JP4312832B2

JP4312832B2 - インビボ組換え

Info

Publication number: JP4312832B2
Application number: JP52825198A
Authority: JP
Inventors: エスケルンビヨルンバッズ，マッズ; ドルベルウラスムッセン，ミカエル; リノヨルゲンセン，ペル; ベデルボルケルト，トルベン; ドゥスコエールリッヒ，スタニアラス
Original assignee: ノボザイムスアクティーゼルスカブ
Priority date: 1996-12-20
Filing date: 1997-12-15
Publication date: 2009-08-12
Anticipated expiration: 2017-12-15
Also published as: ATE284958T1; JP2002515755A; DE69731970T2; AU7873698A; DE69731970D1

Description

本発明の分野
本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法に関する。本法は、有利な特性を有するポリペプチドをコードするDNA配列をもたらす強制人工進化である。
本発明の背景
同一のプラスミド上に置かれたDNA配列間の相同的組換えは、当業者に周知である（Weber and Weissmann, Nucl. Acid. Res.（1983）11, 5661-5669）。EP 252666 B1（Novo Nordisk A/S）, WO 95/22625 A1（Affymax Technologies N.V.）、及びWO 9101087は、同一のプラスミド上に置かれた遺伝子のインビボ組換えを開示している。
EP 449923 B1（Setratech）は、部分的に相同なDNA配列のインビボにおける遺伝子間の組換えの方法を開示している。この組換えは、酵素ミスマッチ修復系に欠陥があるところの細胞内で生じる。
J. Biotechnol.（1991）19, 221-240は、B. Amylolique facdensのゲノム内の遺伝子を失活させるための方法を開示している。この方法は、pE194突然変異体の組み込み及び切除を含む。
Chemical Abstracts 118 : 161925（1993）中には、組換えのために必要なホモロジーの最小配列長が測定されている。この測定方法は、グルコース遺伝子を担持するpE194誘導体の組み込みを含む。
J. Bacteriol.（1982）152,524-526中には、スタフィロコッカス・アウレウス（Staphylococcus aureus）からの２つのプラスミド、pE194とpUB110を含む、プラスミドpBD9が開示されている。pE194又はpUB110に基づく他のプラスミドも、Molecular and General Genetics（1988）, 213, 465-70, Molecular and General Genetics（1984）, 195, 374-7, Plasmid（1981）, 6, 67-77、及びGenetika,（1986）22, 2750-7中に開示されている。
Yichuan Xuebao（1993）, 20, 272-8（Chemical Abstracts 120 : 1670（1994）参照）中に、Chen et. alは、バチルス・リケニフォルミス（Bacillus licheniformis）からの熱安定性α−アミラーゼ遺伝子がその中に挿入されているところのプラスミドpNW102, pE194誘導体を開示している。pNW102は、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）株BF 7658内に形質転換され、その後、非−許容的温度でインキュベートされて、pNW102とBF 7658のα−アミラーゼ遺伝子間での相同的組換えに供される。上記組換え体から作られたα−アミラーゼは、バチルス・リケニフォルミスからのα−アミラーゼと同じ特性を示す。
しかしながら、関連分野においては、改良された特性、例えば増加された安定性、改善された特異性又はより高い活性を有するポリペプチドをコードする遺伝子を得るために、DNA配列が、組み込み及び削除（cross-out）を繰り返すことによりインビボにおいて組み換えられることができることは全く示されていない。
従って、本発明の問題は、新規DNA配列の改良されたインビボ方法を提供することである。
本発明の簡単な説明
本発明は、新規DNA配列を作製するインビボ方法に向けられている。改善された特性をもつ新規DNA配列は、それぞれ相同DNA配列及び複製起源を含む、少なくとも２つのベクターの間のDNAのインビボ交換に関する方法により少なくとも２つの相同DNA配列から、迅速かつ効率的な方法で、作製されることができる。
本発明の方法は、上記相同配列の交換が、１のベクターから他のベクターへの上記組み込み及び切除を、少なくとも１回インビボにおいて繰り返すことにより、行われるということを特徴とする。
従って、第１の側面においては、本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程：
（ａ）DNA構造物の中の１から他のDNA構造物の中の１への組み込みを好む条件下で、それぞれDNA配列と複製起源を含む、少なくとも２つのDNA構造物を含む細胞をインキュベートして、それによりハイブリッドDNA構造物を作り；
（ｂ）上記DNA構造物からの削除を好む条件下で上記細胞をインキュベートして、それにより、それぞれ組換えDNA配列及び複製起点を含む新規DNA構造物を作り；
（ｃ）少なくとも１回、工程ａ）〜ｂ）を繰り返す、
を含む、前記方法に関する。
本発明のインビボ組換え方法の利点の中の１は、上記DNA配列間のインビボにおける交換を繰り返すことにより、上記DNA配列間で多数の異なる組換えパターンを得ることができるということである。
これは、本明細書中図１中に示され、図１は、実施例１に記載されるように行われた、２つのDNA配列、サビナーゼ（Savinase）とサビシン（Savisyn）の間のインビボ組換えの結果を示す。
図１中、サビナーゼ／サビシン組換えクローン、例えば、クローン番号３，８，12は、上記２つの配列の間の２以上のインビボ組換え事件から得られる。
【図面の簡単な説明】
図１は、その複製起点が50℃で働くために耐熱性である、プラスミドpTR、及びその複製起点が45℃を超える温度で働かないために温度感受性である、プラスミドpTS上に置かれた２つのDNA配列の組換えを示す。非許容的条件下（すなわち、50℃において）、pTSはpTR内に組み込まれ、ハイブリッド、プラスミドが作られた。
図２は、それぞれ１のプラスミド上に置かれた２つの新規DNA配列を形成する、ハイブリッド・プラスミドからの削除（cross out）を示す。繰り返されたクロッシング・イン及びアウト（crossing in and out）は、例えば、温度サイクリングにより又は単に、温度圧を保ち、そしてpTSの耐性（すなわち、Erm^R）について選択することにより、行われることができる。
図３は、繰り返し組み込み及びクロッシング・アウトの後に得られるプラスミドを示す。
さらに、図１と２は、ハイブリッド構造の形成のインビボ計測のために好適であり、そしてそのDNA構造の強制削除を行うために好適であるDNA構造系を示す。
図１：DNA構造pTS：
活性タンパク質の発現を指令する好適な活性プロモーター
Erm^R：抗生物質耐性遺伝子
DNA構造pTSは：
GFPの転写を指令するための活性プロモーターを全く含まない。
GFP：緑色蛍光タンパク質
pTS内のErm^R抗生物質耐性遺伝子は、上記活性プロモーターのために活性である。
pTR内のGFP遺伝子は不活性である（すなわち、その遺伝子は転写されない）。なぜなら、その遺伝子の発現を駆動するための活性プロモーターが存在しないからである。
図２：本発明に従って上記ハイブリッド構造を形成した後、GFPは、（上記プロモーターに駆動されて）活性となる。このことが、上記ハイブリッド構造の形成をインビボにおいて計測することを可能にする（さらなる細目については以下を参照のこと）。
反対に、Erm^R抗生物質耐性遺伝子は不活性になる（すなわち、その遺伝子は転写されない）。なぜなら、その遺伝子の発現を駆動する活性プロモーターが存在しないからである。DNAハイブリッド構造の強制削除は、Erm^R抗生物質圧力下で細胞をインキュベートし、それにより上記DNAハイブリッド構造のクロス・アウト強制することにより行われる。なぜなら、上記細胞は、そのDNA構造のクロッシング・アウトが生じた後にのみ、Erm^R抗生物質耐性遺伝子を発現することができるからである。
図４及び５は：２つのDNA配列サビナーゼとサビシンをインビボにおいて組換えるために実施例１に記載したように使用された２つのベクターpSX120（図４）とpMB430（図５）を示す。
pSX120は、ｉ）サビナーゼをコードするオープン・リーディング・フレーム、ii）サビナーゼの転写を指令する活性プロモーター、及びiii）クロラムフェニコールに対する耐性を付与する遺伝子（Cam^R）を含む。
pMB430は、ｉ）サビジンDNA断片、ii）（その後の領域を通しての転写をもたらさない）ターミネーター、iii）エリスロマイシンに対する耐性を付与する遺伝子（Erm^R）、及びiv）緑色蛍光タンパク質（GFP）をコードするオープン・リーディング・フレーム、を含む。
図６は：実施例１において記載されたように行われたサビナーゼ／サビジンのインビボ組換えの結果を示す。この略図は、シャッフルされ／組換えられた12のクローンを示す。
サビジンにユニークな制限部位の位置を水平に与える。
文字“Ｓ”は、その位置における配列がサビナーゼの配列と同一であることを表し、そして文字“Ｚ”は、その配列がサビジン起源であることを表す。配列決定されたクローンの全てが、それらの組換えパターンにおいて相違している。
定義
本明細書中に使用するとき、以下の用語は、以下の意味をもつ：
用語“DNA配列”は、本発明に従って修飾することが望まれるいずれかのDNA配列、例えば、ポリペプチド、例えば、酵素、医薬として活性なポリペプチド、例えば、インスリン成長ホルモン・ヒトホルモン又は成長調節物質、及びプロモーター、転写又は翻訳レギュレーターその他細胞内ポリヌクレオチド及びポリペプチドの如き配列の如き配列をコードするDNA配列を含む。
用語“相同（homologous）”は、DNA配列が、インビボにおける組換えを許容する、同一ヌクレオチドのいくつかのストレッチを有することを、意味する。そのDNA配列内の上記ストレッチは、少なくとも15の塩基対長、より好ましくは少なくとも25の塩基対長、さらにより好ましくは少なくとも50の塩基対長、そして最も好ましくは少なくとも150以上の塩基対長である。
用語“相同”は、ただ１つのヌクレオチドにおいて相違するDNA配列に60％以上同一であるDNA配列のストレッチを含む。DNA配列のストレッチは、70％以上同一、より好ましくは少なくとも80％、特に90％以上同一であることが好ましく、そしてDNA配列のストレッチは、95％同一、最も好ましくは少なくとも97％同一であることがより好ましい。
着目のDNA配列のストレッチ内で、先に言及したDNA配列のホモロジーが、第２の配列からの第１の配列の派生を示す２つの配列間の同一性の程度として測定される。このホモロジーは、好適には、本分野において知られたコンピューター・プログラム、例えば、GCGプログラム・パッケージ中に提供されたGAP（Program Manual for the Wisconsin Package, Version 8, August 1994, Genetics Computer Group, 575 Science Drive, Madison, Wisconsin, USA 53711）（Needleman, S.B. and Wunsch, C.D.,（1970）, Journal of Molecular Bioligy, 48, 443-453）により、測定されることができる。DNA配列の比較のための以下の設定：5.0のGAP創出ペナルティー、及び0.3のGAP伸長ペナルティー、を用いたGAPを使用して、着目の相同DNA配列は、好ましくは、上記のような同一性の程度（a degree of identity）を示す。
用語“組換えられたDNA配列”は、少なくとも２つのDNA配列の間の組換え事件の結果であるDNA配列を意味する。この組換え事件は、単一の組換え事件であることができ、又は少なくとも２つのDNA配列の間の第１の組換え事件、その後の、第１の組換え事件とは異なる部位におけるクロス・アウトであることができる。
用語“DNA構造物（DNA structure）”は、DNA分子、例えば、ベクター、プラスミド、染色体（例えば、バチルス・サブチリスの染色体）、ウィルス、ファージ、トランスポゾン、又はゲノムを意味する。
用語“ベクター”は、組換えられるべきDNA配列と複製起点を含むことができるいずれかの直鎖状又は環状のDNA分子を意味する。この用語は、当業者に知られたいずれかのベクター、例えば、プラスミド又はファージを含む。このDNA配列は、必ずしもそうではないが、場合により、プロモーターの制御下にある。
用語“細胞”は、本発明のインビボ組換え方法に関して本明細書中に使用するとき、“細胞”と、“細胞集団”の両方を包含することを意図される。
用語“転移（transferring）”とは、上記DNA構造物が細胞内に導入されることを意味する。DNA構造物は、DNAの直接導入のために本分野において知られた技術を使用して、例えば、エレクトロポレーション、コンピテント細胞の形質転換、プロトプラスト形質転換、トランスフェクション、形質導入、接合又は弾道（ballistic）形質転換により導入されることができる。
用語“インキュベーティング”（又は培養、増殖成長））とは、細胞が、その正常細胞機能、特に組換えのために必要な機能が活性であるような方法で、処理されることを意味する。細胞は、固体支持体（寒天ペトリ皿）上でインキュベートされることができ、又は細胞は、浸漬条件下でインキュベートされることができる。上記細胞は、試験管、例えば、エッペンドルフ試験管内でインキュベートされることが好ましい。温度感受性の複製起点の場合には、上記試験管は、便利には、オートマチック・サーモサイクラー内に置かれる。さらに、細胞は、標準的な振とうフラスコ内でインキュベートされることができる。
用語“複製起点”（ori）は、DNA構造物の複製が開始される領域を意味する。複製起点に関して、用語“機能的（functional）”とは、複製が上記起点から開始されることができるということを意味する。用語“非機能的（non-functional）”とは、複製が所定の条件下で開始されないこと、又は複製の開始が、例えば、適当な選択圧の下、マーカー遺伝子及びoriをもつDNA構造物を含む細胞の生存のために十分でないレベルにまで、減少されることを意味する。
用語“温度感受性”は、複製起点又はベクターに関して、ベクターが、例えば上昇した温度で、すなわち、その親細胞の成長を未だ許容する、非許容的（non-permissive）条件において、複製することができないということを意味する。
用語“温度耐性”は、複製起点又はベクターに関して、ベクターが上昇した温度において複製することができるということを意味する。
用語“DNAライブラリー”は、多数の異なるDNA配列を含むライブラリーである。DNAライブラリーは、本分野において知られた標準的な手順に従って、例えば、インビトロDNAシャッフリング／DNA組換え（WO 95/17413, WO 95/22625）及び／又は誤りがちなPCR及びカセット突然変異誘発により、作られることができる。
本明細書中、DNAライブラリーは、２〜20程の低い異なる配列を含むことができ、例えば、ただ１つのアミノ酸が変更されているライブラリーであることができる。
さらに、DNAライブラリーは、多数の異なるDNA配列、例えば、10¹⁰までの異なる配列を含むことができる。
本発明の詳細な説明
本発明は、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程：
（ａ）ｉ）少なくとも１の複製起点が非機能的であり、そしてii）上記非機能的起点をもつDNA構造物をそれが含む場合にのみその細胞の成長を許容する選択圧下に、その細胞がある条件下で、それぞれがDNA配列と複製起点を含む、少なくとも２つのDNA構造物を含む細胞をインキュベートし（すなわち、DNA構造物の中の１から他のDNA構造物の中の１内への組み込みを支持し、それによりハイブリッドDNA構造物を作り）；
（ｂ）上記条件から、工程ａ）におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え（すなわち、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウトを支持し）；
（ｃ）少なくとも１回、工程ａ）〜ｂ）を繰り返す、
を含む、前記方法を含む。
組換えられたDNA配列は、新たな特性を有する新規のポリペプチドをコードするであろう。そのとき、組換えられたDNA配列の１以上によりコードされた所望の特性について選択し、そして／又はスクリーンするために、本発明の方法に、選択又はスクリーニング系を取り込むことができる。
上記工程（ｃ）における繰り返しの数は、１の繰り返しであることができ、又はそれは、それ以上、例えば、５〜10の繰り返し、又は50〜100又はさらに多数の繰り返しであることができる。
DNA構造物の複製起点が非機能的であるような条件下で細胞をインキュベートすることにより、組み込みが強制され（又はDNA構造物の生存のために好ましくされる）こと、そして再びDNA構造物の複製起点が機能的であるような条件下で細胞をインキュベートすることにより、クロス・アウトを強制することが、好ましい。
工程（ａ）〜（ｃ）に先に示したルーチンの他の好ましい態様においては、自然にクロス・イン及びクロス・アウトが生じるところの定常条件（例えば、一定温度及び選択圧）下で、上記細胞を維持することが好ましい。すなわち、細胞におけるシャッフリング手順が、上記条件を繰り返して変化させずに、繰り返される。
多数のDNA構造物、例えば、多くのバチルスDNA構造物（ベクター）（バチルス・サブチリス（Bacillus subtitis）その他のグラム陽性バクテリア、Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington, D.C.）においては、複製起点は、ori（＋）及びori（−）を含む。ori（＋）は、第１DNAストランドの複製がどこで開始するかを制御し、そしてori（−）は、第２ストランド上の、複製のための開始点を制御する（Bacillus subtilis及び他のグラム陽性バクテリア、Sonensheim et al., 1993, American Society for Microbiology, Washington D.C.）。
本発明の方法の１の態様においては、少なくとも１のDNA構築物は、ori（−）を含まない（すなわち、ori（＋）だけを含む）。好ましくは、ori（−）を含まないDNA構築物は、その起点（すなわち、ここではori（＋））が、本発明に従って行われるハイブリッド構造物の形成の間に機能的であるところのDNA構造物である。
本発明の上記態様の１の利点は、そのDNA構造物内でori（＋）だけが機能的であるとき、そのDNA構造物が、ori（＋）とori（−）の両方を含むDNA構造物に比較して、比較的長い期間、１本鎖の状態にあるということである。この延長された１本鎖状態は、本発明の方法に従うハイブリッドDNA構造物の形成を容易にする。
好ましくは、上記のようなori（−）を含まないDNA構造物は、バチルスの構造物、より好ましくはバチルスのベクターである。
上記コンセプトを説明するために、ori（−）を含まない修飾されたpTR（TR：耐熱性）バチルス・ベクターの１例がある（図１参照）。上記ハイブリッド形成が50℃で行われる場合、pTRの起点だけが機能的である（pTS（TS：温度感受性）の起点は機能的でない）（図１，２参照）。上記DNA構造物pTRはori（＋）だけを含み、そしてそれ故、比較的長い期間、１本鎖状態にあり、これは、組換え事件、そしてその後のpTS DNA構造物とのハイブリッド形成を容易にする（図１，２参照）。
１のDNA構造物が、特定の（許容的な）条件下で複製することができ、そして他の（非許容的な）条件下で複製することができないベクターであることが、より好ましい。ベクターは、例えば、複製に関して温度感受性であるものであることができる。従って、ベクターは、その親細胞の成長をさらに許容する、上昇された温度において複製することができないものであることができる。細胞は、ベクターの複製を許容する温度において、最初にインキュベートされ、そしてその後、他のDNA構造物内への組み込みが生じることができた後に、インキュベートされ、そのベクターが、組み込まれない場合にその細胞から失われるように、ベクターの複製を許容しない温度で、インキュベートされる。
ベクターは、さらに選択マーカーを含むことができる。この場合、非許容的温度におけるインキュベーションは、（そのDNA配列と選択マーカーを含む）組み込まれたベクターを含む細胞だけが生き残るであろうことを保証するための、選択的条件下で、行われることができる。
さらに、上記ハイブリッド構造物の形成をインビボにおいて計測することができるような系を構築することが好ましい。
好ましくは、これは、インビボにおいてスクリーンすることができ又は選択することができるタンパク質が、上記ハイブリッド構造物が形成された後にのみ発現されるような系を構築することにより行われる。
好ましくは、上記スクリーン可能なタンパク質は、好適な露光下で蛍光性であるタンパク質であり、そして特に、上記蛍光タンパク質は、緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体である。
緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体、並びにGFPがどのように活性化されて蛍光を発するかについては、本分野において記載されており、そしてさらなる細目については（Crameri et al. Nature Biotechnology 14 : 315-319（1996）;及びCormack et al. GENE 173 : 33-38（1996））を参照することができる。
好適な露光下で蛍光性である上記のようなスクリーン可能なタンパク質、そして特にGFP又はその変異体の使用の利点の中の１は、上記ハイブリッド構造物を含む細胞を選択的に拾い出すための、例えば蛍光−活性化セル・ソーティング（FACS）により、それが可能になるということである。これは、本発明の第１の側面に従って、工程ａ）を行った後に上記ハイブリッド構造物を含まない、細胞のバックグラウンドを取り除くことができる。
FACSは広く知られたスクリーニング技術であり、そしてさらなる細目のためには（Cormack et al.“FACS-optimized mutants of the green fluorescent protein（GFP）”GENE 173 : 33-38（1996））を参照することができる。
上記ハイブリッド構造物の形成のインビボにおける計測を可能にする好適な系を説明するために、好適な系の１例を図１と２に示す。
先に討議したようなスクリーン可能なタンパク質の使用に代えて、上記ハイブリッド構造物が形成されるときにのみ、その選択マーカーが転写において活性であるような、選択マーカーを使用することが有利であることができる。
さらに、本発明の第１の側面の工程ｂ）における、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウトが、強制クロッシング・アウト事件であることが好ましい。
上記ハイブリッド構造物からの強制クロッシング・アウトは：
ｉ）上記DNAハイブリッド構造物が選択マーカーを発現せず、そして第１側面の工程ａ）における少なくとも２つのDNA構造物の中の少なくとも１が上記選択マーカーを発現することができるような系を構築し；
ii）上記細胞は、上記DNAハイブリッド構造物のクロッシング・アウトが生じた後にのみ上記マーカー遺伝子を発現することができるので、選択可能な条件下で上記細胞をインキュベートし、それにより上記ハイブリッド構造物のクロス・アウトを強制する、
ことにより行われることができる。
好ましくは、上述の選択マーカー遺伝子は、その複製起点が、上記のように行われたDNAハイブリッド構造物内へのDNA構造物の強制組み込みの間に非機能的であるようなDNA構造物上で発現され、そして好ましくは、その選択マーカー遺伝子は、抗生物質耐性遺伝子である。好適な選択マーカー遺伝子のさらなる説明については以下を参照のこと。
上記ハイブリッドDNA構造物からの強制クロッシング・アウトのコンセプトを説明するために、好適な系の１例を図１と２に示す。
選択マーカーは、本分野において知られたいずれかのマーカー、例えば、細胞に抗生物質耐性を付与、栄養要求性の株に原栄養性を付与し、又は宿主の欠陥を補足する産物をコードする遺伝子であることができる（例えば、dal−株内に導入されたdal遺伝子；B. Diderichsen（1986）, Bacillus : Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.T. Gene san and J.A. Hoch, Eds., Academic Press, pp. 35-46を参照のこと）。選択マーカーは、例えば、知られた源から切除され、又はベクター上に存在し、例えば、本発明の方法において使用されるべきDNA構造物の構築のために使用されるプラスミドであることができる。
この選択は、マーカー遺伝子によりコードされた選択マーカーについての選択圧下で、細胞を培養することにより達成されることができる。
（ベクターがその中に組み込まれるところの）DNA構造物は、例えば、本発明の方法において使用されるべきベクターにより場合により担持されるマーカーに関して先に記載したようないずれかのタイプの、いずれかの選択マーカーをコードする遺伝子を含むことができる。従って、上記マーカー遺伝子は、抗生物質耐性、例えば、カナマイシン、テトラサイクリン、アンピシリン、エリスロマイシン、クロラムフェニコールに対する耐性、又はさまざまな重金属、例えば、セレン酸塩、アンチモン又はヒ素酸塩に対する耐性をコードすることができる。
好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、酵素ミスマッチ修復系において欠陥があり又は一時的に失活され、又はミスマッチ修復の減少されたレベルをもつ。DNAの合成においては、エラーが生じることができ、そして得られた非相補性塩基対は、ミスマッチと言われる。DNAにおけるエラー（ミスマッチ）の校正のためのプロセスが存在する。大腸菌（E.coli）においては、これらのエラーは、第３の酵素（MutU）が２つのDNAストランドをほどき、そして第４の酵素（MutH）が、その後にメチル化されたDNAの配列（GATC）自体の上に新しく合成されたストランドを切断することを可能にする、２つの酵素（MutSとMutL）により、ひじょうに速く、かつ、正確に検出される。より徹底的な説明のためには、EP 449923（Setratech）（この内容を引用により本明細書中に取り込む）を参照のこと。
他の好ましい態様においては、上記プロセスにおいて使用される細胞は、AddABの如き主要な組換え酵素において傷つけられ又は妨害される。AddAB遺伝子を傷つけられた株は、より高い頻度の相同的組換えを示す。正統的（legitimate）な及び非正統的な組換え頻度の両方が高められる。しかしながら特に、非正統的組換えのための組換え頻度は、AddAB ATP−依存性ヌクレアーゼにおいて傷つけられ又は妨害された株と働くとき、支持される（Meima, R ; Haijema, BJ ; Dijkstra, H ; Haan, GJ ; Venema, G ; Bron, S（1997）Role of enzymes of homologous recombination in illegitimate plasmid recombination in Bacillus-subtilis. JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 179, No. 4 pp. 1219-1229）。
他の好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、重要な組換え酵素の中の１、recAを過剰発現している。このrecA酵素は、組換え事件のために必要なヘテロ２本鎖分子を形成するためのssDNAの再生を促進することにより相同的組換えに関係し、そしてDNAストランドの交換を開始させる。（PROGRESS IN NUCLEIC ACID RESEARCH AND MOLECULAR BIOLOGY Vol. 56, pp. 129-223（1997））。recAの過剰発現は、宿主株の古典的な突然変異誘発又は高く発現されたrecA遺伝子のクローニングのいずれかにより達成されることができる。
他の好ましい態様においては、上記方法において使用される細胞は、シャッフルされるべき２つの相同遺伝子の間の組換え頻度を増加させるためにUV、Ｘ−線又はDNA損傷性の剤に供される。UV、Ｘ−線又はDNA損傷性の剤のようなストレスは、SOS応答を介して組換え酵素を誘導し、そしてrecAのような組換えプロセスに関係する酵素を活性化させることが知られている。（BACILLUS SUBTILIS AND OTHER GRAM-POSITIVE BACTERIA, pp. 529-537（1993））。
他の好ましい態様においては、シャッフルされるべき遺伝子の中の１の担体として使用されるpTRベースのプラスミドは、pTRの低−コピー・バージョン又はpWV01,（MOLECULAR AND GENERAL GENETICS Vol. 249, No. 1 pp. 43-50（1995））, pTA1060,（JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 142, No. 1 pp. 315-8（1980））又はpAMb1,（JOURNAL OF BACTERIOLOGY Vol. 157, No. 2 pp. 445-53（1984））のような他のB. subtilis適合性の低−コピー・プラスミドのいずれかにより置き替えられる。さらに好ましい態様においては、シャッフルされるべき遺伝子の中の１を含むDNA構造物の中の１は、細胞の染色上に置かれ、そして他のDNA構造物であって、組換えられるべき着目の他の遺伝子を含むものは、プラスミドである。本発明のインビボ組換え方法を行うとき、そのプラスミドは、染色体上のDNA構築物により組換えられるであろう。
上記プラスミドは、例えば、温度感受性プラスミドであることができる。
低−コピーpTR、又はDNA構造物の中の１が上記のように染色体上に置かれているところの系を使用することの利点は、２つの相同遺伝子の組換え後のハイブリッドDNA構造物が細胞内の遺伝子の優勢な形態であろうということである。非組換えpTRプラスミドの高−コピー・バックグラウンドは、第２ラウンドの組換え後に、第１ラウンドにおいて形成された遺伝子ハイブリッドを野生型に不可避的に復帰させ、そしてそれ故、２つの遺伝子のシャッフリングを阻止するであろう。上記遺伝子の中の１の担体としてその染色体を使用するとき、野生型のバックグラウンドは、pTSが相同遺伝子を介して組み込まれているときに、共存することはできない。
上記方法において使用される細胞は、組換えられたDNA配列の産物の大規模生産のために好適な細胞であることが好ましい。細胞は、バクテリア細胞、より好ましくはバチルス細胞、最も好ましくは、バチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）細胞であることが好ましい。
組換えられるべきDNA配列は、それ自体知られたやり方で上記配列を含む生物から単離／クローン化されることができる。例えば、好適なオリゴヌクレオチド・プローブは、第１の配列に相同な第２の配列を得るために着目の第１のDNA配列に基づき調製されることができる。あるいは、DNA配列は、保存された領域の知識に従って設計されたプライマーに基づいてPCRにより増幅されることができる。
本内容の異なる態様において、用語“１セットの相同DNA配列（“セットＡ”、“セットＢ”、“セットＣ”、等）”、が、例えば、その相同DNA配列が２以上の異なるセットの相同DNA配列（“セットＡ”、“セットＢ”、“セットＣ”、等）から作られ、そして上記相同配列（“セットＡ”、“セットＢ”、“セットＣ”、等）のセットのそれぞれが、本発明に従って異なるDNA構造物（“DNA構造物Ａ”、“DNA構造物Ｂ”、“DNA構造物Ｃ”、等）内に挿入されるような、本発明に係る方法に関する本発明の１の態様に関して、使用される。
この用語は、本発明のインビボ組換え方法が相同DNA配列の多くの“セット”を組換えるために使用されることができるということを説明するために使用される。相同DNA配列の個々の“セット”のそれぞれは、１だけから多くの（例えば、DNAライブラリーを含む“セット”の）個々の相同DNA配列を、個々に含むことができる。
次に相同DNA配列の上記セット（“セットＡ”、“セットＢ”、“セットＣ”、等）のそれぞれが、本発明に従って異なるDNA構造物（“DNA構造物Ａ”、“DNA構造物Ｂ”、“DNA構造物Ｃ”、等）内に挿入されることができる。上記の異なるDNA構造物のそれぞれは、好ましくは、本発明に従って、重要なパラメーター、例えば、異なる複製起点、異なる選択マーカー、等において相違する。
次に、上記DNA構造物（“DNA構造物Ａ”、“DNA構造物Ｂ”、“DNA構造物Ｃ”、等）の全てが、本発明に従って、細胞内に導入されることができ、そして本発明のインビボ組換えのための方法を行うとき、個々のDNA構造物（“DNA構造物Ａ”、“DNA構造物Ｂ”、“DNA構造物Ｃ”、等）のそれぞれが、次に、本発明に従って、ランダムに組換えられることができる。本発明の方法を２〜３回繰り返した後、これは、本方法において使用された相同DNA配列の全ての“セット”の間でランダムに組換えられた、異なって組換えられたDNA配列の多くの異なる組合せを含む、細胞集団内に、DNA集団を与えるであろう。
さらに、用語“１セットの相同DNA配列（“セットＡ”、“セットＢ”、“セットＣ”、等）は、本明細書中、１，２〜３の、そして／又は多くの（例えば、大きなDNAライブラリー）個々の相同DNA配列を含む相同DNA配列の両セットを組換えるための、その系のフレキシビリティーである、本発明のインビボ組換え方法の利点の中の１を説明するために使用される。
従って、本発明の１の態様は、相同DNA配列の上記セットのそれぞれが、１のDNA配列だけを含むところの本発明に係る方法に関する（すなわち、２以上の相同配列の組換え）。
さらに、本発明の態様においては、組換えられるべき相同DNA配列は、事前に作られたDNAライブラリーから、そして／又は個々の異なる事前に作られたライブラリーから得られる。
上記DNAライブラリーから得られた相同DNAは、本発明に従ってベクター内に挿入される（すなわち、そのDNAライブラリーを代表するDNAがベクター内にライゲート（挿入）される）。
本明細書中に記載するように、本発明の方法は、上記ベクターの強制インビボ組換えを許容する方法において相違する、少なくとも２つのDNA構造物（例えば、ベクター）を含む。
DNAライブラリーを代表する相同DNAは、上記異なるベクターの中の１のみ、そして／又は両者内に挿入されることができる。
すなわち、例えば、１のDNAライブラリーを代表する相同DNAが上記異なるベクターの中の１内に挿入（ライゲート）され、そして他のDNAライブラリーを代表する相同DNAがその他のベクター内に挿入される場合、これは、本発明に係るインビボ組換え方法により２つの異なるライブラリーの間の迅速な、かつ、効率的な組換えを許容するであろう。このコンセプトを説明するために、１のライブラリーを代表するDNAが、pTRベクター内に挿入されることができ（図１参照）、そして他のライブラリーを代表するDNAが、pTSベクター内に挿入されることができる（図１参照）。その後、本発明に係る方法により行われたインビボ組換え事件を２〜３回繰り返すことは、上述の２つのライブラリーの組合せである新規ライブラリーを代表する細胞集団を与えるであろう。
従って、相同DNA配列のセットの中の少なくとも１が事前に作られたDNAライブラリーから得られ、そして相同DNA配列の上記セットの中の少なくとも１が、上記DNAライブラリーに相同であるDNA配列である、本発明に係る方法（すなわち、上記DNAライブラリーに相同であるDNA配列への上記DNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす）に；又は
相同DNA配列の上記セットが同一の事前に作られたDNAライブラリーから得られる、本発明に係る方法（すなわち、上記DNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす）に；又は
相同DNA配列の上記セットが、少なくとも２つの異なる事前に作られたDNAライブラリーから得られる、本発明に係る方法（すなわち、少なくとも２つの異なるDNAライブラリーのインビボ組換えのための方法をもたらす）に、関する。
上記DNA配列間のさらなる組換えを得るために、本発明に従って行われた上記DNA配列のインビボ組換えの第１ラウンド後にDNA構造物の単離を行うことが好ましい。上記の単離された構造物は、次に、細胞内に再形質転換され、そしてインビボ組換えのさらなるプロセス・ラウンドが、その後に行われる。
上記工程の利点を以下の実施例により説明する：
セットＡは、DNA配列ａ，ｂが個々に上記ベクターＡ内に導入されているベクターＡである（すなわち、ベクターＡの集団は、DNA配列ａを有するベクターを、そして配列ｂを有するベクターを含む）；そして
セットＢは、DNA配列ｃ，ｄが個々に上記ベクターＢ内に導入されているベクターＢである（すなわち、ベクターＢの集団は、DNA配列ｃを有するベクターを、そして配列ｄを有するベクターを含む）。
次にベクターＡとＢは、細胞集団内に形質転換され、そして本発明に従ってインビボにおいて組換えられる。これは、DNA配列ac, ad, bc, bdの間の組換えを与えるであろう。上記の組換えられた配列を含むベクターＡとＢが単離され、そして上記細胞集団内に再形質転換される。本発明に係るインビボ組換えは、次に、上記４つの（ａ，ｂ，ｃ，ｄ）DNA配列の可能な全ての組換え、例えば、abc, abdc、等の組換えを与えるであろう。
さらなる態様においては、本発明は、相同DNA配列の２つのセット（“セットＡ”と“セットＢ”）がインビボにおいて組換えられる、本発明に係る方法であって、以下の工程：
ａ）耐熱性の複製起点と第１マーカーのための遺伝子を含む１のベクター内に“セットＡ”からの配列を挿入し；
ｂ）温度感受性の複製起点と第２マーカーのための遺伝子を含む１のベクター内に“セットＢ”からの配列を挿入し；
ｃ）上記２つのベクターを細胞内に導入し；
ｄ）場合により、両マーカー遺伝子を有する細胞を好む選択圧下で、両複製起点が機能的であるところの温度で上記細胞をインキュベートし；
ｅ）上記温度を、上記耐熱性複製起点だけが機能的である温度に、シフトさせ；
ｆ）少なくとも１回、工程ｄ）〜ｅ）を繰り返す；
を含む前記方法に、又は
相同DNA配列の２つのセット（“セットＡ”とセットＢ”）がインビボにおいて組換えられる、本発明に係る方法であって、以下の工程；
ａ）耐熱性複製起点と第１マーカーのための遺伝子を含む１のベクター内に“セットＡ”からの配列を挿入し；
ｂ）温度感受性複製起点と第２マーカーのための遺伝子を含む１のベクター内に“セットＢ”からの配列を挿入し；
ｃ）上記２つのベクターを細胞内に導入し；
ｄ）場合により両マーカー遺伝子を有する細胞を好む選択圧下で、耐熱性複製起点だけが機能的である温度で上記細胞をインキュベートし；
ｅ）場合により、上記温度を、両複製起点が機能的である温度に、シフトさせ；
ｆ）少なくとも１回、ｄ）〜ｅ）を繰り返す、
を含む前記方法に関する。
さらなる側面においては、本発明は、所望の生物学的活性を有する１以上の組換えタンパク質を製造する方法であって：
ａ）上記DNA構造物の中の少なくとも１が発現ベクターである、相同DNA配列のインビボ組換えのための方法を行い（この方法は、本明細書中に記載されるように本発明に従って行われる）；
ｂ）工程ａ）からの多くの異なる組換えられたDNA配列によりコードされた多くの異なる組換え体ポリペプチドを発現させ；そして
ｃ）所望の活性を有する１以上の組換えポリペプチドについての好適なスクリーニング又は選択系において、工程ｂ）からの多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択する、
を含む前記方法に関する。
好ましくは、上記工程ａ）における発現ベクターは、本発明に係る相同DNA配列のインビボ組換えのための方法に従って行われた強制ハイブリッドDNA形成（すなわち、上記構造物の互いへの組み込み）の間に複製することができない（例えば、非機能的複製起点をもつ）DNA構造物である。これは、本発明に係る上記ハイブリッド構造物のクロッシング・アウト事件後に、発現ベクターが、組換えられた相同DNAを含む確率を改善するであろう。なぜなら、上記発現ベクターが生存していることができる方法においてのみ、強制ハイブリッド形成方法が、上記ハイブリッド構造の形成を強制するために使用される条件下で複製することができる、他のDNA構造物により実際に組換えられることによるからである。
インビボ組換えのための方法が行われた後（上記工程ａ））、そして上記発現及び上記スクリーニング工程ｂ）とｃ）の前に、上記発現ベクターだけを含む細胞集団を主に作ることが有利である（すなわち、他のDNA構造物は、上記細胞集団から部分的に又はほぼ完全に除去される。）。これは、上記発現ベクターが上記のように強制されたハイブリッドDNA構造物の形成の間に複製することができないときに、特に有利である。なぜなら、このような細胞集団は、有利にはその後のスクリーニング工程（上記工程ｃ））内にある、着目の非組換えDNA配列のひじょうに制限されたバックグラウンドをもつであろうからである。
発現ベクターだけを含む細胞集団を主に作ることは、本分野において知られた標準的な手順に従って、例えば、他のDNA構造物に比較して、その発現ベクターの複製を選択的に好む条件で上記細胞を培養し；又は上記細胞から上記発現ベクターを選択的に精製し、そしてその後、これを新たな細胞集団内に導入することにより、行われることができる。
上記工程ａ）における組換えられた配列によりコードされた組換えポリペプチドの発現は、標準的な発現ベクターの使用により行われることができ、そして／又は標準的な発現ベクターは、本発明に係るインビボ組換え方法のために特に好適な要素を含むように修飾されることができる。
上記工程ｂ）から多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択するための、好適なスクリーニング又は選択系は、その所望の生物学的活性に依存するであろう。
所望の生物学的活性についてスクリーンし又は選択するために好適な多数のスクリーニング又は選択系は、本分野において記載されている。これらの例は、
カルシウム非依存性安定性を有するズブチリシン変異体についてスクリーンするためのスクリーニング系について記載する、Strauberg et al.（Biotechnology 13 : 669-673（1995））；
高められた熱安定性を有するプロテアーゼについてスクリーンするためのスクリーニング・アッセイについて記載する、Bryan et al.（Proteins 1 : 326-334（1986））；及び
洗濯洗剤中の、改良された洗浄性能を有するリパーゼについてスクリーンするためのスクリーニング・アッセイについて記載するPCT-DK 96/00322、
である。
本発明の好ましい態様は、所望の生物学的活性が皿洗浄又は洗濯洗剤において改良された性能であるところの、組換えタンパク質のスクリーニング又は選択を含む。好適な皿洗浄又は洗濯洗剤の例は、PCT/DK96/00322及びWO 95/30011中に開示されている。
本発明は、許容的条件下で同一細胞内で機能することができる少なくとも２つの異なる複製起点、及びポリペプチドをコードする少なくとも２つの相同DNA配列を含む、１セット（少なくとも２つの）ベクターをも含む。好ましい態様においては、少なくとも１の複製起点は温度感受性である。ベクターは好ましくはプラスミドであることができる。
本発明はさらに、少なくとも、
ａ）ポリペプチドをコードするDNA配列と複製起点を含む１のベクターＡ、及び
ｂ）ベクターＡ内の上記DNA配列に相同なDNA配列、及びベクターＡ内の上記複製起点とは異なる複製起点を含むベクターＢ、
を含むベクター系を含む。
上記DNA配列が生物学的な活性を有するポリペプチド、特に酵素、そして特にアミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ（phytase）、及びプロテアーゼの如き酵素、
をコードすることが好ましい。
本発明は、新規、組換え体DNA配列であって、本発明に係る方法により製造されており、又はそれが所望の生物学的活性を有する組換えタンパク質をコードし、ここで、所望の生物学的活性を有する組換えタンパク質が、本発明に従って所望の生物学的活性を有する１以上の組換え体タンパク質のための方法により作られる、ことを特徴とする前記DNA配列を含む。
本発明は、さらに、ポリペプチド、特に酵素の製法であって、ｉ）請求項38に記載の組換えられたDNA配列によりコードされたポリペプチドを発現する細胞を培養し、そしてii）上記発現されたポリペプチドを精製する、ことを含む製法を包含する。
本発明は、さらに、新規のポリペプチド、特に酵素であって、それが本発明に係る方法により製造されることを特徴とするものを包含する。
本発明は、さらに、ポリペプチド、特に酵素であって、それが本発明に係る組換えられたDNA配列によりコードされていることを特徴とするものを包含する。
本発明のポリペプチドは、ペプチドとタンパク質、並びに場合によりグリコシル化されたそれらの形態を含む。これらの例は、酵素、医薬として活性なポリペプチド、例えば、ヒト又は哺乳類ポリペプチドのアナログ、例えば、インスリン、成長ホルモン、ヒト・ホルモン又は成長調節物質である。
本発明を以下の実施例においてさらに詳細に説明する。実施例は、本発明の範囲をいかなる方法においても限定することを意図されていない。
実施例
材料及び方法
株

製造者により推奨されたようにBio-Rad Gene Pulser^TMを使用して調製され、そして形質転換されたエレクトロコンピテント細胞。

コンピテント細胞を、Yasbin, R.E., Wilson, G.A. and Young, F.E.（1975）Trans formation and transfection in lysogenic strains of Bacillus subtilis : evidence for selective induction of prophage in competent cells. J. Bacteriol, 121 : 296-304により記載されたように調製し、そして形質転換させた。
B. subtilis PL 1801。この株は、apr及びnpr遺伝子が破壊されているB. subtilis DN 1885である

プラスミド：
pSX120 :（EP 405901及びWO 91/00345中に記載されている）B. subtilis発現ベクター。このベクターは、野生型サビナーゼ遺伝子を含む。
pE194 :（Horinouchi, S and Weisblum, B., 1982, J. Bacteriol. 150 : 804-814）。
（WO 96/34946及びWO 92/19729中に記載されている）B. subtilis発現ベクター。このベクターは、本明細書中サビシン（Savisyn）といわれる合成サビナーゼ（Savinase）遺伝子を含む。サビシン遺伝子中には、pSX120中に含まれる野生型サビナーゼ遺伝子に比較して、多数の制限部位が導入されている。
pUC19 : Yanisch-Perron, C., Vieria, J. and Messing, J.（1985）Gene 33, 103-119。
pF64L-S65 T-GFP ;は、WO 97/11094中に記載されているF64L-S65T-GFPをコードするDNA断片をコードするE.coliプラスミドである。
pMUTIN−４−MCS :このプラスミドは、Laboratoire de Genetique Microbienne, Institut National de la Recherche Agronomique, 78352 Jouy en Josas-CEDEX, Franceから得られることができる。
溶液／培地
（Ausubel, F.M. et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995中に記載されるような）TY及びLB寒天。
LBPGは、0.5％グルコース及び0.05Ｍリン酸カリウム、pH7.0を補ったLB寒天である。
LBPGSKプレートは、寒天と１％のスキム・ミルクを含むLBPG培地である。
抗生物質は、６μｇ／mlのクロラムフェニコール、10μｇ／mlのカナマイシン、及び５μｇ／mlのエリスロマイシンの濃度において、異なる培地中で使用される。
（Ausubel, F.M. et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995中に記載されているような）TE−バッファー。
一般的分子生物学的方法
DNA操作及び形質転換を、分子生物学の標準的な方法（Sambrook et al.（1989）Molecular Cloning : A laboratory manual, Cold Spring Harbor lab., Cold Spring Harbor, NY ; Ausubel, F.M. et al.（eds.）“Current protocols in Molecular Biology”。John Wiley and Sons, 1995 : Harwood, C.R., and Cutting, S.M.（eds.）“Molecular Biological Methods for Bacillus”。John Wiley and Sons, 1990）を使用して行った。
DNA操作のための酵素を、供給者の指示書に従って使用した。
DNA操作のための酵素
特にことわらない限り、DNA操作のための全ての酵素、例えば、制限エンドヌクレアーゼ、リガーゼ、ポリメラーゼ、PCRポリメラーゼ等は、New England Biolabs, Inc.から得られる。
湿度感受性シャッフリング・プラスミドの構築
pMB430を、以下に示すような５工程のクローニング方法において構築した。このDNA配列全体が配列番号：１内に見られる。
１）温度感受性プラスミドpE194を、pE194プラスミドのユニークClaＩ部位付近に多フローニング部位を導入し、そしてこのようにしてそのClaＩ部位を破壊することにより修飾した。この導入を、そのプラスミド全体を増幅し、そしていくつかのユニーク・クローニング部位を導入するために、プライマー＃22899と24039を使用したPCRにより行った。
このPCRを以下のように行った：
１μｌのpE194 Qiaquickプラスミド・プレップを、200μＭの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）、及び100pmolの各プライマー：

を含むPCRバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.Ol％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中での50μｌのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー（Landgraf, Germany）を使用して行った。１分間94℃での１のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、１分間94℃での変性、１分間55℃でのアニーリング、及び２分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の５μｌアリコートを、0.7％アガロース・ゲル（NuSieve, FMC）中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μｌアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。精製されたDNAを、50μｌの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。50μｌの精製されたPCR断片を、BamHＩで消化し、0.8％低ゲル化温度のアガロース（Sea Plaque GTG, FMC）ゲル中で電気泳動にかけ、関係のある断片をそのゲルから切除し、そして製造者の指示に従ってQIAquick Gel抽出Kit（Qiagen, USA）を使用して精製した。次に単離されたDNA断片を、BamHＩ消化されたpUC191にライゲートし、そしてそのライゲーション混合物を、E. coli SJ2を形質転換させるために使用した。
細胞を、Ｘ−gal（SIGMA, USA）（５−ブロモ−４−クロロ−３−インドールイル・アルファーＤ−ガラクトピラノシド、50μｇ／ml）を補った、エリスロマイシン（200μｇ／ml）を含有するLB寒天プレート上にプレーティングした。
陽性クローンの同定及び特徴付け
形質転換された細胞を、Ｘ−gal（50μｇ／ml）を補ったエリスロマイシン（200μｇ／ml）を含むLB寒天プレート上にプレーティングし、そして一夜３７℃でインキュベートした。翌日、白色コロニーを、これらを新鮮なLB−エリスロマイシン寒天プレート上に再画線塗布することにより、レスキューし、そして一夜37℃でインキュベートした。翌日、各クローンの単一コロニーを、エリスロマイシン（200μｇ／ml）を含む液体LB培地に移し、そして250rpmで振とうしながら37℃で一夜インキュベートした。
プラスミドを、製造者の指示に従ってQIAgenプラスミド精製ミニ・キット（Qiagen, USA）を使用して上記液体培養物から抽出した。上記プラスミドの５μｌのサンプルを、BamHＩで消化した。この消化を、0.7％アガロース・ゲル（NuSieve, FMC）上の電気泳動によりチェックした。約2.7kbと3.7の２つのDNA断片の外観は、陽性クローンを示した。このクローンを、MB293と命名し、そしてこのプラスミドを、pMB293と命名した。
２）次に、pMB293をEcoRＩ消化し、そしてその3.8kb断片を0.7％アガロース・ゲル上で、製造者に従ってQiagenからのQiaQuickゲル精製キットを使用してゲル精製した。（上記PCRプライマーに、そしてpUC19のMCSに起因する）挿入された多クローニング部位をもつpE194を構成するこの断片を、ライゲーションにより円形にし、そしてB. subtilis DN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞を、５μｇ／mlのエリスロマイシンを含むLBPGプレート上で選択し、そしてインキュベーションを一夜33℃で行った。この形質転換からのクローンを再画線塗布し、そして５μｇ／mlのエリスロマイシンを含むTY中で一夜培養した。一夜の培養ブロスから細胞を単離し、そしてプラスミドをQiaquickプラスミド・キットを使用して精製した。これらのプラスミドの制限酵素消化は、上記クローンの正しさを証明した。１のこのようなクローンとプラスミドを、MB333及びpMB333と命名した。
３）次に、pMB333を、いずれのプロモーターをももたないサビジン遺伝子を含むプラスミドの構築のために温度感受性プラスミドとして使用した。この構造物を以下のように作った。
プライマー#21547と#21548及び鋳型としてpSX222を使用したPCRを、上記の条件に従って行った：
１μｌのpSX222 Qiaquickプラスミド・プレップを、200μＭの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）、及び100pmolの各プライマー：

を含むPCRバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中での50μｌのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー（Landgraf, Germany）を使用して行った。１分間94℃での１のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、１分間94℃での変性、１分間55℃でのアニーリング、及び２分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の５μｌアリコートを、0.7％アガロース・ゲル（NuSieve, FMC）中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μｌアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。精製されたDNAを、50μｌの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。50μｌの精製されたPCR断片を、BamHＩとApaＩで消化し、0.8％低ゲル化温度のアガロース（Sea Plaque GTG, FMC）ゲル中で電気泳動にかけ、関係のある断片をそのゲルから切除し、そして製造者の指示に従ってQIAquick Gel抽出Kit（Qiagen, USA）を使用して精製した。精製された断片を、ゲル精製され、BamHＩ及びApaＩ消化されたpMB333にライゲートした。そしてそのライゲーションを、B. subtilis DN1885を形質転換させるために使用した。形質転換された細胞を、５μｇ／mlのエリスロマイシンを含むLBPG寒天プレート上にプレーティングし、そして33℃で一夜インキュベートした。クローンを同様のプレート上で再画線塗布し、そしてプラスミドを、５μｇ／mlエリスロマイシンを含むTY中で33℃でインキュベートされたクローンの一夜培養物から、製造者により記載されたようにQiaquickプラスミド・キットを使用して単離した。プラスミドを、ApaＩとBamHＩを使用した酵素消化によりチェックした。１の正しいクローンをMB339と、そしてそのプラスミドをpMB339と命名した。
４）我々は、ハイブリッド・プラスミドが形成されていることをモニタリングする簡単な方法をテストしようと欲した。従って、我々は、２つの別個のプラスミド上の２つの相同遺伝子の間の強制組換えをモニターすることを欲した。これは、GFPをコードするORFに転写的に融合されたプロモーターを欠くサビジンをもつpE194誘導体を構築することにより行われた。この方法においては、２つの相同遺伝子が組換えられず、そしてそれ故、pSX120上にその他の方法で存在するプロモーターの制御下にGFPを置かない場合には、（サビジンそしてそれ故GFP遺伝子の上流にプロモーターを欠くことにより）GFPの発現が存在しないであろう。このプラスミドを、GFP遺伝子をPCR増幅し、そしてpMB339上のサビジン遺伝子の直下流にそれを導入することにより、構築した。
本明細書中に使用するGFPコーディングDNAは元来の野生型遺伝子の誘導体であり、GFPの誘導体は、国際特許出願WO 97/11094中に記載されたように構築された突然変異体F64L-S65T-GFPのDNA構築物からクローン化した。
上記鋳型プラスミドの構築はWO 97/11094中に記載された。F64L-S65T-GFPをコードするDNA断片を、以下のように上記遺伝子をコードするE.coliプラスミドからPCR増幅した：
１μｌのpF64L-S65T-GFP Qiaquickプラスミド・プレップを、200μＭの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）、及び100pmolの各プライマー：

を含むPCRバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中での50μｌのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー（Landgraf, Germany）を使用して行った。１分間94℃での１のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、１分間94℃での変性、１分間55℃でのアニーリング、及び２分間72℃での伸長を使用して行われた。増幅生成物の５μｌアリコートを、0.7％アガロース・ゲル（NuSieve, FMC）中の電気泳動により分析した。
PCR断片のサブクローニング
上記のように生成されたPCR生成物の45μｌアリコートを、製造者の指示に従ってQIAquick PCR精製キット（Qiagen, USA）を使用して精製した。精製されたDNAを、50μｌの10mM Tris-HCl, pH8.5中で溶出させた。このPCR断片とpMB339をClaＩとNsiＩで消化し、上記のようにゲル精製し、そして一緒にライゲートした。このライゲーション混合物を、DN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞を、LBPG ５μｇ／mlエリスロマイシン上にプレーティングした。18時間のインキュベーションの後、緑色の蛍光細胞が単一コロニーとして見えた。これらの中の１を分析し、そしてMB406として保存し、そして対応のプラスミドをpMB406として保存した。GFPコーディングORFはその転写を駆動する上流のプロモーターをもっていなかったので、GFP発現のための可能な説明は、サビジン−GFP転写融合物のさらに上流のプロモーター、すなわち、repF遺伝子のプロモーターからの読み進まれたということであった。
５）GFPのORF内へのいずれの読み進みをも廃止するために、転写ターミネーターを、repF遺伝子とサビジンDNAの間に挿入した。このターミネーターを、以下のプライマーと条件を使用してpMUTIN−４−MCSプラスミドから増幅した：
１μｌのpMUTIN−４−MCS Qiaquickプラスミド・プレップを、200μＭの各dNTP, 2.5ユニットのAmpliTaqポリメラーゼ（Perkin-Elmer, Cetus, USA）、及び100pmolの各プライマー：

を含むPCRバッファー（10mM Tris-HCl, pH8.3, 50mM KCl, 1.5mM MgCl₂, 0.01％（ｗ／ｖ）ゼラチン）中での50μｌのPCR増幅のために使用した。
上記PCR反応を、DNAサーマル・サイクラー（Landgraf, Germany）を使用して行った。60秒間94℃での１のインキュベーション、その後の40サイクルのPCRが、30秒間94℃での変性、30秒間55℃でのアニーリング、及び１分間72℃での伸長のサイクル・プロフィールを使用して行われた。増幅生成物の５μｌアリコートを、0.7％アガロース・ゲル（NuSieve, FMC）中の電気泳動により分析した。
増幅されたDNAを上記のように精製し、そして同じくBglII及びKpnＩ消化されたpMB406内にKpnＩ−BglII断片としてクローン化した（上記のものと同一の、ゲル精製等のための手順）。このライゲーション混合物をDN1885を形質転換させるために使用し、形質転換された細胞をLBPG ５μｇ／mlエリスロマイシン上にプレーティングした。18時間のインキュベーションの後、細胞が単一のコロニーとして見られた。これらの中の１を分析し、そしてMB430として保存し、そして同様にそのプラスミドをpMB430として保存した。このクローンは、GFPを全く発現していなかった。このことは、そのクローン化されたターミネーターが実際に予想されたように働いたことを示している。得られたプラスミドpMB430全体配列を、配列番号：１として表す。
MB432株の樹立
PL1801バチルス・サブチリスを、100μｌのコンピテントPL1801当り約１μｇの各プラスミドを使用して２つのプラスミドpMB430とpSX120で形質転換させた。この形質転換された細胞を、LBPG−５μｇ／mlエリスロマイシン上にプレーティングし、33℃で一夜インキュベートした。翌日、コロニーを、LBPG−５μｇ／mlエリスロマイシン＋６μｇ／mlクロラムフェニコール上に再画線塗布し、そして33℃で一夜インキュベートした。コロニーを、液体培養物TY−５μｇ／mlエリスロマイシン＋６μｇ／mlクロラムフェニコール中で一夜33℃でも培養し、プラスミドを培養ブロスから精製し、そしてPL1801株内の両pMB430とpSX120の存在を証明した。このクローンを保存し、そしてMB432と命名した。
実施例１
サビナーゼのズブチリシン遺伝子をコードする２つの相同配列の配列シャッフリング
ズブチリシン（subtilisin）タイプのプロテアーゼをコードする（pSX120内に含まれる）サビナーゼ野生型遺伝子を、高い相同性をもつ遺伝子のシャッフリングのための標的として選んだ。新たな制限部位を与える多数のサイレント突然変異が導入されているところの、pSX222内に含まれるサビナーゼ遺伝子（以下、サビジンという）の部位指定変異体を、サビナーゼに対するシャッフリング・パートナーとして使用した。上記２つの遺伝子を、本発明に従って２つの別個の適合性プラスミド上でクローン化した。転写活性なサビナーゼ遺伝子を、クロラムフェニコールに対する耐性をコードするpUB110起源に基づくプラスミド（pSX120、図４）上にクローン化した。サビナーゼ遺伝子を欠いたプロモーターを、同じくエリスロマイシンに対する耐性をコードする温度感受性プラスミドpE194の誘導体（pMB430）上にクローン化した。２つの転写ターミネーターを、いずれの読みをも防ぐためにサビジン遺伝子の上流にクローン化した。
pMB430中、緑色蛍光タンパク質（GFP）は、上記２つのプラスミド間のイン−クロス（in-cross）及びアウト・クロス（out-cross）に視覚的に従うことができるように、サビジン遺伝子に転写的に融合された。
２つのプラスミドpSX120とpMB430で形質転換されたB. subtilis株MB432, pL1801は、上記相同遺伝子間の２つの連続的な２重のクロス・オーバー事件を誘導するために２サイクルの温度シフトを通して採取された。相同的組換え及びプラスミド・ハイブリッド形成は、エリスロマイシンの存在下、制限的温度（42〜50℃）においてLBPGプレート上で選択された。これらの制限的条件下、温度感受性プラスミドpMB430は、サビナーゼ／サビジンの領域内での相同組換えにより安定性pSX120プラスミド内に強制される。組換えが生じている上記コロニーも、上記２つのプラスミド間の組換え及びサビジン−GFPオペロンの同時発生活性化の結果として蛍光になる（図２）。アウト・クロス事件は、２日間30℃の許容的温度でLB−ブロス中、上記クローンを培養し、そしてクロラムフェニコールとエリスロマイシンを含むLBPGプレート上で上記細胞をプレーティングすることにより、スクリーニングされた。
非蛍光性コロニーをプレート上で再画線塗布し、そして上記のような第２ラウンドの温度サイクルを通して採取した。
第２ラウンドのシャッフリングの後、プラスミド調製を20の異なるクローンから行った。コンピテントPL1801は、20のプラスミド・プレップの各々で形質転換し、そしてエリスロマイシンを補ったLBPG上でプレートした。これらのプレートを、pSX120とpMB430の両方が形質転換されていた不所望のクローンを同定するために、クロラムフェニコールとエリスロマイシンを含むLBPG上で複製した。pMB430プラスミドだけが形質転換されているクローンを、シャッフリングが生じているかどうかを同定するために、サビジン領域の配列決定について選択した。図６から、２つの遺伝子、サビナーゼとサビジンの間の組換えが生じていたことは明らかである。12の配列決定されたクローンの全てが、ある程度の組換えを示し、そしてこれらの中の４つが、２つの連続的な２重組換え事件の結果として、陽性に同定されることができる。サビナーゼとサビジン配列の交換が、シャッフルされた断片が、サビジンにとってユニークな制限部位に重複している場合にのみ観察されることができるということに注意することが重要である。２つの２重組換えのための陽性の証拠をもつ４つのクローンは、それ故、最小の数である。なぜなら、この組換えは、２つの隣接する制限部位の間で生じることができたであろうからである。
配列表
（２）配列番号：１についての情報：
（ｉ）配列の特徴：
（Ａ）長さ：5313塩基対
（Ｂ）タイプ：核酸
（Ｃ）鎖の数：１本鎖
（Ｄ）トポロジー：直鎖状
（ii）分子タイプ： DNA
（vi）起源：
（Ａ）生物：プラスミドpMB430
（xi）配列番号：１

Claims

相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程：
（ａ）各々がDNA配列と複製起点を含む、少なくとも２つのDNA構造物を含む細胞を、ｉ）少なくとも１の複製起点が非機能的であり、そしてii）当該細胞が上記非機能的起点をもつDNA構造物を含む場合に当該細胞の成長を唯一許容する選択圧下にあるという条件下で、インキュベートし、それにより、当該DNA構造物のうちの１から他のDNA構造物のうちの１内への組み込みを支持し、そしてそれによりハイブリッドDNA構造物を形成し；
（ｂ）上記条件から、工程ａ）におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え、それにより、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウト、及び組換えDNA配列と複製起点を含むDNA構造物の形成を支持し；
（ｃ）少なくとも１回、工程ａ）〜ｂ）を繰り返す、
を含む前記方法。
少なくとも１のDNA構造物が、染色体、好ましくはバクテリアの染色体、より好ましくはバチルスの染色体、特にバチルス・サブチリスの染色体であることを特徴とする、請求項１に記載の方法。
少なくとも１のDNA構造物が、ベクター、好ましくはバクテリアのベクター、より好ましくはバチルス細胞、特にバチルス・サブチリス細胞内で複製することができるベクターであることを特徴とする、請求項１又は２に記載の方法。
前記DNA構造物の中の少なくとも２つが、２つの異なるベクターである、請求項３に記載の方法。
相同DNA配列のインビボ組換えのための方法であって、以下の工程：
ａ）異なる複製起点を含む、少なくとも２つの異なるベクター内に上記相同DNA配列を挿入し；
ｂ）上記ベクターを細胞内に導入し；
ｃ）当該細胞を、ｉ）少なくとも１の複製起点が非機能的であり、そしてii）当該細胞が上記非機能的起点をもつDNA構造物を含む場合に当該細胞の成長を唯一許容する選択圧下にあるという条件下で、インキュベートし、それにより、DNA構造物のうちの１から他のDNA構造物のうちの１内への組み込みを支持し、それによりハイブリッドDNA構造物を形成し；
ｄ）上記条件から、工程ｃ）におけるよりも、より少ない複製起点が非機能的である条件へ、変え、それにより、上記ハイブリッドDNA構造物からのクロッシング・アウト、及び組換えDNA配列と複製起点を含むDNA構造物の形成を支持し；
ｅ）適宜多数回であるが、少なくとも１回、工程ｃ）〜ｄ）を繰り返す、
を含む前記方法。
少なくとも１の複製起点が、前記ベクターの複製速度が化学的に又は物理的に調節されることができるような方法で、選択されることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか１項に記載の方法。
少なくとも１の複製起点が温度感受性であることを特徴とする、請求項６に記載の方法。
少なくとも１のベクターの複製速度が、温度シフトにより調節されることができることを特徴とする、請求項７に記載の方法。
前記ベクターが、マーカー、好ましくは選択マーカー、特に抗生物質マーカーのための遺伝子を含むことを特徴とする、請求項１〜８のいずれか１項に記載の方法。
前記ベクターが、異なるマーカーのための遺伝子を含むことを特徴とする、請求項９に記載の方法。
少なくとも１のDNA構造物が、ori（−）を含まず、ori（＋）だけを含む、請求項１〜10のいずれか１項に記載の方法。
ori（−）を含まない前記DNA構造物が、請求項１〜11の中のいずれか１項に記載の方法に従って行われたハイブリッドDNA構造物の形成の間にその起点が機能的であるところのDNA構造物である、請求項11に記載の方法。
前記ハイブリッド構造物の形成が、インビボにおいて、好ましくは、DNA構造物の系を有することにより、計測され、ここで、インビボにおいて選択可能なタンパク質が前記ハイブリッド構造物が形成された後にのみ発現される、請求項１〜12の中のいずれか１項に記載の方法。
前記選択可能なタンパク質が、好適な露出下で蛍光性であるタンパク質であり、そして特に前記蛍光タンパク質が緑色蛍光タンパク質（GFP）又はその変異体である、請求項13に記載の方法。
前記ハイブリッド構造物からのクロッシング・アウトが、強制されたクロッシング・アウトである、請求項１〜14のいずれか１項に記載の方法。
前記ハイブリッド構造物からの強制クロッシング・アウトが：
ｉ）上記DNAハイブリッド構造物が選択マーカーを発現せず、そして請求項１〜15の中のいずれか１に記載の少なくとも２つのDNA構造物の中の少なくとも１が前記選択マーカーを発現することができる系を構築し；
ii）前記細胞は、前記DNAハイブリッド構造物のクロッシング・アウトが生じた後にのみ上記マーカー遺伝子を発現することができるので、選択可能な条件下で前記細胞をインキュベートし、それにより上記ハイブリッド構造物のクロス・アウトを強制する、
ことにより行われる、請求項15に記載の方法。
工程ｉ）における選択マーカーが、その複製起点が、上記のように行われたDNAハイブリッド構造物内への前記DNA構造物の強制された組み込みの間に非機能的であるところのDNA構造物上で発現され、そして好ましくは、前記選択マーカー遺伝子が抗生物質耐性遺伝子である、請求項16に記載の方法。
前記相同DNA配列が、少なくとも１の予め作られたDNAライブラリーからのDNA配列を含む、請求項１〜17のいずれか１項に記載の方法。
前記相同DNA配列が、相同DNA配列の２以上の異なるセットから作られ、そして前記相同配列のセットのそれぞれが請求項１〜18の中のいずれか１項に記載の異なるDNA構造物内に挿入される、請求項１〜18のいずれか１項に記載の方法。
前記相同DNA配列のセットの中の少なくとも１が、予め作られたDNAライブラリーから得られ、そして前記相同DNA配列のセットの中の少なくとも１が、前記DNAライブラリーに相同であるDNA配列である、請求項19に記載の方法。
前記相同DNA配列のセットが、同一の予め作られたDNAライブラリーから得られる、請求項19に記載の方法。
前記相同DNA配列のセットが、少なくとも２の異なる予め作られたDNAライブラリーから得られる、請求項19に記載の方法。
前記相同DNA配列のセットが、それぞれ、１のDNA配列だけを含む、請求項19に記載の方法。
前記DNA構造物を含む細胞が、その酵素ミスマッチ修復系内に欠陥があり又は一時的に失活されており又は減少されたレベルのミスマッチ修飾をもつことを特徴とする、請求項１〜23のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が、グラム陽性細胞、例えばスタフィロコッカス（Staphylococcus）細胞、ストレプトコッカス（Streptococcus）細胞、バチルス（Bacillus）細胞、又は特にバチルス・サブチリス（Bacillus subtilis）細胞であることを特徴とする、請求項１〜24のいずれか１項に記載の方法。
前記細胞が、グラム陰性細胞、好ましくはエシュリキア（Escherichia）細胞、特に大腸菌（E.coli）細胞であることを特徴とする、請求項１〜24のいずれか１項に記載の方法。
前記相同DNA配列が、ポリペプチド、特に酵素、及び特に酵素、例えば、アミラーゼ、リパーゼ、クチナーゼ、セルラーゼ、オキシダーゼ、フィターゼ、及びプロテアーゼをコードしていることを特徴とする、請求項１〜26のいずれか１項に記載の方法。
以下のステップ：
ａ）上記DNA構造物の中の少なくとも１が発現ベクターである、請求項１〜27のいずれか１項に記載の相同DNA配列のインビボ組換えのための方法を行い；
ｂ）工程ａ）からの多くの異なる組換えられたDNA配列によりコードされた多くの異なる組換え体ポリペプチドを発現させ；そして
ｃ）所望の活性を有する１以上の組換えポリペプチドについての好適なスクリーニング又は選択系において、工程ｂ）からの多くの異なる組換えタンパク質をスクリーンし又は選択する、
を含む所望の生物学的活性を有する１以上の組換えタンパク質を製造する方法。