JP2000500657A - 細胞におけるｃｄ９５リガンドの発現の検出方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、下記工程：（ａ）細胞から全ＲＮＡを単離する工程；（ｂ）（ａ）由来の全ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに転写する工程；ならびに（ｃ）ＰＣＲ反応において、ＣＤ９５リガンド特異的プライマーにより（ｂ）由来のｃＤＮＡおよびＣＤ９５リガンド競合断片を増幅する工程を含むＣＤ９５リガンドの定量的決定方法に関する。また、該方法は、アポトーシスの程度および／または経路を決定するためにも適する。

Description

【発明の詳細な説明】 細胞におけるＣＤ９５リガンドの発現の検出方法 本発明は、細胞におけるＣＤ９５リガンドの発現の検出方法に関する。 アポトーシスとは、プログラムされた細胞死に対する名称である。それは、例 えば、器官形成および変態、組織の萎縮および腫瘍の退行において見出される。 アポトーシスは、細胞質の濃縮、細胞膜の絨毛の損失、核の分割および染色体Ｄ ＮＡの広範な分解と関連している。アポトーシスの妨害は、ＡＩＤＳ、自己免疫 疾患、腫瘍および白血病等の種々の疾患で発生することがわかった。ＡＩＤＳの 場合、アポトーシスの増加がＣＤ４−Ｔ細胞の強力な減少の原因であるように思 われる。 活性化されたＴ細胞および他の細胞において、ＣＤ９５およびＡＰＯ−１とそ れぞれ称される細胞表面蛋白質が見出されている。ＣＤ９５リガンドおよびＡＰ Ｏ−１リガンドとそれぞれ称される可溶性または膜結合蛋白質は、それぞれ、こ の細胞表面蛋白質に結合して、アポトーシスの誘導を引き起こすことができる。 アポトーシスの程度および経路ならびにアポトーシスの原因となる分子は、こ れまで、決定され得ていない。しかしながら、これは、前記疾患を患っている患 者における追跡管理や好適な治療措置等を行なうことを可能にするために必要で ある。 したがって、本発明の目的は、アポトーシスの程度およびその経路それぞれの 決定に役立つ産物を提供することにある。 本発明によれば、これは、請求の範囲に定義された主題により達成される。 したがって、本発明の主題は、以下ＣＤ９５−Ｌと称するＣＤ９５リガンドが 細胞において定量的に決定されうる方法に関する。 本発明は、アポトーシスは、Ｔ細胞において量の増大したＣＤ９５−Ｌに起因 するという出願人の発見に基づく。さらに、出願人は、アポトーシスの割合は、 ＣＤ９５−Ｌの量により決定されるということを発見した。 本発明の方法は、細胞におけるＣＤ９５−Ｌの量が確実に決定されうる定量的 「ポリメラーゼ連鎖反応」（ＰＣＲ）に関する。細胞中に存在するＣＤ９５−Ｌ ｍＲＮＡの量は、ＲＴ−ＰＣＲ反応により本発明の方法で決定される。ＣＤ９ ５−Ｌに対する定量的ＰＣＲにおいて、ＣＤ９５−Ｌ ｃＤＮＡの量を、ＣＤ９ ５−Ｌ特異的ＤＮＡ競合断片をＰＣＲ反応に添加することにより滴定する。一定 量の全ＲＮＡのｃＤＮＡへの完全な逆転写は、この工程より先行する。該競合断 片は、ヌクレオチド配列の中央での追加の塩基対によりＣＤ９５−Ｌの「野生型 」ｃＤＮＡとは異なるが、同一の隣接した配列を有する。したがって、野生型と 競合断片とは、同じプライマーの組合せにより認識され、ＰＣＲにおいて共同し て増幅されうる。同一のプライマー結合部位と類似のヌクレオチド配列により、 両断片は、同じ増幅速度に供される。しかしながら、サイズにおける微小な相違 は、ＰＣＲによるゲル電気泳動により両ＤＮＡ種の分離を可能にする。アガロー スゲル上でのＤＮＡバンドの強度は、ＰＣＲにおいて使用された最初のｃＤＮＡ の量を反映する。ゲル上でのＣＤ９５−Ｌおよび競合ＤＮＡバンドの結果が同じ ならば、競合物とＣＤ９５−Ｌとが同じ初期濃度で存在していたと結論すること ができる。この方法により滴定されたＣＤ９５−Ｌ ｃＤＮＡの量は、逆転写が 完全に先行するので、全ＲＮＡ中のＣＤ９５−Ｌ ｍＲＮＡの量を反映する。定 量的ＰＣＲ反応の図を、図１に示す。 定量的ＰＣＲは、以下の反応原理に基づく。ＣＤ９５−Ｌの発現割合を定量化 するために、逆転写された全ＲＮＡの一定量のｃＤＮＡをＰＣＲ反応容器中にピ ペットで入れる。例えば、５〜１００００ｆｇの種々の希釈の競合断片を、陰性 対照（−）を除いて各試料に添加する。ＰＣＲ反応後、増幅したＤＮＡ断片を臭 化エチジウムで処理して、アガロースゲル上で分離する。Ｕ．Ｖ．光で該ゲルを 照射することにより、ＤＮＡを可視化する。ＣＤ９５−Ｌ ＤＮＡのバンドと競 合ＤＮＡのバンドの両方が等しい強度を有するという観点から、滴定点（図１で 矢印により記す）を決定する。両方のバンドの等しい比率は、等しい量の決定対 象のＤＮＡと競合ＤＮＡが増幅されたことを示す。同様に、滴定点により決定さ れたＣＤ９５−Ｌ ｃＤＮＡの量（ｍＲＮＡの量に匹敵する）は、用いた全ＲＮ Ａの量中に存在していた。 ＰＣＲ用に合成されたプライマーは、刊行されたＣＤ９５−Ｌの配列に基づく ことが好ましい（Takahashi T ら、Int．Immunol．6，(1984)，1547-1567を参照 ）。ＰＣＲは、当業者が精通している条件下で行なわれる。 例えば、以下のプライマー： Ｌ_up ５’−ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡ−３’ （２５マー、ＣＤ９５−Ｌ配列のヌクレオチド３０１〜３２５に結合す る） Ｌ_down ５’−ＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣ−３’ （２５マー、ＣＤ９５−Ｌ配列のヌクレオチド７７５〜７９９に結合す る） を用いて、ＣＤ９５−Ｌ断片（約５００ｂｐ）および競合断片（約５５０ｂｐ） を増幅することができる。 さらに、例えば、以下のプライマー： Ｌ_upOV ５’−ＧＧＡＴＣＣＧＴＡＣＴＡＣＡＧＴＧＡＡＡＴＴＡＴＧＧＡＡ− ＧＧＧＴＡＴＣＣＧＡＧＴＴＣＡＧＧＡＡＴＴＣＣＡＧＡＧＧＣＡＴ− ＧＧＡＣＣＴＴＧＡＧＴＴＧＧＡＣＴＴＧＣＣ−３’ （８０マー、ヌクレオチド４５１〜４８０に結合する） Ｌ_dwOV ５’−ＣＣＴＴＣＣＡＴＡＡＴＴＴＣＡＣＴＧＴＡＧＴＡＣＧＧＡＴ− ＣＣＧＡＡＴＧＧＧＡＡＧＡＣＡＣＣＴＡＴＧＧＡＡＴＴＧＴＣＣ− ３’ （５８マー、ヌクレオチド４８１〜５０８に結合する） を、競合断片（５５０ｂｐ）の調製に使用することができる。 競合断片としてＰＣＲに用いる変異したＣＤ９５−Ｌ断片は、突然変異誘発、 好ましくはＰＣＲ突然変異誘発により調製される。Ｔ細胞株ＣＥＭ−Ｓ等に由来 するＣＤ９５−Ｌ ｃＤＮＡは、ＰＣＲ突然変異誘発のためのマトリックスとし て役立つ。Ｌ_up／Ｌ_downＰＣＲ断片の２つの部分を、ＰＣＲにおいてプライマー 対Ｌ_up／Ｌ_upOV（２３０ｂｐの長さを有する断片を生ずる）、および第２のＰＣ Ｒにおいてプライマー対Ｌ_down／_downOV（３４９ｂＰの長さを有する断片を生ず る）を使用することにより増幅する。プライマーＬ_upOVは、プライマーＬ_downOV の３０ｂｐ長の突出配列に相補的な５０ｂｐ長の突出配列を含む。精製後、２つ の断片をそれらの相補的領域を介してハイブリダイズさせ、プライマーＬ_up／Ｌ_down を用いる別のＰＣＲ増幅のためのマトリックスとして使用する。その結果は 、ヌクレオチド配列の中央に５０個の追加の塩基を含むＣＤ９５−Ｌの変異した 断片である。競合断片の調製のための図を、図２に示す。 変異した断片と野生型断片との間の競合に基づく本発明の方法は、少量の試料 （１〜５ｘ１０⁶細胞）におけるＣＤ９５−Ｌの細胞内レベルの正確な決定を可 能にする。 ＣＤ９５／ＣＤ９５−Ｌにより伝達されたアポトーシスは、ＡＩＤＳ疾患の場 合、Ｔ細胞の枯渇に関係があることは明白であるので、ＣＤ９５−Ｌの発現の定 量的決定は、ＡＩＤＳ患者の追跡管理のためや治療上の介在の指標として使用さ れうる。さらに、本発明の方法は、Ｔ細胞におけるウイルス誘導性、ＣＤ９５伝 達性アポトーシスを阻害することが可能な潜在的薬物の「薬物スクリーニング」 に関して、イン・ビトロで適する。同様に、細胞におけるＣＤ９５リガンドの定 量的決定は、減少したアポトーシス（白血病等）および増加したＣＤ９５伝達性 アポトーシスに伴う疾患の場合、疾患の定義、追跡管理および「薬物のスクリー ニング」におけるリガンド発現の薬理学的影響に関して使用することができる。 応用の直接の分野としては、現在、自己免疫疾患および移植拒絶の免疫抑制治療 のために使用されているアゾチオプリン、シクロスポリンＡ、シクロホスファミ ド、コルチゾンおよびメトトレキセート等の薬物の効果の分析等が代表例である 。図面の簡単な説明 図１は、ＣＤ９５−Ｌに関する本発明の定量的ＰＣＲの図を示す。 図２は、ＣＤ９５−Ｌの競合ＤＮＡ断片の調製に関する図を示す。 （Ａ）野生型断片およびＰＣＲ増幅のためのその特異的プライマー、Ｌ_upおよび Ｌ_downを示す。 （Ｂ）Ｌ_upおよびＬ_upOVを第１のＰＣＲに用いる。Ｌ_upOVは、配列の中央に結合 し、５０ｂｐの長さを有する５’末端での突出配列を含む。 （Ｃ）Ｌ_downおよびＬ_downOVを第２のＰＣＲに用いる。Ｌ_downOVの５’末端での 最後の３０ｂｐは突出しており、L_upOVの５’末端での最後の３０ｂｐに相補的 である。相補的領域は、ブラシ型様式で示す。 （Ｄ）は、第１および第２のＰＣＲ由来のＰＣＲ産物、３４９および２３０ｂｐ 長のＤＮＡ片を示す。精製後、両断片をそれらの相補的領域を介して互いにハイ ブリダイズさせる。 （Ｅ）（Ｄ）でハイブリダイズした断片を、Ｌ_upおよびＬ_downを再びプライマー として用いる第３のＰＣＲ反応のためのマトリックスとして使用する。 （Ｆ）結果は、配列の中央に５０ｂｐ長の挿入物を保持する変異したＣＤ９５− Ｌ断片である。 図３は、リンパ系細胞におけるＣＤ９５−Ｌ ｍＲＮＡの構成的、誘導性発現 を示す。 以下の実施例により、本発明を説明する。実施例：リンパ系細胞におけるＣＤ９５−Ｌの決定 リンパ系Ｔ細胞Ｊ１６とＣＥＭ−Ｓをそれぞれ、通常の培地で培養し、ＰＭＡ （５ｎｇ／ｍｌ）およびイオノマイシン（２μｇ／ｍｌ）それぞれで、それぞれ 、４時間および２４時間処理した。チョムジンスキー(Chomczynski，P.)とサッ チ(Sacchi，N.)、Anal．Biochem.，162，(1987)，156-159による方法に従って、 該細胞から全ＲＮＡを得て、ＡＭＶ逆転写酵素（Amersham，Braunschweig）およ びオリゴｄＴ１６プライマー(Promega，Heidelberg)により、ｃＤＮＡに転写し た。２０μｌの反応液は、１ｘ ＡＭＶ緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、 ｐＨ８．３；８ｍＭ ＭｇＣｌ₂；５０ｍＭ ＮａＣｌ；１ｍＭ ＤＴＴ）、２ ５０μＭの各ｄＮＴＰ(Pharmacia，Freiburg)、０．５μＭ オリゴ−ｄＴ₁₆； ０．６Ｕ／μｌ ＲＮアーゼ阻害剤（Amersham，Braunschweig）；０．７５Ｕ／ μｌ ＡＭＶ逆転写酵素；５０ｎｇ／μｌ 全ＲＮＡ（添加前に６５℃で５分間 変性）からなるものであった。逆転写は、４２℃で４５分間行ない、次いで、９ ４℃まで５分間加熱することにより、反応を停止した。すべての試薬が過剰に存 在していたので、用いたＲＮＡは、完全にｃＤＮＡに転写されたと仮定すること ができる。 ＣＤ９５−Ｌの発現割合を定量するためには、逆転写された全ＲＮＡの２５０ ｎｇのｃＤＮＡをそれぞれ、ＰＣＲ反応容器にピペットで入れた。前記したよう な競合断片を、１０〜１００００ｆｇの種々の希釈で、陰性対照（−）を除いて 各試料に添加した。反応混合物は：ｃＤＮＡ（＝２５０ｎｇの逆転写された全Ｒ ＮＡ）、１ｘＰＣＲ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．８；５０ｍ Ｍ ＫＣｌ、０．０８％ ＮＰ４０）、１ｍＭ ＭｇＣｌ₂、２００μＭ ｄＮ ＴＰ、０．５μＭ プライマーおよび１．１２Ｕ／容器 Ｔａｑポリメラーゼ( ＭＢＩ／Fermentas)を含む５０μｌであった。増幅は、前記したように、Ｌ_upお よびＬ_downプライマーを用いて、ロボサイクラー（Stratagene）またはBiozymサ ーモサイクラーで行なった。反応条件は、以下のようであった：９４℃で３５秒 間、５６℃で９０秒間および７２℃で１２０秒間を３６サイクル繰り返す。２０ μｌのＰＣＲ反応液を、２％アガロースゲル上で電気泳動により分離し、臭化エ チジウム染色後、Ｕ．Ｖ．光で可視化した。ＣＤ９５−Ｌ ＤＮＡのバンドと競 合ＤＮＡのバンドの両方が等しい強度を有する点を、ゲル上で決定した。該ゲル を図３に示す。同量の野生型断片と競合断片を示す等しいバンドの強度を、矢印 で示す。 未処理のＪ１６細胞は、１０ｆｇのＣＤ９５−Ｌ ｍＲＮＡ／２５０ｎｇの全 ＲＮＡを発現し、未処理のＣＥＭ−Ｓ細胞は、５０ｆｇのＣＤ９５−Ｌ ｍＲＮ Ａ／２５０ｎｇの全ＲＮＡを発現したことが示された。ＰＭＡ／イオノマイシン 処理は、Ｊ１６細胞の場合、２５０ｎｇの全ＲＮＡ当たり１０００ｆｇまでのＣ Ｄ９５−Ｌ ｍＲＮＡの発現を増加させ、ＣＥＭ−Ｓ細胞の場合、２５０ｎｇの 全ＲＮＡ当たり５０００ｆｇまでの発現を増加させた（表１を参照）。 前記データは、ＣＤ９５−Ｌが本発明の方法により定量的に決定されうること を示す。したがって、特に、ＡＩＤＳ等の疾患の場合に、アポトーシスの程度お よび／または経路を決定することができる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１２月１日（１９９７．１２．１） 【補正内容】 請求の範囲 １．下記工程： （ａ）細胞から全ＲＮＡを単離する工程、 （ｂ）（ａ）由来の全ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに転写する工程、ならびに （ｃ）ＰＣＲ反応において、ＣＤ９５リガンド特異的プライマーにより（ｂ）由 来のｃＤＮＡおよびＣＤ９５リガンド競合断片を増幅する工程 （ここで、該ＣＤ９５リガンド特異的プライマーは、下記配列： Ｌ_up ５’−ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡ−３’ Ｌ_down ５’−ＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣ−３’ を有する） を含むＣＤ９５リガンドの定量的決定方法。 ２．該細胞が確立された細胞株または患者に由来するものであることを特徴とす る、請求項１記載の方法。 ３．該細胞がリンパ系T細胞であることを特徴とする、請求項２記載の方法。 ４．アポトーシスの程度および／または経路を決定するための、請求項１記載の 方法の使用。 ５．該決定がＡＩＤＳ患者の細胞でなされるものである、請求項４記載の方法の 使用。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．下記工程： （ａ）細胞から全ＲＮＡを単離する工程、 （ｂ）（ａ）由来の全ＲＮＡを逆転写によりｃＤＮＡに転写する工程、ならびに （ｃ）ＰＣＲ反応において、ＣＤ９５リガンド特異的プライマーにより（ｂ）由 来のｃＤＮＡおよびＣＤ９５リガンド競合断片を増幅する工程 を含むＣＤ９５リガンドの定量的決定方法。 ２．該ＣＤ９５リガンド特異的プライマーが、下記配列： Ｌ_up ５’−ＡＴＧＴＴＴＣＡＧＣＴＣＴＴＣＣＡＣＣＴＡＣＡＧＡ−３’ Ｌ_down ５’−ＣＣＡＧＡＧＡＧＡＧＣＴＣＡＧＡＴＡＣＧＴＴＧＡＣ−３’ を有することを特徴とする、請求項１記載の方法。 ３．該細胞が確立された細胞株または患者に由来するものであることを特徴とす る、請求項１または２記載の方法。 ４．該細胞がリンパ系Ｔ細胞であることを特徴とする、請求項３記載の方法。 ５．アポトーシスの程度および／または経路を決定するための、請求項１記載の 方法の使用。 ６．該決定がＡＩＤＳ患者の細胞でなされるものである、請求項５記載の方法の 使用。