JP2000500746A

JP2000500746A - 治療剤としての、または診断におけるｒａｃ−プロテインキナーゼ

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Publication number: JP2000500746A
Application number: JP9518546A
Authority: JP
Inventors: ヘミングズ，ブライアン・アーサー
Original assignee: ノバルティスアクチエンゲゼルシャフト
Priority date: 1995-11-16
Filing date: 1996-11-05
Publication date: 2000-01-25
Anticipated expiration: 2016-11-05
Also published as: JP4173544B2; DE69633186T2; ES2227614T3; AU7564396A; DE69633186D1; DK0862622T3; PT862622E; EP0862622A1; EP0862622B1; WO1997018303A1; ATE274053T1

Abstract

(57)【要約】本発明は、特にインシュリンによって変調されるプロセスの異常、例えば細胞増殖、インシュリン欠乏および／または過剰血糖レベルに関する疾患の処置における薬物として使用するため、ＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼおよびそのフラグメント、並びにＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼのアクチベーターおよびインヒビターに関する。更に、本発明は、ＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼの潜在的模擬体またはモデュレーターをスクリーニングするのに使用するためのＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼを提供する。本発明は更に、活性成分としてＲＡＣ−ＰＫを含むスクリーニングキット、および候補化合物とＲＡＣ−ＰＫとの特異的相互作用を検出することからなる、ＲＡＣ−ＰＫ活性の模擬体候補またはモデュレーター候補である化合物をスクリーニングする方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】治療剤としての、または診断におけるＲＡＣ−プロテインキナーゼ本発明は、ＲＡＣプロティンキナーゼ（ＲＡＣ−ＰＫ）を治療剤として、ＲＡＣ−ＰＫと相互作用できる分子をスクリーニングするためのリガンドとして使用すること、およびシグナル伝達に関わる分子を同定する方法に関する。タンパク質リン酸化および脱リン酸化は、細胞機能調節の基本的プロセスである。タンパク質リン酸化は、タンパク質リン酸化および脱リン酸化のカスケードにより細胞外シグナルを伝搬し増幅するシグナル伝達に大きく関わる。最も詳しく解析されている２つのシグナル伝達経路は、ｃ−ＡＭＰ−依存性プロテインキナーゼ（ＰＫＡ）およびプロテインキナーゼＣ（ＰＫＣ）を伴う。各経路は、異なる第２のメッセンジャー分子を使用してプロテインキナーゼを活性化し、次に特定の標的分子をリン酸化する。セリン／トレオニンキナーゼの新規サブファミリーが最近同定され、クローニングされており、ここではＲＡＣキナーゼと呼ぶ(RAC-PK;Jones,et al.(1991)Pr oc,Natl,Acad.Sci.USA 88,4171-4175;Jones,et al.(1991)Cell Regulation 2,10 01-1009)が、ＰＫＢまたはＡktとしても知られている。ＲＡＣキナーゼは、２種の近縁のアイソフォーム、ＲＡＣαとＲＡＣβで同定されており、これらは、遺伝子配列にして９０％の相同性を共有している。マウスＲＡＣα（c−akt）は、ＡＫＴ８レトロウイルス由来のＧagタンパク質をネズミc−aktのＮ−末端に融合させることにより作製された、ウイルス癌遺伝子v−aktの細胞性相同物である。ヒトＲＡＣβは、卵巣癌のおよそ１０％に含まれることが分かっており、これは細胞増殖調節におけるＲＡＣキナーゼの関わりを示唆するものである。ＲＡＣキナーゼは、アミノ末端プレクストリン相同（ＰＨ）ドメインを含有する[Haslam,et al.(1993)Nature 363,309-310]。ＰＨドメインは、元々、活性化された血小板中の主要ＰＫＣ基質である４７kＤaのタンパク質、プレクストリンのアミノおよびカルボキシ末端に存在する内部反復配列として同定された［Tyer s，et al.(1988)Nature 333,470-473］。ＰＨドメイン含有分子のスーパーファミリーは、９０以上のメンバーからなり、セリン／トレオニンプロテインキナーゼ(ＲＡＣ、Ｎrk、βＡＲＫ、ＰＫＣμ)、チロシンプロテインキナーゼ(Ｂtk、Ｔec、Ｉtk)、ＧＴＰアーゼレギュレーター(ras−ＧＡＰ、ras−ＧＲＦ、Ｖav、ＳＯＳ、ＢＣＲ)、既知の哺乳動物ホスホリパーゼＣ全て、細胞骨格タンパク質( β−スペクトリン、ＡＦＡＰ−１１０、シントロフィン)、“アダプター”タンパク質（ＧＲＢ−７、３ＢＰ２）およびキナーゼ基質（プレクストリン、ＩＲＳ −１）を含む。 β−スペクトリン、ダイナミンおよびプレクストリンのアミノ末端ドメインについてＰＨドメイン構造が解明されたにもかかわらず、その正確な機能は依然不明である。多くのシグナル形成タンパク質および細胞骨格タンパク質中のＰＨドメインの存在は、タンパク質−タンパク質および膜相互作用を媒介することに関係している。実際に、β−アドレナリン受容体キナーゼ（βＡＲＫ）のＰＨドメインは、β−アドレナリン受容体と結合したヘテロ三量体Ｇ−タンパク質のβγ サブユニットとの結合を部分的に担うようであるが、一方で、バートンチロシンキナーゼ（Ｂtk）のＰＨドメインは、ＰＫＣとの相互作用を媒介するようである。幾つかのＰＨドメインは、弱くではあるが、インビトロでホスファチジル−イノシトール−４−５−ビホスフェートと結合できることが示されている。ＩＭＰＤＨは、グアニン生合成の律速段階に関わる高度保存酵素（細菌と哺乳動物の配列間で４１％のアミノ酸が同一）である。哺乳動物には、区別して発現されるＩ型およびII型と呼ばれる８４％同一の２つのアイソフォームがある[Nat sumeda，et al.(1990)J.Biol.CHem.265,5292-5295]。Ｉ型は低レベルで構成的発現するのに対し、II型のｍＲＮＡおよびタンパク質レベルは細胞増殖中に増大する。ＩＭＰＤＨ活性レベルもまた、多くの細胞において迅速な増殖中に上昇する [Collart,F.R.,and Huberman,E.(1988)J.Biol.Chem.263,15769-15772]。代謝流動を測定することにより、無傷癌細胞の増殖指標は、ＩＭＰのグアニレート生合成への優先チャネリングと連携していることが示されている。細胞ＩＭＰＤＨ活性の阻害は、Ｇ₁−Ｓ中間でのＤＮＡ合成の急な停止と細胞循環遮断をもたらす。チアゾフリンによるＩＭＰＤＨの特異的阻害と続くＧＴＰプールの低下は、Ｇ−タンパク質rasのダウンレギュレーションをもたらし、これは細胞増殖を導く多くのシグナル伝達経路に関わる（概説についてはAvruch,et al.(1994 )Trends Biochem.Sci.19,279-283参照)。興味深いことに、ｐ５３はＩＭＰＤＨ活性レベルを調節するのに関係している [Sherley,J.L.(1991)J.Biol.Chem.266,24815-24828]。ここで、ｐ５３の中度過剰発現（３〜６倍）は、深刻な増殖停止状態を誘導し、その停止状態はプリンヌクレオチド前駆体により解放される。実際に、ｐ５３過剰発現は、ＩＭＰからＸＭＰへの変換における特異的遮断およびＩＭＰＤＨ活性レベルの低下を誘導する。ｐ５３遮断は、ＲＮＡ合成速度に影響せず、またデオキシヌクレオチドにより解放される表現型でもないのでＤＮＡ合成のための前駆体の欠乏が遮断の原因でもないことを示している。この作用は、おそらく、rasなどのＧタンパク質に必要とされるＧＴＰプールのダウンレギュレーションにより媒介されるようである。上記観測は、II型ＩＭＰＤＨが主に、rasなどのシグナル伝達にかかわるＧタンパク質の調節に非常に重要なＧＴＰプールにチャネルされるＸＭＰの生産に関与していることを示す。Ｉ型酵素は、ＲＮＡおよびＤＮＡ合成に必要とされるＧＴＰ／ｄＧＴＰプールにチャネルされるＸＭＰの基礎レベルを提供するのかもしれない。II型ＩＭＰＤＨ活性が変化すると、ＧＴＰ成分が特異的に変わるのでＧＴＰ／ＧＤＰ比率が変わり、このことはrasがＧＴＰ／ＧＤＰ比率の僅かな変化に感受性であるので、rasシグナル形成経路に大きく影響し得る。グリコーゲンシンターゼキナーゼ−３（ＧＳＫ３）は、グリコーゲン代謝を含む哺乳動物細胞生理機能にとって重要な幾つかのプロセスの制御およびインシュリンによるタンパク質合成の制御、並びにＡＰ−１およびＣＲＥＢなどの幾つかの転写因子の活性の変調に関与する。ＧＳＫ３は、ＭＡＰキナーゼおよび別個のインシュリン刺激シグナル形成経路に存在するキナーゼであるｐ７０^S6Kにより引き起こされるセリンリン酸化によりインビトロで阻害される。ＧＳＫ３は、グリコーゲンシンターゼにおけるセリンリン酸化を担い、その脱リン酸化は、筋肉によるグリコーゲン合成の刺激の基礎となる。従って、ＧＳＫ３はグリコーゲンシンターゼを不活性化し、血中糖レベルの増大をもたらす。インシュリンは、ＧＳＫ３の作用を阻害し、グリコーゲンシンターゼを脱リン酸化するホスファターゼの同時活性化と併せて、グリコーゲンシンターゼの活性化および血中糖レベルの低下を導く。ここで、我々は、ＲＡＣ−ＰＫがＧＳＫ３の不活性化とＩＭＰＤＨの活性化に直接関与することを測定した。酵母ツーハイブリッドシステム［Fields,S．and Song,O-K.(1989)Nature 340, 245-246;Chien,et al.（1991）Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.88,9578-9582］を用いて、ＲＡＣ−ＰＫが他のタンパク質と特異的相互作用を形成することによって機能し得るかどうかを測定した。我々はＲＡＣ−ＰＫを、ヒトII型イノシン−５ 'モノホスフェートデヒドロゲナーゼ（ＩＭＰＤＨ）およびＲＡＣ−ＰＫカルボキシ末端結合タンパク質（ＣＴＢＰ）と命名した新規タンパク質と相互作用すると同定した。ＲＡＣ−ＰＫはII型ＩＭＰＤＨ活性を刺激する。我々の発見は、ＧＴＰ生合成におけるＩＭＰＤＨの既知の役割と共に、細胞増殖の調節におけるＲＡＣ−ＰＫの役割を示すものである。更に、ＧＳＫ３由来のペプチドおよびＧＳＫ３自身を用いて、ＲＡＣ−ＰＫがＧＳＫ３と相互作用し、リン酸化し、更に不活性化することを示すことができた。このことは、ＲＡＣ−ＰＫと、細胞増殖を制御するインシュリン依存性シグナル形成経路の調節とを関連付けるものである。これらの結果をまとめ合わせると、ＲＡＣ−ＰＫがインシュリン作用の制御に主要な関わりを持つことが示される。発明の概要本発明により、ＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼおよびそのフラグメント、並びに、特にインシュリンにより変調されるプロセスの異常、例えば、細胞増殖、インシュリン欠乏症および／または過剰血中糖レベルに関連する疾患の処置における薬物として使用するＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼのアクチベーターおよびインヒビターを提供する。また、本発明は、潜在的模擬体またはそのモデュレーターをスクリーニングするのに使用するＲＡＣ−ＰＫプロテインキナーゼを提供する。本発明は更に、ＲＡＣ−ＰＫを活性成分として含むスクリーニングキット、および候補化合物とＲＡＣ−ＰＫとの特異的相互作用を検出することからなる、ＲＡＣ−ＰＫ活性の模擬体またはモデュレーター候補である化合物のスクリーニング法を提供する。発明の詳細な説明第１の態様では、本発明は、薬物として使用するためのＲＡＣプロテインキナーゼまたはそのフラグメント、またはバナジウム酸塩およびウォルトマンニンを除くそのモデュレーターを提供する。バナジウム酸塩は、本明細書で使用する場合、オルソおよびメタバナジウム酸塩、ペルバナジウム酸塩およびその他の関連バナジウムイオンなどの様々な形態を含み、糖尿病の処置における治療剤として知られているものである。例えば、米国特許第5,421,125号、ヨーロッパ特許出願第0 521 787号、ヨーロッパ特許出願第0 264 278号およびヨーロッパ特許出願第0 245 979号参照。１９９５年１２月１５日に出願した英国特許出願第9525702.8号（Ciba-Geigy AG）には、バナジウム酸塩がインシュリン刺激シグナル形成経路のキナーゼおよび特にＲＡＣ−ＰＫの強力なアクチベーターであることが開示されている。従って、バナジウム酸塩は、ＧＳＫ３をリン酸化して、それを不活性化するＲＡＣを刺激し、血中糖レベルの低下を導くことにより、その治療効果を糖尿病にて発揮する。そのため、ＲＡＣ−ＰＫおよびそのアクチベーターは、糖尿病や血中糖レベルが過剰なその他の疾患の処置に有用である。逆に、ウォルトマンニンやオカダ酸などのＲＡＣ−ＰＫのインヒビターは、血中糖レベル不全に関連する疾患の処置に有用である。本発明では、ＲＡＣプロテインキナーゼは、文献に記載のようにどの種類のどのアイソフォームのＲＡＣキナーゼであってもよい。ヒトＲＡＣ−ＰＫが好ましい。ヒトＲＡＣ−ＰＫαは、配列番号３に表す。ＲＡＣキナーゼのドメインは、ＰＨドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端ドメインなどのその個々の機能的部分である。ＲＡＣのドメインを含むＲＡＣのフラグメントは、本発明においてＲＡＣの代わりに使用できるＲＡＣキナーゼタンパク質の機能的に活性な部分である。ＲＡＣ−ＰＫのフラグメントは、好ましくはそのドメイン、有利にはＰＨドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端ドメインである。それぞれの場合で、使用した用語はＲＡＣ−ＰＫの変異体や誘導体、および利用可能な技術に従い天然タンパク質から作製または誘導できるそのフラグメントを包含する。例えば、ＲＡＣ−ＰＫをコードする核酸は、アミノ酸コードの縮重により、それがコードするペプチドの性質に影響を与えることなく変異させることができる。また、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントにおいて、その機能を実質的に変化させることなく、保存アミノ酸置換を行うこともできる。更に、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントの機能を改善または変更する付加、欠失および／または置換も発明の範囲内に認識および包含される。本発明はまた、糖尿病などの血中糖レベルの異常に関わる疾患の処置に使用する薬物を製造するための、ＲＡＣプロテインキナーゼまたはそのフラグメント、またはバナジウム酸塩を除くＲＡＣプロテインキナーゼ活性のモデュレーターの使用を提供する。更に、本発明は、細胞増殖の異常の処置に使用する薬物を製造するための、ＲＡＣプロテインキナーゼまたはそのフラグメント、またはウォルトマンニンを除くＲＡＣプロテインキナーゼ活性のモデュレーターの使用を提供する。抗生物質ウォルトマンニンは、ホスファチジルイノシトール３−ＯＨキナーゼ（ＰＩ−３Ｋ）活性化を阻害することが知られており、シグナル伝達を標的とし、とりわけＲＡＣをおそらくＰＩ−３Ｋを介して間接的に不活性化する。ウォルトマンニンは、新生物腫瘍症状の処置に必要とされてきた。しかしながら、ＲＡＣ−ＰＫの様々なアイソフォームが有糸分裂促進性シグナル伝達、並びにインシュリン依存性シグナル形成において広範囲に関与することは、これまで知られていなかった。この度、我々は、ＲＡＣ−ＰＫが増殖制御にかかわる一因子であるＧＳＫ３とＩＭＰＤＨの両方の調節に関与することを示した。従って、ＲＡＣ−ＰＫは、増殖制御における中心的役割を果たすと結論できる。本発明の治療剤は、薬剤の種類によって常法により製剤化できる。薬剤がバナジウム酸塩などの塩である場合、適宜、中性ｐＨの水溶液にて製剤化し、室温で経口投与する。ＲＡＣ−ＰＫ自身などのペプチド薬の場合、ペプチドを標的細胞へ導入するためにリポソーム送達などのより精巧な送達技術を必要とすることもある。ペプチド治療剤の送達システムは、当分野で詳細に報告されている。増殖制御における主要メディエーターとしてのＲＡＣ−ＰＫの同定により、増殖制御異常を処置するのに使用するための推定治療剤を同定するスクリーニングシステムの設計が可能になる。そのため、本発明の第２の態様では、細胞内シグナル形成の潜在的モデュレーターのスクリーニング法を提供し、その方法は：（ａ）ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントを、スクリーニングする化合物とともにインキュベーションし；（ｂ）その化合物とＲＡＣとの相互作用を検出する工程を含む。スクリーニングは、完全なＲＡＣキナーゼまたはそのフラグメントを用いて実施できる。例えば１９９５年１２月１５日に出願した英国特許出願9525703.6（C iba-Geigy AG）に記載のように、特にＲＡＣキナーゼのＰＨドメインがその作用の多くを媒介するのに重要であることが示されている。更に、下記に開示のとおり、ＲＡＣ−ＰＫはＰＨドメインを介してＩＭＰＤＨと相互作用する。この相互作用は、完全なＲＡＣ−ＰＫを使用するならば、酵母ツーハイブリッドシステムでは観察できないが、インビトロではＲＡＣ−ＰＫのＩＭＰＤＨへの結合が起こる。ＲＡＣ−ＰＫの他のフラグメントとその生理学的標的やレギュレーターとの間にも相互作用が起こる。例えば、ＲＡＣによるＧＳＫ３のリン酸化により証明されるように、ＧＳＫ３は触媒ドメインを介してＲＡＣ−ＰＫに結合する。一方、ＣＴＢＰは、触媒またはＰＨドメインに結合しないが、ＲＡＣのカルボキシ末端ドメインには特異的に結合する。そのため、好ましくは、本発明は、スクリーニングする化合物をＲＡＣのフラグメント、有利にはＰＨドメイン、触媒ドメインまたはカルボキシ末端ドメイン、と共にインキュベーションすることを含む。本発明の方法に使用するＲＡＣ−ＰＫフラグメントは、単離フラグメントの形態または更なるポリペプチドと複合体形成したフラグメントの形態であってもよい。例えば、ツーハイブリッドシステムの場合、フラグメントは、酵母活性化物質ＧＡＬ４などの他のタンパク質に由来するＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインと複合体形成する。更に、本発明の方法で使用したＲＡＣ−ＰＫは、その変異体の形態、例えば構成的に活性化されたキナーゼであってもよい。重要な活性化残基は、キナーゼのサブドメイン７と８の間のいわゆるＴ−ループに存在するＴ３０８である。キナーゼ構造に関する一般的指針は、Woodgett(1994)，Protein Kinases,IRL Press, UKに与えられている。Ｔ３０８をアスパラギン酸と置換すると、キナーゼの基本活性は明らかに増大するが、これは、更に活性化される可能性を残している。故に、本発明は、Ｔhr３０８をＡspに変異させたＲＡＣキナーゼタンパク質を提供する。好ましくは、Ｓer４７３を更にＡspに変異させる。この残基のリン酸化は、インビボでＲＡＣ−ＰＫを完全に活性化するのに必要であり、Ｔ３０８／Ｓ４７３二重変異（Ａspに変換される両方の残基）は、天然のＲＡＣ−ＰＫよりも１８倍高い構成的活性を示す。二重変異は、更なる活性化を受けにくい。変異は、適切な技術によって実施できる。しかしながら、好ましくは、ＲＡＣをコードするヌクレオチド配列のインビトロ部位指向性突然変異誘発および続く組換えＤＮＡ発現システムにおけるＲＡＣの発現である。この方法は、クローン化ＤＮＡの領域内の所定の部位を変更できるインビトロ突然変異誘発法である（比較、M.J.Zoller and M.Smith,Methods Enzymol.(1983),100,468;D.Botstein a nd D.Shortle,Science(1985),229,1193の概説論文）。部位指向性突然変異誘発法は、Sambrook(1989)：Molecular Cloning - A Laboratory Manual,Cold Sprin g Harbor,NY，USAや多くの市販のインビトロ突然変異誘発キットに例示のように、当業者にはよく知られている。スクリーニングする化合物は、実質的に純粋な複合体形成していない形態で存在してもよく、または化学基または更なるポリペプチドと複合体形成していてもよい。ツーハイブリッドシステムの場合、ＰＨドメインを補足するために、ＤＮＡ結合ドメインまたは転写活性化ドメインと複合体形成している。本発明で使用する単離ｐＨドメインは、１９９５年１２月１５日に出願した英国特許出願第9525705.1号（Ciba-Geigy AG）に記載のようにして製造できる。しかしながら、少量のＰＨドメインで十分である場合、ＰＨドメインは、それをコードする核酸配列を細菌細胞培養において当分野で既知の技術に従い実質的に切断した融合タンパク質の形で発現させることにより得ることができる。例えば、ＰＨドメインをコードするＲＡＣのアミノ酸１〜１３１は、有利にはグルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）を用いて融合タンパク質として発現させることができ、続いて、その融合タンパク質をトロンビンで切断し、ＦＰＬＣなどのタンパク質精製技術によりそのドメインを単離できる。この方法では、比較的少量の純粋な可溶性ＰＨドメインが得られる。カルボキシおよびキナーゼドメインも同様に、融合タンパク質として、例えばＧＳＴ融合物として有利に合成される。本発明で使用するＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントは、英国特許出願第95 25702.8号に記載のようにして製造できる。あるいは、ＲＡＣ−ＰＫは、組換え細胞培養にて発現させてもよい。昆虫細胞培養によく利用されるバキュロウイルスベクターが特に好ましく、市販のものから広く入手できる(例えば、Invitroge n and Clontech)。その他にも昆虫細胞に感染する能力のあるウイルスベクターは知られており、例えばシンドビス（Sindbis）ウイルスである(Hahn et al.,(1 992)PNAS(USA)89,2679-2683)。選択したバキュロウイルスベクター（Miller(198 8)Ann.Rev.Microbiol.42,177-199に概説）はオートグラファ・カリフォルニカ(A utographa californica)多発性核多角体病ウイルス、ＡcＭＮＰＶである。典型的には、ポリヘドリンｆウイルス生産に必要とされないため、ＡcＭＮＰＶのポリヘドリン遺伝子の少なくとも一部を異種遺伝子で置換する。異種遺伝子を挿入するには、トランスファーベクターが有利に使用される。トランスファーベクターをＥ.コリ宿主にて調製し、次いで、ＤＮＡ挿入物を相同的組換え法によりＡcＭＮＰＶに移す。本発明に有用なバキュロウイルス技術は、当分野で標準的なよく知られたものであり、O'Reilley et al.,(1994)Baculovirus expres sion vectors;A laboratory manual,Oxford University Press Inc.,NY,USAや市販のバキュロウイルスキットの供給元（例えば、Pharmingen）により出版された文献に概説されている。インキュベーション条件は、ＰＨドメインとスクリーニングした化合物との相互作用を検出するために使用する実際の方法によって変わる。酵母ツーハイブリッドシステムなどの転写活性化検出システムの場合、インキュベーション条件は、遺伝子転写に適した、生存細胞内部に効果のあるようなものである。しかしながら、その他の検出システムは異なるインキュベーション条件を必要とする。例えば、相互作用の検出が、例えば、アフィニティークロマトグラフィーで知られているようなクロマトグラフィーアッセイにおける相対的な親和性に基づくならば、結合を容易にするように条件を調整し、次いで、これを徐々に変化させて、スクリーニングした化合物がＲＡＣ−ＰＫＰＨドメインにもはや結合しない時点を測定できるようにする。検出手段として、ＲＡＣ−ＰＫＰＨドメインにおけるＴrp²²の自然蛍光を採用でき、これは、英国特許出願第9525703.6号に記載のように、そのドメインとのある種の相互作用により阻害される。要約すると、適切な周波数で蛍光を発するように分子を励起し、発光を監視することにより、ある種のＰＨドメイン含有タンパク質のＰＨドメイン中のアミノ末端Ｔrp残基の蛍光を検出できる。例えば、ＲＡＣのＮ−末端Ｔrp²²は、２９０nmで励起させた場合３４５nmで蛍光を発する。タンパク質蛍光を監視する技術は、当分野では広く知られている。我々は、ＲＡＣ−ＰＫのＰＨドメインが高親和性でリン脂質に結合することを示しており、これは、ＲＡＣ−ＰＫがＰＨドメインを介してインビボで膜結合できることを示唆するものである。リン脂質がＲＡＣ−ＰＫＰＨドメインへ結合すると、２２位のＮ−末端トリプトファン（Ｔrp²²）の自然蛍光が消える。ＰＨドメインと細胞膜との相互作用は、ＲＡＣ−ＰＫがシグナル形成経路における膜結合相手と適切に相互作用するのに重要であると考えられるため、この相互作用の撹乱は、シグナル形成分子の細胞膜からの解離によりシグナル形成作用の変調を導く。この変調は、例えば、シグナル形成分子と膜結合相手との別の適切な相互作用が刺激性相互作用であるならば、ダウンレギュレーションであるか、または相互作用が阻害性相互作用である場合はアップレギュレーションであるかのいずれかであり得る。従って、シグナル応答のモデュレーター候補は：（ａ）化合物を、蛍光発光能力のあるシグナル形成分子のＰＨドメインと共にインキュベーションし、（ｂ）その化合物の存在下でＰＨドメインの蛍光のリン脂質誘導化変調、即ち、化合物とＰＨドメインとの機能的相互作用の指標である蛍光変化を検出する、工程を含む方法によりスクリーニングできる。この場合、インキュベーション条件は、ＰＨドメインが２９０nmの周波数で励起する場合、３４５nmで蛍光を容易に検出できるように調整する。本発明によるインキュベーションは多くの手段により達成できるが、基本的な要件は、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントとスクリーニングした化合物がお互いに接触できるようにすることである。これは、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントと化合物を混合するか、またはそれらをコードする核酸を発現させるなど、インシツ(in situ)でそれらを産生することにより達成できる。ＲＡＣ−ＰＫまたはＲＡＣ−ＰＫフラグメントおよび／または化合物が他のポリペプチドとの融合形である場合、それらは、例えば、インシツで発現させることができる。好ましくは、本発明の方法は、ツーハイブリッドシステムに基づく。このようなシステムは、酵母ＧＡＬ４アクチベーターなどの分離可能なＤＮＡ結合および転写活性化ドメインをもつ転写アクチベーターを利用することにより、特異的なタンパク質：タンパク質相互作用を検出する。使用する転写アクチベーターに応答するエレメントにレポーター遺伝子を作動可能に連結させて、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントおよびスクリーニングした化合物にさらすが、この内の１つは転写アクチベーターの転写活性化ドメインと複合体形成しており、その他はＤＮＡ結合ドメインとつながっている。ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントと化合物との特異的相互作用があるならば、転写アクチベーターのＤＮＡ結合ドメインと転写活性化ドメインが並列することになり、レポーター遺伝子の転写が活性化される。あるいは、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメント、例えばそのＰＨドメインまたはその触媒ドメインと、スクリーニングした化合物またはそのフラグメントとの間にみられた結合に基づいて検出してもよい。例えば、ＲＡＣ−ＰＫとインシュリンメディエーターＧＳＫ３との相互作用は、下記では、その不活性化を担うことが知られているＧＳＫ３の主要リン酸化部位周辺のペプチドとＲＡＣキナーゼとの相互作用を監視することにより検出する。同様にして、特定の化合物の活性化または不活性化におけるＲＡＣ−ＰＫの関わりは、変調事象に関与することが知られているその化合物の一部とＲＡＣとの相互作用を監視することによりスクリーニングできる。ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントは、それとスクリーニングする化合物とをインキュベーションし、続いて、ＲＡＣ−特異的抗体によりＲＡＣ−ＰＫ複合体を“取り出す(プルーダウン；pulling down)”ことにより、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントに結合する化合物をスクリーニングするのに使用することもできる。免疫沈降またはイムノ−アフィニティークロマトグラフィーに適した抗体は、当業者に知られている常用技術に従い調製してもよく、現存のモノクローナルまたはポリクローナル抗体であってもよい。例えば、Lane,et al.,(1992)EM BO J.,11,1743-1749参照。ＲＡＣ−化合物複合体を親和性によって単離した後、化合物をＲＡＣ−ＰＫ抗体から解離させ、常用技術により特性化できる。ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントとスクリーニングした化合物との相互作用もまた、間接的に観測できる。例えば、ＲＡＣ−ＰＫ機能のインヒビターまたはアクチベーターは、その化合物の存在下または不在下で基質に対するＲＡＣ− ＰＫの作用を観測することにより検出できる。ＲＡＣ−ＰＫの活性またはその触媒ドメインは、キナーゼの基質を用いるキナーゼ活性アッセイにより評価できる。例えば、確立されたアッセイ法によると、ミエリン塩基性タンパク質が使用できる。ＧＳＫ３などの生理学的基質を用いてもよい。あるいは、ＲＡＣ−ＰＫ活性は、ＲＡＣ−ＰＫ自身のリン酸化の活性化度合いを測定することにより評価してもよい。キナーゼ活性化に通常関与する残基のリン酸化を評価するのが都合よい。ＲＡＣ−ＰＫは、英国特許出願第952570 2.8号に開示されているとおり、セリンおよびトレオニン残基でリン酸化することにより優先的に活性化される。本発明のアッセイは、候補化合物のＲＡＣに対する直接的な作用を測定するのに使用することができ、または、シグナル形成経路において、ＲＡＣの上流で働くキナーゼに対する化合物の作用を測定するのに使用することもできる。後者の場合、ＲＡＣ−ＰＫは上流キナーゼの基質として働き、上流キナーゼの活性は、リン酸化状態またはＲＡＣ−ＰＫの活性を測定することにより評価される。有意義な結果を得るには、免疫抑制または抗増殖剤候補にさらしたＲＡＣ−ＰＫの活性をその薬剤にさらしていないＲＡＣ−ＰＫの活性と比較すべきであり、ＲＡＣキナーゼ活性の変調は、細胞増殖および／またはインシュリンシグナル伝達モデュレーターの可能性があることを示す。この場合、見込みのある化合物は、例えば、細胞増殖アッセイによりその特性を直接測定することによって、更に評価できる。このようなアッセイは、好ましくは、ホスファターゼインヒビターによりキナーゼ活性化を受け、ＲＡＣ−ＰＫモデュレーター候補にさらされ、所望により、続いて成長因子、ＩＬ−２またはＰＭＡなどの有糸分裂促進物質で刺激された細胞の増殖を物理的に測定することを含む。より簡単には、このアッセイは、非刺激細胞を候補モデュレーターにさらし、その後ホスファターゼインヒビターで刺激する必要がある場合もある。本発明は更に、スクリーニングシステムにおけるＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントの使用を含む。このスクリーニングシステムは、好ましくは、特に、その活性がグリコーゲン代謝または細胞増殖に関連する場合、インシュリン活性のモデュレーターである化合物をスクリーニングするために使用する。このような化合物をスクリーニングするのに有用なキットは調製することができ、またＲＡＣ−ＰＫとスクリーニングした化合物との相互作用を検出するための手段と共に、実質的にＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントを含む。故に、好ましくは、このスクリーニングキットは、下記の検出システムの１種を含む。本発明のキットに使用するためのＲＡＣ−ＰＫは、タンパク質の形態、例えば溶液、懸濁液または凍結乾燥状態、または発現システムにおいて、所望によりインシツでＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントを産生可能な核酸配列の形態で提供できる。好ましくは、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントをコードする核酸は、融合タンパク質、例えばＧＳＴ融合物の形態でそれをコードしている。更に別の実施態様では、本発明は、直接的または間接的にＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントと相互作用する化合物を提供する。直接作用する化合物の場合、インシュリンやウォルトマンニンなどの薬剤は除く。このような化合物は、無機または有機物、例えば抗生物質であってもよく、好ましくは細胞内シグナル形成に関わるタンパク質性化合物である。例えば、その化合物はＣＴＢＰ（配列番号１および２）であり得る。本発明の化合物は、下記の技術を用いるスクリーニングにより同定でき、確立された方法により天然源から抽出するか、または低分子量化学的化合物の場合、特に合成により調製する。タンパク質性化合物は、組換え発現システム、例えば下記のバキュロウイルスシステムにて、または例えば英国特許出願第9525705.1 号に記載の細菌システムにて発現させて調製できる。タンパク質性化合物は、主にシグナル形成経路の機能の研究に有用であるが、治療的応用を有することもある。一方、低分子量化合物は、好ましくは確立された方法に従い化学合成により製造する。それらは主に治療剤として必要とされる。一般に低分子量化合物と有機化合物は、インシュリン模擬体または抗増殖剤として有用であり得る。下記実施例において、本発明を単なる例示の目的で更に説明する。実施例１ＲＡＣ−ＰＫとＩＭＰＤＨとの特異的相互作用 (ａ)細菌および酵母株ツーハイブリッド実験用の酵母株およびプラスミドは全てClontech社（Palo A lto,CA）からMATCHMAKERツーハイブリッドシステムの成分として、またはＤ.ナザン博士（Howard Hughes Medical Institute,Baltimore,ML）から入手する。酵母株ＳＦＹ５２６(ＭＡＴa、ura３−５２、his３−２００、ade２−１０１、lys ２−８０１、trp１-９０１、leu２−３、１１２、can^r、gal４−５４２、gal８０−５３８、ＵＲＡ３::ＧＡＬ１−lacＺ)、ＨＦ７c（ＭＡＴa、ura３−５２、 his３−２００、lys２−８０１、ade２−１０１、trp１−９０１、leu２−３、１１２、gal４−５４２、gal８０−５３８、ＬＹＳ２::ＧＡＬ１−ＨＩＳ３、ＵＲＡ３::(ＧＡＬ４１７mer)₃−ＣＹＣ１−lacＺ)およびＰＣＹ２［Chevray and Nathans,1992］（ＭＡＴα、his３−２００、ade２−１０１、lys２−８０１、t rp１−６３、leu２−３、gal４−５４２、gal８０−５３８、ＵＲＡ３::ＧＡＬ１−lacＺ）を用いて、タンパク質−タンパク質相互作用についてアッセイする。酵母株ＨＦ７cは、ライブラリースクリーニング用に使用する。ＳＦＹ５２６とＰＣＹ２は、lacＺ遺伝子と融合したＧＡＬ１プロモーターの上流活性化配列とＴＡＴＡ配列を持つ。ＨＦ７cの場合、ＨＩＳ３をＧＡＬ１プロモーター配列に融合させ、ＬacＺを１７量体ＧＡＬ４コンセンサス配列３コピー足すＣＹＣ１プロモーターのＴＡＴＡ配列に融合させる。ＨＩＳ３とＬacＺは、両方とも、ＧＡＬ４活性化に反応しやすい。形質転換を含む酵母技術は、MATCHMAKERツーハイブリッドシステム中の説明書に従い、またAusubel,et al.,(1994)Current Proto cols in Molecur Biology．John Wiley and Sons,New York,NYに記載のようにして実施する。細菌株ＸＬ−１ブルー（Stratagene）およびＪＭ１０９は、プラスミドのクローニングおよびＧＳＴ融合タンパク質の製造に使用する。細菌株ＪＭ１０９（ＤＥ３）、ＢＬ２１（ＤＥ３）pＬysＳおよびＢＬ２１（ＤＥ３）pＬys Ｅ（Invitrogen）は、(ＨＩＳ)₆−タグ付タンパク質の製造に使用する。一般的な分子生物学的技術は既に記載のようにして実施する[Sambrook,et al.(1989)Mo lecular Cloning:A Laboratory Manual.,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laborato ry,Cold Spring Harbot,NY；Davis,et al.(1986)Basic Methods in Molecular B iology.Elsevier Science Publishing Co.,New York,NY]。（ｂ）プラスミド構築ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン（アミノ酸１−１４７、pＧＢＴ９）およびＧＡＬ４活性化ドメイン（アミノ酸７６８−８８１、pＧＡＤ４２４）を含有する酵母ベクタープラスミド、並びに対照プラスミドpＣＬ１（全長ＧＡＬ４遺伝子）、pＶＡ３（p５３遺伝子）、pＴＤ１（ＳＶ４０ラージＴ抗原）およびpＬＡＭ５ ’（ヒトラミンＣ遺伝子）はClontech社のものである。ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインを含有する酵母ベクターpＰＣ６２はＤ.ナザン博士から得る。グルタチオン −Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）融合ベクターpＧＥＸ−２ＴはPharmacia社のものである。バキュロウイルストランスファーベクター（pＶＬ１３９２）および（ＨＩＳ）₆−タグベクター（pＲＳＥＴ−Ａ）はInvitrogen社のものである。ｐＧＢＴ−ＰＨ１２７、ｐＧＢＴ−ＰＨ１５０、ｐＧＢＴ−ＰＨＩ−IIIおよびｐＧＢＴ−ＰＨIII−ＶＩは、ヒトＲＡＣα ＰＨドメインのアミノ酸１−１２７、１−１５０、１−４７、４７−１２７それぞれとＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとのフレーム内融合物を含有する。これらは、特定のオリゴヌクレオチドで作ったＰＣＲフラグメントをpＧＢＴ９のＥcoＲＩ−ＢamＨＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。pＧＥＸ−ＰＨ１３１、pＧＥＸ−ＰＨ−ＫＩＮ、pＧＥＸ−ＰＨ−ＫＩＮ−ＣＴ、pＧＥＸ−ＫＩＮ−ＣＴ、pＧＥＸ−ＫＩＮおよびpＧＥＸ−ＣＴは、ヒトＲＡＣαのアミノ酸１−１３１、１−４１１、１− ４８０、１４７−４８０、１４７−４１１、４１１−４８０それぞれとＧＳＴとのフレーム内融合物を含有する。これらは、特定のオリゴヌクレオチドで作ったＰＣＲフラグメントをpＧＥＸ−２ＴのＢamＨＩ−ＥcoＲＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。pＧＢＴ−ＰＨ−ＫＩＮ、pＧＢＴ−ＰＨ−ＫＩＮ −ＣＴ、pＧＢＴ−ＫＩＮ−ＣＴ、pＧＢＴ−ＫＩＮおよびpＧＢＴ−ＣＴは、ヒトＲＡＣαのアミノ酸１−４１１、１−４８０、１４７−４８０、１４７−４１１、４１１−４８０それぞれとＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインとのフレーム内融合物を含有する。これらは、対応するpＧＥＸ構築物由来の適切なＢamＨＩ−Ｅc oＲＩフラグメントをＰstＩ−ＢamＨＩおよびＥcoＲＩ−ＸbaＩアダプターを用いてＰstＩ−ＸbaＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。次いで、得られたpＰＣ６２プラスミド由来のＸhoＩ−ＸbaＩフラグメントを単離し、Ｘb aＩ−ＥcoＲＩアダプターを用いてpＧＢＴ９のＸhoＩ−ＥcoＲＩ部位にサブクローンする。pＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ１−４８１、pＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ１−４２７、 pＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ１−３２５、pＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ２８−５１４、pＧＡＤ −ＩＭＰＤＨ７０−５１４、pＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ１−４０およびpＧＡＤ−ＩＭＰＤＨ４２８−５１４は、ヒトII型ＩＭＰＤＨのアミノ酸１−４８１、１−４２７、１−３２５、２８−５１４、７０−５１４、１−４０、４２８−５１４それぞれとＧＡＬ４活性化ドメインとのフレーム内融合物を含有する。これらは、特定のオリゴヌクレオチドで作ったＰＣＲフラグメントをpＧＡＤ４２４のＢamＨＩ− ＳalＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。pＧＥＸ−ＩＭＰＤＨは、完全なヒトII型ＩＭＰＤＨとＧＳＴとのフレーム内融合物を含有する。これは、pＧＡＤＧＨ−ＩＭＰＤＨ由来のＳmaＩ−ＸhoＩＩＭＰＤＨフラグメントを、ＸhoＩ−ＳmaＩアダプターを用いてｐＧＥＸ−２ＴのＳmaＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。pＶＬ１３９２−hＲＡＣαはヒトＲＡＣαの全コード領域を包含するＷ１３８ｘＲＡＣ７１[Jones,et al.(1991)Proc.Natl.Aca d.Sci.U.S.A.88,4171-4175]由来のＥcoＲＩフラグメントを含有した。pＲＳＥＴ −ＰＨＱＫＫＫは、ヒトＲＡＣαのアミノ酸１−１１６とアミノ末端(ＨＩＳ)₆ −タグとのフレーム内融合物を含有し、カルボキシ末端に３つのリジンを付加したものである。これは、pＲＫ−ＲＡＣ［Jones,et al.(1991)Proc.Natl.Acad.Sc i.U.S.A.88,4171-4175］由来のＮdeＩ−ＰflＭＩフラグメントを、ＢamＨＩ−Ｎ deＩおよびＰflＭＩ−ＥcoＲＩアダプターを用いてpＲＳＥＴ−ＡのＢamＨＩ− ＥcoＲＩ部位にサブクローニングすることにより構築する。プラスミドは全て、制限フラグメント分析および配列決定により確認する。（ｃ）ライブラリースクリーニングＲＡＣのＰＨドメインがその他のタンパク質と相互作用するかどうかを測定するために、そのドメインをＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインと融合させ、酵母レポーター株ＨＦ７cにおいてＧＡＬ４転写活性化ドメインと融合させたヒーラーｃＤＮＡライブラリーをスクリーニングする。ヒトのヒーラーＳ３ MATCHMAKER ｃＤＮＡライブラリーは、Clontech社から購入する。pＧＢＴ−ＰＨ１２７は、対照プラスミド（pＧＡＤ４２４、pＣＬ１、pＴＤ１）を用いる場合と用いない場合とでＨＦ７cに形質転換させる。この形質転換由来のコロニーをＨＩＳ３とＬa cＺ発現について試験して、ＰＨドメイン単独では転写を活性化しないことを確認する。次いで、ｐＧＢＴ−ＰＨ１２７だけを含有するＨＦ７c形質転換体を、ツーハイブリッド活性化ベクターpＧＡＤＧＨに挿入した十分なヒーラーＳ３ｃＤＮＡライブラリーで形質転換させて、１.０×１０⁶酵母Ｌeu⁺／Ｔrp⁺形質転換体を産生する。二重に形質転換させた細胞をＬeu^-、Ｔrp^-、Ｈis^-プレートにまき、３０℃で３〜８日間インキュベーションする。陽性コロニーを選出し、三重マイナスプレートにて再度画線培養し、フィルターアッセイによりＬacＺ活性についてアッセイした。その後、Ｈis⁺でＬacＺ⁺のライブラリークローンからｐＧＢＴ−ＰＨ１２７プラスミドをキュアリング（除去）し、Ｈis栄養要求性とＬac Ｚ活性について試験する。次いで、両アッセイにおいて陰性のキュアリング済みクローンを、ｐＧＢＴ９、ｐＧＢＴ−ＰＨ１２７、ＰＬＡＭ５'またはpＴＤ１のいずれかを含有するＰＣＹ２の形質転換体に接合させる。ｐＧＢＴ−ＰＨ１２７の存在下でのみＨis栄養要求性とＬacＺ活性の両方について陽性になる二倍体に相当する活性化クローンを配列決定用に選択する。一次形質転換体１.０×１０⁶のスクリーニングでは、我々は、Ｈis栄養要求性とＬacＺ活性のレポーターを活性化することにより、ＲＡＣのＰＨドメインとの特異的相互作用を示す３７クローンを同定する。これらのクローンは、cＤＮＡ挿入物のサイズに基づき、更に６種の異なるcＤＮＡクラスに分けることができる。配列決定すると、全てのクローンが、イニシエーターメチオニンから既にクローニングしたcＤＮＡの終止コドン［Collart,F.R.,and Huberman,E.(1988)J.B iol.Chem.263,15769-15772］までを含むヒトII型ＩＭＰＤＨをコードすることが分かった。サブドメインＩ−III（アミノ酸１−４７）またはサブドメインＩＶ−ＶＩ（アミノ酸４７−１２７）のいずれかを含有する構築物単独では、ＩＭＰＤＨと何の相互作用も示さないので、相互作用には完全なＰＨドメインが必要である。サブドメインＩＶ−ＶＩとの相互作用の欠如は、この領域がヘテロ三量対Ｇタンパク質のβγ−サブユニットと弱く相互作用することが既に示されているので、重大である。しかしながら、ＩＭＰＤＨとＲＡＣのＰＨドメインとのこの相互作用は、その自然の状況で起こるとおり、ＲＡＣのＰＨドメインに並列したＲＡＣのキナーゼドメインを含有する構築物を伴うツーハイブリッドシステムでは阻害される。これは、ＲＡＣのＰＨドメインどうしの、またはＲＡＣのＰＨドメインと他の領域との分子内相互作用に原因があると思えた。しかしながら、ＰＨとキナーゼドメインとの間にアミノ酸（キナーゼドメインの最初の４アミノ酸を含む）を封入しても、相互作用を阻害しなかった。我々は、ＲＡＣのＰＨドメインとＧＡＬ４活性化ドメインを融合させ、ヒトＲＡＣαＧＡＬ４ＤＮＡ結合構築物のいずれかと相互作用できるかどうかを試験する。そのような相互作用はなんら検出できず、これは、このシステムではＰＨドメインが自己会合せず、またＲＡＣ−ＰＫ分子の他の領域とも複合体形成しないことを示している。よって、上記で観測された相互作用の阻害は、立体障害が原因のようである。我々は、ＲＡＣのＰＨドメインとの相互作用を担う分子の領域を測定するために、ＩＭＰＤＨの入れ子状アミノおよびカルボキシ末端欠失物を構築する。これは、殆ど無傷のＩＭＰＤＨ分子が相互作用には必要であることを示している。ＰＨ相互作用ドメインのアミノ末端境界がアミノ酸２８と７０の間にあり、一方、カルボキシ末端境界はアミノ酸４２７と４８２の間にあることが分かっている。（ｄ）インビトロ結合研究ＩＭＰＤＨがＲＡＣのＰＨドメインと直接相互作用できるかどうかを試験するために、ＧＳＴ融合物を用いるインビトロ結合アッセイシステムを採用する。プラスミドｐＧＥＸ−２Ｔ、ｐＧＥＸ−ＰＨ３１１およびｐＧＥＸ−ＩＭＰＤＨから作ったＧＳＴ融合物は、０.１mＭＩＰＴＧを用いて２４℃で２時間誘導させることによりＥ.コリＸＬ−１ブルー細胞中で発現させる。この融合タンパク質は、細胞をFrench Press中で溶解させる以外は［Smith,D.B.,and Johnson,K.S.(19 88)Gene 67,31-40］に記載のようにして精製する。pＲＳＥＴ−ＰＨＱＫＫＫで形質転換したＢl２１(ＤＥ３)pＬysＳ細胞により産生されたヒトＲＡＣαＰＨドメイン(ＨＩＳ)₆タグ付き融合物は、英国特許出願第9525705.1号に記載のようにして発現させ精製する。要約すると、回収前に細胞を０.２mＭＩＰＴＧを用いて２４℃で２時間誘導させる。細胞ペレットをFrench Pressにて溶解し、続いて可溶性ＰＨドメインをＮi(II)アフィニティー、カチオン交換およびゲル濾過カラムにて精製する。結合研究は、(ＨＩＳ)₆−タグ付きＰＨドメインまたはバキュロウイルス産生ヒトＲＡＣα ２.５μgを含有する総容量１００μlの結合緩衝液（２０mＭホスフェート緩衝液、ｐＨ７.２、１５０mＭＮaＣl、１％トリトンＸ−１００、５mＭＤＴＴ）中グルタチオン−アガロースビーズに結合させたＧＳＴ融合物（２.５μg）を用いて実施する。試料を５分毎に撹拌しながら４℃で１〜２時間インキュベーションする。次いで、ビーズを緩衝液（２０mＭホスフェート緩衝液、ｐＨ７.２、１５０mＭＮaＣl）で３回洗浄し、その後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで分析し、((ＨＩＳ)₆−タグ付きＰＨドメイン結合について)クマシーブルーＲ−２５０で染色するか、またはＳＤＳ−ＰＡＧＥに続いて（ヒトＲＡＣα結合について）ヒトＲＡＣα特異的抗血清を用いてウェスタン・ブロット分析する［Jones et al.,前掲引用］。第２の抗体は、西洋ワサビペルオキシダーゼ結合抗ウサギ抗体（Amersham）であり、オートラジオグラフィーによるＥＣＬ法（Am ersham）を用いて検出する。このアッセイでは、(ＨＩＳ)6−タグ付きＰＨドメインがＧＳＴ−ＩＭＰＤＨ融合物には結合できるがＧＳＴ単独には結合できないことが分かる。我々は、全長バキュロウイルス精製ヒトＲＡＣαがＩＭＰＤＨと直接相互作用できるかどうかを試験するのにもこのアッセイシステムを採用する。全長ヒトＲＡＣαは、英国特許出願第9525702.8号に記載のようにしてバキュロウイルスシステムから発現させて精製する。要約すると、バキュロウイルスは、pＶＬ１３９２−ｈＲＡＣαと野生型バキュロウイルスＡcＭＮＰＶＤＮＡによるＳf９細胞の同時トランスフェクションにより構築し、制限希釈により精製し、ドット− ブロットハイブリダイゼーションにより検出する。この精製ウイルスはＳf９細胞にてヒトＲＡＣαを産生するのに使用する。ヒトＲＡＣαは、連続アニオン交換、ホスホーセルロースおよびゲル濾過クロマトグラフィーにより精製する。ここで、全長ＲＡＣ−ＰＫ分子はＧＳＴ−ＩＭＰＤＨとの特異的相互作用するが、ＧＳＴ単独またはＧＳＴ−ＰＨ融合物とは相互作用しないことがわかる。（ｅ）インビボプル−ダウン（Pull-down）アッセイＭＣＦ−７細胞抽出物でのプル−ダウンアッセイにおいてＧＳＴ−ＩＭＰＤＨを用いると、ＲＡＣαとＧＳＴ−ＩＭＰＤＨとの特異的結合が見られるが、ＧＳＴでは見られない。ＭＣＦ−７細胞は、１２ストロークのダウンス（dounce）ホモジナイザーを用いて、緩衝液（５０mＭトリス−ＨＣl、ｐＨ８.０、１２０mＭＮaＣl、１％ＮＰ−４０、１mＭＥＤＴＡ、１mＭＥＧＴＡ、３０mＭ pＮＰＰ、２５mＭβ−グリセロールホスフェート、１５mＭＰＰi、２５mＭＮaＦ、１m Ｍバナジウム酸塩、２０μＭＰＡＯ、１mＭベンズアミジン、０.１mＭＰＭＳＦ）に溶解させる。１４,０００×g、４℃で１５分間遠心した溶解物上清由来の可溶性タンパク質を、グルタチオンビーズに結合させたＧＳＴ、ＧＳＴ−ＰＨまたはＧＳＴ−ＩＭＰＤＨタンパク質（５μg）に加え、４℃で２時間連続的に撹拌しながらインキュベーションする。次いで、ビーズを溶解緩衝液で４回洗浄し、その後上記のように、ヒトＲＡＣα特異的抗血清［Jones et al.,前掲引用;（ 1991）Cell Reg.2,1001-1009］またはＩＭＰＤＨ特異的抗血清［Collart,F.R.,a nd Huberman,E.(1988)J.Biol.Chem.263,15769-15772］を用いるウエスタン・ブロットにより分析する。ＧＳＴ−ＰＨドメイン融合タンパク質を用いて細胞溶解物からＩＭＰＤＨを取り出す逆実験を実施してもよい。こうして、３種の異種システムにおいてヒトＲＡＣαとヒトII型ＩＭＰＤＨとの結合の存在を示す。（ｆ）酵素アッセイ次いで、ＩＭＰＤＨ活性に対するこの相互作用の影響をアッセイする。ＧＳＴ融合物はＩＭＰＤＨの活性化を引き起こすので、可溶性ＰＨドメインの付加とＧＳＴ単独の付加とを比較した。ＩＭＰＤＨ活性についてのアッセイは、２８６nm での吸光度によりＸＭＰの生産を追跡しながら、実質的に［Antonio,L.C.,and W u,J.C.(1994)Biochem.33,1753-1759］に記載のようにして実施する。ＩＭＰＤＨは、グルタチオンビーズにて精製したＧＳＴ融合物のようにして製造し、次いで、還元グルタチオンを用いて可溶性タンパク質として溶出させる。ＩＭＰＤＨ活性は、可溶性ＧＳＴ（pＧＥＸ−２Ｔ）またはＰＨドメイン（ｐＧＥＸ−ＰＨ１３１から産生）のいずれかの存在下、ＧＳＴ／ＰＨドメインに対するＩＭＰＤＨのモル比率１：５で試験する。さまざまな基質（ミエリン塩基性タンパク質、ＧＳＴまたはＧＳＴ−ＩＭＰＤＨ）を用いる、バキュロウイルス産生ヒトＲＡＣα でのＲＡＣキナーゼアッセイは、実質的に[Jones et al.,前掲引用]に記載のようにして実施する。ＩＭＰＤＨが基質であるかどうかを調べるために、バキュロウイルス産生ヒトＲＡＣαを用いてＲＡＣキナーゼアッセイでＩＭＰＤＨを試験したところ、ＩＭＰＤＨの有意なリン酸化はなんら検出できなかった。実施例２ＧＳＫ３の阻害インシュリン依存性シグナル形成経路の調節に関わることが知られている２種の主要なキナーゼは、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１とｐ７０^S6Kである。これらのキナーゼは、それぞれＰＤ９８０５９とラパマイシンによって阻害される。これらの薬剤は両方とも、ＧＳＫ３のリン酸化を阻害できず、これは、ＧＳＫ３活性化を担うキナーゼがＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１またはｐ７０^S6Kでないことを示している。下記のように、Ｌ６筋管細胞を両方の化合物とインキュベーションし、インシュリンで刺激する。Ｌ６細胞の単層を６cmペトリ皿にて筋管細胞の段階まで生育させ、血清を一晩使わせず、次いで、５０μＭＰＤ９８０５９または１００μ ＭＬＹ２９４００２の存在下または不在下、２０mＭＨepes／ＮaＯＨ（pＨ７.４）／０.１４ＭＮaＣl／５mＭＫＣl／２.５mＭＭgＳＯ₄／１mＭＣaＣl₂／２５m Ｍグルコース（ＨＢＳ緩衝液）中で１時間インキュベーションする。２mＭ８− Ｂr−cＡＭＰまたは０.１μＭラパマイシンを添加する場合は、最後１５分間に含める。細胞を０.１μＭインシュリンで５分間、または１０分までの時間経過で刺激する。培地を吸引除去し、細胞を氷上に置き、氷冷緩衝液Ａ［５０mＭトリス−ＨＣl（pＨ７.５、２０℃）／１mＭＥＤＴＡ／１mＭＥＧＴＡ／１％（w ／v）トリトンＸ−１００／１mＭオルソバナジウム酸ナトリウム／１０mＭグリセロリン酸ナトリウム／５０mＭフッ化ナトリウム／５mＭピロリン酸ナトリウム／２μＭミクロシスチン／０.１％（v／v）２−メルカプトエタノール／ロイペプチド４μg／ml、１mＭベンズアミジン、１mＭフェニルメタンスルホニルフルオリド、３０μg／mlアプロチニン、３０μg／mlアンチパイン、１０μg／mlペプスタチン］０.２mlに溶解させる。免疫沈降による細胞溶解物からのｐ４２^MAPK、ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１またはＧＳＫ３の沈殿および特定のタンパク質またはペプチド基質によるその活性の分析（Cross et al.,(1994)Biochem.J.303,21-26）は、ＧＳＫ３のインシュリン不活性化が、典型的なＭＡＰキナーゼまたはｐ７０^S6Kシグナル形成経路を阻害する薬剤（２mＭ８−Ｂｒ−cＡＭＰまたは０.１μＭラパマイシン）に影響されないことを示す。ラパマイシンおよびＰＤ９８０５９の存在下でＧＳＫ３を阻害するキナーゼを同定するために、緩衝液が更に１mＭＥＧＴＡ、０.１mＭオルソバナジウム酸ナトリウムおよび０.５％（w／v）トリトンＸ−１００を含有する以外は上記のようにして細胞を溶解し、細胞溶解物（０.３mg）をMono Q（Sutherland et al.,( 1994)FEBS Lett.338,37-42）の５×０.１６cmカラムでクロマトグラフィーにかける。このフラクション（０.０５ml）を、リン酸化がＧＳＫ３α（Ｓer²¹）とＧＳＫ３β（Ｓer⁹）の不活性化を誘発するセリン（下線）周辺のＧＳＫ３の配列に対応する合成ペプチドＧＲＰＲＴＳＳＦＡＥＧでアッセイした。このペプチドのリン酸化をもたらす３つの活性ピークが溶出した。これらのピークは、インシュリン刺激を与えなかったり、細胞をインシュリン刺激の前に０.１μＭウォルトマンニンと共にインキュベーションすると、現れない。ＧＳＫ３に対するインシュリンの不活性化作用は、この濃度のウォルトマンニンまたは構造的に関連のないＰＩ−３Ｋのインヒビターである１００μＭＬＹ２９４００２を投与することにより妨げられることが知られている。リン酸化活性の３つのピークは全て、ウサギにペプチドを皮下注射することにより生じるペプチドＦＰＱＦＳＹＳＡＳＳＴＡに対するポリクローナルウサギ抗血清を用いる抗ＲＡＣ抗体により免疫沈降させることができ、５０％(ＮＨ₄)₂ＳＯ₄を用いて沈殿させ、続いてＲＡＣ−ペプチド結合アフィゲル（登録商標）１０カラム（Bio-Rad）でのアフィニティークロマトグラフィーにより精製できる。反対に、抗ＭＡＰＫＡＰキナーゼ−１抗体で免疫沈降させると、Mono Qカラムからはいかなるペプチドリン酸化活性も取り出すことができない。完全なＧＳＫ３がＲＡＣによって不活性化され得ることを測定するために、ＧＳＫ３αおよびＧＳＫ３βをウサギ骨格筋から部分的に精製し(Sutherland et a l.,前掲引用)、特定のペプチド基質（Cross et al.,前掲引用）でアッセイする。各ＧＳＫ３アイソフォームを１５Ｕ／mlまで希釈し、ＲＡＣの存在下または不在下、ＭgＡＴＰで２０分間インキュベーション後ＧＳＫ３活性を測定する。このインキュベーションはキナーゼ反応を止めるためにＥＤＴＡ中２０mＭで行い、ＧＳＫ３を再活性化するために５mＵ／mlＰＰ２Ａ₁と共に２０分間インキュベーションし、ＰＰ２Ａ₁を不活性化するためにオカダ酸中２μＭにし、次いで、ＧＳＫ３活性についてアッセイする。ＲＡＣの不在下では、実験中ＧＳＫ３は安定して活性である。しかしながら、それ以外では、ＲＡＣ−ＰＫは首尾よくＧＳＫ３活性を阻害し、この不活性化はＰＰ２Ａ₁に対して感受性であって、ＧＳＫ３活性を回復した。インシュリン刺激なしの場合、ウォルトマンニンが存在する場合、または抗ＲＡＣ抗体をペプチド免疫原と共にインキュベーションすることによりＲＡＣ−ＰＫ免疫沈降が混乱する場合は全て、この実験ではＧＳＫ３不活性化はみられない。実施例３カルボキシ末端伸長したＲＡＣのキナーゼドメインが他のタンパク質と相互作用できるかどうかを測定するために、そのドメインをＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメインに融合させ、実施例１に従い、酵母レポーター株ＨＦ７c中のＧＡＬ４転写活性化ドメインに融合させたヒーラーcＤＮＡライブラリーをスクリーニングした。要約すると、ＲＡＣαのアミノ酸１４７−４８０を発現ベクターｐＧＥＸ− ２Ｔにおいてフレーム内でＧＳＴに融合させる（実施例１参照）。次いで、Ｐst Ｉ−ＢamＨＩおよびＥcoＲＩ−ＸbaＩリンカーを用いて適当なＢamＨＩ−ＥcoＲＩフラグメントを酵母ベクターpＰＣ６２（Ｄ．ナザン博士）のＰstＩ−ＸbaＩ部位にてサブクローニングして、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン−ＲＡＣキナーゼおよびＣ末端ドメイン融合物を作る。それから、ＸhoＩ−ＸbaＩフラグメントをｐＧＢＴ９（Clontech）にてサブクローニングする。ヒーラーＳ３ MATCHMAKE R cＤＮＡライブラリーを前述のように使用する。一次形質転換体１.５×１０⁶のスクリーニングにおいて、Ｈis栄養要求性およびＬacＺ活性のレポーターを活性化することにより、カルボキシ末端伸長したＲＡＣのキナーゼドメインとの特異的相互作用を示す７つのコロニーを同定する。クローンが相互作用するＲＡＣ−ＰＫの特定領域についての詳細な分析は、その相互作用を与えるのに必要なのはカルボキシ末端６９アミノ酸のみであることを示している。そこで、我々はこの分子をカルボキシ末端結合タンパク質（Carbox y-Terminal Binding Protein）ＣＴＢＰと示す。どのクローンもキナーゼドメイン単独とは相互作用を示さない。この相互作用は全長ＲＡＣ−ＰＫ構築物を含むカルボキシ末端伸長した全ての構築物で見られ、このことは、相互作用がＲＡＣ −ＰＫ分子の他の領域では阻害されないことを示している。興味深いことに、ＲＡＣ−ＰＫのＣ末端ドメインはインシュリン活性化に応答してリン酸化され、これは、ＣＴＢＰがインシュリン作用のモデュレーターとしての役割を持つことを示唆するものである。７つの特異的相互作用クローンは全て、３'末端に〜３００ntのＡＬＵ反復配列を持つ長さ１.３kbの同一のcＤＮＡ挿入物を含有する（配列番号１）。ＡＬＵ反復配列なしのcＤＮＡ配列を用いるＦＡＳＴＡプログラム（GCG Package）でのジーン−ＥＭＢＬヌクレオチドデータベース研究からは、有意な相同性はなんら同定されていない。ＣＴＢＰ cＤＮＡのアミノ酸配列を推定すると、アラニン（２１％）とアルギニン（２１％）に富む短い４７残基のポリペプチドである。ＲＩＰ、スイス−Protと、ＦＡＳＴＡ（GCG Package）を用いるＧＰタンパク質データベースおよびＴＦＡＳＴＡ（GCG Package）を用いるジーン−ＥＭＢＬヌクレオチドデータベースの研究からは、ＣＴＢＰタンパク質配列との相同性はなんら明らかになっていない。同定されたＣＴＢＰの配列は、完全なＣＴＢＰ分子の３’末端を表していると考えられる。新規タンパク質ＣＴＢＰがＲＡＣ−ＰＫと直接相互作用するかどうかを試験するために、実施例１に記載のように、ＧＳＴ融合物を用いるインビトロ結合アッセイシステムを採用する。このアッセイでは、バキュロウイルスシステムにて製造した全長ＲＡＣとＧＳＴ−ＣＴＢＰとは特異的相互作用するが、ＧＳＴ単独とは相互作用しないことが分かる。この相互作用がインビボで起こるかどうかを試験するために、実施例１に記載のようにＧＳＴ−ＣＴＢＰ融合タンパク質とＭＣＦ−７細胞抽出物を用いるプルーダウンアッセイを採用する。ここでは、ＭＣＦ−７ＲＡＣαとＧＳＴ−ＣＴＢＰとは特異的結合するが、ＧＳＴ単独とは結合しないことが分かる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｑ 1/48 Ｃ１２Ｑ 1/48 ＺＧ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｚ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＵ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．薬物として使用するためのＲＡＣプロテインキナーゼまたは、ウォルトマンニンおよびバナジウム酸塩を除く、そのモデュレーター。２．細胞増殖異常の処置に使用する組成物の製造における、ＲＡＣプロテインキナーゼまたは、ウォルトマンニンを除く、そのモデュレーターの使用。３．インシュリン応答異常を伴う疾患の処置に使用する組成物の製造における、ＲＡＣプロテインキナーゼまたは、バナジウム酸塩を除く、そのモデュレーターの使用。４．疾患がグリコーゲン代謝異常を伴うものである、請求の範囲第３項記載の使用。５．（ａ）ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントをスクリーニングする化合物と共にインキュベーションし、（ｂ）その化合物とＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントとの相互作用を検出する、工程からなる、インシュリン媒介細胞内シグナル形成の潜在的モデュレーターをスクリーニングする方法。６．ＲＡＣ−ＰＫフラグメントがＰＨドメイン、触媒ドメインおよびＣ末端ドメインから選択される、請求の範囲第５項に記載の方法。７．請求の範囲第５項に記載の方法により同定された、インシュリン媒介細胞内シグナル形成のモデュレーター。８．ＩＭＰＤＨ、ＧＳＫ３および配列番号１によって部分的に表されるポリペプチドからなる群から選択される、請求の範囲第７項に記載のモデュレーター。９．スクリーニングにおけるＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメント。 10．ＲＡＣまたはそのフラグメント、ＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントをスクリーニングする化合物と共にインキュベーションする手段、およびＲＡＣ−ＰＫまたはそのフラグメントと化合物との相互作用を検出する手段、を含むキット。 11．変異Ｔ３０８−＞ＤおよびＳ４７３−＞Ｄの一方または両方を起こすことにより活性化される、ＲＡＣ−ＰＫ。 12．請求の範囲第５項に記載の方法に使用するための請求の範囲第１１項に記載の活性化されたＲＡＣ−ＰＫ。