JP2000502568A

JP2000502568A - 細胞内での突然変異ライブラリーのｉｎｖｉｖｏ製造のための方法

Info

Publication number: JP2000502568A
Application number: JP9524774A
Authority: JP
Inventors: ボルシャート，トルベン，ベデル; エールリッヒ，スタニスラス，ダスコ
Original assignee: Novo Nordisk AS
Current assignee: Novo Nordisk AS
Priority date: 1996-01-10
Filing date: 1997-01-10
Publication date: 2000-03-07
Also published as: CN101070537A; ATE293684T1; EP0873398A1; WO1997025410A1; AU1367897A; DK0873398T3; DE69733059T2; DE69733059D1; EP0873398B1; CN1210557A

Abstract

(57)【要約】多数の突然変異遺伝子要素を含んで成る細胞内でのライブラリーの in vivo製造のための方法であって、遺伝子要素全体又は一部を複製するためにエラー癖ポリメラーゼを各先祖細胞において使用する方法。この遺伝子要素はｉ）複製が開始される複製起点、ii）任意的な遺伝子マーカー、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子、iii）注目のポリペプチドをコードする遺伝子、を含んで成る。更に、注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列の作製のため及びかかる DNA配列の決定のための方法を記載する。

Description

【発明の詳細な説明】細胞内での突然変異ライブラリーの in vivo製造のための方法発明の分野本発明はポリペプチド変異体のライブラリーの in vivo製造のための方法、これらの変異体のスクリーニング及び所望の特性を示すものの選別に関する。本発明は更に所望のポリペプチド変異体を製造するための方法に関連する。発明の背景酵素及び非酵素タンパク質を含む数多くのポリペプチドが様々な産業、家庭用品、食品／飼料、化粧品、医薬品等において利用するために工業的に製造されている。これらのタンパク質の主要起源は天然微生物である。新たな且つ特別な特性を有するポリペプチドを探索するための伝統的な手法は天然に存在する野生型の生物のスクリーニングであった。これは上記の用途の如き様々な分野において利用されるポリペプチドの非常に有効な製造手段である。しかしながら、往々にして、かかるポリペプチドを十分な量で製造することは可能ではなく、その理由は天然宿主系において産生される量は製造を可能にするには微量すぎてしまい、そしてたとえコストが問題とならなくても、需要との関係で十分な量を供するうえでの困難性にぶつかる（例えはヒト成長ホルモン）。かかる問題はポリペプチドの製造のための組換技術の出現により大幅に解決された。当業界において、ポリペプチドは生物学系の利用により製造されている。所望のポリペプチドをコードする遺伝子をクローニングし、そして当該ポリペプチドをそれらがもとの生物において産生されるよりもはるかに多い量で産生する細胞の中に移入する。この20年間、かかる技術に従って数多くのポリペプチド製造方法が開発されている。往々にして、天然起源由来のタンパク質は所定の用途のための要件を満たさず、そして所定の活性又は生物物性特性に向けて現存のタンパク質を改良する必要があるであろう。タンパク質の新規な変異体は放射線（Ｘ−線及びUV）又は化学突然変異誘発剤を利用して作製することが可能である。しかしながら、この手法は非常にめんどう、且つ時間のかかる工程であるため、この20年の間研究者はより特異的且つ選択的な組換技術、例えば人工的多彩性を構築するためのタンパク質及び遺伝子操作を利用することにより現存のポリペプチドに対する改善を図っている。構造機能関連及び一般のタンパク質化学の知識を利用する考察に基づき、研究者は様々な特性において改善を示すポリペプチド変異体を長い間企案している。しかしながら、ポリペプチドが関与する様々な相互作用はかかる知識に従う合理的な企案が重大な制約を有する点で複雑であることも認識され、そして近年、ランダム突然変異誘発を採用し、次いでそれから産生される非常に大量の変異体をスクリーニング又は選別する方法が注目を浴びてきている。この目的のため、突然変異体の微生物ライブラリーが所望の特性を有する変異体を決定するためのその後の発現及びスクリーニングのために作製されている。何年もの間、多種多様なポリペプチドの変異体を構築するためのin vitro及び in vivo DNA突然変異誘発技術が開発されている。典型的な天然ポリペプチドは 100〜1000個のアミノ酸より成り、そしてそれぞれが20通りで異なりうる（天然アミノ酸だけを考慮して）という事実を考慮し、特異的なポリペプチドについての可能な変異体の数は莫大である。ポリペプチドの改善された変異体を同定するために用いる微生物の集団又はライブラリーの有用性を規定又は決定するための主要パラメーターはこの集団を構成する様々な変異体の数Ｎであるため、大型ライブラリーの必要性が出現した。特に強力な選別系がある場合、所望のポリペプチドの同定のための制限因子はライブラリーのサイズである。 in vitro系において、Ｎの実際の当業界の限界値は約 10⁸である。これは主に宿主生物への操作 DNAの形質転換（細胞への DNAの導入）の非効率性による。この数字は生物間でかなり変動する。最良のケースＥ．コリ(E．coli)において、i n vitro操作 DNAの形質転換の通常の効率、例えば、 DNAフラグメントのライゲーション又は DNAの化学処理による効率は最大で 10⁸個以下の細胞のライブラリーサイズをもたらす(Greg Winter，Current methods in Immunology 5: 253-255 ，1993)。このサイズのライブラリーはごくわずかな例でしか報告されていない。その他の原核生物、例えばバチルス（Bacillus）種、ストレプトコッカス(Str eptococcus)種又はスタフィロコッカス（Staphylococcus）種におけるin vitro ライブラリー構築は現実的な理由のためにこの数値よりも数桁低いであろう。真核系宿主、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisi ae）又は様々なアスペルギルス(Aspergillus)種を考えると、in vitro操作 DNA からは更に低い形質転換体数が予測されうる。大型ライブラリーの特別なケースが、この特別なケースのために有用な特製系に基づく抗体軽鎖及び重鎖のライブラリー間での in vivo組換を基礎に報告されている（Griffiths，A.D.ら、1994，EMBOJ．14: 3245 -3260)。 in vivoで微生物内でポリペプチドの変異体を作製するための数多くの方法があり、それは非常に簡単なもの、例えば細胞の化学又は物理突然変異誘発剤による処理から、エラー癖（error-prone）DNAポリメラーゼを含むが、かかるエラーを修復する誤対合修復系を欠く細胞を頼りとするやや複雑なもの（Stratagene， XL1-red（mutS，mutD，mutT）Catalog #200129）に至る。しかしこれらの技術は大きな欠点を有し、なぜなら突然変異誘発はゲノム（注目のポリペプチドをコード）の特定部分を標的とすることができず、そして高い頻度の突然変異が標的遺伝子と同様に細胞にとっての必須遺伝子においても生じ、突然変異が注目のポリペプチドの影響を及ぼしていない大量の細胞と一緒に大量の細胞死を供してしまうからである。かかる「ノイズ」は標的領域における突然変異の蓄積を制約するであろう。従って、本発明の目的はポリペプチド変異体の非常に大きな数値Ｎを供するためのin vitro標的領域−特異的突然変異誘発手順の提供にある。本発明の第二の目的は現存の及び将来の技術の双方による所望の特性を有する変異体のスクリーニング又は選別に関する。発明の概要従って、本発明は多数の突然変異遺伝子要素を含んで成る細胞内でのライブラリーの in vivo製造のための方法に関連し、この方法はｉ）複製が開始される複製起点、 ii）任意的に、遺伝子マーカー、例えば抗生物質に対して耐性を授ける遺伝子、 iii）注目のポリペプチドをコードする遺伝子を宿主染色体複製機構とは独立に含んで成る遺伝子要素全体又は一部を複製するために各先祖細胞においてエラー癖ポリメラーゼを使用するものである。本発明は更に注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列の作製のための方法であって、ｉ）上記の方法により突然変異ライブラリーを製造する、 ii）前記ライブラリーを注目の前記遺伝子の発現を誘発する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、 iii）前記ポリペプチド変異体を所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そしてかかる所望の変異体を産生する宿主を同定し、そして単離する、 iv）前記宿主内の前記遺伝子要素を配列決定し、所望の変異体をコードする突然変異遺伝子の DNA配列を推定する、方法；並びに注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列の決定のための方法であって、ｉ）上記の方法により突然変異ライブラリーを製造する、 ii）前記ライブラリーを注目の前記遺伝子の発現を誘導する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、 iii）前記ポリペプチドを所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そしてかかる所望の変異体を産生する宿主を同定し、そして単離する、 iv）前記宿主内の前記遺伝子要素を配列決定し、所望の変異体をコードする突然変異遺伝子の DNA配列を推定する；方法に関する。ライブラリーのスクリーニング又は変異体の選別は特定のポリペプチド並びにそのどの特性を改善及び／又は保持するかに依存する。従って、各ケースについてスクリーニングプロトコールを設定する必要がある。数多くのアッセイを含むかかるプロトコールは論文に記載されている(Clacksonら、Nature 352: 624-628 ，1991，Bryan，P ら、Proteins 1: 326-334，1986)。多彩性の構築及び所望の特性を有する変異体の選別の組合せに対する優れたアプローチはファージディスプレー系により多彩性を構築するための本発明の in vivo方法の組合せであろう。注目のポリペプチドの特異的な例は布帛からタンパク質性汚染を除去するために洗剤産業において利用されているアルカリ性プロテアーゼである。この場合、スクリーニングは、熱安定性、酸化安定性、貯蔵安定性、基質特異性及び親和性、非水性溶媒に対する安定性、pHプロフィール、イオン強度依存性、触媒効率及び洗浄性能の如き特性を調べるために実際の洗浄組成物において実施されていることがある。更に、本発明は所望の変異体の製造のための方法であって、ｉ）上記方法に従って決定された注目のポリペプチドをコードするDNA配列を適当な宿主の中に、それがその宿主内で発現されうるように導入する、 ii）前記宿主を前記 DNA配列の発現を誘導する条件下で培養する、そして iii）前記ポリペプチド変異体を回収する、方法に関する。適当な宿主系への選定の DNA配列の導入のための方法は発表されている。Samb rookら、Molecular Cloning: A Laboratory Manual.Cold Spring Harbor Lab.， Cold Spring Harbor，NY.）。適当な増殖培地の選定及び注目のポリペプチド変異体の発現を誘導するように選定される宿主系のその他の条件の選定も当業者の能力に属する。その指針は例えばSambrookら前掲に記載されている。ポリペプチドの回収のため、タンパク質の選別及び精製についての数多くの方法が例えばScopes，R.K.，Protein Purification(1987)，Springer-Verlagに記載されている。最後に、本発明は上記方法により製造されたポリペプチドに関する。発明の詳細な説明本発明は注目の遺伝子における変異体の in vivoライブラリーを構築するための方法を含んで成る。この方法は遺伝子要素、例えば宿主の染色体複製系とは独立に複製できるバクテリオファージ又はプラスミドの利用を包含する。宿主染色体の複製及び遺伝子要素（ファージ／プラスミド）の複製を分割する可能性の利用により、宿主の染色体を完全なままにして遺伝子要素（ファージ／プラスミド）の中に突然変異を選択的に導入することが一の複製系を改変することにより可能である。このとは注目の遺伝子における変異の構築は宿主の生存率を損わないことを意味する。 DNA複製は非常に高精度な工程であり、そしてＥ．コリにおける染色体複製の誤組込み率が一回の複製につき一塩基当り10^-10程度と推定される。 DNA複製の際に実施する塩基対合はポリメラーゼが適正な塩基を所定の位置に組込むのを優先し、それは全複製忠実度の約 10⁵を占める。不適正な塩基が組込まれると、ポリメラーゼは立往生し、そして３′−５′エキソヌクレアーゼは往々にして３′ 誤対合塩基を除去するであろう。この部分は全複製忠実度の約 10²を占めるプルーフリーディングを示す。細胞の修復系は忠実度率の残りの 10³を占める。Ｅ．コリ内での染色体の複製はほとんど DNAポリメラーゼIIIホロ酵素により実施される。このホロ酵素はポリメラーゼ（アルファーサブユニットpolC遺伝子）及び３′−５′エキソヌクレアーゼ（dnaQ遺伝子）等の10種類のポリペプチドを含む多重タンパク質複合体である。更なるポリメラーゼ、 DNAポリメラーゼＩ（DNA polＩ，polA遺伝子）は３種類の活性、即ち、 DNAポリメラーゼ活性、３′−５′エキソヌクレアーゼ活性及び５′−３′エキソヌクレアーゼ活性を、それが一本鎖ポリペプチドであるにもかかわらず、含む。このポリメラーゼは細胞内で複数の機能を有する。 DNA修復とは別に、 DNApolＩも染色体 DNA複製のために必要であり、なぜならそれはラギング DNA鎖の合成の際の DNAフラグメントの合体に関与するからである。しかしながら、それはゲノムのごくわずかな部分しか複製しない。このポリメラーゼは更に所定のクラスのプラスミドの、例えば複製系プラスミドのColEＩ起源、例えばエッシェリヒア・コリ(Ｅ．coli)及びグラム陰性菌におけるpBR322又はグラム陽性菌におけるpAM βＩの如きのプラスミドの DNA複製の開始に関与する。かかるプラスミドは、 DNAポリメラーゼが活性状態で存在していないとき、例えばこの酵素が遺伝的要因で不能となっているとき（例えば非許容温度においての温度感受性変異体）又はほんのわずかな量の DNAポリメラーゼ IIIしか細胞の中に存在していないときに、 DNAポリメラーゼＩの活性を介して完全に複製することができうる。所定の突然変異は DNA複製の忠実度を低下（又は上昇）させることがよく知られる。これらの突然変異はポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼ、又は修復系の要素において主に存在することが地図化された。残念ながら、このような突然変異体はほとんどが完全ゲノム供与のための忠実率を変化／悪化させ、従ってかかる非標的化突然変異は所望されない。かかる突然変異の一例は DNA polＩの３′−５′エキソヌクレアーゼ活性の不活性化でありうる。しかしながら、本発明に従うと、本明細書に規定の一定の遺伝子要素の複製を続けながら、複製系におけるいくつかの要素が一時的に完全又は部分的に「スイッチ」オフとなり得、それ故ゲノムの複製を停止又は大幅に速度低下させうる事実が利用される。温度感受性 DNA polIII（ホロ酵素を条件付きで不能にするポリメラーゼα− サブユニット又は別の温度感受性サブユニット）を含む又は染色体複製の開始のために必要な機能、例えばDnaA、エラー癖DNA polＩ及び注目の遺伝子含有のcol EＩ系プラスミドを含むＥ．コリ株が、プラスミドにおいて突然変異（及び注目の遺伝子）を特異的に導入するように企案された本発明に係る遺伝子系の例である。かかる系において、温度の非許容値への上昇は、 DNA polIIIに完全に機能を停止させ、同時にエラー癖 DNA polＩがその機能を保持し、そして低い忠実度を有するプラスミドを複製させ、プラスミドの突然変異コピーを供する効果を有するであろう。突然変異の作製はランダムなため、各細胞の固有の突然変異を構築し、そして温度の下降により、温度感受性機能は再び活性化し、そして細胞の正常複製が続くであろう。バリエーションはpolIII及びpolＩの温度感受性アレルを有するＥ．コリ株並びにエラー癖ポリメラーゼの誘導体発現（tsリプレッサー（温度感受性）により又は化学誘導による）であろう。一定の温度及びインデューサー突然変異の存在下で、突然変異は遺伝子要素内で蓄積するであろう。許容温度及びインデューサーの非存在下で、完全系は野生型細胞の如く機能する。従って、本発明はその第一観点において、多数の突然変異遺伝子要素を含んで成る細胞内での突然変異ライブラリーの in vivo製造のための方法であって、ｉ）複製が開始される複製起点、 ii）任意的に遺伝子マーカー、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子、 iii）注目のポリペプチドをコードする遺伝子、を宿主染色体複製機構とは独立して含んで成る遺伝子要素全体又は一部を複製するようにエラー癖ポリメラーゼを各先祖細胞において利用する方法に関連する。従って本発明は多数の突然変異遺伝子要素を含んで成る細胞内でのライブラリーの in vivo製造のための方法であって、Ａ）細胞を用意する、ここでかかる細胞はその染色体複製機構とは独立に、（ｉ）（ａ）複製が開始される複製起点、（ｂ）任意的に遺伝子マーカー、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子、（ｃ）注目のポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成る遺伝子要素全体又は一部を複製するであろうエラー癖ポリメラーゼ；及び（ii）実質的に不能となるように可逆的に誘導されうる染色体複製機構；を有する；Ｂ）かかる細胞をその複製を誘導する条件下で増殖させ、多数の先祖細胞を得る；Ｃ）前記エラー癖ポリメラーゼによる前記遺伝子要素の複製を可能にするのに十分な時間前記先祖細胞内で前記染色体複製機構が実質的に不能となるように可逆的に誘導し、前記遺伝子要素内で突然変異を構築する；Ｄ）前記突然変異細胞内で前記染色体複製機構が実質的に機能性となるように可逆的に誘導する；そしてＥ）前記突然変異細胞をその複製を誘導する条件下で増殖させる；ことを含んで成る方法を含んで成る。本明細書において、「突然変異ライブラリー」なる語は、注目のポリペプチドをコードする一の特定の遺伝子に関して異なり合う一式の細胞、細菌又はファージ（典型的には 10⁵〜10¹³種の細胞又はファージ）を意味する。典型的には、ライブラリーの各メンバー内のこの特定のポリペプチドにおいて１又は複数種のアミノ酸変更を導入する。本明細書において、「エラー癖ポリメラーゼ」とは、 DNA複製の際、この目的のために通常利用されるポリメラーゼよりも高い頻度で誤まり（所定の位置における誤まったヌクレオチドの一つ、又は１もしくは複数のヌクレオチドの欠失もしくは挿入を及ぼす）を組込むであろうポリメラーゼを意味する（例えばＥ．コリ DNA polＩ、バチルス・スブチリス（B．subtilis）DNA polＩ、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ）。「先祖細胞」とはここでは突然変異の導入されていない細胞を意味する。本発明の一定の態様において、突然変異サイクルを反復してよく、そしてかかる場合、最初に突然変異された細胞は第２回目の突然変異サイクル等のための先祖細胞となる。本明細書において、「宿主染色体複製機構」とは、宿主染色体の複製を主に司る DNAポリメラーゼ又は DNAポリメラーゼホロ酵素、例えばＥ．コリの DNAポリメラーゼIIIを意味する。本明細書において、「遺伝子要素」と、 RNA又は DNAより成り、独立して複製できる、即ち複製起点を含む小型（１又は２キロ塩基〜 100キロ塩基）因子を意味する。この遺伝子要素は典型的にはバクテリオファージ、ファージミド又はプラスミドであろう。この遺伝子要素は本発明に従い、注目のポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成り、そして更に遺伝子マーカー、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子を含んで成りうる。ウィルス、レトロウィルス又は宿主複製機構とは独立して複製できるトランスポゾン、例えばレトロトランスポゾンも「遺伝子要素」として利用できうる。 Kim及びLoeb（1995，PNAS 92: 684-688）はHN逆転写酵素（HIV-RT）がプラスミド DNA複製の染色体 DNA複製及び開始に関連してＥ．コリ DNA polＩを補完できることを実証した。HIV-RT（及び関連のレトロウィルス逆転写酵素）の誤組込み率は DNA polＩの率、即ち、１ラウンドの複製につき１塩基当り10^-3〜10^-4の誤組込みよりも数桁高い。本発明の態様における突然変異エラー癖Ｅ．コリ DNA polＩの代わりのかかるポリメラーゼの利用は上記の系における誤複製の頻度を有意に高めるであろう。本発明の更なる態様において、上記の突然変異サイクルは反復してよく、即ち、突然変異ポリメラーゼは何度もスイッチオン・オフとなり、これによりより多くの突然変異体が構築できる。かかる工程は更に、多重コピープラスミドを遺伝子要素として使用するなら、プラスミドの分離を助けることができる。一定の遺伝子要素において、複製起点付近に位置する遺伝子要素部分のみがエラー癖ポリメラーゼにより複製されることが想定できうる。かかる場合、注目の遺伝子はこの領域内にあるべきである。本発明の特定の態様において、遺伝子要素はファージであり、ここで注目のポリペプチドをコードする遺伝子は、ポリペプチドが発現によりファージの表層より表示され、それ故スクリーニングが直接実施できるようにする位置にある(Gre g Winter、前掲参照)。ファージの DNA配列及び表示タンパク質間の対応を確保するため、一次ファージストックは、選別又はスクリーニングの前に低感染多重度で野生型Ｅ．コリを介して継代されるべきである。突然変異頻度を更に高めるため、本発明の方法は修復欠陥宿主、例えばmutL， mutS，mutH、又は突然変異ゲノタイプの組合せと一緒に利用する態様を含んで成る。本明細書における「修復欠陥宿主」とは、 DNA修復に直接又は間接的に関与することで知られるタンパク質をコードする遺伝子において１又は複数の改変を含む細胞を意味する。かかる突然変異の結果は、高い頻度の導入突然変異（ポリメラーゼ、化学物質、Ｘ線、UV光、等による）が修復できず、そしてゲノムの中に「永久的に」組込まれるであろうことであり、いわゆる突然変異表現型である。かかる遺伝子の例はmutL，mutS，mutH，mutTである。遺伝子要素と同様に、変異体作製とディスプレー系とを組合せるため、プラスミドの代わりにファージミドを使用してよい。例えば M13，fI，fd。本明細書において、「ファージミド」とは、プラスミド複製起点の他に、ファージ複製起点を含むプラスミドを意味する。ファージミドは条件によりプラスミド又はファージ（ヘルパーファージによる感染に基づき）として複製できる。ファージミド系は１）プラスミド複製起点、例えばColEＩ、２）Ｍ13ファージ複製起点、３）ＧIIIタンパク質をコードする遺伝子に融合した注目の遺伝子より成るキメラ遺伝子、 d.Res．21: 4491-4498，1993）。第一工程は上述のファージミドにより形質転換されたＥ．コリ株の増殖／維持による多彩性の構築であろう。第二工程はファージ粒子へとパッケージングされるであろう一本鎖ファージミドを作り上げるためのヘルパーファージによる感染であろう。変異タンパク質を表示するファージは選別手順にかけることができる。更に、一定のバクテリオファージ、例えばエッシェリヒアにおけるＴ４もしくはＴ７、又はバチルス株における SPOII及び Phi29はそれ自体の DNAポリメラーゼを含み、そして本発明に従うと、上記の遺伝子要素がエラー癖 DNAポリメラーゼを含むバクテリオファージである態様が想定されうる。本発明に従うと、エラー癖ポリメラーゼは典型的には DNAポリメラーゼＩ又は逆転写酵素を含んで成る群から選ばれる。好適なエラー癖ポリメラーゼはＥ．コリ DNAポリメラーゼＩ又は HIV逆転写酵素の変異体である。注目のポリペプチドとしては多数のものが考えられ、そして特に生物活性を発揮するポリペプチドが挙げられうる。それらには酵素、ホルモン、レセプター、凝血因子、抗微生物剤、及びその他のヒト及び動物における様々な障害及び病気の予防及び処置のために重要なポリペプチドが挙げられる。また、工業的な目的のために利用される酵素が挙げられうる。かかる工業的酵素には、カルボニルヒドロラーゼ、カルボヒドロラーゼ、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、フィターゼ、抗微生物ポリペプチド、オキシドリダクターゼ、イソメラーゼ、リアーゼ及びリガーゼの群に属する酵素が挙げられる。本明細書において「カルボニルヒドロラーゼ」は−Ｃ（＝Ｏ）−Ｘ基を含む化合物を加水分解する酵素を意味する。ここでＸは酵素又は窒素である。カルボニルヒドロラーゼの群に属する酵素の特定のクラスは例えばヒドロラーゼ（リパーゼ）及びペプチドヒドロラーゼ（プロテアーゼ）である。プロテアーゼとはRecommendations（1992）of the International Union of B iochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従い酵素分類番号 E.C.3.4に分類される酵素を意味する。酵素には、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれるプロテアーゼが含まれる： 3.4.11（即ち、いわゆるアミノペプチダーゼ）、例えば3.4.11.5（ピロリルアミノペプチダーゼ）、3.4.11.9（Ｘ−プロアミノペプチダーゼ）、3.4.11.10(細菌ロイシルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.12(好熱アミノペプチダーゼ)、3.4.11.1 5(リシルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.17(トリプトファニルアミノペプチダーゼ)、3.4.11.18(メチオニルアミノペプチダーゼ)； 3.4.21（即ち、いわゆるセリンエンドペプチダーゼ）、例えば3.4.21.1（キモトリプシン）、3.4.21.4（トリプシン）、3.4.21.25(ククミシン)、3.4.21.32(ブラチウリン)、3.4.21.48(セレビシン)及び3.4.21.62(スブチリシン)； 3.4.22（即ち、いわゆるシステインエンドペプチダーゼ）、例えば3.4.22.2（パパイン）、3.4.22.3（フィカイン）、3.4.22.6（キモパパイン）、3.4.22.7（アスクレパイン）、3.4.22.14（アクチニダイン）、3.4.22.30(カリカイン)及び3. 4.22.31(アナナイン)； 3.4.23（即ち、いわゆるアスパラギン酸エンドペプチダーゼ）、例えば3.4.23.1（ペプシンＡ）、3.4.23.18(アスペルギロペプシンＩ)、3.4.23.20 (ペニシロペプシン)及び3.4.23.25(サッカロペプシン)；並びに 3.4.24（即ち、いわゆる金属エンドペプチダーゼ）、例えば3.4.24.28(バチロリシン)。関連のスブチリシンの例には、スブチリシン BPN′、スブチリシンアミロサッカリティカス、スブチリシン 108、スブチリシンメセンテリコペプチダーゼ、スブチリシンカールスバーグ、スブチリシンDY、スブチリシン 309、スブチリシン 147、サーミターゼ、アクアリシン、バチリスPB92プロテアーゼ、プロティナーゼＫ、プロテアーゼTW７及びプロテアーゼTW３が含まれる。容易に商業的に入手できるプロテアーゼの特定の例にはEsperase 、膵臓トリプシンNOVO(PTN)，Bio-Feed^TMPro，Clear-Lens Pro(全てNovo Nordis k A/Sより入手できる酵素)が含まれる。 alより市販）が含まれる。プロテアーゼ変異体も注目のポリペプチドとして考慮されることが理解される。かかるプロテアーゼ変異体の例はEP 130.756(Genentech)，EP 214.435(Henkel )，WO 87／04461(Amgen)，WO 87／05050(Genex)，EP 251.446(Genencor)，EP 26 0.105(Genencor)，Thomas ら、(1985)，Nature．318，p.375-376，Thomasら、(1 987)，J.Mol.Biol.，193，pp.803-813，Russelら、(1987)，Nature，328，p.496 -500，WO 88／08028(Genex)，WO 88／08033(Amgen)，WO89／06279(Novo Nordisk A/S)，WO 91／00345（Novo Nordisk A/S），EP 525 610（Solvay）及び WO 94/02618（Gist-Brocades N.V.）に開示されている。プロテアーゼの活性は「Methods of Enzymatic Analysis 」第３版 1984、Ve rlag Chemie，Weinheim，vol.5に記載の通りにして決定できる。リパーゼはここではRecommendations（1992）of the International Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従い酵素分類番号E.C.3.1.1. （カルボン酸エステルヒドロラーゼ）に分類される酵素を意味する。その例には、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれるリパーゼが含まれる： 3.1.1(即ち、いわゆるカルボン酸エステルヒドロラーゼ)、例えば(3.1.1.3)トリアシルグリセロールリパーゼ、（3.1.1.4）ホスホリパーゼＡ₂。リパーゼの例には下記の微生物に由来するリパーゼが含まれる。表示の特許文献は引用することで本明細書に組入れる：ヒュミコラ（Humicola）、例えばＨ．ブレビスポロラ(H．brevispora)、Ｈ．ラヌギノーザ(H．lanuginosa)、Ｈ．ブレビス(H．brevis)、サーモイイデア品種（thermoidea）及びＨ．インソレンス(H．insolens)(US 4,810,414)。シュードモナス(Pseudomonas)、例えばPs．フラギ(Ps．fragi)、Ps．スタッシェリ（Ps．stutzeri）、Ps．セパシア(Ps．cepacia）及びPs．フルオレセンス(P s．fluorescens)(WO 89／04361)又はPs．プランタリイ(Ps．plantarii)もしくは Ps．グラジオリ(Ps．gladioli)(US特許第 4,950,417号(Solvay enzymes))又はPs ．アルカリジェンス(Ps．alcaligenes)及びPs．シュードアルカリジェンス(Ps． pseudoalcaligenes)(EP 218 272)又はPs．メンドシナ(Ps ．mendocina)(WO 88／09367; US 5,389,536)。フサリウム（Fusarium）、例えばＦ．オキシスポルム(F．oxysporum)(EP 130, 064)又はＦ．ソラニ・ピシ(F．solani pisi)(WO 90／09446)。ムコール(Mucor)(また名はリゾムコール(Rhizomucor))、例えばＭ．ミーヘイ( M．miehei)(EP 238 023)。クロモバクテリウム(Chromobacterium)(特にＣ．ビスコスム(C．viscosum))。アスペルギルス(Aspergillus)(特にＡ．ニガー(A．niger))。カンジダ(Candida)、例えばＣ．シリンドラセア(C．cylindracea)(また名はＣ．ルゴサ(C．rugosa))又はＣ．アンタルクチカ(C．antarctica)(WO 88／02775) 又はＣ．アンタルクチカ(C．antarctica)リパーゼＡもしくはＢ(WO 94／01541及び WO 89／02916)。ゲオトリカム(Geotricum)、例えばＧ．カンジドウム(G．candidum)(Schimada ら(1989)，J.Biochem.，106，383-388)。ペニシリウム(Penicillium)、例えばＰ．カンベルチイ(P．camembertii)(Yama guchiら(1991)，Gene 103，61-67)。リゾプス（Rhizopus）、例えばＲ．デレマー(R．delemar)(Hassら(1991)，Gen e 109，107-113)又はＲ．ニベウス(R．niveus)(Kugimiyaら(1992)Biosci.Biotec h.Biochem 56，716-719)又はＲ．オリザ(R．oryzae)。バチルス、例えばＢ．スブチリス(Dartoisら(1993)Biochemicaet Biophysica acta 1131，253-260)又はＢ．ステアロサーモフィルス(B．stearothermophilus) (JP 64／7744992)又はＢ．プミリス(B．pumilus)(WO 91／16422)。。その他のリパーゼの例はLumafast^TM、Ps．メンドシナリパーゼ(Genencor Int. Inc.由来)； Lipomax^TM、Ps．シュートアルカリジェンスリパーゼ(Gist Brocade s／Genencor Int.Inc．由来)；フサリウム・ソラニ(Fusarium solani)リパーゼ( クチナーゼ)(Unilever由来)；バチルス種リパーゼ（Solvay enzymes由来）である。その他のリパーゼはその他の会社から入手できる。リパーゼの活性は「Methods of Enzymatic Analysis」第３版、1984、Verlag Chemie，Weinhein，vol.4又は AF 95／5 GB(avail-able on request from Novo Nordisk A/S)に記載の通りにして決定できる。本明細書において、「カルボヒドラーゼ」は特に５及び６員環構造の炭水化物鎖（例えばデンプン）を分解することのできる全ての酵素を意味する（即ち、Re commendations（1992）of the International Union of Biochemistry and Mole cular Biology（IUBMB）に従って酵素分類番号E.C.3.2(グリコシダーゼ)に属する酵素）。また、本発明に係る炭水化物の群に含まれるのは炭水化物、例えば６員環構造、例えばＤ−グルコースを例えばＤ−フルクトースの如き５員環構造へと異性化することのできる酵素を含む。その例には、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれる炭水化物が含まれる： α−アミラーゼ(3.2.1.1)、β−アミラーゼ(3.2.1.2)、グルカン１，４−α−グルコシダーゼ(3.2.1.3)、セルラーゼ(3.2.1.4)、エンド−１，３（４）−β−グルカナーゼ(3.2.1.6)、エンド−１，４−β−キシラナーゼ(3.2.1.8)、デキストラナーゼ（3.2.1.11）、キチナーゼ（3.2.1.14）、ポリガラクシロナーゼ（3.2. 1.15）、リゾチーム（3.2.1.17）、β−グルコシダーゼ（3.2.1.21）、α−ガラクトシダーゼ（3.2.1.22）、β−ガラクトシダーゼ（3.2.1.23）、アミロ−１，６−グルコシダーゼ（3.2.1.33）、キシラン１，４−キシロシダーゼ（3.2.1.37）、グルカンエンド−１，３−β−Ｄ−グルコシダーゼ（3.2.1.39）、α−デキストリンエンド−１，６−グルコシダーゼ（3.2.1.41）、スクロースα−グルコシダーゼ（3.2.1.48）、グルカンエンド−１，３−α−グルコシダーゼ（3.2.1.59）、グルカン１，４−β−グルコシダーゼ（3.2.1.74）、グルカンエンド−１，６− β−グルコシダーゼ（3.2.1.75）、アラビナンエンド１，５−α−アラビノシダーゼ（3.2.1.99）、ラクターゼ(3.2.1.108)、キトナナーゼ(3.2.1.132)及びキシロースイソメラーゼ(5.3.1.5)。関連のカルボヒドラーゼの例にはトリコデルマ・ハージアヌム(Trichoderma h arzianum)由来のα−１，３−グルカナーゼ；アラビノシダーゼ由来のα−１，６−グルカナーゼ（3.2.1.97）、ラクターゼ(3.2.1.108)、キトナナーゼ(3.2.1. 132)及びキシロースイソメラーゼ(5.3.1.5)が含まれる。関連のカルボヒドラーゼの例にはトリコデルマ・ハージアヌム由来のα−１，３−グルカナーゼ；ペシロマイセス（Paecilomyces）株由来のα−１，６−グルカナーゼ；バチルス・ズブチリス由来のβ−グルカナーゼ；ヒュミコラ・インソレンス由来のβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー由来のβ−グルカナーゼ；トリコデルマ株由来のβ−グルカナーゼ；エルスコビア・キサンチネオリチカ(Oerskovia xanthineolytica)株由来のβ−グルカナーゼ；アスペルギルス・ニガー由来のエキソ−１，４−α−Ｄ−グルコシダーゼ（グルコアミラーゼ）；バチルス・スブチリス由来のα−アミラーゼ；バチルス・アミロリケファシエンス由来のα−アミラーゼ；バチルス・ステアロサーモフィルス由来のα−アミラーゼ；アスペルギルス・オリザ由来のα−アミラーゼ；非病原性微生物由来のα−アミラーゼ；アスペルギルス・ニガー由来のα−ガラクトシダーゼ；ヒュミコラ・インソレンス由来のペントサナーゼ、キシラナーゼ、セロビアーゼ、セルラーゼ、ヘミ−セルラーゼ；トリコデルマ・リーセイ(T．reesei)由来のセルラーゼ；非病原性糸状菌由来のセルラーゼ；アスペルギルス・ニガー由来のペクチナーゼ、セルラーゼ、アラビナーゼ、ヘミ−セルロース；ペニシリウム・リラシヌム由来のデキスラナーゼ；非病原性糸状菌由来のエンド−グルカナーゼ；バチルス・アシドプリチカス由来のプルラナーゼ；クルイベロマイセス・フラギリス由来のβ−ガラクトシダーゼ；トリコデルマ・リーセイ由来のキシラナーゼが含まれる。容易に商業的に入手できるカルボヒドラーゼの特定の例には、Alpha-Gal^TM，B 他のカルボヒドラーゼはその他の会社から入手できる。かかるカルボヒドラーゼの変異体も注目のポリペプチドとして考慮される。カルボヒドラーゼの活性は「Methods of Enzymatic Analysis 」第３版、1984 、Verlag Chemie，Weinheim vol.4 に記載の通りに決定できる。オキシドリダクターゼはここではRecommendations（1992）of the Internatio nal Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従い酵素分類番号E.C.1(オキシドリダクターゼ)に分類される酵素を意味する。その例には、下記の酵素分類（E.C.）番号に分類されるものから選ばれるオキシドリダクターゼが含まれる：グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼ(NAD⁺ )(1.1.1.8)、グリセロール−３−ホスフェートデヒドロゲナーゼNAD(P)⁺(1.1.1.94)、グリセロール− ３−ホスフェート１−デヒドロゲナーゼ(NADP)(1.1.1.94)、グルコースオキシダーゼ(1.1.3.4)、ヘキソースオキシダーゼ(1.1.3.5)、カテコールオキシダーゼ(1 .1.3.14)、ピリルビンオキシダーゼ(1.3.3.5)、アラニンデヒドロゲナーゼ(1.4. 1.1）、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(1.4.1.2)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(NAD(P)⁺ )(1.4.1.3)、グルタミン酸デヒドロゲナーゼ(NADP⁺ )(1.4.1.4)、Ｌ −アミノ酸デヒドロゲナーゼ(1.4.1.5)、セリンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.7)、バリンデヒドロゲナーゼ(NADP⁺ )(1.4.1.8)、ロイシンデヒドロゲナーゼ(1.4.1.9) 、グリシンデヒドロゲナーゼ（1.4.1.10）、Ｌ−アミノ酸オキシダーゼ（1.4.3. 2.）、Ｄ−アミノ酸オキシダーゼ(1.4.3.3)、Ｌ−グルタミン酸オキシダーゼ（1 .4.3.11）、タンパク質−リジン６−オキシダーゼ（1.4.3.13）、Ｌ−リジンオキシダーゼ（1.4.3.14）、Ｌ−アスパラギン酸オキシダーゼ（1.4.3.16）、Ｄ− アミノ酸デヒドロゲナーゼ（1.4.99.1）、タンパク質ジスルフィドリダクターゼ (1.6.4.4)、チオレドキシンリダクターゼ(1.6.4.5)、タンパク質ジスルフィドリダクターゼ(グルタチオン)(1.8.4.2)、ラッカーゼ（1.10.3.2）、カタラーゼ（1 .11.1.6）、ペルオキシダーゼ（1.11.1.7）、リポキシゲナーゼ（1.13.11.12）、スーパーオキサイドジスムターゼ（1.15.1.1）。前記グルコースオキシダーゼはアスペルギルス・ニガーに由来しうる。前記ラッカーゼはポリポルス・ピンシトゥス（Polyporus pinsitus）、ミセリオフトラ・サーモフィラ(Myceliophtora thermophila)、コプリヌス・シネレウス(Coprinus cinereus)、リゾクトニア・ソラニ（Rhizoctonia solani）、リゾクトニア・プラチコラ（R.praticola）、シタリジウム・サーモフィルム（Scyta lidium thermophilum）及びラス・バーニシフェラ（Rhus vernicifera）に由来しうる。ビリルビンオキシダーゼはミロセチェシウム・ベルカリア(Myrothechecium ve rrucaria)に由来しうる。ペルオキシダーゼは例えばダイズ、西洋ワサビ又はコプリヌス・シネレウス(C oprinus cinereus)に由来しうる。タンパク質ジスルフィドリダクターゼは引用することで本明細書に組入れるDK 特許出願第 768／93， 265／94及び 264／94（Novo Nordisk A/S）のいづれかに挙げられているもの、例えば牛起源のタンパク質ジスルフィドリダクターゼ、アスペルギルス・オリザ又はアスペルギルス・ニガー由来のタンパク質ジスルフィドリダクターゼ、及びエッシェリヒア・コリ由来のDsbA又はDsbCであってよい。容易に商業的に入手できるオキシドリダクターゼの特定の例にはGluzyme^TM（N ovo Nordisk A/Sより入手できる酵素）が含まれる。しかしながら、その他のオキシドリダクターゼが他社から入手できる。オキシドリダクターゼの変異体も注目のポリペプチドと考慮されることが理解できる。オキシドリダクターゼの例は「Methods of Enzymatic Analysis 」第３版、1984、Verlag Chemie，Weinheim，vol.3に記載の通りにして決定できる。本明細書においてトランスフェラーゼはRecommendations（1992）of the Inte rnational Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従い酵素分類番号 E.C.2に分類される酵素である。トランスフェラーゼは下記のトランスフェラーゼがサブグループにおける任意のトランスフェラーゼであってよい：１炭素基を転位するトランスフェラーゼ（ E.C.2.1.）；アルデヒド又は残基を転位するトランスフェラーゼ(E.C.2.2)；アシルトランスフェラーゼ(E.C.2.3)；グルコシルトランスフェラーゼ(E.C.2.4)；メチル基を除くアルキル又はアリール基を転位するトランスフェラーゼ(E.C.2.5 )；窒素性基を転位するトランスフェラーゼ(E.C.2.6)。好適な態様において、トランスフェラーゼはトランスグルタミナーゼE.C.2.3. 2.13（タンパク質−グルタミンγ−グルタミルトランスフェラーゼ）である。トランスグルタミナーゼは、ペプチド結合グルタミン残基のγ−カルボキシアミド基がアシル供与体であるアシル転位反応を触媒できる酵素である。様々な化合物における第一アミノ基はアシル受容体として機能することができ、ペプチド結合グルタミン酸のモノ置換化γ−アミドのその後の形成が伴う。ペプチド鎖内のリジン残基のエプシロン−アミノ基がアシル受容体として働くとき、トランスフェラーゼは分子内又は分子間γ−グルタミル−ε−リジル架橋を形成する。トランスグルタミナーゼの例は係属中のDK特許出願第 990／94（Novo Nordisk A/S）に記載されている。トランスグルタミナーゼはヒト、動物（例えばウシ）又は微生物起源のいづれでもよい。かかるトランスグルタミナーゼの例は動物由来トランスグルタミナーゼFXIII ａ；フィサルム・ポリセファルム(Physarum polycephalum)由来の微生物トランスグルタミナーゼ(Kleinら、Journal of Bacteriology，174，p.2599-2605)；ストレプトマイセス種由来のトランスグルタミナーゼ、例えばストレプトマイセス・ラベンジュラ(S．lavendulae)、ストレプトマイセス・リジカス(S．lydicus)( 以前はストレプトマイセス・リバニ(S．libani))及びストレプトバーチシリウム (Streptoverticillium)種、例えばストレプトバーチシリウム・モバラエンス(S ．mobaraense)、ストレプトバーチシリウム・シンナモネウム（S．cinnamoneum ）及びストレプトバーチシリウム・グリセオカーネウム（S．griseocarneum）である(Motokiら、US 5,156,956； Andouら、US 5,252,469；Kaempferら、Journal of General Microbiology，137，1831-1892; Ochi ら、International Journal of Sytematic Bacteriology，44，285-292; Andou ら、US 5,252,469; William sら、Journal of General Microbiology，129，1743-1813)。トランスフェラーゼ変異体も注目のポリペプチドとして考慮されることが理解される。トランスグルタミナーゼの活性は「Methods of Enzymatic Analysis 」第３版、1984、Verlag Chemie，Weinheim，vol.1-10 に記載されている。本明細書においてフィターゼはRecommendations（1992）of theInternational Union of Biochemistry and Molecular Biology（IUBMB）に従い酵素分類番号E .C.3.1.3(リン酸モノエステルヒドロラーゼ)に分類される酵素である。フィターゼはフィテートのイノシトール及び無機リンへの変換を触媒する微生物により産生される酵素である。フィターゼ産生微生物には細菌、例えばバチルス・スブチリス、バチルス・ナットー（B．natto）及びシュードモナス；酵母、例えばサッカロマイセス・セレビジエ（Saccharomyces cerevisiae）；及び菌類、例えばアスペルギルス・ニガー、アスペルギルス・フィキューム(A．ficuum)、アスペルギルス・アワモリ（A ．awamori）、アスペルギルス・オリザ、アスペルギルス・テレウス（A．terreu s）又はアスペルギルス・ニドゥランス(A．nidulans)及びその他の様々なアスペルギルス種が含まれる。フィターゼの例には下記の酵素分類番号（E.C.）に分類されるものから選ばれるフィターゼが含まれる：３−フィターゼ(3.1.3.8)及び６−フィターゼ（3.1.3 .26）。フィターゼの活性は「Methods of Enzymatic Analysis 」第３版、1984、Verl ag Chemie，Weinheim，vol.1-10 に従って決定されうるか、又は EP-A1-0 420 3 58、Example 2Aに記載の方法に従って測定されうる。本明細書において、抗微生物ポリペプチドは任意の抗微生物活性、例えば抗真菌、抗菌及び／又は抗昆虫活性を示すポリペプチドであってよい。かかるポリペプチドはその他の活性、例えば酵素活性も示しうる。本発明に係る抗微生物ポリペプチドの例には下記のものが含まれる： WO 94／ 01459(Novo Nordisk A/S)に記載のカービュラリア属の糸状菌に由来する殺真菌活性ポリペプチド；EP 403,458（Kabigen AB）に記載の抗菌ポリペプチド； WO 92／15691(Imperial ChemInd．PLC)記載のミラビリス(Mirabilis)種から単離された抗微生物タンパク質； WO 92／22578（Bomanら）記載のブタ小腸の抽出物から単離された抗菌ポリペプチド； JP-60130599記載のハンセヌラ(Hansenula) 種の酵母により蓄積される酵母致死作用を有するポリペプチド；米国特許第 5,3 48,865号（Jin Ro LTD）記載の抗微生剤として利用できうるフィトラッカ・インスラリス（Phytolacca insularis）抗ウィルスタンパク質；米国特許第 5,354,6 81号（Novo Nordisk A/S）記載のノカルジオプシス・ダッソンビレイ（Nocardio psis dassonville）由来の細菌溶解タンパク質調製物（Novo Nordisk A/S）が含まれる。その他の抗微生物ポリペプチドの例はマガニニン、プロテグリン、デフェンシン、シュードマイシン、ムタノリシン及びＮ−アセチルムラミダーゼである。本発明は、更なる観点において、注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列を構築するための方法であって、（ｉ）前述の方法により突然変異ライブラリーを製造する、（ii）前記ライブラリーを前記注目の遺伝子の発現を誘導する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、（iii）前記ポリペプチド変異体を所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そして所望の変異体を産生する宿主を同定及び単離する、（iv）前記変異体をコードする DNAを単離する、方法に関する。本発明は更なる観点において、注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列の決定のための方法であって、（ｉ）前述の通りに突然変異ライブラリーを製造する、（ii）前記ライブラリーを前記注目の遺伝子の発現を誘導する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、（iii）前記ポリペプチド変異体を所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そして所望の変異体を産生する宿主を同定及び単離する、（iv）前記宿主内の前記遺伝子要素を配列決定して所望の変異体をコードする突然変異遺伝子の DNA配列を推定する、方法に関する。本発明のこの観点はライブラリーの希釈品を作製し（例えばマイクロタイタープレートの中で）、そしてこれらを培養することにより実施でき、これによりそれぞれがライブラリーの一構成員を起源とする集団ができ、そして各集団から産生されるポリペプチド変異体を所望の特性についてスクリーニングする。他方、このライブラリーはポリペプチド変異体の所望の特性のスクリーニング又は選別を可能にする所望の増殖培地を含む寒天プレート上でプレート培養してよい。ファージディスプレー方法を利用するなら、スクリーニング又は選別はファージで直接実施する。選別に利用する基準は注目のポリペプチド変異体の最終用途に応じて変わるが、試験する典型的な特性には様々な培地中での溶解度及び半減期、抗原性及びアレルギー原性、熱安定性、酸化安定性、貯蔵安定性、基質特異性及び親和性、非水性溶媒に対する安定性、pHプロフィール、イオン強度依存性、触媒効率、並びにポリペプチド変異体が一部を構成する推定の最終製品のその他の成分との適合性が含まれうる。洗剤において使用すべき酵素に関し、調べるべき更なる特性は洗浄性能、及び様々な表面、特に布帛との適合性である。様々なその他の基準が挙げられうる。選定の基準を満足せしめるポリペプチド変異体を産生する集団の同定により、注目のポリペプチド変異体をコードする DNAを当業界公知の方法の利用により単離及び配列決定する。本発明は更に、所望のポリペプチド変異体の製造のための方法であって、（ｉ）上述の通りに決定した DNA配列を適当な宿主に、それがその宿主内で発現されうるように導入する、（ii）前記宿主を前記 DNA配列の発現を誘導する条件下で培養する、そして（iii）前記ポリペプチド変異体を回収する、方法を含む。本発明は任意の細胞、特に任意の微生物細胞に利用してよく、しかし往々にして原核細胞、特に細菌、好ましくはバチルス属等のものを利用するのが適当である。バチルス属のうち、Ｂ．レンタス、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．スブチリス、等を含んで成る群から選ばれる株を利用するのが好ましい。一定の用途に関し、真菌、特に糸状菌、好ましくはアスペルギルス、トリコデルマ属等のものが好ましい。アスペルギルス属の中で、Ａ．オリザ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリ等を含んで成る群から選ばれる株を利用するのが好ましい。トリコデルマ属の中で、Ｔ．リーセイ等を含んで成る群から選ばれる株を利用するのが好ましい。その他の状況において、 BHK、等の細胞を含んで成る群から選ばれる哺乳動物細胞を利用するのがより期待される。本発明は以上の記載及び下記の実施例に限定されない。材料及び方法実施例実施例１利用する系はエッシェリヒア・コリ宿主細胞であり、それはいくつかの染色体突然変異を特徴とする：ｉ）polC遺伝子内のts（熱感受性）突然変異（主要複製がポリメラーゼである DNAポリメラーゼIIIをコードする）； ii）３′−５′エキソヌクレアーゼ活性を低下させることにより増大したエラー率を及ぼすpolA遺伝子内の突然変異(DNAポリメーゼＩをコードする)； iii）mutL突然変異による修復欠陥。 in vivo突然変異誘発のための標的は（ｉ）フレームシフト突然変異又は（ii ）テトラサイクリンに対する耐性を授けるタンパク質をコードする tet遺伝子の中に導入された停止コドンのいづれかを有するプラスミドpBR322(colE1起源)である。各状況において、突然変異の修復は主要テトラサイクリン耐性表現型を供する。 pBR322はアンピシリンに対する耐性を授ける bla遺伝子も含む。標的領域での高い突然変異誘発率は「突然変異導入」条件に曝露した培養物のプレート培養を経てのテトラサイクリン耐性コロニーの高い頻度として認められる。 600nmで測定して１の光学密度に至るまで37℃で増殖させたＥ．コリ培養物を一定の温度、例えば42℃に２，４又は16時間露出させた。この時点で系列希釈培養物を１）アンピシリン（AmpRコロニー）２）テトラサイクリン及びアンピシリン（AmpR及びtetRコロニー）の添加されたLB寒天上でプレート培養する。テトラサイクリン耐性コロニー、対、アンピシリン耐性コロニーの比は、一の特異的な突然変異誘発現象を示唆する１コピーの修復 tet遺伝子を含む培養物中の細胞の数を示す。このことは、クローンがテトラサイクリン耐性を有するようになったら、少なくとも一の特異的な突然変異が当初に導入された遺伝子欠陥を修復するように起こることを意味する。本明細書中の引用文献 Greg Winter，Current methods in Immunology 5: 253-255，1993 Griffiths,A.D. ら 1994，EMBO J.14: 3245-3260 Clacksonら Nature 352: 624-628，1991 Bryan，Pら Proteins 1: 326-334，1986 Sambrookら Molecular Cloning: A Laboraroty Manual．Cold Spring Harbor La b.，Cold Spring Harbor，NY. Scopes，R.K.，Protein Purification(1987)，Springer-Verlag Kim and Loeb（1995，PNAS 92: 684-688） EP 130.756(Genentech)，EP 214.435(Henkel)，WO 87／04461(Amgen)，WO 87／0 5050(Genex)，EP 251.446(Genencor)，EP 260.105(Genencor)，Thomas ら(1985) Nature 318，375-376，Thomasら(1987)J.Mol.Biol.，193 803-813，Russel ら(1 987)Nature 328496-500，WO 88／08028(Genex)，WO 88／08033(Amgen)，WO 89／ 06279(Novo Nordisk A/S)，WO 91／00345(Novo Nordisk A/S)，EP 525 610（Sol vay）及び WO 94／02618(Gist-Brocades N.V.)，US 4,810,414，WO 89／04361， US特許第4,950,417(Solvay enzymes)，EP 218 272，WO 88／09367，US 5,389,53 6，EP 130,064，WO 90／09446)，EP 238 023，WO 88／02775，WO 94／01541，WO 89／02916，Schimada ら (1989)，J.Biochem.，106，383-388，Yamaguchiら (1 991)，Gene 103，61-67，Hassら (1991)，Gene 109，107-113，Kugimiyaら(1992 )Biosci.Biotech.Biochem 56，716-719，Dartoisら（1993）Biochemica et Biop hysica acta 1131，253-260，JP64／7744992，WO 91／16422，WO 93／01285，WO 95／22615，DK特許出願第 768／93，265／94及び 264／94(Novo Nordisk A/S) ，DK特許出願第 990／94 (Novo Nordisk A/S)，Kleinら Journal of Ba cteriology，174，p.2599-2605，Motokiら US 5,156,956; Andouら US 5,252,46 9; Kaempfer ら Journal of General Microbiology，137，1831-1892; Ochiら I nternational Journal of Sytematic Bacteriology，44，285-292; Andouら US 5,252,469; Williams らJournal of General Microbiology，129，1743-1813，W O 94／01459(Novo Nordisk A/S)，EP 403.458(Kabigen AB)，WO 92／15691(Impe rial Chem Ind．PLC)，WO 92／22578(Bomanら)，JP-60130599，US特許第5,348,8 65(Jin Ro LTD.)，US特許第5,354,681(Novo Nordisk A/S)、 Methods of Enzymatic Analysis 第３版 1984，Verlag Chemie，Weinheim，vol. 1-10。 AF 95／5 GB（Novo Nordisk A/Sより注文により入手可能）

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考） //(Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:44） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:185） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:07） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者エールリッヒ，スタニスラス，ダスコフランス国，エフ―78352 ジュイ―アン ―ジョーザセデ，インスティテュナシオナルドゥラルシェルシュアグロノミック

Claims

【特許請求の範囲】１．多数の突然変異遺伝子要素と含んで成る細胞内でのライブラリーの in vi vo製造のための方法であって、ｉ）複製が開始される複製起点、 ii）任意的な遺伝子マーカーが、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子、 iii）注目のポリペプチドをコードする遺伝子、を含んで成る遺伝子要素全体又は一部を複製するためにエラー癖ポリメラーゼを各先祖細胞において使用する、前記方法。２．多数の突然変異遺伝子要素を含んで成る細胞内でのライブラリーの in vi vo製造のための方法であって、Ａ）細胞を用意する、ここでかかる細胞は染色体複製機構とは独立、（ｉ）（ａ）複製が開始される複製起点、（ｂ）任意的に遺伝子マーカーが、例えば抗生物質に対する耐性を授ける遺伝子、（ｃ）注目のポリペプチドをコードする遺伝子、を含んで成る遺伝子要素全体又は一部を複製するであろうエラー癖ポリメラーゼ；及び（ii）実質的に不能となるように可逆的に誘導されうる染色体複製機構；を有する；Ｂ）かかる細胞をその複製を誘導する条件下で増殖させ、多数の先祖細胞を得る；Ｃ）前記エラー癖ポリメラーゼによる前記遺伝子要素の複製を可能にするのに十分な時間前記先祖細胞内で前記染色体複製機構が実質的に不能となるように可逆的に誘導し、前記遺伝子要素内で突然変異を構築する；Ｄ）前記突然変異細胞内で前記染色体複製機構が実質的に機能性となるように可逆的に誘導する；そしてＥ）前記突然変異細胞をその複製を誘導する条件下で増殖させる；ことを含んで成る、前記方法。３．前記細胞が更に欠陥修復系を更に含んで成る、請求項１又は２記載の方法。４．前記遺伝子要素がプラスミド、ファージミド、ファージ、ウィルス、レトロウィルス又はレトロトランスポゾンである、請求項１〜３のいづれか１項記載の方法。５．前記細胞が微生物細胞である、請求項１〜４のいづれか１項記載の方法。６．前記エラー癖ポリメラーゼが DNA polＩ， DNA polII、逆転写酵素、そしてより詳しくはＥ．コリ DNA polＩ、バチルス・スブチリス DNA polＩ， HIV逆転写酵素、T4 DNAポリメラーゼ、T7 DNAポリメラーゼ、Phi29 DNAポリメラーゼを含んで成る群から選ばれる、請求項１〜５のいづれか１項記載の方法。７．実質的に不能となるように可逆的に誘導されうる前記染色体複製機構が温度感受性Ｅ．コリ DNAポリメラーゼIIである、請求項１〜６のいづれか１項記載の方法。８．注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列の決定のための方法であって、（ｉ）請求項１〜７のいづれか１項記載の方法により突然変異ライブラリーを製造する、ここで前記遺伝子要素は前記注目のポリペプチドをコードする遺伝子を含んで成る、（ii）前記ライブラリーを前記注目の遺伝子の発現を誘導する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、（iii）前記ポリペプチド変異体を所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そしてかかる所望の変異体を産生する宿主を同定及び単離する、（iv）前記宿主内の前記遺伝子要素を配列決定し、所望の変異体をコードする突然変異遺伝子の DNA配列を決定する、前記方法。９．注目のポリペプチドの所望の変異体をコードする DNA配列を作製するための方法であって、（ｉ）請求項１〜７のいづれか１項記載の方法により突然変異ライブラリーを製造する、ここで前記遺伝子要素は前記注目の遺伝子をコードする遺伝子を含んで成る、（ii）前記ライブラリーを前記注目の遺伝子の発現を誘導する条件下で培養し、ポリペプチド変異体を製造する、（iii）前記ポリペプチドを所望の特性についてスクリーニング又は選別し、そしてかかる所望の変異体を産生する宿主を同定及び単離する、（iv）前記変異体をコードする DNAを単離する、前記方法。 10．所望のポリペプチド変異体の製造のための方法であって、（ｉ）請求項９に従って得られる又は請求項８に従って決定される DNA配列を適当な宿主に、それがその宿主内で発現されうるように導入する、（ii）前記宿主を前記 DNA配列の発現を誘導する条件下で培養する、そして（iii）前記ポリペプチド変異体を回収する、前記方法。 11．前記注目のポリペプチドが酵素である、請求項１〜10のいづれか１項記載の方法。 12．前記酵素がカルボニルヒドロラーゼ、カルボヒドラーゼ、オキシドリダクターゼ、トランスフェラーゼ、フィターゼ、リガーゼ、リアーゼ及び抗微生物ポリペプチドである、請求項11記載の方法。 13．前記カルボニルヒドロラーゼがプロテアーゼ又はリパーゼである、請求項 12に記載の方法。 14．前記カルボヒドラーゼがアミラーゼ、グルコシダーゼ、セルラーゼ、グルカナーゼ、キシラナーゼ、デキストラナーゼ、キチナーゼ、ポリガラクツロナーゼ、リゾチーム、グルコシダーゼ、ガラクトシダーゼ、キシロシダーゼ、アラビノシダーゼ、ラクターゼ、キチトナナーゼ、キシロースイソメラーゼ、ペクチンエステラーゼ、ラムノガラクツロナーゼ、エンドグルカナーゼである、請求項12 記載の方法。 15．前記オキシドリダクターゼがデヒドロゲナーゼ、オキシダーゼ、リダクターゼ、ラッカーゼ、カタラーゼ、ペルオキシダーゼ、リポキシゲナーゼ、スーパーオキシドジスムターゼである、請求項12に記載の方法。 16．前記トランスフェラーゼが１炭素基を転移するトランスフェラーゼ、アルデヒド又は残基を転移するトランスフェラーゼ、アシルトランスフェラーゼ、グルコシルトランスフェラーゼ、メチル基以外のアルキル又はアリール基を転移するトランスフェラーゼ、窒素性基を転移するトランスフェラーゼである、請求項 12記載の方法。 17．前記細胞が原核細胞、特に細菌、好ましくはバチルス、エッシェリヒア、スタフィロコッカス及びストレプトコッカス属の細胞である、請求項１〜16のいずれか１項記載の方法。 18．前記エッシェリヒアがＥ．コリより選ばれる株である、請求項17記載の方法。 19．前記バチルスがＢ．レンタス、Ｂ．リシェニホルミス、Ｂ．アミロリケファシエンス、Ｂ．スブチリスを含んで成る群から選ばれる株である、請求項17記載の方法。 20．前記細胞が真菌、特に酵母又は糸状菌、好ましくはアスペルギルス、トリコデルマ属のものである、請求項１〜16のいづれか１項記載の方法。 21．前記アスペルギルスがＡ．オリザ、Ａ．ニガー、Ａ．アワモリを含んで成る群から選ばれる、請求項20記載の方法。 22．前記トリコデルマがＴ．リセイを含んで成る群から選ばれる、請求項20記載の方法。 23．前記細胞が BHK細胞又は昆虫細胞を含んで成る群から選ばれる哺乳動物細胞である、請求項１〜16のいづれか１項記載の方法。