JP2000502248A - 平滑筋細胞由来の移動因子 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ヒト平滑筋細胞由来の移動因子をコードしている単離核酸、該核酸から得ることのできる蛋白、該核酸でトランスフェクションされた組み換え宿主細胞、ならびに該蛋白および核酸配列の使用を開示する。

Description

【発明の詳細な説明】 平滑筋細胞由来の移動因子 発明の分野 本発明は、単離ヒト平滑筋細胞由来の移動因子（ＳＤＭＦ）遺伝子、本質的に純 粋なヒトＳＤＭＦ蛋白、および組成物、およびヒトＳＤＭＦ配列および蛋白の製 造および使用方法に関する。 発明の背景 動脈平滑筋細胞（ＳＭＣ）の血管壁内層中への移動は、アテローム性動脈硬化 傷害および環状血管バルーン血管形成後の再狭窄の発症における重要な出来事で ある。血管細胞により分泌され、あるいは他の血液成分に由来する多くのＳＭＣ 移動因子が同定されている。これらの移動因子は、血小板由来増殖因子、インタ ーロイキン−１、形質転換増殖因子−β、フィブロネクチン、ビトロネクチン、 フィブリン−ゲンおよび酸化された低密度リポ蛋白を包含する。 ラットおよびウサギの平滑筋細胞由来の移動因子（ＳＤＭＦ）はKoyama et al .,Atherosclerosis 86，219-226(1991)に記載されている。ラットの動脈ＳＭＣ 由来のＳＤＭＦ蛋白に関するさらなる精製ならびに生物学的および薬理学的研究 は同じグループによりKoyama et al.，J.Biol.Chem．268，13301-13308(1993)に おいて報告されている。 ラットＳＤＭＦは有効なＳＭＣ移動因子であり、ＳＭＣの増殖を促進しないこ とが、研究により示されている。ＳＭＣにより分泌される５８ｋＤａの蛋白は他 の既知ＳＭＣ移動因子から分化したものであり、オートクリン機構により移動を 誘導することが報告されている。ラットＳＤＭＦの配列決定および／またはクロ ーニングは報告されなかった。 ＳＭＣ移動は多くの血管の病理に関与している。ＳＭＣオートクリン移動因子 として、ＳＤＭＦは血管の病理において、例えばアテローム性動脈硬化傷害の初 期の厚膜形成において重要な役割を果たしていると考えられる。ＳＭＣ移動の調 節におけるＳＤＭＦの関与については、ＳＤＭＦおよびそのｃＤＮＡの全体的な 同定を要する。またＳＤＭＦ活性を転調させる化合物、かかるモジュレーターを 同定する方法、ならびにかかる方法において有用な試薬に対する必要性が存在す る。 発明の概要 したがって、本発明の１の態様は、 （ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド９４から１４４０までのヌクレオチド 配列を有するヒトＳＤＭＦをコードしているポリヌクレオチド、 （ｂ）中程度の厳密さのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）に記載のポリ ヌクレオチドの相補物にハイブリダイゼーションでき、機能的なヒトＳＤＭＦを コードしているポリヌクレオチド、および （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの縮重ポリヌクレオチド からなる群から選択される単離ポリヌクレオチドである。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリヌクレオチドによりコードされる機能 的ポリペプチドである。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリヌクレオチドを含むベクターを含んで いる組み換え宿主細胞を蛋白の発現を促進する条件下で培養し、次いで、蛋白の 回収を行うことを特徴とする、本質的に純粋なヒトＳＤＭＦ蛋白の製造方法であ る。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリヌクレオチドに結合しうる配列を含む アンチセンスオリゴヌクレオチドである。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリペプチドのモジュレーターである。 本発明のもう１つの態様は、ＳＤＭＦ活性を転調させる物質の存在について培 地をアッセイする方法であって、下記工程： （ａ）ＳＤＭＦのアミノ酸配列（配列番号：２）を有するＳＤＭＦ蛋白または その機能的誘導体ならびにＳＭＣをチャンバー内に入れること、 （ｂ）ＳＤＭＦ活性を転調させる可能性のある試験物質をＳＤＭＦまたはＳＭ Ｃのいずれかに添加すること、 （ｃ）ＳＭＣの移動を可能にする条件下でチャンバーをインキュベーションす ること、 （ｄ）移動したＳＭＣおよび移動しなかったＳＭＣの数を数えること、次いで （ｅ）対照との比較を行って試験物質の効果を決定すること を含む方法である。 本発明のもう１つの態様は、ＳＤＭＦ活性を転調させる物質の存在について培 地をアッセイする方法であって、下記工程： （ａ）ＳＤＭＦのアミノ酸配列（配列番号：２）を有するＳＤＭＦ蛋白または その機能的誘導体および細胞性結合パートナーを用意すること、 （ｂ）ＳＤＭＦ蛋白／細胞性結合パートナー複合体の形成を可能にする条件下 で、ＳＤＭＦ活性を転調させる可能性のある試験物質とともにインキュベーショ ンすること、 （ｃ）複合体、遊離ＳＤＭＦ蛋白または遊離細胞性結合パートナーの存在につ いてアッセイすること、次いで （ｄ）対照との比較を行って試験物質の効果を決定すること を含む方法である。 本発明のもう１つの態様は、本発明方法により同定されるＳＤＭＦ蛋白転調化 合物である。 本発明のもう１つの態様は、治療上有効量の本発明転調化合物を患者に投与す ることを特徴とする、ＳＤＭＦ活性の転調を必要とする患者の治療方法である。 本発明のもう１つの態様は、治療上有効量の本発明ポリペプチドを患者に投与 することを特徴とする、ＳＤＭＦを必要とする患者の治療方法である。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリペプチドおよび医薬上許容される担体 を含んでなる医薬組成物である。 本発明のもう１つの態様は、ＳＤＭＦ蛋白欠乏に関連した症状の診断方法であ って、 （ａ）個体からポリヌクレオチド試料を単離すること、 （ｂ）ポリヌクレオチド試料および配列番号：１に示すヌクレオチド９４から １４４０までに示すヌクレオチド配列を有するＳＤＭＦをコードしているポリヌ クレオチドをアッセイすること、次いで （ｃ）ポリヌクレオチド試料とＳＤＭＦポリヌクレオチドとの間の相違を比較 すること を特徴とし、相違がＳＤＭＦ遺伝子における変異を示すものである方法である。 本発明のもう１つの態様は、不十分なＳＤＭＦ蛋白機能に関連した症状の治療 方法であって、ＳＤＭＦ蛋白機能を欠乏している患者に請求項１のポリヌクレオ チドを投与することを特徴とし、ＳＤＭＦ蛋白が発現され症状が改善される方法 である。 本発明のさらにもう１つの態様は、いずれかの細胞中に本発明ポリヌクレオチ ドを発現するトランスジェニック非ヒト動物である。 図面の簡単な説明 図１はヒトＳＤＭＦ蛋白のアミノ酸配列をネズミｐ１４蛋白と並置したもので ある。 図２はヒトＳＤＭＦ蛋白のアミノ酸配列をヒトＰＣＯＬＣＥ蛋白と並置したも のである。 図３は精製ヒトＳＤＭＦの生物学的活性を示す実験結果である。 発明の詳細な説明 本明細書の用語「ＳＤＭＦ遺伝子」は、平滑筋細胞由来の移動因子をコードし ているヌクレオチド配列を含むＤＮＡ分子をいう。ヒトＳＤＭＦ遺伝子配列を配 列番号：１に示す。ＳＤＭＦ遺伝子のコーディング領域は配列番号：１のヌクレ オチド９４〜１４４０からなる。推定されるＳＤＭＦ遺伝子産物の４４９個のア ミノ酸配列を配列番号：２に示す。 本明細書の用語「機能的フラグメント」は、特定の遺伝子または遺伝子産物に ついていう場合、全長の遺伝子または関連する遺伝子産物に関する生物学的機能 の実質的にすべてを保持している、全長に満たない遺伝子または遺伝子産物を意 味する。特定遺伝子または遺伝子産物のフラグメントが機能的フラグメントであ るかどうかを決定するために、よく知られたヌクレオチド分解または蛋白分解法 によりフラグメントを得て、フラグメントを生物学的機能について試験する。 本明細書の用語「抗原」は、宿主の免疫系を剌激して体液性および／または細 胞性抗原特異的応答を引き起こす１種またはそれ以上のエピトープを含む分子を いう。また本明細書において該用語を「免疫原」と混用する。 本明細書の用語「エピトープ」は、特異的抗体分子が結合する抗原またはハプ テン上の部位をいう。また本明細書において該用語を「抗原決定基」または「抗 原決定部位」と混用する。 本明細書の用語「モノクローナル抗体」は、１の種（例えば、ネズミ、ウサギ 、ヤギ、ラット、ヒト等）由来の抗体ならびに２種またはおそらくそれ以上の種 由来の抗体（例えば、キメラ抗体およびヒト化抗体）を包含するものと理解され る。 ＲＮＡポリメラーゼが２つのコーディング配列を１つのｍＲＮＡ中に転写し、 次いで、両方の配列に由来するアミノ酸を有する単一のポリペプチドに翻訳され る場合、本明細書では、コーディング配列は別のコーディング配列に「作動可能 に結合」しているという。発現配列が最終的にプロセッシングされて所望蛋白を 生じるかぎり、コーディング配列は互いに隣接している必要はない。 本明細書の用語「組み換えポリペプチド」は、組み換えＤＮＡ法により製造さ れるポリペプチド、すなわち所望ポリペプチドをコードしている外来性ＤＮＡ構 築物により形質転換された細胞から生産されるポリペプチドをいう。「合成」ポ リペプチドは化学合成により製造されるポリペプチドである。 本明細書の用語「レプリコン」は、インビボにおいてＤＮＡ複製の自律的ユニ ツトとして機能する、すなわちそれ自身の制御下で複製しうる遺伝学的エレメン ト（例えばプラスミド、染色体、ウイルス）である。 本明細書の用語「ベクター」は、別のＤＮＡセグメントを結合することができ 、結合セグメントの複製を引き起こすプラスミド、ファージ、またはコスミドの ご ときレプリコンである。 本明細書の用語「リファレンス」遺伝子は、本発明ヒトＳＤＭＦ遺伝子配列を いい、存在する種々の配列多型性を包含するものと理解され、遺伝子中にヌクレ オチド置換が存在しても、遺伝子産物の本質的機能に影響しないものをいう。 本明細書の用語「変異」遺伝子は、リファレンス遺伝子とは異なるヒトＳＤＭ Ｆ配列をいい、ヌクレオチド置換および／または欠失および／または挿入により 本質的機能が損なわれていないものをいう。 本明細書において、特定蛋白のＤＮＡ「コーディング配列」または特定蛋白を 「コードしているヌクレオチド配列」とは、適当な調節配列の制御下に置いた場 合、転写されポリペプチドに翻訳されるＤＮＡ配列である。 本明細書の用語「プロモーター配列」は、細胞中でＲＮＡポリメラーゼに結合 し、下流（３’方向）コーディング配列の転写を開始しうるＤＮＡ調節領域であ る。本発明を定義する目的で、プロモーター配列は、コーディング配列の翻訳開 始コドン（例えば、ＡＴＧ）により３’末端に結合しており、上流（５’方向） に伸長していて、バックグラウンド以上の検出可能なレベルでの転写開始に必要 な最小数の塩基またはエレメントを包むものである。転写開始部位（便利には、 ヌクレアーゼＳ１を用いるマッピングにより決定される）ならびにＲＮＡポリメ ラーゼの結合に応答可能な蛋白結合ドメイン（コンセンサス配列）がプロモータ ー配列中に見いだされるであろう。真核プロモーターは、しばしば（常にではな い）「ＴＡＴＡ」ボックスおよび「ＣＡＴ」ボックスを含む。原核プロモーター はコンサス配列の−１０ないし−３５の位置にシャイン−ダルガノ配列を含む。 本明細書の用語、ＤＮＡ「制御配列」は、宿主細胞において、まとまってコー ディング配列の発現（すなわち転写および翻訳）を生じさせるプロモーター配列 、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流の調節ド メイン、エンハンサー等を総称する。 本明細書において、ＲＮＡポリメラーゼがプロモーター配列に結合し、コーデ ィング配列をｍＲＮＡに転写し、次いで、ｍＲＮＡがコーディング配列によりコ ードされるポリペプチドに翻訳される場合、制御配列は細胞中でコーディング配 列 の「発現を指令する」という。 本明細書の用語「宿主細胞」は、形質転換またはトランスフェクションされた 細胞、あるいは外来性ＤＮＡ配列により形質転換またはトランスフェクションさ れうる細胞をいう。 本明細書において、外来性ＤＮＡが細胞膜の内部に導入された場合、細胞が外 来性ＤＮＡにより「形質転換された」という。外来性ＤＮＡは、細胞のゲノムを 形成している染色体ＤＮＡに組み込まれ（共有結合して）てもよく、あるいは組 み込まれなくてもよい。原核細胞および酵母において、例えば、外来性ＤＮＡは プラスミドのごときエピソームエレメント上で維持されてもよい。真核細胞につ いては、安定に形質転換またはトランスフェクションされた細胞は、外来性ＤＮ Ａが染色体中に組み込まれて、染色体複製により娘細胞に遺伝されるようになっ ている細胞である。この安定性は、外来ＤＮＡを含む娘細胞の集団からなる細胞 系またはクローンを確立する真核細胞の能力により示される。 本明細書の用語「トランスフェクション」または「トランスフェクションされ た」は、細胞が外来性ＤＮＡを取り込み、外来性ＤＮＡをその染色体中に組み込 むプロセスをいう。例えば、細胞にＤＮＡを取り込ませる種々の方法（例えば、 リン酸カルシウム沈降、エレクトロポレーション、リポソームの同化等）によっ て、あるいはウイルスを用いてＤＮＡを細胞中に移行させる感染によって、トラ ンスフェクションを行うことができる。 本明細書の用語「標的細胞」は、他のタイプの細胞（または細胞系）よりも選 択的にトランスフェクションされる細胞である。 本明細書の用語「クローン」は、有糸分裂により単一細胞または共通の祖先か ら生じる細胞集団である。「細胞系」は、インビトロにおいて何世代にもわたっ て安定に増殖しうる初代細胞のクローンである。 本明細書において、ＤＮＡ構築物の「異種」領域とは、天然においては他の分 子と結合して見いだされない別のＤＮＡ分子中の、あるいはこれに結合した、同 定可能なＤＮＡセグメントである。よって、異種領域が遺伝子をコードしている 場合、通常には、その遺伝子は起源となった動物のゲノムにおいては隣接してい ないＤＮＡに隣接することとなる。異種コーディング配列のもう１つの例は、コ ーディング配列自体が天然において見いだされないものである構築物である（例 えば、元の遺伝子とは異なるコドンを有する合成配列）。対立遺伝子変種または 天然に生じる変異は、本明細書にいうＤＮＡの異種領域を生じさせるものではな い。 本明細書において、ポリペプチドの「モジュレーター」とは、ポリペプチド機 能に影響しうる物質である。 本発明の１の態様は、ヒトＳＤＭＦ蛋白および実質的に類似の配列をコードし ている単離ポリヌクレオチドである。単離ポリヌクレオチド配列は、中程度の厳 密さの条件下で配列番号：１にハイブリダイゼーションしうる場合、あるいは配 列番号：１に縮重するＤＮＡ配列をコードしている場合、または中程度の厳密さ の条件下で配列番号：１にハイブリダイゼーションしうるそれらの配列に縮重す るＤＮＡ配列をコードしている場合には、実質的に類似したものである。 「中程度の厳密さの条件」は当業者により理解されている用語であり、例えば 、Sambrook et al Molecular Cloning: A Laboratory Manual,2nd edition,Vol. 1,pp.101-104，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1989)に記載されている 。中程度の厳密さの条件を用いる典型的なハイブリダイゼーションのプロトコー ル以下のごとし。６Ｘ ＳＳＰＥ、５Ｘデンハーツ溶液（１リットルの溶液につ き１０ｇフィコール、１０ｇＢＳＡおよび１０ｇポリビニルピロリドン）、０. ０５％ＳＤＳおよび１００μｇ／ｍｌ ｔＲＮＡを含有する溶液中、６５℃にお いて、ニトロセルロースフィルターをプレハイブリダイゼーションさせる。ハイ ブリダイゼーションプローブを標識、好ましくは放射性標識する(例えば、BI0ST AG-IT^Rキットを用いる)。次いで、６５℃で約１８時間ハイブリダイゼーション を行う。次いで、２Ｘ ＳＳＣおよび０.５％ＳＤＳの溶液中で室温で１５分フィ ルターを２回洗浄する。次いで、フィルターを５８℃で洗浄し、風乾し、次いで 、−７０℃において増強スクリーンを用いてＸ線フィルムに一晩曝露する。 縮重したＤＮＡ配列は配列番号：２と同じアミノ酸配列あるいは中程度の厳密 さの条件下で配列番号：１にハイブリダイゼーションしうる配列によりコードさ れる蛋白をコードしているが、遺伝学的コードの縮重によりヌクレオチドコーデ ィ ング配列中に変化を有するものである。例えば、縮重コドンＵＵＵおよびＵＵＣ は両方ともアミノ酸フェニルアラニンをコードするが、４種のコドンＧＧＸはす べてグリシンをコードする。 あるいは、実質的に類似の配列は、約６６％、好ましくは約７５％、最も好ま しくは約９０％のヌクレオチドまたはアミノ酸が、分子の決められた長さにおい てマッチするものである。本明細書に用いる、実質的に類似とは、本発明配列に 対して同様の同一性を有する配列をいう。よって、ハイブリダイゼーションまた は配列の比較によって、実質的に同じであるヌクレオチド配列を同定することが できる。蛋白分解、ゲル電気泳動および／または精密配列決定のごとき方法によ つて、実質的に同じである蛋白配列を同定することができる。Lecain et al.J.N eurochem.56，2133-2138(1991)により報告されたネズミｐ１４配列ならびにTaka hara et al.J.Biol.Chem.269,26280-26285(1994)により報告されたヒトプロコラ ーゲンＣ−プロテイナーゼエンハンサー前駆体配列（ＰＣＯＬＣＥ）は実質的に 類似した配列という定義から除外される。 本発明単離ポリヌクレオチドの具体例は、好ましくはヒト起源のＤＮＡ、ゲノ ムＤＮＡおよびＲＮＡを包含する。ＳＤＭＦ蛋白をコードしている核酸分子の単 離方法は、当該分野において認識されている手順を用いて、ゲノムまたはｃＤＮ Ａライブラリーを天然または人工プローブで検索することである。例えば、”Cu rrent Protocoles in Molecular Biology”,Ausbel et al．(eds.)GreenePublis hing Association and John Wiley Interscience，New York，1989,1992参照。 当業者は、配列番号:１または少なくとも１５個の連続したヌクレオチドを含む そのフラグメントが特に有用なプローブであることを理解するであろう。また、 好ましくは、かかるプローブを分析的に検出可能な試薬で標識してプローブの同 定を容易にすることができる。有用な試薬は、放射性同位元素、蛍光色素または 検出可能な生成物の生成を触媒する酵素を包含するが、これらに限らない。プロ ーブは、過度の実験を行うことなく当業者がヒト、哺乳動物または他の動物起源 のＳＤＭＦ蛋白をコードしているゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡまたはＲＮＡポリヌク レオチドを単離すること、あるいは関連配列を求めてかかる起源をスクリー ニングすることを可能にするであろう。該関連配列としては、例えばさらなるフ ァミリー、タイプおよび／またはサブタイプのメンバーが挙げられ、本明細書開 示のコーディング配列に対する５’および／または３’領域由来の転写調節およ び制御エレメントならびに他の安定性、プロセッシング、翻訳および組織特異性 決定領域等が含まれる。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリヌクレオチドによりコードされる機能 的ポリペプチドである。本発明の機能的ポリペプチドの１の具体例は、配列番号 ：２に示すアミノ酸配列を有するヒトＳＤＭＦ蛋白である。 本発明のもう１つの態様は、本質的に純粋なヒトＳＤＭＦ蛋白の製造方法であ る。さらにもう１つの態様は、本発明方法により製造されるヒトＳＤＭＦ蛋白で ある。この蛋白は配列番号：２に示すアミノ酸配列を有し、実質的に類似のアミ ノ酸配列を有し、同じ機能を有する変種を包含する。好ましくは、本発明蛋白は 、本発明ポリヌクレオチドをコードしているベクターを含む組み換え宿主細胞を 、蛋白の発現を促進する条件下で培養し、次いでそれを回収することによって、 組み換え遺伝子工学的手法により製造される。 必要な発現制御領域、例えば遺伝子発現に必要な調節配列にＤＮＡを作動する ように連結することにより、単離ポリヌクレオチド、詳細にはＤＮＡを発現ベク ター中に導入することができる。当該分野でよく知られた方法により、原核細胞 （例えば、細菌細胞）、あるいは真核細胞（例えば、酵母または哺乳動物細胞） のごとき適当な宿主細胞中にベクターを導入することができる。上記Ausbelらの 文献参照。調製または単離された、所望蛋白のコーディング配列を適当なベクタ ーまたはレプリコン中にクローン化することができる。多くのクローニングベク ターが当業者に知られており、適当なクローニングベクターを選択することがで きる。クローニング用の組み換えＤＮＡベクターおよび形質転換可能な宿主細胞 の例は、バクテリオファージλ(E.coli)、ｐＢＲ３２２(E.coli)、ｐＡＣＹＣ１ ７７(E.coli)、ｐＫＴ２３０（グラム陰性細菌）、ｐＧＶ１１０６（グラム陰性 細菌）、ｐＬＡＦＲ１（グラム陰性細菌）、ｐＭＥ２９０（非E.coliグラム陰性 細菌）、ｐＨＶ１４（E.coliおよびBacillus subtilis）、ｐＢＤ９（Bacillus ）、 ｐＩＪ６１(Streptomyces)、ｐＵＣ６(Streptomyces)、ＹＩｐ５(Saccharomyces )、バキュロウイルス昆虫細胞系、Drosophila昆虫系、ＹＣｐ１９（Saccharomyc es）およびｐＳＶ２ｎｅｏ（哺乳動物細胞）を包含するが、これらに限らない。 一般的には、”DNA Cloning”：Vols.I & II,Glover et al.ed．IRL Press Oxfo rd(1985)(1987);および T,Maniatis et al．（”Molecular Cloning”Cold Spri ngHarbor Laboratory(1982)）参照。 プロモーター、リボソーム結合部位（細菌での発現のため）および所望により オペレーターのごとき制御エレメントの制御下に遺伝子を置いて、発現構築物を 含むベクターにより形質転換された宿主細胞中において所望蛋白をコードしてい るＤＮＡ配列をＲＮＡに転写させることができる。コーディング配列はシグナル ペプチドまたはリーダー配列を含んでいてもよく、含んでいなくてもよい。例え ば、E.coli tacプロモーターまたはプロテインＡ遺伝子（spa）プロモーターお よびシグナル配列を用いて本発明蛋白を発現することができる。細菌宿主中にお ける翻訳後プロセッシングによりリーダー配列が除去されうる。例えば、米国特 許第４４３１７３９号、第４４２５４３７号および第４３３８３９７号参照。 制御配列のほかに、宿主細胞の増殖に相関して蛋白配列の発現を調節すること を可能にする調節配列を加えることが望ましいかもしれない。調節配列は当業者 に知られている。典型例は、調節化合物の存在をはじめとする化学的または物理 的剌激に応答して遺伝子発現をオンまたはオフにする調節配列である。他のタイ プの調節エレメント、例えばエンハンサー配列がベクター中に存在してもよい。 適当な調節配列を伴ったベクター中に特定のコーディング配列が存在し、制御 配列に対するコーディング配列の位置および方向も適当であり、その結果制御配 列の「制御」下で転写されるように、すなわち制御配列においてＤＮＡ分子に結 合するＲＮＡポリメラーゼがコーディング配列を転写するように発現ベクターを 構築する。この目的を達成するためには、目的とする特定の抗原をコードしてい る配列の修飾が望ましいかもしれない。例えば、いくつかの場合、配列が適当な 方向で制御配列に結合できるように、すなわち読み枠を維持するように配列を修 飾することが必要であるかもしれない。上記クローニングベクター中に導入する 前に制御配列および他の調節配列をコーディング配列に連結してもよい。別法と して、すでに制御配列および適当な制限部位を有している発現ベクター中にコー ディング配列をクローン化することもできる。 いくつかの場合、ヒトＳＤＭＦ蛋白の変異体またはアナログを製造することが 望ましいかもしれない。蛋白をコードしている配列の一部分を欠失することによ り、配列を挿入することにより、および／または配列中の１またはそれ以上のヌ クレオチドを置換することにより、変異体またはアナログを製造してもよい。部 位特異的突然変異法のごときヌクレオチド配列の修飾方法は当業者によく知られ ている。例えば、上記T.Maniatisらの”DNA Cloning”：Vols.I & II；および上 記”Nucleic Acid Hybridization”参照。 選択された発現系および宿主に応じて、目的蛋白が発現される条件下で上記発 現ベクターにより形質転換された宿主細胞を増殖させることにより本発明蛋白を 製造する。好ましい哺乳動物細胞は、ヒト胚の腎細胞（２９３）、サル腎細胞、 繊維芽（ＣＯＳ）細胞、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞、Drosophi laまたはネズミのＬ−細胞を包含する。発現系が蛋白を増殖培地中に分泌する場 合、蛋白を培地から直接精製することができる。蛋白が分泌されない場合、細胞 溶解物から蛋白を単離するかまたは細胞膜フラクションから蛋白を回収する。適 当な増殖条件および回収方法の選択は当業者の範囲内である。 本発明のもう１つの態様は、種々の温度または代謝条件に異なった応答をする 調節エレメントに本発明ポリヌクレオチドを作動するように連結し、そのことに よりそれらの条件に応答して表現型の発現を効果的にオンまたはオフにすること である。 本発明蛋白を同定するための別法は、遺伝子ライブラリーを構築し、得られた クローンを用いてE.coliを形質転換し、個々のコロニーをプールし、ヒトＳＤＭ Ｆに対するポリクローナル血清またはモノクローナル抗体を用いて個々のコロニ ーをスクリーニングすることによる。 既知アミノ酸配列または目的遺伝子のＤＮＡ配列由来のアミノ酸配列を用いて 、自動ペプチド合成装置による固相ペプチド合成のごとき化学合成により本発明 蛋 白を製造してもよい。かかる方法は当業者に知られている。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリペプチドのモジュレーターである。物 質によるＳＤＭＦの機能の転調は、機能の部分的ないし完全な阻害、同一の機能 、ならびに機能促進を包含する。本発明モジュレーターの具体例は、抗体、ペプ チド、オリゴヌクレオチドならびにペプチド模倣物を含む小型有機分子を包含す る。 少なくとも１つのエピトープを含む本発明蛋白またはそれらのフラグメントを 用いて、本明細書開示のアミノ酸配列に対応するエピトープに指向されたポリク ローナル抗体およびモノクローナル抗体の両方の抗体を製造することができる。 ポリクローナル抗体が所望の場合、マウス、ウサギ、ヤギまたはウマのごとき選 択された哺乳動物を本発明蛋白またはそのフラグメント、あるいは変異蛋白で免 疫する。既知方法に従って、免疫された動物からの血清を集め、処理する。免疫 アフィニティークロマトグラフィーまたは他の既知方法により血清のポリクロー ナル抗体を精製することができる。 当業者は、本発明蛋白およびそのフラグメントに対するモノクローナル抗体を 用意に製造することもできる。ハイブリドーマ法を用いるモノクローナル抗体の 製造のための一般的方法論はよく知られている。細胞融合および腫瘍原性ＤＮＡ でのＢリンパ球の直接トランスフェクションまたはエプステインーバーウイルス でのトランスフェクションのごとき他の方法によっても不死化抗体産生細胞系を 作り出すことができる。例えば、M.Schreier et al.,”Hybridoma Techniques” (1980);Hammerling et al.,”Monoclonal Antibodies and T-cell Hybridomas” (1981);Kennettetal.,”MonoklonalAntibodies”(1980);および米国特許第４３ ４１７６１号、第４３９９１２１号、第４４２７７８３号、第４４４４８８７号 、第４４５２５７０号、第４４６６９１７号、第４４７２５００号、第４４９１ ６３２号、および第４４９３８９０号参照。 目的抗原またはそのフラグメントに対して生成したモノクローナル抗体の集団 を、種々の特性、すなわち例えば、イソタイプ、エピトープのアフィニティー等 についてスクリーニングすることができる。モノクローナル抗体は、指向されて いる個々の抗原の、免疫アフィニティー法を用いる精製において有用である。別 法として、目的モノクローナル抗体をコードしている遺伝子を、当該分野におい て知られたＰＣＲ法によりハイブリドーマから単離し、適当なベクター中にクロ ーン化し、発現させてもよい。本発明抗体は、ポリクローナル抗体であれ、モノ クローナル抗体であれ、それらが免疫アッセイ、ＲＩＡ、ＥＬＩＳＡ等における 試薬として使用できるという点で、さらに有用である。放射性同位元素、蛍光分 子または酵素のごとき分析的に検出可能な試薬で本発明抗体を標識することがで きる。 モノクローナル抗体のさらなる用途は、ＳＤＭＦの過剰産生または不適切な産 生から生じる種々の病気の治療である。かかる病気は再狭窄およびアテローム性 動脈硬化を包含する。治療上有効量のＳＤＭＦ−転調モノクローナル抗体をＳＤ ＭＦ活性の転調が必要な患者に投与する。 非ヒト可変領域がヒト不変領域に結合または融合しているキメラ抗体(例えば 、Liu et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,3439(1987)参照)をアッセイに使用し てもよく、また治療的に使用してもよい。好ましくは、治療的なモノクローナル 抗体は、Jones et al.,Nature，321,522(1986); Verhoeyen et al.，Science,23 9,1534(1988);Kabat et al.,J.Immunol.,147,1709(1991);Queen et al.,Proc.Na tl.Acad.Sci.USA,86,10029(1989);Gorman et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,88,3 4181(1991);およびHodgson et al.,Bio/Teclmology,9,421(1991)に記載されたよ うな「ヒト化」されたものであろう。 本発明のもう１つの態様は、本発明ポリヌクレオチドに結合しうる配列を含む アンチセンスオリゴヌクレオチドである。ＳＤＭＦ蛋白をコードしている標的核 酸に特異的に結合し、その転写を妨害するように、合成オリゴヌクレオチドまた は関連アンチセンス化学構造アナログを設計することができる。一般的には、Co hen,J.S.,Trends in Pharm.Sci.,10,435(1989)およびWeintraub,H.M.,Scientifi c American，１月号(1990年)の４０頁参照。 本発明のもう１つの態様は、ＳＤＭＦ蛋白の結合パートナーへの結合を妨害す ることによりＳＤＭＦ蛋白の機能を阻害あるいはさもなくば転調させる物質の存 在に関して培地をアッセイする方法である。例は、細胞表面受容体、可溶性受容 体、結合蛋白、抗体およびそれらのフラグメントならびにＳＤＭＦ蛋白のフラグ メントを包含するが、これらに限らない。他の典型的なＳＤＭＦ蛋白機能のモジ ュレーターは、上記ペプチドあるいは蛋白のいすれかのペプチド模倣物または他 の小型有機分子を包含する。 ヒトＳＤＭＦのアミノ酸配列（配列番号：２）を有するＳＤＭＦ蛋白またはそ の機能的誘導体およびＳＭＣは、下記実施例３に記載の化学走性チャンバーに入 れられ、あるいは上記Koyama et al.J.Biol.Chem.に記載のごとき当業者に知ら れている他の移動アッセイに供せられる。ＳＤＭＦ活性を転調させる可能性のあ る試験物質をＳＤＭＦまたはＳＭＣのいずれかに添加し、ＳＭＣの移動を可能に する条件下でチャンバーをインキュベーションし、次いで、移動したＳＭＣおよ び移動しなかったＳＭＣの数を数える。結果を対照と比較して、試験物質の効果 を決定する。 結合パートナーと一緒になった、ヒトＳＤＭＦ（配列番号：２）のアミノ酸配 列を有するＳＤＭＦ蛋白またはその機能的誘導体が提供される。ＳＤＭＦ遺伝子 産物／結合パートナー複合体の生成を可能にする条件下で、ＳＤＭＦ活性を転調 させる可能性のある試験物質とともに混合物をインキュベーションする。複合体 、遊離ＳＤＭＦ蛋白または遊離結合パートナーの存在に関してアッセイを行い、 結果を対照と比較して試験物質の効果を決定する。 ＳＤＭＦ機能の転調はＳＭＣ移動に影響を及ぼすと考えられる。そのように同 定されるモジュレーターは、アテローム性動脈硬化、再狭窄またはＳＭＣ移動が 関与している他の血管の病気の治療および予防のための処置薬として有用である と考えられる。 さらに、すべてではないが大部分のＳＭＣ移動因子は特異的受容体蛋白と相互 作用する。ＳＤＭＦを用いて、それと相互作用する蛋白を単離することができ、 この相互作用を妨害の標的とすることができる。ＳＤＭＦと他の因子との間の蛋 白−蛋白相互作用の阻害剤は、ＳＤＭＦ活性を転調させる医薬の開発を可能にす る。 ＳＤＭＦ遺伝子産物／結合パートナー複合体の蛋白−蛋白相互作用のごとき蛋 白−蛋白相互作用についてのアッセイ方法、ならびにＳＤＭＦと相互作用する蛋 白の単離方法は、当業者に知られている。以下に述べる方法の使用は、当業者が 過度の実験を行うことなくこれらの目的を達成することを可能にする。 酵母の２−ハイブリッド系は、転写アクチベーター活性の再構築を用いてイン ビボにおいて第１の蛋白と第２の蛋白との間の相互作用を調べる方法を提供する 。該方法は、例えば米国特許第５２８３１７３号に開示されており、試薬はClon techおよびStratageneから入手できる。簡単に説明すると、ＳＤＭＦ ｃＤＮＡ をＧａｌ１４転写因子ＤＮＡ結合ドメインに融合し、酵母細胞において発現させ る。目的細胞から得たｃＤＮＡライブラリーのメンバーをＧａｌ１４のトランス 活性化ドメインに融合させる。ＳＤＮＦと相互作用しうる蛋白を発現するｃＤＮ Ａクローンは、Ｇａｌ１４活性の再構築およびＧａｌ１−ｌａｃＺのごときリポ ーター遺伝子の発現のトランス活性化を誘導するであろう。 別法は、組み換えＳＤＭＦを用いるλｇｔ１１、λＺＡＰ（Stratagene）また は同等ｃＤＮＡ発現ライブラリーのスクリーニングである。組み換えＳＤＭＦ蛋 白またはそのフラグメントをＦＬＡＧ、ＨＳＶまたはＧＳＴのごとき小型ペプチ ドタグに融合させる。ペプチドタグは、心筋クレアチンキナーゼのごときキナー ゼに対する便利なリン酸化部位を有していてもよく、あるいはビオチン化されて いてもよい。組み換えＳＤＭＦを［³²Ｐ］でリン酸化してもよく、あるいは未標 識で使用してストレプトアビジンまたはタグに対する抗体を用いて検出してもよ い。λｇｔ１１ｃＤＮＡ発現ライブラリーを目的細胞から作成し、組み換えＳＤ ＭＦとともにインキュベーションし、洗浄し、次いで、ＳＤＭＦと相互作用する ｃＤＮＡクローンを単離する。例えば、上記T.Maniatisらの文献参照。 もう１つの方法は、ベクターの哺乳動物プロモーターとポリアデニル化部位と の間にｃＤＮＡがが組み込まれている哺乳動物発現ライブラリーをスクリーニン グし、ＣＯＳまたは２９３細胞を一時的にトランスフェクションし、次いで、固 定され洗浄された細胞を標識ＳＤＭＦ（好ましくはヨウ素化されている）ととも にインキュベーションすることにより４８時間後に結合蛋白を検出し、結合ＳＤ ＭＦの検出はオートラジオグラフィーによるものである(例えば、Sims et al., Science241,585-589(1988)およびMcMahan et al.,EMB0 J.10,2821-2832(1991)参 照)。このようにして、目的結合蛋白をコードしているｃＤＮＡを含むｃＤＮＡ のプールを選択し、さらに各プールを分割し、次いで、一時的トランスフェクシ ョン、結合、オートラジオグラフィーのサイクルを行うことにより目的ｃＤＮＡ を単離することができる。別法として、ｃＤＮＡライブラリー全体を哺乳動物細 胞中にトランスフェクションし、次いで、プレートに結合したＳＤＭＦを含むデ ィッシュ上で細胞をパンニングすることにより目的ｃＤＮＡを単離することがで きる。洗浄後に結合している細胞を融解し、プラスミドＤＮＡを単離し、細菌中 で増幅し、次いで、単一ｃＤＮＡクローンが得られるまでトランスフェクション およびパンニングのサイクルを繰り返す(例えば、Seed et al,Proc.Natl.Acad． Sci.USA 84，3365(1987)参照)。結合蛋白をスクリーニングする場合、一時的に トランスフェクションされた細胞から得た上清をアッセイするための結合または 中和アッセイが確立されたならば、同様のプーリング法によりそのｃＤＮＡを得 ることができる。上清をスクリーニングするための一般的方法はWonget al.，Sc ience228，810-815(1985)に開示されている。 もう１つの方法は、ＳＤＭＦと直接相互作用する蛋白の細胞からの単離である 。ＧＳＴまたは小型ペプチドタグとＳＤＭＦとの融合蛋白を作成し、ビーズ上に 固定化する。生合成的に標識された、あるいは末標識の蛋白抽出物を目的細胞か ら調製する。ＳＤＭＦと相互作用する蛋白を特異的にビーズから溶離し、ＳＤＳ −ＰＡＧＥにより分析する。精密配列決定により結合パートナーの１次アミノ酸 配列データを得る。 もう１つの別法は免疫アフィニティー精製である。組み換えＳＤＭＦを標識ま たは未標識細胞抽出物とインキュベーションし、抗−ＳＤＭＦ抗体と免疫沈降さ せる。免疫沈降物をプロテインＡ−セファロースを用いて回収し、ＳＤＳ−ＰＡ ＧＥにより分析する。末標識蛋白をビオチン化により標識し、ストレプトアビジ ンを用いてＳＤＳゲル上で検出する。精密配列決定により結合パートナー蛋白を 分析する。さらに、精密配列決定の前に当業者に知られた標準的な生化学的精製 工程を用いてもよい。 さらにもう１つの別法は、結合パートナーを求めてペプチドライブラリーをス クリーニングすることである。組み換えタグ付きまたは標識ＳＤＭＦを用いて、 ペプチドライブラリーからＳＤＭＦと相互作用するペプチドを選択する。ペプチ ドの配列決定は、相互作用する蛋白中に見いだされるかもしれないコンセンサス ペプチド配列の同定を導く。 これらの方法または当業者に知られた他の方法のいずれかにより同定されたＳ ＤＭＦ結合パートナーならびに上記の推定結合パートナーを本発明アッセイ方法 に用いることができる。ＳＤＭＦ／結合パートナー複合体の存在についてのアッ セイを、例えば、酵母の２−ハイブリッド系、複合体に特異的な抗体を用いるＥ ＬＩＳＡまたは免疫アッセイにより行う。ＳＤＭＦ／結合パートナーの相互作用 の形成を妨害または阻害する試験物質の存在下で、試験物質を欠く対照と比較す ると複合体量が減少していることがわかるであろう。 例えば、特異的抗体を用いるＥＬＩＳＡまたは免疫アッセイにより、あるいは 放射性標識したＳＤＭＦを細胞または細胞膜とともにインキュベーションし、次 いで、遠心分離またはフィルターで分離する工程により、遊離ＳＤＭＦまたは結 合パートナーについてのアッセイを行う。ＳＤＭＦ／結合パートナー相互作用の 形成を妨害または阻害する試験物質の存在下で、試験物質を欠く対照と比較する と遊離ＳＤＭＦまたは遊離結合パートナーの量が増加していることがわかるであ ろう。 本発明のもう１つの態様は、有効量の本発明ＳＤＭＦ蛋白および医薬上許容さ れる担体を含んでなる医薬組成物である。本発明蛋白性薬剤の医薬組成物は、特 に非経口投与、すなわち、皮下、筋肉内または静脈投与に有用である。リポソー ムのごとき膜結合小胞によりＳＤＭＦ蛋白を取り囲んでもよい。 一般的には、非経口的投与用組成物は、適当な担体、好ましくは水性担体に溶 解された本発明蛋白の溶液またはそのカクテルを含んでなる。種々の水性担体、 例えば水、緩衝化された水、０.４％セイライン、０.３％グリシン等を用いてよ い。これらの溶液を滅菌し、一般的には粒子状物質を不含とする。慣用的なよく 知られた滅菌法によりこれらの溶液を滅菌してもよい。組成物は、ｐＨ調節剤お よび緩衝化剤等のごとき生理学的条件を適切化するのに必要な医薬上許容される 補助物質を含有していてもよい。かかる医薬処方中の本発明蛋白の濃度を広範囲 に変化させることができ、すなわち、約０.５％末満から約１％ないし１５もし くは２０％程度、通常には約１％または少なくとも約１％であり、主として液体 の体積、粘度等に基づいて、さらに選択された投与モードに応じて選択されるで あろう。 よって、１ｍｌの滅菌緩衝化水および５０ｍｇの本発明蛋白を含有するように 、筋肉内注射用の本発明医薬組成物を製造することができる。同様に、２５０ｍ ｌの滅菌リンゲル溶液および１５０ｍｇの本発明蛋白を含有するように、静脈輸 液用の本発明医薬組成物を製造することができる。非経口投与可能な組成物の実 際的な製造方法は当業者によく知られているか、あるいは明らかであろうし、例 えば、Remington's Pharmaceutical Science,15th ed.,Mack Publishing Compan y,Easton，Pennsylvaniaにおいて詳細に記載されている。 本明細書記載の蛋白を保存のために凍結乾燥し、使用前に適当な担体で復元す ることができる。この方法は慣用的な蛋白について有効であることが示されてお り、当該分野で知られている凍結乾燥および復元方法を用いることができる。 医師は、最適な本発明治療薬の用量を決定し、用量は投与形態および選択した 個々の化合物に応じて変更されるであろうし、さらにそのうえ、用量は治療中の 個々の患者に応じて変更されるであろう。一般的には、医師は、化合物の最適用 量よりも実質的に少ない用量で治療を開始し、その状況下で最適効果が達成され るまで用量を少しずつ増加させることを望むであろう。一般的には、組成物を経 口投与する場合、非経口的に少量を与えた場合と同じ効果を得るには活性薬剤量 を多く必要とすることがわかっている。一般的には、治療的用量は１日１ないし １０ミリグラムおよびそれより多く、別々の１回分として数回に分けて投与して もよい。 患者の状態に応じて、本発明医薬組成物を予防的および／または治療的処置の ために投与することができる。治療的適用においては、すでに罹病している患者 に、少なくとも部分的に疾病およびその合併症の進行を停止させるに十分な量の 組成物を投与する。予防的適用においては、まだ疾病状態にない患者に本発明化 合物またはそのカクテルを含有する組成物を投与して、疾病に対する患者の抵抗 力を増大させる。 担当医師により選択された用量レベルおよびパターンで、医薬組成物の１回ま たは複数回の投与を行うことができる。いずれの場合にも、本発明医薬組成物は 有効に患者を処置するに十分な量の本発明化合物を提供すべきである。 さらに、いくつかの疾病は遺伝的に欠損した遺伝子から生じる。欠損遺伝子の 配列を正常なものと比較することによりこれらの遺伝子を検出することができる 。ＳＤＭＦ遺伝子中に変異を有する個体を種々の方法によりＤＮＡレベルで検出 してもよい。診断に用いる核酸（ゲノムＤＮＡ、ｍＲＮＡ等）を、血液、尿、唾 液または組織生検、例えば絨毛膜サンプリングまたは羊水細胞採取および剖検材 料のごとき患者の細胞から得てもよい。ゲノムＤＮＡを検出に直接使用してもよ く、あるいは分析前にＰＣＲ、リガーゼ連鎖反応（ＬＣＲ）、鎖置換増幅（ＳＤ Ａ）等により酵素的に増幅してもよい。例えば、Saiki et al.,Nature,324,163- 166(1986)、Bej,et al.,Crit.Rev.Biochem.Molec.Biol.,26,301-334(1991)、Van Brunt,J.,Bio/Technology,8,291-294(1990)参照。ＲＮＡまたはｃＤＮＡを同じ 目的に使用してもよい。一例として、本発明核酸に対して相捕的なＰＣＲプライ マーを用いてＳＤＭＦの変異を同定し分析することができる。例えば、正常ＳＤ ＭＦ遺伝子型と比較した場合の増幅生成物のサイズの変化により欠失および挿入 を検出することができる。増幅したＤＮＡを本発明の放射性標識ＳＤＭＦ ＲＮ Ａあるいは本発明の放射性標識ＳＤＭＦアンチセンスＤＮＡ配列とハイブリダイ ゼーションさせることにより、点突然変異を同定することができる。ＲＮａｓｅ Ａ消化により、あるいは融解温度（Ｔｍ）の差により、完全にマッチした配列 をミスマッチ２重鎖から識別することができる。かかる診断は、出産前および新 生児の試験に特に有用であろう。 さらに、リファレンス遺伝子および「変異」遺伝子間の点突然変異および他の 配列の相違を、他のよく知られた方法、例えば直接ＤＮＡ配列決定、１本鎖コン ホーメーション多型性により同定することができる。0rita et al.,Genomics,5, 874-879(1989)参照。例えば、配列決定プライマーを、２本鎖ＰＣＲ生成物また は修飾ＰＣＲにより得られた１本鎖鋳型分子と一緒に用いる。放射性標識したヌ クレオチドを用いる慣用的方法により、あるいは蛍光タグを用いる自動配列決定 法により、配列決定を行う。クローン化したＤＮＡセグメントをプローブとして 用いて特定のＤＮＡセグメントを検出してもよい。この方法の感度は、ＰＣＲと 組み合わせた場合に大幅に上昇する。ヌクレオチドリピートの存在はＳＤＭＦ活 性における病因となる変化に関連して要る可能性があり、あるいは種々の多型性 のマーカーとして役立つ可能性がある。 変性剤の存在下または不存在下におけるゲル中のＤＮＡフラグメントの電気泳 動度の変化を検出することによりＤＮＡ配列の相違に基づく遺伝学的試験を行っ てもよい。高分解能ゲル電気泳動により、小さな配列の欠失および挿入を可視化 することができる。変性ホルムアミドグラジエントゲルにより異なる配列のＤＮ Ａフラグメントを識別してもよく、ゲル中では個々のＤＮＡフラグメントの融解 温度または部分融解温度に応じてＤＮＡフラグメントの移動度が異なり、ゲル中 の別々の位置で停留する。例えば、Myers et al.,Science,230,1242(1985)参照 。さらに、配列の変化、詳細には小さな欠失を、ヘテロ２重鎖電気泳動のごとき 非変性ゲル電気泳動におけるＤＮＡヘテロ２重鎖の泳動パターンの変化として検 出してもよい。例えば、Nagamine et al.,Am.J.Hum.Genet.,45,337-339(1989)参 照。ＲＮａｓｅおよびＳ１保護またはCotton et al.Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85 ,4397-4401(1985)により開示されたような化学的開裂法ヌクレアーゼ保護アッセ イにより、特定の位置における配列の変化を明らかにしてもよい。 よって、ハイブリダイゼーション(例えば、ヘテロ２重鎖電気泳動、WFhite et al.,Genomics,12,301-306(1992))、ＲＮＡｓｅ保護(例えば、Myers et al.,Sci ence,230,1242(1985))、化学的開裂（例えば、Cotton et al.,Proc.Natl.Acad.S ci.USA,85,4397-4401(1985)）、直接的ＤＮＡ配列決定、あるいは制限酵素の使 用（例えば、制限フラグメント長多型性（ＲＦＬＰ）、ＲＦＬＰにおいて制限フ ラグメントの数およびサイズは、挿入、欠失、ヌクレオチドリピートの存在、な らびにエンドヌクレアーゼ制限配列を生成または破壊する他の変異を示しうる。 ） のごとき方法により特定のＤＮＡ配列の検出を行ってもよい。ゲノムＤＮＡのサ ザンブロツテイングを用いて大きな欠失および挿入、すなわち１００塩基対より も大きいものを同定してもよい。 慣用的なゲル電気泳動およびＤＮＡ配列決定に加えて、微小欠失、異数体度、 トランスロケーションおよび逆位のごとき突然変異をインシトゥ（in situ）分 析により検出することもできる。例えば、Keller et al.,DNA Probes,2nd Ed.,S tockton Press,New York,N.Y.USA(1983)参照。すなわち、単離および／または膜 上への固定化をすることなく細胞中のＤＮＡまたはＲＮＡ配列を分析することが できる。蛍光インシトゥハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）は現在最も普通に 適用されている方法であり、ＦＩＳＨに関する多くの解説がある。例えば、Trac huck et al.,Science,250,559-562(1990)、およびTrask et al.,Trends,Genet. ，7，149-154(1991)参照。それゆえ、SDMF 遺伝子の構造に基づいた核酸を用い ることにより、遺伝学的変異の診断試験を開発することができる。 さらに、いくつかの疾病は、ｍＲＮＡにおける変化により検出されうる遺伝子 発現の変化の結果によるものであるか、あるいはかかる変化により特徴づけられ るものである。別法として、ＳＤＭＦ遺伝子をリファレンスとして用いて、例え ばノーザンブロッティングまたはインシトゥハイブリダイゼーションによって、 上昇または低下したレベルのＳＤＭＦ蛋白を発現する個体を同定することもでき る。 適当なハイブリダイゼーション条件を決定することは当業者の範囲内のことで ある。例えば、”Current Protocols in Mol.Biol.”Vol.I & II,Wiley Intersc ience.Ausbel et al.(eds.)(1992)参照。プローブ法は当業者によく知られてお り、プローブのサイズを広範囲に変化させることができるが、プローブが少なく とも１５ヌクレオチドの長さであるのが好ましいということが理解されている。 また、好ましくは、かかるプローブを分析的に検出可能な試薬で標識してプロー ブの同定を容易にし、あるいは容易にすることができることが理解されている。 有用な試薬は、放射性同位元素、蛍光色素または検出可能な生成物の形成を触媒 できる酵素を包含するが、これらに限らない。一般則として、ハイブリダイゼー ション 条件が厳密であるほど、より密接に関連した遺伝子が回収されるであろう。 ＳＭＣ移動の調節におけるヒトＳＤＭＦの役割は、本発明のさらにもう１つの 態様を確立し、それは遺伝子治療である。「遺伝子治療」とは、目的遺伝子のさ らなるリファレンスコピーを患者の細胞中に挿入する遺伝子補足を意味する。結 果として、リファレンス遺伝子は欠陥を修正し、細胞が正常に機能することを可 能にし、かくして、疾病の徴候が改善される。リファレンスコピーは野生型のＳ ＤＭＦ遺伝子または内在ＳＤＭＦの活性を転調させる蛋白もしくはペプチドをコ ードしている遺伝子であろう。 本発明遺伝子治療はインビボまたはエクスビボ（exvivo）で行える。エクスビ ボ遺伝子治療には、患者細胞の単離および精製、治療遺伝子の導入、および遺伝 学的に変化した細胞を患者体内に戻すことを必要とする。修飾レトロウイルスの ごとき複製欠陥ウイルスを用いて治療ＳＤＭＦ遺伝子をかかる細胞中に導入する ことができる。例えば、マウスMolony白血病ウイルス（ＭＭＬＶ）は、臨床的な 遺伝子試行においてよく知られたベクターである。例えば、Boris-Lauerie et a l.,Curr.0pin.Genet.Dev.,3，102-109(1993)参照。 対照的に、インビボ遺伝子治療は患者細胞の単離および精製を必要としない。 典型的には、患者への投与のために、例えばリポソーム中あるいはBerkner,K.L. ,Curr.Top.Microbiol．Immunol.，158,39-66(1992)により記載されたアデノウイ ルスまたはMuzyczka,N.,Curr.Top.Microbiol.Immunol.,158,97-129(1992)および 米国特許第５２５２４７９号に記載のアデノ関連性連ウイルスのごとき複製欠陥 ウイルス中に治療遺伝子を「パッケージ」する。もう１つのアプローチは、「裸 のＤＮＡ」の投与であり、ＤＮＡで被覆された金粒子を用いる微粒子爆弾により 治療遺伝子が標的組織中に導入される。 本発明遺伝子治療に有用な細胞タイプは、リンパ球、肝細胞、筋芽細胞、繊維芽 細胞、網膜細胞のごとき目の細胞、上皮細胞および内皮細胞を包含する。リポソ ーム中のＤＮＡベクター、ＤＮＡ−蛋白複合体または複製欠陥アデノウイルスの 霧化調合品の吸入により、上皮細胞のトランスフェクションを行うことができる 。例えば、米国特許第５２４０８４６号参照。 本発明のも１つの態様は、いずれかの細胞中で本発明ポリヌクレオチドを発現 しうるトランスジェニックな非ヒト動物である。宿主の適当な受精卵または胚を 本発明ポリヌクレオチドまたはヒトの疾病において見いだされる変異形態ポリヌ クレオチドでトランスフェクションすることにより、トランスジェニックな非ヒ ト動物を得てもよい。例えば、米国特許第４７３６８６６号、第５１７５３８５ 号、第５１７５３８４号および第５１７５３８６号参照。得られたトランスジェ ニック動物をＳＤＭＦ遺伝子機能の研究モデルとして使用してもよい。特に有用 なトランスジェニック動物は、ＳＤＭＦ蛋白の発現に関連した検出可能な表現型 を示す動物である。次いで、薬剤開発の候補物質を、その関連表現型を逆転また は悪化させる能力についてスクリーニングしてもよい。 以下の特定の非限定的な実施例を参照して本発明を説明する。 実施例１ ヒトＳＤＭＦ全長ｃＤＮＡのクローニングおよび配列分析 上記Koyama et al.J.Biol.Chem.の方法によりラットＳＤＭＦ蛋白を精製した 。精製された６０ｋＤａの蛋白を自動エドマン分解配列決定に供したところ、ブ ロックされたＮ末端を含むことがわかった。さらにＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製された ＳＤＳ−ＰＡＧＥ精製された物質をインシトゥでのトリプシン消化に供し、溶離 したペプチドを微小孔性Ｃ１８逆相クロマトグラフィーにより精製した。 ＭＡＬＤＩ質量スペクトル法により決定された１６５５.５ Ｄａの実験質量を有 するトリプシン消化ペプチドのエドマン配列決定により、配列ＹＤＡＬＥＶＦＡ ＧＳＧＴＳＧＱＲ（配列番号：３）を含むことがわかった。ラットＳＤＭＦアミ ノ酸配列をＰＩＲデータベースと比較することにより、Genbank アソシエーショ ン番号ＪＨ０４０３を有する機能不明の４０２個のアミノ酸のネズミ配列との正 確なマッチが示された。この配列はｐ４と同定され、ＤＮＡおよびアミノ酸配列 がLecain らの上記文献に報告されている（配列番号：４および５）。これらの 結果に基づいて、これまで不明であったネズミｐ１４の機能は、平滑筋細胞由来 の移動因子としての機能であることがわかった。 ネズミｐ１４配列を伴う発現配列タグ（ＥＳＴ）として知られる短い部分配列 からなるランダムｃＤＮＡ配列データベースを検索したところ、ｐ１４またはＳ ＤＭＦに対する推定上のヒト相同体の部分をコードする多くのＥＳＴが示された 。ネズミｐ１４ ｃＤＮＡ配列の５’末端とマッチし、開始コドンを含んでいる ＥＳＴを含有するｃＤＮＡを選択し、さらに配列決定を行った（配列番号：１） 。このｃＤＮＡは、もともと、λＺＡＰ中のヒト胎児心臓ｃＤＮＡライブラリー から単離されたものであった。 ＳＤＭＦ ｃＤＮＡの配列分析により、位置９４のＡＴＧから開始し、位置１ ４４１のＴＧＡで終結する、推定分子量４９.４ｋＤａの４４９個のアミノ酸（ 配列番号：２）をコードしている１３４７個のヌクレオチドの読み枠（配列番号 ：１）が明らかとなった。 Lecainらにより報告されたネズミｐ１４ＤＮＡ配列（配列番号：４）は、上記 Takaharaらにより決定されたが、２個のグアノシン残基が省略されていた。Leca inらにより公表された配列のヌクレオチド１２１３および１２１４間に１のさら なる残基が存在し、ヌクレオチド１３７５および１３７６間にもう１つの残基が 存在した。訂正されたネズミｐ１４ＤＮＡおよびアミノ酸配列を、それぞれ配列 番号：６および７に示す。 ＧＣＧプログラムBestfitを用いてヒトＳＤＭＦの推定アミノ酸配列を訂正さ れたネズミｐ１４配列と並置比較した。正味のアミノ酸同一性は８５％であり、 ５つのギャップを伴っており、これを図１に示す（上はヒトＳＤＭＦ；下はネズ ミｐ１４）。両方の蛋白配列は、相捕的蛋白Ｃ１ｒおよびＣ１ｓならびに分泌蛋 白であるヒト骨形態形成蛋白−１、アフリカツメガエル由来のＡＳ抗原、ウシ酸 性精液前駆体蛋白およびブタ精子付着蛋白ＡＷＮ、ＡＱＮ−１および−３におい て見いだされるドメインに対する相同領域の２個のリピート（ネズミ配列の３６ 〜１４５および１５８〜２６９）をコードしている。 ネズミｐ１４アミノ酸配列（配列番号：５）を用いてGenEMBLデータベースを 検索すると、４４９個ののヒトプロコラーゲンＣ−プロテイナーゼエンハンサー 蛋白（ＰＣＯＬＣＥ）（受託番号Ｌ３３７９９）（配列番号：８および９）が示 され、９１.１％の同一性であった。ＰＣＯＬＣＥは上記Takaharaらにより報告 されている。ＧＣＧプログラムBestfitを用いて、ヒトＳＤＭＦの推定アミノ酸 配列（配列番号：２）をヒトＰＣＯＬＣＥ配列（配列番号：９）と並置比較した 。正味のアミノ酸同一性は９９％であり、ギャップはなく、これを図２に示す（ 上はヒトＳＤＭＦ；下はヒトＰＣＯＬＣＥ）。 実施例２ ヒトＳＤＭＦの発現 推定上のヒトＳＤＭＦｃＤＮＡを、ＥｃｏＲＩ（５’末端）およびＫｐｎＩ（ ３’末端）での消化によりそのクローニングベクター(pBluescript)から単離し 、哺乳動物発現ベクターｐＣＤＮ（Aiyar et al.，Molecular and CellularBioc hemistry131,75-86(1994)）中に挿入した。上記ManiatisらのＤＥＡＥデキスト ラン／クロロキン法、次いで、１０％ＤＭＳＯショック（例えばManiatisらの） を用いて、前日に１５０ｍｍフラスコに撒いておいた８ｘ１０⁶個のＣＯＳ細胞 中にこのベクター６０μｇをトランスフェクションした。感染後２４時間、１０ ％ＦＢＳ／ＤＭＥＭ中に細胞を置き、次いで、血清含有培地を除去し、細胞をＰ ＢＳで２回洗浄し、ヌクレオチドを含有する無血清培地１５ｍｌを添加した。４ ８時間後および１２０時間後に培地を集め、遠心分離して細胞残渣を除去し、７ .５％重炭酸ナトリウムを用いてｐＨを約８.０に調節した。 トランスフェクション１日前に２００００個／ｃｍ²の細胞密度で撒いた１リ ットルの細胞培養および、ＤＥＡＥ／デキストラン中１.８ｍｇ／ｍｌのＤＮＡ を用い、４時間後、１０％ＤＭＳＯを添加し、次いで、無血清培地で３日間培養 して、本質的に同様にして大規模ＣＯＳトランスフェクションを行った。 実施例３ ヒトＳＤＭＦの生物活性 ＣＯＳ細胞においてで発現されたヒトＳＤＭＦの生物活性を、インビトロにお けるラット大動脈平滑筋細胞移動モデルにおいて示した。このモデルはHidaka e t al.Atherosclerosis 95，87-94(1992)により報告された。ラツト大動脈平滑筋細 胞（ＲＡＳＭＣ）を０.２％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を補足したDulbecco 改変Eagle培地（ＤＭＥＭ）中に２.５ｘ１０⁶個／ｍｌの濃度で懸濁した。アッ セイにおいて、０.２ｍｌのＲＡＳＭＣをアッセイチャンバーの上部コンパート メントに入れた。チャンバーの下部コンパートメントには０.６ｍｌの０.２％Ｂ ＳＡ補足ＤＭＥＭを入れた。ＣＯＳ細胞培養上清からほぼ均一にまで精製された ヒトＳＤＭＦをフィルターの下側の表面にコーティングするか、あるいは下部コ ンパートメントに添加した。ＲＡＳＭＣを、最大の平滑筋細胞移動（対照）を誘 導する濃度の血小板由来増殖因子（ＲＤＧＦ）または種々の濃度の精製ＳＤＭＦ に供した。９５％空気および５％ＣＯ₂の雰囲気下、３７℃で２０時間インキュ ベーションした。インキュベーション後、上側の表面の移動しなかった細胞をゆ やかに掻き取り、ＰＢＳで３回洗浄した。濾紙を固定し、ギムザ染色した。フィ ルターの下側の表面に移動したＳＭＣの数を顕微鏡により決定し、１のランダム に選択されたハイパワーフィールド（high-power field,HPF）をフィルター１枚 当たりにつき計数した。実験を３系で行った。図３の結果は、精製ＳＤＭＦは用 量依存的にラット平滑筋細胞の移動を促進し、その最大活性はＰＤＧＦの少なく とも４〜５倍であることを示し、上記Koyama et al.,J.Biol.Chem.により公表さ れた観察結果と矛盾しない。 本発明の精神または本質的属性から逸脱することなく、本発明を他の特定の形 態に具体化してもよく、したがって、上記説明ではなく、本発明の範囲を示すも のとして添付した請求の範囲について参照が行われるべきである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｋ 45/00 Ａ６１Ｋ 48/00 48/00 Ｃ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 16/18 16/18 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ Ｃ１２Ｐ 21/02 Ａ６１Ｋ 37/02 //(Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，Ｕ Ｇ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｎ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，Ｒ Ｏ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ハール，マーク・ロバート アメリカ合衆国19405ペンシルベニア州ブ リッジポート、コロンブス・ストリート 641番 (72)発明者 マクドネル，ピーター・コロン アメリカ合衆国19027ペンシルベニア州エ ルキンズ・パーク、トゥルプホッケン・ア ベニュー8311番 (72)発明者 マクナルティ，ディーン・エドワード アメリカ合衆国19147ペンシルベニア州フ ィラデルフィア、フルトン・ストリート 229シー番 (72)発明者 ローゼン，クレイグ・アラン アメリカ合衆国20882メリーランド州レイ トンズビル、ローリング・ヒル・レイン 22400番 (72)発明者 シーメンス，アイボ・ログリア アメリカ合衆国19335ペンシルベニア州ダ ウニングタウン、カーペンターズ・コー ブ・レイン411番 (72)発明者 ヤング，ピーター・ロナルド アメリカ合衆国08648ニュージャージー州 ローレンスビル、ヘンドリクソン・ロード 32番 (72)発明者 ユー，ティアン―リ アメリカ合衆国19083ペンシルベニア州ヘ イバータウン、アーリントン・ロード308 番

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．（ａ）配列番号：１に示すヌクレオチド９４から１４４０までのヌクレオ チド配列を有する、ヒトＳＤＭＦをコードしているポリヌクレオチド。 （ｂ）中程度の厳密さのハイブリダイゼーション条件下で（ａ）に記載のポリ ヌクレオチドの相補物にハイブリダイゼーションでき、機能的なヒトＳＤＭＦを コードしているポリヌクレオチド、および （ｃ）（ａ）または（ｂ）に記載のポリヌクレオチドの縮重ポリヌクレオチド からなる群から選択される単離ポリヌクレオチド。 ２．配列番号：１に示すヌクレオチド配列を有する単離ポリヌクレオチド。 ３．請求項１のポリヌクレオチドによりコードされる機能的ポリペプチド。 ４．配列番号：２に示すアミノ酸配列を有するヒトＳＤＭＦである請求項３の 機能的ポリペプチド。 ５．ＤＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ６．ゲノムＤＮＡである請求項５のポリヌクレオチド。 ７．ＲＮＡである請求項１のポリヌクレオチド。 ８．請求項５のＤＮＡを含むベクター。 ９．請求項８のベクターを含む組み換え宿主細胞。 １０．請求項９の組み換え宿主細胞を蛋白の発現を促進する条件下で培養し、 次いで、発現蛋白の回収を行うことを特徴とする、本質的に純粋なヒトＳＤＭＦ 蛋白の製造方法。 １１．請求項１０の方法により製造されるヒトＳＤＭＦ。 １２．請求項１のポリヌクレオチドに結合しうる配列を含むアンチセンスオリ ゴヌクレオチド。 １３．請求項３のポリペプチドのモジュレーター。 １４．抗体である請求項１３のモジュレーター。 １５．モノクローナル抗体である請求項１４の抗体。 １６．ＳＤＭＦ活性を転調させる物質の存在について培地をアッセイする方法 であって、下記工程： （ａ）ＳＤＭＦのアミノ酸配列（配列番号：２）を有するＳＤＭＦ蛋白または その機能的誘導体ならびにＳＭＣをチャンバー内に入れること、 （ｂ）ＳＤＭＦ活性を転調させる可能性のある試験物質をＳＤＭＦまたはＳＭ Ｃのいずれかに添加すること、 （ｃ）ＳＭＣの移動を可能にする条件下でチャンバーをインキュベーションす ること、 （ｄ）移動したＳＭＣおよび移動しなかったＳＭＣの数を数えること、次いで （ｅ）対照との比較を行って試験物質の効果を決定すること を含む方法。 １７．請求項１６の方法により同定されるＳＤＭＦ蛋白転調化合物。 １８．治療上有効量の請求項１７の転調化合物を患者に投与することを特徴と する、ＳＤＭＦ活性の転調を必要とする患者の治療方法。 １９．ＳＤＭＦ活性を転調させる物質の存在について培地をアッセイする方法 であって、下記工程： （ａ）ＳＤＭＦのアミノ酸配列（配列番号：２）を有するＳＤＭＦ蛋白または その機能的誘導体および結合パートナーを用意すること、 （ｂ）ＳＤＭＦ蛋白／結合パートナー複合体の形成を可能にする条件下で、Ｓ ＤＭＦ活性を転調させる可能性のある試験物質とともにインキュベーションする こと、 （ｃ）複合体、遊離ＳＤＭＦ蛋白または遊離結合パートナーの存在についてア ッセイすること、次いで （ｄ）対照との比較を行って試験物質の効果を決定すること を含む方法。 ２０．請求項１９の方法により同定されるＳＤＭＦ蛋白転調化合物。 ２１．治療上有効量の請求項２０の転調化合物を患者に投与することを特徴と する、ＳＤＭＦ活性の転調を必要とする患者の治療方法。 ２２．治療上有効量の請求項３のポリペプチドを患者に投与することを特徴と する、ＳＤＭＦを必要とする患者の治療方法。 ２３．請求項３のポリペプチドおよび医薬上許容される担体を含んでなる医薬 組成物。 ２４．ＳＤＭＦ蛋白欠乏に関連した症状の診断方法であって、 （ａ）個体からポリヌクレオチド試料を単離すること、 （ｂ）ポリヌクレオチド試料および配列番号：１に示すヌクレオチド９４から １４４０までに示すヌクレオチド配列を有するＳＤＭＦをコードしているポリヌ クレオチドをアッセイすること、次いで （ｃ）ポリヌクレオチド試料とＳＤＭＦポリヌクレオチドとの間の相違を比較 すること を特徴とし、相違がＳＤＭＦ遺伝子における変異を示すものである方法。 ２５．不十分なＳＤＭF蛋白機能に関連した症状の治療方法であって、 ＳＤＭＦ蛋白機能を欠乏している患者に請求項１のポリヌクレオチドを投与する ことを特徴とし、ＳＤＭＦ蛋白が発現され症状が改善される方法。 ２６.いずれかの細胞において請求項５のＤＮＡを発現しうるトランスジェニ ック非ヒト動物。