＣで単離する。

別の態様によれば、本発明によるプロセスの段階Ｃ）における還元アミノ化反応は酸媒体中で水素化シアノホウ素ナトリウム処理を用いて行う。

ネブラリンのジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体は他のすべてのピリミジン又はプリンヌクレオシドよりも、特にアデニンヌクレオシドよりも容易に加水分解されるらしい。

下記例は下記タイプのｄｄＡ及びｄｄＮ　５’　ホスホルアミダイトの合成及び特徴について記載している二Ｂ綿ネブラリンしかしながら、様々な他のリン置換基：ＣＨ３の代わりにＣＮＣＨ２ＣＨ２で保護された他のホスホルアミダイト誘導体も用いることができる。

様々なタイプのオリゴデオキシヌクレオチド（β又はα）を誘導するためのこれらホスホルアミダイトの使用後に得られる生成物のアミン含有反応剤による還元アミノ化は、この順序の段階が中間オリゴマーを単離せずに行われるかぎりにおいて記載されている。

ｆ４１２：ｄｄＡ＊スホルアミダイト：５′　−ジイソフロピルアミノメトキシポスフィニル−２’　、３’　−ジデオキシアデノシンの合成Ｎ、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（１，３９■Ｌ　８ｍｌ１ｏｌ）及びクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（０，９８ｍｌ、５ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（６１）中２’、３’　−ジデオキシアデノシン（４７０，５ｍｇ１２ｓｍｏｌ）の溶液に加える。混合液をアルゴン雰囲気下室温で３０分間攪拌し、しかる後酢酸エチル（８０ｍｌ）含有分液漏斗中に注ぐ。得られた溶液を塩水（４Ｘ　５０ｍ１）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発乾固させる。得られた残渣をシリカゲルカラムでクロマトグラフィーに付し、溶出をシクロヘキサン、ジクロロメタン及びトリエチルアミン混合ｉ！　（９０／９／１〜３０／６９／１゜ｖ／ｖ／ｖ）で行う。望ましい純粋生成物含有画分を合わせ、蒸発乾固させ、残渣をジオキサンに再溶解し、凍結乾燥する。無色粉末（３４５，３１ｇ１収率４４％）を得る。

−３１ｐＮ月Ｒ（ＣＤ３ＯＮ）　１４９−１ｉ９ｐｐ■−’ＨＮＭＩ？（ＣＤ３Ｃ１３）　δ　１１．３３．１！、３２及び８．２８＜３ｓ、２Ｈ。

Ｈ２及びＨａ　）；６．３２（ｍ、ＬＨ，ｏ、　）；４．３４（ｉ、１１．　）＋４）；３．８３（Ｉｌ、２Ｈ１Ｈ５，及びＨ５，、）；３．５ｇ（ｓ、２Ｈ，ＯＨ（ＩＰｒ）２　）；３．４４及び３．４３（２ｄ、３）１．　Ｃ）１３０）：２−５０（１，２Ｈ，Ｈ２，及びＨ２，、）：２．１４（１１，２旧Ｈ３，及びＨａｌ、）：１．＋６（ｍ、１２Ｌ　ＣＨａ　（ｌＰｒ）　２　Ｌ注意：Ｓ− シングレット、ｄ−ダブレット、ｍ−マルチブレット。６−７ＭＳシグナルと比較してｐｐ■で表示された化学シフト一質量スペクトル：ＦＡＢ＜０　、ポリエチレングリコールマトリックス：（Ｍ−Ｈ）−−３９５；Ｂ−−１３４；　ＣＨ３０−Ｐ−（０−）Ｎ−（ＩＰｒ）２−１７８゜ＦＡＢ）０　、ポリエチレングリコールマトリックス：（Ｍ”Ｈ）”　−３９７：　（Ｍ ”Ｈ−）ＩＮ（ＩＰｒ）２　）　”　−２９８；（Ｍ十Ｈ−ＢＨ）　”　−２６２；（Ｍ＋Ｈ−ＣＨ３Ｏ−Ｐ（ＯＨ）Ｎ−＜ＩＰｒ）２）　”　−２１８：　ＣＨ３０−Ｐ−Ｎ（ＩＰｒ）　２及びＢ−Ｃ”−０−１８２；（Ｂ”Ｈ２）　”　 −１３８゜（ｌＩＪ３：ｄｄＮホスホルアミダイト：５′　−ジイソプロピル　アミノメトキシホスフィニル−２’　、３’　−ジデオキシネブラリンの合成Ｎ、Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルエチルアミン（０，６７１，３、８４４Ｂ＋ｍｏｌ）及びクロロ−Ｎ、Ｎ−ジイソプロピルアミノメトキシホスフィン（０，３５ｍＬ　１．８ｍｍｏｌ）を無水ジクロロメタン（５１）中２’、３’　−ジデオキシネブラリン（２１１，６ｍｇ、　０．　９６１ａ＋１ｏｌ）の懸濁液に加える。混合液をアルゴン雰囲気下室温で３０分間攪拌し、しかる後酢酸エチル（４０１）含有分液漏斗中に注ぐ。得られた溶液を塩水（４Ｘ　２５ｍ１）で洗浄する。有機相を硫酸ナトリウムで乾燥し、濾過し、減圧下で蒸発乾固させる。得られた残渣をジクロロメタン及びトリエチルアミン（９０／９／１〜５０／４９／１、　ｖ／ｖ／ｖ＞でシリカゲルカラムクロマトグラフィーに付す。望ましい純粋生成物含有画分を合わせ、蒸発乾固させ、ベンゼンに再溶解された残渣を凍結乾燥する。無色粉末（１６５，３ｍｇ、収率４５％）を得る。

−３１Ｐ　ＮＭＲ（ＣＤ３　ＣＮ）　１５０．０９ｐｐ謹−’ＨＩＪＭＲ＜ＣＤ　ＣＩ　）６９．０３（ｓ、１Ｎ、Ｈ、Ｈ又は３３　２　ＢＨ）：８．８８（ｓ、ＩＨ，）ｌ　ＳＨ又はＨ８）；１１．５９及び８．５５（２ｓ、ＩＨ？、　Ｈ５）ｌｅ又はＨｇ　）；６．４０（＋ｇ、ＩＨ，Ｈｒ）；４．３２（ｍ。

１Ｈ１Ｈ４に３．９３−３．６７（ｍ、２Ｈ２Ｈ５，及び）＋５．、　）：３．８１−３．５１（ｍ、２Ｈ５ＣＨ（ＩＰｒ）　２　）；３．３８及び３．３５（２ｄ、３）１．　ＣＨ３０，ＪＨＰ−１２，９及び１３．５Ｈｚ）；２Ｌ、５４（ｉ、２Ｈ，Ｈ、及びＨ２，、）；２．１８（ｍ。

２８、　Ｈ３，及びＨ３，、）；１．１３（ｍ、１２Ｈ，０Ｈ３（ｊＰｒ））。

−質量スベクトル：ＦＡＢ（０；ポリエチレングリコールマトリックス：（Ｍ−１１）　−３８０；Ｂ−−１１９；　ＣＨ３０−Ｐ−（０−）Ｎ−（ｉＰｒ）２　＝１７８゜ＦＡＢ＞Ｏ、ポリエチレングリコールマトリックス：（Ｍ”Ｈ）”　＝３８２；　（Ｍ＋Ｈ−ＨＮ（ｉＰｒ）２　）　”　−２８１；（Ｍ＋Ｈ−ＢＨ）　”　＝２６２；（Ｍ＋Ｈ−Ｃｌ　３０−Ｐ（ＯＨ）Ｎ−（ｉＰｒ）２　）　”　−２０３：　ＣＨ３０−Ｐ−Ｎ（ｉＰｒ）　２及びＢ−Ｃ”　！０−１８２；　Ｂ−Ｃｉ＝（１１４７；　（Ｂ＋）１２）　”　−１２１゜胆：ホスホルアミダイト法を用いた、固体支持体上における、ジデオキシネブラリンを５′末端で含有したオリゴヌクレオチドの合成ジデオキシネブラリンは文献で記載された方法（例えば、β−配置のオリゴデオキシリボヌクレオチドの場合ではシアノエチルホスホルアミダイト法及びα＝配装のオリゴデオキシリボヌクレオチドの場合ではメチルホスホルアミダイト法：　Ｆ、Ｍａｒｖａｎ、Ｂ、Ｒａｙｎｅｒ、Ｊ、Ｐ、Ｌｅｏｎｅｔｔｆａｎｄ　Ｊ、Ｌ、１ｓｂａｃｈ、Ｎｕｃｌｅｌｃ　Ａｃ１ｄｓ　Ｒｅｓ、、１８．８３３− ８４７．１９８８）に従い常法によりμ−０１量で製造されたオリゴヌクレオチドの合成の最終段階において組込む。

ｄｄＮメチルホスホルアミダイトシントンのカップリングサイクルはメチルホスホルアミダイト法で用いられるサイクルである（前記参考文献）。脱トリチル化段階はこのサイクルの最後で省略される。

オリゴヌクレオチドの脱保護：この脱保護は全く慣用的であり、用いられるリン酸保護基の性質に依存している。

こうしてα−配置のオリゴヌクレオチドの場合に、リン酸の脱保護はチオフェノール／Ｅｔ３Ｎ／ジオキサン（１／ｌ／２．Ｖ／Ｖ／Ｖ）の溶液を用いて室温で３０分間行われ、支持体からのオリゴヌクレオチド除去は室温で３０分間にわたり３２％ＮＨ４ＯＨとの処理で３回行われ、（キャッピングによる）アシル基で保護された官能基の脱保護は３２％ＮＨ４ＯＨを用いて５５″で１６時間行われる。

ＮＨ４ＯＨ処理のみは配置のオリゴデオキシリボヌクレオチドの場合で用いられる。

例５：ウサギグロビン遺伝子の“キャップ“末端に対するオリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端で９−アミノエリブチシンを用いる官能化ジデオキシネブラリンを５′末端に含んだオリゴヌクレオチド（脱保護後に得られた粗反応混合物、２６０　ｎｍで７２吸光単位）を塩酸の１００５Ｍ溶液（３００μｎ＞に溶解する。

混合液を３７℃で１４分間放置する。反応の進行は後記の条件下でＨＰＬＣによりモニターする。

出発オリゴヌクレオチド（ＲＴ　−１７，２０ｓｉｎ、５ａｘ＝２５９．２ｎｓ）の消失及び鎖０ＣＨ−（ＣＨ２）　２−ＣＨＯ）Ｉ−ＣＨ２０−Ｐ−（０″″ ）０゜（ＲＴ−１５，０３１１ｉｎ、λＩＩａｘ−２５９，２ｎｍ）を５′末端に含むオリゴヌクレオチドの形成（λｌ１ａｘ−２６３．４ｎｍ）が観察される。

これら１４分間の酸処理の最後に、ｐＨ５の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（４００ μｇ）中水素化シアノホウ素ナトリウム（６，２ｍｇ、　１００　μｍｏｌ）の溶液、水（５００μｇ）しかる後２０５Ｍ塩酸中９−アミノエリブチシンの１０ｎＭ溶液を連続的に加える。反応混合液を室温で３０分間放置する。この段階において、反応混合液のＨＰＬＣ分析では中間オリゴヌクレオチド（Ｒニー１５．０３ｉｉｎ）の消失及びアミノエリブチシンに結合されたオリゴヌクレオチド（Ｒ−ｒ−１７−８０ｉｉｎ、λｍａｘ−２５９，２ｎｍ及び３０７．２ｎｍ）の形成について示す。次いでこの後者の化合物をＨＰＬＣて精製する。

得られた官能化オリゴヌクレオチドの量は２６０　ｔｖで２９吸光単位である。

この化合物のスペクトル測定純度はこの同波長で９９％である。

用いられたＨＰＬＣ条件注入：１０μｇ３　ｕ　Ｘｌ−０ＤＳ　Ｃｔａベックマンカラム流速１　ｍｌ／ｗｉｎで３０分間にわたるｐＨ５，９の０．　１Ｍ酢酸アンモニウム緩衝液中アセトニトリルの５％溶液から同緩衝液中アセトニトリルの１５％溶液までの直線勾配例６：ＨＩＶ１ウィルスのｔａｔ遺伝子のスプライシング部位に対するβ−オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端で９−アミノエリブチシンを用いる官能化ジデオキシネブラリンを５′末端に含んだオリゴヌクレオチド（脱保護後に得られた粗反応混合物、２６０ｎ■で８０．５吸光単位）を水（７００μＩＩ）に溶解する。

次いで塩酸の１００ｍＭ溶液（３００μｇ）を加える。混合液を３７℃で１２分間放置する。反応の進行は後記の条件下でＨＰＬＣによりモニターする。出発オリゴヌクレオチド（ＲＴ＝　１６．７８ｍ１ｎ、λｗａｘ−２６２．４ｎｗ）の消失とネブラリン塩基（ＲＴ−８，９１ｍ１ｎ　、λ５ａｘ−２６３．４ｎｗ））及び鎖０ＣＨ−（ＣＨ）　−ＣＨｏＨ−ＣＨ２０−Ｐ−（０−）Ｏ□−を５′ 末端１こ含むオリゴヌクレオチド（ＲＴ＝　１６．１８ｓｉｎ、λｍａｘ−２８２，４ｎＩＩ）の同時形成が観察される。

これら１２分間の酸処理の最後に、ｐＨ５の１Ｍ酢酸ナトリウム緩衝液（４００ μｇ）中水素化シアノホウ素ナトリウム（６，２１，１００μｍｏｌ）の溶液、水（５００μＮ）Ｌかる後２０ＩＩＭ塩酸中９−アミノエリブチシンの１０ｎＭ溶液を連続的に加える。反応混合液を室温で３０分間放置する。この段階において、反応混合液のＨＰＬＣ分析では中間オリゴヌクレオチドＣＲＴ−１１ｉ、１６ｍ１ｎ）の消失及びアミノエリブチシンに結合されたオリゴヌクレオチド（ＲＴ−１７，８８ｍ１ｎ、λｗａｘ−２８２，４ｎＩＩ及び３０７．２ｎｉ）の形成について示す。次いでこの後者の化合物をＨＰＬＣで精製する。

得られた官能化オリゴヌクレオチドの量は２６０　ｎｍで３３吸光単位である。

この化合物のスペクトル測定純度はこの同波長で９４％である。

用いられたＨＰＬＣ条件注入：１０μｇ３μ　ｘＬＯＤＳ０１８ベックマンカラム流速１　ｍｌ／１ｎで２０分間にわたるｐＨ５，９の酢酸アンモニウム緩衝液の０．１Ｍ溶液から同緩衝液中アセトニトリルの２０％溶液までの直線勾配要　約　書本発明の主題は式ＲＮＨ２のアミン含有反応剤を用いてオリゴヌクレオチドをその５′ＯＨ末端で官能化するためのプロセスであって、下記段階：ａ）上記オリゴヌクレオチドが合成される；ｂ）ジデオキシヌクレオチドが上記オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端にその５′末端で結合される；Ｃ）共有結合が、上記オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端においてジデオキシヌクレオチドのグリコシド環の酸加水分解による開環から誘導されるオリゴヌクレオチドの５′ ＯＨ末端におけるアルデヒド官能基と上記アミノ試薬との還元アミノ化反応を用いて上記オリゴヌクレオチドと上記ＲＮＨ２アミノ試薬とで行われる；からなることを特徴とする。

国際調査報告国際調査報告ＦＲ９１００５０３Ｓ＾　４８７８８

Claims

【特許請求の範囲】

１．式ＲＮＨ２のアミン含有反応剤を用いてオリゴヌクレオチドをその５′ＯＨ末端で官能化するための方法であって、下記段階：ａ）上記オリゴヌクレオチドが合成される；ｂ）ジデオキシヌクレオチドが上記オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端にその５′末端で結合される；ｃ）共有結合が、上記オリゴヌクレオチドの５′ＯＨ末端においてジデオキシヌクレオチドのグリコシド環の酸加水分解による開環から誘導されるオリゴヌクレオチドの５′ ＯＨ末端におけるアルデヒド官能基と上記アミノ試薬との還元アミノ化反応を用いて上記オリゴヌクレオチドと上記ＲＮＨ２アミノ試薬とで行われる；からなることを特徴とする方法。
２．段階ａ）及びｂ）において、オリゴヌクレオチドの合成が、固体支持体上におけるホスホルアミダイト結合合成であって、その最終段階ではホスホルアミダイト誘導体が、上記オリゴヌクレオチドの５′末端に付加合成サイクルを用いて結合されるジデオキシヌクレオチドに対応したジデオキシヌクレオシドの５′で用いられる、請求項１に記載の方法。
３．段階ａ）及びｂ）の後かつ段階ｃ）の前において、５′末端においてジデオキシヌクレオチドが結合されたオリゴヌクレオチドからなる化合物が固体支持体から除去され、かつ保護基が除去される、請求項１又は２に記載の方法。
４．ジデオキシヌクレオシドホスホルアミダイト誘導体が下記式： ▲数式、化学式、表等があります▼（Ｉ）〔上記式中： −Ｒ１及びＲ２はＣＨ３、ＣＨ（ＣＨ３）２のような場合により置換されたＣ１ −Ｃ７アルキルを表すか又はＲ１及びＲ２は一緒になってモルホリノ基：▲数式、化学式、表等があります▼ を形成する； −Ｒ３は場合により置換されたＣ１−Ｃ７アルキル、特にＣＨ３又はＣＨ２ＣＨ２ＣＮを表す；−Ｂは核酸塩基、特にアデニン、グアニン又はネブラリンを表す〕である、請求項１〜３のいずれか一項に記載の方法。
５．官能化されたオリゴヌクレオチドが下記式：▲数式、化学式、表等があります▼ 〔上記式中： −ＲＮＨはアミン含有反応剤ＲＮＨ２の一価残基である； −Ｊ＝Ｈ又はＯＨ； −残基Ｂは互いに同一でも又は異なっていてもよく、各々α又はβ−アノマー配置でグリコシド環に結合された、場合により修正された核酸の塩基を表す；−基Ｘは互いに同一でも又は異なっていてもよく、オキソ陰イオンＯ−、チオ陰イオンＳ−、アルキル基、アルコキシもしくはアリールオキシ基又はアミノアルキル、アミノアルコキシもしくはチオアルキル基を表す；−ｎは１〜５０である〕である、請求項１〜４のいずれか一項に記載の方法。
６．Ｘ＝Ｏ−、Ｓ−又はＣＨ３である、請求項１〜５のいずれか一項に記載の方法。
７．反応剤のＲＮＨ残基が： −下記式のエチレンジアミン四酢酸誘導基：▲数式、化学式、表等があります▼ −ジエチレントリアミン五酢酸誘導基 −下記式のメチルピロポルフィリン誘導基：▲数式、化学式、表等があります▼ −下記式のフェナントロリン誘導基： ▲数式、化学式、表等があります▼ −アクリジン誘導基： ▲数式、化学式、表等があります▼ −プロフラピン誘導基： ▲数式、化学式、表等があります▼ 〔Ｒ１はアミノ（ＮＨ２）又はアジド（Ｎ３）基を表す〕−９−アミノエリプチシン： ▲数式、化学式、表等があります▼ を表す、請求項１〜６のいずれか一項に記載の方法。
８．段階ｃ）における還元アミノ化反応が酸媒体中で水素化シアノホウ素ナトリウム処理を用いて行われる、請求項１〜７のいずれか一項に記載の方法。
９．下記一般式： ▲数式、化学式、表等があります▼ （上記式中Ｒ１、Ｒ２、Ｒ３及びＢは請求項４で示された意味を有する）に相当することで特徴付けられる、請求項１〜８のいずれか一項に記載の方法で有用なシントン。
１０．Ｂがアデニン、グアニン又はネブラリンを表す、請求項９に記載のシントン。