JP2000500968A - Ｃｒｆ類縁体およびｃｒｆレセプターの光親和性標識におけるそれらの使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は光活性化可能成分と標識を持つＣＲＦまたはその類縁体、ＣＲＦレセプターおよびＣＲＦ結合タンパク質の検出ならびにその結合部位の同定におけるそれらの使用に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＲＦ類縁体およびＣＲＦレセプターの光親和性標識におけるそれらの使用 本発明は光活性化可能成分と標識（ラベル）とを保持するＣＲＦまたはその類 縁体、ならびにＣＲＦレセプタータンパク質およびＣＲＦ結合タンパク質の検出 とその結合部位の同定および特徴づけにおけるそれらの使用に関する。 副腎皮質剌激ホルモン放出因子（ＣＲＦ）は、ＣＮＳ内のストレスに対する内 分泌反応、自律神経反応、免疫反応および行動反応を統合しているようである。 この41アミノ酸からなるポリペプチド（1）は、当初、副腎皮質からの糖質コル チコイドの分泌を剌激することが知られている副腎皮質剌激ホルモン（ＡＣＴＨ ）（2）の放出を剌激するというその下垂体剌激活性に基づいて特徴づけられた 。ＣＲＦが視床下部-下垂体-副腎（ＨＰＡ）軸の主な制御因子であり、ストレス にさらされた時に糖質コルチコイドの放出をもたらすことは、広く認められてい る。 内分泌、自律神経および免疫系におけるＣＲＦの様々な機能は、種々のレセプ タータンパク質によって媒介される。これらレセプターの多くは研究され、ＣＲ Ｆファミリーのいくつかの相同体が、その結合親和力と生物効力について調べら れている。 ＣＲＦはＧタンパク質共役レセプターを介してその活性を発揮する。主として 下垂体と脳内に認められるＣＲＦレセプター１型（ＣＲＦＲ１）は、ヒト、マウ スおよびラットの脳ならびにヒトクッシング副腎皮質剌激細胞腫から独立してク ローン化されている（３−６）。ＣＲＦレセプター２型の２つのスプライス変種 （ＣＲＦＲ２ａとＣＲＦＲ２ｂ）をコードするｃＤＮＡは、脳、心臓および骨格 筋からクローン化された（７−１０）。最近、天然に存在するＣＲＦ類縁体ウロ コルチン（urocortin; Ucn）は、ＣＲＦＲ２の内因性リガンドであると提唱され ている（１１）。 ＣＲＦ受容体とは別に、３７kＤaのＣＲＦ結合タンパク質が特徴づけられてい る。ＣＲＦＲ１やＣＲＦＲ２の既知のスプライス変種のいずれとも相同でないこ のタンパク質は、ヒト／ラットＣＲＦ（ｈ／ｒＣＲＦ）に高い親和力で結合する が、ヒツジＣＲＦ（ｏＣＲＦ）には高い親和力で結合しないことが示されている （１２）。ｈ／ｒＣＲＦに基づくアミノ酸配列を持つ極めて強力なＣＲＦ拮抗薬 アストレッシン（astressin）、シクロ（３０−３３）［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38 ,Ｇlu³⁰，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１２−４１）、はＣＲＦＲ１に対してｈ／ ｒＣＲＦと同様の結合親和力を示すが、ＣＲＦ結合タンパク質には結合しなかっ た（１３）。試験管内下垂体細胞培養アッセイでアストレッシンがＣＲＦ媒介性 ＡＣＴＨ放出を阻害する生物効力は、ｈ／ｒＣＲＦのアミノ酸５〜３６から伸び る、αヘリックスと推定されるぺプチド部分の末端に組込まれたラクタム橋によ るものとされた （１３，１４）。意外なことに、それと同じラクタム橋モチー フをぺプチドに導入しても、ｈ／ｒＣＲＦが下垂体細胞のＡＣＴＨ分泌を剌激す る効力は有意に増大しなかった。したがって、ＣＲＦレセプター活性化と分子全 体のαらせん性の誘導は、ＣＲＦのＮ−末端によるものと考えられた（１３）。 最近、ｒＣＲＦＲ１とラット成長ホルモン放出因子レセプター（ｒＧＲＦＲ）の キメラレセプターを一時的に発現させるＣＯＳＭ６細胞を用いた結合試験で、ｒ ＣＲＦＲ１のＮ末端（ｒＣＲＦＲ_N）に対するアストレッシンの高親和性結合が 示された。ＣＲＦぺプチド作用薬ｈ／ｒＣＲＦとウロコルチンがｒＣＲＦＲ_N／ ｒＧＲＦＲに結合すると、やはりｃＡＭＰ生産が起こるが、その程度はｒＣＲＦ Ｒ１のＣＲＦ剌激より低かった（１５）。別の７回膜貫通型Ｇタンパク質共役レ セプターの特徴づけに関する研究では、部位特異的突然変異導入法により、性腺 剌激ホルモン放出ホルモンの作用薬結合と拮抗薬結合の結合部位が異なることが 明示された（１６）。 ＣＲＦが重要な機能を数多く持つことから、ＣＲＦのそのレセプターに対する 作用薬および拮抗薬結合をより詳しく調べるためには、ＣＲＦ結合に直接関与す るアミノ酸配列を同定すると共に、ＣＲＦレセプターとＣＲＦ結合タンパク質が リガンドと結合した後にたどる細胞生物学的運命を、高い親和力でＣＲＦを結合 するタンパク質に共有結合した標識として役立つＣＲＦ類縁体を用いて研究する ことが有益だろう。 ［¹²⁵Ｉ］Ｔyr⁰ｏＣＲＦによる化学的架橋は、その架橋効率が極めて低く、し かも架橋後の化学的および酵素的切断によって、標識が架橋されたＣＲＦレセプ ターから除去されるので、実際の結合部位を特徴づけるには適さないことがわか っている。 ウシ下垂体前葉膜（１７）、ＡｔＴ−２０マウス下垂体腫瘍細胞（１８）、ラ ットの脳および下垂体前葉（１９，２０）の膜に二官能性試薬を適用することに より、５８,０００〜７５,０００の範囲の分子量を持ついくつかのＣＲＦレセプ ター架橋体が特徴づけられている。しかし、現在までに報告されているＣＲＦ架 橋体はすべて、極めて低収率（＜１％）でしか得られなかった。 単官能性光親和性プローブによる標識は、二官能性試薬を用いる化学的架橋法 による標識より高い収率を与えると期待される。また光活性化は、カルベンやナ イトレンのように反応性の高い分子種を、照射により温和な条件下で選択的に生 成することができるので、熱的活性化よりも優れていると思われる。生成したカ ルベンやナイトレンは、Ｘ−Ｈ結合中に挿入できるので、化学的な親和性標識（ アフィニティーラベル）に対しては通常不活性な基を攻撃することができる。 光親和性標識（フォトアフィニティーラベル；ＰＡＬ）技術を用いるすべての 実験にとって必要な条件は、光活性化可能なリガンドが高い親和力でレセプター に結合し、しかも、そのレセプターがその標識の活性化に使用する光によって破 壊または不活化されないことである（２１，２２）。最近、温和な条件での光化 学分解が可能な新しい種類の光活性化可能化合物アリールジアジリン（aryldiaz irine）類が開発された。 したがって、本発明の根底にある技術的課題は、レセプターに効率よく高い親 和力で結合し、そのレセプターの不可逆的な標識をもたらすＣＲＦまたはその類 縁体を提供することである。 この技術的課題に対する解答は、請求の範囲に特徴づける態様によって与えら れる。 したがって、本発明は、光活性化可能成分と標識とを保持するＣＲＦまたはそ の類縁体を提供する。 この場合、「類縁体」という用語は、ＣＲＦリガンド結合活性を保持するＣＲ Ｆの任意の変種または断片を包含する。 特定の態様では、その光活性化可能成分と標識が互いに隣接する。 光活性化可能成分は、好ましくは、光親和性標識を温和な条件下に適当な波長 で行ないうるような性質を持つべきである。光活性化可能成分の例は、４−（１ −アジ−２，２，２−トリフルロエチル）べンゾイル残基またはそのフェニルア ラニン類縁体である。 標識は、例えば¹²⁵Iなどの放射活性マーカーや、フルオレセインなどの蛍光マ ーカー、あるいは蛍光基を持つアビジンと相互作用するビオチンによるものであ ってもよい。 本発明の好ましい態様は、ＣＲＦ作用薬４−（１−アジ−２,２,２−トリフル オロエチル）べンゾイルー［¹²⁵Ｉ］−チロシン⁰ｏＣＲＦ（化合物３）と、アス トレッシンのアミノ酸配列に基づくＣＲＦ拮抗薬であって、４−（１−アジ−２ ，２，２−トリフルオロエチル）−ベンゾイル（ＡＴＢ）残基と、特異的放射標 識に適したヒスチジンまたはチロシンとを持つもの、例えばＡＴＢ−シクロ（３ ０−３３）［¹²⁵Ｉ−Ｈis¹³，Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲ Ｆ−（１３−４１）（化合物６）やＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38 ，Ｇlu³⁰，¹²⁵Ｉ−Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物７ ）である。 本発明化合物の合成は、光活性可能成分（例えばＡＴＢ）をＣＲＦまたはＣＲ Ｆ類縁体に結合し、次に標識（例えばヨウ素化）することによって、行なうこと ができる。 例えば、４−（１−アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）安息香酸をシクロ （３０−３３）［Ｎle^21,38， Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１ ３−４１）とシクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38,Ｇlu³⁰,Ｔyr³²,Ｌys³³］ｈ／ｒ ＣＲＦ−（１３−４１）に結合することによって、化合物４と化合物５を合成す る。ジアジリン基はテトラキストリフェニルホスフィンパラジウム（０）に対し て感受性であると思われるので（２３）、ぺプチドのＮ−末端にフェニル ジアジリンを結合する前に樹脂上でぺプチドの環化を行なう。次に、ヒスチジン¹³ またはチロシン³²を¹²⁵Ｉでヨウ素化することにより、それぞれ８２ＴＢｑ／m molの比活性を持つ化合物６と化合物７を得る。 本発明の好ましい態様では、［¹²⁵Ｉ］Ｔyr⁰ｏＣＲＦ類縁体が、リガンド結合 を最も妨害しないと考えられるそのＮ−末端（２，２４，２５） に、４−（１ −アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）ベンゾイル残基を持つ。光活性化可能 部分がその分子中の放射活性トレーサーのすぐ近くにあれば、光親和性標識実験 後のぺプチド断片の同定と精製が容易になる。この新しいＣＲＦ類縁体によって 、ＣＲＦＲ１遺伝子で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞に 、約７５kＤaの分子量を持つＣＲＦ−Ｒ１が検出された。 本発明の化合物は、ＣＲＦレセプターとＣＲＦ結合タンパク質の検出、および それらタンパク質の結合部位の同定に使用することができる。本発明の光親和性 標識技術は、光活性化可能リガンドの照射によって寿命の短い分子種が生成し、 それが高収率でそのレセプターと不可逆的に結合するので、レセプター分子内の リガンド結合部位を同定する場合、化学的な架橋法より有利である。その標識に よって同定される親和性標識されたレセプターポリペプチドは安定であるので、 例えばＨＰＬＣなどによってさらに精製することができる。次に、それを切断し て断片化し、アミノ酸配列分析によってその結合部位を同定することができる。図面の簡単な説明 図１ 資料（２６）による光活性化可能なジアジリン１と、それをＴyr⁰ｏＣ ＲＦ１−４１に結合して２およびその¹²⁵ヨウ素化類縁体３を得る合成経路。 図２ （Ａ）形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合した［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣ ＲＦの、ｏＣＲＦ（●）またはヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）による置換。デー タは、代表的実験における各点３つの値の平均である。（挿入図）ｏＣＲＦ（● ）とヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）の結合に関するスキャッチャードプロット。 （Ｂ） ｏＣＲＦ（●）とヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）による、形質移入Ｈ ＥＫ２９３細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の剌激。データは代表的実験におけ る各点３つの値の平均である。誤差線はＳＥＭを表わし、記号のサイズより小さ い場合は示していない。図３ ｏＣＲＦ（●）、ヒツジ・フォトＣＲＦ２（□）、および１００ｎＭ組 換えヒト［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38］ＣＲＦ−（１２−４１）存在下のヒツジ・ フォトＣＲＦ２（×）による、Ｙ７９細胞における細胞内ｃＡＭＰ蓄積の剌激。 データは代表的実験における各点２つの値の平均±ＳＥＭ値（線）である。 図４ ＨＥＫ２９３細胞膜ホモジネートに対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ ３の光親和性架橋。レーン１〜５はｒＣＲＦＲ１をコードするｃＤＮＡで安定に トランスフェクションされた細胞の抽出物。レーン６〜７は非形質移入ＨＥＫ２ ９３細胞の抽出物。放射活性ヒツジ・フォトＣＲＦを、ｏＣＲＦの不在下（レー ン１、５または６）、または１００ｎＭ（レーン２）、１μＭ（レーン３）、１ ０μＭ（レーン４とレーン７）ｏＣＲＦもしくは１μＭ血管作用性小腸ぺプチド （レーン５）の存在下に結合させた。５０μgの全膜タンパク質を約１００,００ ０ｃｐｍのヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦで標識し、２０００単位のＰＮＧaseの存 在下（レーン９）または不在下（レーン８）に保温した（３７℃，３０分）。 図５（Ａ） ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ３で共有結合的に標識し、ＲＰＨＰ ＬＣで精製した膜成分の放射活性を示す図。（Ｂ）プールした画分を７.５％ゲ ルでのＳＤＳ／ＰＡＧＥにかけた。化合物 ２ と化合物 ３ を用いる作用薬結合試験Ａ．予備実験 ＣＲＦＲ１形質移入ＨＥＫ２９３細胞膜での３による光親和性標識実験を最適 化するために、１のジアジリン官能基を使って予備実験を行なった。光分解は１ ００ｓの半減期で進行し、１２分後にはすべてのジアジリンがそのカルベンまた はジアゾ原子価異性体に変換された（８０％カルベン原子価異性体、２０％ジア ゾ原子価異性体（２６））。この光分解は、５つの１５ワットランプを装着した ＵＶ Stratalinker（Stratagene社）を用いて３６０ｎｍの波長で行い、ＵＶ分 光光度計（Beckman ＤＵ６５０分光器，フラートン）でモニターした。ラン プから１４ｃｍの距離で、 １は、１次速度論的に半減期１００秒（４℃）で光 分解された（ｃ＝１ｍＭ（エタノール中），Ｖ＝３８０μＬ，１mＬ石英キュベ ット）。３を膜と共に様々な時間保温した後、光分解し、その光産物をＳＤＳ／ ＰＡＧＥで分析したところ、同じ結果が得られた。 Ｂ．結合およびｃＡＭＰアッセイ ヒツジ・フォトＣＲＦ２の結合親和力と生物効力を決定するために、ｒＣＲＦ Ｒ１をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクションしたＨＥＫ２９３細胞 から永久細胞系を樹立した。次の実験では、ＨＥＫ細胞クローンのプールを使用 した。個々のＨＥＫ細胞クローンを用いて得られる結合結果は、細胞クローンプ ールを用いた結合実験の結果と有意に異ならなかった。スキャッチャード分析か ら、ｏＣＲＦが高親和性部位に７.８±６.３ｎＭのＫ_d値で結合し、低親和性部 位に１３７±９０ｎＭのＫ_d値で結合したことがわかった。Ｂ_max値はそれぞれ３ ０ｆmol／μgタンパク質と３４７ｆmol／μgタンパク質であり、発現効率が高い ことを示した。［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦを置換するヒツジ・フォトＣＲＦ２に ついても、同様のＫ_d値５.６±２.６ｎＭ（Ｂ_max＝１２ｆmol／μgタンパク質） が認められた。スキャッチャード分析は、ヒツジ・フォトＣＲＦが高親和性部位 にのみ結合することを示した（図２Ａ）。ｏＣＲＦまたはヒツジ・フォトＣＲＦ を形質移入ＨＥＫ２９３細胞に適用すると、ｃＡＭＰの蓄積が用量依存的に刺激 された。ｏＣＲＦとフォトＣＲＦのＥＣ₅₀値は、それぞれ０．５±０．２ｎＭと ０.４±０．１ｎＭであった（図２Ｂ）。非形質移入細胞は有意な結合またはｃ ＡＭＰ蓄積を示さなかった。この観察結果は光親和性標識実験でも確認された。 ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦ３は非形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合しなか った（図４参照）。内因性の機能的なＣＲＦレセプター（２７）を持つことが知 られているヒトＹ７９網膜芽腫細胞から得た膜調製物を用いる実験では、ｏＣＲ Ｆまたはヒツジ・フォトＣＲＦ２について２ｎＭ（Ｂ_max＝０．１９ｆmol／μg タンパク質）のＫ_d値が認められた。Ｙ７９細胞では、いずれのＣＲＦ類縁体に ついても、高親和性部位のみが検出された。ヒツジ・フォトＣＲＦとｏＣＲＦは 、Ｙ７９細胞におけるｃＡＭＰ蓄積を、それぞれ２.３±０.５ｎＭおよび １．３±０.６ｎＭのＥＣ₅₀値で剌激した（図３）。これらの結合およびｃＡＭ ＰデータをＡＮＯＶＡプログラムで統計的に分析したところ、ｏＣＲＦとフォト ＣＲＦのＫ_dおよびＥＣ₅₀に有意差がないことがわかった。ヒツジ・フォトＣＲ Ｆの剌激作用の特異性は、このぺプチドの剌激効力が、特異的ＣＲＦ拮抗薬であ る組換えヒト［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38］ＣＲＦ−（１２−４１）の存在下で低 下したという観察結果によって、さらに立証された。この拮抗薬に関する見かけ 上の阻害定数（Ｋ_i）は１０.３±５.０ｎＭだった（図３）。 Ｃ．光親和性標識実験 このレセプターの標識はＢＳＡによって妨害されることがわかっているので（ １７，２８）、新たに調製したトレーサー３を担体タンパク質を一切含まない状 態で保存し、ＢＳＡを含まない緩衝溶液中で光親和性標識実験を行なった。ｒＣ ＲＦＲ1で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の膜とヒツジ^{1 25} Ｉ−フォトＣＲＦ３の混合物を３６０ｎｍで照射した後、ＳＤＳ／ＰＡＧＥを 行なうことにより、７５kＤaの架橋体が同定された（図４）。３６０ｎｍでの照 射を行なわない場合、架橋体は認められなかった。市販の［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣ ＲＦと酒石酸ジスクシンイミジルを用いて、７５kＤaタンパク質を化学的架橋実 験で標識した。当該レセプターに対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦの結合は、 １μＭ ｏＣＲＦの添加によって効率よく阻害できたが、１μＭ血管作用性小腸 ぺプチドでは阻害されず、その結果は、想定されるこの光プローブの特異性と合 致した。上述のように、非形質移入ＨＥＫ２９３膜に対するヒツジ¹²⁵Ｉ−フォ トＣＲＦの光親和性架橋は検出されなかった。７５kＤaタンパク質架橋体をＰＮ Ｇaseで脱グリコシル化すると、４６kＤaタンパク質の生成が、ＳＤＳ／ＰＡＧ Ｅで検出された（図４）。 分離用の光親和性標識実験では、ヒツジ¹²⁵Ｉ−フォトＣＲＦに架橋した膜タ ンパク質をＲＰＨＰＬＣで精製した。ＳＤＳ／ＰＡＧＥ分析により、空隙容量後 に溶出した放射活性画分が、７５kＤa ＣＲＦＲ１タンパク質架橋体を含むこと がわかった（図５）。この架橋操作の収率を計算するために、標識されたレセプ ターを、出発物質として使用したＨＥＫ細胞膜に特異的に結合したヒツジ¹²⁵Ｉ −フォトＣＲＦの放射活性によって分割した。これによれば、収率は少なくとも ２０〜３０％と推定された。化合物 ４ 〜 ７ を用いる拮抗薬結合試験 Ａ．結合およびｃＡＭＰアッセイ 光活性化可能なＣＲＦ拮抗薬４および５の結合親和力と生物効力を測定するた めに、ｒＣＲＦＲ１をコードするｃＤＮＡで安定にトランスフェクションされた ＨＥＫ２９３細胞系と、内因性ＣＲＦレセプター（ＣＲＦＲ１）を発現させるヒ トＹ７９網膜芽腫細胞系を使用した。その結果を表Ｉに示す。スキャッチャード 分析は、Ｙ７９細胞の膜ホモジネートに対するｏＣＲＦの高および低親和性結合 （Ｋ_d1＝１．１±０．７ｎＭ；Ｋ_d2＝１．１±１．３μＭ）と、アストレッシン の高および低親和性結合（Ｋ_d1＝０.９±１.０ｎＭ；K_d2＝１.６±１.６μＭ） を示した。化合物４はアストレッシンと同様の結合特性を示した（Ｋ_d1＝０．６ ±０．５ｎＭ；Ｋ_d2＝３.４±２.２μＭ）。化合物５はこの細胞系のＣＲＦＲ１ に対して低い結合親和力を示した（Ｋ_d1＝２６±２３ｎＭ）。ｏＣＲＦ）アスト レッシン、化合物４、化合物５を形質移入ＨＥＫ２９３細胞の膜ホモジネートに 結合させた場合にも同様の結果が得られ、そのＫ_d値はそれぞれ３.３±０.５ｎ Ｍ、７.７±２.６ｎＭ、３.２±２.７ｎＭ、１２±３．６ｎＭだった。この細胞 系ではｏＣＲＦだけが、低親和性部位に対して、Ｋ_d値１４７±７８ｎＭの結合 を示した。Ｙ７９細胞とＨＥＫ２９３細胞にｏＣＲＦを適用するとｃＡＭＰの蓄 積が容量依存的に剌激され、そのＥＣ₅₀値はそれぞれ３．８±２．６ｎＭと０． ４±０．１ｎＭだった。ヒツジＣＲＦによって刺激されるｃＡＭＰ生産は、Ｙ７ ９細胞で、５ｎＭ拮抗薬の存在下に効率よく阻害できた。アストレッシン、化合 物４、化合物５に関して測定された阻害定数（Ｋ_i）は、それぞれ０．５±０． ３ｎＭ、１．０±０．３ｎＭ）６．０±２．８ｎＭだった。形質移入ＨＥＫ２９ ３細胞におけるｏＣＲＦ剌激性ｃＡＭＰ蓄積を１００ｎＭ ＣＲＦ拮抗薬の存在 下で阻害した場合にも、同様の結果が得られた。アストレッシン、化合物４、化 合物５について、１０１±９２ｎＭ、５１±５２ｎＭ、４９７±７２ｎＭのＫ_i 値を得た。形質移入ＨＥＫ２９３細胞における高親和性レセプ ターの発現量（ｏＣＲＦ： Ｂ_max1＝１６±５ｆｍｏｌ／μg;Ｂ_max2＝１９７± １５ｆmol／μg）はＹ７９細胞（oＣＲＦ：B_max1＝0．３±０．３ｆmol／μg;B_{m ax2} ＝３５±５７ｆmol／μg）より５０倍高いので、ＨＥＫ２９３でｏＣＲＦ剌 激性ｃＡＭＰ生産の有意な減少を観察するには、より高用量のＣＲＦ拮抗薬を適 用する必要があった。非形質移入細胞は有意な結合またはｃＡＭＰ蓄積を示さな かった。この観察結果は光親和性標識実験でも確認された。化合物７は非形質移 入ＨＥＫ２９３細胞の膜に結合しなかった。上記結合およびｃＡＭＰデータをＡ ＮＯＶＡプログラムで統計的に分析したところ、アストレッシンと化合物のＫ_d およびＫ_iには有意差がないことがわかった。どちらのぺプチドも、形質移入Ｈ ＥＫ２９３細胞とＹ７９細胞内でｃＡＭＰを生産させるというｏＣＲＦの剌激効 力を減少させる効力が高かった。しかし化合物５は、両細胞系におけるｃＡＭＰ 生産を阻害する効力が、アストレッシンまたは化合物４と比較して５〜１０倍低 く、ＣＲＦＲ１に対するその結合親和力が弱いことと合致した。 Ｂ．光親和性標識実験 上述のように、新たに調製したトレーサー７を担体タンパク質を含まない状態 で保存し、ＢＳＡを含まない緩衝溶液中で光親和性標識実験を行なった。ｒＣＲ ＦＲ１で持続的にトランスフェクションされたＨＥＫ２９３細胞の膜と化合物７ の混合物を３６０ｎｍで照射した後、ＳＤＳ ＰＡＧＥを行なうことにより、６ ６kＤaの架橋体が同定された。３６０ｎｍで光活性化しない場合、架橋体は認め られなかった。レセプターに対する化合物７の結合は、１μＭ ＡＴＢ−シクロ （３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（３１ −４１）（化合物５）の添加によって効率よく阻害できたが、１μＭ血管作用性 小腸ぺプチド（ＶＩＰ）では阻害されず、その結果は、想定されるこの光プロー ブの特異性と合致した。上述のように、非形質移入ＨＥＫ２９３膜に対する化合 物７の光親和性架橋は検出されなかった。６６kＤaタンパク質架橋体をＰＮＧas eで脱グリコシル化すると、３８kＤaタンパク質の生成がＳＤＳ ＰＡＧＥで検出 された。 したがって本発明の化合物は、様々な組識膜中のレセプターまたはＣＲＦ結合 タンパク質の特異的不可逆的標識と追跡、ならびに、２、 ４または５の蛍光類 縁体を用いた細胞学的研究（例えば細胞選別、レセプター内部移行、輸送に関す る研究）に使用することができる。 下記実施例により本発明を説明する。実施例１ ４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）安息香酸（１）の合成 暗所で、４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）べンジルアルコ ール４２０ｍg（１．９mmol： ４−ブロモベンジルアルコールから出発して７ 段階合成で総合収率４４％）（２６） をジオキサン１．４ｍLと０．２Ｎ Ｋ ＯＨ水溶液１２ｍLに溶解した。次に、ＫＭnＯ₄（４６２ｍg；２．９mmol）を少 しずつ加え、その混合物を周囲温度で２時間攪拌した。沈澱したＭｎＯ₂を濾過 によって除去し、メタノールで数回洗浄し、合わせた濾液を減圧下に濃縮した。 残ったアルカリ溶液をエーテルで抽出し、１Ｎ Ｈ₂ＳＯ₄水溶液でｐＨ２〜３に 酸性化し、再びエーテルで抽出した。その有機相を中性になるまで水で洗浄し、 無水Ｎa₂ＳＯ₄で乾燥し、溶媒を減圧下に留去した。生成物をヘキサンから結晶 化し、２３０ｍgの１（１．Ommol；５３％）を得た：融点１２３〜１２５℃,発 泡（Ｎ₂）と共に分解；¹Ｈ−ＮＭＲ（ＣＤＣl，ＴＭＳ） ７．７２（ＡＡＢＢ ，４Ｈ，Ａｒ−Ｈ）；¹³Ｃ−ＮＭＲ（ＣＤＣl¹³，ＴＭＳ） ２８．４６（ｍ,Ｊ ＝４１Ｈｚ），１２１．８５（ｍ，Ｊ＝２７４Ｈｚ），１２６．４９（ｍ，Ｊ＝ １．３Ｈｚ），１３０．３２（ｍ，Ｊ＝２．９Ｈｚ），１３０．５４（ｓ）,１ ３４．７８（ｓ），１７０．８１（ｓ)；¹⁹Ｆ−ＮＭＲ（ＤＭＳＯ−ｄ₆,ＣＦＣl₃ ） −６４．００；ＵＶ（エタノール）λ（ε） ３４８ｎｍ（２４８）； ＭＳ ｍ／ｚ（相対強度） ２２９（１００，［Ｍ−Ｈ］⁺），２０１（２１， ［Ｍ−Ｎ₂］⁺），１５７（５１），１３７（８）； ＨＲＭＳ 計算値（Ｃ₉Ｈ₅ Ｎ₂Ｆ₃Ｏ₂として） ２２９．０２４９，実測値 ２２９．０２２８。実施例２ ４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイルーチロシン⁰ｏ ＣＲＦ １−４１（２）の合成 暗所で、ＮＭＰ ０．２ｍL中の１ （２６ｇ，０．１１mmol）を、０．２ｍL の０．４５Ｍ ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ（ＤＭＦ中）（６分）と０．１ｍLの２ＭＤ ＩＥＡ（ＮＭＰ中）（２分）で活性化した。８３ｍgのぺプチド樹脂（TentaGeｌ Ｓ ＲＡＭ樹脂上の７．００μｍｏｌ 側鎖保護［Tyr⁰］ｏＣＲＦ １−４１； 容量０．２２mmo1／ｇ）を加え、その混合物を１５分間反応させた。その樹脂を 濾過し、０．５ｍLのＮＭＰで３回洗浄し、７５０μLの切断混合液（結晶性フェ ノール７５μg，ＥＤＴ ２５μL，チオアニソール５０ｐLとｄＨ₂Ｏ ５０μL， ＴＦＡ １ｍL）に加え、１．４時間攪拌した。その樹脂を濾過し、ぺプチドを２ ０ｍLの氷冷エーテル中で沈澱させた。濾過した後、その粗製ぺプチドをＴＦＡ ２ｍLと０．１％ＴＦＡ／水中の２０％ＭｅＣＮ５０ｍLに溶解し、凍結乾燥した 。３８ｍgの粗生成物のうち２８ｍgを調製用逆相ＨＰＬＣで精製し、２．７ｍg の２（０．５４μｍｏｌ，１４％）を得た：ＥＳＩＭＳ計算値５０４５．７；実 測値５０４５．１。分析用ＲＰ−ＨＰＬＣは、溶媒Ａ：０．１％ＴＦＡ／水と溶 媒Ｂ：８０％ＭｅＣＮ−０．１％ＴＦＡ／水を用い、１ｍL／分の流速で、４０ ％Ｂを５分間の後、２５分間で４０−９０％Ｂの条件下に、Ｖｙｄａｃ Ｃ₁₈シ リカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ ）で行なった。Ｒ_t＝１９．６２分。実施例３ ４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）ベンゾイルー［¹²⁵Ｉ］− チロシン⁰ｏＣＲＦ １−４１（３）の合成 文献（２９）の方法にわずかな変更を加えて、２をヨウ素化した。０．０１Ｎ ＨＯＡｃに溶解した２の１００μＭ溶液４μLが入ったチューブに、次の試薬を 一定の順序で加えた：０．５Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．４） １０μL、約２０ ＭＢｑの¹²⁵Ｉ（ＩＭＳ ３０，Amersham社，英国）、０．０５Ｍリン酸緩衝液５ μL中のクロラミンＴ１２．５μg。１５秒後に０．５Ｍリン酸緩衝液１００μL 中のＢＳＡ １０ｍgと０．０５Ｍリン酸緩衝液中のＫＩ １ｍgを加えることに より、反応を停止した。その混合物を、ＭｅＯＨ ５ｍLと０．１％ ＴＦＡ／水 ５ｍLで順次濡らしておいたBond ElutＣ₁₈カートリッジ（Varian Associates 社）にピペットで移した。ヨウ素化されたぺプチドを遊離のヨウ素およびＢＳＡ から分離するために、そのカラムにｄＨ₂Ｏ ５ｍLを流し、次に０．１％ ＴＦ Ａ／水５ｍLを流した。次に、０．１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ中の８０％ ＭｅＣＮ５ｍ Lを添加することにより、ヨウ素化ぺプチドをカラムから溶出した。そのぺプチ ド画分の体積をSpeed Vac（Christ）で約２００μLに減らし、Vydac Ｃ₁₈シリカ ゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎｍ）に 載せ、溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ／水）と溶媒Ｂ（８０％ＭｅＣＮ−０．１％Ｔ ＦＡ／水）を用いて１ｍL／分の流速で溶出した。溶出は、４５％ Ｂで５分間 の後、２５分間の４０−９５％ Ｂで行なった。３の保持時間はＲ_t＝１７．３ ６分だった。液体シンチレーターフローセルを装着したBeckman１７１放射性同 位体検出器を使用した。ぺプチドの比活性：８２ＴＢｑ／mmol。放射活性のピー ク試験管をプールし、β−メルカプトエタノールを０．５Ｍの最終濃度で加えた 。ヨウ素化トレーサー３（図１）を小分けして−２０℃で保存し、通例２ヶ月間 、結合アッセイと光親和性標識実験に使用した。実施例４ ヒツジＣＲＦ、シクロ（３０−３３）［Ｄ−Ｐhe¹²，Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｌys^{3 3} ］ｈ／ｒＣＲＦ−（１２−４１）（アストレッシン）、ＡＴＢ−シクロ（３０ −３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａla³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１ ）（化合物４）、ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ｔyr³², Lys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物５）の合成 TentaGel Ｓ ＲＡＭ樹脂でのＦｍｏｃ化学（０．１ミリモルスケール，Ｒａｐ ｐ社，ドイツ連邦共和国チュービンゲン）を用いて、モデルＡＢＩ ４３３Ａぺ プチド合成装置（Applied Biosystems社）でＣＲＦぺプチドを合成した。ぺプ チドを樹脂から切断した後、その粗製ぺプチドを、０．１％トリフルオロ酢酸（ ＴＦＡ）水溶液とＭｅＣＮの混合液を用いてWaters Prep Nova-Pak ＨＲ Ｃ₁₈シ リカゲルカラム（５×３０ｃｍ，粒子サイズ６μｍ，ポアサイズ６ｎｍ）で調製 用逆相ＨＰＬＣ（ＲＰＨＰＬＣ）を行なうことにより、精製した。精製したぺプ チドの質量スペクトルは、Micromass AutoSpec−Ｔタンデム質量分析計でＥＳＩ （エ レクトロスプレーイオン）ＭＳにより測定した。 環化ＣＲＦ類縁体の合成には、アミノ酸誘導体Ｆｍｏｃ−Ｇlu（ＯＡｌ）−Ｏ ＨとＦｍｏｃ−Ｌys（Ａｌｏｃ）−ＯＨ（PerSeptive Biosystems社，ドイツ連 邦共和国ハンブルグ）を使用した。側鎖保護ぺプチドを、ＨＯＡｃ／Ｎ−メチル アニリン／ジクロロメタン（ｖ／ｖ； ２：１：４０）中でＰｄ⁰［ＰＰｈ₃］₄ と３時間反応させた後、ＤＭＦ中のＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとＮＭＰ中のＤＩＥＡで ８時間環化した。Ｎ末端Ｆｍｏｃ基をＮＭＰ中のピペリジンで除去した後、４− （１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル）安息香酸を、暗所で、ＤＭＦ中 のＨＯＢｔ／ＨＢＴＵとＮＭＰ中のＤＩＥＡを用いて、ぺプチド樹脂のＮ末端に 結合した。次に、ぺプチドを樹脂から切断し、調製用ＲＰＨＰＬＣで精製した。 精製したＣＲＦぺプチドを、溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ−水）と溶媒Ｂ（８０％ ＭｅＣＮ−０．１％ ＴＦＡ−水）を用いて、１ｍL／分の流速で、Vydac Ｃ_{1 8} シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ ｎｍ）での分析用ＲＰＨＰＬＣにかけた。試料は、５％ Ｂで５分間溶出させた 後、３０分間にわたる５−９５％ Ｂの直線勾配で溶出させた。（ｏＣＲＦ： ＥＳＩ ＭＳ 計算値４６７０．４，実測値４６６９．２，Ｒ_t＝２５．９分； アストレッシン： ＥＳＩ ＭＳ 計算値３５６５．１，実測値３５６３．１， Ｒ_t＝２４．８分;４： ＥＳＩ ＭＳ 計算値３５６２．１，実測値３５６１． １，Ｒ_t＝３０．２分；５： ＥＳＩ ＭＳ 計算値３５６４．２，実測値３６ ５３．７，Ｒ_t＝２９．６分）。 ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［¹²⁵Ｉ−Ｈis¹³,Ｎle^21,38,Ｇlu³⁰,Ａla³²,Ｌys³³ ］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）（化合物６）およびＡＴＢ−シクロ（３０− ３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，¹²⁵Ｉ−Ｔyr³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３− ４１）（化合物７） 化合物６と化合物７を既述の如くヨウ素化した（２９，３０）。ぺプチドをBo nd E1ut Ｃ₁₈カートリッジ（Analytichem社，米国カリフォルニア州ハーバーシ ティ）で部分精製した後、溶媒Ａ（０．１％ ＴＦＡ−水）と溶媒Ｂ（８０％ ＭｅＣＮ−０．１％ ＴＦＡ−水）を用いて、流速１ｍL／分で、Vydac Ｃ₁₈ シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ，ポアサイズ３０ｎ ｍ）でのＲＰＨＰＬＣを行なうことにより、精製した。試料は、４５％Ｂで５分 間溶出させた後、２５分間にわたる４５−９５％ Ｂの直線勾配で溶出させた（ ６ ：Ｒ_t＝２１．９分； ７ ：Ｒ_t＝２０．４分）。液体シンチレーションフ ローセルを装着したBeckman１７１放射性同位体検出器（Beckman社，米国カリフ ォルニア州フラートン）を用いて、放射活性をモニターした。ぺプチドの比活性 は８２ＴＢｑ／mmolだった。実施例５ ＨＥＫ２９３細胞のトランスフェクション １０％ウシ胎児血清（Sigma社，米国ミズーリ州セントルイス，カタログ番号 Ｆ−７５２４）を添加し、４ｍＭ Ｌ−グルタミン（GIBC0 BRL社，カタログ番号 ０４３−０５０３０）、０．４５％グルコースの最終濃度にしたダルベッコ改良 イーグル培地（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ社，米国メリーランド州ゲーサーズバーグ， カタログ番号０４１−０１８８５Ｍ）中で、ヒト胚腎細胞２９３（Graham，Smil ey，RussellおよびNaim，1977）（ソーク研究所（ラホーヤ）のC．Stevens博士 とG．Sharmaから入手）を生育した。それを既述の如く維持した（３１）。ラッ トＣＲＦＲ１遺伝子断片（１２８４ｂｐ，ＢamＨＩ，ＥcＩＩ２６ＩＩ断片）を ベクターｐｃＤＮＡ３（Invitrogen社，米国カリフォルニア州サンディエゴ）に サブクローニングした。その組換えプラスミド（ｐＣＤＮＡ３−ｒＣＲＦ₁）を 単離し、Qiagenプラスミド調製システム（Qiagen社，ドイツ・ヒルデン）で精製 した。連結部位をＤＮＡ配列分析によって確認した。 カルシウム／ＢＢＳトランスフェクション法（３２） を用いて、ＨＥＫ２９ ３細胞をｐＣＤＮＡ３−ｒＣＲＦ−Ｒ１でトランスフェクションした。トランス フェクションの１６時間後に、培地を除去し、選択培地（６００μg／ｍLジェネ テシン／培地）に置換した。細胞をコンフルエントまで生育し、１：２に分割し て、さらに選択した。選択条件下で１〜２週間の生育後は、すべての細胞がジェ ネテシン耐性であり、正常に生育した。実施例６ 粗製膜の調製 実施例５に従って得た細胞を細胞培養フラスコから細胞スクレーパーで氷冷Ｐ ＢＳ緩衝液中に掻き出した。その細胞を１５０ｇ、４℃で１０分間沈降させ、１ ×ＰＢＳ緩衝液に再懸濁し、再び遠心分離した。上清を完全に除去し、細胞ぺレ ットの湿重量を測定した。その細胞を、細胞１ｇあたり３ｍLのＣＲＦ膜緩衝液 （５０ｍＭ Ｔｒｉｓ／Ｃl，５ｍＭ ＭｇＣl₂，２ｍＭ ＥＧＴＡ，５００μL トラシルオール（Trasylol；ＦＢＡ，米国ニューヨーク），１mＭ ＤＴＴ，ｐＨ ７．４）に懸濁し、中サイズのポリトロン装置（出力レベル５）で１０ストロー ク（各２秒）の処理を行なった。冷却下に６００ｇで５分間、核を沈降させた。 上清をパスツールピペットで注意深く取り出し、氷上に集めた。同じポリトロン 処理を用いて、ぺレットを同量の膜緩衝液で再抽出した。その懸濁液から再び核 を上述のように沈降させた。合わせた上清を１０,０００ｇで１５分間遠心分離 することにより、膜を沈降させた。そのぺレットを、細胞１ｇあたり３ｍLの貯 蔵緩衝液（２０％グリセロールを含む膜緩衝液）に、ガラステフロンホモジナイ ザーで１０ストロークすることによって再懸濁した。その懸濁液のうち２μLと ４μLを用いて、マイクロＢＣＡアッセイ（Pierce社，米国ロックフォード）を 行い、総タンパク質濃度を見積もった（約２．５μg／μL）。膜を液体窒素で凍 結し、使用するまで−７０℃で保存した。実施例７ ｏＣＲＦ、アストレッシン、化合物２、４および５を用いる結合アッセイ 保温緩衝液（ＢＳＡを１ｍｇ／ｍLとなるように添加した膜緩衝液）２００ｐL 中のぺプチド（ｃ＝０〜１μＭ）と１００,０００ｃｐｍまたは２００,０００ｃ ｐｍの［¹²⁵Ｉ−Ｔyr⁰］ｏＣＲＦを含むチューブに、２５μgのタンパク質（Ｈ ＥＫ２９３細胞）または１００μgのタンパク質（Ｙ７９細胞）を含む膜懸濁液 １００μLを加えた。保温（１時間，２３℃）後、膜緩衝液（１ｍL）を加えた。 １４，０００×ｇで遠心分離（４℃，５分）した後、ぺレットを膜緩衝液１ｍL で２回洗浄した。放射活性を１４７０ WIZARD自動ガンマカウンター（Berthold 社，ハノーバー）で測定した。データ分析は、非線形カーブフィッティングプロ グラムＬＩＧＡＮＤで行なった。実施例８ ａ）３を用いた光親和性標識実験 光親和性標識実験は、使用した保温緩衝液がＢＳＡを含まないことを除いて、 原則的に上述と同じ方法で行なった。一連の濃度のｏＣＲＦ（０、１００ｎＭ、 １μＭ、１０μＭ）またはＶＩＰ（１μＭ）と１チューブあたり１８０，０００ ｃｐｍの３に、形質移入細胞または非形質移入細胞のＨＥＫ２９３膜ホモジネー ト（７５μgタンパク質／チューブ）を加え、表記の時間、保温した。光分解の 前にぺレットを３回洗浄し、緩衝液３００μLに再懸濁し、３６０ｎｍで３０分 間照射した（４℃，ランプから距離８ｃｍ）。光分解後、緩衝液１ｍLを加え、 そのぺレットを１５，０００ｒｐｍで５分間遠心した。そのぺレットをｄＨ₂Ｏ １５μLと２×ＳＤＳ １５μLに再懸濁し、１００℃で５分間加熱した。その試 料を７．５％ＳＤＳゲルでの電気泳動にかけ、FujixＢＡＳ２０００スキャナー （Raytest社）を用いてＢＡＳ−ＩＰ ＮＰ ２０４０Ｐイメージングプレート上 でオートラジオグラフィーを行なった。市販マーカー（ＳＤＳ−ＰＡＧＥハイレ ンジマーカー，BioRad）と比較したゲル移動度から、見かけ上の分子量を見積も った。ゲルの考証はプログラムＴＩＮＡ（シュトラウベンハルト）とＷＩＮＣＡ Ｍ（Cybertech社）で行なった。 ｂ）化合物２を用いた光親和性標識実験 ＢＳＡを使用しない点以外は結合アッセイと同様にして、光親和性標識実験を 行なった。試料（２５μｇタンパク質／チューブ）をリガンドと共に保温（１時 間，２３℃）した後、３６０ｎｍで３０分間照射（４℃，ランプからの距離８ｃ ｍ）した。いくつかの実験では、光標識されたレセプターをＰＮＧase（New Eng land Biolabs社，シュヴァルバッハ）で脱グリコシル化した。次に、試料を加熱 （１００℃，５分）し、ＳＤＳ ＰＡＧＥにかけた。オートラジオグラフィーは ＢＡＳ−ＩＰ ＮＰ ２０４０Ｐイメージングプレートで行なった。Fujix ＢＡ Ｓ２０００スキャナー（Raytest社，シュトラウベンハルト）を用いて放射活性 をモニターした。ゲルの考証はＴＩＮＡプログラム（Raytest社）で行なった。実施例９ ｃＡＭＰ剌激 ＨＥＫ２９３細胞とヒトＹ７９網膜芽腫細胞（American Type Cell Culture, ロックヴィル）を、それぞれ１ｍＭまたは５ｍＭ ３−イソブチル−１−メチル キサンチンの存在下に種々のＣＲＦ類縁体と保温した（３７℃，３０分）。Ｙ７ ９細胞の保温培地には、さらに１ｍg／ｍL ＢＳＡと０．０５ｍg／ｍLアスコル ビン酸を追加した。化合物２または光活性化可能なアストレッシン類縁体を使用 する場合は、すべての実験を暗所で行なった。培地を除去した後、細胞を６％ト リクロロ酢酸水溶液で溶解した（１００℃，５分）。細胞溶解液は、ＲＩＡキッ ト（Amersham社，リトルチャルフォント）でアッセイするまで、−７０℃で保存 した。データ分析はシグモイド用量応答曲線フィッティングプログラムＡＬＬＦ ＩＴで行なった。一方向分散分析により、群間の統計的有意性を決定した。実施例１０ ７５kＤaタンパク質架橋体の精製と特徴づけ 膜タンパク質（２５０μg）を１．１×１０⁷ｃｐｍの３（２．８２mmol）で標 識した。その試料の１０分の１を５０％ギ酸／エタノール溶液（１００μL）に 溶解し、Vydac Ｃ₄シリカゲルカラム（０．４６×２５ｃｍ，粒子サイズ５μｍ ，ポアサイズ３０ｎｍ）によるＲＰＨＰＬＣにかけた。溶出は、０．５％トリフ ルオロ酢酸水溶液とエタノールの混合液で行なった。 資 料 1） Spiess,J.,Rivier,J.,Rivier,C.およびVale,W.(1981)Proc.Natl.Acad．Sci ．USA 78，6517-6521. 2） Vale,W.,Spiess,J.,Rivier,C.およびRivier,J．(1981)Science 213,1394-13 97. 3） Vita，N.,Laurent，P.，Lefort，S.，Chalon,P.,Lelias，J.-M.，Kaghad,M. ,Le Fur,G.,Caput,D.およびFerrara,P．(1993),FEBS Lett.335，1-5. 4） Chen,R.,Lewis,K.A.,Perrin,M.H.およびVale,W．(1993)Proc．Natl.Acad．S ci．USA 90，8967-8971. 5） Perrin,M.H.,Donaldson，C．J.,Chen,R.,Lewis,K.A.およびVale，W.(1993)E ndocrinology 133，3058-3061. 6） Chang,C.P.,Pearse II,R.V.,0'Connell,S.およびRosenfeld，M．G.(1993)Ne uron 11，1187-1195. 7） Lovenberg，T．W.，Liaw，C．W.，Grigoriadis，D．E.，Clevenger 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───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (72)発明者 ケップケ，アンドレアス ドイツ連邦共和国デー−37176ネルテン− ハルデンベルク、クラッペンベルクヴェー ク８番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．光活性化可能成分と標識を持つＣＲＦまたはその類縁体。 ２．光活性化可能成分と標識が互いに隣接している請求項１のＣＲＦまたは類 縁体。 ３．光活性化可能成分が４−（１−アジ−２，２，２−トリフルオロエチル） ベンゾイル残基である請求項１または２のＣＲＦまたは類縁体。 ４．標識が放射活性マーカーである請求項１〜３いずれかのＣＲＦまたは類縁 体。 ５．標識が¹²⁵Ｉである請求項４のＣＲＦまたは類縁体。 ６．標識が蛍光マーカーである請求項１〜３いずれかのＣＲＦまたは類縁体。 ７．４−（１−アジ−２,２,２−トリフルオロエチル）べンゾイルー［¹²⁵Ｉ ］−チロシン⁰ｏＣＲＦである請求項１〜５いずれかのＣＲＦまたは類縁体。 ８．ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［¹²⁵Ｉ−Ｈis¹³，Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，Ａ la³²，Ｌys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）である請求項１〜５いずれかのＣ ＲＦまたは類縁体。 ９．ＡＴＢ−シクロ（３０−３３）［Ｎle^21,38，Ｇlu³⁰，¹²⁵Ｉ−Ｔyr³²，Ｌ ys³³］ｈ／ｒＣＲＦ−（１３−４１）である請求項１〜５いずれかのＣＲＦまた は類縁体。 １０．ＣＲＦレセプターとＣＲＦ結合タンパク質を検出するための請求項１〜 ９いずれかのＣＲＦまたはその類縁体の使用。 １１．ＣＲＦレセプターまたはＣＲＦ結合タンパク質の結合部位を同定するた めの請求項１〜９いずれかのＣＲＦまたはその類縁体の使用。 １２．該レセプタータンパク質が組識膜中に検出される請求項１０または１１ の使用。 １３．該レセプタータンパク質がＨＥＫ２９３細胞の膜中に検出される請求項 １０〜１２いずれかの使用。 １４．該ＣＲＦレセプタータンパク質が６６または７５kＤaの分子量を持つ請 求項１０〜１３いずれかの使用。 １５．ＣＲＦレセプタータンパク質の精製法であって、そのタンパク質を含有 する膜調製物を請求項１〜９いずれかのＣＲＦまたはその類縁体と反応させ、光 分解を行い、得られた生成物をＨＰＬＣで精製することからなる方法。 １６．ＣＲＦレセプターまたはＣＲＦ結合タンパク質の結合部位を特徴づける 方法であって、そのＣＲＦ結合タンパク質またはＣＲＦレセプターを請求項１５ の方法で精製し、その精製産物を断片化し、関連する断片のアミノ酸配列を決定 することからなる方法。 １７．請求項１６の方法によってその結合部位が同定されたＣＲＦレセプター またはＣＲＦ結合タンパク質。