NL1006429C2

NL1006429C2 - Werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte.

Info

Publication number: NL1006429C2
Application number: NL1006429A
Authority: NL
Inventors: Robert Johan Wagenvoord; Hendrik Coenraad Hemker
Original assignee: Univ Maastricht
Priority date: 1997-06-27
Filing date: 1997-06-27
Publication date: 1998-12-29
Also published as: US6140062A; JP2000501296A; JP3157844B2; CA2264274A1; EP0929692A1; WO1999000515A1

Description

Werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte in met name plasma.

5 In het bloedstollingsmechanisme spelen de stollingsfactoren X en II een belangrijke rol. De intrinsieke en extrinsieke wegen van het bloedstollingsmechanisme komen bijeen bij stollingsfactor X. Onder invloed van de geactiveerde factor X (FXa) wordt factor II (protrombi-ne) geactiveerd tot Ila (Flla ofwel trombine). Trombine katalyseert 10 vervolgens de omzetting van fibrinogeen in fibrine, waardoor de feitelijke bloedstolling optreedt.

Een belangrijke inhibitor van zowel FXa als Flla is antitrombine III (AT), een eiwit dat voorkomt in bloedplasma en dat FXa en Flla deactiveert door er op irreversibele wijze een complex mee te vormen.

15 AT remt aldus de bloedstolling. Het is bekend dat heparine de deacti-verende werking van AT versterkt door de reactiesnelheid, waarmee AT met FXa of Flla een irreversibel complex vormt te verhogen.

Heparine is een mengsel van polysacchariden met molecuulgewichten die variëren van 2000 tot meer dan 40000. Het is bekend dat actief 20 heparine uit twee verschillende typen actieve moleculen bestaat: heparine moleculen met een molecuulgewicht dat hoger is dan 5*100 Dalton (ACLM) en heparine moleculen met een molecuulgewicht van 5400 Dalton of lager (BCLM). De ACLM variant bezit zowel anti-FXa- als anti-FIIa-activiteit, terwijl de BCLM variant uitsluitend anti-FXa-activiteit 25 bezit. Om deze reden is de verhouding tussen anti-FIIa-activiteit en anti-FXa-activiteit afhankelijk van de verdeling van de polysaccharide ketens in het heparine mengsel.

Doel van de onderhavige uitvinding is onder andere dan ook een werkwijze te verschaffen, waarmee het mogelijk is zowel het totale 30 heparinegehalte als de afzonderlijke gehalten van de ACLM en BCLM varianten te bepalen.

Methodes om het heparinegehalte van monsters te bepalen zijn bekend. Voorbeelden zijn de anti-trombine-test, de anti-FXa-test, een test waarin de geactiveerde partiële tromboplastine tijd (APTT) wordt 35 gemeten en verscheidene testen waarin de afbraak van FXa of Flla wordt gemeten. De uitkomsten van deze testen worden vaak beïnvloed door toevallige variaties van de plasmamonsters. Om deze reden is een kali-bratie tegen een standaardhoeveelheid heparine noodzakelijk voor elke 1006429 2 verzameling plasmamonsters. Hierbij wordt er vanuitgegaan dat de uitkomst van de test met de standaard op dezelfde wijze zal variëren als met de te testen monsters. Dit is echter niet altijd het geval. Een belangrijke oorzaak hiervan is het hierboven beschreven Feit dat hepa-5 rine bestaat uit twee verschillende typen actieve moleculen. De verhouding tussen anti-FIIa- en anti-FXa-activiteit is afhankelijk van de verdeling van de polysaccharide ketens in de heparine. De anticoagule-rende werking is afhankelijk van de hoeveelheid aanwezig anti-FIIa-activiteit. Omdat de verhouding anti-FIIa- tot anti-FXa-activiteit 10 varieert per monster en per monsterbereiding en tevens afhankelijk is van het type heparine en de tijd waarna wordt gemeten, kan de uitkomst van een test die geen onderscheid maakt tussen ACLM en BCLM heparine-moleculen leiden tot verkeerde interpretaties van de testresultaten. Verschillende testen reageren verschillend op veranderingen in de 15 verhouding tussen anti-FIIa-activiteit en anti-FXa-activiteit en derhalve is het moeilijk conclusies te trekken omtrent het trombotisch gedrag van een patiënt.

De onderhavige uitvinding heeft derhalve tevens tot doel een werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte in een monster te 20 bepalen, waarbij onderscheid kan worden gemaakt tussen de beide hiervoor genoemde soorten heparinemoleculen. Daarnaast dient de werkwijze volgens de uitvinding relatief eenvoudig en snel uitgevoerd te kunnen worden.

Deze en andere doelen worden gerealiseerd met de werkwijze vol-25 gens oe uitvinding.

De uitvinding heeft derhalve betrekking op een werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte, welke werkwijze de volgende trappen omvat: (a) toevoegen van een bekende hoeveelheid trombine (Flla) of 30 geactiveerde stollingsfactor X (FXa) aan een mengsel dat een bekende concentratie chromogeen substraat (S), een bekende concentratie antitrombine (AT) en een monster met onbekende heparineconcentratie omvat, waarbij de hoeveelheid Flla of FXa zodanig moet worden gekozen dat het aanwezige S voor ten 35 hoogste 20%, bij voorkeur voor ten hoogste 10%, wordt omge zet gedurende de periode die het AT nodig heeft om al het aanwezige Flla of FXa te inactiveren, (b) de optredende reacties laten aflopen en na afloop van de 1006428 3 reacties de eindconcentratie van het omgezette chromogeen substraat ([pNA]eind) bepalen, (c) met de gevonden [pNA]eind de snelheidsconstante (kdec) van de reactie van Flla of FXa met AT bepalen met behulp van de 5 relatie: kdec = kcat, * [S] * 1 * In [AT] (1)

Km [pNA]eind [AT]-[E] waarin: 10 Km = Michaelis-constante = (kcat + k.J/kj (2) kcat = snelheidsconstante van de vorming van het product pNA uit het tussencomplex FIIa-S of FXa-S kx = snelheidsconstante van de vorming van een tussencomplex FIIa-S of FXa-S uit Flla of FXa en S, 15 k.x = snelheidsconstante van de ontleding van het tussencomplex FXa-S of FIIa-S tot FXa of Flla en S, [S] = beginconcentratie van het substraat, [AT] = beginconcentratie van AT, en [E] = beginconcentratie van FXa of Flla, en 20 (d) met behulp van de aldus gevonden waarde van kdec uit een vooraf bepaalde ijkcurve van kdec versus heparineconcentratie de heparineconcentratie van het monster bepalen, waarbij de temperatuur gedurende de gehele werkwijze nagenoeg constant is.

25 Een groot voordeel van de werkwijze volgens de uitvinding is dat het een eindpuntsbepaling en dus tijdsonafhankelijk is. Veel van de thans bekende werkwijzen daarentegen zijn gebaseerd op een momentopname of reeks van momentopnamen uit een voortschrijdende reactie. Een ander groot voordeel is dat het heparinegehalte van veel monsters 30 tegelijk kan worden gemeten door gebruik te maken van microtiterplaat-jes, die meerdere uitsparingen (meestal 96) bevat. Verder heeft de werkwijze volgens de uitvinding het grote voordeel dat er rechtstreeks aan plasma kan worden gemeten. Het plasma dient hiertoe slechts verdund te worden met een geschikte buffer.

35 In trap (a) van de werkwijze volgens de uitvinding wordt een bekende hoeveelheid Flla of FXa toegevoegd aan een mengsel van S, AT en het monster met onbekende heparineconcentratie. Door het toevoegen van Flla of FXa treden twee reacties op:

10 0 6 4 2 S

4 ^dec FIIa/FXa + AT ————·> irreversibel complex (3) kj kcat FIIa/FXa + S <==> (ES) -> pNA + FIIa/FXa (4) 5 k_t

Er wordt verondersteld dat de omzetting van S in pNA verloopt volgens Michaelis-Menten kinetiek. Dit betekent dat S in grote overmaat ten opzichte van FIIa/FXa aanwezig moet zijn, zodat geldt dat 10 [S]+[(ES)]*[S]. Tevens wordt aangenomen dat de reactie vein AT met Flla of FXa een tweede orde proces is. De Michaelis constante Km kan voor reactie (4) worden bepaald (zie relatie {2)). Om een "constante" [S] te waarborgen mag ten hoogste slechts 20% van het aanwezige S worden omgezet, bij voorkeur ten hoogste 10%.

15 Zoals hierboven reeds is aangegeven is bekend dat heparine de reactiesnelheid van de vorming van het irreversibele complex tussen FXa of Flla enerzijds en AT anderzijds substantieel doet toenemen. Gevonden is dat wanneer de juiste omstandigheden worden aangelegd de toename van de snelheidsconstante kdec rechtevenredig is met een toena-20 me van het heparine gehalte. Hierdoor is het mogelijk om via de bepaling van kdec de heparineconcentratie van een monster te meten.

Als chromogeen substraat kan in principe elk bekend chromogeen substraat worden toegepast, mits het de juiste kinetische eigenschappen heeft. Bij hydrolyse van een geschikt substraat komt doorgaans p-25 nitroanilide (pNA) vrij. De hoeveelheid vrijgekomen pNA kan op eenvoudige wijze spectrofotometrisch worden gemeten bij een golflengte van 405 nm. Er zijn echter wel enige praktische overwegingen die het gebruik van bepaalde substraten minder geschikt maken. De affiniteit van het substraat voor het enzym (d.i. Flla of FXa) is van invloed op de 30 heparinebepaling. Hoe hoger deze affiniteit namelijk is, hoe langer het duurt voordat alle enzym is gedeactiveerd door AT door de vorming van een irreversibel complex daarmee. Met andere woorden, het gebruik van een chromogeen substraat met een hoge affiniteit voor Flla of FXa betekent dat het langer duurt voordat de reactie (3) volledig is afge-35 lopen. Dit betekent dat de heparinemeting langer duurt. Bij voorkeur worden daarom substraten gebruikt met een niet al te hoge affiniteit voor Flla of FXa. Voorbeelden van zeer geschikte substraten zijn [methylsulfonylethyl]oxycarbonyl-valyl-arginine p-nitroanilide (Msc-Val-Arg-pNA) en malonyl-a-aminoisobutyryl-arginine p-nitroanilide 40 methylester monochloride (SQ68).

10 C 6 4 2 9 ' 5

In een uitvoeringsvorm die de voorkeur verdient, wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding dan ook verdund bloedplasma gebruikt als het monster met onbekende heparineconcentratie. Bij voorkeur is het bloedplasma daarbij zodanig verdund dat de heparineconcentratie in 5 het middengedeelte van de ijkcurve ligt. In de praktijk betekent dit dat bloedplasma 20 tot 100 maal, bij voorkeur 30 tot 75 maal, moet worden verdund. Hierdoor zal de heparineconcentratie in het uiteindelijke (d.i. verdunde) monster doorgaans niet meer dan 0.05 U/ml bedragen. De eenheid U/ml {units per ml) is een standaardeenheid voor het 10 aangeven van heparineconcentraties en wordt algemeen toegepast. De betekenis van deze eenheid en de wijze waarop zij is bepaald is beschreven in Merton R.E., Curtis A.D., Thomas D.P., A comparison of heparin potency estimates obtained by activated partial thromboplastin time en British pharmacopoeial assays, Thromb. Haemost. 1985; 53:116-15 117.

In trap (b) van de onderhavige werkwijze laat men allereerst de bovenbeschreven reactie (3) aflopen. Wanneer deze reactie is afgelopen, zal ook reactie (4) niet meer verlopen. Doorgaans worden de hoeveelheden van de reactanten zodanig gekozen dat reactie (3) binnen 30 20 minuten is afgelopen, hoewel een langere reactietijd even goede resultaten zou opleveren. De reden waarom de reactie bij voorkeur niet te lang mogen duren, is het feit dat de volledige heparinebepaling binnen een in de praktijk acceptabele tijdsspanne uitgevoerd moet kunnen worden. Nadat reactie (3) volledig is verlopen en reactie (4) dus ook 25 is gestopt, wordt de eindconcentratie van het omgezette chromogene substraat bepaald. Dit omgezette substraat is doorgaans verkregen door hydrolyse van het oorspronkelijke substraat en is spectrofotometrisch te bepalen. Zoals hiervoor reeds is vermeld, wordt het chromogene substraat door Flla of FXa gehydrolyseerd, waarbij p-nitroanilide 30 (pNA) vrijkomt. De eindconcentratie van pNA, [pNA]eind, kan namelijk op eenvoudige wijze spectrofotometrisch bij een golflengte van 405 nm worden bepaald. Dit is algemeen bekend.

In trap (c) wordt vervolgens met de aldus gevonden [pNA]eind de snelheidsconstante van de reactie van Flla of FXa met AT (kdec) bepaald 35 met behulp van de hierboven gegeven relatie (1). De kinetische constanten kcat en Km van de enzymatische hydrolyse van het chromogene substraat kunnen worden bepaald uit de zogeheten Lineweaver-Burk plot, waarin de reciproke substraatconcentratie (1/[S], langs de abscis) is '10 C 6 4 2 9 ' 6 uitgezet tegen de reciproke snelheid waarmee pNA wordt gevormd (1/v, langs de ordinaat). De rechte snijdt de abscis bij 1/Km, zodat Km eenvoudig kan worden bepaald. De rechte snijdt de ordinaat bij l/vmax, waarbij vmax = kcat * [E] en [E] de beginconcentratie van Flla of FXa 5 is. Door vmax af te lezen uit de figuur en te delen door de bekende [Flla] of [FXa] wordt de waarde voor kcat verkregen. Dit alles is bekend. Omdat [S], [AT] en [E] bekend zijn, kan ln[AT]/([AT]-[E]) berekend worden. [pNA]eind wordt, zoals gezegd, spectrofotometrisch gemeten.

10 In trap (d) wordt met behulp van de gevonden waarde van kdec uit een vooraf bepaalde ijkcurve van kdec versus heparineconcentratie de heparineconcentratie van het monster bepaald. De ijkcurve (d.i. ijk-lijn) kan op de op zichzelf bekende wijzen worden opgesteld. Bij het opstellen van de ijkcurve dienen dezelfde reactanten te worden ge-15 bruikt, die ook in de test zelf worden toegepast. Op deze wijze is de nauwkeurigheid van de test namelijk optimaal. De ijkcurve wordt bij voorkeur opgesteld in een zodanig gebied van de heparineconcentratie dat de te meten pNA-concentratie sterk afhankelijk is van de heparineconcentratie. In de praktijk is gebleken dat de meting van de kdec van 20 de Flla-inactivering door AT een goede betrouwbaarheid heeft, wanneer de kdcc lager is dan 200.000 (Ms)'1 en bij voorkeur lager is dan 100.000 (Ms)'1. De meting van de kdec van de FXa inactivering door AT is goed betrouwbaar gebleken bij een kdec lager dan 100.000 (Ms)'1, bij voorkeur lager dan 50.000 (Ms)'1. Deze grenzen bepalen het concentratiegebied, 25 waarin heparinemetingen goede resultaten opleveren. Voor standaard heparine blijkt een anti-FIIa test zeer goede resultaten op te leveren, wanneer het heparine concentratiegebied 0-0,04 U/ml is en bij voorkeur 0-0,02 U/ml is. Voor een anti-FXa meting is een concentratiegebied van 0 tot 0.08 U/ml, bij voorkeur 0 tot 0.04 U/ml, bijzonder 30 goed bruikbaar voor het opstellen van de ijkcurve. Het spreekt vanzelf dat het monster bij voorkeur ook zodanig wordt verdund dat de hepari neconcentratie daarvan in hetzelfde gebied ligt als waarvoor de ijkcurve is opgenomen. De beste resultaten worden derhalve verkregen, wanneer het monster zodanig wordt verdund dat de heparineconcentratie 35 tussen 0 en 0.04 U/ml is.

Omdat de diverse reactiesnelheden en snelheidsconstanten afhankelijk zijn van de temperatuur is het belangrijk dat de temperatuur gedurende alle trappen van de werkwijze nagenoeg constant is.

1 β 0 6 4 2 9 7

Teneinde een indicatie te krijgen van de concentraties van de afzonderlijke ACLM en BCLM varianten van heparine, kan de werkwijze volgens de uitvinding zodanig worden uitgevoerd dat de trappen (a) tot en met (d) afzonderlijk worden uitgevoerd met FXa en met Flla. Hierbij 5 geldt dat anti-FIIa activiteit aanwezig is in heparinefracties met een molecuulgewicht van meer dan 5400 Dalton (ACLM-variant). Anti-FXa activiteit wordt aangetroffen in heparinefracties met een molecuulgewicht van 2800 Dalton en hoger. Voor zowel de anti-FIIa als de anti-FXa activiteit geldt dat de activiteit sterk afhankelijk is van de 10 grootte van de heparinemoleculen. Aangezien heparine een mengsel is van moleculen van verschillende grootten, kunnen de hoeveelheden van de ACLM- en BCLM-variant niet eenvoudig worden bepaald door uitsluitend de anti-FIIa en de anti-FXa activiteit van een monster te meten. Wel geldt dat de verhouding anti-FIIa activiteit/anti-FXa activiteit 15 daalt naarmate het molecuulgewicht van de heparinemoleculen kleiner wordt. Beneden 5400 Dalton is deze verhouding nul (geen anti-FIIa activiteit), terwijl gevonden is dat boven 8000 Dalton deze verhouding ongeveer 3 bedraagt.

De uitvinding wordt geïllustreerd aan de hand van het volgende 20 voorbeeld.

Voorbeeld

De kinetische constanten kcat en Km van de hydrolyse van het chro-mogene substraat Msc-Val-Arg-pNA door menselijk Flla werden bepaald 25 bij 37 “C. Hiertoe werd de hydrolysesnelheid van Msc-Val-Arg-pNA als functie van de concentratie van Flla bij deze temperaturen gemeten. De resultaten staan in Tabel 1 en in Figuur 1.

Tabel 1 Hydrolysesnelheden 30 Exp. 5 mM S BOA 4.30 μΜ Flla ^Hydrolysesnelheiid^ __(pl)__(pl)__(pl)__(pM/min)_ 1 480 60 60 21,8 22,7 2 240 300 60 21,0 19,4 3 120 420 60 13.8 13,7 4 80 460 60 11,4 11,0 35 5 60 480 60 9,9 9.5 6 48 492 60 8,1 8,3 7 40.8 499 60 7.2 7.1

De gebruikte oplossingen waren een 5 mM oplossing van Msc-Val- 100 6 429 8

Arg-pNA (=S); een bufferoplossing (BOA) die 175 mM NaCl, 50 mM tris-HC1 (pH 7-9) en 2 mg/ml ovalbumine bevat; en een 4.30 μΜ oplossing van gezuiverd menselijk Flla. De substraat concentratie [S] werd bepaald door de optische dichtheid van het reactiemengsel bij 316 nm te meten 5 en te delen door een voor S kenmerkende constante (= 12900). Op deze wijze kan tevens de concentratie van Flla, FXa en AT worden bepaald, alleen wordt dan bij 280 nm gemeten en gedeeld door een voor elk eiwit (bekende) constante. Elke hydrolysesnelheid werd twee maal gemeten door gedurende 60 seconden bij 405 nm de pNA concentratie spectrofoto-10 metrisch te bepalen.

Uit figuur 1 kan worden afgeleid dat bij 37 °C voor de kinetische constanten van de hydrolyse van Msc-Val-Arg-pNA door Flla geldt: vmax = 28,38 μΜ/min, zodat kcat = 1,117 s'1, en Km = 1,011 mM.

15

Op analoge wijze werd bepaald dat de kinetische constanten voor de hydrolyse van Msc-Val-Arg-pNA door FXa de volgende waarden hadden: kcat = 1,87 s'1 en Km = 5.50 mM.] 20

Vervolgens werden de ijkcurves bepaald voor de meting van zowel de anti-FIIa activiteit als de anti-FXa activiteit. De resultaten staan in de figuren 2a en 2b.

De bepaling van de anti-FIIa en anti-FXa activiteit van heparine 25 werd hiertoe uitgevoerd in twee rijen cuvetten. Het reactiemengsel (600 μΐ) bevatte 1.0 μΜ AT, 2 mM Msc-Val-Arg-pNA, heparine zoals aangegeven in de figuren en de bufferoplossing BOA, zoals hierboven aangegeven. De reactie werd uitgevoerd bij 37 °C and werd op t=0 opgestart door toevoeging van 500 nM Flla (bovenste rij cuvetten) of 500 30 nM FXa (onderste rij cuvetten). Elke seconde gedurende 25 minuten werd de optische dichtheid bij 405 nm gemeten. De reactieconstanten kdec * werden bepaald door curve-fitting (-0-) of berekend uit de optische dichtheid na 25 minuten (-«-).

De bepaling van heparine in plasmamonsters kan op analoge wijze 35 worden uitgevoerd. Plasmamonsters die heparine bevatten (0-1,5 U/ml) werden 33x verdund in BOA. Vervolgens werden de reactiemengsels gemaakt door 100 μΐ verdund plasma, 100 μΐ 3μΜ AT + 6 mM Msc-Val-Arg-pNA en 100 μΐ 1,5 μΜ Flla of FXa te mengen. Na 25 minuten werd spectro- '10 0 6 4 2 ?' 9 fotometrisch (bij 405 nm) de pNA concentratie gemeten en werd de kdec berekend volgens relatie (1). Met behulp van de ijkcurves uit de figuren 2a en 2b werd vervolgens de heparineconcentratie van het verdunde monster bepaald, waarna de heparineconcentratie van het onverdunde 5 monster werd berekend.

De resultaten in termen van kdec en heparineconcentratie van het onverdunde monster staan in Tabel II.

Tabel II Heparine bepaling in plasma 10 _Anti-PIIa activiteit__Anti-FXa activiteit_ kdec Heparine kdec Heparine (Ms)'1__(U/ml)__(Ms)-1__(U/ml) 20184__0__9319__0_ 44522__0,0047__14970__0,0043 15 79305__0,0106__23635__0,0108 96003 0,0145 33585 0,0183 1006429

Claims

1. Werkwijze voor het bepalen van het heparinegehalte, welke werkwijze de volgende trappen omvat: 5 (a) toevoegen van een bekende hoeveelheid trombine (Flla) of geactiveerde stollingsfactor X (FXa) aan een mengsel dat een bekende concentratie chromogeen substraat (S), een bekende concentratie antitrombine (AT) en een monster met onbekende heparineconcentratie omvat, waarbij de hoeveelheid Flla of 10 FXa zodanig moet worden gekozen dat het aanwezige S voor ten hoogste 20%, bij voorkeur voor ten hoogste 10%, wordt omgezet gedurende de periode die het AT nodig heeft om al het aanwezige Flla of FXa te inactiveren, (b) de optredende reacties laten aflopen en na afloop van de 15 reacties de eindconcentratie van het omgezette chromogeen substraat ([pNA]eind) bepalen, (c) met de gevonden [pNA]eind de snelheidsconstante (kdec) van de reactie van Flla of FXa met AT bepalen met behulp van de relatie: 20 kdec = kcat * [S] * 1 * In [AT] (1) Km [pNA]eind [AT]-[E] waarin: Km = Michaelis-constante = (kcat + k.jJ/kj (2) 25 kcat = snelheidsconstante van de vorming van het product pNA uit het tussencomplex FIIa-S of FXa-S kj = snelheidsconstante vein de vorming van een tussencomplex FIIa-S of FXa-S uit Flla of FXa en S, k.j = snelheidsconstante van de ontleding van het 30 tussencomplex FXa-S of FIIa-S tot FXa of Flla en S, [S] = beginconcentratie van het substraat, [AT] = beginconcentratie van AT, en [E] = beginconcentratie van FXa of Flla, en (d) met behulp van de aldus gevonden waarde van kdec uit een 35 vooraf bepaalde ijkcurve van kdec versus heparineconcentratie de heparineconcentratie van het monster bepalen, waarbij de temperatuur gedurende de gehele werkwijze nagenoeg constant is. 1006429

2. Werkwijze volgens conclusie 1, waarin het monster met onbekende heparineconcentratie verdund bloedplasma is.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, waarin het bloedplasma zodanig is verdund dat de heparineconcentratie 0 tot 0.04 U/ml bedraagt.

4. Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, waarin als chromogeen substraat Msc-Val-Arg-pNA of SQ68 wordt toegepast.

5· Werkwijze volgens een of meer van de voorgaande conclusies, waarin [pNA]eind spectrofotometrisch wordt bepaald bij een golflengte 10 van 405 nm. 1006429'