JP2000500661A

JP2000500661A - Ｃｄ６リガンド

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Publication number: JP2000500661A
Application number: JP10507085A
Authority: JP
Inventors: バートンエフヘインズ; アレヤンドロアルフォ; ダヴァルクマーパテル; マイケルエイボーウェン; ハンスマーカード; アントニーダブリューシアダク
Original assignee: Bristol Myers Squibb Co
Current assignee: Bristol Myers Squibb Co
Priority date: 1996-07-18
Filing date: 1997-07-17
Publication date: 2000-01-25
Also published as: US5998172A; EP0856009A1; CA2232142A1; EP0856009A4; WO1998003551A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、一般的には、ＣＤ６に関し、特に、胸腺上皮細胞、単球、活性化Ｔ細胞及び他の様々な種類の細胞の表面上に存在するＣＤ６リガンドに関する。更に、本発明は、ＣＤ６とそのＣＤ６リガンドの相互作用を阻害する方法及び化合物の中からその相互作用の阻害能をスクリーニングする方法に関する。また、本発明はＣＤ６リガンドに特異的な抗体及びその結合フラグメントに関する。

Description

【発明の詳細な説明】ＣＤ６リガンド本発明は、政府の支持により、国立衛生研究所からの補助金（交付番号ＣＡ− ２８９３６及びＡＩ−０７２１７）を基礎に行われた。政府がこの発明に対して権利を有する。本件出願は、1993年11月２日に出願の出願番号第08/143,903号の一部継続出願であり、その内容の全てを参考として本発明明細書に引用する。発明の分野本発明は、一般的にＣＤ６に関し、特に胸腺上皮細胞、単球、活性Ｔ細胞及び他の様々な種類の細胞の表面に存在するＣＤ６リガンドに関する。本発明はまた、ＣＤ６リガンドをコードする核酸配列及びこれを含むベクターと宿主細胞に関する。更に、本発明は、ＣＤ６とそのＣＤ６リガンドの相互作用を阻害する方法及び化合物の中からその相互作用の阻害能をスクリーニングする方法に関する。背景ＣＤ６は、ＣＤ５及びマクロファージスカベンジャーレセプターに類似の１３０ｋＤａ糖タンパク質である(Aruffoら、J.Exp.Med．174:949(1991))。ＣＤ６は、成熟胸腺細胞、末梢Ｔ細胞及びＢ細胞サブセットの表面上に発現される（Kamo unら、J．Immunol．127:987(1981)）。ＣＤ６は、ＣＤ６に対するモノクローナル抗体（ｍａｂ）がＴ細胞のＴ細胞レセプター（ＴＣＲ）仲介による活性化を増加させるので、Ｔ細胞活性化に関係すると考えられ(Gangemiら、J．Immunol．14 3:2439(1989))、そのＣＤ６分子はＴＣＲ仲介Ｔ細胞の引き金となる間にチロシンリン酸化される(Wee ら、J．Exp．Med．177:219(1993))。ＣＤ６に対するｍａｂは、同種異系骨髄移植の場合のＴ細胞欠損に臨床上有効であることが示された（Soiffer ら、J．Clin．Oncol．10:1191(1992)）。Ｔ細胞表面抗原に対するｍａｂのパネルの中から胸腺細胞のヒト胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）への結合阻害能をスクリーニングすることにより得られた結果から、ＣＤ６が胸腺細胞のＴＥＣへの結合に関係することが示唆された（Vollger ら， J．Immunol．138:358(1987)）。本発明は、その結合に関係したＣＤ６のリガンド及び該リガンドをコードする核酸配列に関する。本発明の目的及び要約本発明の一般的な目的は、ＣＤ６リガンドを提供することである。本発明の具体的な目的は、単離した形のＣＤ６リガンド及び該リガンドをコードする核酸配列を提供することである。更に、本発明の目的は、ＣＤ６のＣＤ６リガンドへの結合を阻害する方法を提供することである。更にまた、本発明の目的は、化合物の中からＣＤ６／ＣＤ６リガンド結合阻害能をスクリーニングする方法を提供することである。また、本発明の目的は、ＣＤ６リガンドに特異的なモノクローナル抗体を提供することである。一実施態様においては、本発明は、単離したＣＤ６リガンドに関し、その形態としては２価カチオン依存性及び２価カチオン非依存性の双方が含まれる。更に、本発明は、そのようなリガンドのミメトープに関する。他の実施態様においては、本発明はＣＤ６リガンドをコードする核酸配列及びこれを含むベクター及び宿主細胞に関する。また、本発明は、ＣＤ６リガンドまたはその一部を製造する方法に関し、該方法はＣＤ６リガンドコード配列またはその一部を含む宿主細胞を該配列が発現されるような条件下において培養し、ＣＤ６またはその一部を生産することを含む。他の実施態様においては、本発明は、第２細胞の表面上に存在するＣＤ６リガンドへの、第１細胞の表面上に存在するＣＤ６の結合を阻害する方法に関する。本方法は、該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６と可溶性ＣＤ６リガンド又はそのミメトープとを、該可溶性ＣＤ６リガンド又はそのミメトープが該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６に結合し、もって、該第２細胞の表面上に存在する該ＣＤ６リガンドの該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６への結合を阻害するような条件下に接触させる工程を含む。また、本方法は、該第２細胞の表面上に存在する該ＣＤ６リガンドと可溶性ＣＤ６又はそのミメトープとを、該可溶性ＣＤ６又はそのミメトープが該第２細胞の表面上に存在する該ＣＤ６リガンドに結合し、もって、該第１細胞の表面上に存在する該ＣＤ６の該第２細胞の表面上に存在する該ＣＤ６リガンドへの結合を阻害するような条件下に接触させる工程を含む。他の実施態様においては、本発明は、試験化合物の中からＣＤ６のＣＤ６リガンドへの結合阻害能をスクリーニングする方法に関する。本方法は、ｉ）該試験化合物とＣＤ６及びＣＤ６リガンドの一方とを、該試験化合物と該ＣＤ６又はＣＤ６リガンド間に複合体が形成することができるような条件下に接触させる工程、ii）工程（ｉ）から得られたＣＤ６又はＣＤ６リガンドと試験化合物の組合わせとＣＤ６とＣＤ６リガンドのもう一方とを、該ＣＤ６と該ＣＤ６リガンド間に複合化が生じることができるような条件下に接触させる工程、及びiii)該ＣＤ６と該ＣＤ６リガンド間の複合化の程度を求め、もって、該試験化合物について該ＣＤ６の該ＣＤ６リガンドへの結合阻害能を求める工程を含む。さらなる実施態様において、本発明は酵素的に生産することができる抗−ＣＤ６リガンド抗体及びその抗原結合フラグメント（例えばＦａｂ及びＦ（ａｂ）₂ フラグメント）及び組換え法により生産することができるＣＤ６リガンド特異的結合タンパク（例えば融合タンパク及びキメラ抗体）に関する。本発明の他の目的及び利点は、下記の説明から明らかになるであろう。図面の簡単な説明図１．ＣＤ６−Ｉｇ（＝ＣＤ６−Ｒｇ）の胸腺上皮細胞（ＴＥＣ）への結合に関する２価カチオンの影響。ＴＥＣを２％ＢＳＡ、トリス−ＨＣｌ緩衝化食塩水（ＴＢＳ）及び５mMＣａＣｌ₂、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂のいずれかを含有するバッファー中５μg のＣＤ６−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇとインキュベートし、間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより分析した。種々のバッファー中のＣＤ６−Ｉｇの相対結合が示されている。相対結合は、ＴＢＳ中の特異結合に対する試料バッファー中のＣＤ６−Ｉｇ（ＣＤ６−Ｉｇの蛍光−ＣＤ５−Ｉｇの蛍光）の特異結合の比率として求めた。３回の実験の代表が示されている（ＴＢＳ＋Ｍｇは１回だけ行った）。ＣａＣｌ₂とＭｎＣｌ₂は共に、ＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を顕著に高めることができた（ｐ≦０.１）。図２．ＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合は、Ｍｎ⁺⁺により高められる。ＴＥＣを２％ＢＳＡ、ＴＢＳ及び種々の濃度のＭｎＣｌ₂を含有するバッファー中５μg のＣＤ６−Ｉｇ又はＣＤ５−Ｉｇとインキュベートし、間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより分析した。グラフは、種々の量のＭｎＣｌ₂を含有するバッファー中のＣＤ６−Ｉｇの相対結合を示すものである。３回の個々の実験の代表が示されている。図３．ＴＥＣへの結合は、ＣＤ６をＣＯＳ細胞中で発現することにより高められる。ＣＤ６を安定な方法で発現するＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）又は対照ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｎｅｏ）をカルセイン−ＡＭ標識ＴＥＣと１：５の比で４℃において６０分間インキュベートした。光学顕微鏡と蛍光顕微鏡の組合わせを用いて結合を検出した。３以上の結合ＴＥＣを含むＣＯＳ細胞％である結合を求めた。ＣＤ６をＣＯＳ細胞中で発現すると、ＣＯＳ細胞のＴＥＣへの結合が高められ、この結合は抗ＣＤ６抗体によって阻害された。図４．モノクローナル抗体Ｊ４−８１は、ヒトＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質のヒトＴＥＣへの結合を阻害する。ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からの４７０ｍａｂの結合パネル及び抗インテグリンｍａｂのパネルの中からＴＥ細胞に対する反応性をスクリーニングした。ＴＥ細胞と反応した１５４ｍａｂのうち１２６を、ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞への結合を阻害する分析に用いた。ＴＥ細胞と反応し、かつこの実験に用いた研究会のｍａｂは次のものであった：Ａ００８、Ａ０１４、Ａ０２３−４、Ａ０３６−７、Ａ０４４、Ａ０４７−９、Ａ０６３、Ａ０６５、Ａ０７０、Ａ０７４、Ａ０８０、Ａ０９０、Ａ０９２、Ａ１０７、Ａ１１０、Ａ１１３、Ａ１２４、Ａ１３２、Ａ１３９、Ａ１４１、Ａ１４５、Ｂ００２、Ｂ００３、Ｂ００５−６、Ｂ０１１−２、Ｂ０１４、Ｂ０１９、Ｂ０２５、Ｂ０２７−９、Ｂ０３１、Ｂ０４６、Ｂ０４９、Ｂ０５２、Ｂ０５５−７、Ｂ０５９、Ｂ０６８、ＣＢ１０、ＣＢ２２、ＣＢ２７、Ｅ００１、Ｅ０１５、Ｅ０３１、Ｅ０４５、Ｅ０５０、Ｅ０５３−４、Ｅ０５６−７、Ｍ０１− ２、Ｍ０９、Ｍ１４−５、Ｍ２５、Ｍ３２、Ｍ３５−８、Ｍ４３−４、ＭＲ１、ＭＲ４、ＭＲ６、ＭＲ９、ＭＲ１２、ＭＲ１４、ＸＢ００１、ＮＫ３２、Ｐ００５、Ｐ０１２、Ｐ０２３、Ｐ０３６、Ｐ０４４、Ｐ０９８、Ｐ１０７−８、Ｓ００９、Ｓ０１３、Ｓ０２３−４、Ｓ０３１、Ｓ０７５、Ｓ１０７、Ｓ１８８、Ｓ２０１、Ｓ２４１、Ｓ２４５、Ｓ２５２、Ｓ２６３、Ｓ２７１、Ｓ２７３−４、５Ｔ−０１５、５Ｔ−０７６、５Ｔ−０８０、５Ｔ−０８４、ＣＤ２４.３、ＣＤ４０.２、ＣＤ７３.１、ＣＤ７４.１及びＣＤ７７.１。使用した抗インテグリンｍａｂは次のものであった：ＴＳ２／７、Ｐ１Ｈ６、１２Ｆ１、Ｐ１Ｂ５、Ｐ４Ｇ９、Ｂ５６１０、Ｐ３０１０、ＥＡ−１−６、１３５−１３Ｃ、Ｐ５０２、Ｐ３０９、Ｋ２０、β４、Ｐ３Ｇ８、Ｐ３Ｇ２、Ｐ１Ｈ１２及びＴＳ２／１６。細胞をｍａｂと１：１００の希釈度で４℃において１５分間インキュベートし、次に、５μg のＣＤ５−Ｉｇ或いはＣＤ６−Ｉｇとインキュベートした。細胞を洗浄し、ヒトＩｇＧのＦｃ部分に特異的なフルオレセイン複合抗血清との反応及びフローサイトメトリーにより融合タンパク質を検出した。ＣＤ６−Ｉｇ結合とＣＤ５−Ｉｇ結合の蛍光の差である特異結合を求めた。対照ｍａｂ（Ｐ３）と比べた結合が示されている。４つの例は、ヤギ抗ヒトＩｇＧ−Ｆｃが試験ｍａｂと交差反応したものである（Ａ０２４、Ｂ０４９、５Ｔ−０８４及びＣＤ７３ .１）。ｍａｂＪ４− ８１（Ｓ２５２）はＣＤ６−Ｉｇ結合を５６±５％だけ阻害した（Ｎ＝２）。図５．ｍａｂＪ４−８１は、培養したＴＥＣの全ての表面と強く反応する。培養したＴＥＣをｍａｂＪ４−８１（ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からのＳ２５２）及び対照ｍａｂ（Ｐ３）と４℃で３０分間インキュベートした。２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した後、フルオレセイン複合ヤギ抗マウスＩｇＧとの反応、次にフローサイトメトリーにより結合した抗体を検出した。対照ｍａｂ（Ｐ３）及びＣＤ６リガンドに対するｍａｂ（Ｊ４−８１）の蛍光プロファイルが示されている。図６．ＣＤ６及びそのリガンドの生後のヒト胸腺中での発現。凍結ヒト胸腺切片（４μm）中ＣＤ６及びそのリガンドを、各々ｍａｂＴ１２及びＳ２５２（Ｊ４−８１）を用いて間接免疫蛍光により標識した。パネル１はＴ１２に対する反応性パターンを示すものであり、パネル２はｍａｂＪ４−８１に対する反応性パターンを示すものである。少なくとも３種類の異なる胸腺組織が同様の結果で分析された。ＣＤ６は、髄質（ｍｅｄ）中の胸腺細胞上に発現されかつ皮質（ｃｔｘ）中の胸腺細胞上に中程度に発現された。ｍａｂＪ４−８１は、髄質胸腺上皮細胞及びハッサル小体（ＨＢ）を検出した。図７．ＣＤ６−Ｉｇによる代謝的に標識したＴＥＣからの放射性標識糖タンパク質の免疫沈降。細胞を６−³H−グルコサミンで４８時間標識し、溶解し、溶解物をＣＤ６−Ｉｇ及び対照としてＣＴＬＡ４−Ｉｇで免疫沈降した。ＴＥＣ溶解物のＣＤ６−Ｉｇ免疫沈降は、１５mMＥＤＴＡを含めて及び含めずに行った。１０５ｋＤａ分子及び３５ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇによる免疫沈降は２価カチオン非依存性であり、９０ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇによる免疫沈降は２価カチオン依存性であった。図８．ＣＤ６−Ｒｇ（＝ＣＤ６−Ｉｇ）は、多数のヒト由来細胞系へ結合する。ＣＤ６−Ｒｇ（実線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の多数のヒト細胞系への結合をフローサイトメトリーにより調べた。細胞系を、ＣＤ６−Ｒｇの結合能に基づいて高結合、低結合及び非結合の３種類に分類した。細胞をこれらの３種類に分類するために用いられる結合％は、蛍光強度がイソタイプ適合ＣＤ５−Ｒｇ融合タンパク質で染色した細胞より大きい細胞数に基づく（縦の一点鎖線）。試験したヒト細胞系は次のものであった：（ａ）ＨＢＬ−１００、（ｂ）Ｈ３７１９、（ｃ）Ｈ３６０６、（ｄ）ＬＣＬ８６６４、（ｅ）ＧＭ０８３３、（ｆ）ＩＭＲ９０、（ｇ）Ｊｕｒｋａｔ、（ｈ）Ｐｅｅｒ、（ｉ）ＨＵＴ７８、（ｊ）ＨＰＢ−ＡＬＬ、（ｋ）ＪＭ、（ｌ）Ｈ９、（ｍ）ＬＴＲ２２８及び（ｎ）Ｒａｊｉ。全１０⁴細胞を各実験で分析した。図９．ＣＤ６−Ｒｇ結合は飽和性及びトリプシン感受性である。（Ａ）増加濃度のＣＤ６−Ｒｇ及びＣＤ５−Ｒｇの乳がん腫細胞系ＨＢＬ−１００への結合をフローサイトメトリーで調べた。結合％（縦軸）を図８に記載されたように求めた。全１０⁴細胞を各タンパク質濃度で調べた。（Ｂ）ＣＤ６−Ｒｇのトリプシン処理ＨＢＬ−１００細胞への結合を、ＣＤ６−Ｒｇ及びＣＤ５−Ｒｇの未処理ＨＢＬ−１００細胞への結合とフローサイトメトリーで比較した。この図は、３回実験のうちの代表の結果を示すものである。トリプシン消化は記載されたように行った。図１０．ＣＤ６−Ｒｇ結合は２価カチオン依存性である。ＥＤＴＡ（＋ＥＤＴＡ、点線）の存在下ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合をＣＤ６−Ｒｇ（一点鎖線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の結合とフローサイトメトリーで比較した。ＣＤ６−Ｒｇ／ＨＢＬ−１００複合体を形成させて、ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合に関するＥＤＴＡの影響を調べた（＋ＥＤＴＡ、実線）。全１０⁴細胞を各実験で調べた。図１１．ＣＤ６−Ｒｇ結合は抗ＣＤ６ｍＡｂで遮断される。２種類の異なった抗ＣＤ６ｍＡｂ（ＭＢＧ６及びＧ３−６）及び不適当なＩｇＭｍＡｂについてＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞への結合能をフローサイトメトリーで調べた。各々の場合において、連続希釈の抗体を試験した。図１２．ＣＤ６−Ｒｇ結合はサイトカインによりモデュレートされる。ＣＤ６−Ｒｇ（実線）及びＣＤ５−Ｒｇ（破線）の未処理ＨＢＬ−１００細胞又は指定したサイトカインで処理したＨＢＬ−１００細胞への結合をフローサイトメトリーで試験した。ＣＤ６−Ｒｇ結合後の、任意のマーカー（一点鎖線）より右側に蛍光強度があるＨＢＬ−１００細胞の比率（％）は各パネルに記されている。（Ａ）及び（Ｂ）欄に示されたデータは、２種類の異なる実験を表している。図１３．ＣＤ６−Ｒｇ結合タンパク質の免疫沈降。ＨＢＬ−１００細胞を[³ H]グルコサミンで放射能標識した。細胞溶解物からＥＤＴＡの不在下又は存在下にＣＤ６−ＲｇＣＴＬＡ４−Ｉｇ或いは抗ＥＧＦレセプターｍＡｂと反応性のあるタンパク質を免疫沈降させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析した。矢印は、ＥＤＴＡの不在下にＣＤ６−Ｒｇに結合した２つの放射能標識ポリペプチドを示す。分子量はｋＤａで示されている。図１４．ＣＤ６−Ｒｇはリンパ系器官において細胞に結合する。（Ａ）皮膚に結合するＣＤ６−Ｒｇ。真皮中に散在する細胞が標識されている。毛幹の非特異的標識は矢印で示されている。（Ｂ）ヒトＩｇＧ１と連続皮膚切片との反応性。毛幹の弱い標識のみ明らかである（矢印）。（Ｃ）ＣＤ６−Ｒｇと胸腺組織との反応性。微細な網目状の標識パターンが皮質内に存在している。（Ｄ）ヒトＩｇＧ１と胸腺組織との反応性。わずかなバックグラウンド標識だけが検出された。（Ｅ）ＣＤ６−Ｒｇとリンパ節との反応性。中間又は皮質傍洞の細胞が標識された。（Ｆ）ヒトＩｇＧ１のリンパ節組織への結合は観察されなかった。図１５．ヒト表皮ケラチン細胞はＣＤ６の表面リガンドを発現する。培養した表皮ケラチン細胞とＣＤ６−Ｒｇ、ＣＤ５−Ｒｇ又はＥＬＡＭ１−Ｒｇとの反応性が示されている。細胞を５μg の融合タンパク質と２％ＢＳＡを含有するＰＢＳ中でインキュベートし、洗浄した。その融合タンパク質をヒトＩｇＧに対するフルオレセイン複合ヤギ抗血清で標識し、フローサイトメトリーで分析した。図１６．ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用は、ＴＥ−胸腺細胞結合を仲介する。５回の個々のＴＥ−胸腺細胞結合実験の纏めが示されている。パネルＡは特異抗体の存在下のロゼット形成量を示し、パネルＢは融合タンパク質存在下のロゼット形成量を示す。標準誤差は棒線で示されている。抗ＣＤ６抗体及びＣＤ６ −Ｒｇ融合タンパク質は共にＴＥ−胸腺細胞結合を部分的に阻害し、Ｔ１２はロゼット形成を４９±９％だけ阻害し、ＣＤ６−Ｒｇはロゼット形成を３５±９％だけ阻害した。対照と３５.１（ｐ＜０.００３）、Ｔ１２（ｐ＜０.０１５）とＣＤ６−Ｒｇ（ｐ＜０.０５）間の結合の差は統計的に有意であった。図１７．ＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合は、ＣＤ６特異的である。ｍＡｂＴ１２による間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーで求めたＣＯＳ−ｎｅｏ（対照）細胞及びＣＯＳ−ＣＤ６細胞上のＣＤ６発現のヒストグラムが示されている。バックグラウンド蛍光（対照ｍＡｂＰ３）は点線で示され、ＣＤ６発現は実線で示されている。棒グラフは、ｍＡｂＰ３或いはＴ１２の存在下ＣＯＳ−ｎｅｏ及びＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合を示す。３回の個々の実験の平均とＳＥＭが示されている。図１８．ＣＤ６の胸腺細胞サブセット上の発現。胸腺細胞をｍＡｂＴ１２、ヤギ抗マウスＩｇＧのフルオレセイン複合Ｆａｂフラグメント及びＣＤ４−ＰＥとＣＤ８−サイクロムの組合わせで染色し、ＦＡＣＳｔａｒ^Plusフローサイトメータで分析した。全胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８＋（未熟、ＤＰ）胸腺細胞、ＣＤ４＋ＣＤ８−（成熟、ＳＰ４）及びＣＤ４−ＣＤ８＋（成熟、ＳＰ８）胸腺細胞上のＣＤ６発現のヒストグラムによって３種類の異なる胸腺に関する実験の代表的データが示されている。バックグラウンド蛍光（対照ｍＡｂＰ３）は、各ヒストグラムに示されている。図１９．ＣＤ６は、成熟及び未熟胸腺細胞の双方のＴＥ細胞への結合を仲介する。ＣＤ１＋又はＣＤ１−胸腺細胞を、対照抗体（Ｐ３）、抗ＣＤ２（３５. １）又は抗ＣＤ６（Ｔ１２）の存在下にＴＥ細胞とインキュベートし、ロゼット形成を分析した。３回の個々の実験からの抗ＣＤ２及び抗ＣＤ６によるＴＥ−胸腺細胞結合及びＳＥＭ（対照抗体に相対する）の平均阻害％が示されている。ＣＤ１＋（未熟）胸腺細胞のＴＥ細胞への結合阻害は白い棒で示され、ＣＤ１（成熟）胸腺細胞の結合阻害は斜線の棒で示されている。成熟及び未熟サブセットの双方の胸腺細胞のＴＥＣへの結合は、抗ＣＤ２及び抗ＣＤ６抗体により阻害される。抗ＣＤ２ｍＡｂ３５.１によるＣＤ１＋対ＣＤ１−細胞の阻害の差は統計的に有意である（ｐ＜０.０１）が、抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２による阻害の差はなかった（ｐ＜０.２５）。図２０．胸腺上皮細胞及び胸腺線維芽細胞はＣＤ６のトリプシン感受性表面リガンドを発現する。（Ａ）胸腺上皮細胞、胸腺線維芽細胞及び胸腺細胞のＣＤ６−Ｒｇとの反応性を示す代表的ヒストグラムが示されている。また、各パネルにおいては、対照融合タンパク質ＣＤ５−Ｒｇによる蛍光のバックグラウンドレベルが示されている。（Ｂ）ＣＤ６−Ｒｇの２価カチオン含有培地中ＥＴ細胞への結合（−ＥＤＴＡ）、培地中トリプシン処理ＴＥ細胞への結合（トリプシン）或いはＰＢＳ＋１０mMＥＤＴＡ中ＴＥ細胞への結合（ＥＤＴＡ）を試験した。間接ＩＦ及びフローサイトメトリーにより求めたＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を示す代表的実験（実施した＞１０回から）のヒストグラムが示されている。図２１．ＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合に関するＪ４−８１及びＪ３−１１９のプレインキュベーションの影響。２価カチオン（−ＥＤＴＡ）を含む又は２価カチオンを含まない（＋ＥＤＴＡ）培地中ｍＡｂＰ３（対照）、Ｊ４−８１又はＪ３−１１９の存在下、間接ＩＦ及びフローサイトメトリーで検出したＣＤ６−ＲｇのヒトＴＥ細胞の表面への結合のヒストグラムが示されている。各パネルにおいて対照ヒトＩｇＧの結合が示されている。下のパネルは、Ｐ３、Ｊ４− ８１或いはＪ３−１１９の存在下のＣＤ６−Ｒｇ結合の纏めの混成ヒストグラムを示すものである。データは、２価カチオンの存在下の１０回の実験及び２価カチオンを含まない２回の実験の代表である。図２２．ｍＡｂＪ３−１１９は、ビオチニル化Ｊ４−８１のＴＥ細胞の表面への結合を遮断する。ｍＡｂＡ３Ｄ８、Ｊ３−１１９及びＪ４−８１の増加濃度の存在下のビオチニル化Ｊ４−８１の特異結合（蛍光単位−バックグラウンド）が示されている。希釈した腹水（１：５０、１：１００、１：２５０及び１：５００）を用い、ｍＡｂの相対量は希釈度×１０³の逆数として示されている。ＴＥ細胞の表面に強く結合するｍＡｂＡ３Ｄ８はＪ４−８１の結合を変えなかったが、Ｊ３−１１９と非ビオチニル化Ｊ４−８１の双方はビオチニル化Ｊ４−８１の結合を阻害した。データは、２回の実験の代表である。図２３．ｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇは、ヒトＴＥ細胞の表面上の同じ１００ｋＤａ糖タンパク質に結合する。ｍＡｂＰ３（対照）、ｍＡｂＪ４−８１、ｈＩｇＧ１（ヒトＦｃ対照）或いはＣＤ６−Ｒｇに架橋した¹²⁵I標識ＴＥ細胞表面タンパク質のオートラジオグラフが示されている。架橋したタンパク質は、電気泳動の前に２−ＭＥ単独（架橋剤を切断する）或いはトリプシンと２−ＭＥで処理した。ＣＤ６−ＲｇとｍＡｂＪ４−８１の双方が同じトリプシン消化パターンで１００ｋＤａタンパク質に結合した。データは、２回の個々の実験の代表である。図２４．ＣＤ６Ｌ−１００の生後ヒト胸腺における発現。ｍＡｂＪ４−８１により間接ＩＦで染色した生後２ヵ月のヒト胸腺の凍結切片の光学顕微鏡写真（５つの胸腺について代表的実験）が示されている。パネルＡは、ｍＡｂＪ４−８１により間接ＩＦで染色した胸腺の切片を示すものである。パネルＡは胸腺皮質の切片を示し、パネルＢはハッサル小体（ＨＢ）を有する胸腺髄質の切片を示す。胸腺莢膜は、パネルＡでは破線で示されている。皮質内及び髄質のＨＢ内及び回りの胸腺上皮細胞（矢印）は共に、ｍＡｂＪ４−８１と反応した。胸腺細胞は、ｍＡｂＪ４−８１と反応しなかった。同じパターンは、ｍＡｂＪ３−１１９を用いて見られた(図示されていない)(４００×拡大)。図２５．ＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合はＣＤ６特異的である。図２５Ａ．ＣＯＳ−ｎｅｏ（対照）及びＣＯＳ−ＣＤ６細胞上へのＣＤ６の発現のヒストグラムを間接的免疫蛍光法により抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２（Gangemi ら、J．Immunol．143:2439-2447(1989)）（実線）または対照抗体Ｐ３（点線）を用いて決定した。図２５Ｂ．棒グラフは、Ｔ１２、Ｊ４−８１またはＰ３ｍＡｂのいずれかの存在下におけるＣＯＳ−ｎｅｏ及びＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合を示している。示されているのは、３回の異なる実験の平均及びＳＥＭである。図２６．ＡＬＣＡＭと称されるＣＤ６リガンドの予期アミノ酸配列の配列分析、ＡＬＣＡＭｍＲＮＡ発現のノザン分析、及び活性化Ｔ細胞によるＡＬＣＡＭ細胞表面発現。図２６Ａ．ＡＬＣＡＭ（残基３５−５１２）、ＢＥＮ、ニューロリン（neurol in）、ＲＡＧＥ及びＭＵＣ１８の免疫グロブリン様細胞外ドメインの調節。タンパク質名の直前の小文字は種を示している（ヒト(human)はｈ、にわとり(chicke n)はｃ、及び魚（fish）はｆで示されている）。コンセンサス残基とは、３種以上のタンパク質において一致するものを言う。不変残基には影をつけて示してあり、システイン残基はアステリスクを付けて強調している。示されているペプチド配列の番号は以下の出版物から得たものである：cBEN，8-484(Pourquie ら、P roc．Natl．Acad．Sci．USA 89:5261(1992)); ニューロリン、1-466(Lawssing ら、Differentiation 56:21(1994)); RAGE，3種類のIgドメインを含む、30-307( Neeper ら、J．Biol．Chem．267:14998(1992)); MUC18，40-525(Lehmannら、Pro c．Natl．Acad．Sci．USA 86:9891(1989))。図２６Ｂ．末梢血単球からの全ＲＮＡの１５μg 及び休止及びＰＨＡ活性化（７２時間）末梢血単核細胞、Ｔ細胞リンパ種ＣＥＭ及びＭＯＬＴ４、赤白血病細胞系Ｋ５６２、Ｂ細胞リンパ種ＲＡＭＯＳ、ＲＡＪＩ及びＤＡＵＤＩ、骨髄単球細胞系ＨＬ６０及びＵ９３７、大顆粒球リンパ種ＹＴ、ヒト胸腺腫瘍ＨＢＬ−１００及びＣＯＳ細胞からの全ＲＮＡの２５μg を使用してＲＮＡブロットを作製した。ランダムプライムされた(random primed)³²P-ラベル化ＡＬＣＡＭまたはグリセルアルデヒド３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＧＡＰＤＨ）ｃＤＮＡをプローブとして使用した。図２６Ｃ．末梢血単核細胞をインビトロにおいてＰＨＡにより活性化し、Ｔ細胞のＣＤ６−ＲｇまたはＪ４−８１いずれかへの結合能を１０日間、２色免疫蛍光及びフローサイトメトリー法を用いてモニターした。時間（日）に対する平均のチャンネル(channel)蛍光をプロットした。図２７．ヒト染色体地図。ｃＤＮＡプローブのＲバンド染色体への蛍光切片上ハイブリッド形成法（ＦＩＳＨ）により、バンドｑ１３．１−ｑ１３．２における染色体３上の両方の染色分体上にシグナル（矢印で示されている）が発生した。領域はＧバンドイデオグラム上の括弧で示されている。図２８．ＡＬＣＡＭのＣＤ６への結合。図２８Ａ．抗ＡＬＣＡＭｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇ融合タンパクのＡＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞形質移入体への結合を示すフローサイトメトリーヒストグラム。図２８Ｂ．抗ＣＤ６ｍＡｂＧ３−６及びＡＬＣＡＭ−ＲｇのＣＤ６発現ＣＯＳ細胞形質移入体への結合を示すフローサイトメトリーヒストグラム。ｍＡｂのまたは融合タンパクのみかけの形質転換ＣＯＳ細胞に対するバックグラウンド結合のレベルは、影の付いたヒストグラムで示されている。図２９．ＡＬＣＡＭコード配列及び予期アミノ酸配列。図３０．ＡＬＣＡＭドメイン及びその切断型。発明の詳細な説明本発明は、結合対の一方の構成部分を示す分子に関するものであり、このときその結合対のもう一方の構成部分は成熟胸腺細胞、末梢Ｔ細胞及びＢ細胞サブセットの表面上に存在するＣＤ６分子である。本明細書中で言及されるＣＤ６リガンドは２つの形態で存在し、１つはＣＤ６結合に対して２価カチオン非依存性であり、もう１つは２価カチオン依存性である。これらの形態の１番目（カチオン非依存性形態）は、１０５ｋＤａタンパク質を含み（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めた）、活性化白血球細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ）と称される。２番目の形態は、二価カチオン依存性であり、ＡＬＣＡＭとは分離した異なる分子であり、９０ｋＤａタンパク質を含んでいる（還元条件下ＳＤＳ−ＰＡＧＥで求めた）。図２９に示される予期アミノ酸配列に基づいたＡＬＣＡＭの分子量は約６５ｋＤａである。図２９に示されるＡＬＣＡＭのアミノ酸配列は、Ｎ−結合グリコシル化のための９つの潜在部位を含む。従って、ＡＬＣＡＭＣＤ６リガンドのグリコシル化された形態は１００〜１０５ｋＤａの分子量を有すると考えられる。ＡＬＣＡＭは成熟タンパクから開裂したＮ−末端疎水性シグナルペプチド、次に細胞外ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン及び原形質ドメインからなる。単一ドメインまたはドメインの組合せを、様々な相互作用を阻害するために使用することができる。例えば、細胞外ドメイン（単独で、または同じあるいは他の配列と組み合わせて）は、ＣＤ６−ＡＬＣＡＭ相互作用の阻害のための有用な物質であることが期待される。ＡＬＣＡＭの細胞外ドメインは５つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインに分けることができる。２つのＮ−末端ドメインはＶ−セットであり、続く３つのＩｇドメインはＣ２−セットのものである(Pourquieら、Proc ．Natl．Acad．Sci．USA 89:5261(1992); Tanaka ら、Neuron 7:535(1991); Bur nsら、Nueron 7:209(1991))。（図３０参照）。これらのＩｇ様ドメインは他の配列から単離して、または他の配列と組み合わせて使用することができる。本発明のＣＤ６リガンド（ＡＬＣＡＭ）は、線維芽細胞、皮膚表皮ケラチン細胞、髄質ＴＥＣ、消化管上皮、膵島及び腺房細胞並びに単球及び活性化Ｔ細胞、肝細胞及び脳皮質のニューロンを含む様々な種類の組織及び細胞上に存在する。ＣＤ６リガンドの組織分布は、ＣＤ６／ＣＤ６リガンド系がＴ細胞と単球及び他の活性化Ｔ細胞並びに上皮細胞、線維芽細胞及び膵島細胞のような特殊化された細胞との相互作用の仲介に重要であることを示す。ＣＤ６及びＣＤ６リガンドの脳内での発現はＣＤ６／ＣＤ６リガンド系が神経系細胞の相互作用に関連することを示している。本発明のＣＤ６リガンドは、下記実施例に記載されるように免疫沈降により、例えばＣＤ６融合タンパク質を用いて天然源（上記参照）から単離することができる。適切な融合タンパク質、ＣＤ６−Ｉｇ（＝ＣＤ６−Ｒｇ）融合タンパク質は、ＣＤ６の細胞外部分のコード配列(Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991)) をSeed & Aruffo(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3365(1987))に記載されているようにヒトＩｇＧのＦｃ部分のコード配列に結合することにより生産することができる。ＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質は、以前に記載されているように過渡的トランスフェクションによりＣＯＳ細胞中で発現させることができる(Seed & Ar uffo，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:3365(1987))。上記で言及したものを含む細胞源からのＣＤ６リガンドの利用可能性は、ＣＤ６リガンド遺伝子のクローニングを可能にする。ＣＤ６リガンドの全て又は一部の配列決定は、ＣＤ６リガンドコード配列を、例えば、ｃＤＮＡ又はゲノムＤＮＡライブラリーから単離する際の使用に適切な核酸プローブ又はプライマーを設計するのに必要な情報を与えるであろう。Stratageneからの Unizap XR系を用いて胸腺上皮細胞から適切なｃＤＮＡライブラリーを調製することができる。使用することができる他のライブラリーとしては、Stratageneからの脳前頭皮質及び肝臓腫瘍ＨｅｐＧ２ｃＤＮＡライブラリーが含まれる。更に詳細には、ＣＤ６リガンドはアフィニティークロマトグラフィーで精製することができる。抗ＣＤ６リガンドｍａｂ(５〜１０mg)(例えば、Pesandoら，J ．Immunol．137:3689(1986))を用いて、Patelら(Virology 149:174(1986))に記載されているように抗ＣＤ６リガンドをＣＮＢｒ活性化セファロース４Ｂ(Pharm acia)上に固定化することによりＣＤ６リガンドに対するアフィニティーカラムを調製することができる。タンパク質溶解物、例えば胸腺上皮細胞からの又はＢ細胞系溶解物からのＣＤ６リガンドは、抗ＣＤ６リガンドセファロースカラムを用いてアフィニティー精製することができる。ＣＤ６リガンドは、更にトリフルオロ酢酸を含むアセトニトリル／Ｈ₂Ｏ勾配を用いるＣ₁₈逆相ＨＰＬＣカラム(Vy dac)により２４０nmのＵＶ検出で精製することができる。（実施例IVは乳ガン細胞からのＣＤ６リガンドのＪ４−８１免疫精製の記載を含む。実施例Ｖ及びVIはＡＬＣＡＭの４種類の付加エピトープへの抗体の調製に関する記載を含む。）純度が決定されると、未処理（intact）ＣＤ６リガンド及びＶ８−プロテアーゼ、トリプシンまたは他のプロテアーゼにより産生するペプチドのＮ−末端アミノ酸配列を決定することができる。アミノ酸配列から縮重オリゴヌクレオチドプライマーを、ＣＤ６リガンドのｃＤＮＡを認識するように設計して、ＣＤ６リガンドｃＤＮＡをＰＣＲ増幅することができる。ＰＣＲ増幅におけるエラーを防御するために、³²Ｐ−ラベル化ＰＣＲ増幅ＣＤ６リガンドｃＤＮＡを適するｃＤＮＡライブラリーからＣＤ６リガンドｃＤＮＡを検出するためのプローブとして使用することができる。ＣＤ６リガンドｃＤＮＡのヌクレオチド配列は標準的な方法を用いて決定することができる。（一般的には以下を参照。Sambrook，Fritsh 及びManiatis，Molecular Cloning: A Laboratory Manual，2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)）実施例IVは、パルス−液体タンパク質配列決定装置内における精製したＡＬＣＡＭ及びそのＣＮＢｒフラグメントの分析についての記述を含む。未処理タンパク及び内部フラグメントからのアミノ酸配列は、ニワトリ神経接着分子ＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰと相同性である。実施例IVは、ニワトリＢＥＮに相当するＤＮＡフラグメントを使用してＣＤ６リガンドｃＤＮＡを単離することを記載している。ＡＬＣＡＭｃＤＮＡ配列及び予期アミノ酸配列は図２９に示されている。クローン化されると、ＣＤ６リガンドコード配列を、例えばプロモーターに操作的に連鎖した発現構築物（ベクターはウイルス又はプラスミドベクターである）中に入れて、宿主細胞中へ導入することができる。その構築物は、その構築物を用いて原核又は真核宿主細胞を形質転換することができる。ＣＤ６リガンドはグリコシル化タンパク質であるので、真核宿主が好ましい。哺乳動物細胞系が特に有利である（例えば、ＣＯＳＭ６系又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞系）。ＣＤ６リガンドは、ＣＤ６リガンドタンパク質（例えば、Ｉｇ融合タンパク質）をコードする遺伝子により形質転換した宿主細胞を、コード配列が転写されかつその転写物がタンパク質に翻訳されるような条件下に培養することにより可溶性形態で生産することができる。本発明は、ＣＤ６リガンド全体に関し、更に、例えば、ＣＤ６リガンドに特異的な抗体(モノクローナル（実施例Ｖ及びVI参照）又はポリクローナル)(又はその結合断片)を生じる標準免疫化プロトコールに使用することができる抗原としての使用に適切なその一部に関する（リガンドおよびその一部は化学的にまたは組換えにより合成することができる）。その一部は、ＣＤ６リガンドの少なくとも５連続アミノ酸（ＡＬＣＡＭ配列の例は図２９に示されている）、好ましくは少なくとも１０又は１２アミノ酸、更に好ましくは少なくとも２５連続アミノ酸、最も好ましくは少なくとも４０、４５または５０アミノ酸を表す。より大きな一部、例えば、少なくとも１００、２５０又は５００アミノ酸の一部も使用することができる。本発明は、単独の、または他のＣＤ６リガンドドメイン配列または非ＣＤ６リガンド配列と組合せた、シグナル配列、または細胞外、膜貫通あるいは細胞質ドメイン（又は細胞外ドメインの免疫グロブリン可変領域様ドメイン（Ｖ）及び免疫グロブリン定常部様ドメイン（Ｃ）サブユニットのようなこれらのドメインのサブユニット）に相当するＣＤ６リガンドの部分を含む。本発明は、また、ＣＤ６リガンドコード配列（ＤＮＡまたはＲＮＡ）全体及びその一部に関し、これらは、例えばプローブまたはプライマーとしての使用に適している（strategene及び／またはGibco による標準的に記載されるハイブリダイゼーション条件（例えばＰＣＲに対する）を使用することができる）。そのような部分はＣＤ６リガンドの（例えば、図２９に示される配列の）少なくとも１５、２０、３０、７５または１５０ヌクレオチドを表す。また、より大きな部分、例えば、少なくとも３００、７５０または１５００ヌクレオチドの部分、を使用することができる。本発明は、シグナル配列または細胞外、膜貫通または細胞質ドメインに相当するＣＤ６リガンドの一部を含む。そのような部分は、様々な組合せ及び非ＣＤ６リガンドコード配列（例えばＡＬＣＡＭ−Ｒｇ）との組合せ中に存在する。抗ＣＤ６ｍａｂによりＣＤ６をＴ細胞上に結合すると、分離されていないＴ細胞に効力のあるコマイトジェンシグナルを与え(Gangemiら，J．Immunol．143:24 39(1989); Morimoto ら，J．Immunol．140:2165(1988); Weeら，J．Exp．Med．1 77:219(1993))、分離されたＣＤ４＋Ｔ細胞クローンを直接活性化し(Swackら，J ．Biol．Chem．266:7137(1991))、ＴＣＲγδを直接活性化するがＴＣＲαβＴ細胞を活性化しない(Pawlec ら，Hum．Immunol．31:165(1991))。即ち、ＣＤ６はＴＣＲ仲介Ｔ細胞の引き金となることに密接に関係する成熟Ｔ細胞分子であり、ＴＣＲ複合体の連結反応はＣＤ６リン酸化をもたらす(Weeら，J.Exp．Med．17 7:219(1993))。生体内でＣＤ６／ＣＤ６リガンド相互作用を阻害する方法は、効力のある免疫治療法を与える。可溶性ＣＤ６リガンド（天然源から単離又は組換え的に生産した）を用いて、例えば、Ｔ細胞ＣＤ６−ＣＤ６リガンド＋補助細胞接触に依存するＣＤ６仲介Ｔ細胞活性化を阻害することができる。その免疫治療法は、多発性硬化症のような活性化Ｔ細胞による疾患、コーガン症候群を含む炎症性葡萄膜炎、リウマチ様関節炎、ウェゲナー肉芽腫症及び一過性動脈炎のようなＴ細胞仲介脈管炎症候群及び臓器同種異系移植拒否反応を治療するのに有効である。実際に、同種異系骨髄（ＢＭ）移植片に用いたＢＭのＣＤ６ｍａｂ欠乏が移植片対宿主疾患を防止することが示された(Soifferら，J．Clin．Oncol．10:1191(1992))。可溶性ＣＤ６リガンドのほかに、可溶性ＣＤ６並びにＣＤ６及びＣＤ６リガンドのミメトープ(模擬体)(例えば、ランダムＲＮＡ、ＤＮＡ又はペプチドライブラリーから、例えば、Szostak（TIBS 17:89(1992)）又はTsaiら(J．Immunol．15 0:1137(1993))に記載されているように調製された)を、ＣＤ６／ＣＤ６リガンド相互作用を阻害することを含む方法において免疫治療剤として用いることができる。抗ＣＤ６及び抗ＣＤ６リガンド抗体（好ましくはモノクローナル抗体（実施例Ｖ及びVI参照））もその方法に用いることができる。これらの免疫治療剤は、例えば、薬学的に許容しうる担体、希釈剤等と医薬組成物として処方される。組成物中の活性剤の濃度及び活性剤の投与量は、物質、患者及び探究された効果によって変動する。最適投与量は容易に決定することができる。ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用がＣＤ６発現細胞のＴＥ細胞への接着を仲介するという証明は、ＣＤ６−ＣＤ６リガンド結合がＴ細胞成熟調節の役割を果たしていることを示している。ＣＤ２／ＬＦＡ−３、ＩＣＡＭ−１／ＬＦＡ−１、ＶＬＡ−３、−４、−６及びフィブロネクチンを含む他の分子は、胸腺細胞−ストローマル細胞の結合における接着分子として作用する（Singer et al，J．Imm unol．144:2931-2939(1990)，Giunta et al，J．Exp．Med.，173:1537-1548(199 1)，Utsumi et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 88:5685-5689(1991)）。ＣＤ６リガンドの同定により、胸腺細胞−ＴＥ細胞結合及びＴＥ細胞成熟におけるＣＤ６の相対的寄与を決定することができる。ＣＤ６リガンドはまた、Ｂ細胞の発生にも関与していてもよい。というのはニワトリにおける研究は、ＡＬＣＡＭ（ＢＥＮ）がファブリシウス(Fabricius)のブルサ（Pourquie et al,Development 109:743-752(1990)）（Ｂ細胞が発生する鳥の器官）における内皮細胞上に発現されることを示したからである。現在、ＣＤ６リガンドの細胞間シグナルの変換能については、全く情報がない。抗−ＣＤ６ｍＡＢＴ１２は補助（修飾）細胞の存在下、かつ架橋ＦｃＲの明確な不在下においてＴ細胞を活性化できるという発見は、ＣＤ６を通じたシグナルによるＴ細胞の活性化が自己免疫反応性において重要であることを示している(Gangemi et al，J．Immunol．143:2439-2447(1989 ))。このサポートとして、抗ＣＤ６ｍＡｂは自己ＭＬＲを増強または阻害することができる(Gangemi et al，J．Immunol．143:2439-2447(1989 )，Bott et al，Int．Immunol．7:783-792(1994))(Singer，N.G．et al, J．Imm unol．(1994))。ＣＤ６リガンドは活性化されたＴ細胞及び単球並びに多数のＴ及びＢ細胞系により発現されるので、ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用はＣＤ６＋Ｔ及びＢ細胞と活性化された白血球の間の機能的な相互作用の役割を果たしていると考えられ、ＣＤ６−ＣＤ６リガンド結合は活性化白血球の間の接着相互作用を仲介すると考えられる。このように、ＡＬＣＡＭは炎症応答の開始に影響しなくてもよいが、リウマチ様の関節炎のような慢性的炎症応答の維持を阻害してもよい。ニワトリにおけるＡＬＣＡＭ（ＢＥＮ）は、初期の胚発生の期間及び脳において優位に発現される(Pourquie et al.，Development 109:743-752(1990))。ＡＬＣＡＭは、同種親和性接着分子として機能し、かつ神経突起の成長をサポートする(Tanaka et al，Neuron 7:535-545(1991))，Burns et al，Neuron 7:209-220( 1990))。脳におけるニューロンによるヒトＡＬＣＡＭの発現が報告されている（ Peter et al，"Identification and characterization of an 100kDa ligand fo r CD6 on human thymic epithelial cells"，J．Exp．Med．(1994)）。免疫系及び神経系間の相互作用は、多発性硬化症、アルツハイマー病、及び筋萎縮性側索硬化症のような、特定の慢性的神経変性症の病理学において重要である（Appel et al，Advances in Neurology 56:405-412(1991)，McGeer et al，Can．J．Neu rol．Sci．18:376-379(1991)，Rowland，L．P.，Advances in Neurology 56:3-2 3(1991)）。ＣＤ６及びＣＤ６リガンドが両方ともこれらの系における細胞により発現されるという知見は、レセプター／リガンド対が免疫及び神経系間の細胞性相互作用において機能することを示している。例えば、炎症は免疫応答の増幅を必要とするので、ＣＤ６結合のブロックは免疫応答増幅及び炎症を防止することが予想できる。さらに、脳の細胞による白血球相互作用の阻害は、慢性的神経変性病の治療に使用することができる。ＡＬＣＡＭにおける突然変異は、神経及び／または免疫系の障害を誘導することが予想される。そのような障害が明らかになると、ＣＤ６リガンドヌクレオチド配列またはＣＤ６リガンドに対して同定されたＲＦＬＰ（制限フラグメント長多形性）(restriction fragment length polymorphisms)を、遺伝子検索候補のマーカーとして使用することができる。例えば、ＡＬＣＡＭは運動ニューロン及び免疫細胞上に発現されるため、ＡＬＣＡＭ変異をスクリーニングする候補の病気は、筋萎縮性側索硬化症及び多発性硬化症の散発的事例である。上記に加えて、本明細書の記載から、可溶性ＡＬＣＡＭを、例えば障害を受けた神経または切断された神経の再生を誘導するために使用できることが理解されるであろう。障害を受けた神経の部位に可溶性ＡＬＣＡＭを、例えば注入により投与することにより、誘導を行うことができる。ＣＤ６リガンド遺伝子は、神経系及び免疫系に影響するメンデル障害における変異に対する潜在的候補である。さらなる試験を示唆する病気は、まだ、ＣＤ６リガンド遺伝子が割り当てられるヒト染色体３の領域に位置づけられていない。ＣＤ６リガンドｃＤＮＡにおいて同定される多形性は、遺伝子除外研究の候補として使用することができる。（注目される多形性は、ｃＤＮＡは、ＰＨＡ活性化ｃＤＮＡライブラリー及びＨＬ６０細胞から得られるという事実に起因するものであってもよい。異なるドナー源はしばしば遺伝子において多形性を示す）。本発明の具体的な態様が以下の実施例において詳細に記載されるが、これらの実施例は制限されるものではない。実施例Ｉ実験の詳細：細胞及び培養条件。ＴＥＣを、以前に記載されているように強化培地中で移植片手法により培養した（Singerら，Human Immunol．13:161(1985)）。ヒト胸腺組織を、心臓血管矯正手術を受ける子供たちからの廃棄組織としてデュークユニバーシティーメディカルセンターの病理科から入手した。汚染している胸腺線維芽細胞を、ヒト線維芽細胞上の細胞表面抗原に結合するｍＡｂ１Ｂ１０と補体仲介溶菌により除去し（Singerら，J．Invest．Dermatol．92:166(1989)）、次にＰＢＳ中０.０２％ＥＤＴＡで処理した。３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層をＰＢＳ中０.０２％ＥＤＴＡで処理した後、培養皿から０.０２％ＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中０.０５％トリプシンでＴＥＣを剥離した。細胞を３回洗浄した後、分析した。ＴＥＣを、５％ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、０.０２５ μg/mlアンホテリシンＢ(Gibco)、１００U/mlペニシリン及び１０００μg/mlストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中５００U/mlＩＦＮ−γで３７℃において４８〜７２時間活性化した。胸腺細胞は、胸腺組織からかき裂くことにより得、フィコール−ヒパックで遠心することにより精製し、ＲＰＭＩ１６４０で洗浄した。胸腺細胞を直ちに用いるか又は２０％ＦＣＳ、７.５％ＤＭＳＯ及びＲＰＭＩ１６４０中１０μg/mlゲンタマイシン(Scherring)を含有する培地中で凍結した。凍結した胸腺細胞を、記載されているように３０％ＦＣＳ、１０μg/mlデオキシリボヌクレアーゼＩ(S igma)、１０μg/mlゲンタマイシン及びＲＰＭＩ１６４０中２０U/mlヘパリン(Up john)を含有する培地中でインキュベートすることにより解凍した(Denningら，J .Immunol．138:680(1987))。生存胸腺細胞をフィコール−ヒパックで遠心することにより精製した。ＣＯＳ−Ｍ６細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム (Gibco)、０.０２５μg/mlアンホテリシンＢ(Gibco)、１００U/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で生育した。ヒト表皮ケラチン細胞（ＥＫ）を新生児包皮から培養した。包皮をＨＢＳＳ(G IBCO)中２.５ mg/mlトリプシンＩＩＩ型(Sigma)中で４℃において一晩インキュベートし、表皮を取り出し、単細胞浮遊液の中へかき裂き、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に播種し、記載されているように培養した(Has himotoら，J．Exp．Med．157:259(1983))。細胞表面抗原の検出：非固定培養細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（０.９M ＮａＣｌ、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７.３）或いは２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＤＭＥＭに懸濁した。細胞をＣＤ６−Ｒｇ、ＣＤ５−Ｒｇ又はＥＬＡＭ −Ｒｇ(Sandro Aruffo，Bristol-Myers Squibb)、組換え融合タンパク質（１００μg/ml）と４℃で３０分間インキュベートし、２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳで洗浄した。ＦＩＴＣ複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ₁を第２試薬として用いた。細胞をFACStar Plusフローサイトメータ（Becton-Dickinson，Inc.、マウンテンビュー、カリフォルニア州）で分析し、データをソフトウェアプログラム PC-Lysys(Becton-Dickinson)を用いて処理した。ＴＥＣ−胸腺細胞ロゼット結合分析：ＴＥＣ−胸腺細胞ロゼット結合分析を記載されているように行った（Singerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6588 (1986)）。簡単に述べると、１０⁶胸腺細胞を２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＰＢＳ又はＤＭＥ中２×１０⁵ＴＥＣと混合し、２５０ｇで３分間遠心し、４℃で６０分間インキュベートした。細胞を弱く再懸濁し、光学顕微鏡によって計数した。胸腺細胞を３個以上結合したＴＥＣを陽性として評価した。これらの実験で用いた胸腺細胞を新たに単離するか、液体窒素から解凍するか或いは亜集団に分離した。胸腺細胞を、Ｎａ１／３４（抗ＣＤ１；Andrew McMichael、オックスフォード、英国）及びヤギ抗マウスＩｇＧ(KPL)で間接免疫蛍光染色した後にFACStar Plusを用いて蛍光活性化細胞選別することによりＣＤ１⁺（未熟、ＣＤ６^low）又はＣＤ１^-（成熟、ＣＤ６^hi）亜集団に分離した。選別した細胞の再分析により全胸腺細胞亜集団は純度＞９５％であった。ＴＥＣ−胸腺細胞結合は、結合前に胸腺細胞或いはＴＥＣを抗体又は融合タンパク質とプレインキュベートすることにより阻止した。使用した抗体は次のものとした：Ｐ３Ｘ６３( 対照ｍａｂ)(ＡＴＣＣ)、３５.１（抗ＣＤ２；John Hansenから、シアトル、ワシントン州（Martinら，J．Immunol．131:180(1983)）及びＴ１２（抗ＣＤ６；E llis Reinherzから、ボストン、マサチューセッツ州(Reinherz ら，Cell30:735(1 982)）。ＣＯＳ細胞トランスフェクション及び結合実験：安定なＣＤ６発現ＣＯＳ細胞系を、ＣＭＶプロモーターの制御下ＣＤ６遺伝子を含むプラスミド(A．Aruffo 、シアトル、ワシントン州 Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))及びLiao らに記載されているＳＶ４０プロモーターによって誘導された細菌ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｎｅｏプラスミド(J．Immunol．12/1,1993)を同時トランスフェクトすることにより作成した。ネオマイシン耐性遺伝子を発現する細胞は、６０μg/mlＧ４１８(GIBCO)を含有するＤＭＥ／１０％ＦＣＳ中でインキュベートすることにより選択した。ＣＤ６を発現する細胞は、ｍａｂＴ１２を用いて間接免疫蛍光で同定した。ＣＤ６陽性及び陰性細胞は、Becton-Dickinson FAC Star^Plusフローサイトメータを用いて単細胞選別することによりクローン化した。ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）及び対照ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−Ｎｅｏ）を上述したものと同じＴＥ細胞と共に結合実験に用いた。ＣＯＳ細胞とＴＥ細胞とを区別するために、ＴＥ細胞を収集前に１μg/mlカルセインＡＭ(Molec ular Probes、ユージーン、オレゴン州）と３７℃で１５分間代謝的に標識した。カルセインＡＭ標識細胞は蛍光性であり、蛍光顕微鏡で他の細胞から容易に区別することができる。ＣＤ６−Ｒｇ（ＣＤ６−Ｉｇ）キメラ遺伝子の構築及び融合タンパク質の調製：全長ＣＤ６をコードするｃＤＮＡを含むプラスミド（Aruffoら，J．Exp．Med. 174:949(1991)）を制限酵素Ｅｓｐ１で消化することにより、ＣＤ６免疫グロブリン融合遺伝子を構築した。次に、Ｅｓｐ１消化プラスミドをＤＮＡポリメラーゼとフラッシュし、それに適切なＢａｍＨＩリンカーを加えた。次に、そのプラスミドをＢａｍＨＩ及びＮｄｅ１で消化した。次に、ＣＤ６の細胞外ドメインを含む断片を単離し、ヒトＩｇＧ１タンパク質の定常部をコードするｃＤＮＡ断片を含むベクター中にサブクローン化した（Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci．U SA 89:2292(1992)）。ＣＤ５−Ｉｇ及びＣＴＬＡ４−Ｉｇの構築は別に記載されている(Linsleyら，Science 257:792(1992)及びJ．Exp．Med．174:561(1991))。適切な遺伝子の５００μg のＤＮＡをＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法によりＣＯＳ細胞にトランスフェクトした。１８〜２４時間後、１０％ＦＢＳダルベッコ変法イーグル培地を無血清培地で置き換え、その後ＰＢＳで洗浄した。細胞培養液を７〜１０日維持した後、収集した。簡単に述べると、融合タンパク質を含む上清を２５００ rpmで２０分間遠心し、０.４５μm ミリポアフィルターでろ過した。上清を２ml充填プロテインＡカラムに流速１.００ml／分で通過させた。結合した融合タンパク質をｐＨ３.５、０.１M クエン酸で溶離し、直ちにｐＨ９.０、１.０M トリスで中和した。次に、溶離したタンパク質をＰＢＳ中で一晩透析し、Bradford法を用いてタンパク質を定量した。ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞への結合を阻害するｍａｂのスクリーニング：ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からのｍａｂ及び抗インテグリンｍａｂのパネル（図４の説明参照）の中から第２試薬としてフルオレセイン複合ヤギ抗マウスＩｇＧ（ＫＰＬ）を用いて上述のＴＥ細胞表面の反応性をスクリーンした。ＴＥ細胞に反応した１５４ｍａｂの中の１２６をこの分析に用いた。ＴＥ細胞（１００ｋ）を腹水又は精製ｍａｂと１：１００で４℃で１５分間インキュベートした。この混合液にＣＤ５−Ｉｇ或いはＣＤ６−Ｉｇ（５μg）を加え、４℃で２時間反応した。ＰＢＳ含有２％ＢＳＡで洗浄した後、ＣＤ５−Ｉｇ及びＣＤ６−ＩｇをヒトＩｇＧ(Sigma)のＦｃタンパク質に特異的なフルオレセイン複合ヤギ抗血清で標識した。この試薬は、ほとんどのマウスｍａｂと交差反応しなかった。生じる交差反応性を説明するために、ＣＤ６−ＩｇとＣＤ５−Ｉｇを含む試料間の蛍光（ΔＦＬ）の差である結合を求めた。対照ｍａｂＰ３とプレインキュベートした試料のΔＦＬを１００％結合とした。免疫沈降及びタンパク質標識条件：１２０μCi/ml グルコサミン（ＮＥＮ）を標識実験に用いた。放射能標識グルコサミンの添加と同時に細胞を無グルコース培地＋１０％透析ウシ胎児血清中で４８時間培養した。次に、細胞をＥＤＴＡを用いて引き上げ、ＨＢＳＳ中で洗浄し、ロイペプチン、ＰＭＳＦ及びペプスタイン（１μg/ml）、０.０５％胆汁酸ナトリウム、２％ＮＰ−４０を含有する２０mMトリス、ｐＨ７.５に溶解した。その溶解物を１００μg/mlヒトＩｇＧ１、次に５０μl のプロテインＡビーズで前清澄化した。次に、前清澄化した溶解物を５０μg/mlＣＤ６−Ｒｇ又はＣＴＬＡ４−Ｉｇ又は２μg/ml抗ＥＧＦレセプター抗体とインキュベートした。その溶解物に２mMＣａ⁺⁺及びＭｇ⁺⁺を加えた（これはＨＢＳＳ結合バッファーに含有した２価カチオンの濃度である）。免疫沈降物を溶菌バッファーで３回、ＰＢＳで２回洗浄し、還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥローディングバッファー中で煮沸し、８〜１０.５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルに充填した。そのゲルを４０％プロパノール中に固定し、ｍＡＭｉＡｍｐｌｉｆｙ^R試薬(Am ersham)で増強し、乾燥し、オートラジオグラフィー処理した。結果：抗ＣＤ６ｍａｂ及びＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質はＴＥ−胸腺細胞結合を阻害する：浮遊液ＴＥ−胸腺細胞結合分析を用いて（表１）、ＣＤ６ｍａｂＴ１２がＴＥ−胸腺細胞結合を４９±９％（Ｎ＝５）だけ阻害することがわかった。同様に、組換えＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質はＴＥ−胸腺細胞結合を３５±９％（Ｎ＝５）だけ阻害した。これにより、ヒトＴＥＣがＣＤ６のリガンドを発現することが示された。 ^aＴＥ細胞ロゼット％である結合を求めた（≧３結合胸腺細胞）。５回の個々の実験の平均及び標準誤差が示されている。^b 阻害％＝１００（対照の結合−実験の結合）／対照の結合対照は、ｍａｂに対してＰ３及びＣＤ６−Ｉｇに対してＥＬＡＭ−Ｉｇとした。Ｐ値は、ｍａｂ又はＣＤ６−Ｉｇの存在下の結合を対照結合と比較するテイルが２つのスチューデントのｔ検定を表す。ヒトＴＥ細胞はＣＤ６のリガンドを発現する：ヒトＴＥＣがＣＤ６のリガンドを発現することを確認するために、ＴＥＣを組換えＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質とインキュベートし、間接免疫蛍光、次いでフローサイトメトリーによりＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を分析した。負の対照（ＣＤ５−Ｉｇ及びＥＬＡＭ− Ｉｇ）はいずれもＴＥＣ表面に結合しなかったが、ＣＤ６−ＩｇはＴＥ細胞に結合し（表２）、ヒトＴＥ細胞表面上に発現したＣＤ６のリガンドがあることが示された。ＣＤ６−ＩｇのＴＥ細胞上のＣＤ６リガンドへの結合は２価カチオン（Ｃａ⁺⁺及びＭｎ⁺⁺）によって高められ、ＥＤＴＡによって部分的に阻害された（図１及び図２）。データは、ＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合に対して少なくとも２成分があり、１成分（又はリガンド）は２価カチオンに依存し、１成分（又はリガンド）は２価カチオンに依存しない。 ^a培養したＴＥ細胞を２０００μg/ml融合タンパク質とインキュベートした。間接免疫蛍光、次にフローサイトメトリーにより融合タンパク質を検出した。^b 直線平均蛍光チャンネル。データは３回の実験の代表である。ＣＤ６は接着性分子である：Ｔ１２とＣＤ６−Ｉｇが共に胸腺細胞のＴＥＣへの結合を部分的に阻害するという事実は、ＣＤ６が接着性分子であることを示した。しかしながら、ＴＥロゼット実験は、Ｔ１２とＣＤ６−Ｉｇが立体障害のためにＴＥ−胸腺細胞結合を阻害する可能性を除外しなかった。ＣＤ６が実際に接着性分子であるかを求めるために、高レベルのトランスフェクトしたＣＤ６を発現するＣＯＳ細胞系（ＣＯＳ−ＣＤ６）を作成した。ＣＤ６の存在しないＣＯＳ細胞（ＣＳ−Ｎｅｏ）はＴＥＣに結合しなかったが、ＣＯＳ−ＣＤ６細胞はＴＥＣを結合した（図３）。更に、このＣＯＳ−ＣＤ６：ＴＥ細胞結合は、結合がＣＤ６に対するｍａｂ（Ｔ１２）によって阻害されるのでＣＤ６依存性であった。ｍａｂＪ４−８１はＣＤ６のリガンドと反応する：そのＣＤ６リガンドを同定するために、ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からの抗インテグリンｍａｂの多量のパネル及び４７９ｍａｂのブラインドパネルの中からＴＥ細胞に対する反応性をスクリーンした。ＴＥＣと反応した１５４ｍａｂの中の１２６ｍａｂを分析に用いてＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を阻害した。図４に示されるように、研究会ｍａｂＳ２５２（Ｊ４−８１）だけがＣＤ６−ＩｇのＴＥＣへの結合を阻害することができた。Ｂ細胞表面抗原に対して高めたｍａｂＪ４−８１は、Ｂ細胞上の１０５ｋＤａタンパク質を認識し(Pesandoら，J．Immun ol．137:3689(1986))、培養した全ＴＥＣ上の表面（図５）及びヒト胸腺の凍結切片中の髄質ＴＥＣ（図６）と強く反応する。ＴＥＣからの１０５ｋＤａ、９０ｋＤａ及び３５ｋＤａ分子のＣＤ６−Ｉｇによる免疫沈降：ＥＤＴＡ不在下に、ＣＤ６−Ｉｇ融合タンパク質は分子量１０５、９０及び３５ｋＤａを有するタンパク質分子を免疫沈降した(図７、レーン１)(注：約１５０ｋＤａバンド)。ＥＤＴＡ存在下に、ＣＤ６−Ｉｇは１０５及び３５ｋＤａ分子のみ免疫沈降した(図７、レーン２)(注：約１５０ｋＤａバンド)。レーン３では、ＥＤＴＡ不在下に、対照融合タンパク質、ＣＴＬＡ４−Ｉｇは１０５、９０又は３５ｋＤａタンパク質分子を免疫沈降しなかった。ｍａｂＪ４−８１はＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ細胞への結合を阻害する：ｍａｂＪ４−８１によって検出した１０５／３５ｋＤａタンパク質分子がＣＤ６のリガンドであることを定義するために第３の方法を用いた。上で示したように、ＣＯＳ−ＣＤ６：ＴＥＣ結合はＣＤ６特異的である。ＣＤ６とＪ４−８１によって認識された１０５／３５ｋＤａ分子が接着性分子対を形成することを更に証明するために、ｍａｂＪ４−８１によるＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ：ＴＥＣ結合が阻害された（表３）。 ^aＣＯＳ細胞ロゼット％である結合を求めた（３≧結合ＴＥＣ）。３回の個々の実験の平均及び標準誤差が示されている。^b 阻害％＝１００（Ｐ３の結合−実験の結合）／Ｐ３の結合Ｐ値は、Ｔ１２又はＪ４−８１の存在下の阻害をＰ３の存在下の阻害と比較するテイルが２つのスチューデントのｔ検定を表す。間接ＩＦ分析におけるＪ４−８１とヒト組織の反応性：ｍａｂＪ４−８１は、ＴＥＣ、表皮ケラチン細胞、膵の腺房細胞及び島細胞、消化管上皮、単球（１０％）及び活性ＢＰＴ細胞（２１％）と反応した。Ｂ細胞は、Ｈ４−８１にも陽性である(Pesandoら，J．Immunol．137:3689(1986))。一緒にすると、これらのデータからＣＤ６−ＣＤ６リガンド系がＴＥＣ−胸腺細胞相互作用に関係すること、ＣＤ６が接着性分子であること及びｍａｂＪ４−８１によって検出された１０５／３５ｋＤａタンパク質がＣＤ６のリガンドを含むことが証明される。更に、ｍａｂＪ４−８１によって定義されたＣＤ６−２価カチオン非依存性リガンドが様々な種類の免疫及び上皮細胞上で発現されることは、ＣＤ６／ＣＤ６リガンド系が他の免疫細胞と他の免疫細胞との相互作用及び種々の上皮微環境との相互作用に重要であることを示すものである。実施例II 実験の詳細：細胞系、融合タンパク質及び抗体．結腸がん腫由来細胞系Ｈ３７１９及び黒色腫由来細胞系Ｈ３６０６は、Drs．K.E．& I．Hellstrom（Bristol-Myers Squi b、シアトル、ワシントン州）から得た。ヒト乳房上皮細胞系ＨＢＬ−１００、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系ＬＣＬ、ヒト肺線維芽細胞ＩＭＲ９０、成人Ｔ細胞白血病Ｊｕｒｋａｔ、皮膚Ｔ細胞リンパ腫ＨＵＴ７８、ヒト末梢血急性白血球白血病由来細胞系ＨＰＢ−Ａ１１、ヒトＴ細胞リンパ腫Ｈ９、ヒトバーキットリンパ腫Ｒａｊｉ、線維芽細胞系ＧＭ０８３３、Ｂ細胞リンパ芽球腫Ｐｅｅｒ、Ｔ細胞白血病ＪＭ及びＢ細胞リンパ芽球腫ＬＴＲ２２８を用い、主にアメリカン・タイプ・カルチュア・コレクション（ロックビル、メリーランド州）から入手した。ＣＤ５−Ｒｇ(Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 89:10242(1992))、ＥＬＡＭ１−Ｒｇ(Walzら，Science 250:1132(1990))及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ(Linsleyら，J．Exp．Med．174:561(1991))は以前に記載されている。抗ＣＤ６ｍＡｂＧ３−６（ＩｇＧ）は、Dr．J．Ledbetter(Bristol-Myers Squib 、シアトル、ワシントン州)(Ledbetterら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:138 4(1987))からのものであり；抗ＣＤ６ｍＡｂＭＢＧ６（ＩｇＭ）は、Dr．A．McM ichael（オックスフォード大学、オックスフォード、英国）（Bastinら，J．Cli n．Exp．Immunol．46:597(1981)）からのものであり；抗ＣＤ６ｍＡｂ２Ｈ１は、Dr．C．Morimoto(Dana-Farber Cancer Institute、ボストン、マサチューセッツ州)(Morimotoら，J．Immunol.140:2165(1988))からのものであり；抗ＣＤ６ｍＡｂＴ１２は以前に記載されている(Reinherzら，Cell30:735(1982))。ＤＮＡ制限酵素及びＤＮＡリンカーはNew England Biolabs(ビバリー、マサチューセッツ州)から入手し；ＲＰＭＩ、ＨＢＳＳ、ＦＢＳ及び前染色分子量マーカーはGIBCO -BRL(ガイザースバーグ、メリーランド州)から入手した。ヒト表皮ケラチン細胞（ＥＫ）は新生児包皮から培養した。包皮をＨＢＳＳ(GIBCO-BRL)中２.５ mg/ml トリプシンＩＩＩ型(Sigma、セントルイス、ミズーリ州）中で４℃において一晩インキュベートし、表皮を取り出し、単細胞浮遊液の中へかき裂き、マイトマイシンＣ処理３Ｔ３線維芽細胞支持細胞層上に播種し、(Hashimotoら，J．Exp．Me d．145:259(1983))に記載されているように培養した。ＣＤ６−Ｒｇの調製．ＣＤ６をコードする全長ｃＤＮＡを含むＣＤ６−Ｒｇをコードするプラスミド(Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))を制限酵素ＥｓｐＩで消化し、ＤＮＡポリメラーゼＩのクレノウフラグメントで処理し、ＢａｍＨＩリンカー(New England Biolabs、ビバリー、マサチューセッツ州)に結合した。次いで、ベクターを制限酵素ＮｄｅＩ及びＢａｍＨＩで消化した。ＣＤ６の細胞外ドメインを含むＮｄｅＩ／ＢａｍＨＩＤＮＡをヒトＩｇＧ₁の定常部（ヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３）をコードするｃＤＮＡ断片を含むプラスミド中にサブクローン化した。ＣＤ６−Ｒｇタンパク質を以前に記載されているように（Ar uffoら，Cell 61(7):1303(1990)）ＣＯＳ細胞中での過渡的発現により調製し、ＣＯＳ細胞移入体の上清からプロテインＡカラム（Repligen、ケンブリッジ、マサチューセッツ州）に吸収させ、それから溶離することにより精製した。ＣＤ６−Ｒｇ細胞結合実験．典型的には、ＨＢＳＳ／２％ＦＢＳ／２０mMヘペス（洗浄／染色バッファー）中５×１０⁷細胞／mlを５０μg/mlの融合タンパク質とインキュベートした。粘着細胞はＰＢＳ中０.５mMＥＤＴＡ（ＰＢＳ／ＥＤＴＡ）を含む皿から剥がし１回洗浄し、非粘着細胞は１回洗浄した後に融合タンパク質と１時間氷上でインキュベートした。引き続き、細胞を３回洗浄し、ＦＩＴＣ−ヤギ抗ヒトＩｇＧ（１０μg/ml，Tago、バーリンガム、カリフォルニア州）と１時間氷上でインキュベートした。細胞を３回洗浄し、ＰＢＳ中１％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した（Epics V，Coult er、ヒアリー、フロリダ州）。この染色手順を用いてＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００への結合が飽和可能であるかを調べた。これらの実験において、ＣＤ６−Ｒｇ及び対照融合タンパク質は次の濃度で用いた：１０、２０、３０、４０、５０、１００及び２００μ/ml 。ＣＤ６−Ｒｇリガンドのトリプシンに対する感受性を調べるために、ＨＢＬ−１００細胞（５×１０⁷）を０.０５％トリプシン／０.５mMＥＤＴＡで３７℃において３０分間処理し、洗浄／染色バッファーで３回洗浄し、ＣＤ６−Ｒｇとインキュベートし、上記のようにフローサイトメトリーで分析した。ＣＤ６−Ｒｇ結合に２価カチオンが要求されることを調べるために、ＣＤ６−Ｒｇを１５mMＥＤＴＡの存在下にＨＢＬ−１００細胞とインキュベートするか或いはＣＤ６−Ｒｇと予めインキュベートし洗浄したＨＢＬ−１００細胞にＥＤＴＡを加えた。抗ＣＤ６遮断実験の場合、ＣＤ６−Ｒｇ（５０μg/ml）を１ mg/ml抗ＣＤ６ｍＡｂＧ３−６（ＩｇＧ）又はＭＢＧ６ｍＡｂ(IgM，A.J．McMichaelから)を含む腹水又はイソタイプ適合（ＩｇＭ）抗体の１：５０、１：１００及び１：２００希釈度とインキュベートした。ＨＢＬ−１００細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合のサイトカイン誘導モジュレーションを調べるために、細胞をＣＤ６−Ｒｇ結合実験の前にＩＬ−１β、ＴＮＦ−α(Genzyme、ボストン、マサチューセッツ州)及びＩＦＮ− γ(Upstate Biotechnology Inc.、ラックプラシド、ニューヨーク州)(１０ ng/m l)と個々に、２つに組合わせて又は全て一緒に３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートした。免疫沈降実験．免疫沈降実験の場合、細胞を１０％正常ＲＰＭＩ及び１０％透析ＦＢＳを含有する無グルコースＲＰＭＩ中１２０μCi/ml の［６−³H］グルコサミン(NEN Dupont、ボストン、マサチューセッツ州）と３７℃、５％ＣＯ₂で４８時間インキュベートした。細胞をＰＢＳ／ＥＤＴＡを有する培養皿から引き上げ、ＨＢＳＳ中で洗浄し、ロイペプチン、ＰＭＳＦ及びペプスタチン（１μg/ ml，Boehringer Manheim、インディアナポリス、インディアナ州）を含有する２０mMトリス、ｐＨ７.５に溶解した。その溶解物を攪拌して核を除去し、５０μg /mlのヒトＩｇＧ１(Sigma)及び５０μl のプロテインＡ−セファローススラリー (Repligen)と２回４℃で３０分間インキュベートすることにより前清澄化した。次に、細胞溶解物を２mMＣａ²⁺及びＭｇ²⁺或いは１５mMＥＤＴＡの存在下５０μ l のプロテインＡ−セファローススラリー(Repligen)と共に５０μg/mlのＣＤ６ −Ｒｇ又はＣＴＬＡ４−Ｉｇ又は２μg/mlの抗ＥＧＦレセプター抗体(Oncogen S cience、ユニオンデイル、ニューヨーク州)と４℃で２〜４時間インキュベートした。次に、プロテインＡ−セファロースビーズを溶菌バッファーで３回洗浄した。免疫沈降したタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ（８〜１０.５％勾配ゲル）、次にオートラジオグラフィーで分析した。免疫組織学．マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）リンパ系及び非リンパ系組織を切除し、液体窒素で凍結した。６マイクロメートルクリオスタット組織切片を調製し、ガラススライド上に取り付け、氷冷却アセトンで固定した。固定した切片を、１ mMＣａ²⁺及びＭｇ²⁺、１０％ＢＳＡ及び１０％正常ヤギ血清（ＮＧＳ）を含有するＰＢＳ溶液（染色バッファー）中５０μg/mlのＣＤ６−Ｒｇ又はヒトＩｇＧ１ (Sigma)を用いて室温で１時間染色した。スライドを染色バッファー中で３回洗浄し、１０μg/mlのフルオレセイン複合アフィニティー精製ヤギ抗ヒトＩｇＧ抗体(Tago)と室温で１時間インキュベートした。染色バッファーで３回洗浄した後、スライドを蛍光顕微鏡で調べた。結果：ＣＤ６レセプターグロブリン、ＣＤ６−Ｒｇ．ＣＤ６のアミノ酸末端シグナル配列を含む４００アミノ酸細胞外ドメインをコードするｃＤＮＡ断片(Aruffo ら，J．Exp．Med．174:949(1991))をヒトＩｇＧ₁のヒンジ（Ｈ）、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインをコードするｃＤＮＡ断片上に融合することによりＣＤ６−Ｒｇ融合遺伝子を構築し、上記のように哺乳動物発現ベクターＣＤＭ７Ｂ^-（Aruffo ら，Cell 61(7):1303(1990)）中にサブクローン化した。ＩｇＧ定常部をコードするｃＤＮＡ断片は３つの点突然変異を含む。これらのアミノ酸置換により、ＩｇＧＦｃドメインのＦｃＲＩ、ＩＩ及びＩＩＩへの結合が傷害された。本実験に用いたＣＤ６−Ｒｇタンパク質は、ＣＯＳ細胞内での過渡的発現により得られ、プロテインＡカラムに吸収させそれから溶離することにより精製した (Aruffo ら，Cell 61(7):1303(1990))。ＣＤ６−Ｒｇは共有結合のホモ二量体として発現され、ＥＬＩＳＡ分析で試験した抗ＣＤ６ｍａｂ全てによって確認された（Ｔ１２、２Ｈ１、ＭＢＧ６及びＧ３−６）。以前に記載されたＣＤ５−Ｒｇ（Aruffoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10242(1990)）、ＥＬＡＭＩ−Ｒｇ(Walzら，Science 250:1132(1990))及びＣＴＬＡ４−Ｉｇ(Linsleyら，J．Exp ．Med．174:561(1991))融合タンパク質及び／又はヒトＩｇＧ１は、結合及び免疫沈降実験全てにおいてイソタイプ適合対照として用いた。ヒト及びマウス細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合．ＣＤ６−Ｒｇの多数のヒト及びマウス細胞系への結合をフローサイトメトリーを用いる間接免疫蛍光により調べた。ＣＤ６−Ｒｇは、試験した細胞系のサブセットに結合した（図８）。ＣＤ６ −Ｒｇ染色後に最も明るい蛍光強度を示す細胞系の中では、ヒト乳房上皮由来細胞系ＨＢＬ−１００、ヒト結腸がん腫由来細胞系Ｈ３７１９、黒色腫由来細胞系Ｈ３６０６、ＥＢＶ形質転換ヒトＢ細胞系ＬＣＬ及びヒト線維芽細胞系ＧＭ０８３３及びＩＭＲ９０があった。ＣＤ６−Ｒｇ結合後に中間の蛍光強度を示す細胞系の中では、リンパ系細胞系Ｊｕｒｋａｔ、Ｐｅｅｒ及びＨＵＴ７８があった。ＨＰＢＡＬＬ、ＪＭ、Ｈ９、ＬＴＲ２２８及びＲａｊｉを含む他の多数のリンパ系細胞系は、ＣＤ６−Ｒｇへの結合を示さなかった。これらの細胞系はいずれも、対照融合タンパク質ＣＤ５−Ｒｇへ有意な結合を示さなかった。ＨＢＬ−１００細胞系への結合を更に確認した。増加濃度のＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００細胞系への結合は、ＣＤ６−Ｒｇとこの細胞系との相互作用は用量依存及び飽和可能であることを示した（１００μ g/ml、図９Ａ）。これらの細胞をトリプシンで処理するとＣＤ６−Ｒｇ結合を消滅する（図９Ｂ）が、ノイラミニダーゼ又はＮ−グリカナーゼ処理はＣＤ６−Ｒｇ結合を少しだけ減少した。ＣＤ６−ＲｇのＨＢＬ−１００への結合は、キレート剤をＣＤ６−Ｒｇ／ＨＢＬ−１００結合前に加えると部分的にＥＤＴＡ感受性であったが結合後に加えると感受性でなかった（図１０）。更に、ＣＤ６−ＲｇはＰＢＳ中でこの細胞系に極めて弱く結合したが、Ｃａ²⁺或いはＭｇ²⁺を加えると（最終濃度２mM）、ＨＢＬ−１００細胞への強いＣＤ６−Ｒｇ結合が得られた。抗ＣＤ６ｍＡｂＭＧＢ６及びＧ３−６についてＣＤ６のＨＢＬ−１００細胞への結合遮断能を調べた。ＭＧＢ６ｍＡｂはＨＢＬ−１００へのＣＤ６−Ｒｇ結合を濃度依存方式で遮断することができた（図１１）が、Ｇ３−６ｍＡｂはＨＢＬ −１００へのＣＤ６−Ｒｇ結合を０.０２ mg/ml程度の高い濃度で遮断することができなかった（図１１）。ＣＤ６−Ｒｇ結合に関するサイトカインの影響．サイトカインは、多数の細胞表面タンパク質の発現を調節する。ＨＢＬ−１００細胞によって発現したＣＤ６結合タンパク質の発現に関するサイトカインの影響を調べた。それらの細胞をＩＬ−１β、ＴＮＦα及びＩＦＮ−γの混合物で処理すると、ＣＤ６リガンド発現のダウンレギュレーションが生じた（図１２）。サイトカインの各々を単独で又はサイトカインの２つの組合わせで処理すると、ＴＮＦαとＩＦＮ−γの混合物がこれらの細胞によるＣＤ６リガンド発現のダウンレギュレーションに主に関与することが示された。ＣＤ６リガンドの免疫沈降．ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質を用いて、ＨＢＬ −１００細胞によって発現したＣＤ６リガンドを免疫沈降した。¹²⁵Ｉ細胞表面標識又は［³⁵Ｓ］メチオニン／システイン代謝標識後にＣＤ６リガンドを両細胞系から免疫沈降する多数の試みは不成功であった。対照的に、ＣＤ６−Ｒｇを加える前にＨＢＬ−１００細胞溶解物から〜９０及び〜４０ｋＤａの［³H］グルコサミン標識表面糖タンパク質が得られた（図１３）。〜４０ｋＤａタンパク質がユニークなタンパク質或いは〜９０ｋＤａタンパク質の分解酸物であるかは明らかでない。同様に、ＣＤ６−Ｒｇは〜９０及び〜４０ｋＤａのタンパク質を［³H ］グルコサミン標識Ｈ３６０６から免疫沈降させることができた。ＣＤ６−Ｒｇは、ＥＤＴＡが細胞溶解物に存在する場合にはこれらのタンパク質を免疫沈降することは不可能であった。更に、ＣＤ６−Ｒｇは、ＥＤＴＡの存在及び不在の両方で放射性標識ＨＢＬ− １００細胞溶解物から分子量〜１００ｋＤａを有するポリペプチドを免疫沈降したがＣＴＬＡ４−Ｉｇは免疫沈降しなかった（図１３）。この所見は、ＨＢＬ− １００細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合がＥＤＴＡによって完全に遮断されない（図１０）がＨＢＬ−１００細胞をトリプシンで前処理することにより完全に消滅したことを示した細胞結合実験と一致する（図９Ｂ）。この〜１００ｋＤａポリペプチドもＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質によってＨ３６０６溶解物から免疫沈降した。ＣＤ６−Ｒｇ免疫組織化学．高レベルのＣＤ６リガンドを発現する組織を同定するために、マウス脳、皮膚、肝臓、腎臓、心臓、脾臓、リンパ節、胸腺及び小腸から得られた組織切片のパネルについてＣＤ６−Ｒｇ結合を調べた。反応性は皮膚、リンパ節及び胸腺細胞切片に認められた（図１４）。皮膚では真皮の明るい中断染色及び毛嚢の染色が認められた（図１４Ａ）が、ヒトＩｇＧ₁も毛嚢と反応し、この相互作用が分子のＣＤ６部分によって仲介されなかったことが示された。胸腺では主な反応性は皮質で認められ（図１４Ｃ）、リンパ節では明るい染色が中間洞に沿って見られた（図１４Ｅ）。これらの所見に基づいて、ＣＤ６−Ｒｇのマウス胸腺上皮由来細胞系Ｚ２１０への結合及び培養したヒト表皮ケラチン細胞（ＥＫ）への結合を調べた。ＣＤ６ −ＲｇがＺ２１０及びＥＫ細胞の双方に結合することがわかった（図１５）。Ｚ２１０細胞への結合はトリプシン感受性、２価カチオン依存であり、ＨＢＬ−１００細胞と同様の方法でサイトカインによりモデュレートされた。対照融合タンパク質ＣＤ５−Ｒｇは、Ｚ２１０又はＥＫ細胞に結合しなかった（図１５）。実施例III 実験の詳細：細胞及び培養条件．ＴＥ細胞及び胸腺線維芽細胞（ＴＥ）を、記載されているように移植片手法により培養した(Singer ら，Human Immunol．13:16(1985); Singerら，J．Invest．Dermatol．92:166(1989))。ヒト胸腺組織を、心臓血管矯正手術を受ける子供たちからの廃棄組織としてデュークユニバーシティーメディカルセンターの病理科から入手し、胸腺細胞を記載されているように調製した (Denningetら，J．Immunol．139:2573(1989))。ＣＯＳ−Ｍ６細胞（ＡＴＣＣ、ロックビル、メリーランド州）及びＨＢＬ−１００細胞（ＡＴＣＣ）を、１０％ＦＣＳ、１mMピルビン酸ナトリウム、０.０２５μg/mlアンホテリシンＢ、１００U/mlペニシリン及び１００μg/mlストレプトマイシンを含有するＤＭＥＭ中で生育した。モノクローナル抗体．本実験に用いられる抗体は次のものである：Ｐ３Ｘ６３／Ａｇ８（対照ｍＡｂ；ＡＴＣＣ）、３５.１（抗ＣＤ２；J．Hansen 、シアトル、ワシントン州）、Ｔ１２（抗ＣＤ６; E．Reinherz、ボストン、マサチューセッツ州）、Ｎａ１／３４（抗ＣＤ１ａ; A．McMichael、オックスフォード、英国）、Ａ３Ｄ８（抗ＣＤ４４；（Telenら，J．Clin．Invest．71:1878( 1983)）、Ｊ４−８１及びＪ３−１１９(Pesandoら，J．Immunol．137:3689(1986 ))、フィコエリトリン複合抗ＣＤ４（ＣＤ４−ＰＥ; Dako，カーピンテリア、カリフォルニア州）、サイクロム複合抗ＣＤ８（ＣＤ８−Ｃｙ; Pharmingen、サンジエゴ、カリフォルニア州）及びヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会（Shaw，分化抗原発現の交差系統（ブラインドパネル）分析の概念：白血球型別、Schlossmanら、編集、オックスフォード大学出版、オックスフォード(1994)）。細胞表面抗原の検出．非固定培養ＴＥ細胞、ＴＦ、ＣＯＳ細胞又はＨＢＬ− １００細胞をＰＢＳ、ＴＢＳ（０.９M ＮａＣｌ、５０mMトリス−ＨＣｌ、ｐＨ7 .３；５mMＣａＣｌ₂、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂を含めるか又は含めずに）或いは２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＤＭＥＭ（１０mMＥＤＴＡを含めるか又は含めずに）に懸濁した。細胞をＣＤ６−Ｒｇ(Weeら，Cell，Immuno l．(1994))又はＣＤ５−Ｒｇ(Arrufoら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:10242 (1991))、ＥＬＡＭ−Ｒｇ(Walzrら，Science 250:1132(1990))、ＣＴＬＡ４−Ｒｇ組換え融合タンパク質(Linsleyら，J．Exp．Med．174:561(1991))又は対照としてヒトＩｇＧ(Sigma、セントルイス、ミズーリ州)(１００μg/ml)と４℃で３０分間インキュベートし、２％ＢＳＡ及び０.１％ＮａＮ₃を含有するＰＢＳで洗浄した。フルオレセイン複合ヤギ抗ヒトＩｇＧ₁(Kirkegaard & Perry Laborator ies，Inc.，ガイザースバーグ、メリーランド州)を第２試薬として用いた。細胞をPrifile IIフローサイトメータ(Coulter Corp.，ヒアリー、フロリダ州)或いは FACStar^Plusフローサイトメータ（Becton-Dickinson，Inc .、マウンテンビュー、カリフォルニア州）で分析し、データをソフトウェアプログラム PC-Lysys を用いて処理した。融合タンパク質相互作用のトリプシン感受性を求めるために、細胞を１mMＥＤＴＡを含有するＰＢＳ中０.２％トリプシンと３７℃において３０分間インキュベートし、融合タンパク質と反応する前に十分に洗浄した。３色免疫蛍光実験を行った。ＴＥ−胸腺細胞ロゼット結合分析．ＴＥ−胸腺細胞ロゼット結合分析を記載されているように行った（Singerら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 83:6588(198 6)）。胸腺細胞を、Ｎａ１／３４及びヤギ抗マウスＩｇＧによる間接免疫蛍光染色後に FACStar^Plus蛍光活性化細胞選別機を用いて蛍光活性化細胞選別することによりＣＤ１⁺（未熟、ＣＤ６^lo）又はＣＤ１^-（成熟、ＣＤ６^hi）亜集団に分離した。選別細胞の再分析により胸腺細胞亜集団は純度＞９５％であった。ＴＥ− 胸腺細胞結合分析に用いたｍａｂは飽和結合力価で又は超過力価で用いた。ＣＯＳ細胞トランスフェクション及び結合実験．安定なＣＤ６発現ＣＯＳ細胞系を、ＣＭＶプロモーターの制御下ＣＤ６遺伝子を含むプラスミドＣＤ６−１５(A．Aruffoら，J．Exp．Med．174:949(1991))及び記載されているＳＶ４０プロモーターによって誘導された細菌ネオマイシン耐性遺伝子を含むｐＳＶｎｅｏプラスミド(Liao ら，J．Immunol．151:6490(1993))を同時トランスフェクトすることにより構築した。ＣＤ６を発現するＣＯＳ細胞は、ｍＡｂＴ１２を用いる間接免疫蛍光分析で同定した。ＣＤ６＋及びＣＤ６−細胞は、Becton-Dickinson FACStar^Plus蛍光活性化細胞選別機を用いてクローン化した。ｐＳＶｎｅｏ（ＣＯＳ−Ｎｅｏ）をトランスフェクトしたＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６Ｄ）及び対照ＣＯＳ細胞をＴＥ細胞と共に懸濁結合分析に用いた。ＣＯＳ細胞とＴＥ細胞とを区別するために、ＴＥ細胞を収集前に１μM カルセインＡＭ（Molecular Probes、ユージーン、オレゴン州）で３７℃において１５分間ＰＢＳ中で代謝的に標識した。カルセインＡＭ標識細胞は蛍光性であり、蛍光顕微鏡で非標識細胞から区別することができる。ＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合を阻害するｍＡｂのスクリーニング．ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会のブラインドパネルからのｍａｂ及び抗インテグリンｍａｂパネルの中からＴＥ細胞表面の反応性をスクリーンした。ＴＥ細胞と反応した１５４ｍａｂの中の１２６をこの分析に用いた。ＴＥ細胞(１０⁵)を腹水又は精製したｍａｂと１：１００で４℃で１５分間インキュベートした。この混合液にＣＤ５−Ｒｇ（５μg）或いはＣＤ６−Ｒｇ（５μg）を加え、４℃で２時間反応させた。２％ＢＳＡを含有するＰＢＳで洗浄した後、ＣＤ５− Ｒｇ及びＣＤ６−ＲｇをヒトＩｇＧ(Sigma)のＦｃタンパク質に特異的なフルオレセイン複合抗血清で標識した。フルオレセイン複合抗ヒトＩｇＧで生じるマウスＩｇとの交差反応性を説明するために、ＣＤ６−ＲｇとＣＤ５−Ｒｇを含む試料間の蛍光（ΔＦＬ）の差として結合を求めた。対照ｍＡｂＰ３とプレインキュベートした試料のΔＦＬを1００％結合とした。抗体遮断実験．ｍＡｂＪ４−８１をプロテインＧ−セファロースカラム（Pi erce、ロックフォード、イリノイ州）を用いて腹水から精製し、製造業者によって勧められているようにスルホ−ＮＨＳ−ビオチン(Pierce)でビオチニル化した。ビオチン−Ｊ４−８１（１μg/ml）をｍＡｂＡ３Ｄ８、Ｊ４−８１又はＪ３− １１９の可変量の存在下にＴＥ細胞の表面に結合した。ＦＩＴＣ複合ストレプトアビジン(Soughern Biotechnology Associates，Inc.、バーミンガム、アラバマ州)とインキュベートした後、細胞を洗浄し、０.４％パラホルムアルデヒドで固定し、フローサイトメトリーで分析した。免疫沈降及びタンパク質標識条件．ＴＥ細胞を１２０μCi/ml ³H−グルコサミン(New England Nuclear、ボストン、マサチューセッツ州)で代謝的に標識し、収集し、以前にに記載されているように免疫沈降した(Weeら，Cell．Immuno l．(1994))。ＴＥ細胞表面タンパク質を、ラクトペルオキシダーゼを用いて¹²⁵ Ｉ(New England Nuclear)で以前に記載されているように標識した(Jones、放射性標識リンパ球タンパク質の１次元及び２次元ポリアクリルアミドゲル電気泳動による分析：細胞免疫学における選択法、Mishell & Shiigi，eds．W.H．Freema n & Company，New York，pp．398-440(1980))。タンパク質架橋． ¹²⁵Ｉで表面標識したＴＥ細胞をｍＡｂ（１：１００腹水）、精製した免疫グロブリン（２００μg/ml）又は組換え免疫グロブリン融合タンパク質（２００μg/ml）とＤＭＥ／５％ＦＢＳ中で２〜４時間インキュベートした。冷ＰＢＳで十分に洗浄した後、結合した免疫グロブリンをＰＢＳ中１mMＤＴＳＳＰ(Pierce)で４℃で６０分間細胞表面タンパク質に架橋した。ＤＴＳＳＰを２０mMトリス−ＨＣｌ（ｐＨ８.０）で不活性化し、細胞を冷ＰＢＳで洗浄した。細胞を、１％ＮＰ−４０、１mMＰＭＳＦ、０.１mMＴＬＣＫ及び０.１％ＮａＮ₃ を含有するＰＢＳに溶解した。免疫グロブリン複合体をプロテインＡ−セファロースビーズ(Sigma)で精製した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥの前に、タンパク質複合体を２％２−メルカプトエタノール（２−ＭＥ）を含有するＳＤＳローディングバッファー（２％ＳＤ、１０mMトリス−ＨＣｌｐＨ７.４、２０％グリセロール、ブロモフェノールブルー）で可溶化して架橋剤を切断した。タンパク質の同一性を確認するために、精製したタンパク質複合体を１mMＥＤＴＡ中０.２％トリプシンで２５℃において３０分間処理した(Patelら，Virology149:174(1986))後、可溶化し架橋剤を切断した。不連続ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル中でタンパク質を電気泳動した後、ゲルを４０％メタノールに固定し、Amplify^R試薬（Amersh am、アーリントンハイツ、イリノイ州）を含浸し、乾燥し、オートラジオグラフィー膜に露光するか又は PhorphorImager System(Molecular Dynamics、サニーベイル、カリフォニア州)を用いて画像にした。免疫組織学．正常ヒト組織を廃棄組織としてデュークユニバーシティーメディカルセンターの病理科から入手し、液体窒素で凍結した。アセトン固定組織切片についてｍＡｂ反応性の間接ＩＦ分析を記載されているように行った(Haynes ら，J．Invest．Dermatol．768:323(1982))。結果：ＴＥ−胸腺細胞結合に関する抗ＣＤ６抗体及びＣＤ６−Ｒｇの影響．胸腺細胞のＴＥ細胞への結合におけるＣＤ６の役割を、ＴＥ−胸腺細胞懸濁結合分析を用いて求めた。ＣＤ６（Ｔ１２）及び組換えＣＤ６免疫グロブリン融合タンパク質（ＣＤ６−Ｒｇ）に対する抗体は共に、胸腺細胞のＴＥ細胞への結合を阻害した（図１６）。以前に報告されているように(Patel & Haynes，Semin．Immunol ．5:283(1993))、抗ＣＤ２ｍＡｂ３５.１（正の対照として）はＴＥ−胸腺細胞結合を７６±５％（ｐ＜０.００３）だけ阻害した。抗ＣＤ６抗Ｔ１２はＴＥ− 胸腺細胞結合を４９±９％（ｐ＜０.０１５）だけ阻害した。同様に、ＣＤ６ヒトＩｇ融合タンパク質、ＣＤ６−ＲｇはＴＥ−胸腺細胞結合を３５±９％（ｐ＜０. ０５）だけ阻害した。飽和量のｍＡｂ３５.１とＴ１２の組合わせをＴＥ−胸腺細胞結合分析に加えると、ｍＡｂ３５.１単独による遮断とほとんど違わないレベルの結合阻害（７４±１０％阻害）が得られた。それにもかかわらず、抗ＣＤ６ｍＡｂ及びＣＤ６−Ｒｇによるデータから、ＣＤ６が胸腺細胞のＴＥ細胞への結合で沈降する接着性分子であること及びヒトＴＥ細胞上にＣＤ６に対するリガンドがあることが示された。ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞のＴＥ細胞への結合．抗ＣＤ６抗体とＣＤ６−Ｒｇの双方によるＴＥ−胸腺細胞結合阻害はＣＤ６が接着性分子であることを示すが、ＴＥ−胸腺細胞結合の阻害は立体障害のために起こることもある。ＣＤ６が接着性分子であることを確認するために、ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６）の安定な移入体を構築した（図１７）。ｐＳＶｎｅｏだけをトランスフェクトしたＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ｎｅｏ）はＴＥ細胞に十分に結合しなかった（６±１％ＣＯＳ−ｎｅｏ結合ＴＥ細胞）が、ＣＯＳ−ＣＤ６はＴＥ細胞に結合した(２５ ±２％ＣＯＳ−ＣＤ６結合ＴＥ細胞、ｐ＜０.０１)(図１７)。ＣＯＳ−ＣＤ６／ＴＥ結合の特異性は、ＣＤ６ｍＡｂＴ１２によるＣＯＳ−ＣＤ６／ＴＥ結合阻害を試験することにより調べた。対照ｍＡｂＰ３及びＣＯＳ−ｎｅｏ細胞（６±１％ＣＯＳ−ｎｅｏ結合ＴＥ）と比べると、ＣＤ６ｍＡｂＴ１２はＣＯＳ−ＣＤ６のＴＥ細胞への結合（５±１％ＣＯＳ−ＣＤ６結合ＴＥ、ｐ＜０.０１）を基線レベルの結合まで完全に阻害し（図１７）、ＣＯＳ−ＣＤ６／ＴＥ結合がＣＤ６特異的であることが確認された。胸腺細胞サブセットのＴＥ細胞への結合に関する抗ＣＤ６ｍＡの影響．ＣＤ６の胸腺細胞サブセット上での発現を調べると共に選別した成熟対未熟胸腺細胞サブセットのＴＥ細胞への結合をＣＤ６ｍＡｂの存在下に試験することにより、胸腺細胞サブセットの結合におけるＣＤ６の役割を求めた。ＣＤ６の胸腺細胞サブセット上の発現は、３色免疫蛍光及びフローサイトメトリーにより求めた（図１８）。胸腺細胞は全てＣＤ６を発現したが、未熟なＣＤ４＋ＣＤ８＋二重陽性（ＤＰ）胸腺細胞はＣＤ６^loであり、成熟ＣＤ４＋ＣＤ８−又はＣＤ４− ＣＤ８＋一重陽性（ＳＰ）胸腺細胞はＣＤ６^hiであった。胸腺細胞サブセットのＴＥ細胞への結合におけるＣＤ６の役割を求めるために、胸腺細胞を蛍光活性化細胞選別によりＣＤ１＋及びＣＤ１−に分離した。ＣＤ１＋胸腺細胞がＤＰＣＤ６^lo細胞でありＣＤ１−がＳＰＣＤ６^hiであることからＣＤ１を選び、ＣＤ１ｍＡｂはＴＥ−胸腺細胞結合を阻害しない（Patel & Hayn es，Semin．Immunol．5:283(1993)）。ＣＤ１＋及びＣＤ１−胸腺細胞は共にＴＥ細胞に十分に結合した（各々４５±４％及び５４±６％、Ｐ＝ＮＳ）。ＣＤ２ｍＡｂ３５.１は、成熟胸腺細胞の結合より（５２±１１％阻害）未熟な胸腺細胞の結合を阻害した(７７±９％阻害)(ｐ＜０.０１)。ＣＤ６ｍＡｂＴ１２も未熟（２２±７％阻害）及び成熟（３９±１７％阻害）胸腺細胞共にＴＥ細胞への結合を阻害した(ｐ＜０.２５)(図１９)。ＣＤ６−Ｒｇの胸腺微環境の細胞への結合．ＣＤ６−Ｒｇ融合タンパク質のＴＥ細胞、胸腺線維芽細胞及び胸腺細胞への結合能を間接ＩＦ及びフローサイトメトリーにより求めた。ＣＤ６−Ｒｇは、ＴＥ細胞の表面及び胸腺線維芽細胞に結合したが、胸腺細胞に結合しなかった（図２０Ａ）。ＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合は、トリプシン感受性であり、２価カチオンに部分的に依存性であった（図２０Ｂ）。ＣＤ６−ＲｇはＤＭＥ及び５％ＦＢＳを含有するバッファー中でＴＥ細胞に十分に結合したが、１０mMＥＤＴＡの存在下にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合は５４±４％だけ阻害した（Ｎ＝５、ｐ＜０.００１、図２０Ｂ）。ＣＤ６−Ｒｇ結合の２価カチオン依存性を更に評価するために、５mMＣａＣｌ₂ 、５mMＭｇＣｌ₂又は５mMＭｎＣｌ₂を含有するバッファー中でＣＤ６−Ｒｇ結合を求めた。ＣａＣｌ₂及びＭｎＣｌ₂は共にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を高めた（各々１４４±５％、ｐ＝０.０１及び３１８±２２％、ｐ＜０.０１）が、ＭｇＣｌ₂はＣＤ６−Ｒｇ結合に影響しなかった（９４±２％、ｐ＝ＮＳ）。ＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合の抗体仲介阻害．ＣＤ６リガンドの同定を始めるために、ヒト白血球分化抗原に関する第５回国際研究会からの４７９ｍＡｂのパネルの中からＴＥ細胞表面に対する反応性を間接免疫蛍光及びフローサイトメトリーによりスクリーンした(Shaw，分化抗原発現の交差系統（ブラインドパネル）分析の概念：白血球型別、Schlossmanら、編集、オックスフォード大学出版、オックスフォード(1994))。ＴＥ細胞の表面と反応した１５４ｍＡｂの中の１２６ｍＡｂを分析に用いてＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を阻害した。第２抗血清と反応しなかった１２２ｍＡｂの中の１つだけ（Ｊ４−８１）がＣＤ６− ＲｇのＴＥ細胞への結合を阻害した。ｍＡｂＪ４−８１は、ＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を６０±７％（Ｎ＝１０、ｐ＜０.００１）及び乳房細胞系ＨＢＬ −１００への結合を４０±３％（Ｎ＝３、ｐ＜０.０２）だけ阻害し（図４）、ＣＤ６−Ｒｇを結合することも示された(Weeら，Cell．Immunol．(1994))。フローサイトメトリー分析においては、ＴＥ細胞及びＨＢＬ−１００細胞の双方がｍＡｂＪ４−８１と強く反応した。 ^* Δ蛍光＝蛍光（ＣＤ６−Ｒｇ）−蛍光（ＣＤ５−Ｒｇ）ＴＥ細胞の表面に十分に結合する選択ｍＡｂの存在下に対照（ＣＤ５−Ｒｇ）と比較したＣＤ６−Ｒｇ結合が示される。⁺ 結合％＝１００[ΔＦＬ（実験ｍＡｂ）−ΔＦＬ(Ｐ３)]／ΔＦＬ（Ｐ３） §阻害％＝１００[ΔＦＬ（Ｐ３）−ΔＦＬ(実験ｍＡｂ)]／ΔＦＬ（Ｐ３）Ｊ４−８１で検出された分子上の第２エピトープと反応することが報告されたｍＡｂＪ３−１１９(Pesandroら，J．Immunol．137:3689(1989))は、ＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合（図２１）を４８±５％（Ｎ＝３、ｐ＜０.００５）だけ及びＨＢＬ−１００細胞への結合を４５±１１％（Ｎ＝３、ｐ＜０.１）だけ高めた。ｍＡｂＪ３−１１９がｍＡｂＪ４−８１と同じタンパク質を認識することを確認するために、ｍＡｂＪ３−１１９のビオチニル化Ｊ４−８１のＴＥ細胞への結合遮断能を試験した。ＣＤ４（ＴＥ細胞の表面に十分に結合する）に対するｍＡｂＡ３Ｄ８はＪ４−８１結合に効果がなかったが、Ｊ４−８１とＪ３−１１９ｍＡｂは共にビオチニル化Ｊ４−８１の結合を阻害した(各々９９％と８２％) (図２２)。更に、ｍＡｂＪ４−８１は、Ｊ３−１１９によって検出された抗原のＢ細胞上の表面発現をモデュレートした(Pesandroら，J．Immunol．137:3689(19 86))。ｍＡｂＪ４−８１がＣＤ６に対するリガンドを認識することを更に決定するために、Ｊ４−８１についてＣＯＳ−ＣＤ６細胞のＴＥ細胞へのＣＤ６特異結合阻害能を試験した。ｍＡｂＪ４−８１はＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ６細胞への結合を顕著に阻害し（８７±１％、Ｎ＝３、ｐ＜０.００１）、もって、Ｊ４−８１がＣＤ６リガンドを認識することが確認された。ｍＡｂＪ４−８１及びＣＤ６−Ｒｇは、同じ１００ｋＤａＴＥ細胞タンパク質を結合する。ＣＤ６−Ｒｇに結合するＴＥ細胞表面タンパク質を同定するためにある方策が考えられ、もって、ＣＤ６と表面¹²⁵Ｉ標識ＴＥ細胞上のＣＤ６リガンドとの相互作用をＤＴＳＳＰ、遊離アミノ基と反応性の切断可能なホモ二官能性架橋試薬で安定し、ＣＤ６−Ｒｇ含有複合体をプロテインＡ−セファロースビーズを用いて精製した。この方策を用いると、ＣＤ６−Ｒｇは１００ｋＤａＴＥ細胞表面タンパク質と特異的に反応した（図２３）。¹²⁵Ｉ標識ＴＥ細胞に架橋したｍＡｂＪ４０−８１もＣＤ６−Ｒｇによって認識された１００ｋＤａタンパク質と移動する１００ｋＤａタンパク質を生じた（図２３）。トリプシン消化実験は、Ｊ４−８１によって同定された１００ｋＤａタンパク質がＣＤ６−Ｒｇによって同定された１００ｋＤａタンパク質と同じトリプシン消化パターンを有する（図２３）ことを示し、両タンパク質が同一であることが示された。ｍＡｂＪ４−８１も、³H−グルコサミンで代謝的に標識したＴＥ細胞の抽出液から１００ｋＤａタンパク質を特異的に免疫沈降した。１００ｋＤａＣＤ６リガンドはＣＤ６に対して２価カチオン非依存リガンドである。免疫沈降実験（上記）は、ＣＤ６−Ｒｇが２価カチオンの存在下及び不在下に１００ｋＤａタンパク質を免疫沈降することができることを示した。即ち、１００ｋＤａタンパク質は２価カチオン非依存ＣＤ６リガンドであることができる。更に、Ｊ４−８１だけが２価カチオンの存在下にＣＤ６−ＲｇのＴＥ細胞への結合を部分的に阻害し、ＣＤ６に対して１を超えるリガンドがあることが示された。ｍＡｂＪ４−８１はＥＤＴＡの存在下にＴＥ細胞へのＣＤ６−Ｒｇ結合をほぼ完全に阻害し(８０±１０％阻害、ｐ＜０.１)(図２１)、主として２価カチオン非依存ＣＤ６−ＣＤ６リガンド相互作用に関係することが確認された。対照的に、ｍＡｂＪ３−１１９は２価カチオンの不在下にＣＤ６−Ｒｇ結合を４７± ７％（Ｐ＜０.１）だけ高めた（図２１）。ｍＡｂＪ４−８１反応性の組織分布．Ｊ４−８１によって認識された１００ｋＤａ糖タンパク質の組織分布を種々のヒト組織の凍結切片について間接ＩＦにより調べた（表５）。ｍＡｂＪ４−８１とヒト組織及び細胞系との反応は広範囲であった。ＣＤ６は生後のヒト胸腺内の胸腺細胞上で発現したが、１００ｋＤａＣＤ６リガンドは皮質及び髄質ＴＥ細胞及びハッサル体上で発現した（図２４）。胸腺以外の組織では、Ｊ４−８１は表皮ケラチン細胞、消化管上皮、乳房上皮、膵臓の腺房細胞及び島細胞、肝細胞、尿細管上皮、大脳皮質のニューロン及び線維芽細胞と反応した。各種類の組織においてｍＡｂＪ４−８１と反応する細胞の種類を挙げる。実施例IV 実験の詳細：細胞系、組織培養および抗体．ＴＥ細胞を報告されている外殖技術により培養した(Singer et al，Human Immunol．13:161(1985); Singer et al, J．Inves t．Dermat．92:166，(1989))。ＣＯＳ細胞、乳ガンＨＢＬ−１００、Ｂ−細胞リンパ細胞系Ｒａｍｏｓ、ＲａｊｉおよびＤａｕｊｉ、Ｔ細胞リンパ球細胞系ＣＥＭおよびＭＯＬＴ４、赤白血球細胞系Ｋ５６２、および単球様細胞系ＨＬ６０およびＵ９３７をＡＴＣＣ（ロックビル、ＭＤ）から入手し、イスコブ（Iscove's ）変性ダルベコ培地に１０％ウシ血清を加えた標準組織培養条件下において維持した。ＮＫ−様細胞系ＹＴはポダック(E．Podack)(Univ．of Miami Sch．of Med icine)から入手した。この実験に使用した抗体は、腹水としてＪ４ −８１（Pesando et al．J．Immunol．137:3689(1986))、Ｌｅｕ４（抗ＣＤ３） −フィコエリトリン(Becton Dichkinson，San Jose，CA)、Ｇ３−６（J．Ledibe tter，Bristol-Myers Squibb からの抗ＣＤ６）、抗Ｌ６（Bristol-Myers Squib b、ＡＴＣＣ）、Ｔ１２（抗−ＣＤ６、ＡＴＣＣ）、およびＰ３（ＡＴＣＣ）である。ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞形質移入体へのＴＥ細胞の結合．ＣＯＳ−ＣＤ６およびＣＯＳ−ｎｅｏ細胞をＣＤ６をコードするプラスミド(Aruffo et al，J．Exp. Med．174:949(1991))、およびｐＳＶｎｅｏプラスミド(Liao et al，J．Immuno l．151:6490(1993))を同時に形質移入することにより作成した。Ｇ４１８選択後、ＣＤ６＋細胞をベクトンディッキンソンＦＡＣＳｔａｒ^PLUS蛍光活性化細胞選別機を使用してクローンを行った。ＣＯＳ−ｎｅｏおよびＣＯＳ−ＣＤ６ＴＥ細胞を、懸濁結合アッセイにおいて使用した。ＣＯＳ細胞とＴＥ細胞を区別するために、ＴＥ細胞を１μｍのカルセインＡＭ(分子プローブ、Eugene,OR)を用いて、３７℃において１５分間、ＰＢＳ中で標識を行ってから収集した。カルセインＡＭ−標識化細胞は蛍光性であり、蛍光顕微鏡により標識を行っていない細胞と区別することができる。ＴＥ細胞と複合化したＣＯＳ−ＣＤ６細胞の割合をスコアにすることにより接着を定量化した。接着をブロックするために、抗体Ｔ１２、Ｊ４−８１、およびＰ３を飽和結合タイターの過剰下において用いた。ｍＡｂＪ４−８１により認識される抗原の遺伝子のクローニングおよびキャラクタリゼーション．ＨＢＬ−１００細胞（〜３×１０⁹）からのＡＬＣＡＭのＪ４−８１免疫親和性精製を記載されるように行った（Bowen et al, J．Immuno l．151:5896(1993)）。精製したタンパク質およびＣＮＢｒフラグメントは、パルス−液体タンパクシークエンサー内において、既に記載された方法により分析を行った(Maresh et al，Arch．Biochem．Biophys．311:95(1994))。アミノ末端配列を、ジェネティックコンピューターグループ（ＧＣＧ）配列分析ソフトを使用してスイスプロットデータベース(SwissProt data base)に対してスクリーニングを行った。ニワトリＢＥＮプローブは、ニワトリ胚ｃＤＮＡライブラリー（ Clontech）からＰＣＲにより合成され、³²Ｐ−ｄＣＴＰによりランダム、プライム標識化され、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用された。一部のｃＤＮＡクローンを単離し、該ｃＤＮＡの５’エンドの２００ｂｐを使用して、全てのコード領域を含むクローンをＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーから単離した。ＡＬＣＡＭのｃＤＮＡ誘導ペプチド配列を用いたデータベース検索を、ＢＬＡＳＴプログラムを用いて行い、４つの最も高いスコアリングヒットの整列化およびコンセンサス配列の誘導化をＧＣＧ配列分析ソフトからのPileupおよびPrettyプログラムを用いて行った。ノザン分析．末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）をリンパ球分離培地(Organon Tek nika，Durham，NC)から、製造者の指示書に従い分離した。ＰＢＭＣを１μg／ｍｌの植物性血球凝集素（ＰＨＡ；Boehringer Mannheim Indianapolis，IN）を用いて刺激を行った。全体の細胞性ＲＮＡはＴＲＩｚｏｌ試薬を用いて調製した(G ibco BRL，Gaithersburg，MD)。単球をＰＢＭＣからプラスチックへ2.5 時間付着することにより単離した。ＲＮＡは変性ホルムアルデヒドゲル上で分画した；２５μg のＲＮＡを単球（１５μg が添加されている）を除く全ての試料に添加した。ＲＮＡをニトロセルロースＴＣ(Schleicher and Schuell，Keene，NH)に移動し、³²Ｐ−ｄＣＴＰによりランダム、プライム標識化されたＡＬＣＡＭまたはＧＡＰＤＨｃＤＮＡによりプローブとした。フィルターを−７０℃においてフィルムに露出させ、現像した。ＰＨＡブラスト調製および染色．ＰＢＭＣを単離し、上述したようにＰＨＡにより活性化を行い、ｍＡｂＪ４−８１腹水（１：２００）またはＣＤ６−Ｒｇ（５０μg ／ｍｌ）、次にＦＩＴＣ標識化第二抗体および抗−ＣＤ３−ＰＥにより選択した日数染色した；Ｊ４−８１染色Ｔ細胞の細胞蛍光分析をＦＡＣＳｃａｎ（Becton Dickinson，San Jose，CA）上で、ＣＤ３正細胞上にゲートすることにより行った。ＡＬＣＡＭコード遺伝子の染色体地図．ＣＤＭ７中の2.2 ｋｂおよび1.9 ｋｂ挿入物を含むヒトＡＬＣＡＭ遺伝子の二種類の重複ｃＤＮＡを、記載されているように蛍光切片上ハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）のためのプローブとして使用した(Milatovich et al，Genomics 11:1040(1991))。プローブをビオチン −ｄＵＴＰを用いて、ニックトランスレーション法により標識を行い、５００ng ／５０μｌ（スライドあたり）の濃度で、ヒトＰＨＡ−刺激リンパ球培養からの予備処置および変性を行った分裂中期染色体にハイブリダイズを行った。非ヒトゲノミックＤＮＡではないが、キャリアの役割をするサーモン精子ＤＮＡを競合者として使用した。インキュベーション、洗浄、アビジン−ＦＴＩＣ(V ector Laboratories)によるシグナル検出およびビオチン化ヤギ抗−アビジンＤ抗体(Vector Laboratories)による一回の増幅の後、染色体はヨウ化プロピジウムで対比染色を行い、アクシオホト（Axiophot(Zeiss)）エピ蛍光顕微鏡下で上述したように分析を行った（Milatovich et al，Genomics 11:1040(1991)）。ハイブリダイゼーションシグナルは、シグナルが染色体の双方の染色分体上に観察される場合にのみ、特異的であるとした。冷却電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラ（Photometrics PM512）を用いてデジタル画像により記録を行い、疑似色で表示した。ＡＬＣＡＭ−Ｒｇ構築．ＡＬＣＡＭ−Ｒｇは、ＣＤ６−Ｉｇと同様のＰＣＲ技術により構築した(Aruffo et al，Proc．Natl．Acad．Sci．US A89:2292(1992 ))。ｐＣＤＭ８におけるＡＬＣＡＭｃＤＮＡをテンプレートとして使用した。ｐＤＣＭ８のＣＭＶプロモーター中のＭｌｕＩ部位を包含する正オリゴヌクレオチドプライマー(GGCCAGATATACGCGTTGACATT)、およびＢａｍＨＩ部位を含み、ＡＬＣＡＭの細胞外膜基部残基をコードするヌクレオチドに特異的な逆プライマー(T GTATCATGTGGATCCGCCTGGTCATTCACCTTTTCTCT)を切断ＡＬＣＡＭをコードするＤＮＡフラグメントをコードするフラグメントを合成するのに使用した。このＰＣＲ生産物をＭｌｕＩおよびＢＡＭＨＩにより消化を行い、同様に消化を行ったヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ１、およびＣＨ２ドメインをコードするベクター（ｐＣＤＭ７）に結紮した。ヒトＩｇＧ１のＦｃタンパク質に融合したＡＬＣＡＭの細胞外領域をコードするキメラ遺伝子を生じた。タンパク質がＣＯＳ細胞におけるＡＬＣＡＭ−Ｒｇの一過性の発現により生産され、かつプロテインＡセファロースへの吸着および溶出により精製された。簡単に述べると、プラスミドＤＮＡをＣＯＳ細胞にＤＥＡＥ−デキストランクロロキン法により形質移入した。１８〜２４時間後、１０％ＦＢＳダルベコ変性イーグルス培地をＰＢＳですすぎ洗浄をしたのち血清を含まない培地と交換した。細胞培養は７〜１０日間維持した後、収集した。簡単に述べると、融合タンパク質を含む上澄み液を２５００ｒｐｍで２０分間遠心分離をし、0.45μｍミリポアフィルターで濾過を行った。この上澄み液をプロテインＡセファロースカラムに１.００ml／min .の流速で通した。結合した融合タンパク質をｐＨ３.５、０.１Ｍクエン酸で溶出し、すぐにｐＨ９.０、１.０Ｍトリスで中和した。融合タンパク質をＰＢＳに対して透析を行い、セルチコア濃縮機(Certicor concentrator)(Amicon)を用いて濃縮を行った。ＣＤ６−ＲｇのＡＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞への結合およびＡＬＣＡＭ−ＲｇのＣＤ６発現ＣＯＳ細胞への結合．ＣＯＳ細胞は、ＤＥＡＥ−デキストラン法により、親ベクターＣＤＭ８、またはＣＤ６或いはＡＬＣＡＭをコードするｃＤＮＡクローンにより形質移入された（Aruffo et al，Proc．Natl．Acad．Sci.，US A 84:8573(1987)）。形質移入して３日後、細胞をＰＢＳ／０.５ｍＭＥＤＴＡにより脱離を行い、ＰＢＳで洗浄し、およびｍＡｂまたは融合タンパク質を次の濃度で含むＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０.１％ＮａＮ₃（ＰＢＡ）中に再懸濁した：Ｊ４ −８１（ａＡＬＣＡＭ）腹水の１：２００希釈、Ｇ３−６（ａＣＤ６）５μg ／ｍｌ、ＣＤ６−Ｒｇ５０μg ／ｍｌ、およびＡＬＣＡＭ−Ｒｇ２５μg ／ｍｌ。氷上で３０分おいた後、細胞をＰＢＡで２回洗浄し、ヤギ抗−マウスまたはヒトＩｇＧ−ＦＩＴＣのいずれかを含有するＰＢＡ中に氷上で３０分間再懸濁を行った。細胞を二回ＰＢＡで洗浄し、ＰＢＳで一回洗浄を行い、ＰＢＳ／１％ホルムアルデヒド中に固定化し、かつフローサイトメトリーで分析を行った。結果：形質移入ＣＯＳ細胞上のＣＤ６はＴＥ細胞接着を促進する．胸腺細胞−ＴＥ細胞接着におけるＣＤ６の役割を直接調査するために、ＣＤ６を発現する安定なＣＯＳ細胞形質移入体を作成した。ＣＤ６発現ＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ＣＤ６）はＴＥ細胞接着を支持したが、一方、親ベクターのみにより形質移入されたＣＯＳ細胞（ＣＯＳ−ｎｅｏ）は支持しなかった（図２５）。ＴＥ細胞のＣＯＳ−ＣＤ６細胞への接着は、ＣＯＳ−ＣＤ６細胞を抗−ＣＤ６ｍＡｂＴ１２により前処理するか、またはＴＥ細胞をＪ４−８１ｍＡｂにより前処理することにより阻害され（図２５ｂ）、これはＣＤ６仲介によるＴＥ細胞への接着がｍＡｂＪ４−８１により認識される分子に関連していることを示している。ｍＡｂＪ４−８１により認識される抗原のクローニングおよびキャラクタリゼーション（活性化白血球−細胞接着分子（ＡＬＣＡＭ））．Ｊ４−８１アフィニティーカラムを使用してＨＢＬ−１００、ＣＤ６リガンドを高レベルで発現するガン腫細胞系（Wee et al，Cell，Immunol．158:353(1994)）およびＪ４−８１により認識される抗原（Patel et al，J．Exp．Med．(1994)）からタンパク質を精製した。未処理タンパク質および内部ペプチドフラグメントから得られるアミノ酸配列は、ニワトリ神経接着分子ＢＥＮ／ＳＣ−１／ＤＭ−ＧＲＡＳＰ(Puo rquie et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA B9:5261（1992）；Tanaka et al，N euron 7:535(1991)，Burns et al，Neuron 7:209 81991),これらはまた活性化ニワトリ白血球により発現されると報告されている（Corbel et al，Cell Immunol ．141:99(1992)）と実質的に相同性であることが見いだされた。ニワトリＢＥＮに相当するＤＮＡフラグメントはＰＣＲにより得られ、ＰＨＡ活性化ヒトＴ細胞ｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングするために使用した。完全コード領域を含まない単一クローンが単離された。このクローンの５’領域から誘導された２００ｂｐＰＣＲフラグメントを、ＨＬ６０ｃＤＮＡライブラリーから完全コード配列を含む−1.9 ｋｂｃＤＮＡクローンを単離するために使用した（ヌクレオチド配列はGenBank に寄託された；受け入れ番号＃Ｌ38608）。２種類のｃＤＮＡクローンは、重複領域の３つのヌクレオチド位置において多形性を示し、そのうちの二つはタンパク質レベルの相違を生じる（位置８３６におけるＨＬ６０からＴ細胞クローンへのＧからＡの変化はＮ２３１のＳによる置換を生じる；位置９６５におけるＨＬ６０からＴ細胞クローンへのＣからＴの変化はＮ２７４のＴによる置換を生じる）。ニワトリＢＥＮのヒト相同性予期アミノ酸配列（ＡＬＣＡＭ）、Ｉ型膜タンパク質は、２７アミノ酸（ａａ）Ｎ−末端疎水性シグナルペプチド、続いて５００ａａ細胞外ドメイン、２４ａａ疎水性膜貫通ドメインおよび３２ａａ細胞質ドメインからなる（図２９参照）。ＡＬＣＡＭのグリコシル化は、〜６５ｋＤａの予期分子量と免疫沈降により観察される分子量１００−１０５ｋＤａとの間の相違の大部分の原因であると考えられる(Patel et al，J．Exp．Med．(1994)); Pesando et al，J．Immunol，137:689(1986))。ＡＬＣＡＭとデータベース内の他のアミノ酸配列の比較は、ニューロリン（Lawssing et al，Differentiation 56:21(1994)）、金魚の視覚系の神経軸策に発現されるタンパク質（３８％同一性／５５％類似性）、ＲＡＧＥ(Neeper et al，J．Biol．Chem．267:14998(1992 ))、進行性グリケーション終末産物のレセプター（２８／４３％）およびＭＵＣ 18(Lehmann et al，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 86:9891(1989))、その発現が転移性メラノーマ細胞に関連する細胞表面タンパク質（２３／４９％）に相同性であることを示した（図２６Ａ）。ＡＬＣＡＭは活性化白血球により発現される．ノザンブロット分析により、分裂促進因子により発現された〜5.2 ｋｂｍＲＮＡとハイブリダイズしたＡＬＣＡＭｃＤＮＡプローブは、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）および多数のＴ細胞、Ｂ細胞、単球および癌誘導細胞系を活性化した；活性化された単球は、〜１０および８.５ｋｂの二種類の付加的マイナー種を示した（図２６Ｂ）。ＡＬＣＡＭｍＲＮＡは未活性化ＰＢＭＣ内では検出されなかった。活性化Ｔ細胞中のＡＬＣＡＭ転写物の存在がＪ４−８１およびＣＤ６−Ｒｇ結合タンパク質の発現に相当するかどうかを調査するために、ＰＢＭＣをＰＨＡにより活性化し、バルク培養の一部をフローサイトメトリーで１０日間試験した。Ｔ細胞上のＪ４−８１およびＣＤ６結合タンパク質の発現は活性化２日後に観察され、３日めに最大となり、活性化８日後に検出不可能レベルにまで低下した（図２６Ｃ）。Ｊ４−８１およびＣＤ６−Ｒｇ活性化Ｔ細胞への結合は、同じ動態学を示し、これらの２分子が同じ分子ターゲットを認識することを示している。ヒトＡＬＣＡＭ遺伝子の染色体バンド３ｑ１３.１〜ｑ１３.２への割り当て．ＡＬＣＡＭｃＤＮＡクローンをプローブとして使用した蛍光切片上ハイブリダイゼーション実験は、ヒト染色体３の基部ロングアーム上の単一部位へ遺伝子を局在化させた。分析された２５の分裂中期のスプレッドのうち、２０がこの部位における双方の染色分体上に特異的な蛍光シグナルを示し、および１３および２０が両方の染色体３ホモローグ上にシグナルを有した。染色体は、細胞培養を同調した後、ＢｒｄＵの挿入により産生されるＲ−バンド形成パターンにより同定された。ＡＬＣＡＭシグナルは、バンド３ｑ１３.１−ｑ１３.２に割り当てられた（図２７）。ＡＬＣＡＭはＣＤ６リガンドである．ＨＬ６０細胞から単離されたＡＬＣＡＭｃＤＮＡクローンがＪ４−８１およびＣＤ６−Ｒｇに結合するタンパク質の発現を支配するものであるかどうか直接調査するために、ｃＤＮＡをＣＯＳ細胞内に形質移入した。形質移入３日後、ＣＯＳ細胞のＪ４−８１（ａＡＬＣＡＭ）またはＣＤ６−Ｒｇに結合する能力をフローサイトメトリー法で試験を行った。図２８Ａに示されるように、ＡＬＣＡＭ発現ＣＯＳ細胞はＪ４−８１およびＣＤ６ −Ｒｇ両方に結合可能であった。ＡＬＣＡＭはＣＤ６リガンドであるということをさらに確認するために、ＡＬＣＡＭ−Ｒｇをコードするキメラ遺伝子を構築した。この部分を共有結合性ホモダイマーとして、〜２００ｋＤａの分子集団として発現し、ｍＡｂＪ４−８１により認識した。ＡＬＣＡＭ−ＲｇのＣＤ６への結合を示すために、ＣＯＳ細胞をＣＤ６をコードするｃＤＮＡクローンにより形質移入し(Aruffo et al，J．Exp．Med．174:949(1991))、フローサイトメトリーにより３日後に試験した。ＣＤ６により形質移入されたＣＯＳ細胞は、Ｇ３−６（ａＣＤ６）およびＡＬＣＡＭ−Ｒｇ（図２８Ｂ）両方に結合した。これらの結果は、ＣＤ６およびＡＬＣＡＭがレセプター／リガンド対であることを示している。ニワトリＢＥＮは同型接着を仲介することが報告されている（Pourquie et al ,Proc．Natl，Acad，Sci，USA 89:5261(1992)); Tanaka et al，Neuron 7:535(1 991)); Burns et al，Neuron 7:209(1991))。ＡＬＣＡＭ−Ｒｇは、ＡＬＣＡＭを発現するＣＯＳ細胞に結合することができ、これはＡＬＣＡＭが同種親和性および異種親和性接着双方を仲介することを示している。実施例V 抗ヒトＡＬＣＡＭモノクローナル抗体の製造．生後６〜８週の雌ＢＡＬＢ／ｃマウス(Taconic，Germantown，NY)を、ヒトＡＬＣＡＭの細胞外ドメインがマウスＩｇＧ２ａのヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインに融合したものからなる精製した組換え融合タンパク質を用いて免疫した。初回免疫は腹腔内に、５０μg のタンパク質のＲｉｂｉ補助剤(R-730，Ribi ImmunoChem Research，Inc.，Hami lton，MT)中エマルジョン１００μｌを投与した。２つの同一の免疫化を１９日目と２９日目に行った。６３日目に、１００μlのPBS 中の５０μg のタンパク質を血管内に投与した。三日後、細胞を脾臓及び全ての同定可能なリンパ節から採取し、３：１に比の白血球：ミエローマ細胞をＸ６３−Ａｇ８．６５３ミエローマ細胞と（Kearney et al，J．Immunol．123:1548(1979)）、レーンらの方法( J．Immunol．81:223(1985))に従い融合した。細胞懸濁液を１５の９６ウェルカルチャープレートに、１．４４ｘ１０⁵細胞／ウェルの密度で、ハイブリドーマ生育培地存在下に播種した。上記ハイブリドーマ生育培地は、１０％ウシ胎児血清、２ｍＭＬ−グルタミン、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシン、１０％クローニングファクター(ＢＭ−CondimedＨ１；Boerhin ger Mannheim，Indianapolis，IN)及びＨＡＴ（１００μＭヒポキサンチン；０．４μＭアミノプロテイン；１６μＭチミジン）が補充されたイソコフダルベコ変性培地(Isocove's Modified Dulbecco's Medium)(IMDM)である。ハイブリドーマ上澄み液のスクリーニング．１０日後にハイブリドーマ上澄み液について、セイヨウワサビ過酸化酵素（ＨＲＰ）複合化ヤギ抗マウスＩｇＧ第二次試薬(Zymed Laboratories，South San Francisco，CA)を使用する、抗原捕捉ベースＥＬＩＳＡを使用してスクリーニングを行い、結合ｍＡｂの検出を行った。簡単に述べると、ｐＨ９．６の５０ｍＭの炭酸水素ナトリウムで希釈した５０ｎｇの融合タンパク質を室温で一晩、９６ウェルイムロンＩＩマイクロタイタープレート(Dynatech Laboratories，Chantilly，VA)のウェルに吸収させた。ウェルを３回、ＰＢＳ／０．５％Ｔｗｅｅｎ−２０を用いて洗浄し、未反応サイトを検体希釈液(Genetic Systems，Seatle，WA)を使用して１時間ブロックを行った（以下も含めてのインキュベーションは室温で行った）。プレートを３回洗浄し、ハイブリドーマの上澄み液を１時間かけて添加し、３回洗浄した。ＨＲＰ複合化第二試薬（検体希釈液に１：１０００の割合で希釈した）をウェルに１時間かけて添加し、３回洗浄した。ＥＩＡ基質バッファーで１：１００に希釈されたＥＩＡクロマゲン（chromagen）（Genetic Systems，Seattle，WA）を添加し、約１５分展開させ、１ＮＨ₂ＳＯ₄で停止した。プレートをバイオテック（BioT ek）マイクロタイタープレートリーダー上でＯＤ４５０／６３０で読みとった（ Biotek Instruments，Winooski，NH）。ＡＬＣＡＭＲｇと反応するが、同様に構築された不適切なＲｇ融合タンパク質に反応しない上澄み液をさらにＡＬＣＡＭを発現するＴ細胞リンパ細胞系（ＨＰＢ−ＡＬＬ）への結合について評価した。約５×１０⁵細胞を１００μｌの上澄み液で１時間氷上で処理を行い、ＰＢＡ（ＰＢＳ／１％ＢＳＡ／０．１％アジ化ナトリウム）で３回洗浄を行い、次に、ヤギ抗マウスＩｇＧ−ＦＩＴＣ(BioSour ce International，Camarillo，Clif.)のＰＢＡ希釈液（１：５０）により３０分間氷上で処理を行った。細胞をＰＢＡ×２、ＰＢＳ×１で洗浄し、ＰＢＳ／２％ホルムアルデヒドで固定し、ＦＡＣＳｃａｎ(Becton Dickinson，Mountain Vi ew，CA)を備えたフローサイトメトリーで分析を行った。ＨＰＢ−ＡＬＬ細胞を認識するｍＡＢを生産するハイブリドーマを、ＨＡＴが欠如するハイブリドーマ生育培地中の９６ウェルマイクロタイタープレート中で限界希釈することによりクローン化した。上澄み液を同様にＥＬＩＳＡ及びＦＡＣＳ分析を用いて上述したように評価した。抗ＡＬＣＡＭのキャラクタリゼーションハイブリドーマ／モノクローナル抗体．ハイブリドーマクローンを増大させ、上澄み液をプロテインＧセファロースアフィニティークロマトグラフィーに積載し、精製した抗体を得た。抗体を０．１ｍクエン酸ナトリウム（ｐＨ３．０）により希釈し、１／１０体積の１Ｍトリス（ｐＨ９．０）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。抗体をセントリコン30（Centricon 30）濃縮機（Amicon，Beverly，M A）で濃縮し、ＯＤ２８０吸収により定量化し、抗体濃度を測定した。実施例VI 抗体ドメイン特異性の測定ＡＬＣＡＭは５つの細胞外Ｉｇ様ドメイン：３つのＣ２セットドメインが続く２つのアミノ末端Ｖセットドメインによりコードされている。モノクローナル抗体のドメイン特異性を測定するために、切り取った、カルボキシ末端ドメインから始まる一連のＡＬＣＡＭＲｇ融合タンパク質を構築した（以下に述べる）。融合タンパク質をＣＯＳ細胞中に発現させ、プロテインＡセファロースアフィニティークロマトグラフィーにより精製した。ＡＬＣＡＭ融合タンパク質（ＡＬＣＡＭ−、ＡＬＣＶＶＣＣ−、ＡＬＣＶＶＣ−、ＡＬＣＶＶ−、ＡＬＣＶ−）及び無関連の融合タンパク質ＣＤ６Ｒｇを、上記に述べたように、イムロンＩ（Dynatech Laboratories，Chantilly，VA）９６ウェルマイクロタイタープレート内に６０ｎｇ／ウェルの濃度で吸収させた。ＥＬＩＳＡスクリーニングを行うためにプレートを上記と同様に処理した。ただし、検体希釈液中に希釈した精製抗体を５０ｎｇ／ウェルで加えた。吸着したヒトＩｇＧ、１：２０００の比率で検体希釈液に希釈したＨＲＰ接合ロバ抗マウスＩｇＧ(Jackson Imm unoresearch，Malvern，PA)を融合タンパク質に結合する抗体の検出に使用した。この実験の結果を表６に要約した。また、上記に述べた抗−ＡＬＣＡＭｍＡＢ、Ｊ４−８１を本アッセイに加えた。この種類の分析から、モノクローナル抗体のドメイン特異性に関する予想を行うことが可能である。ＨＡＬ１５１はＶ１を認識したが、一方Ｊ４−８１は、ＨＡＬ３１．１、３３．１、６２．１、８１及び１４３と同様にＡＬＣＡＭのＶ２を認識するようである。ＨＡＬ１９２はＣ１を認識し、ＨＡＬ２０．１、４７．１及び１４５はＣ２を認識し、及びＨＡＬ８．２はＣ３を認識する。 ^* 予測ドメイン特異性は、固定化ＡＬＣＡＭ融合タンパク質に対する抗−ＡＬＣＡＭの結合を測定するＥＬＩＳＡにより測定した。モノクローナル抗体を上記に述べた方法と同様のアッセイにより、アイソタイプ化した。ＡＬＣＡＭＲｇをイムロンＩプレートに吸着させ、上記モノクローナル抗体で処理を行った。結合した抗体を、以下の希釈を行ったｍＩｇＧアイソタイプ特異的ＨＲＰ複合第二試薬(Pharmingen，SanDiego，CA)を用いて評価した：ＩｇＧ１１：１５０００、ＩｇＧ２ａ１：１００、ＩｇＧ２ｂ１：２０００、及びＩｇＧ３１：２５０。基質をＨ₂ＳＯ₄で停止する前に４５分間展開させた。ＯＤ４５０／６３０における読み取りを行った。ＨＡＬ８．２、３１．１、３３．３、６２．１、８１、１１４．３、１４５及びＪ４−８１はＩｇＧ１であり、ＨＡＬ２０．１及び１５１はＩｇＧ２ａであり、かつＨＡＬ４７．１及び１４３はＩｇＧ２ｂである。以下のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマをアメリカンタイプカルチャーコレクション、ロックビル、ＭＤに１９９６年６月１８日に寄託し、以下に示す受託番号が付けられた。抗体受託番号ＨＡＬ８．２ＨＢ１２１３９ＨＡＬ４７．１ＨＢ１２１３７ＨＡＬ６２．１ＨＢ１２１３８ＨＡＬ１４３ＨＢ１２１４１ＨＡＬ１１４．３ＨＢ１２１３６ＨＡＬ１５１．２．１ＨＢ１２１４０実施例VII ＡＬＣＡＭドメイン切断融合タンパク質の構築．ＡＬＣＡＭＲｇ融合タンパク質の構築は上記に述べた通りである。ＡＬＣＡＭの単一又は複数ドメインをコードする相補ＤＮＡフラグメント（図３０）はＰＣＲ法（ポリメラーゼ鎖反応）により得られた。個々のフラグメントに使用したプライマーのセットは以下の通りである：(1)ＦＰ３／ＶＶＣＣ−Ｒ、(2)ＦＰ３／ＶＶＣ−Ｒ、(3)ＦＰ３／ＶＶ −Ｒ、(4)ＦＰ３／Ｖ−Ｒ。プライマーの配列は：ＦＰ３ｇｔａｃｇｇｇｃｃａｇａｔａｔａｃｇｃｇｔｔｇａｃａｔｔｇａｔｔａ、ＶＶＣＣ−Ｒａｇｔｇｔｃｔａｔａｇｇａｔｃｃｔｔｇｃｃｔｔｃｔａｃａａｔｇａｇａｇｔ、ＶＶＣ−Ｒａｇｔｇｔｃｔａｔａｇｇａｔｃｃａａａｔｃｃａａａｔａｇｔｇａａｃｔｇｔ、ＶＶ−Ｒａｇｔｇｔｃｔａｔａｇｇａｔｃｃｔｃｔｇｔａｇｇａｔａｇｔａａａｔａｔｃ、Ｖ−Ｒａｇｔｇｔｃｔａｔａｇｇａｔｃｃａｇｔｇｃｔｔｔｇｃｔｔａｃａａｔｔｔｃａｇｇ。合成に使用されたテンプレートはｐＣＤＭ８中のＡＬＣＡＭｃＤＮＡである。反応は、Ｔａｇポリメラーゼ(Boerhinger Mannheim，Indianapolis，IN)を製造者の指示に従って使用して標準ＰＣＲプロトコールにより行った。サイクルは以下のようであった。１×９４℃／３分、５５℃／２分、７２℃／３分；３０×９４℃／１．５分、５５℃／２分、７２℃／２．５分及び１×７２℃／３分。ＰＣＲ生成物はＭＬＵ１及びＢＡＭＨ１制限酵素により消化し、同じ酵素により同様に消化したヒトＩｇＧ１のヒンジ、ＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むベクター中にクローン化した。ＣＯＳ細胞中に該ベクターを形質移入し、融合タンパク質を上記抗体精製において述べたようにプロテインＡセファロースに対する吸着及び溶出により精製した。＊＊＊上記で言及した文献は全て参考として本明細書に引用する。本発明の開示を読み取ることから、当業者は方式及び詳細の種々の変更を本発明の真の範囲から逸脱することなく行うことができることを理解するであろう。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/08 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＶＧ０１Ｎ 33/53 33/566 33/566 33/577 Ｂ 33/577 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:91） (72)発明者ヘインズバートンエフアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27707 ダーラムウェントワースドライヴ 4923 (72)発明者アルフォアレヤンドロアメリカ合衆国ワシントン州 98020 エドモンズスプルースストリート 1012 (72)発明者パテルダヴァルクマーアメリカ合衆国ノースカロライナ州 27712 ダーラムディアチェイスウィンド 3012 (72)発明者ボーウェンマイケルエイアメリカ合衆国ワシントン州 98040− 4408 シアトルロイストリート 200 −＃540 (72)発明者マーカードハンスアメリカ合衆国ワシントン州 98040− 4408 マーサーアイランドサウスイーストフォーティシックススストリート 9222 (72)発明者シアダクアントニーダブリューアメリカ合衆国ワシントン州 98107 シアトルノースウェストファーストアベニュー 6210

Claims

【特許請求の範囲】１．第一細胞表面上に存在するＣＤ６の第二細胞表面上に存在するＣＤ６リガンドへの結合を阻害する方法であって、該ＣＤ６リガンドと抗−ＣＤ６リガンド抗体又はその結合フラグメントとを、該抗体又はその結合フラグメントが該第二細胞表面上のＣＤ６リガンドへ結合し、それにより第一細胞表面上に存在するＣＤ６の第二細胞表面上に存在するＣＤ６リガンドへの結合を阻害するような条件下に接触させることを特徴とする上記方法。２．化合物の、ＣＤ６のＣＤ６リガンドへの結合阻害能をスクリーニングする方法であって、 i)試験化合物と、ＣＤ６リガンド若しくはその結合部位又は抗−ＣＤ６リガンド抗体若しくはその結合フラグメントのいずれか一つとを、該試験化合物と該ＣＤ６リガンド若しくはその結合部位、又は該抗−ＣＤ６リガンド抗体若しくはその結合フラグメントが複合体を生成するような条件下に接触させること； ii)他のＣＤ６リガンド若しくはその結合部位又は抗−ＣＤ６リガンド抗体若しくはその結合フラグメントと、工程(i)において得られる複合体とを、該ＣＤ６リガンド若しくはその結合部位又は該抗−ＣＤ６リガンド抗体若しくはその結合フラグメントの結合が生じるような条件下に接触させること、及び iii)該ＣＤ６リガンド若しくはその結合部位又は該抗−ＣＤ６リガンド抗体若しくはその結合フラグメントの結合程度を測定し、それにより該試験化合物の、該ＣＤ６リガンドの該抗−ＣＤ６リガンド抗体への結合阻害能を測定すること、を含む上記方法。３．図２９に示されるＣＤ６リガンドのＶ１、Ｃ１、Ｃ２又はＣ３ドメインに特異的なモノクローナル抗体。４．ＨＡＬ８．２、４７．１、６２．１、１１４．３、１４３若しくは１５１又はその抗原結合フラグメントの結合特性を有するモノクローナル抗体。５．図２９に示されるアミノ酸配列を有する分子の細胞外ドメインのＩｇ−様ドメイン。６．該Ｉｇ−様ドメインがＶ−様ドメインである、請求項５に記載のＩｇ−様ドメイン。７．該Ｉｇ−様ドメインがＣ２−様ドメインである、請求項５に記載のＩｇ−様ドメイン。８．請求項３に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。９．請求項４に記載のモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマ。 10．ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ１２１３６、ＨＢ１２１３７、ＨＢ１２１３８、ＨＢ１２１３９、ＨＢ１２１４０、又はＨＢ１２１４１である、ハイブリドーマ。 11．請求項３に記載の該モノクローナル抗体の抗原結合部位を有する組換え結合タンパク。