JP2000502342A - 固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカーアームおよびその製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 固体支持体オリゴヌクレオシド合成用のリンカー アームであって、該リンカー アームは、式（１）を備え、該式（１）において、Ｘ¹は、−Ｏ−基、−Ｓ−基、−Ｓ（Ｏ）₂−基および−Ｎ（Ｒ１２）−基からなる群から選択され；Ｒ¹²は、水素基、置換または未置換Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換_C〜-_C3０アリール基、および置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；Ｘ³は、−Ｏ−基または−Ｎ（Ｈ）−基であり、Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³Ｒ⁴およびＲ⁵は、同じかまたは異なり、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；ｎは、０、１または２であり、Ａ’及びＢ’の一方は、水素基、ハロゲン化物基、置換又は未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基及び置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる群から選択され、Ａ’およびＢ’の他方は、式（２）を有し、該式（２）において、−Ｏ−基、−Ｓ−基、−Ｓ（Ｏ）₂−基および−Ｎ（Ｒ¹³）−基からなる群から選択され、Ｒ¹³は、水素基、置換または未置換Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じかまたは異なり、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換Ｃ5〜Ｃ40アルキルアリール基からなる群から選択され、ｐは０または１であり、ｍは、０、１または２である。リンカー アームを製造するための方法が開示されている。このリンカー アームは、固体支持体オリゴヌクレオチド合成に有用であり、また、自発的な加水分解に対する安定性と、リンカー アームから合成されたオリゴヌクレオチドの意図された分割の容易さとの望ましい組み合わせを特徴とする。

Description

【発明の詳細な説明】 固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカーアームおよびその製法 技術的分野 本発明は、固体支持体オリゴヌクレオチド合成（solid support oligonucleo- tide synthesis）のためのリンカー アームに関し、またその製法に関するもの である。 背景の技術 固体支持体上の有機化学の技術は一般に知られている。この話題に関する有用 な調査研究論文はフリュヒテル（Fruchtel）らの“固体支持体上の有機化学（Or ganic Chemistry on Solid Supports）”、Angew.Chem.Int.Ed.Engl.,１９９６ 、３５巻、１７−４２ページに見いだされる；その内容は参考として本明細書に 組み入れられるものである。 フリュヒテルらが述べているように、この技術はポリペプチド、オリゴヌクレ オチドおよびオリゴ糖の自動固相合成を発達させた。ここで特に興味深いのは、 オリゴヌクレオチドの固相合成である。下記はこの話題に関する有用な調査研究 論文／テキストブックである： ビューケージ（Beaucage）ら、テトラヘドロン(Tetrahedron)、１９９２、４ ８巻、２２２３ページ； ビューケージら、テトラヘドロン、１９９３、４９巻、６１２３−６１９４ペ ージ； デービス（Davis）ら、固相合成における技術革新および展望（Innovation an d Perspectives in Solid Phase Synthesis）（編集.R.Epton）、Intercept、An dover、１９９２、６３ページ； モントセラ（Montserra）ら、テトラヘドロン、１９９４、５０巻、２６１７ ページ； この各々の内容は参考として本明細書に組み入れられるものである。 オリゴヌクレオチドの固相合成において、スクシニル リンカー アームを担 持する無機固体支持体上でオリゴヌクレオチドを合成することは公知である；例 えば下記の文献を参照されたい： カルサーズ（Caruthers）ら、遺伝子工学（Genetic Engineering）、Plenum P ress、ニューヨーク（１９８２）、４巻、１−１７ページ； レッツィンガー（Letsinger）ら、遺伝子工学、Plenum Press、ニューヨーク （１９８５）、５巻、１９１ページ； フレーラー（Froehler）ら、核酸研究（Nucleic Acids Research）１４巻、５ ３９９−５４０７ページ（１９８６）；および マットィシ（Matteucci）ら、Journal of American ChemicalSociety、１０３ 巻、３１８５−３１８６ページ（１９８１）； これらの内容は参考として本明細書に組み入れられるものである。 典型的にはスクシニル リンカー アームは下記の一般式を有する： こうしてスクシニル基は、成長するオリゴヌクレオチドをその末端３’ヒドロキ シル基からエステル結合によって、そして支持体上の第一アミンにアミド結合に よって結合させる。その支持体は例えば従来のコントロールド・ポーラスガラス （ＣＰＧ）またはシリカである。所望オリゴヌクレオチドがひとたび合成される と、エステルカルボニル基の加水分解によって、それをスクシニル リンカーア ームから遊離させるか、または切断する。その加水分解剤は普通は濃水酸化アン モニウムである。普通はこの反応は完了するまでに１〜４時間かかる。現在の固 相オリゴヌクレオチド合成器が改良されると、この切断段階は所望オリゴヌクレ オチドの合成のために必要な総時間数の５０％またはそれ以上に達する。 こうして固相オリゴヌクレオチド合成に用いるための改良リンカー アームを 開発するために当業者は種々の試みを行っている。 特に注目すべきはレッツィンガーら（レッツィンガー）の米国特許第５，１１ ２，９６２号である；この内容は参考として本明細書に組み入れられるものであ る。レッツィンガーは、下記の構造式を有するオリゴヌクレオチドおよびオリゴ ヌクレオチド誘導体の固相合成のためのリンカー アームを教示している： こうしてレッツィンガーは、彼の主張によれば、合成されたオリゴヌクレオチド またはオリゴヌクレオチド誘導体を１〜３０分の間に、それらオリゴヌクレオチ ドが完全に保護されたままになるようにして遊離することができる、オキサリル リンカー アームを教示している。オキサリル リンカー アームは、彼の主張 によれば、メタノール中５％水酸化アンモニウム、水酸化アンモニウム、湿潤第 三アミン、トリエチルアミン／アルコール、トリエチルアミン／メタノール、ト リエチルアミン／エタノール、水性トリメチルアミンおよびその他の塩基によっ て速やかに切断される。残念ながら、レッツィンガーのオキサリル リンカーア ームは彼が主張する利点によって被害を受ける。より詳細に述べるならば、本発 明者は、レッツィンガーのオキサリル リンカー アームが顕著な自発的加水分 解（例えば１カ月あたり約１０〜４０％の自発的加水分解）を受け、そのため市 場的規模におけるその使用が難しいことを発見した。このことの詳細は以下に示 す。オキサリル リンカー アームは作るのがむずかしい、なぜならばそれは、 非常に反応性に富みかつ有毒でしたがって危険である塩化オキサリルを使用しな ければならないからである。 よって、当業者は、スクシニル リンカー アームの利点（製造／利用しやす い）およびオキサリル リンカー アームの利点（短い切断時間）を有し、一方 両方のアームの欠点を軽減または未然に防ぐことができるリンカー アームをい まだに必要としている。 発明の開示 先行技術の上記の欠点の少なくとも１つを防ぎまたは緩和する固体支持体オリ ゴヌクレオチド合成のための新規のリンカー アームを提供することが本発明の 目的である。 固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカー アームの新規の製法を 提供することが本発明のもう一つの目的である。 よって、その一面において、本発明は固体支持体オリゴヌクレオチド合成のた めのリンカー アームを提供する；このリンカー アームは下記の式を含む： 上記式中、Ｘ¹は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-、−Ｃ_(O)−および−Ｎ(Ｒ¹²) −からなる群から選択され；Ｒ¹²は水素、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキ ル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀ アルカリール基を含んでなる群から選択され；Ｘ³は−Ｏ−または−Ｎ（Ｈ）− であり；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は同じかまたは異なり、水素、ハロゲン 化物、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀ アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる 群から選択され；ｎは０、１または２であり；Ａ’およびＢ’の１つは水素、ハ ロゲン化物、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅ 〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる 群から選択され、Ａ’およびＢ’の他の１つは下記の式であらわされ： 上記式中、Ｘ²は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-、−Ｎ(Ｒ¹³)−からなる群から 選択され；Ｒ¹³は水素、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または 未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基を 含んでなる群から選択され；Ｒ⁶およびＲ⁷は同じかまたは異なり、水素、ハロゲ ン化物、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀ アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からな る群から選択され；ｐは０または１；ｍは０、１または２である。 また別の一面において、本発明は固体支持体オリゴヌクレオチド合成のための リンカー アームの製法を提供する； その製法は：次の段階： 反応：（Ａ）下記の式（Ｉ）のリンカー アーム、 ここで上記式（Ｉ）中、Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³は、同じかまたは異なり、水素、ハ ロゲン化物、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅ 〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群か ら選択され；Ｒ⁴およびＲ⁵は、同じかまたは異なり、置換または未置換のＣ₁〜 Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換 のＣ₅ 〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；Ｘ¹は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（ Ｏ）₂-、および−Ｎ(Ｒ¹²)−からなる群から選択され；Ｒ¹²は、水素、置換また は未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、お よび置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；ｎ は０、１または２であり；ＡおよびＢの１つは、水素、ハロゲン化物、置換また は未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、お よび置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され、Ａ およびＢの他の１つは下記の式であらわされ：上記式中ｐは０または１、Ｘ²は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-および−Ｎ(Ｒ¹³ )−からなる群から選択され、Ｒ¹³は、水素、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀ア ルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜 Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じかまたは異 なり、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀ アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択 され；ｍは０、１または２であるリンカー化合物またはその誘導体；または下記 の式IIであらわされる化合物であって、 上記式中、Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−およびＯ−（(ＣＨ₂)ｌ−Ｏ） ｑからなる群から選択され、ｌは６０以下の整数であり、ｑは１〜１０００の 範囲の整数であり、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、ｍおよびｎは前記と同じ意味であり、 ＹがＯであるとき、ｎおよびｍの少なくとも１つは０または２であるという条件 がつけられている前記化合物を；（Ｂ）所望ヌクレオシドのＯＨと反応させて、 エステル結合を有する誘導体化ヌクレオシドを作り；（Ｃ）固体支持体と反応さ せてリンカー アームを作る段階を含んでなる。 もう一つの面では、本発明は固体支持体オリゴヌクレオシド合成のためのリン カー アームの製法を提供する；そのリンカー アームは下記の式を含み： 上記式中Ｘ３は−Ｏ−または−Ｎ（Ｈ）−であり； その製法は、下記の式III、IVおよびＶであらわされ、上記式中Ｘ³は、前に定義したものである化合物類を、Ｏ−（７−アザベンゾト リアゾール−１−イル）−１、１、３、３−テトラメチルウロニウム ヘキサフ ルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル ）−１、１、３、３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート、 （ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびそれらの 混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでなる活性化 剤の存在下で、一緒に反応させる段階を含む。 本発明のリンカー アームは、（ｉ）製造および使用しやすい；（ii）無視で きるほど少ない自発的加水分解（１年あたり、＜５％）；および（iii）合成さ れ たオリゴヌクレオチドが速やかに（室温で概ね５分以内）切断される、という所 望の組み合わせを提供する。 本明細書を通して使用する用語“オリゴヌクレオチド”とは、広い意味を有す るものであり、一般的オリゴヌクレオチド、主鎖改変オリゴヌクレオチド（例え ばオリゴ治療薬として有用なホスホロチオエート、ホスホロジチオエートおよび メチル−ホスホネート同族体など）およびオリゴヌクレオチド誘導体、例えばオ リゴヌクレオチド−ペプチド結合体などを包含する。 図面の簡単な説明 本発明の実施態様は添付の図面によって説明される： 図１は、本発明の製法の特異的好適実施態様を示す。 発明を実施するための最良の形態 こうして本発明は、支持体と出発ヌクレオシドとの間の特殊なリンキング化合 物の使用が、固体支持体オリゴヌクレオチド合成のための改良リンカー アーム に導くことを発見した。 １実施態様において、リンキング化合物は、下記の式Ｉの化合物： またはその誘導体である。上記式中：Ｘ¹は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-、 −Ｃ（Ｏ）−および−Ｎ(Ｒ¹²)−からなる群から選択され；Ｒ¹²は、水素、置換 または未置換のＣ¹〜Ｃ²⁰アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基 、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基を含んでなる群から選択され； Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、同じかまたは異なり、水素、ハロゲン化物、 置 換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール 基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる群から選 択され；ｎは０、１または２であり；ＡおよびＢの１つは、水素、ハロゲン化物 、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリ ール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる群から選択 され、ＡおよびＢの他の１つは下記の式であらわされ： 上記式中、ｐは０または１、Ｘ²は、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-、−Ｃ（Ｏ ）−および−Ｎ(Ｒ¹³)−からなる群から選択され；Ｒ¹³は、水素、置換または未 置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換ま たは未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基を含む群から選択され；Ｒ⁶およびＲ⁷は 同じかまたは異なり、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未 置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基から なる群から選択され；ｍは０、１または２である。 本明細書を通じて、置換部分を参照する場合、その置換の性質は明細書によっ て制限されるものでなく、Ｃ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、Ｃ₅〜 Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択できる。 好適には式ＩのＢは、水素、ハロゲン化物、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀ア ルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜 Ｃ₄₀アルキルアリール基からなる群から選択され、それによって“パラ”の位置 に酸含有部分を与える。 式ＩのＲ⁴およびＲ⁵が、両方共に、水素であり、式ＩのＲ⁶およびＲ⁷が、両方 共に水素であるのが好ましい。式ＩのＲ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、Ｒ¹²およびＲ¹³の各 々が水素であるのがより好ましい。 式Ｉのｍおよびｎの少なくとも１つ、より好適には両方共に１であり、式Ｉの ｐが１であるのが好ましい。 式ＩのＲ¹、Ｒ²およびＲ³の各々が水素で、式ＩのＸ¹およびＸ²が両方共にＯ であるのが好ましい。 式Ｉの好適リンキング化合物は、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸である。当 業者には公知のように、その化合物は下記の構造を有する： これは、固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカー アームを製造す るためにこの酸を使用した最初であると考えられる。 他の実施態様において、リンキング化合物は下記の式IIを有する化合物であっ て： 上記式中Ｙは、−Ｏ−、−Ｓ−、Ｓ（Ｏ）₂-、および−Ｏ−（(ＣＨ₂)₁-Ｏ）ｑ からなる群から選択され、ｌは６０以下の整数であり、ｑは１〜１０００の範囲 の整数であり、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、ｍおよびｎは前と同様の意味をもち、Ｙが Ｏであるとき、ｎおよびｍの少なくとも１つは０か２であるという条件がつけら れる。 好適には式Ｉのｌは、１〜１０の範囲の整数であり、式IIのｑは、１〜１００ ０の範囲の整数である。 式 の最も好適な化合物はチオジグリコール酸（すなわちＲ⁴＝Ｒ⁵＝Ｒ⁶＝Ｒ⁷ ＝Ｈ、ｎ＝ｍ＝１、およびＹ＝Ｓ）である。 本発明のリンカー アームを定義づける上記の式において、ＮＵＣＬＥＯＳＩ ＤＥ（ヌクレオシド）は、下記の式の１つから選択される部分である： 上記式中、Ｒ⁸およびＲ¹⁰は同じかまたは異なり、水素または保護基であり、Ｒ⁹ は水素（デオキシリボヌクレオシドまたはＤＮＡの場合）または−ＯＲ¹¹（リボ ヌクレオシドまたはＲＮＡの場合）であり、ここではＲ¹¹は水素または保護基で あり、Ｂ＊は核酸塩基である。例えばＲＮＡの場合、２個の水酸基があり、それ らは保護されていてもよい。またリンカーは５’−、３’−、または（もしリボ ースである場合）２’−ヒドロキシル位置のいずれかに付着できる。実際、ＲＮ Ａ配列の場合、ヌクレオシドとリンカー化合物との間に形成されるエステルリン カーがヌクレオシドの２’−ヒドロキシル位置であっても、３’−ヒドロキシル 位置であってもほとんど差はない。こうして熟練せる当業者はヌクレオシドがそ の種々のヒドロキシル部分において保護され、またはブロックされることを理解 するであろう。 有用な保護基の非制限的例はトリチル、メトキシトリチル、ジメトキシトリチ ル（ＤＭＴ）、ジアルキルホスファイト、ピバリル−イソブチルオキシカルボニ ル、ｔ−ブチルジメチルシリル、フェノキシアセタール、９−フェニルキサンテ ン−９−イル（ピキシル）、テトラヒドロピラニル、メトキシテトラヒドロピラ ニル、メトキシメチル、ベンジルオキシメチル、メトキシエトキシメチル、メチ ルチオメチル、ジアルキルホスフェート、レブリニル、ジメチルフェニルシリル 、トリメチルシリル、イソプロピルジメチルシリル、ジイソプロピルメチルシリ ル、ジエチルイソプロピルシリル、トリイソプロピルシリル、アセチル、ベンゾ イル、ピバロイル、トリフルオロアセチル、アリル、ベンジル、ｏ−ニトロベン ジル、ｏ−ヒドロキシスチリルジメチルシリル、２−オキソ−１，２−ジフェニ ルエチル、アリルオキシカルボニル、モノメトキシメチル、ニトロベラトリルオ キシカルボニル、ジメトキシベンゾイン、ジメトキシベンゾイン カルボネート 、メチルニトロピペロニル カルボネート、フルオレニルメトキシカルボニル、 ２−フェニルスルホニルエトキシカルボニル、フルオロフェニルメトキシピペリ ジニルなどからなる群から選択される。 当業者には公知のように、５’−ヒドロキシル位置に用いられる保護基の主な 必要条件は、リンカー アームの切断をおこすことなくそれが選択的に除去され ることである。例えば５’−ヒドロキシル位置（１つまたは複数）のための好適 保護基は酸に不安定なジメトキシトリチル基である。その他のヒドロキシル位置 の保護基の主な必要条件は上記保護基の除去のために用いられる条件に対して安 定なことである。これらの後者の保護基はリンカーを切断するために用いる同じ 条件（以下で論ずる）または分離条件によって除去される。これらの位置の好適 保護基はトリアルキルシリル（すなわちｔ−ブチルジメチルシリル）またはアセ チルである。その他の情報は以下の文献から得られる： １．グリーン（T.W.Greene）&ナッツ（P.G.M.Nuts）、“有機合成における保 護基（Protecting Groups in Organic Synthesis）”、第２版（１９９１）、Jo hnWiley and Sons,Inc.，ＮＹ； ２．シェルハース（M.Schelhaas）&ワルドマン（H.Waldman）、“有機合成に おける保護基戦略（Protecting Group Strategies in Organic Synthesis）”、 Angew.ChemieInt.Ed.Engl.３５巻、２０５６−２０８３ページ（１９９６）； ３．ゲイト（M.J.Gait）編“オリゴヌクレオチド合成、実際的アプローチ（Ol igo nucleotide Synthesis A Practical Approach）”IRL Press、オックスフォ ード（１９８４）； ４．ナラング（S.A.Narang）編、“ＤＮＡおよびＲＮＡの合成および使用（Sy nthesis and Appilcations of DNA and RNA）”、Academic Press,Inc.，オーラ ンド（１９８７）； ５．アグラワル（S.Agrawal）編、“分子生物学における方法、２０巻：オリ ゴヌクレオチドおよび同族体のためのプロトコル（Methods in Molecular Biolo gy,Vol.20:Protocols for Oligonucleotides and Analogs）”Humana Press、To towa、ＮＪ（１９９３）； これらの各々の内容は、その他の考えられるヒドロキシル保護基について論ずる ために、参考として本明細書に組み入れられるものである。 所望ヌクレオシドを保護する方法は一般的なものであり、熟練せる当業者の権 限の範囲内である。例えばメルビー（Melby）の米国特許第３，４００，１９０ 号、カルサース（Caruthers）らの米国特許第４，４５８，０６６号を参照され たい;その各々の内容は参考として本明細書に組み入れられるものである。 本発明の範囲のデオキシリボヌクレオシドの好適製法は、５’−ジメトキシト リチル保護基および適した環外アミノ保護基を有するヌクレオシド、例えば、Ｎ⁶ −ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン、Ｎ⁴- ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン、５’−ジメ トキシトリチル−Ｎ２-イソブチリル−２’−デオキシグアノシン、または５’ −ジメトキシトリチルチミジンを用いることである。 本発明の範囲のリボヌクレオシドの好適製法は、適した環外アミノ保護基を有 し、２’−または３’−ヒドロキシル位置のどちらかに保護基がない５’−ジメ トキシトリチル保護ヌクレオシドを用いることである。リンカーはその後２つの 隣接ヒドロキシル基のどちらか１つ（どちらでもかまわない）と反応することが でき、その結果２’−および３’−結合の混合物を与える。その後未反応のヒド ロキシル基を、無水酢酸による固定ヌクレオシド処理によってアセチル化するこ とができる。別法として、５’−ジメトキシトリチル基、適切な環外アミノ基保 護、３’−ヒドロキシル保護基かまたは２’−および３’−保護基の混合物のど ちらかを有するリボヌクレオシドを用いることができる。３’−保護化合物は、 ２’−ヒドロキシル位置を保護するときに同時に生成し、ほとんど他の用途をも たない、概ね好ましくない異性体である。 本発明のリンカー アームを定義づける上記式において、ＳＵＰＰＯＲＴ（支 持体）は、従来の固体支持体である。その固体支持体の性質は特に制限されてお らず、熟練せる当業者の権限の範囲内である。例えば、固体支持体は無機物質で もよい。適した無機物質の非制限的な例は、シリカ、ポーラスガラス、アルミノ シリケート、ボロシリケート、金属酸化物（例えば酸化アルミニウム、酸化鉄、 酸化ニッケルなど）およびこれらの１つ以上を含む粘土からなる群から選択でき る。或いは、固体支持体は架橋ポリマーのような有機物質でもよい。適した架橋 ポリマーの非制限的例はポリアミド、ポリエーテル、ポリスチレンおよびそれら の混合物からなる群から選択できる。ここに用いるために好適な固体支持体は一 般的なものであり、ポーラスガラスビーズまたはポリスチレンビーズから選択で きる。 本発明のリンカー アームを作成するこの製法において、活性化剤の存在下で リンカー化合物と所望ヌクレオシドと固体支持体とを反応させるのが好ましい。 本明細書を通して用いられる用語“活性化基（activating group）”とは広義の ものであり、カルボキシル部分のアシル炭素に離脱基を結合させることによって 、カルボキシル部分（例えば、式Ｖのリンキング化合物上の）を活性化すること のできる親電子試薬類を包含する一例えばボダンスキー（M.Bodanszky）著“ペ プチド合成の原理（Principles of Peptide Synthesis）”、第２版、Springer- Verlag）ベルリン（１９９３）を参照されたい；この内容は参考として本明細書 に組み入れられるものである。こうして活性化剤は下記の少なくとも１つを開始 できなければならない：（ａ）分離した段階または諸段階においてカルボキシル 部分から反応性アシル化剤を形成し（これは誘導体の１例である）、その後直ち にアミノ成分（この場合はアミノ末端支持体）で処理してアミド結合を形成する か、またはヒドロキシ成分（この場合はヒドロキシ末端支持体または所望ヌクレ オシド上のヒドロキシル基）で処理してエステル結合を形成する；（ｂ）段階（ ａ）に述べたアミノまたはヒドロキシ成分で処理する前に、別個に任意的精製を 伴う、分離可能のアシル化剤の形成；（ｃ）アミノ／ヒドロキシ成分の存在下で 、２成分の混合物に活性化剤を添加することによって、アシル化中間体を形成す る。こうして（ａ）、（ｂ）および（ｃ）の各々はカルボン酸エステルおよび− アミド両方を形成するために適用でき、３経路すべてはヌクレオシドを支持体に 結合させるために使用できる。 例えば、先ず最初に塩化オキサリルをトリアゾールと反応させ、それから生成 したオキサリル トリアゾリドにヌクレオシドを付加するというレッツィンガー の方法は経路（ａ）の例である。ｐ−ニトロフェノール、またはジ−、トリ−、 テトラ−、またはペンタ−塩素化またはフッ素化フェノール、またはＮ−ヒドロ スクシンイミドを用いてカルボン酸基を“活性”エステルに変換するのは経路（ ｂ）の一般的例である。経路（ｃ）は近年最も一般的に用いられる方法であり、 カルボジイミド試薬（ジシクロヘキシルカルボジイミド、１−（３−ジメチルア ミノプロピル）エチルカルボジイミド、およびジイソプロピルカルボジイミド） もウロニウム試薬（Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１、１、 ３、３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、 ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ））も両方共このアプロー チに用いられる。実際、本発明の一面は、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ ＨＯＢｔ）、ＨＡＴＵまたはＨＢＴＵ（ＨＢＴＵの方が好ましい）の１つまたは 両方を、４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）と組み合わせて使用すると驚 くべきことに、そして予想に反して、従来の活性化剤（例えばＤＭＡＰと１−（ ３−ジメチルアミノプロピル）−エチルカルボジイミド（ＤＥＣ））を使用した 場合と比べて、固体支持体への誘導体化ヌクレオシドの比較的速い、高レベルの 担持がおこることを発見したことに関係する。 好適実施態様において、リンカー化合物、所望ヌクレオシドおよび固体支持体 の反応は、活性化剤に加えて、反応をスピードアップするための求核触媒または 添加剤（典型的には４−ジメチルアミノ ピリジン（ＤＭＡＰ）、１−ヒドロキ シベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、または１−ヒドロキシ−７−アザベンゾト リアゾール（ＨＯＡｔ））、およびカルボン酸基をイオン化するための第三アミ ン塩基（典型的にはトリエチルアミン、ピリジン、またはジイソプロプルエチル アミン）の存在下で行われる。 こうして熟練せる当業者は、活性化されたカルボン酸基がエステルまたはアミ ド結合の生成を適切に開始することができ、活性化試薬が所望ヌクレオシドに悪 影響を与えないという条件のもとでは、活性化剤の精密な性質は特に制限されな いことを当然理解する。 こうしてカルボン酸の、酸塩化物；活性エステル（すなわちニトロフェニル、 ニトロフェニルチオ、トリクロロフェニル、トリフルオロフェニル、ペンタクロ ロフェニル、ペンタフルオロフェニル、または３−ヒドロキシ−２，３−ジヒド ロ−４−オキソ−ベンゾトリアジンエステル）；活性ヒドロキシルアミンエステ ル（すなわちＮ−ヒドロキシフタールイミドまたはＮ−ヒドロキシスクシンイミ ド）；酸無水物；または混合無水物への変換による活性化は、所望結合を形成す る誘導体を生成し、したがってこれらの戦略は本発明に含まれる。 活性化剤の非制限的例は、アリールスルホニルクロリド（例えばベンゼンスル ホニルクロリド（ＢＳ−Ｃｌ）、メシチレンスルホニルクロリド（ＭＳ−Ｃｌ） 、トリイソプロピルスルホニルクロリド（ＴＰＳ−Ｃｌ））；活性アリールスル ホニルエステル（すなわちＢＳ−Ｃｌ、ＭＳ−ＣｌまたはＴＰＳ−Ｃｌのイミダ ゾール、トリアゾール、ニトロトリアゾール、またはテトラゾールエステル）； ２−エトキシ−１−（エトキシカルボニル）−１，２−ジヒドロキノリン（ＥＥ ＤＱ）；アシルカルボネート：１，１’−（カルボニルジオキシ）ジベンゾトリ アゾール；クロロトリメチルシラン；カルボジイミド（すなわちジシクロヘキシ ルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−エチルカ ルボジイミド（ＤＥＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド（ＤＩＣ））の単独化 合物、または補助的求核剤（すなわち１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯ Ｂｔ）、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒド ロキシスクシンイミド（ＨＯＳｕ）、または３−ヒドロキシ−３、４−ジヒドロ −１，２，３−ベンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯｂｔ）および／または触媒 （すなわち４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾ ール（ＮＭＩ））との組み合わせからなる群から選択される；またはウロニウム 塩（すなわちテトラメチルウロニウム クロリド（ＴＭＵ−Ｃｌ）、２−（１Ｈ −ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール− １−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレー ト（ＴＢＴＵ）、２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメチルウロニ ウム テトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、２−（３，４−ジヒドロ−４−オ キソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−１，１，３，３−テトラメ チルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＤＢＴＵ）、２−（２−オキソ− １（２Ｈ）−ピリジル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフル オロボレート（ＴＰＴＵ）、２−（５−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシミ ド）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（Ｔ ＮＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３−ジメチル −１，３−トリメチレンウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＭＴＵ ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−ビス（ ペンタメチレン）ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｉｐＵ）、 Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−ビス（テト ラメチレン）ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｙＵ）、Ｏ−（ ７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロ ニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ））の単独化合物、または補助 的求核剤（すなわち１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒド ロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシンイ ミド（ＨＯＳｕ）、または３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−１，２，３−ベ ンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯｂｔ））および／または触媒（例えば４−ジ メチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）またはＮ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）） との組み合わせも所望結合を生成する。 適した活性化剤のその他の例は下記の文献のいずれかに見いだされる： エム．ボダンスキー（M.Bodanszky）“ペプチド合成の原理”、第２版、スプ リンガ フェアラーク（Springer-Verlag）、ベルリン（１９９３）； ジョーンズ（J.Jones）“アミノ酸およびペプチドの合成（Amino Acid and Pe ptide Synthesis）”、オックスフォード大学出版（Oxford University Press） 、オックスフォード（１９９２）； ジー．グラント（G.Grant）“合成ペプチド：ユーザーのための指針（Synthet ic Peptides：A Users Guide）”、ダブリュー．エイチ．フリーマン アンドコ ウ（W.H.Freeman & Co.）ＮＹ（１９９２）； イー．ハスラム（E.Haslam）、テトラヘドロン、３６巻、２４０９ページ（１ ９８０）； エム、オグリアルソ（M.A.Ogliaruso）およびウォルフェ（J.F.Wolfe）“カル ボン酸、エステル、それらの誘導体の合成（Synthesis of Carboxylic Acids,Es ters and Their Derivatives）”、ジョン ウイリ アンド サンズ チセスタ （John Wiley & Sons、Chicester）（１９９１）； これら各々の内容は、文献により本明細書に組み入れられるものである。 本発明の製法の好適実施態様を図１を参照して説明する。図１において、ＤＭ Ｔはジメトキシトリチルを指す；Ｂは核酸塩基であり、ＡはＨ（デオキシリボヌ クレオシドの場合）またはＯＲ（リボヌクレオシドの場合）であり、ここでＲは Ｈまたはブロッキング／保護基、例えば先行パラグラフに記載したようなものを 指す。図１は説明のためにのみ与えられた好適実施態様に過ぎないことは明らか である。下記の議論において、括弧内の参照番号は図１の参照番号と対応する。 本発明の製法の１実施態様において、リンカー化合物（２）を先ず最初に所望 ヌクレオシド（１）と反応させて誘導体化ヌクレオシド（３）を作る。誘導体化 ヌクレオシド（３）をその後固体支持体と反応させてリンカー アーム（５）を 作る−−図１の段階１ａおよび２ａを参照されたい。 この製法のもう一つの実施態様において、リンカー化合物（２）を先ず最初に 固体支持体と反応させて誘導体化支持体（４）を作り、その後誘導体化支持体（ ４）を所望ヌクレオシド（１）と反応させてリンカー アーム（５）を作る。 図１に示すように、リンカー アーム（５）において、エステル結合がヌクレ オシドとリンカー化合物との間に形成され、アミド結合がリンカー化合物と固体 支持体との間に形成される。もちろん熟練せる当業者たちは、もし支持体が末端 ヒドロキシル基を含む場合は、リンカー化合物と固体支持体との間にエステルリ ンカーが形成されることを理解する。 図１の段階３に説明されるように、ひとたびリンカー アーム（５）が作られ たならば、それを従来の方法で用いてそのリンカー アーム（６）に付着したオ リゴヌクレオチドを合成する−−例えば米国特許第５，１１２，９６２号（レッ ツィンガー）を参照されたい；これは参考として本明細書に組み込まれるもので 図１の段階３に説明されるように、ひとたびリンカー アーム（５）が作られ たならば、それを従来の方法で用いてそのリンカー アーム（６）に付着したオ リゴヌクレオチドを合成する−−例えば米国特許第５，１１２，９６２号（レッ ツィンガー）を参照されたい；これは参考として本明細書に組み込まれるもので ある。 この時点において、オリゴヌクレオチドは固体支持体から切断され、遊離オリ ゴヌクレオチド（７）と使用ずみ支持体を与える（８）−−図１の段階６参照。 切断段階は通常、最初のヌクレオシドがリンキング化合物（すなわち式 および の化合物）に付着した点の加水分解を含む。 切断をおこすために用いる試薬は特に制限されず、熟練せる当業者の権限の範 囲内である。好適には試薬は弱塩基である。この目的に適した試薬の非制限的例 は、水酸化アンモニウム、水酸化アンモニウム／メタノール、トリエチルアミン ／アルコール（例えばエタノール、メタノール、など）、メチラミン、ジメチル アミン、トリメチルアミン／水、メチラミン／水酸化アンモニウム、アンモニア ／メタノール、炭酸カリウム／メタノール、ｔ−ブチラミン、エチレンジアミン などからなる群から選択される。 切断はＤＭＦ中２０％ピペリジン溶液を用いて室温でも行うことができる。し かし重要なことに切断速度は遅く（ｔ_1/2〜２００分（ｍｉｎ））、そのためま だピペリジン溶液を用いて、より敏感な保護基（例えばフルオレニルメトキシカ ルボニル（Ｆｍｏｃ）基など）を除去したり、非誘導体化カルボン酸基を反応性 のないアミドに変換したりすることができる。リンカーアームを中性条件下で室 温でフッ化物イオン（例えば１Ｍテトラブチルフッ化アンモニウム／ＴＨＦまた はトリエチルアミン トリヒドロフルオリド）で処理することによって切断する こともできる。 好適切断法は室温で濃水酸化アンモニウム水溶液で３分間処理することである 。 本発明の実施態様は、本発明の範囲を制限するものではない下記の実施例で 説明される。実施例においては、種々の材料および図１が参照される。実施例に は下記の材料を用いた； １．ＣＰＧ、長鎖アルキルアミン コントロールド・ポーラスガラス、１２０ 〜２００メッシュ、５００Å、９０〜１２０μｍｏｌ／ｇのＮＨ２基）；ＣＰＧ 社（Lincoln Park、ＮＪ）から市販される； ２．ＨＱＰＤ、ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−二酢酸、ランカスタ シンセシス（ Lancaster Synthesis）社（ランカシャー（Lancashire）、英国）から市販され る； ３．水酸化アンモニウム溶液（２８−３０％）および溶媒はＶＷＲ Canlab社 （Edmonton,Alberta,カナダ）から入手した； ４．キャップＡ：無水酢酸、２，６−ルチジンおよびテトラヒドロフラン（Ｔ ＨＦ）１：１：８の容量比からなる溶液； ５．キャップＢ：Ｎ−メチルイミダゾールおよびＴＨＦ、１６：８４の容量比 からなる溶液； ６．Ｉ₂/Ｈ₂Ｏ酸化、容量比７：２：１のＴＨＦ中０．０５Ｍ Ｉ₂、Ｈ₂Ｏおよ びピリジンからなる溶液； ７．無水ピリジンおよびアセトニトリル（ＣａＨ₂から蒸留したもの）； ８．無水メタノール、Ｍｇターニング（Ｍｇ turnings）から蒸留したもの； ９．ＤＭＡＰ、４−ジメチルアミノピリジン、試薬級； １０．ＤＩＥＡ、ＣａＨ₂から蒸留した無水ジイソプロピルエチルアミン; １１．ＤＥＣ、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−エチルカルボジイミド 、試薬級； １２．ＨＢＴＵ、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３ ，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロ−ホスフェート、試薬級； １３．ＨＯＢＴ)１−ヒドロキシベンゾトリアゾール、試薬級; １４．ＴＥＡ、トリエチルアミン、試薬級； １５．Ｎ⁶-ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシ ン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート、Ｎ⁴-ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル −２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート、Ｎ²-イソブチリル− ５’−ジ−メトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−ヘミスク シネートおよび５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミスクシネー トはシグマケミカル社から入手した； １６．硫酸マグネシウム、試薬級； １７．塩化オキサリル、試薬級； １８．クロロホルム、試薬級； １９．ジクロロメタン、試薬級；そして ２０．スクシニル−ＣＰＧ、８９μｍｏｌ／ｇ担持、は無水琥珀酸とＬＣＡＡ −ＣＰＧからダムハ（Damha）らの方法（Nucl.Acids Res.１８巻、３８１３ペー ジ、１９９０）を用いて作った。 下記の実施例において不溶性支持体上（に担持されている）ヌクレオシドの量 は分光光度法トリチル分析によって測定した。この方法では支持体試料（４−５ ｍｇ）を直接１０ｍＬ容量フラスコに正確に秤取した。それから１，２−ジクロ ロエタン中ジクロロ酢酸溶液（ジクロロ酢酸：１、２−ジクロロエタンの容量比 、５：９５）を加えてフラスコを満たす。その内容物をその後徹底的に混合し、 オレンジ色の溶液の吸光度をフィリップスＵＶ／Ｖｉｓ分光光度計で波長５０３ ｎｍで測定した。それからヌクレオシド担持量（μｍｏｌ／ｇのＣＰＧ）を次の ように計算した： 担持量＝（Ａ₅₀₃×Ｖｏｌ×１０００）／（Ｗｔ×７６） 上記式中、Ａ₅₀₃＝５０３ｎｍにおける吸光度、Ｖｏｌ＝溶液の容量（ｍＬ）、 Ｗｔ＝試験したＣＰＧの量（ｍｇ）。トリチル測定の精度は約±２〜３％であっ た。 実施例１：５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミヒドロキノン− Ｏ、Ｏ’−ジアセテートの合成（図１、段階１ａ）。 ＨＱＰＡ（１０ｍｍｏｌ、２．２６ｇ）、５’−ジメトキシトリチルチミジン （１０mmoｌ、５．４５ｇ）、ＤＭＡＰ（１ｍｍｏｌ、１２２ｍｇ）、ＤＥＣ（ １０ｍｍｏｌ、１．９２ｇ）、トリエチルアミン（０．２ｍｌ）およびジクロロ メタン（５０ｍｌ）を１００ｍｌ丸底フラスコ中で合一し、室温で一晩撹拌した 。溶液を分液漏斗に移し、付加的ＣＨ₂Ｃｌ₂(５０ｍｌ)で希釈し、酸性Ｈ₂Ｏ（ １０％ＨＣｌ水溶液を含む１５０ｍｌＨ₂Ｏ）で１回洗い、ＮａＨＣＯ₃で１回、 Ｈ₂Ｏで２回洗った。ＣＨ₂Ｃｌ₂溶液を無水ＭｇＳＯ₄上で乾燥し、濾過し、それ から蒸発することにより、明灰色フォームが得られた（９５％収率）。粗材料 をシリカゲルＴＬＣによってチェックすると(Ｒｆ＝０．０２、５％メタノール ／ＣＨＣｌ₃;またはＲｆ＝０．０８、１０％メタノール／ＣＨＣｌ₃)、大部分所 望産物（図１の化合物３）を含むことが判明した。残る不純物は、未反応のヌク レオシド(Ｒｆ＝０．３９、５％メタノール／ＣＨＣｌ₃)、および、ジエステル と予想されるより速く移動する不純物(Ｒｆ＝０．５４、５％メタノール／ＣＨ Ｃｌ₃)を含んでいた。この粗材料はそれ以上精製しなくとも支持体に結合させる のに適していた。しかし所望ならば、シリカゲルカラムクロマトグラフィーによ り０−３０％メタノール／ＣＨＣｌ₃勾配を用いて精製することができる。 実施例２：ＨＯＰＡ誘導体化ＣＰＧの合成（図１、段階１ｂ） １０１μｍｏｌ／ｇアミノ担持ＣＰＧ（１ｇ）、ＨＱＰＡ（１ｍｍｏｌ、２２ ６ｍｇ）、ＤＭＡＰ（１ｍｍｏｌ、１２２ｍｇ）、ＨＢＴＵ（１ｍｍｏｌ、３７ ９ｍｇ）および無水ピリジン（５ｍＬ）を２０ｍｌねじ蓋つきガラスバイアル中 で合一し、室温で撹拌した（５分間）。Ｈ₂Ｏ（１ｍＬ）を加え、振とうを続け た（１０分間）。ＣＰＧを濾別し、メタノール（〜５０ｍｌ）で洗い、その後Ｃ Ｈ₂Ｃｌ₂(〜５０ｍｌ)で洗い、真空中で乾燥した。ＣＰＧ試料（〜１−２ｍｇ） を０．２８Ｍニンヒドリン／エタノール（１００μＬ）と共に加熱すると陰性結 果が出た（無色ビーズ）。 実施例３：ＤＥＣを用いる５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミ ヒドロキノン−Ｏ，Ｏ’−ジアセテートとＣＰＧとの結合（図１、段 階２ａ） 実施例１からの精製していないヌクレオシド−３’−Ｏ−カルボン酸生成物（ ２．０ｍｍｏｌ、１．５ｇ）、ＤＭＡＰ（０．５ｍｍｏｌ、６１ｍｇ）、ＤＥＣ （５ｍｍｏｌ、０．９６ｇ）、ＣＰＧ（５ｇ）、トリエチルアミン（０．５ｍｌ ）および無水ピリジン（２５ｍｌ）を１００ｍＬ丸底フラスコ中で合一し、室温 で振とうした（４．５時間）。ＣＰＧを濾別し、メタノールで、その後ＣＨ₂Ｃ ｌ₂で洗った。未反応アミノ基は、ＣＰＧを１：１容量比のＣａｐＡおよびＣａ ｐＢ溶液混合物で処理し（２時間）、その後ＣＨ２Cｌ２で洗い、乾燥すること によってキャッピングした。ヌクレオシド担持量はトリチル分析によって測定し た。典型的担持量は３０−４０μｍｏｌ／ｇであった。 実施例４：ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを用いる５’−ジメトキシトリチルチミジン−３ ’−Ｏ−ヘミヒドロ−キノン−Ｏ，Ｏ’−ジアセテートとＣＰＧとの 結合（図１、段階２ａ） 実施例１からの精製していないヌクレオシド−３’−Ｏ−カルボン酸生成物（ ０．０５ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）、ＨＢＴＵ（０．０５ｍｍｏｌ、１９ｍｇ）、Ｈ ＯＢＴ（０．０５ｍｍｏｌ、７ｍｇ）、ＣＰＧ（５００ｍｇ）、ＤＩＥＡ（０． １ｍｍｏｌ、１７μｌ）、および無水ＤＭＦ、ジクロロメタン、アセトニトリル 、またはピリジン（５ｍｌ）をネジ蓋付きガラス壜中で混ぜ合わせ、室温で振と うした。ＣＰＧ試料を時々取り、トリチル分析を行った。最大担持に達した後（ １時間）、ＣＰＧを濾別し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗い、乾燥し、実施例３に記載したよ うにキャッピングした。各溶媒で種々の時間間隔で得られたヌクレオシド担持量 を表１に示す。 実施例５：高度に担持した５’−ジメトキシトリチルチミジンＣＰＧ（図１、段 階２ａ）の製法 実施例１からの精製していないヌクレオシド−３’−Ｏ−カルボン酸生成物（ ０．１ｍｍｏｌ)７６ｍｇ）、ＨＢＴＵ（０．１ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）、ＨＯＢ Ｔ（０．１ｍｍｏｌ、１４ｍｇ）、ＣＰＧ（５００ｍｇ）、ＤＩＥＡ（０．２ｍ ｍｏｌ、３４μｌ）および無水アセトニトリル（３ｍｌ）を密栓フラスコ中で合 一し、室温で振とうした。ＣＰＧ試料を時々取ってトリチル分析を行った。最大 の担持に達したとき（１時間）、ＣＰＧを濾別し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗い、乾燥した 。１０、２０、３０および６０分のカップリング時間後に得られたヌクレオシド 担持量はそれぞれ６０．９、６４．８、６５．９および６６．２μｍｏｌ／ｇで あった。 表１：ＨＢＴＵ／ＨＯＢＴを用いた場合の５’−ジメトキシトリチルチミジン担 実施例６：５’−ジメトキシトリチルチミジンとＨＯＰＡ誘導体化ＣＰＧとの結 合（図１、段階２ｂ） ５’−ジメトキシトリチルチミジン（０．１ｍｍｏｌ、５４ｍｇ）、ＨＢＴＵ （０．１ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）、ＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）、実施 例２で作られたＨＱＰＡ−ＣＰＧ（２５０ｍｇ）および無水アセトニトリル（１ ｍl）をねじ蓋つきガラスバイアル中で合一し、室温で振とうした（２時間）。 ＣＰＧを濾別し、ＣＨ２Cl２で洗い、乾燥した。トリチル分析は４２．９μｍｏ ｌ／ｇの担持量を示した。 実施例７：自動オリゴヌクレオチド合成にヌクレオシド−ＨＯＰＡ−ＣＰＧ支持 体の使用 ヌクレオシド誘導体化ＣＰＧ（図１の化合物４）を一般の誘導体化ＣＰＧと同 じように用いた、すなわちＣＰＧをプラスチック製合成カラム（〜１２ｍｇ／カ ラム）に充填し、従来の合成試薬を有するパーキン−エルマーアプライド−ビオ システムズ３９４自動ＤＮＡ合成器に取り付けた。オリゴヌクレオチド合成は改 変しない０．２μｍｏｌスケール合成サイクルを用いて行われた。しかし従来の 自動的最終方法の待ち段階（表２）は変更され、総切断時間は６０分から３分間 に短縮された。合成オリゴヌクレオチドを含む水酸化アンモニウム溶液をその後 加熱し（５０℃、１６時間）、一般的方法でオリゴヌクレオチドの脱保護を完了 した。 表２：：ＰＥ／ＡＢＤ３９４ＤＮＡ合成器の自動末端操作プログラム 注：試薬１０および１８はそれぞれ水酸化アンモニウムおよびアセトニト リルである。 実施例８：オキサリル リンカーアーム 塩化オキサリル（２．５ｍｍｏｌ、２１８μｌ）を、セプタム（隔膜）で封止 した５０ｍｌバイアル中で、無水ピリジン（２５ｍｍｏｌ、２．０ｍｌ）および 無水アセトニトリル（１７．５ｍｌ）中トリアゾール（１２．５ｍｍｏｌ、８６ ３ｍｇ）の撹拌、室温溶液に加えた。無水ピリジン（２．５ｍｌ）およびアセト ニトリル（１７．５ｍｌ）中５’−ジメトキシトリチルチミジン（２．５ｍｍｏ ｌ、１０４４ｍｇ）溶液を第２のセプタム封止バイアル中で作った。それからヌ クレオシド溶液を注射器で定常的撹拌下の第１の溶液に加えた。３０−４５分間 撹拌後、溶液を１００ｍｌフラスコ中のＣＰＧ（１０ｇ）に加えた。そのフラス コの内容物を３０分間撹拌し、その後無水メタノール（５０ｍｌ）を加えた。５ 分後、ＣＰＧを濾別し、クロロホルムで洗い、乾燥した。その後ＣＰＧをＣａｐ ＡおよびＣａｐＢ溶液の１：１容量比の混合物で３０分間キャッピングし、洗い 、乾燥した。トリチル分析により、ヌクレオシド担持は３０−４０μｍｏｌ／ｇ の範囲であることが確認された。 実施例９：スクシニル リンカーアーム 方法Ａ（ポン（Pon）ら、１９８８、Biotechniques ６巻、７６８−７７５ペ ージによる） ５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート（０．２ｍ ｍｏｌ、１２３ｍｇ）、ＣＰＧ（１ｇ）、ＤＥＣ（２ｍｍｏｌ、３８２ｍｇ）、 ＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）、トリエチルアミン（８０μｌ）および 無水ピリジン（１０ｍｌ）を１００ｍｌ丸底フラスコ中で合一し、室温で振とう した（３０−６０分間）。ＣＰＧを濾別し、ピリジンで、その後ＣＨ２Cl２で洗 い、乾燥した。トリチル分析により、ヌクレオシド担持は３０−４０μｍｏｌ／ ｇの範囲であることが確認された。 方法Ｂ（米国特許第５，５５４，７４４号（ボーングル（Bhongle）ら）によ る） ＨＯＢＴ（０．０１５ｍｍｏｌ、２ｍｇ）、ＣＰＧ（０．５ｇ）、無水アセト ニトリル（２ｍｌ）、無水ピリジン（０．１ｍｌ）およびジイソプロピルカルボ ジイミド（０．１５ｍｍｏｌ）２４μｌ、をねじ蓋つきガラスバイアル中で合一 し、室温で振とうした（２０分間）。５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’ −Ｏ−ヘミスクシネート（０．０５ｍｍｏｌ、３２ｍｇ）をバイアルに加え、室 温で一晩振とうを続けた。ＣＰＧを濾別し、ＣＨ２Cl２で洗い、乾燥した。トリ チル分析でヌクレオシド担持量６８．４μｍｏｌ／ｇが確認された。 方法Ｃ（ダムハら、１９９０、Nucl.Acids Res.１８巻、３８１３−３８２１ペ ージ） ＣＰＧ（２５ｇ）、無水琥珀酸（５０ｍｍｏｌ、５ｇ）、ＤＭＡＰ（５ｍｍｏ ｌ、６１０ｍｇ）および無水ピリジン（１１０ｍｌ）を２５０ｍｌ丸底フラスコ 中で合一し、室温で振とうした（２４時間）。その後ＣＰＧを濾別し、メタノー ルおよびクロロホルムで洗い、乾燥した。 上記のようにして作ったスクシニル化ＣＰＧ（１ｇ）、５’−ジメトキシトリ チルチミジン（０．１ｍｍｏｌ、５４ｍｇ）、ＤＥＣ（１ｍｍｏｌ、１９２ｍｇ ）、ＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）、トリエチルアミン（８０μｌ）お よび無水ピリジンを１００ｍｌ丸底フラスコ中で合一し、室温で一晩振とうした 。ペンタクロロフェノール（０．５ｍｍｏｌ、１３５ｍｇ）をフラスコに加え、 もう１日振とうを続けた。最後にピペリジン（５ｍｌ）を加え、５分間振とう後 、ＣＰＧを濾別し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗い、乾燥し、実施例３のようにキャッピング した。トリチル分析により、ヌクレオシド担持量は３０−４０μｍｏｌ／ｇの範 囲であることが確認された。 実施例１０：リンカーアームの安定性の評価 ５’−ジメトキシトリチル化ヌクレオシド、オキサリル（実施例８）またはＨ ＱＰＡ（実施例３−６）リンカーアームで誘導体化した後、長鎖アルキルアミン コントロールド・ポーラスガラス（ＬＣＡＡ−ＣＰＧ）支持体をクロロホルムま たはジクロロメタンでよく洗い、残留試薬を除去した。支持体を乾燥させ、その 後ヌクレオシド担持をトリチル分析によって測定した。ＣＰＧは使用するまで密 栓ガラスバイアル中に室温で貯蔵した。 ＣＰＧ試料（〜５０ｍｇ）をブフナー漏斗上でジクロロメタンでよく洗い、支 持体に共有結合していないヌクレオシドをすべて除去することによってＣＰＧ試 料のヌクレオシド含量を再測定した。この洗浄段階は重要であった；この洗浄が なければ、その後のトリチル分析は支持体表面上の共有結合した（すなわち完全 無傷リンカー）と共有結合していない（すなわち分離しているリンカー）ヌクレ オシドとを区別することはできなかったであろう。乾燥後、洗ったばかりのＣＰ Ｇでトリチル分析を行った。新たに測定したヌクレオシド担持量を最初の担持量 と比較し、切断程度を決定した。 オキサリル リンカーの場合、最初のヌクレオシド担持量が〜４０μｍｏｌ／ ｇである６ロットを調べた。その結果を表３に示す。表３では、“経過時間”は リンカーアームの合成後に経過した期間である。 表３：オキサリル リンカーアームの安定性 これらの結果は切断量の大きな変動を示した（〜１０−４０％切断／月）。こ れはオキサリル リンカーが不満足であることを我々に納得させるデータであり 、このリンカー化学のその後の評価は止めた。 同様な安定性試験をＨＱＰＤリンカーを含む支持体で行った結果は、表４に示 す。 表４：ＨＱＰＤリンカーアームの安定性 これらの結果はｄＡ、ｄＣおよびＴヌクレオシドで非常によい安定性を示し、 ｄＧでは１カ月あたり〜０．７％切断を示した。これはオキサリル リンカーア ームで得られた結果より遥かにすぐれている。 実施例１１：ＨＢＴＵ／ＤＭＡＰを用いる５’−ジメトキシトリチルチミジン− ３’−Ｏ−ヘミスクシネートとＬＣＡＡ−ＣＰＧとのカップリング ５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート（０．０５ ｍｍｏｌ、３２ｍｇ）、ＨＢＴＵ（０．０５ｍｍｏｌ、１９ｍｇ）、ＤＭＡＰ（ ０．０５ｍｍｏｌ、６ｍｇ）、ＣＰＧ、１０１μｍｏｌ／ｇ、（０．５ｇ）、無 水アセトニトリル（２ｍＬ）、および無水ピリジン（０．１ｍＬ）をセプタムで 封止したバイアル中で合一し、室温で５分間振とうする。ＣＰＧを濾別し、クロ ロホルムで洗い、乾燥した。トリチル分析は６５．３μｍｏｌ／ｇの担持量を示 した。比べてみると、これは、上記ボーングルらのＤＩＣ／ＨＯＢＴ法および同 一のＣＰＧおよびヌクレオシドを用いて一晩行った反応から得られた担持量の９ ５％であった。 実施例１２：ＨＢＴＵ／ＤＭＡＰを用いる５’−ジメトキシトリチルチミジンと スクシニルＣＰＧとのカップリング ５’−ジメトキシトリチルチミジン（０．１ｍｍｏｌ、５４ｍｇ）、ＨＢＴＵ （０．１ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）、ＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）、スク シニル−ＣＰＧ（２５０ｍｇ）および無水アセトニトリル（１ｍｌ）を１本のね じ蓋ガラスバイアル中で混ぜ合わせた。５’−ジメトキシトリチルチミジン（０ ．０５ｍｍｏｌ、３７ｍｇ）、ＨＢＴＵ（０．０５ｍｍｏｌ、１９ｍｇ）、ＤＭ ＡＰ（０．０５ｍｍｏｌ、６ｍｇ）、スクシニル化ＣＰＧ、８９μｍｏｌ／ｇ（ ２５０ｍｇ）および無水アセトニトリル（１ｍＬ）を含む第２のバイアルも作っ た。各バイアルからＣＰＧの１部（〜１０ｍｇ）を時々取り出し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で 洗い、担持量をトリチル分析によって測定した結果を、表５に示す。最後の試料 分析後、残るＣＰＧを濾別し、ＣＨ₂Ｃｌ₂で洗い、乾燥した。 実施例１３：ヌクレオシド−３’−Ｏ−ヘミスクシネートとＬＣＡＡ−ＣＰＧと の自動的カップリング Ｎ６-ベンゾイル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシアデノシン− ３’−Ｏ−ヘミスクシネート（０．０５ｍｍｏｌ、３８ｍｇ）、Ｎ４-ベンゾイ ル−５’−ジメトキシトリチル−２’−デオキシシチジン−３’−Ｏ−ヘミスク シネート（０．０５ｍｍｏｌ、３７ｍｇ）、またはＮ２-イソブチリル−５’− ジメトキシトリチル−２’−デオキシグアノシン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート （０．０５ｍｍｏｌ、３７ｍｇ）のいずれかと、ＤＩＥＡ（０．０５ｍｍｏｌ、 ９μＬ）をセプタムで封止したバイアルに入れ、無水アセトニトリル（１ｍＬ） に溶解した。セプタムで封止したバイアル中の５’−ジメトキシトリチルチミジ ン−３’−Ｏ−ヘミスクシネート（０．０５ｍｍｏｌ、３２ｍｇ）およびＤＩＥ Ａ（０．０５ｍｍｏｌ、９μＬ）を無水ＣＨ２Cl２/アセトニトリル、容量比１ ：１（１ｍＬ）に溶解した。各溶液をその後０．４５μｍ注射器フィルターを通 して濾過し、ＰＥ／ＡＢＤ３９４自動ＤＮＡ合成器の＃５、６または７のボトル 位置のいずれかに据え付けた。同様に調製したＨＢＴＵ（０．１ｍｍｏｌ、３８ ｍｇ）およびＤＭＡＰ（０．１ｍｍｏｌ、１２ｍｇ）−無水アセトニトリル（２ ｍＬ）溶液をＤＮＡ合成器の＃８のボトル位置に据え付けた。ＬＣＡＡ−ＣＰＧ （１２ｍｇ）をプラスチック合成カラムに正確に秤取し、ＤＮＡ合成器のカラム 位置＃１に据え付けた。 表５：５’−ジメトキシトリチルチミジンとスクシニル−ＣＰＧとのＨＢＴＵ／ ＤＭＡＰカップリング 注：１．ＨＢＴＵ／ＤＭＡＰの代わりにＨＡＴＵ／ＤＭＡＰの使用は同様な結果 をもたらした。すなわちより強力なＨＡＴＵ試薬を使用するメリットはなかった 。 ２．上記のカップリング反応をＨＢＴＵ／ＨＯＢＴおよび０．２ｍｍｏｌ／ ｇのＤＭＴ−Ｔを用いても行った。しかし、その反応は速度が半分に過ぎず、３ ０、６０および１２０分後に担持量はそれぞれ６．５、１３．０および２５．６ μｍｏｌ／ｇであった。 ボトル＃５、６または７のいずれかの１つの内容と、ボトル＃８の内容とを同時 に合成カラムに供給するための一般的ユーザー操作は、ＰＥ／ＡＢＤ３９４ユー ザーマニュアルのように決めた。一般的開始操作は次のように決められた：１、 アセトニトリル充填およびアルゴンのフラッシング（４×）により合成カラムを 洗う；２、上記の一般的ユーザー操作法を用いて、カラムにヌクレオシド−３’ −Ｏ−ヘミスクシネートおよびＨＢＴＵ／ＤＭＡＰ溶液を満たす；３、アセトニ トリル充填およびアルゴンのフラッシング（４×）によって合成カラムを洗う。 ボトル＃７および＃８を同時に合成カラム＃１に供給するための決められたユー ザー操作＃２００を含む開始操作のためのサンプルリストを表６に示す。開始操 作の完了後、未変更の０．２μｍｏｌ規模の合成サイクルが自動的に開始され、 一般的方法でオリゴヌクレオチド合成が行われる。ＣＰＧ上の担持量は次のよう に決められる；１．取り付けられたフラクションコレクターを用いて最初のトリ チル色を集める；２．その色を、２５．０ｍｌのジクロロ酢酸−１、２−ジクロ ロエタン溶液（５：９５、容量）で希釈する；３．吸光度（５０３ｎｍ）を測定 する；そして下記の式を用いて担持量を測定する： 担持量（μｍｏｌ／ｇ）＝（Ａ₅₀₃×ｖｏｌ×１０００）／（７６×Ｗｔ）上 記式中、ｖｏｌ=容量（ｍＬ）、Ｗｔ＝ＣＰＧ量（ｍｇ）である。 試薬を合成カラムに充填するために必要な短かい時間（４秒）内に、４５−５ ３μｍｏｌ／ｇのヌクレオシド担持量が得られた（すなわち表６、段階＃１３） 。待ち時間（すなわち表６、段階＃１４）は必要なかった。 実施例１４：５’−ジメトキシトリチルチミジン−３’−Ｏ−ヘミヒドロキノン −Ｏ、Ｏ’−ジアセテートとＬＣＡＡ−ＣＰＧとの自動カップリン グ ０．０１、０．０２５および０．０５Ｍ５’−ジメトキシトリチルチミジン− ３’−Ｏ−ヘミヒドロキノン−Ｏ、Ｏ’−ジアセテートおよびＤＩＥＡの無水ア セトニトリル溶液を作り、０．４５μｍシリンジ フィルターを通して濾過し、 ＰＥ／ＡＢＤ３９４ＤＮＡ合成器のボトル＃７として据え付けた。自動誘導体化 を実施例１３に記載のようにして、０．０１Ｍ、０．０２５Ｍおよび０．０５Ｍ ＨＢＴＵおよびＤＭＡＰ溶液を用いて行った。０．０１、０．０２５および０ ．０５Ｍ試薬を用いて４第二反応から得た５’−ジメトキシトリチルチミジン担 持量は１３．４、２８．８および４６．０μｍｏｌ／ｇであった。 表３．１ ＬＣＡＡ−ＣＰＧを自動的に誘導体化するためのＰＥ／ＡＢＤ３９４ ＤＮＡ合成器の一般的開始操作法 表３．１ ＬＣＡＡ−ＣＰＧを自動的に誘導体化するためのＰＥ／ＡＢＤ３９４ ＤＮＡ合成器の一般的開始操作法 （1）段階のナンバー （2）ファンクション＃ （3）ファンクションネーム（4 ）段階の時間 １ボトル＃１８は無水アセトニトリルを含む。 ２一般的ユーザー機能 ３この段階は、より緩徐なカップリング反応の場合、増加させることができ る。

───────────────────────────────────────────────────── 【要約の続き】₂ −基および−Ｎ（Ｒ¹³）−基からなる群から選択さ れ、Ｒ¹³は、水素基、置換または未置換Ｃ₁〜Ｃ₂₀アル キル基、置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、およ び置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる 群から選択され、Ｒ⁶およびＲ⁷は、同じかまたは異な り、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換Ｃ₁〜 Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール 基、および置換または未置換Ｃ5〜Ｃ40アルキルアリー ル基からなる群から選択され、ｐは０または１であり、 ｍは、０、１または２である。リンカー アームを製造 するための方法が開示されている。このリンカー アー ムは、固体支持体オリゴヌクレオチド合成に有用であ り、また、自発的な加水分解に対する安定性と、リンカ ー アームから合成されたオリゴヌクレオチドの意図さ れた分割の容易さとの望ましい組み合わせを特徴とす る。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカーアームの製法であって 、（Ａ）下記の式（Ｉ）であらわされるリンカー化合物： またはその誘導体であって、上記式中、Ｒ¹、Ｒ²、およびＲ³は同じかまたは異 なり、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置 換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀ア ルカリール基からなる群から選択され；Ｒ⁴およびＲ⁵は同じかまたは異なり、置 換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール 基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択さ れ；Ｘ¹は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−および−Ｎ（Ｒ¹²）−からなる群から 選択され；Ｒ¹²は水素基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換また は未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリ ール基からなる群から選択され；ｎは０、１または２であり；ＡおよびＢの１つ は水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換ま たは未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカ リール基からなる群から選択され；ＡおよびＢの他の１つは下記の式を有し： 上記式中、ｐは０または１であり、Ｘ²は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｃ （Ｏ）−および−Ｎ（Ｒ¹³）−からなる群から選択され、Ｒ¹³は水素基、置換ま たは未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、 および置換または未置換のＣ５-Ｃ４０アルカリール基からなる群から選択され ；Ｒ⁶およびＲ⁷は同じかまたは異なり、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル 基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜 Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され、ｍは０、１または２である上記化 合物；または下記の式IIで表され： 上記式中Ｙは−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-およびＯ−（(ＣＨ₂)₁-Ｏ）ｑから なる群から選択され、１は６０以下の整数であり、ｑは１〜１０００の範囲の整 数であり、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、ｍおよびｎは上と同じ意味を有し、ＹがＯであ るとき、ｎおよびｍの少なくとも１つは０または２であるという条件である化合 物を、（Ｂ）所望ヌクレオシドのＯＨと反応させて、エステル結合を有する誘導 体化ヌクレオシドを作り；（Ｃ）固体支持体と反応させてリンカーアームを作る 諸段階を含むことを特徴とする固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリン カーアームの製法。 ２．リンカー化合物を先ず最初に所望ヌクレオシドと反応させて誘導体化ヌクレ オシドを作り、その誘導体化ヌクレオシドをその後固体支持体と反応させてリン カーアームを作ることを特徴とする請求項１に記載の製法。 ３．リンカー化合物を最初に固体支持体と反応させて誘導体化支持体を作り、そ の後前記誘導体化支持体を所望ヌクレオシドと反応させてリンカーアームを作る ことを特徴とする請求項１に記載の製法。 ４．リンカー化合物が式Ｉから選択されることを特徴とする請求項１に記載の製 法。 ５．Ｂが水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、 置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀ アルキルアリール基からなる群から選択されることを特徴とする請求項４に記載 の製法。 ６．Ｒ⁴およびＲ⁵が両方共水素基であることを特徴とする請求項１に記載の製法 。７．Ｒ⁶およびＲ⁷が両方共水素基であることを特徴とする請求項１に記載の製 法。８．Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶およびＲ⁷の各々が水素基であることを特徴とする請求項 ４に記載の製法。 ９．ｍおよびｎが両方共１であることを特徴とする請求項４に記載の製法。 １０．ｐが０であることを特徴とする請求項４に記載の製法。 １１．１が１〜１０の範囲の整数であることを特徴とする請求項１に記載の製法 。 １２．Ｒ¹²およびＲ¹³が両方共水素基であることを特徴とする請求項１に記載の 製法。 １３．Ｒ¹、Ｒ²およびＲ³の各々が水素基であることを特徴とする請求項１に記 載の製法。 １４．Ｘ¹およびＸ²が両方共Ｏである請求項１に記載の製法。 １５．固体支持体が無機物質であることを特徴とする請求項１に記載の製法。 １６．無機物質がシリカ、ガラスビーズ、ポーラスガラス、アルミノシリケート 、ボロシリケート、酸化金属、粘土およびこれらの混合物からなる群から選択さ れることを特徴とする請求項１５に記載の製法。 １７．固体支持体が有機物質であることを特徴とする請求項１に記載の製法。 １８．有機物質が架橋ポリマーであることを特徴とする請求項１７に記載の製法 。 １９．架橋ポリマーがポリアミド、ポリスチレンおよびこれらの混合物からなる 群から選択されることを特徴とする請求項１８に記載の製法。 ２０．所望ヌクレオシドをリンカー化合物との反応の前に保護基と反応させるこ とを特徴とする請求項１に記載の製法。 ２１．リンカー化合物と所望ヌクレオシドが、エステル結合を形成できる活性化 剤の存在下で反応することを特徴とする請求項１に記載の製法。 ２２．活性化剤が、アリールスルホニル クロリド（例えばベンゼンスルホニル クロリド（ＢＳ−Ｃｌ）、メシチレンスルホニル クロリド（ＭＳ−Ｃｌ）、ト リイソプロピルスルホニル クロリド（ＴＰＳ−Ｃｌ））；活性アリールスルホ ニル エステル（例えばＢＳ−Ｃｌ、ＭＳ−ＣｌまたはＴＰＳ−Ｃｌのイミダゾ ール−、トリアゾール−、ニトロトリアゾール−、またはテトラゾールエステル ）；２−エトキシ−１−（エトキシカルボニル）−１，２−ジヒドロキノリン（ ＥＥＤＱ）；アシルカルボネート；１，１’−（カルボニルジオキシ）ジベンゾ トリアゾール；クロロトリメチルシラン；カルボジイミド（例えばジシクロヘキ シルカルボジイミド（ＤＣＣ）、１−（３−ジメチルアミノプロピル）−エチル カルボジイミド（ＤＥＣ）、ジイソプロピルカルボジイミド(ＤＩＣ)）の単独、 または補助的求核剤（すなわち１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ） 、１−ヒドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシ スクシンイミド（ＨＯＳｕ）、または３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−１， ２，３−ベンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯｂｔ）、４−ジメチルアミノピリ ジン（ＤＭＡＰ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ））との組み合わせ；およ びこれらの混合物からなる群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の 製法。 ２３．活性化剤がウロニウム塩であることを特徴とする請求項１に記載の製法。 ２４．ウロニウム塩が、テトラメチルウロニウム クロリド（ＴＭＵ−Ｃｌ）、 ２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチル ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾト リアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフ ルオロボレート（ＴＢＴＵ）、２−スクシンイミド−１，１，３，３−テトラメ チルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＳＴＵ）、２−（３、４−ジヒド ロ−４−オキソ−１，２，３−ベンゾトリアジン−３−イル）−１，１，３，３ −テトラメチルウロニウム テトラフルオロボレート（ＴＤＢＴＵ）、２−（２ −オキソ−１（２Ｈ）−ピリジル−１，１，３，３−テトラメチルウロニウムテ トラフルオロボレート（ＴＰＴＵ）、２−（５−ノルボルネン−２，３−ジカル ボキシミド）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム テトラフルオロボ レート（ＴＮＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，３ −ジメチル−１，３−トリメチレンウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ ＨＡＭＴＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３， ３−ビス（ペンタメチレン）ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰ ｉｐＵ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３− ビス（テトラメチレン）ウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＰｙＵ ）、Ｏ−（７−アザベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラ メチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ））からなる群から 選択されることを特徴とする請求項１に記載の製法。 ２５．ウロニウム塩が補助的求核剤の存在下で用いられることを特徴とする請求 項２４に記載の製法。 ２６．補助的求核剤が１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）、１−ヒ ドロキシ−７−アザベンゾトリアゾール（ＨＯＰＡｔ）、Ｎ−ヒドロキシスクシ ンイミド（ＨＯＳｕ）、または３−ヒドロキシ−３，４−ジヒドロ−１，２，３ −ベンゾトリアジン−４−オン（ＨＯＯｂｔ）、４−ジメチルアミノピリジン（ ＤＭＡＰ）、Ｎ−メチルイミダゾール（ＮＭＩ）およびこれらの混合物からなる 群から選択されることを特徴とする請求項１に記載の製法。 ２７．固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカーアームであって、下 記の式を含み； 上記式中：Ｘ¹は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｃ（Ｏ）−および−Ｎ(Ｒ^{1 2} )−からなる群から選択され；Ｒ¹²は水素基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀ア ルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅ 〜Ｃ₄₀アルキルアリール基を含んでなる群から選択され；Ｘ³は−Ｏ−または− Ｎ（Ｈ）−であり；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は同じかまたは異なり、水素 基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未 置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール 基からなる群から選択され；ｎは０、１または２であり；Ａ’およびＢ’の１つ は水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ１-Ｃ２０アルキル基、置換 または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルア リール基からなる群から選択され、Ａ’およびＢ’の他の１つは下記の式であら わされ： 上記式中、Ｘ²は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂-、−Ｎ(Ｒ¹³)−からなる群から 選択され；Ｒ¹³は水素基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換また は未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基 を含んでなる群から選択され；Ｒ₆およびＲ₇は同じかまたは異なり、水素基、ハ ロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換の Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アルキルアリール基 からなる群から選択され；ｐは０または１；ｍは０、１または２であることを特 徴とするリンカーアーム。 ２８．Ｂ’が水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル 基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀ア ルキルアリール基を含んでなる群から選択されることを特徴とする請求項２７に 記載のリンカーアーム。 ２９．Ｒ⁴が水素基である請求項２７に記載のリンカーアーム。 ３０．ｍおよびｎが両方共１であることを特徴とする請求項２７に記載のリンカ ーアーム。 ３１．Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ¹²およびＲ¹³の各々が水素基であることを特徴とする 請求項２７に記載のリンカーアーム。 ３２．Ｘ¹およびＸ²が両方共Ｏであることを特徴とする請求項２７に記載のリン カーアーム。 ３３．ＳＵＰＰＯＲＴ（支持体）が無機物質であることを特徴とする請求項２７ に記載のリンカーアーム。 ３４．無機物質が、シリカ、ガラスビーズ、ポーラスガラス、アルミノシリケー ト、ボロシリケート、酸化金属、粘土およびこれらの混合物からなる群から選択 されることを特徴とする請求項３３に記載のリンカーアーム。 ３５．ＳＵＰＰＯＲＴ（支持体）が有機物質であることを特徴とする請求項２７ に記載のリンカーアーム。 ３６．有機物質が架橋ポリマーであることを特徴とする請求項３５に記載のリン カーアーム。 ３７．固体支持体オリゴヌクレオチド合成のためのリンカーアームの製法であっ て、リンカーアームは下記の式であらわされ； 上記式中、Ｘ³が−Ｏ−または−Ｎ（Ｈ）−であり； 前記製法は、 下記の式III、IVおよびＶであらわされ： 上記式中、Ｘ３は上に定義したものである化合物を一緒に、Ｏ−（７−アザベン ゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキ サフルオロホスフェート（ＨＡＴＵ）、２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１− イル）−１，１，３，３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェー ト（ＨＢＴＵ）、１−ヒドロキシベンゾトリアゾール（ＨＯＢｔ）およびこれら の混合物からなる群から選択される少なくとも１つのメンバーを含んでなる活性 化剤の存在下で反応させる段階を含むことを特徴とする固体支持体オリゴヌクレ オチド合成のためのリンカーアームの製法。 ３８．活性化剤と４−ジメチルアミノピリジン（ＤＭＡＰ）の存在下で行われる ことを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ３９．活性化剤が２−（１Ｈ−ベンゾトリアゾール−１−イル）−１，１，３， ３−テトラメチルウロニウム ヘキサフルオロホスフェート（ＨＢＴＵ）である ことを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ４０．Ｚが下記の式を有することを特徴とする請求項３７に記載の製法： ４１．Ｚが下記の式を有することを特徴とする請求項３７に記載の製法： ４２．Ｚが下記の式を有することを特徴とする請求項３７に記載の製法： ４３．Ｚが下記の式を有し： 上記式中、Ｘ¹が、−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−、−Ｃ（Ｏ）−および−Ｎ( Ｒ¹²)−からなる群から選択され；Ｒ¹²は水素基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀ アルキル基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置 換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択され；Ｘ³は−Ｏ−または−Ｎ （Ｈ）−；Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ⁴およびＲ⁵は、同じかまたは異なり、水素基、ハ ロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未置換の Ｃ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルカリール基から なる群から選択され；ｎは０、１または２であり；Ａ’およびＢ’の１つが水素 基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換または未 置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキルアリ ール基からなる群から選択され；Ａ’およびＢ’の他の１つが下記の式であらわ され： 上記式中、Ｘ２は−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−、および−Ｎ(Ｒ¹³)−からな る群から選択され；Ｒ¹³は水素基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、 置換または未置換のＣ５-Ｃ３0アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ_{4 0} アルカリール基からなる群から選択され、Ｒ⁶およびＲ⁷は同じかまたは異なり 、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル基、置換ま たは未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₄₀アルキ ルアリール基からなる群から選択され；ｐは0または１；ｍは０、１または２で あることを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ４４．Ｂ¹が、水素基、ハロゲン化物基、置換または未置換のＣ₁〜Ｃ₂₀アルキル 基、置換または未置換のＣ₅〜Ｃ₃₀アリール基、および置換または未置換のＣ₅〜 Ｃ₄₀アルカリール基からなる群から選択されることを特徴とする請求項３７に記 載の製法。 ４５．Ｒ⁴が水素基であることを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ４６．ｎおよびｍが両方共１であることを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ４７．Ｒ¹、Ｒ²、Ｒ³、Ｒ¹²およびＲ¹³の各々が水素基であることを特徴とする 請求項３７に記載の製法。 ４８．Ｘ¹およびＸ²が、両方共に、−Ｏ−である請求項３７に記載の製法。 ４９．Ｚが下記の式を有し： 上記式中、Ｙが−Ｏ−、−Ｓ−、−Ｓ（Ｏ）₂−およびＯ−（(ＣＨ₂)₁-Ｏ）ｑか らなる群から選択され、１が６０以下の整数であり、ｑは１−１０００の範囲の 整数であり、Ｒ⁴、Ｒ⁵、Ｒ⁶、Ｒ⁷、ｍおよびｎは上と同じ意味を有し、Ｙが０で あるとき、ｎおよびｍの少なくとも１つが０または２であるという条件がつけら れることを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ５０．ＳＵＰＰＯＲＴ（支持体）が無機物質であることを特徴とする請求項３７ に記載の製法。 ５１．無機物質がシリカ、ガラスビーズ、ポーラスガラス、アルミノシリケート 、ボロシリケート、酸化金属、粘土およびこれらの混合物からなる群から選択さ れることを特徴とする請求項３７に記載の製法。 ５２．ＳＵＰＰＯＲＴ（支持体）が有機物質であることを特徴とする請求項３７ に記載の製法。 ５３．有機物質が架橋ポリマーであることを特徴とする請求項３７に記載の製法 。 ５４．ＮＵＣＬＥＯＳＩＤＥ（ヌクレオシド）が下記の式の１つから選択される 部分であり： 上記式中、Ｒ⁸およびＲ¹⁰は、同じかまたは異なり、水素基または保護基であり 、Ｒ⁹は水素基またはＯＲ¹¹であり、ここでＲ¹¹は、水素基または保護基であり 、Ｂ＊は、核酸塩基であることを特徴とする請求項３７に記載の製法。