JPH0684399B2 - ペプチド - Google Patents

ペプチド

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JPH0684399B2
JPH0684399B2 JP62295370A JP29537087A JPH0684399B2 JP H0684399 B2 JPH0684399 B2 JP H0684399B2 JP 62295370 A JP62295370 A JP 62295370A JP 29537087 A JP29537087 A JP 29537087A JP H0684399 B2 JPH0684399 B2 JP H0684399B2
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Description

【発明の詳細な説明】 〔産業上の利用分野〕 本発明は、新規なペプチドに関する。
本発明によつて提供されるペプチドは担持上に容易に固
定化され、次いで熱処理されることにより、ニコチン性
アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を特異的に
吸着しうる性能を発現する。従つて、本発明によつて提
供されるペプチドは、神経筋接合部のシナプス後膜上に
存在するニコチン性アセチルコリンレセプターに対する
自己抗体に原因する神経筋伝達障害が病態の中心である
とされている重症筋無力症の治療において有用である。
〔従来の技術〕
ネイチヤー（Nature）、第299巻、第793〜797頁（1982
年）には、シビレエイの１種であるトルペド・カリホル
ニカ（Torpedo californica）の電気器官から取得され
るニコチン性アセチルコリンレセプターのα−サブユニ
ツト前駆体が461個のアミノ酸から構成されており、そ
の一次構造を解明し得たことが報告されている。この報
告によれば、該α−サブユニツト前駆体の一次構造にお
ける第183〜200位のアミノ酸配列は式−Gly−Trp−Lys
−His−Trp−Val−Tyr−Tyr−Thr−Cys−Cys−Pro−Asp
−Thr−Pro−Tyr−Leu−Asp−で示されている。プロシ
ーデイングス・オブ・ザ・ナシヨナル・アカデミー・オ
ブ・サイエンシス・オブ・ザ・ユナテツド・ステーツ・
オブ・アメリカ（Proceedings of the National Academ
y of Sciences of the United States of America）、
第84巻、第3633〜3637頁（1987年）には、トルペド・カ
リホルニカの電気器官から取得されるニコチン性アセチ
ルコリンレセプターのα−サブユニツトの一次構造にお
ける第182〜198位のアミノ酸配列に対応するペプチドが
合成され、このペプチドをアガロース系担体〔CNBr−活
性化セフアロースCL−4B（CNBr−activated Sepharose
CL−4B）〕に固定化して形成させた吸着剤が、ニコチン
性アセチルコリンレセプターに対するマウス抗体および
ウサギ抗体と結合することが報告されている。バイオケ
ミカル・アンド・バイオフイジカル・リサーチ・コミユ
ニケーシヨンズ（Biochemical and Biophysical Resear
ch Communications）、第135巻、第82〜89頁（1986年）
には、トルペド・カリホルニカから取得されたニコチン
性アセチルコリンレセプターのα−サブユニツトをプロ
テアーゼで分解することによつて該α−サブユニツトの
一次構造における第153〜350位のアミノ酸配列に対応す
ると考えられる分子量18キロドルトンのフラグメントが
得られ、このフラグメントがニコチン性アセチルコリン
レセプターのリガンド結合部位に対するマウスモノクロ
ーン抗体およびα−ブンガロトキシンと結合することが
報告されている。
〔発明が解決しようとする問題点〕
重症筋無力症の治療において重症筋無力症の主たる原因
物質であるとされているニコチン性アセチルコリンレセ
プターに対するヒト自己抗体を除去する手段の確立が望
まれているが、その実用的な手段はまだ確立されていな
いのが実状である。
しかして、本発明の目的は、ニコチン性アセチルコリン
レセプターに対するヒト抗体を有効に吸着する能力を有
する吸着剤を効率的に製造するために有用な新規なペプ
チドを提供することにある。
（問題点を解決するための手段） 本発明によれば、上記目的は、一般式 Ｈ−Ｘ−Gly−Trp−Lys−His−Trp−Val−Tyr−Tyr−Th
r−Cys−Cys−Pro−Asp−Thr−Pro−Tyr−Leu−Asp−Ｙ
−Ｚ （Ｉ） 〔式中、ＸおよびＹは一方が単結合を表わすか、または
Asp、Glu、Lysおよび （式中、ｎは１〜17の整数を表わす。）で示される二価
の基からなる群から選ばれるアミノ酸残基もしくは該群
から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基の２〜10個
がペプチド結合によつて形成するペプチド残基を表わ
し、他方がAsp、Glu、Lysおよび （式中、ｎは前記定義のとおりである。）で示される二
価の基からなる群から選ばれるアミノ酸残基もしくは該
群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基の２〜10
個がペプチド結合によつて形成するペプチド残基を表わ
し、Ｚは水酸基またはアミノ酸を表わし、上記アミノ酸
配列のCys-Cysにおいて各々のCysが有するメルカプト基
は相互に結合してジスルフイド結合を形成していてもよ
い。〕 で示されるペプチドを提供することによつて達成され
る。
本発明書においては各種アミノ酸残基を慣例の略号で記
述する。略号は本発明の技術分野においてよく知られた
ものであるが、本発明に関係あるものを以下に列記す
る。
Asp:L−アスパラギン酸残基 Cys:L−システイン残基 Glu:L−グルタミン酸残基 Gly:グリシン残基 His:L−ヒスチジン残基 Leu:L−ロイシン残基 Lys:L−リジン残基 Pro:L−プロリン残基 Thr:L−トレオニン残基 Trp:L−トリプトフアン残基 Tyr:L−チロシン残基 Val:L−バリン残基 また本発明書においては、常法に従つてアミノ酸配列を
Ｎ末端のアミノ酸が左側に位置し、Ｃ末端のアミノ酸が
右側に位置するように記述する。
一般式（Ｉ）におけるＸおよびＹは上記のとおり定義さ
れるが、ＸおよびＹの両方が単結合であるペプチドなら
びにＸおよびＹのいずれかが上記で定義されたものと異
なるアミノ酸残基またはペプチド残基であるペプチド
は、担体上に効率よく固定化されない場合があるだけで
なく、担体上に固定化され熱処理されることによつても
ニコチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体
を吸着する能力が充分には発現しない場合がある。一般
式（Ｉ）におけるＸおよびＹが表わすペプチド残基とし
ては、例えば、次のペプチド残基を挙げることができ
る。
Asp−Asp−Lys−Lys−Glu−Gly−， −Lys−Glu−Glu−Gly−Asp−Asp−Lys−Lys−Gly−Gly
− 一般式（Ｉ）で示されるペプチドの合成は、ペプチドの
合成において通常用いられる方法、例えば、固相合成
法；または段階的伸長法、フラグメント縮合法のような
液相合成法により行われるが、固相合成法により行うの
が操作上簡便である〔例えば、ジヤーナル・オブ・ジ・
アメリカン・ケミカル・ソサエテイー（Journal of the
American Chemical Society）、第85巻、第2149〜2154
頁（1963年）；日本生化学会編「生化学実験講座１ タ
ンパク質の化学IV 化学修飾とペプチド合成」（昭和52
年11月15日 株式会社東京化学同人発行）、第207〜495
頁；日本生化学会編「続生化学実験講座２ タンパク質
の化学（下）」（昭和62年５月20年 株式会社東京化学
同人発行）、第641〜694頁など参照〕。
一般式（Ｉ）で示されるペプチドの固相合成法による製
造は、例えば、目的とするペプチドのＣ末端に対応する
アミノ酸またはアミノ酸アミドが有するα−カルボキシ
ル基またはα−カルバモイル基からそれぞれ水素原子を
除いて得られるアシルオキシ基またはアシルアミノ基を
結合させたスチレン−ジビニルベンゼン共重合体などの
反応溶媒に不溶性の重合体に、目的とするペプチドのＮ
末端の方向に向つて、対応するアミノ酸を該アミノ酸を
有するα−カルボキシル基以外のα−アミノ基などの官
能基を保護したうえで縮合させて結合させる操作と該結
合したアミノ酸におけるα−アミノ基などのペプチド結
合を形成するアミノ基が有する保護基を除去する操作を
順次繰返すことによつて、ペプチド鎖を伸長させ、目的
とするペプチドに対応するペプチド鎖を形成し、次いで
該ペプチド鎖を重合体から脱離させ、かつ保護されてい
る官能基から保護基を除去することにより目的とするペ
プチドを得、次いでこれを精製することによつて実施さ
れる。ここで、ペプチド鎖の重合体からの脱離および保
護基の除去はフツ化水素を用いて同時に行うのが副反応
を抑制する観点から好ましい。また、得られたペプチド
の精製は逆相液体クロマトグラフイーで行うのが効果的
である。
一般式（Ｉ）で示されるペプチドは担体上に効率的に固
定化することができる。担体上に固定化された一般式
（Ｉ）で示されるペプチドは、熱処理を受けることによ
つて、血清などの液体中のニコチン性アセチルコリンレ
セプターに対するヒト抗体を吸着する能力を顕著に発現
する。一般式（Ｉ）で示されるペプチドを固定化する際
に使用する担体としては、親水性の表面を有し、かつペ
プチドとの間で共有結合を形成させるために利用しうる
アミノ基、カルボキシル基、水酸基などの反応性の官能
基を有するものが好ましい。また該ペプチドを体液中の
ニコチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体
を吸着させるための吸着剤として使用する場合には、上
記の担体はさらに体液に不溶性であり、多孔性であるも
のが好ましい。多孔性の担体はニコチン性アセチルコリ
ンレセプターに対するヒト抗体を吸着させうる有効表面
積が広いことから、このような担体としては排除限界タ
ンパク質分子量が約106〜109の範囲内であるかまたは平
均細孔径が約50〜1000ナノメートルの範囲内であるもの
を使用するのが好ましい。担体は粒子状、繊維状、シー
ト状、中空糸状などの任意の形状であることができる。
かかる担体としては、例えば、CM−セルロフアインCH
（排除限界タンパク質分子量：約３×106；生化学工業
株式会社販売）などのセルロース系担体;CM−トヨパー
ル650C（排除限界タンパク質分子量:5×106；東ソー株
式会社製）などのポリビニルアルコール系担体;CM−ト
リスアクリルＭ（CM−Trisacryl M）〔排除限界タンパ
ク質分子量:1×107；スウエーデン国フアルマシア−LKB
（Pharmacia−LKB）社製〕などのポリアクリルアミド系
担体；セフアロースCL−4B（Sepharose CL−4B）〔排除
限界タンパク質分子量:2×107；スウエーデン国フアル
マシア−LKB（Pharmacia−LKB）社製〕などのアガロー
ス系担体などの有機質担体；およびCPG−10−1000〔排
除限界タンパク質分子量:1×108；平均細孔径:100nm;米
国エレクトロ−ニユークレオニクス（Electro−nucleon
ics）社製〕などの多孔性ガラスなどの無機質担体が挙
げられる。
一般式（Ｉ）で示されるペプチドの担体上への固定化
は、一般にペプチドまたはタンパク質を担体上に固定化
する場合に採用される方法に従つて行われる。その固定
化方法としては、例えば、担体が有するカルボキシル基
をＮ−ヒドロキシコハク酸イミドと反応させることによ
つてスクシンイミドオキシカルボニル基に変換し、これ
に一般式（Ｉ）で示されるペプチドをアミノ基の部分で
反応させる方法（活性エステル法）、担体が有するアミ
ノ基またはカルボキシル基にジシクロヘキシルカルボジ
イミドなどの縮合試薬の存在下で一般式（Ｉ）で示され
るペプチドのカルボキシル基またはアミノ基を縮合反応
させる方法（縮合法）、担体と一般式（Ｉ）で示される
ペプチドとをグルタルアルデヒドなどの２個以上の官能
基を有する化合物を用いて架橋する方法（担体架橋法）
などが挙げられる。一般式（Ｉ）で示されるペプチドを
活性エステル法で担体上に固定化して得られる吸着剤が
最も高いニコチン性アセチルコリンレセプターに対する
ヒト抗体の吸着能力を有する。一般式（Ｉ）で示される
ペプチドの担体上への固定化量は、得られる吸着剤がニ
コチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体の
有意量を吸着しうるためには通常約３×10-8モル/g（担
体）以上が必要であり、担体上に固定化された一般式
（Ｉ）で示されるペプチドがヒト抗体の吸着に有効に利
用されるためには約１×10-7〜10-6モル/g（担体）の範
囲内であるのが好ましい。
担体上に固定化された一般式（Ｉ）で示されるペプチド
は、前述のとおり熱処理を受けることによつてニコチン
性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を吸着す
る高い活性を発現する。熱処理温度は60℃以上であるこ
とが好ましいが、熱処理温度が高すぎる場合にはペプチ
ドおよび／または担体が分解する場合があるので、該熱
処理温度は180℃以下に抑えることが好ましい。また熱
処理時間は約５分間以上であることが好ましいが、熱処
理時間が長すぎる場合にはペプチドおよび／または担体
が分解する場合があるので、該熱処理時間は約１時間以
内とするのが好ましい。熱処理は、担体上に固定化され
たペプチドを水または水溶液中で所定の温度に加熱する
ことによつて実施することができる。熱処理は塩化ナト
リウムを含むリン酸塩緩衝液などの緩衝塩類水溶液中で
実施するのがペプチドの分解を抑制しうる点から好まし
い。
〔実施例〕
以下、実施例により本発明を説明するが、本発明は実施
例により限定されるものではない。
実施例１ で示されるペプチドをペプチド自動合成装置〔米国アプ
ライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製
モデル430A（Model430A）〕を用いて固相合成法により
合成した。４−〔Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリ
シルオキシメチル〕フエニルアセトアミドメチル を0.78ミリモル/g（樹脂）の割合で有するスチレン−ジ
ビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼン
の構成比（モル比）:99対１〕からなる粒状樹脂〔米国
アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）
社製PAMグリシン（Glycine）,t−Boc−Gly〕を0.64g用
い、これに第１表に示す一連の操作に従つて目的とする
ペプチドのＮ末端の方向に向つて対応するＬ−アスパラ
ギン酸、Ｌ−システイン、グリシン、Ｌ−ヒスチジン、
Ｌ−ロイシン、Ｌ−リジン、Ｌ−プロリン、Ｌ−トレオ
ニン、Ｌ−トリブトフアン、Ｌ−チロシンおよびＬ−バ
リンを順次結合させた。縮合反応において上記のアミノ
酸はそれぞれＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−O4−ベ
ンジル−Ｌ−アスパラギン酸無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキ
シカルボニル）−Ｓ−（ｐ−メトキシベンジル）−Ｌ−
システイン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グ
リシン無水物、Ｎα−（ｔ−ブトキシカルボニル）−N
Im−トシル−Ｌ−ヒスチジン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキ
シカルボニル）−Ｌ−ロイシン無水物、N2−（ｔ−ブト
キシカルボニル）−N6−ベンジルオキシカルボニル−Ｌ
−リジン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ
−プロリン無水物、Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−
O3−ベンジル−Ｌ−トレオニン無水物、Ｎα−（ｔ−ブ
トキシカルボニル）−Ｌ−トリプトフアン無水物、Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−O4−ベンジル−Ｌ−チロ
シン無水物およびＮ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−Ｌ
−バリン無水物として用い、それらの使用量は基質に対
して約２倍モル量とした。縮合反応は室温下で行い、反
応時間は縮合させるアミノ酸の種類によつて異なるが18
〜30分間の範囲内であつた。またＮα−（ｔ−ブトキシ
カルボニル）−NIm−トシル−Ｌ−ヒスチジン無水物を
用いる縮合反応では変換率が低いために、第１表に示す
一連の操作を終了したのち、さらに第１表における工程
４〜６の操作を繰り返すことによつて縮合反応を再度実
施した。
全てのアミノ酸についての反応操作が終了したのち、得
られた樹脂をグラスフイルター上でジエチルエーテル、
ジクロロメタンおよびメタノールを用いて順次洗浄し、
次いで真空乾燥することによつて2.1gの乾燥樹脂を得
た。ポリトリフルオロモノクロロエチレン製の反応容器
（株式会社ペプチド研究所製HF−反応装置Ｉ型）中で、
乾燥樹脂1gをアニソール1.5mlおよびエチルメチルスル
フイド0.25mlと混合し、この混合物に−20℃の温度でフ
ツ化水素10mlを加え、同温度で30分間、次いで０℃の温
度で30分間攪拌した。得られた反応混合物からフツ化水
素、アニソールおよびエチルメチルスルフイドを減圧下
に除去し、残留物をグラスフイルター上でジエチルエー
テルを用いて充分洗浄した。得られた残留物を２規定の
酢酸水溶液で抽出し、抽出液を凍結乾燥することにより
ペプチドの粗製物を0.5g得た。
得られ粗製物を分取用逆相高速液体クロマトグラフイー
〔カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径:5μｍ）充
填カラム（内径:10mm、長さ:300mm）（株式会社ケムコ
製デベロシル（Develosil）ODS10mmφ×30mm）；移動
相：トリフルオロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニト
リルと水の混合溶媒（アセトニトリルの濃度は20分間で
20容量％から35容量％になるように漸次変化させた）〕
で精製することによつて、目的とするペプチドの精製物
を50mg得た。
得られた精製物を分析用逆相高速液体クロマトグラフイ
ー〔カラム：オクタデシル化シリカゲル（粒径:5μｍ）
充填カラム（内径:4mm、長さ:150mm）（東ソー株式会社
製TSKgel ODS−80TM4mmφ×150mm）；移動相：トリフル
オロ酢酸を0.05容量％含有するアセトニトリルと水の混
合溶液（アセトニトリルの濃度は30分間で５容量％から
50容量％になるように漸次変化させた）；流速:1ml/
分；検出法：波長210nmにおける吸光度〕に付したとこ
ろ、19.2分に単一の鋭いピークが示された。FAB（高速
原子衝撃）法マススペクトルにより求められた精製物の
分子量は2814であつた（理論値:2815.21）。また、精製
物を塩酸を用いて加水分解して得られた生成物をアミノ
酸組成分析に付した結果は次のとおりであつた（括弧内
の数字は論理値を示す）。リジン:5.23（５），グリシ
ン:1.94（２），トリプトフアン:2.02（２），ヒスチジ
ン:0.98（１），バリン:0.92（１），チロシン:3.07
（３），トレオニン:2.07（２），シスチン:0.85
（１），プロリン:2.13（２），アスパラギン酸:2.10
（２），ロイシン:1.00（１）。
実施例２〜16 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより第２表に示すペプチドを得
た。ただし、固相用の樹脂として、実施例２および実施
例10では４−〔Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）グリシ
ルオキシメチル〕フエニルアセトアミドメチル基を0.78
ミリモル/g（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニル
ベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成
比（モル比）:99対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプラ
イド・バイオシステムズ（Applied Biosystems）社製PA
Mグリシン（Glycine）,t−Boc−Gly〕を用い、実施例
３、実施例５、実施例８および実施例12では４−〔Ｎ−
（ｔ−ブトキシカルボニル）−O4−ベンジル−α−Ｌ−
アスパルチルオキシメチル〕フエニルアセトアミドメチ
ル基を0.78ミリモル/g（樹脂）の割合で有するスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベン
ゼンの構成比（モル比）:99対１〕からなる粒状樹脂
〔米国アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosys
tems）社製PAMアスパラギン酸（Aspartic acid）,t−Bo
c−Ｌ−Asp（OBzl）〕を用い、実施例４および実施例６
では４−〔Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニル）−O5−ベン
ジル−α−Ｌ−グルタミルオキシメチル〕フエニルアセ
トアミドメチル基を0.78ミリモル/g（樹脂）の割合で有
するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンと
ジビニルベンゼンの構成比（モル比）:99対１〕からな
る粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ（Appl
ied Biosystems）社製PAMグルタミン酸（Glutamic aci
d）,t−Boc−Ｌ−Glu（OBzl）〕を用い、実施例７、実
施例９および実施例11では４−〔N2−（ｔ−ブトキシカ
ルボニル）−N6−（クロロベンジルオキシカルボニル）
−Ｌ−リジルオキシメチル〕フエニルアセトアミドメチ
ル基を0.78ミリモル/g（樹脂）の割合で有するスチレン
−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレンとジビニルベン
ゼンの構成比（モル比）:99対１〕からなる粒状樹脂
〔米国アプライド・バイオシステムズ（Applied Biosys
tems）社製PAMリジン（Lysiue）,t−Boc−Ｌ−Lys（Cl
−Ｚ）〕を用い、また実施例13〜16ではα−アミノ−ｐ
−メチルベンジル基を0.78ミリモル/g（樹脂）の割合で
有するスチレン−ジビニルベンゼン共重合体〔スチレン
とジビニルベンゼンの構成比（モル比）:99対１〕から
なる粒状樹脂〔米国アプライド・バイオシステムズ（Ap
plied Biosystems）社製ｐ−メチルBHAレジン（ｐ−Met
hyl BHA Resin）〕を用いた。また縮合反応においてＬ
−グルタミン酸、12−アミノドデカン酸および18−アミ
ノオクタデカン酸はそれぞれ、Ｎ−（ｔ−ブトキシカル
ボニル）−O5−ベンジル−Ｌ−グルタミン酸無水物、12
−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）ドデカン酸無水物
および18−（ｔ−ブトキシカルボニルアミノ）オクタデ
カン酸無水物として用いた。
得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロマ
トグラフイーに付したところ、いずれも単一のピークが
示された。それらの精製物についてFAB法マススペクト
ルにより求められた分子量および塩酸を用いて加水分解
して得られた生成物のアミノ酸組成分析値をそれぞれ第
３表に示す。
参考例１および２ 実施例１におけると同様な方法でペプチドの固相合成お
よび精製を行うことにより、 で示されるペプチド（参考例１）および で示されるペプチド（参考例２）を得た。ただし、固相
用の樹脂として、４−〔Ｎ−（ｔ−ブトキシカルボニ
ル）−O4−ベンジル−α−Ｌ−アスパルチルオキシメチ
ル〕フエニルアセトアミドメチル基を0.78ミリモル/g
（樹脂）の割合で有するスチレン−ジビニルベンゼン共
重合体〔スチレンとジビニルベンゼンの構成比（モル
比）:99対１〕からなる粒状樹脂〔米国アプライド・バ
イオシステムズ（Applied Biosystems）社製PAMアスパ
ラギン酸（Aspartic acid）,t−Boc−Ｌ−Asp（OBz
l）〕を用いた。
得られたペプチドの精製物を分析用逆相高速液体クロマ
トグラフイーに付したところ、いずれも単一のピークが
示された。それらの精製物についてFAB法マススペクト
ルにより求められた分子量および塩酸を用いて加水分解
して得られた生成物のアミノ酸組成分析値をそれぞれ第
４表に示す。
参考例３ （ａ）金属ナトリウムの存在下で蒸留することによつて
得られたジオキサン50ml中にセルロース粒子（生化学工
業株式会社販売、CM−セルロフアインCH）10gを懸濁
し、得られた懸濁液にＮ−ヒドロキシコハク酸イミド0.
5gおよびジシクロヘキシルカルボジイミド1.0gを加え、
混合物を室温下で１晩振盪攪拌した。得られた混合物を
0.02モル/lのリン酸塩緩衝液（pH:7.4）で洗浄し、吸引
濾過した。得られ粒子を、実施例１で得られたペプチド
の20mgを含有する0.02モル/lのリン酸塩緩衝液（pH:7.
4）20mlと混合し、この混合物を４℃の温度で１晩攪拌
した。得られた混合物を吸引濾過した。濾液を分析用逆
相高速液体クロマトグラフイーに付したが、残存する未
反応のペプチドは認められなかつた（担体上のペプチド
の固定化率：約100％）。このようにして、実施例１で
得られたペプチドの20mgが固定化されたセルロース粒子
を約10g得た。
（ｂ）上記のようにして得られたペプチドが固定化され
たセルロース粒子の1gずつを、塩化ナトリウムを0.15モ
ル/l含有する0.02モル/lのリン酸塩緩衝液（pH:7.4）の
各5ml中に懸濁し、それぞれ80℃（水浴上、常圧下）、1
00℃（水浴上、常圧下）、121℃（オートクレーブ滅菌
器中、加圧下）および150℃（オートクレーブ滅菌器
中、加圧下）の温度で20分間熱処理した。このようにし
て吸着剤をそれぞれ得た。
参考例４ （ａ）参考例３（ａ）においてセルロース粒子10gの代
りにボリビニルアルコール粒子（東ソー株式会社製CM−
トヨパール650C）10gを用い、かつ実施例１で得られた
ペプチド20mgの代りに実施例２で得られたペプチド20mg
を用いる以外は同様な方法により、実施例２で得られた
ペプチドの18.4mgが固定化されたポリビニルアルコール
粒子を約10g得た（ペプチドの固定化率：約92％）。
（ｂ）上記のようにして得られたペプチドが固定化され
たポリビニルアルコール粒子の1gを、塩化ナトリウムを
0.5モル/l含有する0.02モル/lのリン酸塩緩衝液（pH:7.
4）5ml中に懸濁し、オートクレーブ滅菌器等で加圧下に
121℃の温度で20分間熱処理した。このようにして吸着
剤を得た。
参考例５ （ａ）多孔性ガラス粒子〔米国エレクトロ−ニユークレ
オニクス（Electro−nucleonice）社製CPG−10−1000〕
10gを、γ−アミノプロピルトリエトキシシランを5ml含
有するトルエン溶液100ml中で24時間加熱還流下に反応
させた。得られた混合物を、金属ナトリウムの存在下で
蒸留することによつて得られたジオキサンで洗浄し、吸
引濾過した。得られた粒子を、金属ナトリウムの存在下
で蒸留することによつて得られたジオキサン100ml中に
懸濁し、この懸濁液に無水コハク酸3gを加え、混合物を
室温下で１晩撹拌した。得られた混合物を、金属ナトリ
ウムの存在下で蒸留することによつて得られたジオキサ
ンで洗浄し、吸引濾過した。得られた粒子を、金属ナト
リウムの存在下で蒸留することによつて得られたジオキ
サン50ml中に懸濁し、この懸濁液にＮ−ヒドロキシコハ
ク酸イミド0.5gおよびジシクロヘキシルカルボジイミド
1.0gを加え、混合物を室温下で１晩撹拌した。得られた
混合物を0.02モル/lのリン酸塩緩衝液（pH:7.4）で洗浄
し、吸引濾過した。得られた粒子を、実施例３で得られ
たペプチド20mgを含有する0.02モル/lのリン酸塩緩衝液
（pH:7.4）20mlと混合し、この混合物を４℃の温度で１
晩攪拌した。得られた混合物を吸引濾過し、実施例３で
得られたペプチドの20mgが固定化された多孔性ガラス粒
子を約10g得た（ペプチドの固定化率：約100％）。
（ｂ）上記のようにして得られたペプチドが固定化され
た多孔性ガラス粒子の1gをペプチドが固定化されたポリ
ビニルアルコール粒子1gの代りに用いる以外は参考例４
（ｂ）におけると同様な方法により、吸着剤を得た。
参考例６〜18 （ａ）第５表に示すペプチドの20mgを用いる以外は参考
例３（ａ）、参考例４（ａ）または参考例５（ａ）のい
ずれかにおけると同様な方法によりペプチドが固定化さ
れた粒子状担体をそれぞれ得た。使用した粒子状担体お
よび担体上へのペプチドの固定化率をそれぞれ第５表に
示す。
（ｂ）上記のようにして得られたペプチドが固定化され
た粒子状担体の1gを参考例４（ａ）で得られたペプチド
が固定化されたポリビニルアルコール粒子1gの代りに用
いる以外は参考例４（ｂ）におけると同様な方法によ
り、吸着剤をそれぞれ得た。
参考例19 （ａ）参考例３（ａ）において実施例１で得られたペプ
チド20mgの代りに参考例１で得られたペプチド20mgを用
いる以外は同様な方法により、参考例１で得られたペプ
チドの14.4mgが固定化されたセルロース粒子を約10g得
た（ペプチドの固定化率：約72％）。
（ｂ）上記のようにして得られたペプチドが固定化され
たセルロース粒子の1gをペプチドが固定化されたポリビ
ニルアルコール粒子1gの代りに用いる以外は参考例４
（ｂ）におけると同様な方法により、吸着剤を得た。
参考例20 （ａ）参考例４（ａ）において実施例２で得られたペプ
チド20mgの代りに参考例２で得られたペプチド20mgを用
いる以外は同様な方法によりペプチドのポリビニルアル
コール粒子への固定化操作を行つた。参考例２で得られ
たペプチドはリン酸塩緩衝液中での溶解度が低いため、
濾液中に残存する未反応のペプチドを分析用逆相高速液
体クロマトグラフイーにより定量することが不可能であ
つた。
（ｂ）上記の固定化操作に付して得られたポリビニルア
ルコール粒子の1gを参考例４（ａ）で得られたペプチド
が固定化されたポリビニルアルコール粒子1gの代りに用
いる以外は参考例４（ｂ）におけると同様な方法によ
り、吸着剤を得た。
試験例１ 重症筋無力症患者の血清0.5mlに参考例３で得られた吸
着剤50mgを加え、37℃の温度で３時間懸濁させた。得ら
れた懸濁物を遠心分離し、上清を得た。得られた上清中
におけるニコチン性アセチルコリンレセプターに対する
ヒト抗体の濃度をCon A法〔蛋白質核酸酵素、第26巻、
第1578〜1591頁（1981年）など参照〕により求めた。す
なわち、被検液をニコチン性アセチルコリンレセプター
および放射線標識したα−ブンガロトキシンと順次接触
させ、得られた処理液をコンカナバリンＡ（Con A）を
固定化したセフアロース（Sepharose）を充填したカラ
ムに通したのちカラムの放射活性を計測することによつ
て、該被検液中に含まれていたα−ブンガロトキシンと
ニコチン性アセチルコリンレセプターとの結合を阻害す
るヒト抗体の量をトキシン結合阻害活性度（カラムの放
射活性の減少率）として定量した。結果を第６表に示
す。なお、比較のために、参考例３（ａ）で得られたペ
プチドが固定化されたセルロース粒子（熱処理せず）を
使用した場合に得られた結果、ならびに実施例１で得ら
れたペプチドの代りにグリシンを用いる以外は参考例３
（ａ）におけると同様な方法により得られたグリシンが
固定化されたセルロース粒子、およびこのグリシンが固
定化されたセルロース粒子をペプチドの固定化されたセ
ルロース粒子の代りに用いる以外は参考例３（ｂ）にお
けると同様な方法により121℃で熱処理して得られた吸
着剤を使用した場合に得られた結果をあわせて第６表に
示す。
試験例２ 試験例１において参考例３で得られた吸着剤の代りに参
考例４〜18で得られた吸着剤を用いる以外は同様な方法
により、血清の懸濁処理を行い、得られた上清中におけ
るニコチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗
体の濃度を求めた。得られた結果を第７表に示す。な
お、比較のために、参考例19または参考例20で得られた
吸着剤を使用した場合に得られた結果、ならびに試験例
１で比較のために使用したものと同じグリシンが固定化
されたセルロース粒子を121℃で熱処理して得られた吸
着剤を使用した場合に得られた結果を第７表にあわせて
示す。
〔発明の効果〕 本発明によれば、上記の実施例から明らかなとおり、ニ
コチン性アセチルコリンレセプターに対するヒト抗体を
有効に吸着する能力を有する吸着剤を効率的に製造する
ために有用な新規なペプチドが提供される。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｇ０１Ｎ 33/564 Ｚ 8310−2Ｊ 33/566 8310−2Ｊ Ｃ０７Ｋ 99:00 (72)発明者 中島 俊秀 大阪府大阪市北区梅田１丁目12番39号 株 式会社クラレ内 (72)発明者 大村 祐章 大阪府大阪市北区梅田１丁目12番39号 株 式会社クラレ内 (72)発明者 高倉 孝一 大阪府大阪市北区梅田１丁目12番39号 株 式会社クラレ内 審査官 前田 憲彦 (56)参考文献 特表 平２−502538（ＪＰ，Ａ) Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ． 17 （12），1697−1702（1987) Ｊ．Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｃｈｅｍ． ６ （５），365−373（1987) Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．Ｌｅｔｔ． 82 （１），113−119（1987) Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ． 26 （12），3261−3266（1987) ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ． 199（１），68 −74（1986)

Claims (1)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】一般式 Ｈ−Ｘ−Gly−Trp−Lys−His−Trp−Val−Tyr−Tyr−Th
    r−Cys−Cys−Pro−Asp−Thr−Pro−Tyr−Leu−Asp−Ｙ
    −Ｚ 〔式中、ＸおよびＹは一方が単結合を表わすか、または
    Asp、Glu、Lysおよび （式中、ｎは１〜17の整数を表わす。）で示される二価
    の基からなる群から選ばれるアミノ酸残基もしくは該群
    から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基の２〜10個
    がペプチド結合によつて形成するペプチド残基を表わ
    し、他方がAsp、Glu、Lysおよび （式中、ｎは前記定義のとおりである。）で示される二
    価の基からなる群から選ばれるアミノ酸残基もしくは該
    群から選ばれる少なくとも１種のアミノ酸残基の２〜10
    個がペプチド結合によつて形成するペプチド残基を表わ
    し、Ｚは水酸基またはアミノ基を表わし、上記アミノ酸
    配列のCys−Cysにおいて各々のCysが有するメルカプト
    基は相互に結合してジスルフイド結合を形成していても
    よい。〕 で示されるペプチド。
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EP88311029A EP0318240A3 (en) 1987-11-25 1988-11-22 Peptide, adsorbent, method for production thereof, and method for use thereof
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Ｊ．ＰｒｏｔｅｉｎＣｈｅｍ．６（５），３６５−３７３（１９８７）
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