JP2000500649A - ＩｇＧ分離媒体および新規プロテインＡ変異体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 基本マトリックスおよび、システインを含む組み換えプロテインＡを提示するマトリックス結合基を含む分離媒体。該基は式

Description

【発明の詳細な説明】 ＩｇＧ分離媒体および新規プロテインＡ変異体 ＩｇＧ−結合タンパク質を提示する吸着剤が、２０年以上、水性媒体中のＩｇ Ｇを捕獲するために使用されている。最初に、天然プロテインＡ(ＧＢ１,４４１ ,９７９(Ｓjoqvist))が使用された。後に、組み換え的に製造される形のプロテ インＡおよびプロテインＧ((ＷＯ８４００７７３)(Ｌofdahl,et al)およびＥＰ ２６２,１９２(Ｇuss，et al)およびＵ.Ｓ.５,０８２,７７３(Ｆahnestock))が 開発された。 プロテインＡは、動物種に関しては広いＩｇＧ−特異性を有するが、特異性は サブクラスによって変化し得る(例えば、ヒトＩｇＧ３はプロテインＡに結合し ない)。プロテインＧは、主要な重要な哺乳類種の全てのＩｇＧサブクラスに結 合する。プロテインＧと比較したプロテインＡの利点は、ＩｇＧとの結合が弱く 、プロテインＡからＩｇＧを遊離するために、相対的に緩和な条件が使用できる ことである。これは、個々のモノクローナル抗体の精製に重要である。 組み換え技術は、異なるドメインの機能に関して、ＩｇＧ−結合タンパク質の 簡単な地図作成を可能にする。プロテインＡの場合、天然の形は５つの連続して 配列されたＩｇＧ−結合ドメイン(Ｅ、Ｄ、Ａ、ＢおよびＣ)、続いてＩｇＧに結 合しないＸ−ドメインを含むことが判明した。新規方法は、ＩｇＧ−結合フラグ メントおよび、１個またはそれ以上のアミノ酸が置換、付加または欠失している 変異体の製造を容易にする。特記しない限り、プロテインＡという記載は、天然 形またはＩｇＧ−結合フラグメントおよび天然プロテインＡと同じＩｇＧ特異性 を有するプロテインＡの変異体を意味する。システインを含むプロテインＡの変 異体は、相対的に初期に製造され、挿入されたシステイン残基は基本マトリック スへの結合に使用された。システインをＣ−末端残基として置かないことが重要 であった。システインを、Ｃ−末端部で最後から２番目のアミノ酸として有する 変異体は、ジスルフィド形成により活性化Thiol Sheparose(登録商標)(Pharmaci a Biotech AB，Uppsala，Sweden)に結合し、ＩｇＧ−分離媒体として研究されて いる(T．Profy(Repligen)；ＥＰ２８４,３６８およびＵ.Ｓ.５,０８４,５５９) 。同様の研究がまたＦＡＳＥＢ ８７、１９８７年３月２９日−４月２日（ポス ターＮ４４、Profy，et al)でも提示された。Ｃ−末端リンカー配列(Ｃ−末端か ら１０個の配列)にシステインを有するプロテインＡの３つの変異体(１、２およ び５ドメイン)で得られた結果は、後に提示された。これらの後の変異体は、ま たジスルフィド結合形成によりチオプロピルＳepharose(登録商標)に共有的に結 合した。トレシルクロライドまたはトシルクロライド活性化ゲルへの固定化が、 還元的感受性結合基を避ける意図で、別法として示された。等モル関係が、Ｉｇ Ｇ結合キャパシティーと１ドメインおよび２ドメイン変異体のドメインの数の間 で判明した。５ドメイン変異体はＩｇＧの２倍モル量以上は決して結合しなかっ た。天然プロテインＡの可溶性形で初期に達成されたものと同等のＩｇＧ−キャ パシティーが達成された(ある適用において、非−ｃｙｓ−含有変異体が２から ３の間のモル結合比を与えるということが後に発見された)。 それと平行して、Ｇenex(Ｕ.Ｓ.４,９７７,２４７(Ｆahnestock，et al))が、 システインがＩｇＧ−結合ドメインのＣ−末端位置に置かれたrProtein Ｇ−cy sの組み換え変異体を製造している。このプロテインＧ変異体を基にした分離媒 体の製造において、選択は、rProtein G-cysの２官キャパシティー性試薬４−( ｐ−マレイミドフェニル)酪酸Ｎ−スルホサクシンイミジルで活性化したアミノ ヘキシル−アガロース(Ｕ.Ｓ.４,９７７,２４７、請求項１および１８欄、２２ −３７行)への共有結合に関してであった。GammaBindG(登録商標)(Pharmacia Bi otech AB)は商品として入手可能な、Ｃ−末端残基としてシステインを有する固 相rProtein G-cys生産物である。生産物は、システイン残基を、４−(Ｎ−マレ イミドメチル)シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−スルホサクシンイミジルで 活性化したアミノヘキシルアガロースと結合させることにより合成する。 我々が気づいている限り、Repligenにより製造されたマトリックス−結合rPro tein A-cysは商品として有利であるとされたことはない。理由は、マトリック スへの結合が不安定な構造(−Ｓ−Ｓ−)によるものであるということであり得る が、理由は我々が知らないファクターによるものでもあり得る。しかしながら、 理由がどうであれ、完全に商品として優性である吸着剤は、天然プロテインＡま たはシステインを欠く組み換えプロテインＡの異なる形を使用している。プロテ インＧを基本にした商品の市場は、恐らくプロテインＡがより有利な結合特性を 有するため、これまで本質的に小さかった。 本発明の目的 本発明の目的は、ａ)プロテインＡのＩｇＧ−結合特異性；ｂ)天然プロテイン Ａを基本にした他の吸着剤と少なくとも同程度の安定性；ｃ)マトリックス結合r Protein A-cysの既知の変異体と比較して、同じまたは改善されたＩｇＧ結合の キャパシティー(先にmol ＩｇＧ／mol プロテインＡのcys-変異体の比率とし て、１、２またはそれ以上のＩｇＧ結合ドメインと先に計算された)を有する吸 着媒体を提供するという必要性に要約できる。２またはそれ以上のドメインを有 する変異体に関して、これはモル比＞２であることを意味する。これらの目的の 達成は、異なる出発物質からのＩｇＧの洗浄に使用するより有効な方法を可能に する。 本発明 本発明の主態様は、式Ｉ： −Ｂ−Ｘ−rProtein A-cys Ｉ 〔式中、 ａ．rProtein A-cysはそのアミノ酸配列にシステインを含む組み換え的に製造 されたプロテインＡ； ｂ．Ｂは基本マトリックスに結合する橋；および ｃ．ＸはrProtein A-cys由来のヘテロ原子ＮまたはＳを含む〕 に従った基で置換された基本マトリックスを含む分離媒体である。 特徴的性質は、Ｘがチオエーテル硫黄(−Ｓ−)および／または２級アミン(− ＮＨ−)であることであり、即ち、一つのおよび同じ分離媒体において、Ｘは、 本質的に１００％の全てのＸがチオエーテル硫黄であるように、５０％の選択性 で、チオエーテル硫黄または／および２級アミンのいずれかまたは両方であり得 る。 全ＩｇＧ結合キャパシティーとマトリックスのＩｇＧの量の間の最適モル比は 、吸着剤のプロテインＡに存在するＩｇＧ−結合ドメインの数に依存して変化し 得る。１ドメイン変異体において、比率は１であり、２ドメイン変異体において 比率は≒２である。３、４および５ドメイン変異体に関しては、比率は≒２また は好ましくは＞２である。最大値は、ＩｇＧ−結合ドメインの数により決定され 、それと共に使用するプロテインＡ構築物次第である。 本発明のこの態様において、Ｂは、本質的に、ＩｇＧの吸着／脱着に適応する 条件下(時間、温度、ｐＨ等)で十分な安定性を有する任意のものであり得る。橋 −Ｂ−の適切な構造の例は、アミド、エステル、エーテル、チオエーテル、炭化 水素鎖、アゾ、カルバメート等である。鎖−Ｂ−に存在する炭化水素は直鎖、分 枝鎖または環状であり得、一般に飽和炭素原子のみを有する(２−１０炭素原子 、好ましくは２、３または４個の炭素原子で明白な親水性性質を保持する)。橋 −Ｂ−が基本マトリックスにエーテル構造またはアミド／エステル構造により結 合しているのが好ましい。Ｂが、所望により１個またはそれ以上の酸素／窒素原 子で中断され、１個またはそれ以上のアミノまたはヒドロキシ基で置換されてい てもよい、直鎖または環状飽和炭化水素鎖を含むことも好ましい。安定性の理由 のため、１個および同じ炭素原子が最大１個の酸素または窒素原子と結合してい る。−Ｂ−として無条件に好ましい構造は、rProtein A-cysがマトリックスに エポキシ基またはエピハロ基により結合している時に発生するもの、即ち、その 右端(Ｘに最も近い)に存在するＢが構造 −ＣＨ₂−ＣＨＯＨ−ＣＨ₂− であるものである。Ｘは、リジン中のε−アミノ基またはＮ−末端アミノ基また はシステイン中のチオール基のいずれが結合しているかに依存して、２級アミン またはチオエーテルとなる。 前記橋構造は、現在の方法に従って、例えば、エピクロロヒドリン、ビスエポ キシド(１,４−ビス(２,３−エポキシプロポキシ)ブタン、４−(マレイミドメチ ル)−シクロヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−スルホサクシンイミジル等)のような ２機能性試薬の使用により形成できる。適切な基本マトリックスは、それらが多 かれ少なかれチオールまたはアミノ基と選択的に反応する基を含むように、この ような試薬で活性化し得る。好ましい結合試薬および条件は、１級アミノ基(リ シル中のε−アミノおよびＮ−アミノ末端)と非常に僅かしか反応しない。 rProtein A-cysの適切な形は、天然配列中にシステインで置換されたアミノ 酸を有する。あるいは、システインが、末端に融合しているアミノ酸配列(リン カー)に、または天然配列の挿入としてまたはそのＩｇＧ−結合部位として存在 できる。システインはまた、好ましくはＩｇＧ−結合ドメインのＮ−末端または Ｃ−末端である、ペプチドリンカー中にも含まれ得る。一般に、末端システイン は内部システインとするのが好ましい。使用するリンカーの長さは、通常重要で はなく、例えば、１から１５アミノ酸残基で変化し得る。全てのシステイン修飾 に関して、ＩｇＧ結合キャパシティーが失われないことが必須である。 rProtein A-cysはまた他の方法でも修飾し得る。例えば、rProtein A-cysは 、プロテインＡからのＩｇＧ−結合ドメインに加えて、１個またはそれ以上のプ ロテインＧ由来または他のＩｇＧ−結合タンパク質由来のＩｇＧ−結合ドメイン も含む融合タンパク質であり得る(Guss，et al.，EP262,192参照)。天然ドメイ ンは、変更され得、１回またはそれ以上の回数発生し、また欠失し得る。天然非 ＩｇＧ−結合ドメインは完全にまたは一部欠失し得る。 rProtein A-cysは現法と同様にして製造できる(Profy T，EP294,386;およびL jungquist，et al.，Eur．J．Biochem．186(1989)，557-561)。 基本マトリックスは、多くのアミノ基および／またはヒドロキシ基、主に後者 を含む親水性ポリマーである。基本マトリックスは通常水性媒体に不溶性である 。基本マトリックスは、意図される使用に適した異なる基と架橋し得るおよび／ またはそれらを提供し得るデキストラン、セルロース、澱粉、アガロース、プル ラン、キシラン等のようなポリサッカライドに由来し得る。合成ポリマーの中で 、ヒドロキシアルキルアクリレートまたは対応するメタクリレートのポリマー、 ポリビニルアルコール、ビニルヒドロキシアルキルエーテルのポリマー等を特記 できる。ポリマーが可溶性である限り、水性媒体に不溶性な支持体、例えばスチ レ ンジビニルベンゼンコポリマーと架橋または吸着または共有結合させて、不溶性 にできる。基本マトリックスは、多かれ少なかれ球状および／または多孔性また は非孔性であり得る粒子の形でもよい。マトリックスの一つの具体的な形は、ジ ビニルベンゼン−スチレンコポリマーまたは他の疎水性ポリマー／コポリマーか ら成る多孔性疎水性粒子であり、その内部および／または外部表面は親水性であ り、ＯＨ−基を備える。態様の一つの好ましいタイプにおいて、マトリックスは 通常水性媒体に不溶性であり、多孔性であり、ポリサッカライドを基本とする。 本発明の他の主要な態様は、分離媒体へのＩｇＧの結合(吸着)に関する。次い で、ＩｇＧを前記のように分離媒体と接触させる。吸着は、通常、ＩｇＧを製造 できる血清または細胞培養物に由来する水性媒体で起こる。適当な条件は、０− ３５℃、ｐＨ６−８、塩濃度０.１−３Ｍの範囲である(結合するＩｇＧのタイプ に依存)。結合ＩgＧの脱着前に、分離媒体を、適当には本質的に吸着緩衝液と同 じｐＨの緩衝液で通常洗浄し、その後脱着を慣用的に、例えば、５より下のｐＨ を有する緩衝液で処置することにより行う。条件は非変性的であるべきである。 Ｃ−末端にシステインを有するrProtein A-cysは新規である。 本発明の分離媒体へのＩｇＧの結合は、広い範囲で使用される。溶液からのＩ ｇＧの捕獲を含む方法、即ち、水性溶液に溶解しているＩｇＧをそこに存在する 他の成分から分離するために使用できる。ＩｇＧの結合は、クロマトグラフィー 中またはバッチ法の方法中の段階の一部であり得る。ＩｇＧの結合は、いわゆる イムノアッセイまたは全血または血漿からＩｇＧを除去するための生体外法の一 部でもあり得る。使用の主要な領域は(モノクローナル抗体を含む)ＩｇＧの精製 に見られる。 本発明の非常に好都合な態様は、Ｃ−末端システインによるrProtein A-cys の、Anval(登録商標)(Anval，Torshalla，Swedem)のような浸した充填粒子を含 むクロマトグラフィー粒子マトリックスへの結合である。このようにして得たク ロマトグラフィー支持体は、固定化流動性ベッドにおけるＩｇＧのクロマトグラ フィー的分離に非常に有用であることが判明した。"吸着法および分離媒体"に関 する我々の同時の特許出願ＳＥ９５０３９２６−９を参照(引用して包含させる) 。 拡張／流動化ベッドでのクロマトグラフィーに関しては、ＷＯ９２１８２３７(P harmacia Biotech AB)参照。 実験部分 rProtein A-cysの製造 rProtein A-cysはＥＰ２８４,３６８の記載またはLjungqvist，et al.，Eur ．J．Biochem．186(1989)，557-561と同様にして製造した。配列は、最初の１８ 個のアミノ酸(シグナル配列)が欠失し、最後の１０３アミノ酸がＣ−末端にシス テインを有するヘキサペプチドに置換されている以外、ＥＰ２８４,３６５の記 載と同一であった。 rProtein A-cysの基本マトリックスへの結合 １,４−ビス(２,３−エポキシプロポキシ)ブタン(ＢＰＲ−ブタン)による活性 化。１リットルの排出(drained)Sepharose(登録商標)ＦＦ(エピクロロヒドリン と架橋したビーズの形のアガロース、Pharmacia Biotech AB，Uppsala，Sweden) を蒸留水でフィルター漏斗上で洗浄し、３００ml蒸留水に溶解した５５ｇ Ｎａ ＯＨと、３５℃で、システムを攪拌しながら温度制御反応器中で混合した。３９ ０ml ＢＰＲ−ブタンを添加した。システムを２時間、３５℃で攪拌し、続いて １５ｌ水で洗浄した。 rProtein A-cysの結合。活性化ゲルをフィルター漏斗で、３×１リットルの 、窒素ガスを飽和させた０.１Ｍ Ｎａ−リン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.５ で洗浄し、水分を排出させた。次いでゲルを、窒素ガスを飽和させた０.１Ｍ Ｎａ−リン酸、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ８.５に溶解した５.５ｇ rProtein A- cysと混合した。システムを、窒素ガスを通しながら３７℃で攪拌した。硫酸ナ トリウム(３７０ｇ)を添加した。システムを２時間、３７℃で攪拌した後、ゲル を３ｌ蒸留水で洗浄し、吸引により水抜きした。 脱活性化。水抜きしたゲルを、９００ml ０.２Ｍ炭酸水素ナトリウム、０.１ Ｍ ＮａＣｌ、１ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ１０に溶解した１００mlチオグリセロー ルと、システムを攪拌しながら混合した。システムを一晩、３７℃で攪拌し、そ の後ゲルをフィルター漏斗で、０.１Ｍトリス、０.１５Ｍ ＮａＣｌ、ｐＨ８お よび０.０５Ｍ酢酸で、各サイクル３×１ゲル容量で３サイクル洗浄した。ゲル を最後に水で洗浄した。 ヒトＩｇＧの全キャパシティーの測定 装置： スーパーループを有するＦＰＬＣ(Pharmacia Biotech AB) カラム： １ml ＨＲ ５／５(Pharmacia Biotech AB) 緩衝液Ａ： １０ｍＭ リン酸２水素ナトリウム、０.１５Ｍ 塩化ナ トリウム、１０ｍＭ ＥＤＴＡ、ｐＨ７ 緩衝液Ｂ： ０.５Ｍ酢酸(約２.７のｐＨを付与する) ＩｇＧ−溶液： 緩衝液Ａ中の１５０mg ヒトＩｇＧ(遠心および濾過) プリンター速度： ０.０５−０.２５cm／分 １.０mlの排出ゲルをカラムに詰め、緩衝液Ａで平衡化した。ＩｇＧ−溶液を 流速０.１５ml／分で、ゲルがＩｇＧ飽和となるまでスーパーループを通して流 した。緩衝液Ａで同じ流速で洗浄した後、結合ＩｇＧを９ml緩衝液Ｂで、０.３ ０ml／分の流速で溶出した。緩衝液Ｂでの溶出物を回収し、その容量を測定した (秤量)。１：１０に希釈した後、Ａ₂₈₀を読み取った。ＩｇＧ−キャパシティー の決定に適応させた式は：溶出容量ml×溶出容量でのＡ₂₈₀×７.２４４＝mg排出 ゲルのＩｇＧ／mlであった。 ヒトＩｇＧの除去キャパシティーＱ_Bの測定 カラム： ＸＫ１６／２０(Pharmacia Biotech AB) 緩衝液Ａ： ２０ｍＭ Ｎａ−リン酸、ｐＨ７.０ 緩衝液Ｂ： ０.１Ｍグリシン、ｐＨ３.０ ＩｇＧ−溶液： 約０.５ｇ ＩｇＧ／リットル緩衝液Ａ 流速： １０ml／分(３００cm／h) プリンター速度： ０.０２cm／ml カラム容量： ２３ml ＩｇＧ溶液の輸送は、溶出液で測定しているｃ／ｃ₀(ｃおよびｃ₀はカラムに 通した後および通す前のタンパク質濃度である)が１％に到達した時に妨害され た。次いで、吸着ＩｇＧを緩衝液Ｂで溶出し、その容量をmg ＩｇＧ／ml排出ゲ ルとして測定した。 最も高い力学的キャパシティーを提供した結合実験の結果および条件は：Ｎａ −硫酸１.３Ｍ；rProtein A-cysの装填量７．１mg／mlゲル；結合緩衝液ｐＨ８ .５；結合温度３７℃；結合時間２時間；全キャパシティー５２.２mg ＩｇＧ／ mlゲル；除去キャパシティーｃ／ｃ₀＝１％で３１.３mg／mlゲルであった。５− ６mg rProtein A-cysを各mlゲルに装填した実験において、大きい相対的力学 的キャパシティーが得られた。 他の結合法 rProtein A-cysのエポキシ結合を、Ｎ−ヒドロキシサクシンイミド(ＮＨＳ) に結合した天然プロテインＡ(システイン欠失)と、４−(Ｎ−マレイミドメチル) シクロ−ヘキサン−１−カルボン酸Ｎ−スルホサクシンイミジル(Sulfo-SMCC)に 結合したProtein A-cysで比較した。天然プロテインとＮＨＳまたはエポキシド との結合において、rProtein A-cysの結合はチオール基により行われる。rProt ein A-cysとエポキシ(ＢＰＲ)の結合において、結合はアミノ基においてのみ起 こる。試薬Sulfo-SMCCの場合、結合はチオール基およびアミノ基の両方について 起こり、優性はｐＨにより測定できる。置換のかなりの程度で、全キャパシティ ーはＮＨＳ、エポキシ、Sulfo-SMCCの順番で増加した。差異は、恐らく末端に位 置しない基を経由したアミン結合によるステアリン効果によるものであろう。rP rotein ＧとrProtein G-cysの比較試験もまた下記に報告する。 ¹⁾Pharmacia Biotech AB、²⁾内部仕分け番号、³⁾具体化していない、⁴⁾GammaBin dG(登録商標)タイプ２はプロテインＧおよびGammaBindG(登録商標)タイプ３はシ ステインをＣ−末端に有するプロテインＧ。両方の変異体は二つのＩｇＧ−結合 ドメインを有する。 結果は、非常に良好な全キャパシティーおよび除去キャパシティーが達成され 、mol ＩｇＧ／mol rProtein A-cysのキャパシティーは、ｃｙｓ−含有Ｉｇ Ｇ−結合タンパク質について以前に達成されたものより遥かに優れていることを 示した。 ヒトＩｇＧの除去キャパシティー。異なるプロテインＡとの比較実験。 方法：プロテインＡマトリックス(rProtein Ａ Sepharose（登録商標）Fast Flo w)(本発明、エポキシにより固定化)；Protein A Sepharose（登録商標）4 Fast Flow(ＣＮＢｒにより固定化、Pharmacia Biotech AB)；PROSEP A(登録商標)(Bio processing Ltd.，UK)およびProtein A Hyper D(登録商標)(BioSepra S.A.，Fra nce)をＸＫ１６／２０カラムに、ベッド高１０cmまで詰めた。ゲルを２０ｍＭリ ン酸緩衝液、ｐＨ７.４で平衡化した。同じ緩衝液にヒトポリクローナルＩｇＧ( １mg／ml)を含むサンプルを各ゲルで、１９０cm／ｈの直線流動で流した。サン プル輸送を、溶出液中のＩｇＧ濃度がサンプル溶液の最初のＩｇＧ濃度の１０％ に到達したら中断した。非結合ＩｇＧを洗い流し、結合ＩｇＧを０.１Ｍクエン 酸、ｐＨ３で溶出した。除去キャパシティーＱ_Bを、溶出液中のＩｇＧの量がサ ンプル中の最初のＩｇＧ濃度の５％に到達した時に、ゲルml当たりに結合するＩ ｇＧの量として計算した。 溶出ＩｇＧフランクション中のプロテインＡの濃度をＥＬＩＳＡで測定した。 ＩｇＧフラクション中のプロテインＡの量をプロテインＡ／mg ＩｇＧとして得 る。 結果： これらの値は、本発明が、その除去キャパシティーが他の商品として入手可能 なマトリックスよりも高いプロテインＡ吸着剤の構築を可能とする。同じマトリ ックスと比較して、プロテインＡ放出に関する安定性は、大まかに同じか良好で ある。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．基本マトリックスおよび、システインを含む組み換えプロテインＡを提示 するマトリックス結合基を含み、該基が式 −Ｂ−Ｘ−rProtein A-cys Ｉ 〔式中、Ｂは基本マトリックスに結合する橋およびＸはrProtein A-cys由来の ヘテロ原子ＮまたはＳを含む〕 に従い、Ｘがチオエーテル硫黄(−Ｓ−)および／または２級アミン(−ＮＨ−)で あることを特徴とする、分離媒体。 ２．橋−Ｂ−がエーテルにより基本マトリックスに結合し、それが所望により １個またはそれ以上の酸素／窒素原子で中断され、１個またはそれ以上のアミノ またはヒドロキシ基で置換されていてもよい、直鎖または環状飽和炭化水素鎖を 含み、１個および同じ炭素原子が最大１個の酸素原子または窒素原子と結合して いる、請求項１記載の分離媒体。 ３．システインが末端ペプチドリンカーに含まれることを特徴とする、請求項 １−２に記載の分離媒体。 ４．ペプチドリンカーがＣ−末端であることを特徴とする、請求項１−３のい ずれかに記載の分離媒体。 ５．システインがrProtein A-cysのＣ−末端アミノ酸であることを特徴とす る、請求項１−４のいずれかに記載の分離媒体。 ６．基本マトリックスがポリヒドロキシポリマー、好ましくは不溶性ポリサッ カライドであることを特徴とする、請求項１−５のいずれかに記載の分離媒体。 ７．Ｃ−末端残基がシステインであることを特徴とする、組み換えプロテイン Ａ−ｃｙｓ。