JP2000501282A

JP2000501282A - 微生物の保存方法

Info

Publication number: JP2000501282A
Application number: JP9516410A
Authority: JP
Inventors: ニュー，ロジャー，ランダル，チャールズ; ハート，チャールズ，アンソニー
Original assignee: コーテックス（ユーケー）リミテッド
Priority date: 1995-10-25
Filing date: 1996-10-25
Publication date: 2000-02-08
Also published as: CN1202829A; ZA969015B; EP0857069A1; NZ320446A; CA2235495A1; KR19990067029A; NO981865L; NO981865D0; AU7318396A; AU714485B2; GB9521806D0; BR9610932A; WO1997015331A1

Abstract

(57)【要約】感染能を維持するような、ウィルスなどの微生物の保存方法、および例えばワクチンを調製する際の上記方法の使用が提供される。

Description

【発明の詳細な説明】微生物の保存方法本発明は、微生物がその感染能を維持するような微生物の保存方法に関するものである。特に、本発明は、ウィルス粒子の保存方法に関するものである。貯蔵／生育可能性の問題は微生物の貯蔵に関連して生じる。特に、ウィルス粒子が以下などの用途を目的として使用されるウィルスの貯蔵に関連して問題が生じる：（ａ）例えば、遺伝子治療に使用されるウィルスベクター；（ｂ）例えば、培養物バンク(culture bank)の、一般的な研究の発達を目的とするウィルスの貯蔵；（ｃ）農業での害虫の制御を目的として環境中に放出するのに使用されるウィルス；および（ｄ）ワクチン。ウィルス粒子からなるワクチンは、長年の間使用されてきた。しかしながら、このようなワクチンは、ウィルス成分がその感染能を失わずに、場合によっては長期間、貯蔵できることが必須である。一般的な貯蔵方法としては、凍結または凍結肝臓が挙げられ、後者は一般的に後の段階で水を使用した再構築を伴う。残念なことに、ウィルスによっては、上記プロセスにかけると生育可能性／感染能の減少を示すものがある。上記したように適切に貯蔵されないウィルスとしては、ポリオウィルスがある。このウィルスは、水性懸濁液中で室温で容易に分解し、０℃で２週間しか安定せず、凍結乾燥によって破壊される。上記特定のウィルスでは、好ましい貯蔵方法としては、−７０℃で凍結するかまたは４℃で冷却することが挙げられる。しかしながら、このような貯蔵条件は、熱帯の国々や必要とされる設備や備品が不足するような国々で使用するのには特に適当でない。国際出願番号ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２４９５号には、疎水性相に可溶化される親水性物質からなる組成物、およびその調製方法が開示される。また、英国出願番号９４２４９０１．８号には、疎水性相における親水性物質の保持を補助する成分をさらに含ませるＰＣＴ／ＧＢ９４／０２４９５号に記載されるのと同様の組成物が開示される。さらに、英国出願番号９４２４９０２．６号には、組成物の形成を補助する部分を導入するＰＣＴ／ＧＢ９４／０２４９５号に記載されるのと同様の組成物が開示される。加えて、英国出願番号９４２２９９０．３号には、疎水性相中に可溶化され、懸濁されまたは分散される免疫原からなる免疫原性組成物が開示される。この免疫原はウィルスであってもよく、また上記組成物はワクチンとして有用である。微生物、特にポリオウィルス粒子等のウィルス粒子は、水性培地内で再構築された後に感染能を維持しつつ、周囲温度での長期間の貯蔵に適した形態に変換されることが発見された。したがって、このような組成物は、一般的な貯蔵方法があまり適当でない国で特に好ましく使用され、このようなウィルスを極度に凍結あるいは長期間冷却することを必要とせずに輸送及び貯蔵できる効果的な手段を提供する。したがって、第一の概念によると、本発明は、以下の段階からなる、感染能を維持するような微生物の貯蔵方法を提供するものである：（ｉ）微生物を両親媒性物質(amphiphile)と結合させ；および（ｉｉ）疎水性相中に微生物を可溶化、懸濁または分散する。好ましい実施態様によると、上記微生物はウィルス粒子、特にポリオウィルス粒子である。上記方法を行うための適当な方法としては、ＰＣＴ／ＧＢ９４／０２４９５号、ＵＫ９４２４９０１．８号、ＵＫ９４２４９０２．６号及びＵＫ９４２２９９０．３号に記載される方法がある。疎水性溶媒は、例えば、長鎖の脂肪酸、中鎖の脂肪酸、枝分れ鎖のアルコール、モノグリセリド、ジグリセリド、中鎖のトリグリセリド、長鎖のトリグリセリド、これらのハロゲン化（例えば、フッ素化）類似体、またはポリオキシエチレン含有脂質である。好ましい実施態様によると、疎水性溶媒は、モノ−、ジ−若しくはトリ−グリセリド、またはオレイン酸である。好ましい実施態様によると、上記方法は以下からなる：（ｉ）液状媒体中に微生物を両親媒性物質と一緒に分散し；（ｉｉ）液状媒体を除去して、微生物に配向する親水性へッド基(head grou p)を有する両親媒性分子のアレイを残し；および（ｉｉｉ）微生物／両親媒性物質アレイ周辺に非水性溶媒を提供する。上記液状媒体は水であってもよく、例えば、凍結乾燥、遠心真空乾燥または他の適当な方法によって、除去できる。好ましくは、上記方法において、両親媒性物質は、リン脂質であり、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリンまたはヘキサデシルホスホコリン等のこれらのうちのーの誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーなどの、ホスファチジルコリンヘッド基を有するものである。胆汁酸、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性スルフェート、べタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルランＣ２４（Solulan C24）、ポリオキシエチレン４０ステアレート(polyoxye thylene４０ stearate）、ツィーンシリーズの界面活性剤の一種、スパン(Span) シリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされた（pegolated:ポリエチレングリコール部分の付加によって修飾された）ヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５(Cremaphor EL35)。以下に限定されることを意図するものではないが、上記方法において、微生物、例えば、ウィルス粒子は、まず両親媒性分子とアレイを形成すると考えられる。次に、このアレイは順番に疎水性溶媒で被覆される。このようにして、水による微生物への接近が制限されるが、これは微生物調製物が凍結乾燥状態から再構築される際の貯蔵特性が向上されることを説明するものである。第二の概念によると、本発明は、以下の段階からなる、感染能を維持するような微生物の貯蔵方法を提供するものである：（ｉ）水相において微生物を両親媒性物質(amphiphile)と結合させ；および（ｉｉ）水を除去する。好ましくは、水は凍結乾燥によって除去される。両親媒性物質は、リン脂質であってもよく、例えば、ホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリンまたはへキサデシルホスホコリン等のこれらのうちの一の誘導体またはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーなどの、ホスファチジルコリンヘッド基を有するものである。胆汁酸、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性スルフェート、べタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルランＣ２４(Solulan C24 )、ポリオキシエチレン４０ステアレート(polyoxyethylene 40 stearate)、ツイーンシリーズの界面活性剤の一種、スパン(Span)シリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされた（pegolated:ポリエチレングリコール部分の付加によって修飾された）ヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５(Cremaphor EL35)。上記概念の特に好ましい実施態様によると、両親媒性物質は、ソルランＣ２４ (Solulan C24)、ポリオキシエチレン４０ステアレート（polyoxyethylene 40 st earate）、ツィーンシリーズの界面活性剤の一種、スパン(Span)シリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされた（pegolated:ポリエチレングリコール部分の付加によって修飾された）ヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５(Cremaphor EL35)である。特に好ましい実施態様によると、両親媒性物質は、ソルランＣ２４（Solulan C24）またはポリオキシエチレン４０ステアレート（p olyoxyethylene 40 stearate）である。水を除去すると、両親媒性物質／微生物のアレイは「開放(open)」形態を有することが可能である。したがって、再構築時には、水は依然として微生物に接近しており、これにより感染能が失われるであろう。したがって、本発明の上記概念の他の好ましい実施態様によると、上記方法はまた、水の除去後に混合物の温度を上昇する段階を含む。これにより、確実に両親媒性物質／微生物のアレイによってとられた構造がより凝縮し、さらにこれにより再構築時に水に対する接近がより制限される。加熱段階を使用する際には、両親媒性物質は水の除去後に固体を維持するものであってもよく、例えば、レシチン、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性スルフェート、べタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルランＣ２４(Solulan C24)、ポリオキシエチレン４０ステアレート(polyoxyethylene 40 s tearate)、ツイーンシリーズの界面活性剤の一種、スパン(Span)シリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされた（pegolated:ポリエチレングリコール部分の付加によって修飾された）ヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５（Cremaphor EL35)などの、リン脂質から選択できる。他の概念によると、本発明は、以下を提供するものである：ｉ）上記方法のいずれかによって得られる微生物組成物、特にウィルス粒子、例えばポリオウィルス粒子からなる微生物組成物；およびｉｉ）ウィルス粒子の貯蔵を目的とする本発明の組成物の使用。本発明の各概念の好ましい態様は、必要であれば変更を加えて(mutatis mutan dis)、各他の概念と同様である。本発明を下記実施例を参照しながら説明するが、本発明は下記実施例によって何等制限されるものではない。実施例１１ｍｌの培養液当たり１０⁹個のポリオウィルス粒子（セービン株(Sabin stra in)、タイプ１、２、３）の懸濁液を蒸留水で１０００倍に希釈した。この希釈された懸濁液１ｍｌを１ｍｌの蒸留水における超音波処理された大豆のリン脂質の分散液（１００ｍｇ／ｍｌの濃度）と混合した。リン脂質は加えずにウィルスのみを含ませた、コントロールのバイアル瓶を調製した。双方のバイアル瓶の内容物を液体窒素中でシェルフリーズし(shell-freeze)、一晩凍結乾燥した。翌日、１ｍｌのオレイン酸をウィルス及びリン脂質を含むバイアル瓶に添加した後、このバイアル瓶の内容物を数時間ローラーミキサーで混合した。透明な溶液が得られた。ポリオウィルスのコントロールのバイアル瓶を上記と同様にして調製した。ウィルスのみを含む、このコントロールのバイアル瓶に、１ｍｌの培養液を添加した。１０μｌの油／ウィルス調製物を新たなバイアル瓶に移し、１ｍｌの２％ウシ胆汁抽出物（主にタウロコール酸ナトリウムを含む）溶液を添加した。この混合物を、水相中に粒子を放出する目的で、よく振盪して、水中に油を分散させた。一連の１０倍希釈液を培養液で作製し、０．５ｍｌの各希釈液をビロ細胞(Viro cell)の密集した単層に添加し、４日間インキュベートし、無傷のウィルスの存在について試験した。同様の方法をコントロールのバイアル瓶の内容物にも行った。成長を、各単層におけるウィルスにより誘導された細胞の溶解を目視で観察することによって評価した。成長は、以下のようにして２連の希釈液で記録した：これらの結果から、本発明の方法は、凍結乾燥単独に比べて、明らかに貯蔵されるウィルス調製物の生育可能性を向上することが示される。実施例２５×１０⁸個粒子／ｍｌを含むウィルス懸濁液（遠心して混入するタンパク質を除去）（セービン株(Sabin strain)、タイプ１、２、３）を、２００μｌの懸濁液を９．９ｍｌの蒸留水に添加することにより５０倍に希釈して、５×１０⁷ 個粒子／ｍｌの濃度を得た。この懸濁液を２．５ｍｌの４個の等容のアリコートに分け、７ｍｌのねじ込キャップ付きのガラス製バイアル瓶中に分散した。１アリコートを本実験に使用し、２アリコートを実施例３に記載される実験に使用した。２．５ｍｌの超音波処理されたリン脂質の分散液（１００ｍｇ／ｍ１）を、緩やかに混合しながら希釈ウィルス粒子のアリコートに加えた。この混合液２００ μｌを２０個の凍結乾燥用バイアル瓶中に分散し、残りを、１００μｌのアリコートとして、「乾燥前」コントロールとして他のチューブに移した。コントロールは、＋４℃で一晩貯蔵された。凍結乾燥用バイアル瓶を凍結乾燥器の遠心ローター中に置き、一晩凍結乾燥した。翌日、１００μｌの培養液を、一晩凍結乾燥されたバイアル瓶１０本の内容物に加え、他の１０本には１００μｌのオレイン酸（イギリス薬局方(B.P.)）を添加した。それぞれの群を「Ｍ」及び「Ｏ］と記した。「Ｍ」と記した２本のチューブのサンプル１０μｌを新たな１ｍｌのバイアル瓶に移して、２５ｍｇ／ｍｌタウロコール酸ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸塩溶液１ｍｌを添加し、よく混合した。上記条件下で、油をよく分散させて、透明な溶液を得た。サンプルの４×２０μｌのアリコートを、＋４℃で一晩貯蔵された乾燥前コントロール群から新たな１ｍｌのバイアル瓶に移した。これらのバイアル瓶のうちの２本に１ｍｌの培地を加え、他の２本には２５ｍｇ／ｍｌタウロコール酸ナトリウムを含む０．１Ｍ重炭酸塩溶液１ｍｌを添加した。各バイアル瓶の内容物をよく混合した。上記のようにして調製された懸濁液を用いて、存在するポリオウィルスの生育可能性を測定するために、べロ細胞(Vero cell)の単層培養液で１０倍希釈を行った。結果は、５０％の細胞障害効果が観察される最大の希釈率として表した。実施例３２．５ｍｌの蒸留水を実施例２で調製されたウィルス粒子の１アリコートに添加し、この群を「Ｗ」と記した。２．５ｍｌのソルランＣ２４(Solulan C24) （１００ｍｇ／ｍｌ）を他のアリコートに加え、ゆるやかに混合した。この群を「Ｓ」と記した。２００μｌの各調製物を１０本の凍結乾燥用バイアル瓶中に分散し、残りを、１００μｌのアリコートとして、「乾燥前」コントロールとして他のチューブに移した。コントロールは、＋４℃で一晩貯蔵された。凍結乾燥用バイアル瓶を凍結乾燥器の遠心ローター中に置き、一晩凍結乾燥した。翌日、１００μの培養液を、「Ｗ」群の各バイアル瓶に添加し、ゆるやかに混合した。「Ｓ」群のバイアル瓶は、密閉し、５秒間、湯浴中で６０℃に加熱してソルランＣ２４(Solulan C24)を溶融したところ、透明な溶液が得られた。室温に冷却すると、この材料は固化した。９０μｌの培地を「Ｓ」群のバイアル瓶に添加し、全容積を１００μｌとした。次に、１０μｌのサンプルを「Ｓ」及び「Ｗ」群の各バイアル瓶から新たな１ｍｌのバイアル瓶に移して、１ｍｌの培地をそれぞれに加えて、よく混合した。新たな１ｍｌのバイアル瓶に、乾燥前群のそれぞれのバイアル瓶のサンプルの４×２０μｌを添加し、１ｍｌの培地をそれぞれに加えた。各バイアル瓶の内容物をよく混合した。上記のようにして調製された懸濁液を用いて、べ口細胞(Vero cell)培養液で１０倍希釈を行い、存在するポリオウィルスの生育可能性を測定した。結果は、５０％の細胞障害効果が観察される最大の希釈率として表した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ハート，チャールズ，アンソニーイギリス国，リバプールエル69 ３ビーエックス，デパートメントオブメディカルミクロバイオロジーアンドゲニト−ウリナリーメディシン，ザユニバーシティオブリバプール

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の段階からなる、感染能を維持するような微生物の貯蔵方法：（ｉ）微生物を両親媒性物質と結合させ；および（ｉｉ）疎水性相中に微生物を可溶化、懸濁または分散する。２．該微生物がウィルス粒子である、請求の範囲第１項に記載の方法。３．該ウィルス粒子がポリオウィルス粒子である、請求の範囲第２項に記載の方法。４．該疎水性溶媒が長鎖の脂肪酸、中鎖の脂肪酸、枝分れ鎖のアルコール、モノグリセリド、ジグリセリド、中鎖のトリグリセリド、長鎖のトリグリセリド、これらのハロゲン化（例えば、フッ素化）類似体、またはポリオキシエチレン含有脂質である、請求の範囲第１項から第３項のいずれかに記載の方法。５．該疎水性溶媒がモノ−、ジ−若しくはトリ−グリセリドである、請求の範囲第４項に記載の方法。６．該疎水性溶媒がオレイン酸である、請求の範囲第４項に記載の方法。７．以下からなる、請求の範囲第１項から第６項のいずれかに記載の方法：（ｉ）液状媒体中で微生物を両親媒性物質と結合し；（ｉｉ）液状媒体を除去して、微生物に配向する親水性へッド基を有する両親媒性分子のアレイを残し；および（ｉｉｉ）微生物／両親媒性物質アレイ周辺に疎水性溶媒を提供する。８．該両親媒性物質がリン脂質、胆汁酸塩、胆汁酸、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性スルフェート、べタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルランＣ２４、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ツィーンシリーズの界面活性剤の一種、スパンシリーズの界面活性剤の一種またはぺゴレイトされたヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５である、請求の範囲第１項から第７項のいずれかに記載の方法。９．該両親媒性物質がホスファチジルコリン（ＰＣ）、リゾホスファチジルコリン（ｌｙｓｏ−ＰＣ）、スフィンゴミエリン、ヘキサデシルホスホコリンまたはホスホリルコリンを含む両親媒性ポリマーであるリン脂質である、請求の範囲第８項に記載の方法。１０．下記段階からなる、感染能を維持するような微生物の貯蔵方法：（ｉ）水相において微生物を両親媒性物質と結合させ；および（ｉｉ）水を除去する。１１．該水が凍結乾燥によって除去される、請求の範囲第１０項に記載の方法。１２．両親媒性物質及び微生物の混合物が水の除去後に温度を上昇することによって凝縮形態に変換される、請求の範囲第１０項または第１１項に記載の方法。１３．該微生物がウィルス粒子である、請求の範囲第１０項から第１２項のいずれかに記載の方法。１４．該ウィルス粒子がポリオウィルス粒子である、請求の範囲第１３項に記載の方法。１５．該両親媒性物質がリン脂質、糖脂質、ポリオキシエチレン含有界面活性剤、親油性スルフェート、べタイン、サルコシン含有界面活性剤、ソルランＣ２４、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ツィーンシリーズの界面活性剤の一種、スパンシリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされたヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５である、請求の範囲第１０項から第１４項のいずれかに記載の方法。１６．該両親媒性物質がソルランＣ２４、ポリオキシエチレン４０ステアレート、ツィーンシリーズの界面活性剤の一種、スパンシリーズの界面活性剤の一種またはペゴレイトされたヒマシ油誘導体、例えばクレマフォーイーエル３５である、請求の範囲第１５項に記載の方法。１７．該両親媒性物質がポリオキシエチレン４０ステアレートである、請求の範囲第１６項に記載の方法。１８．該両親媒性物質がソルランＣ２４である、請求の範囲第１６項に記載の方法。１９．請求の範囲第１項から第１８項のいずれかに記載の方法によって得られる微生物組成物。２０．ウィルス粒子を含む、請求の範囲第１９項に記載の微生物組成物。２１．ポリオウィルス粒子を含む、請求の範囲第２０項に記載の微生物組成物。２２．ウィルス粒子の貯蔵を目的とする請求の範囲第２０項または第２１項に記載の組成物の使用。２３．被検者の免疫応答を誘導するための請求の範囲第１９項から第２１項のいずれかに記載の組成物の使用。２４．被検者の免疫応答を誘導できる薬剤を調製するための請求の範囲第１９項から第２１項のいずれかに記載の組成物の使用。