JP2000502882A

JP2000502882A - サーモトガ由来のクローン化ｄｎａポリメラーゼ類およびそれらの変異体

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Publication number: JP2000502882A
Application number: JP9511360A
Authority: JP
Inventors: チャッタージー，デブ・ケイ; ヒューゲス，エイ・ジョン・ジュニア
Original assignee: ライフ・テクノロジーズ・インコーポレイテッド
Priority date: 1995-09-08
Filing date: 1996-09-06
Publication date: 2000-03-14
Also published as: AU7236296A; US5948614A; EP0871775A1; EP0871775A4; WO1997009451A1

Abstract

(57)【要約】本発明は、サーモトガ（TneおよびTma）由来の実質的に純粋な熱安定性ＤＮＡポリメラーゼおよびそれらの変異体に関する。Tne ＤＮＡポリメラーゼは、約１００キロダルトンの分子量を有し、Taq ＤＮＡポリメラーゼよりも熱安定性である。変異体ＤＮＡポリメラーゼは、（１）該ＤＮＡポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下または除去させる第１の変異；（２）該ＤＮＡポリメラーゼの５'→3'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下たは除去させる第２の変異；（３）ジデオキシヌクレオチドに対して非識別性になった該ＤＮＡポリメラーゼをもたらす該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックスにおける第３の変異、からなる群から選択される少なくとも１つの変異を有する。本発明はまた、Ｅ.コリ中での野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現、クローン化遺伝子を含有するＤＮＡ分子、ならびに該遺伝子を発現する宿主に関する。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、よく知られたＤＮＡ配列決定、標識、増幅およびcＤＮＡ合成反応に使用され得るものである。

Description

【発明の詳細な説明】サーモトガ由来のクローン化ＤＮＡポリメラーゼ類およびそれらの変異体発明の背景発明の分野本発明は、実質的に純粋な、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼに関する。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーモトガ(Thermotoga)ＤＮＡポリメラーゼ、さらに詳しく言えば、サーモトガ・ネアポリターナ(Thermotoga・neapolitana) （Tne）ＤＮＡポリメラーゼまたはサーモトガ・マリチーマ(Thermotoga・mariti ma）（Tma）ＤＮＡポリメラーゼである。好ましくは、このポリメラーゼは、約１００キロダルトンの分子量を有するものである。本発明は、さらに、Ｅ.コリ中でのサーモトガＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現、クローン化遺伝子を含有するＤＮＡ分子、ならびに該遺伝子を発現する宿主に関するものでもある。本発明のＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、およびcＤＮＡ合成に使用され得るものである。本発明は、また、TneおよびTmaＤＮＡポリメラーゼを含む、サーモトガＤＮＡポリメラーゼの変異体に関するものでもある。特に、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、実質的に３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異；変異体ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ分子中へのジデオキシヌクレオチド類組み込み能力をデオキシヌクレオチド類とほぼ同程度の効率のものにする変異；および実質的に５ '→３'エキソヌクレアーゼ活性を低下させる変異を含む。本発明のサーモトガ（例えば、TneおよびTma）変異体ＤＮＡポリメラーゼは、上記の諸性質のひとつないしそれ以上を有する。これらのＤＮＡポリメラーゼ変異体も、ＤＮＡ配列決定、増幅反応、およびｃＤＮＡ合成に使用され得るものである。本発明は、さらに、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下した、その他のＤＮＡポリメラーゼ類の新規変異体にも関する。背景情報ＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡ鋳型に相補的であるＤＮＡ分子の形成を合成する。一本鎖ＤＮＡ鋳型へのプライマーのハイブリダイゼーションにより、ポリメラーゼは、順次、伸長鎖の３'−ヒドロキシル基にヌクレオチドを加えながら、ＤＮＡを５'→３'方向へ合成する。このようにして、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ｄＮＴＰｓ）およびプライマーの存在下、一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的な新規ＤＮＡ分子が合成できる。多数のＤＮＡポリメラーゼが、好中温性の微生物、例えばＥ.コリから単離されている。これらの好中温性ＤＮＡポリメラーゼの多くがクローン化されている。LinらはＴ４ＤＮＡポリメラーゼをクローン化し、Ｅ.コリ中で発現させている。(Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84：7000-7004(1987))。Taborらはクローン化Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼを記載しており(U.S．Patent No.4795699)、他方、Mink leyら（J.Biol.Chem.259:10386-10392(1984)）およびChatterjee（U.S．Patent No.5047342）は、それぞれ、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩ、およびＴ５ＤＮＡポリメラーゼのクローン化を記載している。好熱細菌類由来のＤＮＡポリメラーゼは知られているが、これらの酵素を単離しさらにクローン化することまでの研究は比較的に少ない。Chienら［J．Bacter iol．127：1550-1557(1976)］は、サームス・アクァティクス(Thermus aquaticu s）（Taq）由来のポリメラーゼを取得するための精製スキームを記載している。取得タンパク質は、ゲル濾過分析によるものは約６３０００ダルトンの分子量のものであり、ショ糖勾配遠心分離によるものは６８０００ダルトンのものであった。Kaledinら［Biokhiymiya 45：644-51(1980)］は、Ｔ.アクァティクス(Ｔ.aq uaticus)ＹＴ１株からＤＮＡポリメラーゼを単離するための精製操作を開示した。精製した酵素は、６２０００ダルトンの単量体タンパク質であったと報告された。Gelfandら（U.S．Patent No.4889818）は、サームス・アクァティクス由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローン化した。このタンパク質の分子量は、約８６０００ないし９００００ダルトンであることが判明した。 Simpsonらは、サーモトガ種由来の熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを精製し、部分的にその特性を明らかにした（Biochem.Cell.Biol．86：1292-1296(1990))。S impsonらにより単離された精製ＤＮＡポリメラーゼは、ＳＤＳ−ポリアクリルアミドゲル電気泳動およびサイズ排除クロマトグラフィーによって測定したとき、８５００ダルトンの分子量を示した。この酵素は、基質が存在しない場合、９５ ℃では３分、５０℃では６０分の半減期を示し、最適pHはpH７.５ないし８.０の範囲にあることを示した。トリトンＸ−１００は、この酵素の熱安定性を増強するように思われた。Simpsonらによって記載された熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを取得するために用いられた株は、サーモトガ種のＦｊＳＳ３−Ｂ.１株であった（Hussar et al.FEMS Microbiology Letters37:121-127(1986))。その他、サーモトガ・マリチーマ由来の熱安定性のＤＮＡポリメラーゼがクローン化され、配列決定されている(U．S．Patent 5374553、ここに引用を明示して本発明の一部とする)。その他のＤＮＡポリメラーゼは、バチルス・ステラオサーモフィルス(Bacillu s steraothermophilus)を含む好熱性細菌（Stenesh et al．J.Biochim．Biophy. Acta272:156-166(1972);およびKaboev et al．J．Bacteriol．145：21-26(1981) )、および古細菌(archaebacterial)種の数種（Rossi et al.，System．Appl．Mi crobiol．７:337-341(1986)；Klimiczak et al.，Biochemistry 25：4850-4855( 1986)；およびElie et al.，Eur．J．Biochem．178:619-626(1989)）から単離されている。最も大規模に精製された古細菌ＤＮＡポリメラーゼは、半減期が８７ ℃で１５分のものであったと報告されている（Elie et al.(1989),同上）。Inni sら[In PCR Protocol；A Guide To Methods and Amplification，Academic Pres s，Inc.，San Diego(1990)］は、数種の非常に高い温度で成長し得る、特に好熱性のユーバクテリアおよび古細菌を認め（Bergquist et al.,Biotech Genet．En g．Rev．５:199-244(1987)；およびKelly et al.,Biotechnol.Prog．４：47-62( 1988))、これらの微生物が非常に熱安定性のＤＮＡポリメラーゼをもっているかもしれないことを示唆している。既知ポリメラーゼの多くでは、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、ポリメラーゼのＮ−末端領域に存在する。(Ollis，et al.，Nature 313:762-766(1985);F reemont et al.，Proteins１:66-73(1986)；Joyce,Cur.Opin.Struct.Biol.I：12 3-129(1991)）その変異が、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性をほとんど失わせると思われているアミノ酸が幾つか存在する。（ Gutman & Minton，Nucl．Acids Res．Acids Res．21:4406-4407(1993)）これらのアミノ酸は、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩ中の、Tyr⁷⁷、Gly¹⁰³、Gl y¹⁸⁴およびGly¹⁹²を含むものである。５'-エキソヌクレアーゼドメインは、必ずしも必要ではないことが知られている。既知例のうち最も良いのは、Ｅ.コリポリメラーゼＩのクレノウ・フラグメントである。このクレノウ・フラグメントは、５'-エキソヌクレアーゼ活性のない、天然タンパク質分解性フラグメントである（Joyce et al.，J.Biol.Chem．257：1958-64(1990))。この活性を有しないポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定に有用である。多くのＤＮＡポリメラーゼは、さらに、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性も有する。このエキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼにプルーフ・リーディング（校正）能力を与える。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をもたないＴ５ＤＮＡポリメラーゼは、米国特許第５２７０１７９号に開示されている。この活性をもたないポリメラーゼは、ＤＮＡ配列決定に特に有用である。 dＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部位は、通常、ポリメラーゼのカルボキシル末端領域に存在する（Ollis et al.,Nature 313:762-766(1985)；F reemont et al.，Proteins１：66-73(1986))。Ｅ.コリポリメラーゼＩのPhe⁷⁶² は、ヌクレオチド類と相互作用するアミノ酸の１種であることが示されている(J oyce & Steitz，Ann．Rev．Biochem．63：777-822(1994)；Astake，J．BIol. Ch em．270：1945-54(1995))。このアミノ酸をTyrに変えると、ジデオキシヌクレオチドに対し非識別性の変異体ＤＮＡポリメラーゼとなる。Deb Ｋ．チャッテリイにより、１９９５年９月８日付けで出願され、「変異体ＤＮＡポリメラーゼ類およびそれらの使用」と題する、並行米国出願第０８／５２５０８７号を参照し、ここに明示して本書の一部とする。このように、当該技術分野では、より熱安定性のＤＮＡポリメラーゼの開発が必要とされていた。当該技術分野では、また、エキソヌクレアーゼ活性をもたずしかもジデオキシヌクレオチド類に対しては非攻撃性であるような、野生の、あるいは変異体ＤＮＡポリメラーゼ類の取得が必要とされていた。発明の概要本発明は、分子生物学において有用な、さらなるＤＮＡポリメラーゼを提供することにより、これらの当該技術分野の欲求を満足させるものである。具体的には、本発明は熱安定性のＤＮＡポリメラーゼを含むものである。好ましくは、このポリメラーゼは、分子量が約１００キロダルトンのものである。また、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、サーモトガから単離されたものであり、より詳しくは、このＤＮＡポリメラーゼは、サーモトガ・ネアポリターナ（Tne）およびサーモトガ・マリチーマ（Tma）から取得されるものである。本発明のＤＮＡポリメラーゼの単離に好適であるサーモトガ種は、アフリカ大陸の硫気性温泉から単離されたものである（Windberger et al.,Arch．Microbiol．151，506-512(1989) 。本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼは、極めて熱安定性であり、洗剤の共存または非共存下、９０℃で６０分加熱後５０％以上の活性を示す。従って、本発明のＤＮＡポリメラーゼは、TaqＤＮＡポリメラーゼより一層熱安定性である。本発明は、また、サーモトガＤＮＡポリメラーゼ酵素をコードする遺伝子のクローニングに関するものでもある。本発明によるサーモトガＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含むＤＮＡ分子は、宿主細胞中で形質転換され、ＤＮＡポリメラーゼを産生するように発現され得るものである。原核生物および真核生物細胞を含む、全ての種類の宿主が、本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の発現に使用し得る。好ましくは、原核生物細胞が、この発明のＤＮＡポリメラーゼの発現に使用される。本発明による好ましい原核生物宿主はＥ.コリである。本発明は、さらに、配列決定反応においてポリメラーゼをddＮＴＰに対して非識別性とする、Ｏ−ヘリックスにおけるアミノ酸変化がある、PolＩ型の変異体熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ類、およびそれらをコードするＤＮＡにも関している。このＯ−ヘリックスは、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ、但しＸはいかなるアミノ酸でもよい、と定義されるものである。本発明は、さらに、エキソヌクレアーゼ活性をもたないか、および／または配列決定反応においてddＮＴＰに対して非識別性である、サーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体に関するものでもある。本発明は、また、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下もしくは喪失せしめる変異を有するＤＮＡポリメラーゼ類全般にもかかわる。特に、本発明は、（ａ）ポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を低下もしくは除去すること；（ｂ）ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を低下もしくは除去すること；および（ｃ）ジデオキシヌクレオチドに対する識別作用を低下もしくは除去すること、よりなる群から選ばれる少なくとも１種の方法で修飾された、サーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体に関する。本発明はまた、ＤＮＡポリメラーゼの製造方法にもかかわるが、該方法は：（ａ）本発明の宿主細胞を培養し；（ｂ）該遺伝子を発現させ：次いで（ｃ）該宿主細胞から該ＤＮＡポリメラーゼを単離することよりなる方法である。本発明は、さらに、：（ａ）第１ＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズし、（ｂ）ひとつまたはそれ以上のデオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび本発明のＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第１ＤＮＡ分子の全体または一部に相補的な第２ＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下に、（ａ）工程の該ＤＮＡ分子をインキュベーションすること、よりなる２本鎖ＤＮＡ分子を合成する方法にもかかわる。そのようなデオキシ− およびジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートは、dＡＴＰ、dＣＴＰ、d ＧＴＰ、dＴＴＰ、dＩＴＰ、７−デアザ−dＧＴＰ、７−デアザ−dＡＴＰ、dＵＴＰ、ddＡＴＰ、ddＣＴＰ、ddＧＴＰ、ddＩＴＰ、ddＴＴＰ、[α−Ｓ]dＡＴＰ、[α−Ｓ]dＴＴＰ、[α−Ｓ]dＧＴＰおよび［α−Ｓ]dＣＴＰを含む。本発明は、さらに、ＤＮＡ分子の配列決定方法にもかかわるが、該方法は：（ａ）第１ＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズし：（ｂ）工程（ａ）の該ＤＮＡ分子を、デオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類、本発明のＤＮＡポリメラーゼおよびターミネーターヌクレオチドと接触させ、（ｃ）該第１ＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子群の無作為集団を合成するのに十分な条件下に、但し、該合成されたＤＮＡ分子群は、該第１ＤＮＡより長さが短くかつそれらの３'末端においてターミネーターヌクレオチドを含むものである、工程（ｂ）の混合物をインキュベーションし；そして（ｄ）該第１ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように、該合成されたＤＮＡ分子群をサイズ毎に分離すること、よりなるものである。そのようなターミネーターヌクレオチドには、ddＴＴＰ、 ddＡＴＰ、ddＧＴＰ、ddＩＴＰまたはddＣＴＰが含まれる。本発明は、さらに、二本鎖ＤＮＡ分子を増幅する方法にもかかわるが、該方法は：（ａ）第１プライマーが該ＤＮＡ分子の第１鎖の３'−末端またはその近くの配列に相補的であり、第２プライマーが該ＤＮＡ分子の第２鎖の３'−末端またはその近くの配列に相補的である、第１および第２プライマーを用意し；（ｂ）本発明のＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第１鎖と相補的な第３ＤＮＡ分子および該第２鎖と相補的な第４ＤＮＡ分子が合成される条件下に、該第１プライマーを該第１鎖とそして該第２プライマーを該第２鎖とハイブリダイズし、（ｃ）該第１および第３鎖、ならびに該第２および該第４鎖を変性させ；そして（ｄ）（ａ）ないし（ｃ）の工程を１回ないしそれ以上回繰り返すこと、よりなるものである。本発明は、また：（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１容器手段；（ｂ）１種またはそれ以上のジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類を含有する第２容器手段；（ｃ）１種またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類を含有する第３容器手段、を含む、ＤＮＡ分子配列決定用キットにもかかわる。本発明は、また：（ａ）本発明のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１容器手段；（ｂ）１種またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート類を含有する第２容器手段、を含む、ＤＮＡ分子増幅用キットにもかかわる。本発明は、さらに、Tne ＤＮＡポリメラーゼのAsp⁸、Glu¹¹²、Asp¹¹⁴、Asp¹¹⁵ 、Asp¹³⁷、Asp¹³⁹、Gly¹⁰²、Gly¹⁸⁷またはGly¹⁹⁵に対応するアミノ酸の少なくとも１つを変異させている、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下または除去された変異体ＤＮＡポリメラーゼにもかかわる。本発明は、さらに：（ａ）本発明の宿主細胞を培養し；（ｂ）変異体ＤＮＡポリメラーゼを発現させ；そして（ｃ）該変異体ＤＮＡポリメラーゼを単離すること、を含む、Tne ＤＮＡポリメラーゼのAsp⁸、Glu¹¹²、Asp¹¹⁴、Asp¹¹⁵、Asp¹³⁷、As p¹³⁹、Gly¹⁰²、Gly¹⁸⁷またはGly¹⁹⁵に対応するアミノ酸の少なくとも１つを変異させている、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下または除去された変異体ＤＮＡポリメラーゼの製造方法にもかかわる。図面の簡単な説明図１は、Tne ＤＮＡポリメラーゼの９０℃での経時的熱安定性を示す。サーモトガ・ネアポリターナ細胞の粗抽出物から部分的に精製したＤＮＡポリメラーゼをこのアッセイに使用した。図２は、クローン化したTne ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有するＥ.コリ宿主から単離したTne ＤＮＡポリメラーゼの時間依存的ＤＮＡポリメラーゼ活性を示す。図３は、様々なＤＮＡポリメラーゼの放射性dＡＴＰおよび［αＳ]dＡＴＰ組み込み能力を比較するものである。Tne ＤＮＡポリメラーゼはTaq ＤＮＡポリメラーゼよりも効率よく［αＳ]dＡＴＰを組み込む。図４は、Sport１およびpＵＣ１９中にTne ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する近似ＤＮＡフラグメントの制限地図を示す。この図はまた、Ｏ−ヘリックス相同配列を含有する領域を示す。図５Ａおよび５Ｂは、３つの読み取り枠（リーディング・フレーム）全てにおいて、サーモトガ・ネアポリターナ・ポリメラーゼ遺伝子のＯ−ヘリックス領域を含むカルボキシル末端部分のヌクレオチドおよび推定アミノ酸配列を示す。図６Ａは、プラスミドpＵＣ−Tne（３'→５'）およびpＵＣ−Tne ＦＹの構築を略図的に表す。図６Ｂは、プラスミドpTrc Tne３５およびpTrc TneＦＹの構築を略図的に表す。図７は、プラスミドpTrc Tne３５ＦＹの構築を略図的に表す。図８は、プラスミドpＴＴＱ Tne５ＦＹおよびpＴＴＱ Tne５３５ＦＹの構築を略図的に表す。図９は、実施例１２のTne ＤＮＡポリメラーゼによる効率的³⁵Ｓ取り込みを示す２つの配列決定反応組を含有するゲルを表す。Ａ組ではTne ＤＮＡポリメラーゼを用いてアルカリ変性pＵＣ１９ＤＮＡを配列決定した。Ｂ組ではＭ１３mｐ１９(＋)ＤＮＡを配列決定した。図１０は、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼが、ポリ(dA)テイルを持つcＤＮＡを含有するプラスミドから明瞭な配列を作ることを示す、３つの配列決定反応組を含有するゲルを表す。cＤＮＡ挿入物を含有するアルカリ変性プラスミドＤＮＡは、Tne ＤＮＡポリメラーゼ（ＡおよびＢ組）または配列Ｖｅｒ２.０（Ｃ組）のいずれかを用いて配列決定した。図１１は、ポリ(dC)を含有するプラスミドから配列を作る実施例１２の変異体 Tne ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ組）、Sequenase(登録商標)（Ｂ組）およびTaqＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ組）を比較する、３つの配列決定反応組を含有するゲルを表す。図１２は、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ（Ａ組）が、ThermoSe quenase（登録商標）（Ｂ組）よりも３倍強くかつTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ組）で得られるむらのあるバンド強度を持たない³⁵Ｓ−標識配列を産生することを示す３つの配列決定反応組を含有するゲルを表す。図１３は、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼが高品質のイン・ビトロ増幅ＤＮＡ配列を産生することを示す、４つの配列決定反応組を含有するゲルを表す（Ａ組、Ｅ.コリβ polＩ（〜４５０bp）；Ｂ組、Ｅ.コリrrsＥ（〜３５０ｂｐ）；Ｃ組、pＳＣ１０１(〜１.５kb)由来のori；およびＤ組、ヒトＨＳＩＮＦ遺伝子由来のエクソン(〜７５０bp))。図１４Ａおよび1４Ｂは、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼがポリ( dA)またはポリ(dC)ストレッチを含有する二本鎖ＤＮＡクローンから優れた配列を提供することを示す、３および４つの配列決定反応組をそれぞれ含有するゲルを表す。図１４Ａ、ホモポリマーを持つ挿入物を含有するスーパーコイル状プラスミドＤＮＡを変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼを用いてサイクルシーケンス法にかけた（Ａ組、ＲＰＡ１；Ｂ組、elf（キャップ結合タンパク質）；およびＣ組、ポリ(dC)−テイル化５'ＲＡＣＥ誘導化挿入物)。図１４Ｂ、)ホモポリマーを持つ挿入物を含有するスーパーコイル状プラスミドＤＮＡをTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ組）またはSequiTherm(登録商標)（Ｅ−Ｇ組）を用いてサイクルシーケンス法にかけた（Ｄ組、ＲＰＡ；Ｅ組、ＲＰＡ；Ｆ組、ポリ(dC)−テイル化５'ＲＡＣＥ誘導化挿入物；およびＧ組、elf）。図１５は、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼおよび³²Ｐ末端標識プライマーを用いるサイクルシーケンス法を示す、２つの配列決定反応組を含有するゲルを表す。図１６Ａ−１６Ｃおよび1６Ｄ−１６Ｆは、蛍光染色プライマーシーケンス法における、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ（１６Ａ−１６Ｃ）とAm pliTaq ＦＳ（登録商標）（１６Ｄ−１６Ｆ）との比較を示す２組のクロマトグラムを表す。図１７Ａ−１７Ｃおよび１７Ｄ−１７Ｆは、蛍光染色ターミネーターシーケンス法における、実施例１２の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ（１７Ａ）とAmpliT aq ＦＳ（登録商標）（１７Ｂ）との比較を示すクロマトグラムを表す。好ましい実施態様の詳細な説明定義続く説明には組換えＤＮＡ技術に使用される多くの用語が広範囲に使用されている。かかる用語の持つ範囲を含み、明細書および請求の範囲の明瞭かつ一定の理解を得るために、下記の定義を与える。クローニングベクター。宿主細胞中で自律的に複製でき、かつ１または少数の制限エンドヌクレアーゼ認識部位でベクターに必須の生物学的機能を失うことなく測定可能な様式でＤＮＡ配列を切断でき、更にその複製およびクローニングを起こすためにその認識部位へＤＮＡをスプライスできるという特徴を持つ、プラスミド、コスミドまたはファージＤＮＡまたはその他のＤＮＡ分子。クローニングベクターは、さらに、クローニングベクターで形質転換させた細胞の同定に使用するのに適したマーカーを含有し得る。マーカーは、例えば、テトラサイクリン耐性またはアンピシリン耐性である。発現ベクター。クローニングベクターに類似するが、宿主への形質転換後、ベクター内にクローン化された遺伝子の発現を高める能力があるベクター。クローン化遺伝子は、通常、プロモーター配列などのある種の制御配列の制御下に置かれる（即ち、“作動可能に連結”させる）。組換え宿主。発現ベクター、クローニングベクターまたはあらゆるＤＮＡ分子内に所望のクローン化遺伝子を含有する原核または真核微生物。用語“組換え宿主”は、遺伝子工学により宿主染色体またはゲノムに所望の遺伝子を含有させたような宿主細胞を含むことも意味する。宿主。複製可能な発現ベクター、クローニングベクターまたはあらゆるＤＮＡ分子のレシピエントであるあらゆる原核または真核微生物。このＤＮＡ分子は、構造遺伝子、プロモーターおよび／または複製起点を含有し得るが、これらに限定されない。プロモーター。一般に、開始コドンに近接して位置する遺伝子の５'領域として説明されるＤＮＡ配列。このプロモーター領域で、隣接する遺伝子の転写が開始される。遺伝子。ポリペプチドまたはタンパク質の発現に必要な情報を含むＤＮＡ配列。プロモーターおよび構造遺伝子、並びにタンパク質の発現に関連するその他の配列を含む。構造遺伝子。メッセンジャーＲＮＡに転写され、次いで特定のポリペプチドに特有のアミノ酸配列へと翻訳されるＤＮＡ配列。作動可能に連結。本明細書で使用する場合、プロモーターが構造遺伝子によりコードされるポリペプチドの発現の開始を制御する位置にあることを意味する。発現。発現は、遺伝子がポリペプチドを産生するプロセスである。それは、メッセンジャーＲＮＡ（mＲＮＡ）への遺伝子の転写およびかかるmＲＮＡのポリペプチドへの翻訳を含む。実質的に純粋。本明細書で使用する場合、“実質的に純粋”とは、所望の精製タンパク質が、自然界において所望のタンパク質に関連する細胞汚染物質で本質的に汚染されていないことを意味する。汚染性細胞成分には、これらに限定されないが、ホスフェート、エキソヌクレアーゼ、エンドヌクレアーゼまたは不要なＤＮＡポリメラーゼ酵素がある。プライマー。本明細書で使用する場合、“プライマー”とは、ＤＮＡ分子の増幅または重合化の際にヌクレオチドモノマーの共有結合により伸長する一本鎖オリゴヌクレオチドを表す。鋳型。本明細書で使用する“鋳型”という用語は、増幅、合成または配列決定される二本鎖または一本鎖ＤＮＡ分子を表す。二本鎖ＤＮＡ分子の場合、その鎖を変性させて第１および第２鎖を形成させた後に、これらの分子を増幅、合成または配列決定できる。ＤＮＡ鋳型の一部に相補的なプライマーを好適な条件下でハイブリダイズさせると、本発明のＤＮＡポリメラーゼが該鋳型またはその一部に相補的なＤＮＡ分子を合成できる。本発明によれば、新しく合成されたＤＮＡ分子は、元のＤＮＡ鋳型に等しいかまたはそれよりも短い長さであり得る。新しく合成されたＤＮＡ分子の合成または伸長中にミスマッチな組み込みが起こる結果、１または多数のミスマッチ塩基対が生じることがある。そのため、合成されたＤＮＡ分子は、ＤＮＡ鋳型と厳密に相補的である必要はない。組み込み。本明細書で使用する“組み込み”という用語は、ＤＮＡ分子またはプライマーの一部となることを意味する。増幅。本明細書で使用する“増幅”は、ＤＮＡポリメラーゼを用いてヌクレオチド配列コピー数を増やすためのインビトロ法を表す。核酸増幅の結果、ＤＮＡ分子またはプライマーへのヌクレオチドの組み込みが起こり、それによって、ＤＮＡ鋳型に相補的な新しいＤＮＡ分子が形成される。形成されたＤＮＡ分子およびその鋳型は、更なるＤＮＡ分子を合成するための鋳型として使用できる。本明細書で使用する場合、１回の増幅反応は何ラウンドものＤＮＡ複製からなることもある。ＤＮＡ増幅反応には、例えば、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）がある。１回のＰＣＲ反応は３０ないし１００“サイクル”のＤＮＡ分子の変性および合成からなることができる。オリゴヌクレオチド。“オリゴヌクレオチド”は、１ヌクレオチドのペントースの３'位と隣接ヌクレオチドのペントースの５'位との間のホスホジエステル結合によりつながれる共有結合ヌクレオチド配列を含んでなる合成または天然分子を表す。ヌクレオチド。本明細書で使用する“ヌクレオチド”は、塩基−糖−ホスフェートの組み合わせを表す。ヌクレオチドは、核酸配列（ＤＮＡおよびＲＮＡ）のモノマー単位である。“ヌクレオチド”の用語は、dＡＴＰ、dＣＴＰ、ｄＩＴＰ、dＵＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰなどのデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートまたはそれらの誘導体を含む。かかる誘導体には、例えば、[αＳ]dＡＴＰ、７−デアザ−dＧＴＰおよび７−デアザ−dＡＴＰがある。本明細書で使用するヌクレオチドの用語はまた、ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ddＮＴＰ）およびそれらの誘導体も表す。ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの例には、これらに限定されないが、ddＡＴＰ、ddＣＴＰ、ddＧＴＰ、ddＩＴＰ、ddＴＴＰがある。本発明によれば、“ヌクレオチド”は、未標識のものでもよく、またよく知られた技術により検出可能に標識されていてもよい。検出可能な標識には、例えば、放射性アイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識がある。熱安定性。本明細書で使用する“熱安定性”は、熱による不活性化に対して耐性であるＤＮＡポリメラーゼを表す。ＤＮＡポリメラーゼは、プライマーを５' →３'方向に伸長することにより、一本鎖ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子の形成を合成する。好中温性ＤＮＡポリメラーゼの場合、この活性は、熱処理により不活性化され得る。例えば、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼ活性は、酵素を９０℃の温度に３０秒間さらすことにより全体的に不活性化される。本明細書で使用する場合、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼ活性は、好中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも熱不活性化に対して耐性である。しかしながら、熱安定性ＤＮＡポリメラーゼは、熱不活性化に対して全体的に耐性である酵素を表すことを意味していないため熱処理によりＤＮＡポリメラーゼ活性がある程度低下することもある。熱安定性ＤＮＡポリメラーゼはまた、典型的に、好中温性ＤＮＡポリメラーゼよりも高い最適温度を有するものである。ハイブリダイゼーション。用語“ハイブリダイゼーション”および“ハイブリダイズする”は、２つの相補的二本鎖核酸分子（ＲＮＡおよび／またはＤＮＡ）の対形成を表す。本明細書で使用する場合、２つの核酸分子は、その塩基対形成が完全に相補的でなくても、ハイブリダイズできる。従って、塩基のミスマッチがあっても、当分野でよく知られている好適な条件を採用すれば２つの核酸分子のハイブリダイゼーションは妨げられない。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性。“３'→５'エキソヌクレアーゼ活性”は、当分野でよく知られた酵素活性である。この活性は、ＤＮＡポリメラーゼに付随することが多く、ＤＮＡ複製“修正”または校正メカニズムに関連すると考えられている。 “３'→５'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下したＤＮＡポリメラーゼ” は本明細書では（１）対応する未変異の野生型酵素の３'→５'エキソヌクレアーゼ活性の約１０％またはそれ以下、好ましくは約１％またはそれ以下を有する変異したＤＮＡポリメラーゼまたは（２）約１単位／mgタンパク質以下、または好ましくは約０.１単位／mgタンパク質またはそれ以下の３'→５'エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、のいずれかとして定義する。３'→５' エキソヌクレアーゼの活性単位は、“BRL 1989 Catalogue & Reference Guide" 、５頁に記載のように末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（ＴｄＴ）により［³Ｈ]dＴＴＰで標識したラムダＤＮＡ３'−末端のHhaＩフラグメントを用いてアッセイした、６０分３７℃で基質末端１０ナノモルを溶解する活性量と定義する。タンパク質は、Bradford,Anal.Biochem.72:248(1976)の方法により測定する。比較手段として、天然の野生型Ｔ５−ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＮＡＰ）またはpＴＴＱ１９−Ｔ５−２によりコードされるＴ５−ＤＮＡＰは約１０単位／mgタンパク質の比活性を有するのに対し、ｐＴＴＱ１９−Ｔ５−２（エキソ）によりコードされるＤＮＡポリメラーゼ（米国５，２７０，１７９）は約０. ０００１単位／mgタンパク質の比活性または非修飾酵素の比活性の０.００１％を有し、１０⁵倍低下した。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性。“５'→３'エキソヌクレアーゼ活性”もまた、当分野でよく知られた酵素活性である。この活性は、Ｅ.コリ PolＩおよび Pol IIIなどのＤＮＡポリメラーゼに付随することが多い。 “５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下したＤＮＡポリメラーゼ” は本明細書では（１）対応する未変異の野生型酵素の５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の約１０％またはそれ以下、好ましくは約１％またはそれ以下を有する変異したＤＮＡポリメラーゼまたは（２）約１単位／mgタンパク質以下、または好ましくは約０.１単位／mgタンパク質またはそれ以下の５'→３'エキソヌクレアーゼ比活性を有するＤＮＡポリメラーゼ、のいずれかとして定義する。３'→５'および５'→３'エキソヌクレアーゼ活性はいずれも、シーケンシングゲルにて観察できる。活性５'→3’エキソヌクレアーゼ活性は、伸長プライマーの５'末端からヌクレオチドを除去することにより、シーケンシングゲルにおいて不特定のラダー（ladder）を生じる。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性は、続くシーケンシングゲルにおける放射性標識プライマーのデグラデーションにより測定できる。こうして、これらの活性の相対量は、例えば、野生型と変異体ポリメラーゼを比較することにより、常用の実験のみを用いて測定できる。１．サーモトガＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼは、ＤＮＡポリメラーゼを産生するどのサーモトガ株からも単離できる。本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を単離するのに好ましい株は、サーモトガ・ネアポリターナ(Tne )およびサーモトガ・マリチーマ(Tma)である。本発明のＤＮＡポリメラーゼを単離するのに最も好ましいサーモトガ・ネアポリターナは、アフリカ大陸の硫気性温泉から単離された(Windberger等、Arch.Microbiol.151:506-512(1989))ものであり、また、Deutsche Sammlung von Microorganismen und ZellkullurenGmbH（ＤＳＭＺ：ドイツ微生物および細胞カルチャーコレクション）Mascheroder Weg 1b D-3814 Braunschweig,Germanyから寄託番号５０６８（１９８８年１２月１３日に寄託）として得ることもできる。本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子をクローニングするために、サーモトガ細胞から得られたポリメラーゼ遺伝子を含有する単離したＤＮＡを用いて、ベクター中に組換えＤＮＡライブラリーを構築する。当分野でよく知られているあらゆるベクターを使用して、野生型または変異体サーモトガＤＮＡポリメラーゼをクローニングできる。しかしながら、使用したベクターは、組換えＤＮＡライブラリーを形質転換させる宿主と適合性（compatible）でなければならない。プラスミドライブラリーを構築するための原核生物ベクターには、Ｅ.コリ内で複製できるようなプラスミド、例えば、pＢＲ３２２、ＣolＥ１、pＳＣ１０１、pＵＣ−ベクター(pUC１８、pＵＣ１９等:Molecularcloning,A lllaboratory M anual,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(19 82);およびSambrook等：Molecular Cloning,A Laboratory Manual（第２版）Col d Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,New York(1989))がある。Bacillus属のプラスミドには、pＣ１９４、pＣ２２１、pＣ２１７等がある。このようなプラスミドは、Glyczan,T.によりThe Molecular Biology Bacilli, Academic Press,York(1982),307-329に開示されている。適切なStreptomyces属のプラスミドには、ｐＩＪ１０１（Kendall等、J.Bacteriol 169:4177-4183(198 7))がある。シュードモナス属のプラスミドは、John等（Rad.Insec.Dis.8:693-7 04(1986))およびIgaki(Jpn.J.Bacteriol.33:729-742(1978))により概説されている。広い宿主範囲のプラスミドまたはコスミド、例えば、pＣＰ１３（DarzinsおよびChakrabarbary,J.Bacterio1.,159:9-18,1984）もまた、本発明に使用できる。本発明の遺伝子をクローニングするのに好ましいベクターは、原核生物ベクターである。好ましくは、pＣＰ１３およびpＵＣベクターを用いて本発明の遺伝子をクローニングする。本発明の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングするのに好ましい宿主は、原核生物宿主である。最も好ましい原核生物宿主は、Ｅ.コリである。しかしながら、本発明の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子は、これらに限定されないが、エシェリシア(Echerichia)、バシラス(Bacillu s)、ストレプトマイセス(Streptomyces)、シュードモナス(Pseudomonas)、サルモネラ(Salmonella)、サラチア(Serratia)およびプロテウス(Proteus)を含むその他の原核生物宿主内でクローニングすることもできる。特に興味深い細菌宿主には、Ｅ.コリＤＨ１０Ｂがあり、これは、Life Technologies,Inc.(LTI)(Gait hersburg,MD）から入手できる。本発明の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼのクローニングおよび発現用の真核生物宿主には、酵母、カビおよび哺乳動物細胞がある。かかる真核細胞における所望のＤＮＡポリメラーゼの発現には、真核生物のプロモーターを含む真核生物の調節領域を使用する必要があり得る。真核細胞において本発明の野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子をクローニングおよび発現させることは、よく知られた真核生物ベクター系を用いてよく知られた技術により達成できる。一旦、ＤＮＡライブラリーを特定のベクターにて構築してから、よく知られた技術により適切な宿主を形質転換させる。形質転換コロニーをペトリ皿当たりおよそ２００−３００コロニーの密度でプレートする。次いで、形質転換Ｅ.コリコロニーをニトロセルロース膜に移すことによりコロニーを熱安定性ＤＮＡポリメラーゼの発現についてスクリーニングする。移した細胞をニトロセルロース上で生育させた（およそ１２時間）後、標準技術により細胞を溶解させ、次いで、膜を９５℃で５分間処理して、内生のＥ.コリ酵素を不活性化する。宿主ポリメラーゼを不活性化するために、その他の温度を使用することもあり、これは使用した宿主およびクローニングするＤＮＡポリメラーゼの温度安定性によって変わる。それから、よく知られた技術を用いてＤＮＡポリメラーゼ活性の存在をアッセイすることにより、安定なＤＮＡポリメラーゼ活性を検出する。Sagner等、Ge ne 97:119-123(1991)、その全体を本明細書の一部とする。本発明のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子は、Sagner等、前掲に記載の方法を用いてクローニングできる。 Tne ＤＮＡポリメラーゼをコードする野生型遺伝子を含有する組換え宿主、Ｅ.コリＤＨ１０Ｂ（pＵＣ−Tne）は１９９４年９月３０日、アメリカ合衆国６１６０４イリノイ州、ペオリア、ノース・ユニバーシティー・ストリート１８１５番のアグリカルチュラル・リサーチ・カルチャー・コレクション（ＮＲＲＬ）に寄託番号ＮＲＲＬＢ−２１３３８として寄託された。Tma ＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子もまた、クローニングおよび配列決定されている（米国特許５,３７４,５５３、その全体を出典明示により本明細書の一部とする）。サーモトガ（例えば、TneまたはTma）ＤＮＡポリメラーゼが３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する場合、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより、その活性は低下、実質的に低下または除去され得る。このような変異には、点変異、フレーム・シフト変異、欠失および挿入がある。好ましくは、当分野でよく知られた技術（Sambrook等（１９８９）：Molecular Cloning,A Laboratory Manual(第２版)、Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor, N.Y.）を用いて３'→５'エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺伝子の領域を変異または欠失させる。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性は、３'→５'エキソヌクレアーゼドメイン内に部位特異的変異を起こすことにより、低下または減少させることができる。以下参照。本発明の特定の実施態様では、Tne ＤＮＡポリメラーゼのAsp³²³（配列番号３）を別のアミノ酸、好ましくはAla³²³に変えて、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下させる。TmaのAsp³²³を別のアミノ酸、好ましくはAlaに変えて、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を実質的に低下させることもできる。ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性は、ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を変異させることにより、低下または除去させることができる。このような変異には、点変異、フレーム・シフト変異、欠失および挿入がある。好ましくは、当分野でよく知られた技術を用いて５'→３'エキソヌクレアーゼ活性をコードする遺伝子の領域を欠失させる。本発明の実施態様では、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性と関連する６つの保存アミノ酸のいずれか１つを変異させることができる。Tne ＤＮＡポリメラーゼに関するこれらの保存アミノ酸の例には、As p⁸、Glu¹¹²、Asp¹¹⁴、Asp¹¹⁵、Asp¹³⁷およびAsp¹³⁹がある。その他の変異可能な部位は、Gly¹⁰²、Gly¹⁸⁷およびGly¹⁹⁵である。本発明は、広義には、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の低下または除去をもたらすＤＮＡポリメラーゼの変異を指向するものである。その他の特定の変異は、次のアミノ酸に対応する。Ｅ.コリ polＩ：Asp¹³，Glu¹¹³，Asp¹¹⁵，Asp¹¹⁶，Asp¹³⁸およびAsp¹⁴⁰ Taq pol： Asp¹⁸，Glu¹¹⁷，Asp¹¹⁹，Asp¹²⁰，Asp¹⁴²およびAsp¹⁴⁴ Tma pol： Asp⁸，Glu¹¹²，Asp¹¹⁴，Asp¹¹⁵，Asp¹³⁷およびAsp¹³⁹ Taq ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国５,０７９,３５２に番号付けされているとおりである。サーモトガ・マリチーマ（Tma）ＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸残基は、米国５,３７４,５５３に番号付けされているとおりである。その他のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列を比較することにより、対応する部位を容易に位置付けでき、かつ５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠く対応するＤＮＡポリメラーゼのコード配列を調製するためにＤＮＡを変異させることができる。そのように変異させることができるその他のＤＮＡポリメラーゼの例には次のものがある：Ｓ.ニューモニアエ(S.pneumoniae)、Ｔ.フラブス(T.flavus)、Ｄ.ラジオディラムス(D.radiodurans)、Ｂ.カルドテナクス(B.caldotenax)の同等物は、Gutman and Mintonから得られた。Ｔ.サーモフィラス(T.thermophilus)の同等物は、国際特許第ＷＯ９２／０６２００から得られた。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を破壊するためには、異なる特性を有するアミノ酸を選択する。例えば、Aspなどの酸性アミノ酸を、塩基性、中性または極性であるが非電荷のアミノ酸、例えば、Lys、Arg、His(塩基性)；Ala、Val、Leu 、ＩleN Pro、Met、Phe、Trp（中性）；またはGly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGln（極性であるが非電荷）に変えることができる。GluをAsp、Ala、Val、L eu、Ｉle、Pro、Met、Phe、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGlnに変えてもよい。具体的には、対応する位置でのAla置換は５'エキソ活性を破壊すると期待される。好ましくは、オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発法を用いて、コードＤＮＡ分子に沿って定めたあらゆる部位での考えられる全ての種類の塩基対変化を見込んだ変異体ＤＮＡポリメラーゼを作る。一般に、この技術は、対象となるＤＮＡポリメラーゼをコードする一本鎖ヌクレオチド配列に（１またはそれ以上のミスマッチ以外は）相補的なオリゴヌクレオチドをアニーリングすることを含む。この場合、ミスマッチのオリゴヌクレオチドをＤＮＡポリメラーゼにより伸長させて、一の鎖上に所望の配列変化を有する二本鎖ＤＮＡ分子を作る。鎖変化は、もちろん、アミノ酸の欠失、置換または挿入をもたらすことができる。次いで、二本鎖ポリヌクレオチドを適切な発現ベクターに挿入でき、そうして変異体ポリペプチドを産生できる。上記オリゴヌクレオチド指向突然変異誘発は、もちろんＰＣＲによっても実施できる。その他の実施態様では、ＤＮＡポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼドメイン全体をタンパク質分解切断または遺伝子工学により除去できる。例えば、唯一（ユニーク）のSphＩ制限部位を用いて、Tne ＤＮＡポリメラーゼの２１９アミノ末端アミノ酸をコードするヌクレオチドを欠くクローンを得ることができる。かかるクローンの例は、pＴＴＱTne５３５ＦＹおよびpＴＴＱTne５ＦＹである。あるいは、２１９アミノ末端アミノ酸より小さいものを除去してもよく、例えば、常用の実験法を用いて、Tne ＤＮＡポリメラーゼをコードするＤＮＡをエキソヌクレアーゼで処理し、フラグメントを単離し、そのフラグメントをクローニング媒体へライゲートし、そのクローニング媒体で細胞をトランスフェクションし、そして、形質転換体をＤＮＡポリメラーゼ活性および５'→３'エキソヌクレアーゼ活性の欠乏についてスクリーニングすることによる。サーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体を作成して、そのポリメラーゼをジデオキシヌクレオチドなどの非天然ヌクレオチドに対して非識別性にすることもできる。サーモトガポリメラーゼのＯ−ヘリックス内の変化、例えば、その他の点変異、欠失および挿入を起こして、そのポリメラーゼを非識別性にすることもできる。例えば、この特性を有する１つのTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、図５Ａおよび５Ｂで番号付けた６７位および配列番号３の７３０位のアミノ酸Pheの代わりにTyrのような非天然アミノ酸を用いる。Ｏ−リックス領域は、配列番号３の７２２−７３５位のアミノ酸、または図５Ａおよび５Ｂで番号つけた５９−７２位のアミノ酸に対応する１４アミノ酸配列である。このＯ−ヘリックスは、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ、但しＸはいかなるアミノ酸でもよい、と定義され得る。識別活性を与えるのに最も重要なアミノ酸には、Arg、LysおよびPheがある。７２２位のArgの代わりに使用できるアミノ酸は、独立して、ASP、Glu、Ala、Val、Leu、Ｉle、Pro、Met、Phe、TrP、Gly 、Ser、Thr、CyS、Tyr、Gln、Asn、LysおよびHisから選択される。７３０位のPh eの代わりに使用できるアミノ酸には、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Ala、Val、Le u、Ile、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、Cys、Tyr、AsnまたはGlnがある。配列番号３の７２６位のLysの代わりに使用できるアミノ酸には、Tyr、Arg、His、As p、Glu、Ala、Val、Leu、Ｉle、Pro、Met、Trp、Gly、Ser、Thr、CyS、Phe、Asn またはGlnがある。好ましい変異体には、Tyr⁷³⁰、Ala⁷³⁰、Ser⁷³⁰およびThr⁷³⁰ がある。このようなTne変異体は、本明細書に記載したようによく知られた部位指向突然変異誘発法により調製できる。実施例１０も参照。対応する変異体は、Arg⁷²²、Lys⁷²⁶およびPhe⁷³⁰を含む、Tma ＤＮＡポリメラーゼからも調製できる。最も好ましい変異体には、Phe⁷³⁰からTyr⁷³⁰、Ser⁷³⁰、 Thr⁷³⁰およびAla⁷³⁰がある。２．サーモトガＤＮＡポリメラーゼの発現増加本発明の野生型または変異体サーモトガＤＮＡポリメラーゼの発現を最適化するために、誘導または構成プロモーターがよく知られており、組換え宿主内でポリメラーゼ構造遺伝子を高レベルで発現させるのに使用できる。同様に、当分野でよく知られている高コピー数ベクターもまた、高レベルの発現を達成するのに使用できる。誘導的高コピー数を有するベクターもまた、組換え宿主内でのサーモトガＤＮＡポリメラーゼの発現を高めるのに有用である。所望の構造遺伝子を原核細胞（例えば、Ｅ.コリ(Ｅ.coli)、Ｂ.ズブチリス(Ｂ．subtilis)、Ｐ.シュードモナス(Ｐ.seudomonas)等）内で発現させるためには、所望の構造遺伝子を機能性原核細胞プロモーターに作動可能に連結させる必要がある。しかしながら、天然サーモトガプロモーターは原核生物宿主内でそのポリメラーゼ遺伝子を発現させるように機能できる。そのため、天然サーモトガプロモーターまたはその他のプロモーターを用いてＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現させることができる。このような他のプロモーターは、発現を高めるために使用することもでき、構成または調節（即ち、誘導または抑制解除）プロモーターのいずれかであり得る。構成プロモーターの例には、λバクテリオファージのin tプロモーターおよびpＢＲ３２２のβ−ラクタマーゼ遺伝子のblaプロモーターがある。原核生物の誘導プロモーターの例には、λバクテリオファージの主たる右プロモーターおよび左プロモーター(Ｐ_RおよびＰ_L)、Ｅ.コリのtrp、recA、la cZ、lacＩ、tet、gal、trcおよびtacプロモーターがある。Ｂ.ズブチリスのプロモーターには、α−アミラーゼ(Ulmanen等、J.Bacteriol 162:176-182(1985))およびバシラスバクテリオファージプロモーター(Bryczan.T．：The Molecular Biology Of Bacilli,Academic Press,New York(1982))がある。ストレプトマイセスプロモーターは、Ward等、Mol.Gen.Genet.203:468478(1986)に記載されている。原核生物プロモーターはまた、Glick，J.Ind.Microbiol.1:277-282(1987)； Cenatiempto,Y.,Biochimie 68:505-516(1986)；およびGottesman,Ann.Rev.Genet .18:415-442(1984)に概説されている。原核細胞内での発現には、遺伝子コード配列の上流のリボソーム結合部位の存在も必要とされる。このようなリボソーム結合部位は、例えば、Gold等、Ann.Rev.Microbiol.35:365404(1981)に開示されている。真核細胞内でのサーモトガ（例えば、TheおよびTma）ＤＮＡポリメラーゼの発現を高めるためには、よく知られた真核生物プロモーターおよび宿主が使用できる。しかしながら、好ましくは、サーモトガＤＮＡポリメラーゼ発現増加は原核生物宿主にて遂行される。この酵素を過剰発現させるのに好ましい原核生物宿主は、Ｅ.コリである。３．サーモトガＤＮＡポリメラーゼの単離および精製本発明の酵素（サーモトガＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体）は好ましくはクローン化ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有および発現する組換え宿主の発酵により産生する。しかしながら、本発明の野生型および変異体ＤＮＡポリメラーゼは、本発明のポリメラーゼを産生するあらゆるサーモトガ株から単離できる。このポリメラーゼのフラグメントもまた、本発明に包含される。かかるフラグメントには、タンパク質分解フラグメントおよびポリメラーゼ活性を有するフラグメントがある。サーモトガによりまたはクローン化サーモトガＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を含有する宿主により同化され得るあらゆる栄養素を培地に添加できる。最適培養条件は、使用した株および培地組成によってその場その場で選択すべきである。生育培地には、発現させる所望の遺伝子を含有するベクターＤＮＡを確実に保存するために抗生物質を添加してもよい。サーモトガ・ネアポリターナの培養条件は、例えば、Huber等、Arch.Microbio1.144：324-333(1986)に記載されている。培地処方もまた、ＤＳＭまたはＡＴＣＣカタログおよびSambrook等：Molecular Clon ing,a Laboratory Manual(第２版),Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されている。本発明のＤＮＡポリメラーゼを産生するサーモトガおよび組換え宿主細胞は液体培地から、例えば遠心により分離できる。一般に、集めた微生物細胞は適切な緩衝液に分散させ、次いで、超音波処理により、またはその他のよく知られた操作により破壊して、緩衝溶液により酵素を抽出させる。超遠心または遠心により細胞破片を除去した後、ＤＮＡポリメラーゼを標準タンパク質精製技術、例えば、抽出、沈殿、クロマトグラフィー、アフィニティークロマトグラフィー、電気泳動またはその他により精製できる。精製中にＤＮＡポリメラーゼの存在を検出するためのアッセイは、当分野でよく知られており、これらの酵素の存在を測定するために常用の生化学的精製法の最中に使用できる。４．サーモトガＤＮＡポリメラーゼの使用本発明の野生型および変異体サーモトガＤＮＡポリメラーゼ（例えば、TmaおよびTne）はよく知られたＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識、ＤＮＡ増幅およびcＤＮＡ合成反応に使用できる。３'→５'エキソヌクレアーゼ活性のないまたは実質的に低下したサーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性のないまたは実質的に低下したサーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体または dＮＴＰおよびddＮＴＰに対して非識別性の酵素を作るＯ−ヘリックス中に１またはそれ以上の変異（例えば、配列番号３のPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰変異）を含有するサーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体は、特にＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識およびＤＮＡ増幅反応およびcＤＮＡ合成に有用である。更に、これらの特性の２つまたはそれ以上を含有するサーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体もまた、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識およびＤＮＡ増幅またはcＤＮＡ合成反応に有用である。よく知られているように、配列決定反応（等温ＤＮＡシーケンス法およびＤＮＡのサイクルシーケンス法）はＤＮＡポリメラーゼの使用を必要とする。ジデオキシ媒介配列決定は、ＤＮＡポリメラーゼにより伸長させる特定のポリマーを使用するチェーン・ターミネーション技術の使用、塩基特異的鎖伸長ターミネーターおよび元のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように新しく合成された鎖伸長停止ＤＮＡ分子をサイズ毎に分離するためのポリアクリルアミドゲルの使用を伴う。具体的には、ＤＮＡ分子は、それぞれが異なる塩基特異的ターミネーターを含有する４つの別個のＤＮＡ配列反応を用いて配列決定する。例えば、第１反応はＧ−特異的ターミネーターを含有し、第２反応はＴ− 特異的ターミネーターを含有し、第３反応はＡ−特異的ターミネーターを含有し、第４反応はＣ−特異的ターミネーターを含有し得る。好ましいターミネーターヌクレオチドには、ddＡＴＰ、ddＴＴＰ、ddＧＴＰ、ddＩＴＰおよびddＣＴＰなどのジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート（ddＮＴＰ）がある。ジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの類似体もまた使用でき、当分野でよく知られている。ＤＮＡ分子を配列決定する場合、ddＮＴＰはデオキシリボース塩基の３'位のヒドロキシル残基を欠くため、それらをＤＮＡポリメラーゼにより伸長ＤＮＡ鎖に組み込むことができても、３'−ヒドロキシル残基がないので次のホスホジエステル結合が形成できず、ＤＮＡ分子伸長の停止をもたらす。従って、少量の１ ddＮＴＰが配列決定反応混合物中に含まれる場合、鎖伸長と塩基特異的停止とが競合し、配列決定するＤＮＡ鋳型よりも短い長さの合成ＤＮＡ分子集団が生じる。４つの別個の酵素反応において４つの異なるddＮＴＰを用いることにより、合成ＤＮＡ分子集団はサイズ毎に分離できるので、元のＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できる。ジデオキシヌクレオチドによるＤＮＡ配列決定はよく知られており、Sambrook等：Molecular Cloning,a Laboratory Manua l,Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.(1989)に記載されている。容易に認識されるとおり、本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体は、かかる配列決定反応に使用することもできる。よく知られているように、典型的に配列決定反応は検出可能に標識したヌクレオチドを含む。多数の標識ヌクレオチドが配列決定（または標識）反応に使用でき、これらに限定されないが、放射性アイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識がある。本発明の野生型および変異体ＤＮＡポリメラーゼは、配列決定（または標識）反応中にαＳヌクレオチド（[αＳ]dＡＴＰ、[αＳ]dＴＴＰ、[αＳ]dＣＴＰおよび[αＳ]dＧＴＰ）を組み込むのに有用であり得ることが分かっている。例えば、[α³⁵Ｓ]dＡＴＰは、配列決定反応において通常使用される検出可能に標識されたヌクレオチドであるが、これは、本発明のTne ＤＮＡポリメラーゼを用いると、Taq ＤＮＡポリメラーゼを用いるよりも３倍効率良く組み込まれる。従って、本発明の酵素は、[α³⁵Ｓ]dＮＴＰを用いてＤＮＡ分子を配列決定するまたは標識するのに特に適している。よく知られたＤＮＡ増幅技術であるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）は、ＤＮＡポリメラーゼおよびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを用いて標的ＤＮＡ鋳型を増幅するプロセスである。かかるＰＣＲ反応では、増幅させるＤＮＡ分子の第１鎖の３'末端（または３'末端近く）に相補的な第１プライマーと増幅させるＤＮＡ分子の第２鎖の３'末端（または３'末端近く）に相補的な第２プライマーの２つのプライマーをそのそれぞれのＤＮＡ鎖にハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーション後、ＤＮＡポリメラーゼはデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートの存在下で、増幅させるＤＮＡ分子の第１鎖に相補的な第３のＤＮＡ分子と第２鎖に相捕的な第４のＤＮＡ分子を合成できる。この合成により２つの二本鎖ＤＮＡ分子が生じる。その後、このような二本鎖ＤＮＡ分子はＤＮＡポリメラーゼ、プライマーおよびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを提供することにより、更なるＤＮＡ分子の合成用のＤＮＡ鋳型として使用できる。よく知られているように、元の反応を（過剰のプライマーおよびデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを用いて）“循環（サイクリング）”させて変性および合成工程を複数回行わせることにより、更に合成を行う。典型的には、一本鎖ＤＮＡ鋳型を形成するための二本鎖ＤＮＡ分子の変性は高温で行う。本発明の野生型および変異体サーモトガＤＮＡポリメラーゼは、熱安定性のＤＮＡポリメラーゼであるため、ＤＮＡ増幅反応の際のかかる熱循環に耐えるものである。よって、本発明の野生型および変異体ＤＮＡポリメラーゼは、特に、増幅の際にＤＮＡ分子を変性させるために高温を使用するＰＣＲ反応に理想的に適している。本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼおよび変異体（例えば、TneおよびＴm a）はまた、mＲＮＡ鋳型からcＤＮＡを製造するのにも使用できる。米国特許第5 ,405,776および5,244,797参照、その開示内容を出典明示により本明細書の一部とする。よって、本発明は、（ａ）mＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーまたはその他の相補的プライマーと接触させてハイブリッドを形成させ、（ｂ）工程（ａ）で形成させた該ハイブリッドを本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼまたは変異体および４つのdＮＴＰと接触させ、それによって、cＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得ること、を含んでなる、mＲＮＡからcＤＮＡを製造する方法にも関する。工程（ｂ）の反応混合物が産生するcＤＮＡに相補的な好適なオリゴヌクレオチドを更に含んでなる場合、第１鎖合成に続いてdsＤＮＡを得ることも可能である。よって、本発明は、本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼおよびその変異体を用いてdsＤＮＡを製造する方法にも関する。５．キット本発明の野生型および変異体サーモトガＤＮＡポリメラーゼはキットの製造に適している。野生型または変異体ＤＮＡポリメラーゼを含んでなるキットは、キットの内容物によるが、よく知られた技術により、ＤＮＡ分子の検出可能標識、ＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ分子増幅またはcＤＮＡ合成に使用できる。米国特許第4 ,962,020号、第5,173,411号、第4,795,699号、第5,498,523号、第5,405,776号および第5,244,797号参照。このようなキットは、閉鎖空間内に１またはそれ以上の容器手段、例えば、バイアル、試験管およびその他を入れるために仕切りを設けた収容手段を含む。このような各容器手段にはＤＮＡ配列決定、ＤＮＡ標識、ＤＮＡ増幅またはcＤＮＡ合成を実施するのに必要な成分または成分の混合物が含まれる。ＤＮＡ配列決定用キットは多くの容器手段からなる。第１容器手段には、例えば、サーモトガＤＮＡポリメラーゼまたはその変異体の実質的に精製したサンプルを入れる。第２容器手段には、ＤＮＡ鋳型に相補的なＤＮＡ分子を合成するのに必要な１種または多種のヌクレオチドを入れることができる。第３容器手段には１種または多種の異なるジデオキシヌクレオシドトリホスフェートを入れることができる。第４容器手段にはピロホスファターゼを入れる。上記の容器手段に加えて、１または多数のＤＮＡプライマーからなる更なる容器手段をキット内に含めてもよい。ＤＮＡ増幅用に使用されるキットは、例えば、本発明の実質的に純粋な変異体または野生型サーモトガＤＮＡポリメラーゼからなる第１容器手段と一本鎖型のヌクレオチドまたはヌクレオチドの混合物からなる１または多数の更なる容器手段からなるであろう。ＤＮＡ増幅用キットには様々なプライマーを含めてもよく、また含めなくても良い。 cＤＮＡを合成するためのキットは、野生型または本発明の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼを含む第１のコンテナー手段を含み、第２のコンテナー手段は、４つのdＮＴＰを含み、第３のコンテナー手段は、オリゴ（ｄＴ）プライマーを含む。米国特許第５,４０５,７７６号および第５,２４４,７９７号参照。本発明のサーモトガＤＮＡポリメラーゼがまたdsＤＮＡの製造が可能であるため、第４のコンテナー手段は、第１の鎖cＤＮＡと相補的な適当なプライマーを含み得る。もちろん、これらの試薬の１個またはそれ以上を一試験管で合わせることも可能である。作業濃度でのこのような調剤の詳細は、１９９６年８月１４日に出願され、“核酸増幅および配列決定のための安定な組成物”と題する特許出願に詳述され、その内容は、その全体を引用して本明細書に明確に包含させる。所望により、本発明のキットはまたＤＮＡ分子の合成または配列形成中に使用し得る検出可能に標識したヌクレオチドを含むコンテナー手段も含み得る。多くの標識の一つをこのようなヌクレオチドの検出に使用し得る。例としての標識は、放射性アイソトープ、蛍光標識、化学発光標識、生物発光標識および酵素標識を含むが、これらに限定されない。６．サーモトガＤＮＡポリメラーゼの利点本発明のサーモトガＤＮＡは、ＤＮＡ配列形成において卓越した利点がある。例えば、一本伸長配列形成において本発明のTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体を使用した場合、それらは強い、明らかな³⁵Ｓ−標識配列形成を発生し、背景割合ーにおける誤った停止を減少し、高温配列形成反応を可能にする。本発明のTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体による優れた³⁵Ｓ取り込みは、鋳型要求性を１０倍減少でき、³²Ｐより鋭いバンドを提供し、³²Ｐより低いエネルギー放射を除去し、³² Ｐより長い貯蔵寿命を有する。更に、Tneポリメラーゼ変異体は、長い配列読み取りを製造し、より正確な配列解釈を提供する。加えて、この高温性ポリメラーゼでの７０℃の反応温度の使用は、構造含有およびＧＣ−に富む鋳型の配列形成効率を増加させる。修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ(Sequenase(登録商標))と比較して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、構造含有およびＧＣ−に富む鋳型の配列形成効率を改善し、標識および伸長のためのインキュベーション時間をより短くし、１０分の１の鋳型の量から完全な長さの配列を得ることが可能となる。他のポリメラーゼに関して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、適当な反応条件下で、優れた³⁵Ｓ− dＮＴＰ取り込みのため、より同一なバンド強度を提供し、長い、より正確な配列読み取りを与え、弱いまたは欠失“ドロップアウト”バンドが存在せず、構造含有およびＧＣ−に富む鋳型の増加した配列形成効果を示し、ホモポリマー含有鋳型からの配列人工物を示さず、より短いフィルム暴露および／またはより短い鋳型インプットを提供する。サイクルシーケンス法に関して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、適当な条件下で、強い、明らかな³⁵Ｓ−標識配列を製造し、背景割合に対する配列シグ停止を減少し、高温反応を可能にする。Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体はまた優れた³⁵S dＡＴＰ取り込みを可能にし、従って、短いフィルム暴露および／またはより短い鋳型インプットを提供し、³²Ｐより鋭いバンドを提供し、³²Ｐより低いエネルギー照射を放出し、³²Ｐより長い貯蔵寿命を有する。Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、また長い配列読み取りを提供し、より正確な配列解釈を与える。プライマーの³²Ｐ末端標識は、より純粋でないＤＮＡからの少ない背景からデータを製造し、５fmole（０.０１μg）程少ないＤＮＡを必要とする。サイクルシーケンス法に関して、変異体Taq ＤＮＡポリメラーゼ(ThermoSeque nase(登録商標))と比較して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は３倍強い³⁵Ｓ− 標識配列を、他に２時間のサイクル標識段階無しに、³⁵Ｓ標識のために設計した特別なプライマー無しに製造し、ＰＣＲ産物の配列形成を、プライマーを使用して直接可能にする。SequiTherm（登録商標）と比較して、Tne ＤＮＡポリメラーゼは３倍強い³⁵Ｓ標識配列を製造し、より同一なバンド強度を与え、より長くより正確な配列読み取りを与え、少ない鋳型および少ないプライマーを必要とし、ホモポリマーを含む鋳型から配列人工物を提供しない。種々の他のポリメラーゼ（例えば、Tth ＤＮＡポリメラーゼ）と比較して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、適当な条件下で、３倍強い³⁵Ｓ標識配列を製造し、より同一なバンド強度を与え、より長くより正確な配列読み取りを与え、弱いまたは欠失“ドロップアウト”バンドを与えず、構造含有およびＧＣ−に富む鋳型の配列形成効率を改善し、ホモポリマー領域を通して含む、配列形成ラダーにおける誤った停止を減少する。蛍光配列形成に関して、Tne ＤＮＡ変異体ポリメラーゼは、色素プライマーおよび色素ターミネーターを容易に受け入れ、背景割合に対して配列シグナルをＮＡポリメラーゼ変異体は、また長い配列読み取りを提供し、より正確な配列解析を提供し、異種混合物中の塩基対の定量を提供する。Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体が色素ターミネーターの良好な取り込みを提供するため、このような色素ターミネーターは５００倍減少できる。更に、増加したシグナルは、塩基招集を改善し、配列のための経費および時間を削減し、ゲル導入前の過剰な色素除去の必要性を排除し、より同一なバンド強度を提供する。色素プライマーの効率的使用は、不純ＤＮＡから少ない背景でデータを製造し、０.６μg程少ないdsＤＮＡ（２本鎖ＤＮＡ）を必要とする。蛍光配列形成におけるThermo Sequenase（登録商標）およびAmpliTaq ＦＳ（登録商標）の使用に関して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、色素ターミネーター配列形成においてより同一なバンド強度を提供し、色素プライマーと同等の結果を得る。SequiTherm（登録商標）に関して、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、色素ターミネーターおよび色素プライマーの両方でより長い、より正確な配列形成読み取りを与えるより同一なバンド強度を与え、５００倍少ない色素ターミネーターを使用し、色素ターミネーターの反応後除去を排除し、１０倍少ない鋳型を必要とし、色素プライマーを使用した異種混合物における塩基の定量を可能にする。蛍光配列形成における、AmpliTaq（登録商標）およびAmpliTaqＣＳ（登録商標）のような、種々の他の酵素の使用に関して、変異Tne ＤＮＡポリメラーゼは、適当な反応条件下、色素ターミネーターおよび色素プライマーの両方で、より同一なバンド強度およびより正確な配列読み取りを提供し、弱いまたは欠失“ドロップアウト”バンドを与えず、低い背景および低い誤った停止をし、５００倍少ない色素ターミネーターを使用し、色素ターミネーターの反応後除去を排除し、１０倍少ない鋳型を必要とし、異種混合物における塩基の定量を可能にする。図３に示すように、Tne ＤＮＡポリメラーゼは、α−チオdＡＴＰを、TaqＤＮＡポリメラーゼの割合の３倍取り込む。しかしながら、驚くべきことに、[α−³ ⁵ Ｓ]dＡＴＰおよびTne ＤＮＡポリメラーゼの変異体を使用した配列形成反応において、α−チオdＡＴＰをdＡＴＰの代わりに使用した場合、得られる配列形成バンドシグナル強度は、約８−１０倍増加する。ｄＡＴＰを使用した場合、見られる弱いシグナルは、混合プールからの、dＡＴＰへのα−チオdＡＴＰより強い、ＤＮＡポリメラーゼの取り込み指向性を反映する。dＡＴＰの量を単に減少することによるシグナル強度を改善する試みは、多くの誤った停止を含む非常に質の悪い配列をもたらす。[α−³²Ｐ]dＡＴＰおよびdＡＴＰの低濃度を使用した並行実験は、同様な質の悪い配列を製造し、ヌクレオチド濃度不均衡が、酵素の不十分な働きをもたらしたことを示す。[α−³⁵Ｓ]dＡＴＰと混合したα−チオdＡＴＰを使用することにより、４つのヌクレオチド濃度はシグナルまたは配列の質を低下させることなく、一定に保った。本発明を一般的に記載しているが、説明のために提供し、特記しない限り本発明を限定する意図はない、以下の実施例を参考にしてより容易に理解できよう。実施例１：細菌株および生育条件サーモトガ・ネアポリターナＤＳＭＮｏ．５０６８を、ＤＳＭカタログに記載のような嫌気的条件下で(培地を窒素でスパーギングしながら、レサズリン、Ｎa₂Ｓおよび硫黄顆粒添加)、８５℃で油浴中、１２から２４時間生育させた。細胞を、ブロスをワットマン１番濾紙を通して濾過して回収した。懸濁液を氷浴に回収し、次いで冷蔵庫中、８,０００rpmで２０分遠心した。細胞ペーストを−７０℃で、全ゲノムＤＮＡ単離前に貯蔵した。Ｅ．コリ株を２ＸＬＢブロス基本（Lennox Ｌブロス基本：ＧＩＢＣＯ／ＢＲＬ）培地で生育させた。形質転換細胞を、ＳＯＣ（リットル当たり２％トリプトン、０.５％酵母抽出物、酵母１０mＭＮａＣｌ,，２.５mＭＫＣｌ、２０mＭグルコース、１０mＭＭｇＣｌ₂および１０mＭＭｇＳＯ₄）中で、プレーティング前にインキュベートした。適当な場合、抗生物質添加は２０mg／ｌテトラサイクリンおよび１００mg／ｌアンピシリンであった。Ｅ.コリ株ＤＨ１０Ｂ(Lorow et al.Focus 12：19-20(1990))を宿主株として使用した。的確なＤＨ１０Ｂは、Li fe Technologies，Inc.(LTI)(Gaithersburg，MD)から得られ得る。実施例２：ＤＮＡ単離サーモトガ・ネアポリターナ染色体ＤＮＡは１．１ｇの細胞から、細胞を２．５ml ＴＮＥ（５０mM トリス−ＨＣｌ、pＨ８.０、５０mＭＮａＣｌ、１０mＭＥＤＴＡ）中に懸濁し、１％ＳＤＳで１０分、３７℃で処理することにより単離した。ＤＮＡを融解細胞を一晩４℃で穏やかに揺らすことによりフェノールで抽出した。翌日、融解細胞をクロロホルムイソアミルアルコールで抽出した。得られる染色体ＤＮＡを更にＣｓＣｌ密度勾配により更に精製した。密度勾配から単離した染色体ＤＮＡを３回イソプロパノールで抽出し、一晩、１０mＭトリス− ＨＣｌ（pＨ８.０）および１mＭＥＤＴＡ（ＴＥ）含有緩衝液に対して透析した。実施例３：ゲノムライブラリーの構築実施例２で単離した染色体ＤＮＡを、プラスミドpＣＰ１３にゲノムライブラリーを構築するために使用した。簡単に、それぞれ１０μgのサーモトガ・ネアポリターナ染色体ＤＮＡを含む１０試験管を、０．０１から１０単位のSau３Ａ１で１時間、３７℃で消化させた。消化ＤＮＡの一部を、アガロース（１.２％）ゲルで試験し、消化の程度を測定した。５０％より少ない消化のサンプルをプールし、エタノール沈殿してＴＥに溶解した。部分的に消化した染色体ＤＮＡの６．５μgを、BamH Ｉ制限エンドヌクレアーゼで消化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したpＣＰ１３コスミド１.５μgにライゲートした。部分的に消化したサーモトガＤＮＡとBamH Ｉ開裂pＣＰ１３のライゲーションは、Ｔ４ＤＮＡリガーゼで２２℃で１６時間行った。ライゲーション後、約１μgのライゲートＤＮＡを、λ−パッケージング抽出物（Life Technologies，Inc.，Gaither sburg，MDから入手）を使用してパッケージした。次いで、ＤＨ１０Ｂ細胞（Lif eTech．Inc.）を１００μ1のパッケージ物質で感染させた。感染細胞をテトラサイクリン含有プレート上に置いた。連続希釈を行い、約２００から３００のテトラサイクリン耐性コロニーをプレート当たりに得た。実施例４：サーモトガ・ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼ発現コロニーのスクリ−ニング本発明のサーモトガ・ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼ遺伝子の同定を、本明細書にその全体を引用して包含させるSagner et al.，Gene 97：119-123(1991 )を使用してクローンした。簡単に、実施例３からのＥ．コリテトラサイクリン耐性コロニーをニトロセルロース膜に移し、１２時間生育させた。次いで、細胞をクロロホルム：トルエン（１：１）の蒸気で２０分融解し、１０分、室温で乾燥させた。次いで膜を９５℃で５分処理し、内因性Ｅ．コリ酵素を不活性化した。生存ＤＮＡポリメラーゼ活性を、膜をポリメラーゼ反応混合物（５０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ８.８)、１mＭＭｇＣｌ₂、３mＭ β−メルカプトエタノール、１０μＭ dＣＴP、dＧＴＰ、dＴＴＰおよび１５μCiの３,０００Ci/mmol[α³² Ｐ]dＡＴＰ)１５m1に、３０分、６５℃で浸水させて検出した。オートラジオグラフィーを使用して、サーモトガ・ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼを発現する３つのコロニーを同定した。細胞を液体培養で生育させ、タンパク質抽出物を超音波処理により製造した。クローン熱安定性ポリメラーゼの存在は、９０℃での処理、続く７２℃での酸不溶性ＤＮＡへの放射活性デオキシリボヌクレオチドトリフォスフェートの取り込みによるＤＮＡポリメラーゼの測定により確認した。Tne ＤＮＡポリメラーゼを発現する、これらのコロニーの一つは、pＣＰ１３-３２と命名したプラスミドを含み、更なる実験に使用した。実施例５：Tne ＤＮＡポリメラーゼのサブクローニング Tne ＤＮＡポリメラーゼ遺伝子を発現するpＣＰ１３−３２クローンが約２５k bのＴ.ネアポリターナＤＮＡを含むため、Tneポリメラーゼ遺伝子の小さいフラグメントのサブクローニングを試みた。Ｅ.コリ／pＣＰ１３−３２から精製されたTneＤＮＡポリメラーゼの分子量は約１００kdであった。従って、２.５−３.O kbＤＮＡフラグメントが完全長ポリメラーゼのコードに十分である。実施例３と同様のSau３Ａ部分消化の第２ラウンドは、pＣＰ１３−３２ＤＮＡを使用して行った。この場合、３.５kb領域をアガロースゲルから切断し、Gene Clean(BIO 10 1，La Jolla，CA)で精製し、BamH Ｉで直線化し、ウシ腸アルカリホスファターゼで脱リン酸化したプラスミドpSport１(Life Technologies，Inc.)にライゲートした。ライゲーション後、ＤＨ１０Ｂを形質転換し、コロニーを実施例４記載のようにＤＮＡポリメラーゼ活性に関して試験した。数個のコロニーが、Tne ＤＮＡポリメラーゼを発現すると同定された。約３kb挿入物を含む一つのコロニー（pSport-Tne）を更に特徴付けした。ＤＮＡフラグメントの制限地図を図４に示す。更に、２.７kb HindIII−SstＩフラグメントをpＵＣ１９にサブクローンし、pＵＣ１９−Tneを製造した。Ｅ.コリ／pＵＣ１９-ＴneはまたTne ＤＮＡポリメラーゼを製造する。 Tneポリメラーゼクローンを当分野で既知の方法で配列決定した。出発ＡＴＧ前の５'末端を得るヌクレオチド配列を配列番号１に示す。Tneポリメラーゼのカルボキシ末端領域をコードする得られたヌクレオチド配列を、図５Ａおよび５Ｂ（配列番号１７）に示す。配列番号１７が翻訳された時、ヌクレオチド配列の決定の間に発生したフレームシフトエラーにより、Tneポリメラーゼの完全アミノ酸配列を製造しない。しかしながら、Tneポリメラーゼのアミノ酸配列は、配列番号１７の全３つのリーディングフレームの翻訳により得られ、これらの配列は既知のポリメラーゼアミノ酸配列と匹敵し、共にTneポリメラーゼ配列を、配列番号１８に明示のアミノ酸配列の形に結合する。Tneをコードする完全ヌクレオチド配列は、配列番号２に示し、完全アミノ酸配列は配列番号３に示す。配列番号３は、Tne配列がＮ−末端メチオニンを有することを示す。野生型Ｔn eタンパク質がＮ−末端メチオニンを含むか否かは、確実には知られていない。このＮ−末端メチオニンを、当業者に既知の方法で、例えば、メチオニンアミノペプチダーゼで除去することが可能である。実施例６：Ｅ．コリ由来のサーモトガ・ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼの精製クローンTne ＤＮＡポリメラーゼ（ＤＨ１０Ｂ／pSport−Tne）を発現するＥ．コリ細胞１２gを、氷冷抽出緩衝液（５０mＭトリス−ＨＣｌ(pH７.４)、８％グリセロール、５mＭメルカプトエタノール、１０mＭＮａＣｌ、１m ＭＥＤＴＡ、０.５mＭＰＭＳＦ）２０ml中で、超音波処理（Heat Systems Ultrasonics Inc.，model ３７５超音波処理器中、中チップで４回３０秒バースト）により融解した。超音波処理抽出物を８０℃で１５分加熱し、次いで氷で５分冷却した。５０mＭＫＣｌおよびＰＥＩ（０.４％）を添加し、核酸を除去した。抽出物を浄化のために遠心した。硫酸アンモニウムを６０％まで添加し、ペレットを遠心により回収し、カラム緩衝液（２５mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ７.４)、８％グリセロール、０．５％ＥＤＴＡ、５mＭ２−メルカプトエタノール、１０mＭＫＣｌ）１０mlに再懸濁した。ブルー−セファロース（Pharmacia）カラムまたは好ましくはTosoヘパリン（Tosohaas）カラムを７カラム容量のカラム緩衝液で洗浄し、１５カラム容量の緩衝液の１０mＭから２ＭＫＣｌの勾配で溶出した。ポリメラーゼ活性を有するフラクションをプールした。フラクションを２０容量のカラム緩衝液に対して透析した。プールフラクションをToso６５０Ｑカラム（Tosoha as）に付した。カラムを基底ＯＤ₂₈₀まで洗浄し、２５mＭトリス(pＨ７.４)、８％グリセロール、０.５mＭＥＤＴＡ、１０mＭＫＣｌ、５mＭ β−メルカプトエタノールから同緩衝液＋６５０m ＭＫＣｌまでの直線１０カラム容量勾配で溶出を行った。活性フラクションをプールした。実施例７：精製Tne ＤＮＡポリメラーゼの特徴付け１．サーモトガ・ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼの分子量の決定１００キロダルトンの分子量を、Laemmili，U.K.，Nature(Lond.)227：680-68 5(1970)の方法により、１２.５％ＳＤＳゲル中の電気泳動により決定した。タンパク質をクーマシー・ブリリアント・ブルーでの染色により検出した。１０kdタンパク質ラダー（Life Technologies，Inc.）を標準として使用した。２．³Ｈ−dＡＴＰに対する[α³⁵Ｓ]−dＡＴＰの取り込みの測定法 [αＳ]dＡＴＰ取り込みを、最終量５００μlの反応混合物中で評価し、それは７２℃で５分間予備インキュベートし、[³Ｈ]ＴＴＰヌクレオチドカクテル(各１００μＭのＴＴＰ、dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰと９０.３cpm／pmolの[³Ｈ]ＴＴＰ)、[αＳ]dＡＴＰを唯一のdＡＴＰ源として含むヌクレオチドカクテル（各１００μＭの[αＳ]dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、ＴＴＰと２３５cpm/pmolの[α³⁵ Ｓ]dＡＴＰ）または混合カクテル（５０μＭ[αＳ]dＡＴＰ、５０μＭ dＡＴＰ、１００μＭＴＴＰ、１００μＭ dＣＴＰ、１００μＭ dＧＴＰと１１８cpm ／pmolの[³⁵αＳ]dＡＴＰおよび４５.２cpm／pmolの[³Ｈ]ＴＴＰ）のいずれかおよび５０mＭビシン、pＨ８.５、３０mＭＭgＣｌ₂、０.２５mg／ml活性化サケ精子ＤＮＡ、２０％グリセロールを含んだ。反応を０.３単位のＴ．ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼまたはＴ．アクアティクスＤＮＡポリメラーゼの添加により開始させた。示す時間に、２５μlアリコートを除去し、氷冷ＥＤＴＡの添加により最終濃度を８３mＭまで添加することにより停止させた。停止反応サンプルの２０μlアリコートをＧＦ／Ｃフィルターにスポットした。取り込みの割合を比較し、Ｔ.ネアポリターナ対Ｔ．アクアティクスの率として示した。[α³⁵Ｓ］ｄＡＴＰのＴ.ネアポリターナＤＮＡポリメラーゼによる取り込みは、Ｔ.アクアティクスＤＮＡポリメラーゼのものより３倍高かった。実施例８:逆転写酵素活性（Ａ）_n：(ｄＴ)_12-18は、ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性のアッセイに最も頻繁に使用される合成鋳型プライマーである。これはレトロウイルス様逆転写酵素に特異的ではないが、多くの真核および原核ＤＮＡポリメラーゼにより複製される(ModakおよびMarcus，J．Bio1．Chem．252:11-19(1977);Gerard et al., Biochem．13:1632-1641(1974);SpadariおよびWeissbach，J．Biol．Chem．249:5 809-5815(1974))。(Ａ)_n：(dＴ)_12-18は、細胞性、複製ＤＮＡポリメラーゼにより、Ｍｎ⁺⁺存在下で特に良く複製され、Ｍｇ⁺⁺存在下では効率が少し悪い(Modak およびMarcus，J．Biol．Chem．252:11-19(1977)；Gerardetal.，Biochem. 13:1 632-1641(1974);SpadariおよびWeissbach，J．Biol．Chem．249:5809-5815(1974 ))。比較して、より細胞性の、複製ＤＮＡポリメラーゼは、合成鋳型プライマー (Ｃ)_n：(dＧ)_12-18を、Ｍｎ⁺⁺またはＭｇ⁺⁺のいずれの存在下でも効果的に複製しないが、レトロウイルス逆転写酵素はする。従って、ＤＮＡポリメラーゼの合成鋳型プライマーでの試験において、試験の説得力が、最低から最大に増加する：(Ａ)_n：(dＴ)_12-18(Ｍn⁺⁺)＜(Ａ)_n：(dＴ)^12-18(Ｍｇ⁺⁺)＜＜(Ｃ)_n：(dＧ)_12- ₁₈ (Ｍn⁺⁺)＜(Ｃ)_n：(dＧ)_12-18(Ｍg⁺⁺)。 Tne ＤＮＡポリメラーゼの逆転写酵素活性は、（Ａ）_n：(dＴ)₂₀および(Ｃ)_n ：(dＧ)_12-18を使用したサーマス・サーモフィルス(Thermnus thermophilus)(Tt h)ＤＮＡポリメラーゼと同等であった。（Ａ）_n：（ｄＴ）₂₀の反応混合物（５０μl）は、５０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ８.４)、１００μＭ (Ａ)_n、１００μ Ｍ (dT)₂₀および４０mＭＫＣｌ、６mＭＭｇＣｌ₂、１０mＭジチオスレイトールおよび５００μＭ [³H]dＴＴＰ（８５cpm／pmole）または１００mＭＫＣｌ、１mM MnCl₂および２００μＭ [³Ｈ]dＴＴＰ（９２cpm／pmole）を含んだ。（Ｃ）_n：（ｄＧ）_12-18の反応混合物（５０μｌ）は、５０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ８.４)、６０μＭ（Ｃ）_n、２４μＭ(ｄＧ)_12-18および５０mＭＫＣｌ、１０mＭＭｇＣｌ₂、１０mＭジチオスレイトールおよび１００μＭ[³Ｈ]dＧＴＰ（１３２cpm／pmole)または１００mＭＫＣｌ、０.５mＭＭｎＣｌ₂および２００μＭ[³H]dＧＴＰ(１０７cpm／pmole)を含んだ。反応混合物はまたTth ＤＮＡポリメラーゼ（Perkin-Elmer）２.５単位またはTne ＤＮＡポリメラーゼ2.５単位も含んだ。インキュベーションは、４５℃で１０分、続いて７５℃で２０分行った。表は、TneおよびTth ＤＮＡポリメラーゼの、（Ａ）_n：(ｄＴ)₂₀および(Ｃ)_n: (d Ｇ)_12-18の、Ｍｇ⁺⁺およびＭｎ⁺⁺の存在下での取り込みの相対的レベルの測定の結果を示す。Tne ＤＮＡポリメラーゼは、逆転写酵素により特異的な反応条件下、即ち、（Ａ）_n：（ｄＴ）₂₀とMg⁺⁺および(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18とMn⁺⁺またはMg⁺ ⁺ 存在下でTth ＤＮＡポリメラーゼよりも良好な逆転写酵素であるように見える。 (Ａ)_n：(ｄＴ)₂₀および(Ｃ)_n：(ｄＧ)_12-18でのTthおよび Tne ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡポリメラーゼ活性実施例９：サーモトガ・ネアポリターナ３'→５'エキソヌクレアーゼ変異体の構築 Tne ＤＮＡポリメラーゼの部分のアミノ酸配列を、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼ1、Taq ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔ５ＤＮＡポリメラーゼおよびＴ７ＤＮＡポリメラーゼのような他の既知のＤＮＡポリメラーゼと比較し、３'→５'エキソヌクレアーゼ活性領域およびＤＮＡポリメラーゼ内のdＮＴＰ結合ドメインを局在化した。３'→５'エキソヌクレアーゼドメインの一つは、下記の種々のＤＮＡポリメラーゼのアミノ酸配列（B1anco，L．etal．Gene112：139-144(1992)；Brait hwaiteおよびIto，Nucleic Acids Res．21:787-802(1993)）との比較に基づいて決定した： Tne ３１８ＰＳＦＡＬＤ^*ＬＥＴＳＳ３２８（配列番号４） PolＩ３５０ＰＶＦＡＦＤＴＥＴＤＳ３６０(配列番号５：Braithwa iteおよびIto，前掲) Ｔ５１３３ＧＰＶＡＦＤＳＥＴＳＡ１４３(配列番号６：Braithwa iteおよびIto，前掲) Ｔ７１ＭＩＶＳＤＩＥＡＮＡ１０(配列番号７：Braithwa iteおよびIto，前掲) ３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne ＤＮＡポリメラーゼを製造する第１段階に関して、pSport−Tneの２kb SphフラグメントをＭ１３mp１９（ＬＴＩ，Gaithersburg，MD）にクローンした。組み換えクローンを、Ｅ.コリＤＨ５α Ｆ'ＩＱ(LTI，Gaithersburg，MD)中で選択した。適当な挿入物のクローンの一つを使用し、ウラシル化一本鎖ＤＮＡを、Ｅ.コリＣＪ２３６（Biorad，Califor nia)を、Ｅ.コリＤＨ５αＦ'ＩＱから得た適当なファージ粒子で感染させることにより単離した。オリゴヌクレオチド、ＧＡＣＧＴＴＴＣＡＡＧＣＧＣＴＡＧＧＧＣＡＡＡＡＧＡ（配列番号８）を、部位直接変異誘発を行うために使用した。この部位直接変異誘発は、Asp³²³（上記＊で示す）をAla³²³に変換させた。Eco４７III制限部位をこの変異誘発の一部として製造し、続く変異誘発における変異体のスクリ−ニングを容易にした。変異誘発を、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼをＴ４ＤＮＡポリメラーゼの代わりに使用する以外、Bioradマニュアル(1987)に記載のプロトコールを使用して行った（USB，C1eve1and, OH)。変異体クローンを、変異誘発オリゴヌクレオチドに製造したEco４７III制限部位に関してスクリ−ニングした。製造Eco４７III部位を有する変異体の一つを更なる実験に使用した。Asp³²³のAla³²³への変異は、ＤＮＡ配列決定により確認された。３'→５'エキソヌクレアーゼ変異を発現ベクター中に取り込ませるために、変異体ファージをSphＩおよびHindIIIで消化した。変異を含む２kbフラグメントを単離した。このフラグメントはpＵＣ−Tneにクローンし、野生型フラグメントと置換した。図６Ａ参照。所望のクローン、pＵＣ−Tne(３'→５')を単離した。変異配列の存在は、独特なEco４７III部位の存在により確認した。次いでプラスミドをSstＩおよびHindIIIで消化した。完全変異体ポリメラーゼ遺伝子( ２.６kb)を精製し、SstＩおよびHindIII消化pTrc９９発現ベクター（Pharmacia ，Sweden）にクローンした。クローンをＤＨ１０Ｂで選択した（LTI，Gaithersb urg，MD)。得られるプラスミドをpTrcTne３５で消化した。図６Ｂ参照。このクローンは、活性熱安定ＤＮＡポリメラーゼを製造した。実施例１０：フェニルアラニンからチロシン変異体上記のように、dＮＴＰ結合ドメインを含むポリメラーゼ活性部位は、通常ポリメラーゼのカルボキシル末端領域に存在する。Tneポリメラーゼ遺伝子の配列は、恐らくｄＮＴＰと接触し、相互作用するであろうアミノ酸が、内部BamHI部位から出発する６９４塩基対以内に存在することを示す。図４および図５Ａおよび５Ｂ参照。この結論は、原型ポリメラーゼＥ.コリＤＮＡポリメラーゼ１との相同性に基づく。Po1isky et al.，J．Biol．Chem．265：14579-14591(1990)参照。ポリメラーゼ遺伝子のカルボキシル末端部分の配列は、図５Ａおよび５Ｂに示す。この配列に基づいて、アミノ酸配列を種々のポリメラーゼとＯ−ヘリックスで比較することが可能である。ＤＮＡポリメラーゼの完全配列は配列番号３に示する。図５Ａおよび５Ｂの配列中の対応するＯ−ヘリックス領域バンドは、アミノ酸５９から７２を含む。 Tne 722 ＲＲＶＧＫＭＶＮＦＳＩＩＹＧ 735 （配列番号９） PolＩ 754 ＲＲＳＡＫＡＩＮＦＧＬＩＹＧ 767 （配列番号１０）Ｔ５ 562 ＲＱＡＡＫＡＩＴＦＧＩＬＹＧ 575 （配列番号１１）Ｔ７ 518 ＲＤＮＡＫＴＦＩＹＧＦＬＹＧ 531 （配列番号１２） Taq 659 ＲＲＡＡＫＴＩＮＦＧＶＬＹＧ 672 （配列番号１３） Taq ＤＮＡポリメラーゼのフェニルアラニンを置換することにより、ポリメラーゼが、ジデオキシヌクレオチドのような非天然ヌクレオチドに対して区別不可能となることが示された。特別に本明細書に引用して包含する、“変異体ＤＮＡポリメラーゼおよびその使用”と題する、１９９５年９月８日に出願のDeb K. Chatterjeeの特許出願番号０８／５２５,０８７参照。変異は、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがフェニルアラニンの代わりにチロシン残基を含み、Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼがジデオキシヌクレオチドに対して区別不可能であるという仮説に基づいた。対応する残基、Ｅ.コリ PolＩのPhe⁷⁶²は、ヌクレオチドと直接相互作用するアミノ酸である。(JoyceおよびSteitz，Ann．Rev．Biochem．63：777-822 (1994);Astake，M．J.，J．Biochem．270:1945-1954(1995))。同様なTne ＤＮＡポリメラーゼの変異体を製造した。配列番号３に番号付けしてあるように、TneポリメラーゼのPhe⁷³⁰をTyr⁷³⁰に変えるために、部位直接変異誘導をオリゴヌクレオチドを、オリゴヌクレオチドＧＴＡＴＡＴＴＡＴＡＧＡＧＴＡＧＴＴＡＡＣＣＡＴＣＴＴＴＣＣＡ(配列番号１４)を使用して行った。このオリゴヌクレオチド直接変異体誘導の一部として、HpaＩ制限部位を、変異体のスクリーニングを容易にするために製造した。同じウラシル化一本鎖ＤＮＡおよび実施例９に記載の変異誘導方法を、この変異誘導に使用した。変異誘導に続いて、変異体をHpaＩ部位に関してスクリーニングした。所望のHpaＩ部位を有する変異体を更なる実験に使用した。変異はＤＮＡ配列決定により確認した。 Phe⁷³⁰からTyr⁷³⁰への変異は、野生型SphＩ−HindIIIフラグメントを変異体ファージＤＮＡで得た変異体フラグメントで置換することによりpＵＣ−Tneに挿入した。所望のクローン、pＵＣ−TneＦＹの存在を、独特なHpaＩ部位の存在により確認した、図６Ａ参照。完全な変異体ポリメラーゼ遺伝子をpTrc９９に、Sst Ｉ−HindIIIフラグメントとして、上記ＤＨ１０Ｂで記載したようにサブクローンした。得られるプラスミドは、pTrcTneＦＹと命名した（図６Ｂ）。クローンは活性熱安定ポリメラーゼを製造した。実施例１１：３'→５'エキソヌクレアーゼおよびPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰への二重変異体３'→５'エキソヌクレアーゼ変異およびPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰変異を同じ発現ベクター、pTrc９９に挿入するために、両方の変異をpＵＣ−Tneクローンに最初に再構築することが必要であった。図７参照。pＵＣ−Tne（３'→５'）およびpＵＣ −TneＦＹをBamHＩで消化した。消化pＵＣ−Tne（３'→５'）を脱リン酸化し、ライゲーションに続く再循環を避けた。得られるフラグメントを１％アガロースゲルで精製した。一番大きなBamHＩフラグメント(４.４kb)をｐＵＣ−Tne（３' →５'）消化ＤＮＡから精製し、Phe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰変異を含む最も小さなBamHＩフラグメント(０.８kb)を精製し、ライゲートしてpＵＣ−Tne３５ＦＹを製造した。適切な配向および同じプラスミド内の両方の変異の存在を、Eco４７III、Hpa ＩおよびSphＩ−HindIII制限消化を確認した。図７参照。両方の変異を含む完全なポリメラーゼを、pTrc９９中のSstＩ−HindIIIフラグメントとしてサブクローンし、ＤＨ１０Ｂ内にpTrcTne３５ＦＹを製造した。クローンは活性な熱安定ポリメラーゼを製造する。実施例１２：３'→５'エキソヌクレアーゼ、５'→３'エキソヌクレアーゼおよびPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰３重変異既知のポリメラーゼのほとんどにおいて、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性はポリメラーゼのアミノ末端領域に存在する(Ollis，D．L.，etal.，Nature 313， 762-766,1985;Freemont，P．S.，et al.，Proteins 1，66-73,1986;Joyce,C．M .，Curr．Opin．Struct．Bio1．1:123-129(1991))。これに５'→３'エキソヌクレアーゼを担うことに関係するある保存アミノ酸が存在する(GutmanおよびMinto n，Nucl．Acids Res．21，4406-4407，1993)。前掲参照。５'→３'エキソヌクレアーゼドメインが必ずしも必要でなことが知られている。最も知られた例は、Ｅ .コリPolＩのクレノウフラグメントである。クレノウフラグメントは、５'→３' エキソヌクレアーゼ活性を欠く天然タンパク質分解性フラグメントである(Joyce ，C.M.，et al.，J.Biol. Chem. 257, 1958-1964, 1990)。５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を欠くTne ＤＮＡポリメラーゼと相当な変異体を製造するために、 SstＩ部位から６８０塩基に存在する独特なSphＩ部位の存在が、開発された。p ＵＣ−Tne３５ＦＹをHindIIIで消化し、クレノウフラグメントで満たし、平滑末端を製造してSphＩで消化した。１.９kbフラグメントを、発現ベクターpＴＴＱ１９（Stark，M．J．R.，Gene 51，255-267，1987）に、SphＩ−S maＩ部位で挿入し、ＤＨ１０Ｂに挿入した。このクローニング方法は、フレーム内ポリメラーゼクローンを、ベクターからのメチオニンの開始コドンと共に製造した。得られるクローンは、Tne ＤＮＡポリメラーゼの２１９アミノ末端を欠く。このクローンをpＴＴＱTne５３５ＦＹと命名する。クローンは活性熱安定ポリメラーゼを製造する。配列形成反応中に異常な配列ラダーの存在を欠くことにより証拠付けされるように、エキソヌクレアーゼ活性は検出されない。この特定の変異体ポリメラーゼはＤＮＡ配列形成に非常に適している。実施例１３：５'→３'エキソヌクレアーゼ欠失およびPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰置換変異体 Tne ＤＮＡポリメラーゼPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰変異体の５'→３'エキソヌクレアーゼ欠失変異を製造するために、pＴＴＱTne５３５ＦＹの１.８kb SphＩ−SpeＩフラグメントを、pＵＣ−TneＦＹの同一のフラグメントで置換した。図８参照。得られるクローン、pＴＴＱTne５ＦＹは、活性な熱安定ＤＮＡポリメラーゼを製造する。標識プライマーの分解の速度の測定に関して、この変異体は、野生型Tne ＤＮＡポリメラーゼと同等な変調した、低いが検出可能な３'→５'ヌクレアーゼ活性を有する。LTI，Gaithersburg，MDから入手可能なＭ１３／pＵＣ Forward ２３−Base Sequencing Primer(登録商標)は、[Ｐ³²]ＡＴＰおよびＴ４キナーゼで５'末端を標識した。反応混合物は野生型または変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼのいずれか２０単位、標識プライマー０.２５pmol、２０mＭトリシン、pＨ８.７、８５mＭ酢酸カリウム、１.２mＭ酢酸マグネシウムおよび８％グリセロールを含む。インキュベーションは７０℃で行った。種々の時点において、１０μl アリコートを５μlサイクルシーケンス法停止溶液に移し、６％ポリアクリルアミノ配列形成ゲルに溶解し、続いてオートラジオグラフィーを行った。野生型ポリメラーゼはプライマーを５から１５分で分解するが、プライマーの同量の分解に変異体ポリメラーゼは６０分以上かかった。先の結果は、変異体ポリメラーゼが、Taq ＤＮＡポリメラーゼと結合して使用した場合、１２kbのＤＮＡゲノムより多く増幅できることを示す。従って、変異体ポリメラーゼは大フラグメントＰＣＲに適当である。実施例１４：変異体ポリメラーゼの精製変異体ポリメラーゼの精製は、“サーモトガ・ネアポリターナ”と題し、１９９５年１月９日に出願された米国特許出願番号０８／３７０，１９０に記載され、上記実施例６に僅かに変えているように本質的に行った。具体的に、クローン変異Tne ＤＮＡポリメラーゼを発現する細胞５から１０gを、Heat System Ultra sonic，Inc．Mode 1375機械で、５０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ７.４）；８％グリセロール;５mＭ２−メルカプトエタノール、１０mＭＮａＣｌ、１ｍＭＥＤＴＡおよび０.５mＭＰＭＳＦを含む超音波処理緩衝液中で、超音波処理により融解した。超音波処理サンプルを７５℃で１５分加熱した。熱処理に続き、２００mＭＮａＣｌおよび０.４％ＰＥＩを添加して核酸を除去した。抽出物を浄化のために遠心した。硫酸アンモニウムを４８％まで添加し、ペレットを２５m Ｍトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）；８％グリセロール；０.５％ＥＤＴＡ；５m Ｍ２−メルカプトエタノール；１０mＭＫＣｌを含むカラム緩衝液に再懸濁し、ヘパリンアガロース（ＬＴＩ）カラムに付した。カラムを、充填緩衝液を使用して１０カラム容量で洗浄し、１０mＭから１ＭＫＣｌの緩衝勾配の１０カラム容量緩衝液で溶出した。ポリメラーゼ活性を有するフラクションをプールし、上記のカラム緩衝液で、pＨを７.８に調節して透析した。フラクションの透析プールをMonoＱ（Pharmacia）カラムに付した。カラムをヘパリンカラムについて上記のように洗浄および溶出した。活性フラクションをプールし、単位アッセイを行った。２５mＭＴＡＰＳ(pＨ９.３)、２mＭＭｇＣｌ₂、５０mＭＫＣｌ、１mＭＤＴＴ、０.２mＭ dＮＴＰ、５００pg／ml ＤＮＡse Ｉ処理サケ精子ＤＮＡ、２１mCi／ml[αＰ³²]dＣＴＰおよび種々の量のポリメラーゼを最終量５０μl中に含んだ。７０℃で１０分のインキュベーション後、０.５ＭＥＤＴＡ１０μlを試験管に添加した。ＴＣＡ沈殿可能カウントは、反応混合物４０μlを使用してＧＦ／Ｃフィルターを使用して測定した。実施例１５：変異体ポリメラーゼによるＤＮＡ配列形成配列形成プライマー前のＭ１３／pＵＣ２３−塩基を、以下の混合物と３７℃ で１０分インキュベートすることにより、配列形成に使用するために³²Ｐ−末端標識した：６０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ７.８)、１０mＭＭｇＣｌ₂、２００mＭＫＣｌ、０.２μＭプライマー、０.４μＭ(２μＣｉ／μl)[γ−³²P]ＡＴＰ、０．２Ｕ／μlＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ。標識は、５５℃で５分インキュベートすることにより停止させた。４つの１０μl塩基特異的配列形成反応を各試験のために設定した。ポリメラーゼおよびddＮＴＰ濃度は、下記のように変化した：反応の他の成分は一定に保った：１.１nＭ pＵＣ１８ＤＮＡ、２２nＭ³²Ｐ −末端標識プライマー、３０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ９.０)、５mＭＭｇＣｌ₂ 、５０mＭＫＣｌ、０．０５％(w/v)Ｗ−１、０．０５６Ｕ／μl ＤＮＡポリメラーゼ(表参照)、２０μＭ dＡＴＰ、２０μＭ dＣＴＰ、２０μＭ７−デアザ −dＧＴＰ、２０μＭ dＴＴＰ。サンプルを熱循環器中で９５℃で３分、次いで（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒、７０℃で６０秒）２０サイクルおよび（９５℃で３０秒、７０℃で６０秒）１０サイクルでインキュベートした。反応を停止溶液（９５％ (v/v)ホルムアミド、１０mＭＥＤＴＡ（ｐＨ８．０）、０．１％(w/v)ブロモフェノールブルー、０.１％(w/v)キシレンシアノール）５μlで停止させ、２分、７０℃で変性させた。３μlアリコートを６％ＴＢＥ／ウレア配列形成ゲルで分離した。乾燥ゲルをBioＭＡＸ−ＭＲＸ線フィルムに１６時間暴露した。結果Ｐ³²末端標識プライマーを使用したサイクルシーケンス法を、野生型Tne ＤＮＡポリメラーゼ、それぞれの３変異体、TneＦＹ、Tne３５ＦＹおよびTne5３５ＦＹを使用して製造した。全４つのポリメラーゼは、配列形成ラダーを製造する。 TneＦＹ変異体は、Taqサイクルシーケンス法反応条件を使用した時、９塩基配列形成ラダーしか提供しなかった。これは、能率的ddＮＴＰ取り込みによる早すぎる停止を示す。１００の係数までジデオキシヌクレオチドを希釈すると、ラダーは約２００塩基まで伸びた。従って、TneＦＹ中のＦ→Ｙ変異は、ジデオキシヌクレオチドを、野生型ポリメラーゼよりも高い頻度で取り込むことを可能とした。Tne35FY変異体は、ジデオキシヌクレオチド取り込みに関して同等の能カを示した。この場合、配列は４００塩基対を越えて伸長し、過剰なＰ³²末端標識Ｍ１３／pＵＣforwad２３Base配列形成プライマーバンドが、ラダーの２３塩基位置に残っていた。２３塩基プライマーバンドの持続性は、３'→５'エキソヌクレオチド活性が著しく減少していることを証明した。Tne５３５ＦＹ変異体は、Tne３５ＦＹと同様に行動するが、シグナル強度が少なくとも５倍増加した。背景は非常に低く、相対的にバンド強度は非常に同一であり、配列依存強度変化は示さなかった。実施例１６：全長Tne ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'−エクソヌクレアーゼ変異体の生成１．５'−３'エクソヌクレアーゼ活性に関与する２個のアミノ酸の同定 Tne ＤＮＡポリメラーゼは、Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩと同様の３種の酵素活性を有する。すなわち５'−３'ＤＮＡポリメラーゼ活性、３'−５'エクソヌクレアーゼ活性および５'−３'エクソヌクレアーゼである。本実施例では、全長 Tne ＤＮＡポリメラーゼにおける５'−３'エクソヌクレアーゼ活性の消失を目的とする。Gutman and Minton（Nucleic Acids Res．1993,21,4406-4407）は、ｐｏｌＩファミリーの種々のＤＮＡポリメラーゼにおける全体として１０種のカルボキシレートを含有する６種（Ａ−Ｆ）の保存５'−３'エクソヌクレアーゼドメインを同定した。１０カルボキシレートのうち７種（ドメインＡ）ＤおよびＥにおいて）は、Taq ＤＮＡポリメラーゼの結晶構造から判断して（Kim et al．Nat ure，1995,376,612-616）、２価金属結合に深く関与しているものと考えられている。しかし、これらのカルボキシレートが５'−３'エクソヌクレアーゼ活性に実際に関与していることを明確に表すものはない。これらのカルボキシレートのいくつかについての生化学特性を見つけだすために、ドメインＡおよびＥにおけるアスパラギン酸の２つを変異誘発のために選択した。これら２ドメインにおける下記のアスパラギン酸を同定した。 Tne ＤＮＡポリメラーゼ：５ＦＬＦＤ⁸ＧＴ１０（ドメインA） Taq ＤＮＡポリメラーゼ：１５ＬＬＶＤ¹⁸ＧＨ２０および Tne ＤＮＡポリメラーゼ：１３２ＳＬＩＴＧＤ¹³⁷ＫＤＭＬ１４１（ドメインE） Taq ＤＮＡポリメラーゼ：１３７ＲＩＬＴＡＤ¹⁴²ＫＤＬＹ１４６２．変異誘発のための一本鎖ＤＮＡの単離一本鎖ＤＮＡをpSportTne（前掲参照）から単離した。pSportTneをＤＨ５αＦ 'ＩＱ（ＬＴＩ，Gaithersburg，ＭＤ）に形質転換により導入した。単一のコロニーをアンピシリンを有するCirc1e Grow（Ｂｉｏ１０１，ＣＡ）培養基２m l中で３７℃、１６時間生長せしめた。新しい培地１０mlに培養物０.１mlを接種し、Ａ５９０が大略０.５に達するまで３７℃で生育せしめた。その際、Ｍ１３ＫＯ７ヘルパーファージ（１×１０¹¹pfu／ｍｌ,ＬＴＩ）０．１mlを培養物に加えた。感染した培養物を７５分間生育せしめた。次いで、カナマイシンを５０μ g／ml加え、培養物を一夜（１６時間）生育せしめた。培養物を遠心した。上清液９mlをＲNaseＡおよびＤNaseＩの各５０μgでＭｇＣｌ₂１０mｌの存在下に３０分間室温で処理した。この混合物に３Ｍ酢酸アンモニウムと２０％ポリエチレングリコールの混合液０.２５量を加え、氷上で２０分間インキュベートするとファージが沈降した。ファージを遠心分離で採取した。ファージ・ペレットをＴＥ（１０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ８)および１mＭＥＤＴＡ）２００μlに溶解した。ファージ溶液を緩衝飽和フェノール（ＬＴＩ，Gaithersburg，ＭＤ）の等量で２回、フェノール:クロロホルム：イソアミルアルコール混合液（２５：２４：１，ＬＴＩ，Gaithersburg，ＭＤ）の等量で２回、最後にクロロホルム：イソアミルアルコール（２４：１）で２回抽出した。水層に７.５Ｍ酢酸アンモニウム０.１量およびエタノール２.５量を加え、１５分間室温でインキュベートすると、一本鎖ＤＮＡが沈降した。ＤＮＡを遠心分離で採取し、ＴＥ２００μlに懸濁した。３．Ｄ⁸およびＤ¹³⁷の変異誘発アラニンにＤ⁸およびＤ¹³⁷を変異誘発するために２種のオリゴを設計した。そのオリゴは５’ＧＴＡＧＧＣＣＡＧＧＧＣＴＧＴＧＣＣＧＧＣＡＡＡＧＡＧＡＡＡＴＡＧＴＣ３’（配列番号１５）（Ｄ８Ａ）および５’ＧＡＡＧＣＡＴＡＴＣＣＴＴＧＧＣＧＣＣＧＧＴＴＡＴＴＡＴＧＡＡＡＡＴＣ３’（配列番号１６）( Ｄ１３７Ａ)である。Ｄ８ＡオリゴにおけるNgoＡＩＶ（太字下線）およびオリゴＤ１３７ＡにおけるKasＩ（太字下線）部位を変異誘発後のクローンの簡易同定のために創生した。Ｔ４キナーゼ（ＬＴＩ，Gaithersburg，ＭＤ）５単位を用いてMutaジーン・プロトコール（Bio−Rad，ＣＡ）に従って、各オリゴ２００pmol をキナーゼ化した。Mutaジーン・プロトコールに従って、一本鎖ＤＮＡ２００ng をオリゴ２pmolでアニールした。アニール工程に続いて、野生型Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼ（ＵＳＢ,Ohio）５単位およびＴ４リガーゼ（ＬＴＩ）０．５単位を用いて、相補的ＤＮＡ合成および連絡反応を行った。反応物１μlをMutＳＥ．コリ（Duke大学、ＮＣのPaul Modrich博士より得る）の形質変換に用い、アンピシリン含有の寒天プレートから選択した。コントロールアニーリングおよび合成反応は、バックグランドを測定するための何らのオリゴの追加なしに、実施した。オリゴ含有の形質変換プレートはオリゴなしのものより５０−６０倍多いコロニーを形成した。各変異原性オリゴの示す合成から６コロニーを生育し、各制限部位（NgoＡＩＶまたはKasＩ）を調べた。Ｄ８Ａ（NgoＡＩＶ）については、６中４で２フラグメント（３kbおよび４．１kb）を生成した。pSportTneはｆｌ遺伝子間領域の近くにNgoＡＩＶ部位を有するので、Tne ＤＮＡポリメラーゼ内の新しいNgoＡＩＶは、予想されたフラグメントを産生した。プラスミドはpSpor tTneNgoＡＩＶと命名した。Ｄ１３７Ａ（KasＩ）については、６中５のクローンが１.１kbおよび６kbの２種の予想されたフラグメントを産生した。pSportTneが他のKasＩ部位を有するので、新たにつくられたKasＩ部位は、これら２種の予想されたフラグメントを生成した。プラスミドはpSportTneKasＩと命名した。Ｄ８ＡおよびＤ１３７変異の両方ともＤＮＡ配列決定により確認された。４．発現ベクターへの変異体ポリメラーゼの再構築 Tne ＤＮＡポリメラーゼおよび変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼの発現過程において、様々なクローンを構築した。その一つのクローンをpＴＴＱ Tne SeqＳ１と命名した。このプラスミドは次のように構築した。最初に、上記変異誘発法と同様に、グリシン１９５をpSportTneにおけるアスパラギン酸に変えた。Ｅ.コリＤＮＡポリメラーゼＩの対応アミノ酸（polＡ２１５、ドメインＦ）における変異が５'−３'エクソヌクレアーゼ活性（GutmanおよびMinton、上記参照）を消失することが分かった。SspＩ部位を変異ポリメラーゼにつくった。第２に、Ｇ１９５Ｄ変異を含む６５０bp SstＩ−SphＩフラグメントをpＵＣＴｎe３５ＦＹ（参照、前掲）にサブクローン化し、野性型フラグメントを再置した。このプラスミドをpＵＣTne３０２２と呼ぶ。最後に、全変異Tne ＤＮＡポリメラーゼをpＵＣTne３０２２からpＴＴＱ１８にSstＩ−HindIIIフラグメントとしてサブクローン化し、pTＴＱTneSeqＳ１を生成せしめた。この発現ベクター中にＤ８またはＤ１３７Ａを導入するために、６５０bp SstＩ−SphＩをpSportTneNgo ＡＩＶまたはpSportTneKasＩからの同じSstＩ−SphＩフラグメントと共に再置した。このプラスミドを夫々、pＴＴＱTneNgo（Ｄ８Ａ）およびpＴＴＱTneKas（Ｄ１３７Ａ）と名付けた。５．ＤＮＡ配列決定による変異の確認両変異ポリメラーゼのＤＮＡ配列決定により制限部位NgoＡＩＶおよび変異Ｄ８ＡならびにKasＩ部位および変異Ｄ１３７Ａの存在を確認した。ＤＮＡ配列決定によって、３'−５'エクソヌクレアーゼ領域における変異Ｄ３２３ＡおよびＥ co４７III制限部位の存在も確認された。さらに、ＤＮＡ配列決定によって、変異Tne ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックス領域におけるＦ３７０Ｙ変異および HpaＩ制限部位が確認された。６．変異Tne ＤＮＡポリメラーゼの５'−３'エクソヌクレアーゼ活性全長ＤＮＡポリメラーゼを上記のように精製した。５'−３'エクソヌクレアーゼ活性をＬＴＩカタログ記載のように測定した。簡単に言うと、ラベル（³²Ｐ） HaeIII消化λＤＮＡ（ＬＴＩ）１pmolをアッセイに供した。緩衝組成物は、２５ mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ８.３)，５mＭＭｇＣｌ₂，５０mＭＮａＣｌ，０.０１％ゼラチンである。反応物５０μl中に野性または変異ＤＮＡポリメラーゼのいずれかの０、２、４、６および１０単位を加えることにより反応が始まった。反応混合物を１時間７２℃でインキュベートした。１０μアリコットをＰＥＩ−セルローズ薄層クロマトグラフィーにかけ、遊離したラベルを液体シンチレーションで定量した。このアッセイにおいて、Ｄ８ＡおよびＤ１３７Ａ変異体のいずれも、野性型Tne ＤＮＡポリメラーゼに比して０.０１％以下のラベル遊離を示した。結果は、Ｄ８ＡおよびＤ１３７Ａ変異体のいずれにおいても５'−３'エクソヌクレアーゼ活性がかなり消失していることを表す。このように初めて、これら２個のアスパルテートが５'−３'エクソヌクレアーゼ活性に関与していることが確認された。７．変異ＤＮＡポリメラーゼのＤＮＡ配列決定特性下記組成物の４種の単離塩基−特異反応を各Tneポリメラーゼ変異体について設定した。組成物は、６.５nＭ pＵＣ１８,１１１nＭＭ1３／pＵＣ２３塩基前方配列プライマー、３０mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ９.０)，５mＭＭｇＣｌ₂，１０mＭＮａＣｌ，１０mＭＤＴＴ，０.０５％（w/v）Ｗ−１，０.００１８５Ｕ／μl無機ピロホスファターゼ、０．３７μCi／μl（０.３７μＭ）［α−³⁵Ｓ］dＡＴＰ，１６.７μＭ α−チオ-dＡＴＰ，１６.７μＭ dＣＴＰ，１６.７μ Ｍ７−デアザ−dＧＴＰ，１６．７μＭ dＴＴＰおよび０.０４２μＭ ddＡＴＰ，０．３μＭddＣＴＰ，０.２５５μＭ ddＧＴＰまたは０.３７５μMddＴＴＰのいずれかである。これらの反応において、種々の変異体の濃度は、０.１８５Ｕ／μl Tne５３５ＦＹ、０.１７０Ｕ／μl Ｄ８Ａまたは０．１８５Ｕ／μl Ｄ１３７Ａとした。反応容量は各々６μlとした。試験管をＭＪ Research ＤＮＡ Engine熱サイクラー中で９５℃、３分間インキュベートし、次いで、２０回転（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で６０秒）および１０回転（９５℃で３０秒および７０℃で６０秒）を行った。停止液（９５％（v/v）ホルムアミド、１０mＭＥＤＴＡ(pH８.０)，０．１％（w/v）ブロモフェノール・ブルー、０．１％（w/v）キシレンシアノール）３μlで反応を終了し、２分間７０℃ で変性せしめた。３μlアリコットを６％ＴＢＥ／尿素配列決定ゲル上に分離した。乾燥ゲルをKodak BioMax Ｘ線フィルムに室温で約１８時間露出せしめた。配列決定データの結果から、Tne ＤＮＡポリメラーゼのＤ８ＡおよびＤ１３７Ａ変異体の両者が、５'−エクソヌクレアーゼドメインを欠失した他のTne ＤＮＡポリメラーゼ（Ｔｎｅ５３５ＦＹ）に匹敵して、全４レーンにおいて等しいバンド強度を有する等価の配列ラダーを産生することが示唆される。この結果からさらに、ＤＮＡポリメラーゼ含有の５'−３'エクソヌクレアーゼの特性であるラダーの配列に偽バンドが見られないので、両Ｄ８ＡおよびＤ１３７Ａ変異体が５ '−エクソヌクレアーゼ活性を消失していることも示唆される。実施例１７：配列決定反応におけるTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体の利点この実施例において、実施例１２のTne ＤＮＡポリメラーゼが用いられ、これは、Phe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰変異（ddＮＴＰsに対してdＮＴＰsを非識別化する）、Asp³² ³ →Ala³²³変異（実質的に３'→５'エクソヌクレアーゼ活性を減じる）およびＮ末２１９アミノ酸欠失変異（５'→３'エクソヌクレアーゼ活性を消失する）を有する。 Sequence Ver２.０（商標）は、Amersham International plc.Little Chalfon t，Englandにより販売されている修飾Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼである。 Taq ＤＮＡポリメラーゼは、ＬＴＩ，Gaithersburg，ＭＤから購入した。 Thermo Sequence（商標）は、Amersham International plc.Little Chalfont ，Englandにより販売されている５'−エクソヌクレアーゼ欠失含有のTaqＦ→Ｙ変異体である。 AmpliTaq ＦＳ（商標）は、Perkin Elmer ＡＢＩ，Foster City，ＣＡにより販売されているＧly³⁷変異を含有すると考えられるTaq Ｆ→Ｙ変異体である。 Sequitherm（商標）は、Epicenter，Madison，ＷＩにより販売されている熱親和性ＤＮＡポリメラーゼである。方法 Tne ＤＮＡポリメラーゼでの³⁵Ｓサイクル配列決定下記の組成物の４種の単離塩基−特異反応を各鋳型について設定した。組成物は、６．５nＭ dsＤＮＡ，１１１nＭプライマー、３０mＭトリス−ＨＣｌ（p Ｈ９.０），５mＭＭｇＣｌ₂，１０mＭＮａＣｌ，１０mＭＤＴＴ，０.０５％（w/v）Ｗ−１，０.１８５Ｕ／μＬ Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体、０.００１８５Ｕ／μuｌ熱親和性無機ピロホスファターゼ、０.３７μＣｉ／μl（０．３７μＭ）［α−³⁵Ｓ］dＡＴＰ，１６.７μＭ α−チオ-dＡＴＰ，１６.７ μＭ dＣＴＰ，１６．７μＭ７−デアザ−dＧＴＰ，１６．７μＭ dＴＴＰおよび０．０４２μＭ dd ＡＴＰ，０.３μＭ ddＣＴＰ，０.２５５μＭ ddＧＴＰまたは０.３７５μＭ d dＴＴＰのいずれかである。反応容量は夫々６μｌとした。試験管をＭＪ Resear ch ＤＮＡ Engine熱サイクラー中で９５℃、３分間インキュベートし、次いで２０回転（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で６０秒）および１０回転（９５℃で３０秒および７０℃で６０秒）を行った。停止液（９５％(v/v)ホルムアミド、１０mＭＥＤＴＡ（pＨ８．０），０．１％(w/v)ブロモフェノール・ブルー、０.１％(w/v)キシレンシアノール）３μlで反応を終了し、２分間７０℃で変性せしめた。３μlアリコットを６％ＴＢＥ／尿素配列決定ゲル上に分離した。乾燥ゲルをKodak BioMax Ｘ線フィルムに室温で約１８時間露出せしめた。 Tne ＤＮＡポリメラーゼでの³²Ｐ末端ラベルプライマーサイクル配列決定配列決定プライマーは、１０分間３７℃で反応液（６０mＭトリス−ＨＣｌ，１０m ＭＭｇＣｌ₂，２００mＭＫＣｌ，０.６μＭプライマー、０.４μＭ(2μCi／μ l）［γ−³²Ｐ］ＡＴＰ，０．２Ｕ／μl Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ）をインキュベートすることによりラベルした。５分間５５℃でインキュベートして反応を停止した。下記の組成物の４種の単離塩基−特異反応を各鋳型について設定した。組成物は、１．１nＭ dsＤＮＡ，６７nＭ ³²Ｐ末ラベルプライマー、３０mＭトリス−ＨＣｌ（pＨ９.０），５mＭＭｇＣｌ₂，５０mＭＫＣｌ，０.０５％(w/v )Ｗ−１，０．１８５Ｕ／μl Tne ＤＮＡポリメラーゼ、０.００１８５Ｕ／μl 熱親和性無機ピロホスファターゼ、２０μＭ dＡＴＰ，２０μＭ dＣＴＰ，２０ μＭ７ーデアザ−dＧＴＰ，２０μl dＴＴＰまたは０.４μＭ ddＡＴＰ，０.４ μＭ ddＧＴＰまたは０.４μＭ ddＴＴＰのいずれかである。反応容量は夫々１０μlとした。試験管をＭＪ Research ＤＮＡEngine熱サイクラー中で９５℃、３分間インキュベートし、次いで２０回転（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で６０秒）および１０回転（９５℃で３０秒および７０℃で６０秒）を行った。停止液（９５％(v/v)ホルムアミド、１０mＭＥＤＴＡ(pＨ８.０)，０．１％(w/v)ブロモフェノール・ブルー、０．１％(w/v)キシレンシアノール）３μlで反応を終了し、２分間７０℃で変性せしめた。３μlアリコットを６％ＴＢＥ／尿素配列決定ゲル上に分離した。乾燥ゲルをKodak BioMax Ｘ線フィルムに室温で約１８時間露出せしめた。 Tne ＤＮＡポリメラーゼでの一本鎖伸長配列決定この反応はssＤＮＡまたは変性dsＤＮＡのいずれかを必要とする。ＤＮＡは１０μl量でプライマーに、５分間５０℃で下記反応条件で加熱することによりアニールする。すなわち６０mＭトリス−ＨＣｌ(pH９.０)，６０mＭＫＣｌ，１０mＭＭｇＣｌ₂，０．１％(w/v)Ｗ−１で１５０nＭ dsＤＮＡと１５０nＭプライマーあるいは５０nＭ ssＤＮＡと５０nＭプライマーである。ラベル反応物（１０μlアニールＤＮＡプライマー０.３２μCi／μl（０．３２μＭ）［α−³⁵ Ｓ］dＡＴＰ，４８.８mＭトリスＨＣｌ(pＨ９．０)，４８.４mＭＫＣｌ，８．１mＭＭｇＣｌ₂，１９４nＭ dＣＴＰ，１９４nＭ７−デアザ−dＧＴＰ，１９４nＭ dＴＴＰ，６．５nＭＤＴＴ，０．０８１％(w/v)Ｗ−１，０．３２Ｕ／ μl Tne ＤＮＡポリメラーゼ、０.００３２Ｕ／μl熱親和性無機ピロホスフェート）の条件である。次いで反応混合物の４塩基−特異反応管に分配する。各管は全反応量６μlを含有し、５分間７０℃で下記の条件でインキュベートする。ＤＮＡ−ラベルプライマー０．１９μCi／μl（０.１９μＭ）［α−³⁵Ｓ］dＡＴＰ，２８mＭトリス−ＨＣｌ(pＨ９.０)，２８mＭＫＣｌ，４.７mＭＭｇＣｌ₂ ，４２μＭ dＡＴＰ，４２μＭ dＣＴＰ，４２μＭ７−デアザ−dＧＴＰ，４２μＭ dＴＴＰ，３．８mＭＤＴＴ，０．０４７％(w/v)Ｗ−１，０.１９Ｕ／μ l Tne ＤＮＡポリメラーゼ、０.００１９Ｕ／μl熱親和性無機ピロホスフェートおよび０.８３μＭ ddＡＴＰ，０.８３μＭddＣＴＰ，０.８３μＭ ddＧＴＰあるいは０.８３μＭ ddＴＴＰの条件である。停止液（９５％(v/v)ホルムアミド、１０mＭＥＤＴＡ（pH８.０）、０．１％(w/v)ブロモフェノール・ブルー、０．１％(w/v)キシレンシアノール）４μlを加えることにより反応を終了し、２分間７０℃で変性せしめる。２μlアリコットを６％ＴＢＥ／尿酸配列決定ゲル上に分離する。乾燥ゲルを、他に特記しない限り、Kodax BioMax Ｘ線フィルムに室温で約２時間、露出せしめる。 Tne ＤＮＡポリメラーゼでの蛍光染色プライマー配列決定４種の塩基特異反応を各鋳型に設定する。ＡおよびＣの反応容量は５μlであり、ＧおよびＴの反応容量は１０μlである。反応組成物は、２０nＭ dsＤＮＡまたは１０nＭ ssＤＮＡと３０mＭトリス−ＨＣｌ（ｐＨ９.０），３０mＭＫＣｌ，５mＭＭｇＣｌ₂，０.０５％(w/v)Ｗ−１，２０μＭ dＡＴＰ，２０μＭ dCＴP，２０μＭ７−デアザ−dＧＴＰ，２０μＭ dＴＴＰ，０.２９Ｕ／μl Tn e ＤＮＡポリメラーゼ、０.００２９Ｕ／μl熱親和性無機ピロホスファターゼである。４本の各管は下記のように塩基特異的染色プライマーおよびddＮＴＰも含有する。Ａ：０.４μＭＪＯＥ染色プライマー、０.４μＭ ddＡＴＰＣ：０.４μＭＦＡＭ染色プライマー、０.４μＭ ddＣＴＰＧ：０.４μＭＴＡＭＲＡ染色プライマー、０.４μＭ ddＧＴＰＴ：０.４μＭＲＯＸ染色プライマー、０.４μＭ ddＴＴＰ各管を熱サイクラーで９５℃、３分間インキュベートし、次いで、２０回転（９５℃で３０秒、５５℃で３０秒および７０℃で６０秒）および１０回転（９５ ℃で３０秒および７０℃で６０秒）せしめる。反応物を集め、Centri Sepスピンカラム上で精製し、そして乾燥する。乾燥ペレットを８３％ホルムアミド３μl 、４.２mＭＥＤＴＡ（pＨ８.０）に溶解し、丁度９０℃で２時間加熱し、次いで全試料をＡＢＩ３７３ストレッチ器の４.７５％ポリアクリルアミド／ＴＢＥ／尿素ゲルにかける。ゲルは３２ワットで１４時間作動する。 Tne ＤＮＡポリメラーゼでの蛍光染色ターミネーター配列決定各鋳型に１反応物２０μlを設定した。反応物の組成は、１２.５nＭ dsＤＮＡまたは６.２５nＭ ssＤＮＡと０.１６μＭプライマー、３０mＭトリス−ＨＣｌ (pＨ９.０)，３０mＭＫＣｌ，５mＭＭｇＣｌ₂，０.０５％(w/v)Ｗ−１，０.６ mＭdＡＴＰ，０.６mＭ dＣＴＰ，１.８mＭｄＩＴＰ，０.６mＭ dＴＴＰ，０.５Ｕ／ml Tne ＤＮＡポリメラーゼ、０.００５Ｕ／μl熱親和性無機ピロホスファターゼである。反応物には、ＡＢＩで供給されるもとの濃度よりも１６倍低い最終濃度での４塩基特異的染色ターミネーターも含まれる。試験管を熱サイクラー中で２５回転（９６℃で３０秒、５０℃で１５秒および６０℃で４分）にインキュベートする。反応物をCentri Sepスピンカラム上で精製し、そして乾燥する。乾燥ペレットを８３％ホルムアミド３μl、４.２mＭＥＤＴＡ（pＨ８.０）に溶解し、丁度９０℃で２時間加熱し、次いで全試料をＡＢＩ３７３ストレッチ器の４．７５％ポリアクリルアミド／ＴＢＥ／尿素ゲルにかける。ゲルは３２ワットで１４時間作動する。結果一本鎖伸長配列決定図９は、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体による効率的³⁵Ｓ取り込みが一本鎖および二本鎖ＤＮＡ配列決定における強力なシグナルを提供することを示す。アルカリ変性pＵＣ１９ＤＮＡ（０.５pmol）は、上記したように（セットＡ）、実施例１２のTne ＤＮＡポリメラーゼでの一本鎖伸長配列決定法を用いて、配列決定された。フィルムを僅か２時間露出せしめた。Ｍ１３mp１９（＋）ＤＮＡは記述したように（セットＢ）、Tne ＤＮＡポリメラーゼ一本鎖伸長配列決定反応における鋳型の通常量の１／１０で用いた。フィルムを２０時間露出せしめた。 Tne変異体がこのような強いシグナルを産生するので、配列性質を損なうことなしに、鋳型をより経済的に用いることができる。図１０は、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体がポリ（dA）テイルを持つcＤＮＡ含有のプラスミドから明瞭な配列を生成することを示す。cＤＮＡ挿入物（１．５pmol）含有のアルカリ変性プラスミドＤＮＡを、一本鎖伸長配列決定法におけるTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ａ組およびＢ組）または標準キットプロトコールによるSequenase Ver２.０（商標）（Ｃ組）のいずれかを用いて配列決定した。Ａ組、β−アクチンcＤＮＡ；Ｂ組、ＲＰＡ１ cＤＮＡ（複製タンパク質）およびＣ組、ＲＰＡ２ cＤＮＡ（複製タンパク質）である。図１１でTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体を比較する。Sequenase（商標）およびTaq ＤＮＡポリメラーゼはポリ（dc）含有のプラスミドから配列を生成する。ポリ（dc）テイル５'ＲＡＣＥ由来挿入物含有のプラスミドＤＮＡ（１.５pm ol）をアルカリ変性した。ＤＮＡは、記述されたように一本鎖伸長配列決定法で Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ａ組）、キットマニュアルに記載のようにSequ ence Ver２.０（商標）（Ｂ組）およびTaq Trackキット（Promega，Madison，ＷＩ）の推奨プロトコールに従ってTaqデポ（Ｃ組）を用いて、配列決定した。サイクロ配列決定図１２は、サイクロ配列決定におけるTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体がThermo Sequence（商標）より３倍強力であり、６０サイクルラベル工程を有しない³⁵ Ｓラベル配列を産生することを示す。ポリ（ｄＣ）テイル５ＲＡＣＥ由来挿入物含有のプラスミドＤＮＡ（０.５μg）は、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体（Ａ組）を用いて、サイクル化配列決定した。フィルム露出は６時間であった。キットマニュアル記載のようにThermo Squenase（商標）を用いて、６０サイクルのインキュベーションの部分プライマー伸長によりプラスミドＤＮＡ（０.５μg）を³⁵ Ｓでラベルした。次いで、鎖ターミネーターの存在下に標準サイクルプロトコールによった。フィルム露出は１８時間であった。プラスミドＤＮＡ（０.５μg ）は、fmolキットマニュアルに記載のようにTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Ｃ組）を用いてサイクル配列決定された。フィルム露出は１８時間であった。注意、Ｃ組の不均質バンド強度。図１３は、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体がインビトロ増幅ＤＮＡ高品質の配列を産生することを示す。Ｅ.コリ染色体ＤＮＡ、プラスミドpＳＣ１０１およびヒトゲノムＤＮＡから直接的に鋳型をインビトロ増幅し、単純イソプロパノール沈降で精製し、ついで定量した。Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体および増幅プライマーのひとつを用いてＤＮＡ（１００fmol）をサイクロ配列決定した。Ａ組、Ｅ.コリ βpolＩ（４５０bp以下）；Ｂ組、Ｅ.コリrrsＥ（３５０bp以下）；Ｃ組、pＳＣ１０１からのori（１.５kb以下）およびＤ組、ヒトＨＳＩＮＦ遺伝子からのエクソン（７５０bp以下）；括弧内は増幅産物の大きさ。注意、これらのＤＮＡはThermoSequenase（商標）を用いて配列決定できない。なぜなら、プライマーがラベル反応の特別の必要条件に合致しなかったためである。図１４Ａおよび１４Ｂは、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体がポリ（ｄＡ）またはポリ（dC）伸長を含む二本鎖ＤＮＡクローンからの優れた配列を提供することを示す。図１４Ａホモポリマーを有する挿入物含有のスーパーコイル状プラスミドは、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いてサイクル配列決定された。フィルム露出は６時間であった。Ａ組、ＲＰＡ１；Ｂ組、elf（キャップ結合タンパク質）；およびＣ組、ポリ（dＣ）テイル５'ＲＡＣＥ由来挿入物である。図１４Ｂ、ホモポリマーを持つ挿入物含有のスーパーコイル状プラスミドＤＮＡは、fmolキットマニュアルのTaq ＤＮＡポリメラーゼ（Ｄ組）キットマニュアルによるSequilTherm（商標）を用いてサイクル配列決定した。フィルム露出は１８時間であった。Ｄ組、ＲＰＡ；Ｅ組、ＲＰＡ；Ｆ組、ポリ（ｄＣ）テイル５ 'ＲＡＣＥ由来挿入物；およびＧ組、elf。注意、多くの偽ストップ、特にホモポリマーにおいて。図１５は、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体および³²Ｐ末端ラベルプライマーを用いたサイクル配列決定を示す。配列決定プライマーは、Ｔ４キナーゼを用いる³² Ｐでラベルされた最初の５'末端であった。Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体を用いて、スーパーコイル状プラスミドＤＮＡ（５０fmol）をサイクル配列決定した。フィルム暴露は１８時間であった。左右のセットは同じ反応のアリコットで、右側は左よりも４５分後にゲルに充填された。蛍光自動化配列決定図１６Ａ−１６Ｃおよび１６Ｄ−１６Ｆは、蛍光染色プライマー配列決定におけるTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体とAmpliTaq ＦＳ（商標）（１６Ｄ−１６Ｆ）の比較を示す。Tne ＤＮＡポリメラーセ変異体またはAmpliTaq ＦＳ（商標）を用いて、染色プライマー（ＡＢＩ，Foster City，ＣＡ）でpＵＣ１９ＤＮＡを配列決定した。図１７Ａ−１７Ｃおよび１７Ｄ−１７Ｆは、蛍光染色ターミネーター配列決定におけるTne ＤＮＡポリメラーゼ変異体（１７Ａ−１７Ｃ）とAmpliTaq ＦＳ（商標）（１７Ｄ−１７Ｆ）の比較を示す。Tne ＤＮＡポリメラーセ変異体またはAmpliTaq ＦＳ（商標）を用いて、染色ターミネーター（ＡＢＩ，Foster City ，ＣＡ）でpＵＣ１９ＤＮＡを配列決定した。注意、Tneでピークの高さの平らさがより大きい。これらの結果によると、Tne ＤＮＡポリメラーゼ変異体は、他のＤＮＡポリメラーゼに比して、それらが同様の変異体であろうがなかろうが、ＤＮＡ配列決定において予想外のよい結果をもたらす。以上の記載から、当業者は、本発明の基本的特性を容易に確認し、その本質および範囲を逸脱することなく、様々な変更および修飾を加えて、過度の実験をせずに種々の用途および条件に本発明を適用することができる。引用したすべての特許、特許出願および公表文献は、その全体が本明細書の一部を構成する。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｒ 1:19） (Ｃ１２Ｎ 9/12 Ｃ１２Ｒ 1:19） (31)優先権主張番号０８／５３７，４００ (32)優先日平成７年10月２日(1995．10．2) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／５７６，７５９ (32)優先日平成７年12月21日(1995．12．21) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (31)優先権主張番号０８／６８９，８１８ (32)優先日平成８年８月14日(1996．8．14) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ヒューゲス，エイ・ジョン・ジュニアアメリカ合衆国20876メリーランド州ジャーマンタウン、セント・ジョーンズベリー・レイン19444番

Claims

【特許請求の範囲】１．(a) ポリメラーゼの３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を低下または除去すること； (b) ポリメラーゼの５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を低下または除去すること；および (c) ジデオキシヌクレオチドに対する識別作用を低下もしくは除去すること、よりなる群から選ばれる少なくとも１種の方法で修飾された、サーモトガＤＮＡポリメラーゼ変異体。２．少なくとも２種の方法で修飾された、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。３．３種の方法で修飾された、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。４．ジデオキシヌクレオチドに対して非識別性になった該DＮＡポリメラーゼをもたらす、該ＤＮＡポリメラーゼのＯ−ヘリックスにおける変異を含む、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。５．該Ｏ−ヘリックスが、ＲＸＸＸＫＸＸＸＦＸＸＸＹＸ、但しＸはいかなるアミノ酸でもよい、と定義される、請求項４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。６．該変異体ＤＮＡポリメラーゼがTneＤＮＡポリメラーゼである、請求項５に記載のＤＮＡポリメラーゼ。７．該変異がPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰置換である、請求項６に記載のTneＤＮＡポリメラーゼ。８．該ＤＮＡポリメラーゼが実質的に低下した３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有するTneＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ変異体。９．該変異がAsp³²³→A1a³²³置換である、請求項８に記載の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ。１０．該変異体ポリメラーゼがPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰置換およびAsp³²³→A1a³²³ 置換の両方を含む、請求項６に記載の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ。１１．該ＤＮＡポリメラーゼが実質的に低下した５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するTne ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。１２．該変異体ポリメラーゼがＮ−末端５'→３'エキソヌクレアーゼドメインにおける欠失変異を有する、請求項１１に記載の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ。１３．該変異体ポリメラーゼが２１９Ｎ−末端アミノ酸を欠く、請求項１２に記載の変異体Tne ＤＮＡポリメラーゼ。１４．変異体Tma ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１に記載のＤＮＡポリメラーゼ。１５．該ポリメラーゼがPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰置換を有する、請求項１４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。１６．該ＤＮＡポリメラーゼが実質的に低下した３'→５'エキソヌクレアーゼ活性を有する、請求項１４に記載のＤＮＡポリメラーゼ。１７．該変異がAsp³²³→A1a³²³置換である、請求項１６に記載の変異体TmaＤＮＡポリメラーゼ。１８．該変異体ポリメラーゼがPhe⁷³⁰→Tyr⁷³⁰置換およびAsp³²³→A1a³²³置換の両方を含む、請求項１４に記載の変異体TmaＤＮＡポリメラーゼ。１９．該ＤＮＡポリメラーゼが実質的に低下した５'→３'エキソヌクレアーゼ活性を有するTma ＤＮＡポリメラーゼである、請求項１４に記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。２０．該変異体ポリメラーゼがＮ−末端５'→３'エキソヌクレアーゼドメインにおける欠失変異を有する、請求項１９に記載の変異体Tma ＤＮＡポリメラーゼ。２１．該変異体ポリメラーゼが２１９またはそれ以下のＮ−末端アミノ酸を欠く、請求項２０に記載の変異体Tma ＤＮＡポリメラーゼ。２２．請求項１のＤＮＡポリメラーゼをコードする遺伝子を含むベクター。２３．該遺伝子がプロモーターに作動可能に連結されている、請求項２２記載のベクター。２４．該プロモーターがλ−Ｐ_Lプロモーター、tacプロモーター、trpプロモーターおよびtrcプロモーターからなる群から選択される、請求項２３記載のベクター。２５．請求項２２のベクターを含む宿主細胞。２６．ＤＮＡポリメラーゼの製法であって： (a) 請求項２５の宿主細胞を培養し、 (b) 該遺伝子を発現させ、 (c) 該宿主細胞から該ＤＮＡポリメラーゼを単離することを含む、方法。２７．該宿主細胞がＥ.コリである、請求項２６に記載の方法。２８．二本鎖ＤＮＡ分子の合成法であって； (a) 第１ＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズし、 (b) １つまたはそれ以上のデオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートおよび請求項１のＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第１ＤＮＡ分子の全部または一部に相補的な第２ＤＮＡ分子を合成するのに十分な条件下で、工程 (a) の該ＤＮＡ分子をインキュベーションすること、を含む、方法。２９．該デオキシ−またはジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが、 dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰ、dＴＴＰ、dＩＴＰ、７−デアザ−dＧＴＰ、７−デアザ−dＡＴＰ、dＵＴＰ、ddAＴＰ..ddＣＴＰ、ddGＴＰ,.ddＩＴＰ、ddＴＴＰ、 [α−Ｓ]dＡＴＰ、[α−Ｓ]dＴＴＰ、 [α−Ｓ]dＧＴＰおよび [α−Ｓ]dＣＴＰからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。３０．１またはそれ以上の該デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを検出可能に標識する、請求項２８に記載の方法。３１．ＤＮＡ分子の配列決定法であって： (a) 第１ＤＮＡ分子にプライマーをハイブリダイズし、 (b) 工程 (a) の該ＤＮＡ分子をデオキシリボヌクレオシドトリホスフェート、請求項１のＤＮＡポリメラーゼおよびターミネーターヌクレオチドと接触させ、 (c) 合成されたＤＮＡ分子が第１ＤＮＡ分子よりも短い長さであり、かつ合成されたＤＮＡ分子がそれらの３'末端にターミネーターヌクレオチドを含むように、該第１ＤＮＡ分子に相補的なＤＮＡ分子の無作為集団を合成するのに十分な条件下、工程 (b) の混合物をインキュベーションし、そして (d) 該第１ＤＮＡ分子のヌクレオチド配列の少なくとも一部を決定できるように該合成されたＤＮＡ分子をサイズ毎に分離すること、を含む、方法。３２．該デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが、dＡＴＰ、dＣＴＰ、 dＧＴＰ、dＴＴＰ、dＩＴＰ、７−デアザ−dＧＴＰ、７−デアザ−dＡＴＰ、dＵＴＰ、[α−Ｓ]dＡＴＰ、[α−Ｓ]dＴＴＰ、[α−Ｓ]dＧＴＰおよび［α−Ｓ］d ＣＴＰからなる群から選択される、請求項３１に記載の方法。３３．該ターミネーターヌクレオチドがddＴＴＰ、ddＡＴＰ、ddＧＴＰまたは ddＣＴＰである、請求項３１に記載の方法。３４．１またはそれ以上の該デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを検出可能に標識する、請求項３１に記載の方法。３５．該ターミネーターヌクレオチドを検出可能に標識する、請求項３１に記載の方法。３６．該プライマーが検出可能に標識されている、請求項３１に記載の方法。３７．二本鎖ＤＮＡ分子の増幅法であって： (a) 第１プライマーが該ＤＮＡ分子の第１鎖の３'−末端またはその近くの配列に相補的であり、第２プライマーが該ＤＮＡ分子の第２鎖の３'−末端またはその近くの配列に相補的である、第１および第２プライマーを提供し； (b) 請求項１のＤＮＡポリメラーゼの存在下、該第１鎖と相補的な第３ＤＮＡ分子および該第２鎖と相補的な第４ＤＮＡ分子が合成される条件下に、該第１プライマーを該第１鎖と、該第２プライマーを該第２鎖とハイブリダイズし、 (c) 該第１および第３鎖、ならびに該第２および該第４鎖を変性させ、そして (d) 工程 (a) ないし (c) を１回またはそれ以上回繰り返すこと、を含む、方法。３８．該デオキシリボヌクレオシドトリホスフェートが、dＡＴＰ、dＣＴＰ、 dＧＴＰ、dＴＴＰ、dＩＴＰ、７−デアザ−dＧＴＰ、７−デアザ−dＡＴＰ、dＵＴＰ、[α−Ｓ]dＡＴＰ、[α−Ｓ]dＴＴＰ、[α−Ｓ]dＧＴＰおよび［α−Ｓ］d ＣＴＰからなる群から選択される、請求項３７に記載の方法。３９．(a) 請求項１のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１容器手段、 (b) １またはそれ以上のジデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含有する第２容器手段、 (c) １またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含有する第３容器手段、を含む、ＤＮＡ分子配列決定用キット。４０．(a) 請求項１のＤＮＡポリメラーゼを含有する第１容器手段、 (b) １またはそれ以上のデオキシリボヌクレオシドトリホスフェートを含有する第２容器手段、を含む、ＤＮＡ分子増幅用キット。４１．Tne ＤＮＡポリメラーゼのAsp⁸、Glu¹¹²、Asp¹¹⁴、Asp¹¹⁵、Asp¹³⁷、As p¹³⁹、Gly¹⁰²、Gly¹⁸⁷またはGly¹⁹⁵に対応するアミノ酸の少なくとも１つが変異されている、５'→3'エキソヌクレアーゼ活性を有するが実質的に低下または除去された変異体ＤＮＡポリメラーゼ。４２．変異体Ｅ.コリpolI、Taq、TneまたはTma ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４１に記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。４３．Tne ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４２に記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。４４．Tma ＤＮＡポリメラーゼである、請求項４３に記載の変異体ＤＮＡポリメラーゼ。４５．請求項４１の変異体ＤＮＡポリメラーゼをコードするベクター。４６．請求項４５のベクターを含む宿主細胞。４７．Tne ＤＮＡポリメラーゼのAsp⁸、Glu¹¹²、Asp¹¹⁴、Asp¹¹⁵、Asp¹³⁷、As p¹³⁹、Gly¹⁰²、Gly¹⁸⁷またはGly¹⁹⁵に対応するアミノ酸の少なくとも１つが変異されている、５'→３'エキソヌクレアーゼ活性が実質的に低下または除去された変異体ＤＮＡポリメラーゼの製法であって： (a) 請求項４６の宿主細胞を培養し、 (b) 変異体ＤＮＡポリメラーゼを発現させ、そして (c) 該変異体ＤＮＡポリメラーゼを単離すること、を含む、方法。４８．mＲＮＡからcＤＮＡを製造する方法であって： (a) mＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーまたはその他の相補的プライマーと接触させてハイブリッドを形成させ、 (b) 工程 (a) で形成させた該ハイブリッドを請求項１のTne ＤＮＡポリメラーゼおよびdＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰと接触させ、それによって、cＤＮＡ−ＲＮＡハイブリッドを得ることを含む、方法。４９．mＲＮＡからdsＤＮＡを製造する方法であって： (a) mＲＮＡをオリゴ（ｄＴ）プライマーまたはその他の相補的プライマーと接触させてハイブリッドを形成させ、 (b) 工程 (a) で形成させた該ハイブリッドを請求項１のTne ＤＮＡポリメラーゼ、dＡＴＰ、dＣＴＰ、dＧＴＰおよびdＴＴＰ、並びに第１鎖cＤＮＡに相補的なオリゴヌクレオチドと接触させ、それによって、dsＤＮＡを得ることを含む、方法。