JP2000501296A

JP2000501296A - ヘパリン含有量の測定方法

Info

Publication number: JP2000501296A
Application number: JP11505108A
Authority: JP
Inventors: ヴァゲンフォールド，ロベルト，ヨハン; ヘムカー，ヘンドリク，コエンラード
Original assignee: ユニベルシテイトマーストリヒト
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1998-06-26
Publication date: 2000-02-08
Anticipated expiration: 2018-06-26
Also published as: US6140062A; JP3157844B2; NL1006429C2; CA2264274A1; EP0929692A1; WO1999000515A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、下記工程を包含するヘパリン含有量の測定方法に関する：（ａ）既知濃度の発色源性基質（Ｓ）、既知濃度の抗トロンビン（ＡＴ）および未知ヘパリン濃度を有する試料を含有する混合物に、既知量のトロンビン（ＦＩＩａ）または活性化した凝固因子Ｘ（ＦＸａ）を添加する工程、ここでＦＩＩａまたはＦＸａの量は、存在するＳの多くて２０％、好ましくは多くて１０％を、存在するＦＩＩａまたはＦＸａの全部を不活性化するのにＡＴが要する時間中に反応させるように選択する；（ｂ）生じる反応を進行させ、次いで反応完了後に、反応した発色源性基質の最終濃度（［ｐＮＡ］_final）を測定する工程、（ｃ）見出された［ｐＮＡ］_finalを用いて、ＦＩＩａまたはＦＸａとＡＴとの反応の速度定数（Ｋ_dec）を決定する工程：および（ｄ）ヘパリン濃度に対するＫ_decの予め作成された計算曲線から、このようにして見出されたＫ_dec値を用いて、試料中のヘパリン濃度を決定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】ヘパリン含有量の測定方法本発明は、ヘパリン含有量、特に血漿中のヘパリン含有量の測定方法に関する。凝固因子ＸおよびＩＩは、血液凝固メカニズムにおいて重要な役割を演じる。血液凝固メカニズムの内在素と外在素とは、凝固因子Ｘで出会う。活性化した因子Ｘ（ＦＸａ）の影響下に、因子ＩＩ（プロトロンビン）は、活性化され、ＩＩａ（ＦＩＩａまたはトロンビン）を形成する。トロンビンは次いで、フィブリノーゲンのフィブリンへの変換を触媒し、その結果として、血液凝固が実際に生じる。ＦＸａおよびＦＩＩａの両方の重要なインヒビターは、抗トロンビンＩＩＩ（ＡＴ）であり、この蛋白質は、血漿で生じ、また不可逆的様相で複合体の形成を伴い、ＦＸａおよびＦＩＩａを不活性化する。すなわち、ＡＴは、血液凝固を抑制する。ＡＴがＦＸａまたはＦＩＩａと不可逆性複合体を形成する反応速度を増大させることによって、ヘパリンはＡＴの不活性化作用を強化することが知られている。ヘパリンは、２０００から４０，０００以上まで変化する分子量を有する多糖類の混合物である。活性ヘパリンは、２種の相違するタイプの活性分子、すなわち５４００ダルトン以上の分子量を有するヘパリン分子（ＡＣＬＭ）および５４００ダルトンまたはそれ以下の分子量を有するヘパリン分子（ＢＣＬＭ）から構成されていることが知られている。ＡＣＬＭ分子は、抗−ＦＸａ活性および抗− ＦＩＩａ活性の両方を有し、他方、ＢＣＬＭ分子は、抗−ＦＸａ活性のみを有する。この理由で、抗−ＦＩＩａ活性と抗−ＦＸａ活性との間の比は、ヘパリン混合物中の多糖類鎖の分布に依存する。従って、本発明の目的は、中でも、ＡＣＬＭ分子およびＢＣＬＭ分子の総合ヘパリン含有量および個別の含有量を測定することができる方法を提供することにある。試料のヘパリン含有量の測定方法は、公知である。一例として、抗−トロンビン試験、抗−ＦＸａ試験、活性化した部分的トロンボプラスチン時間（ＡＰＴＴ）を測定する試験、およびＦＸａまたはＦＩＩａの分解を測定する各種試験がある。上記諸試験の結果は、多くの場合、血漿試料における無作為の変化により影響される。この理由で、採取された各血漿試料について、ヘパリン標準量に対する計算が必要である。これらの方法において、標準値を用いる試験の結果は、被験試料毎に、同一方法で変化するものと見做される。しかしながら、これは常時、実際には起きない。この重要な原因は、ヘパリンが２つの相違するタイプの活性分子からなるという、上記の事実にある。抗−ＦＩＩａ活性と抗−ＦＸａ活性との間の比は、ヘパリン中の多糖類鎖の分布に依存する。抗凝固作用は、存在する抗−ＦＩＩａ活性の量に依存する。抗−ＦＩＩａ活性対抗−ＦＸａ活性比は、各試料毎に、および各試料標本毎に変化し、またヘパリンのタイプおよび測定が行われた後の時間に依存することから、ＡＣＬＭとＢＣＬＭとを区別しない試験の結果は、試験結果の不正確な解釈を導く。各種試験は、抗−ＦＩＩａ活性と抗 −ＦＸａとの間の比の変化にはほとんど反応せず、患者の血栓形成挙動（ｔｈｒｏｍｂｏｔｉｃｂｅｈａｖｉｏｕｒ）について、結論を引き出すことが困難である。従って、本発明の目的はまた、上記２種のタイプのヘパリン分子を区別することができる、試料中のヘパリン含有量の測定方法にある。さらにまた、ＵＳ５，３０８，７５５には、未知ヘパリン濃度を有する試料を、ＡＴおよび因子Ｘａまたはトロンビン用の基質と混合する、ヘパリン濃度の測定方法が記載されている。次いで、この試料に、当該酵素がＡＴによって不活性化され、また基質の一部が、その濃度を測定することができる生成物に変換される方法で、因子Ｘａまたはトロンビンを添加する。上記刊行物によると、酵素に対して高い親和性を有する基質、例えばＳ２２３８およびＳ２２２２が使用される。この結果として、測定値が最終レベルに達する前に、比較的長い時間を要する。さらに、この方法では、ＡＴによる酵素阻害速度定数を測定することはできず、従ってヘパリンの活性にかかわる結論を引き出すことはできない。従って、本発明の目的はさらにまた、比較的迅速に、また簡単に実施することができ、また絶対的結果を提供する、試料中のヘパリン活性の測定方法を提供することにある。この目的およびその他の目的は、本発明に従い達成される。従って、本発明は、ヘパリン含有量の測定方法に関し、この方法は、下記工程を包含する：（ａ）既知濃度の発色源性基質（Ｓ）、既知濃度の抗トロンビン（ＡＴ）および未知ヘパリン濃度を有する試料を含有する混合物に、既知量のトロンビン（ＦＩＩａ）または活性化した凝固因子Ｘ（ＦＸａ）を添加する工程、ここでＦＩＩａまたはＦＸａの量は、存在するＳの多くて２０％、好ましくは多くて１０％を、存在するＦＩＩａまたはＦＸａの全部を不活性化するのにＡＴが要する時間中に、反応させるように選択されている；（ｂ）生じる反応を進行させ、次いで反応終了後に、反応した発色源性基質の最終濃度（［ｐＮＡ］_final）を測定する工程、（ｃ）見出された［ｐＮＡ］_finalを用いて、下記関係式を使用し、ＦＩＩａまたはＦＸａとＡＴとの反応の速度定数（Ｋ_dec）を決定する工程：（式中、Ｋｍ＝ミカエリス定数＝（Ｋ_cat＋Ｋ_-1）／Ｋ₁ （２）Ｋ_cat＝中間複合体ＦＩＩａ−ＳまたはＦＸａ−Ｓからの生成物ｐＮＡの生成にかかわる速度定数、Ｋ₁＝ＦＩＩａまたはＦＸａおよびＳからの中間複合体ＦＩＩａ−ＳまたはＦＸａ−Ｓの生成にかかわる速度定数、Ｋ_-1＝中間複合体ＦＸａ−ＳまたはＦＩＩａ−ＳのＦＸａまたはＦＩＩaおよびＳへの分解にかかわる速度定数、［Ｓ］＝基質の初期濃度、［ＡＴ］＝ＡＴの初期濃度、および［Ｅ］＝ＦＸａまたはＦＩＩａの初期濃度）、および（ｄ）ヘパリン濃度に対するＫ_decの予め作成された計算曲線から、このようにして見出されたＫ_dec値を用いて、試料中のヘパリン濃度を決定する工程。上記方法は、全体を通して温度をほぼ一定にする。本発明による方法の格別の利点は、終点測定法であること、従って時間−独立性であることにある。これに対して、現在まで知られている方法の多くは、進行中の反応からの一時的記録または一連の一時的記録に基づいている。もう一つの格別の利点は、多くの試料中のヘパリン濃度を、複数個の凹部（一般に、９６個）を有する微量滴定（ｍｉｃｒｏｔｉｔｒｅ）プレートを用いることによって、同時的に測定することができることにある。さらにまた、本発明による方法は、測定を血漿に対して直接行うことができるという格別の利点を有する。この目的のためには、血漿を適当な緩衝液で稀釈するだけでよい。本発明による方法の工程（ａ）において、Ｓ、ＡＴおよび未知ヘパリン濃度を有する試料の混合物に、既知量のＦＩＩａまたはＦＸａを添加する。ＦＩＩａまたはＦＸａを添加した結果として、２つの反応が生じる：ＳのｐＮＡへの変換は、ミカエリス−メンテン速度論に従って進行するものと推測される。このことは、ＳがＦＩＩａ／ＦＸａに対して大過剰に存在しなけれまた、ＡＴとＦＩＩａまたはＦＸａとの反応は、二次元（ｓｅｃｏｎｄｏｒｄｅｒ）プロセスであると推測される。ミカエリス定数Ｋｍは、反応式（４）のために測定される（関係式（２）参照）。「一定」の［Ｓ］を保証するために、存在するＳの多くて２０％のみを、好ましくは多くて１０％のみを変換しなければならない。すでに上記したように、ヘパリンが、一方でＦＸａまたはＦＩＩａと、他方で、ＡＴと、不可逆性複合体を形成する反応速度を実質的に増大させることは知られている。正しい条件が造り出された場合、速度定数Ｋ_decの増大は、ヘパリン濃度の増加に直接比例する。この結果として、Ｋ_decを測定することによって、試料中のヘパリン濃度を測定することができる。正しい速度論的性質を有するかぎり、既知の全部の発色源性基質を、発色源性基質として使用することができる。適当な基質の加水分解中に、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）が通常、遊離される。遊離したｐＮＡの量は、４０５ｎｍの波長で、分光光度測定法により測定することができる。しかしながら、実際に、あまり適当ではない或る種の基質を用いる実施例もある。酵素（すなわち、ＦＩＩａまたはＦＸａ）に対する基質の親和性は、ヘパリン測定に影響する。実際に、この親和性が大きいほど、不可逆性複合体の形成の結果として、ＡＴにより不活性化させる酵素の全部の取り込みに、より長い時間を要する。換言すれば、ＦＩＩａまたはＦＸａに対して大きい親和性を有する発色源性基質を使用することは、反応を完了させるために、反応（３）でより長い時間を要することを意味する。これは、ヘパリン測定がより長い時間を要することを意味する。従って、好ましくは、ＦＩＩａまたはＦＸａに対してあまり大きくない親和性を有する基質が使用される。非常に好適な基質の例には、（メチルスルホニルエチル）オキシカルボニルバリルアルギニンｐ−ニトロアニリド（Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ）およびマロニル−α−アミノイソブチリルアルギニンｐ−ニトロアニリドメチルエステルモノクロライド（ＳＱ６８）がある。従って、好適態様に従う場合、未知ヘパリン濃度を有する試料として、稀釈した血漿を、本発明による方法で使用する。この場合、ヘパリン濃度が計算曲線の中央部分に適応するように、この血漿を稀釈すると好ましい。実施上で、これは、血漿を２０〜１００倍、好ましくは３０〜７５倍に稀釈すべきことを意味する。この結果として、最終試料（すなわち、稀釈した試料）中のヘパリン濃度は通常、０．０５Ｕ／ｍｌよりも多くない。この単位Ｕ／ｍｌ（１ｍｌあたりの単位）は、ヘパリン濃度を表わすための標準単位であり、一般に使用されている。上記単位の意味および測定方法は、ＭｅｒｔｏｎＲ．Ｅ．，ＣｕｒｔｉｓＡ．Ｄ．およびＴｈｏｍａｓＤ．Ｐ．による、「活性化した部分的トロンボプラスチン時間および英国薬局方試験により得られるヘパリン力価推定の比較」（ＡｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｈｅｐａｒｉｎｐｏｔｅｎｃｙｅｓｔｉｍａｔｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙａｃｔｉｖａｔｅｄｐａｒｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｐｌａｓｔｉｎｔｉｍｅａｎｄＢｒｉｔｉｓｈｐｈａｒｍａｃｏｐｏｅｉａｌａｓｓａｙｓ）、Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．，１９８５；５３：１１６〜１１７に記載されている。本方法の工程（ｂ）において、上記反応（３）を優先して進行させる。この反応が完了した時点で、反応（４）はまた、もはや進行しない。通常、反応剤の量は、反応（３）が３０分間以内に完了するように選択するが、より長い反応時間を用いても、均等に良好な結果を得ることもできる。何故に反応時間があまり長くない方が好ましいかの理由は、実用上で許容される時間間隔内に、完全なヘパリン測定を行うことができるべきであるという事実にある。反応（３）を完了まで進行させ、従ってまた、反応（４）を停止させた後に、反応した発色源性基質の最終濃度を測定する。この反応した基質は通常、元の基質の加水分解によって得られ、分光光度測定によって決定することができる。すでに上記したように、発色源性基質は、ＦＩＩａまたはＦＸａにより加水分解され、このプロセスで、ｐ−ニトロアニリド（ｐＮＡ）が遊離される。実際に、ｐＮＡの最終濃度［ｐＮＡ］_finalは、４０５ｎｍの波長における分光光度測定によって、容易に測定することができる。次に、工程（ｃ）において、ＦＩＩａまたはＦＸａとＡＴとの反応の速度定数（Ｋ_dec）を、上記関係式（１）を使用し、このようにして見出された［ｐＮＡ］_finalを用いて決定する。発色源性基質の酵素による加水分解の速度定数Ｋ_cat およびＫｍは、いわゆるラインウィーバー−バークのプロットから決定することができ、これは、基質濃度の逆数（１／［Ｓ］、横軸）を、ｐＮａが形成される速度の逆数（１／ｖ、縦軸）に対してプロットされたものである。この直線は、１／Ｋｍで横軸を横切り、従ってＫｍは容易に決定することができる。この直線は、１／Ｖ_maxで縦軸を横切る。ここで、Ｖ_max＝Ｋ_cat＊［Ｅ］であり、［Ｅ］はＦＩＩａまたはＦＸａの初期濃度である。この図面からＶ_maxを読み取り、次いで既知［ＦＩＩａ］または［ＦＸａ］で割り算することによって、Ｋ_ca _t 値が得られる。これは全て既知である。［Ｓ］、［ＡＴ］および［Ｅ］は既知であるから、１ｎ［ＡＴ］／（［ＡＴ］−［Ｅ］）を計算することができる。上記したように、［ｐＮＡ］_finalは、分光光度測定によって決定することができる。工程（ｄ）において、試料中のヘパリン濃度は、Ｋ_decについて見出された数値を用いて、ヘパリン濃度に対する予め作成されたＫ_decの計算曲線から決定することができる。この計算曲線（すなわち、検量線）は、それ自体公知の方法でプロットすることができる。この計算曲線をプロットする際、試験それ自体に使用される反応剤と同一の反応剤を使用すべきである。この方法で、試験の精度は実際に、最適になる。この計算曲線を、測定されるｐＮＡ濃度がヘパリン濃度に強く依存するようなヘパリン濃度領域でプロットしておくと好ましい。実際に、ＡＴによるＦＩＩａ不活性化のＫ_decの測定は、Ｋ_decが２００，０００（Ｍｓ）^-1 よりも小さい、好ましくは１００，０００（Ｍｓ）^-1よりも小さい場合に、良好な信頼度を有する。ＡＴによるＦＸａ不活性化のＫ_decの測定は、Ｋ_decが１００，０００（Ｍｓ）^-1よりも小さい、好ましくは５０，０００（Ｍｓ）^-1よりも小さい場合に、充分な信頼度をもって見出されている。これらの限界は、ヘパリン測定が良好な結果をもたらす濃度範囲を決定する。標準ヘパリンの場合、抗− ＦＩＩａ試験は、ヘパリン濃度範囲が０〜０．０４Ｕ／ｍｌ）好ましくは０〜０．０２Ｕ／ｍｌである場合に、非常に良好な結果をもたらすものと見做されヘる。抗−ＦＸａ測定の場合には、計算曲線の作成において、０〜０．０８Ｕ／ｍｌ好ましくは０〜０．０４Ｕ／ｍｌの濃度範囲を、申し分なく使用することができる。いうまでもなく、試料はまた、そのヘパリン濃度を計算曲線が作成された範囲と同一範囲にあるように、稀釈されることが好ましい。従って、ヘパリン濃度が０〜０．０４Ｕ／ｍｌであるように試料を稀釈した場合に、最良の結果が得られる。種々の反応速度および速度定数は、温度に依存することから、この方法の工程全部にわたり、温度をほぼ一定にすることは重要である。ヘパリンのＡＣＬＭ分子およびＢＣＬＭ分子のそれぞれの濃度値を得るためには、本発明による方法を、ＦＸａおよびＦＩＩａを別々に用い工程（ａ）〜（ｄ）を包括的に行う方法で、行う。この場合、抗−ＦＩＩａ活性は、５４００ダルトンよりも多い分子量を有するヘパリン区分（ＡＣＬＭ分子）に存在する。抗− ＦＸａ活性は、２８００ダルトンまたはそれ以上の分子量を有するヘパリン区分に存在する。抗−ＦＩＩａ活性および抗−ＦＸａ活性は両方ともに、その活性はヘパリン分子の大きさに強く依存する。ヘパリンは種々の大きさの分子の混合物であるから、ＡＣＬＭ分子の量およびＢＣＬＭ分子の量は、試料中の抗−ＦＩＩａ活性および抗−ＦＸａ活性のみを測定することによっては、容易に決定することはできない。しかしながら、抗−ＦＩＩａ活性−抗−ＦＸａ活性比は、ヘパリン分子の分子量が小さくなるほど減少する。５４００ダルトン未満で、この比はゼロであり（すなわち、抗−ＦＩＩａ活性は存在しない）、他方、８０００ダルトンより大きいと、この比は約３であることが見出された。本発明を、下記例を引用して説明する。例発色源性基質Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡのヒトＦＩＩａによる加水分解の速度論定数Ｋ_catおよびＫｍを、３７℃で測定した。このために、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡの加水分解の速度を、上記温度で、ＦＩＩａの濃度の関数として測定した。これらの結果を表１および図１に示す。使用溶液は、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ（＝Ｓ）の５ｍＭ溶液、ＮａＣｌ１７５ｍＭ、トリスＨＣｌ（ｐＨ７．９）５０ｍＭおよびオヴァルブミン２ｍｇ／ｍｌを含有する緩衝溶液（ＢＯＡ）、並びに精製ヒトＦＩＩａ４．３０μＭ溶液であった。基質濃度［Ｓ］は、この反応混合物の光学密度を３１６ｎｍで測定し、次いでＳの固有定数（＝１２９００）で割り算することによって決定した。ＦＩＩａ、ＦＸａおよびＡＴの濃度はまた、この方法で決定することができるが、この場合の測定は、２８０ｎｍで行い、また割り算を各蛋白質にかかわる定数（公知）により行う。各加水分解速度は、４０５ｎｍで６０秒間、ｐＮＡ濃度を分光光度測定により測定することによって、２回、測定した。図１から、３７℃におけるＭｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡのＦＩＩａによる加水分解の速度諭定数は、Ｖｍａｘ＝２８．３８μＭ／分、すなわちＫ_cat＝１．１１７／秒、およびＫｍ＝１．０１１ｍＭであると推定することができる。同様の方法で、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡのＦＸａによる加水分解にかかわる速度論定数を測定し、下記の数値を得た：Ｋ_cat＝１．８７／秒およびＫｍ＝５．５０ｍＭ_o 抗−ＦＩＩａ活性及び抗−ＦＸａ活性の両方を測定するために、計算曲線を作成した。この結果を図２ａおよび２ｂに示す。この目的には、ヘパリンの抗−ＦＩＩａ活性及び抗−ＦＸａ活性の測定を、２列キュベットで行った。反応混合物（６００μｌ）は、ＡＴ１．０μＭ、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡ２ｍＭ、図中に特定されているとおりのヘパリンおよび上記の緩衝溶液ＢＯＡを含有していた。この反応は、３７℃で行い、ＦＩＩａ５００ｎＭ（キュベットの上列）またはＦＸａ５００ｎＭ（キュべットの下列）を加えることによりｔ＝０で開始した。２５分間にわたり、各秒毎に、４０５ｎＭで光学密度を測定した。この反応定数Ｋ_decは、曲線に合わせて（−○−）、または２５分後の光学密度から計算して（−■−）、決定した。血漿試料中のヘパリンの測定は、同様の方法で行うことができる。ヘパリン（０〜１．５Ｕ／ｍｌ）を含有する血漿試料を、ＢＯＡで３３×に稀釈した。次いで、稀釈した血漿１００μｌ、ＡＴ３μＭ＋Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ− ｐＮＡ６ｍＭの１００μｌおよびＦＩＩａまたはＦＸａ１．５μＭの１００ μｌを混合することによって、反応混合物を調製した。２５分後に、ｐＮＡ濃度を、分光光度測定により測定し（４０５ｎｍにおいて測定）、Ｋ_decを関係式（１）に従い計算した。この稀釈した試料の血漿のヘパリン濃度を次いで、図２ａおよび２ｂからの計算曲線を用いて決定し、その後、未稀釈試料のヘパリン濃度を計算した。Ｋ_dec値および未稀釈試料のヘパリン濃度の結果を、表２に示す。

Claims

【特許請求の範囲】１．下記工程：（ａ）既知濃度の発色源性基質（Ｓ）、既知濃度の抗トロンビン（ＡＴ）および未知ヘパリン濃度を有する試料を含有する混合物に、既知量のトロンビン（ＦＩＩａ）または活性化した凝固因子Ｘ（ＦＸａ）を添加する工程、ここでＦＩＩａまたはＦＸａの量は、存在するＳの多くて２０％、好ましくは多くて１０％を、存在するＦＩＩａまたはＦＸａの全部を不活性化するのにＡＴが要する時間中に反応させるように選択されている；（ｂ）生じる反応を進行させ、次いで反応完了後に、反応した発色源性基質の最終濃度（［ｐＮＡ］_final）を測定する工程、（ｃ）見出された［ｐＮＡ］_finalを用いて、下記関係式を使用し、ＦＩＩａまたはＦＸａとＡＴとの反応の速度定数（Ｋ_dec）を決定する工程：（式中、Ｋｍ＝ミカエリス定数＝（Ｋ_cat＋Ｋ_-1）／Ｋ₁ （２）Ｋ_cat＝中間複合体ＦＩＩａ−ＳまたはＦＸａ−Ｓからの生成物ｐＮＡの生成にかかわる速度定数、Ｋ₁＝ＦＩＩａまたはＦＸａおよびＳからの中間複合体ＦＩＩａ−ＳまたはＦＸａ−Ｓの生成にかかわる速度定数、Ｋ_-1＝中間複合体ＦＸａ−ＳまたはＦＩＩａ−ＳのＦＸａまたはＦＩＩa及びＳへの分解にかかわる速度定数、［Ｓ］＝基質の初期濃度、［ＡＴ］＝ＡＴの初期濃度、および［Ｅ］＝ＦＸａまたはＦＩＩaの初期濃度）、および（ｄ）ヘパリン濃度に対するＫ_decの予め作成された計算曲線から、このようにして見出されたＫ_dec値を用いて、試料中のヘパリン濃度を決定する工程、を包含し、上記工程の全体を通して、温度はほぼ一定である、ヘパリン含有量の測定方法。２．未知ヘパリン濃度を有する試料が稀釈した血漿である、請求項１に記載の方法。３．ヘパリン濃度が０〜０．０４Ｕ／ｍｌであるように血漿を稀釈する、請求項２に記載の方法。４．発色源性基質として、Ｍｓｃ−Ｖａｌ−Ａｒｇ−ｐＮＡまたはＳＱ６８を使用する、請求項１〜３のいずれか１項に記載の方法。５．［ｐＮＡ］_finalを、４０５ｎｍの波長で分光光度測定法により測定する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の方法。