JP2000502900A

JP2000502900A - 組換えウイルス偽粒子ならびにそのワクチンおよび抗腫瘍性用途

Info

Publication number: JP2000502900A
Application number: JP09524051A
Authority: JP
Inventors: イグナシオカサル; クリスティーヌセドリック; ハビエルサラセカ; クロードルクレルク; マンリシャールロ; パロマルエダ
Original assignee: Institut Pasteur
Current assignee: Institut Pasteur
Priority date: 1996-01-02
Filing date: 1996-08-30
Publication date: 2000-03-14
Also published as: NO324205B1; ES2282998T3; EP0871738A1; DK0871738T3; AU6933296A; US6458362B1; PT871738E; CA2241280A1; NO983054D0; NZ316970A; EP0783038A1; IL167886A; EP0871738B1; AU731706B2; NO983054L; BR9612422A; ES2257753T3; EP0783038B1; DE69635825T2; WO1997024443A1

Abstract

(57)【要約】少なくとも１種のウイルス構造蛋白質の自動アセンブリーにより構成され、２０と６０ｎｍの間のサイズを有し、略二十面体構造を形成し、前記蛋白質は８〜２５個のアミノ酸の配列を含む少なくとも１種の抗原決定基の存在により修飾され、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩおよび／またはII分子の少なくとも１種と結合することができ、前記結合がＣＤ８⁺および／またはＣＤ４⁺Ｔリンパ球により認識されることを特徴とする組換えウイルス偽粒子。これらの偽粒子は、抗ウイルスワクチンとして、又は薬物として使用することができる。

Description

【発明の詳細な説明】組換えウイルス偽粒子ならびにそのワクチンおよび抗腫瘍性用途本発明は、細胞障害性CD8⁺Ｔリンパ球(CTL)およびCD4⁺ ヘルパーＴリンパ球のインビボで高レベルの応答を誘発するのに特に有用な、パルボウイルス科のウイルスまたは関連ウイルスの組換えウイルス偽粒子(pseudo-particle)に関する。他の目的は、抗腫瘍ワクチンまたは薬剤の産生のための、これらの偽粒子の使用である。それは、該偽粒子を生理学的に許容される賦形剤および／または希釈剤の中に含む組成物も包含する。 1995，11，975-983)によると、腫瘍の場合に本質的である細胞性介在への応答は、２つの部分に分けることができる： − 一方で、CD4⁺ Ｔリンパ球および抗原提示細胞(CPA)の関与を引き起こす応答の開始、および − 他方で、CD8⁺ Ｔリンパ球が関与する細胞障害性エフェクター応答。活性化されたCD4⁺ Ｔリンパ球は増殖し、サイトカインを分泌し、一方、活性化されたCD8⁺ Tリンパ球は増殖し、細胞障害性Tリンパ球( CTL)に分化する。リンパ球のこれらの２つのファミリーは、従って、異なる機能を有し、異なるメカニズムで活性化される。CD4⁺ リンパ球の刺激は、抗原の分解から生じるペプチドの主要組織適合性遺伝子複合体(MHC)のクラスII分子への結合(associatio n)を必要とし、他方、CD8⁺ 細胞のものは、MHCのクラスI分子へのペプチドの結合を必要とする。多くの予防的または治療的戦略が既に、ウイルス、細菌、寄生虫、あるいは癌または腫瘍性疾患により生じる様々なヒトおよび動物の疾患をコントロールする試みにおいて提案されてきた。例えば、インビボで「生きた」ベクターによるCTL応答の誘発が公知である。しかしながら、これらのベクターの安全性は、特に免疫抑制された個体に対しては保証されない。さらに、これらの「生きた」ベクターの複製を使用するシステムは、免疫欠乏個体内でそれらの活性を維持しない。マルチネス(Martinez)らは、Vaccine(vol．10，pp.684-690，1992)において、ブタのワクチン接種でのブタパルボウイルス(PPV)の中空カプシドの使用を教示している。パルボウイルス科は、ブタ、ウシ、ネコ、ウサギ、ラットおよびヒトのような哺乳動物に非常に広く分布するウイルスを含む。しかしながら、パルボウイルスは、それらの宿主哺乳動物に比較的に特異的である。ブタのパルボウイルス(PPV)は、特に、産業的なブタ繁殖において多くの感染症の原因となっている。ブタパルボウイルス(PPV)は、一本鎖DNA分子を含み、対称正二十面体を有する20 nm径の被覆されない等大粒子からなる。それは、２つのカプシドタンパク、VP1(83 kDa)およびVP2(64 kDa)、並びにVP2のタンパク加水分解から生じる第３のタンパクVP3からなる。 VP2タンパクは、組換えバキュロウイルスシステムを用いて昆虫細胞により産生され、産生されたVP2タンパクは、自己組立して、天然ビリオンと同じサイズを有するウイルス偽粒子を形成することが可能である。PPVに対するブタのワクチン接種は、アジュバントであるアルヒドロゲル(Alhydrogel)(50％)＋クィルＡ (Quil A)500μｇ(スーパーフォス(Superfos))と組合せた前記カプシドの混合物で、それらを免疫することによって為される。この文献の教示に匹敵するものは、EP-551.449およびEP-554.414出願に見られ、それら出願はまた、他のウイルスタンパク質に対応する抗原決定基がカプシド中に組込まれるかもしれないことを開示しているが、これらの抗原決定基の性質については特定していない。 EP-647.655出願は、VP2の抗原性部位に対応する合成ペプチドに関する。それは、従って、完全なタンパク質を記載していない。セドリック(SEDLIK)らは、Journal of General Virology(76:2361-2368，1995 )において、Bリンパ球およびTCD4⁺リンパ球によってそれぞれ認識されるポリオウイルスの２つのエピトープC3:BおよびC3:TのためのベクターとしてPPVハイブリッド粒子の使用を記載している。C3:T CD4⁺エピトープを含む粒子は、T，CD4⁺ 細胞の増殖性応答を刺激可能であるが、T CD8⁺細胞については可能ではない。刺激のこの特異性に加えて、応答は、低いレベルで維持し、これは効果的な免疫化に不十分である。いずれにしても、これらの強制的な応答の誘発は、アジュバント（ミョウバンまたは完全フロイントアジュバント）の使用を必要とする。さらに、異種抗原決定基を組込む意図をもって偽粒子を修飾する試みは、偽粒子の形成阻害のような困難に遭遇する。後者が形成されるときでも、異種抗原決定基は必ずしも免疫原性ではなく、抗原決定基は例えば、その天然のコンホメーションをとり得ない、または抗原提示細胞によって産生され得ない部位に恐らく位置する。他の点では、「生きた」ベクターを用いたワクチンと同じ方法では、アジュバントと結合したこれらのハイブリッド粒子の安全性は、完全には保証されない。それは、生物に有害な二次的効果を誘発し得るアジュバントの幾つかの特性から、毒性が生じるかもしれないからである。従って、現在の技術水準からは、処置された個体の健康に対するリスクがなく、免疫刺激性アジュバントを使用せずに、細胞障害性T-リンパ球およびT-ヘルパーの応答を刺激する信頼し得る効果的なシステムは知られていない。さらに、C3:Tエピトープを含むハイブリッド粒子は、アジュバントなしに効果的なT CD4⁺応答を引き出すことはできない。出願人は、MHCのクラスIまたはクラスII分子の少なくとも１つとそれぞれ結合し得る抗原決定基を含む偽粒子を用いて、CD8⁺リンパ球応答、換言すれば細胞障害性応答、および／またはCD4⁺ T細胞によるサイトカイン分泌を特異的に誘発することが可能であることを示した。本発明の目的は、２０と６０ｎｍの間のサイズを有し、略二十面体構造を形成する少なくとも１種のウイルス構造蛋白質の自動アセンブリーにより構成される組換えウイルス偽粒子であって、前記蛋白質は８〜２５個のアミノ酸の配列を含む少なくとも１種の抗原決定基の存在により修飾され、主要組織適合遺伝子複合体（ＭＨＣ）のクラスＩまたはII分子の少なくとも１種と結合することができ、Ｃ３：Ｔエピトープを除き、またはこれら抗原決定基のいくつかの組み合わせである。本発明によるＣＤ８⁺Ｔリンパ球は、少なくとも１種のクラスＩＭＨＣ分子と結合することができる８〜９個のアミノ酸の配列を含む少なくとも１種の抗原決定基を認識することができる。本発明によるＣＤ４⁺Ｔリンパ球は、少なくとも１種のクラスII ＭＨＣ分子と結合することができる８〜２５個のアミノ酸の配列を含む少なくとも１種の抗原決定基を認識することができる。有利には、該構造蛋白質は、パルボウイルス科またはその関連ウイルスの少なくとも１種のパルボウイルス蛋白質、好ましくは少なくとも１種のＶＰ２蛋白質を含む。本発明による粒子は、Ｂ型肝炎ウイルスの表面あるいはコア蛋白質からなる粒子、ポリオウイルス、ウサギ出血性ウイルス、ノーウォーク・ウイルス(Norwalk virus)、ロタウイルス、レトロウイルスｇａｇ蛋白質（ＨＩＶ、ＦＩＶ、ＦｅＬＶ）の粒子、または一般に１以上のウイルス蛋白質の発現によりインビトロで自動アセンブリー可能な任意の被覆されていないウイルス粒子であってもよい。本発明による粒子は、各種タイプの蛋白質を含み得、ハイブリッド粒子を形成し得る。それらは例えばＶＰ１及びＶＰ２蛋白質からなってもよい。抗原決定基を含む配列とクラスＩおよび／またはII分子の間で形成される結合は、ＣＤ８⁺またはＣＤ４⁺Ｔリンパ球レセプターにより認識され、これらリンパ球の分化及び増殖を誘導する。有利には、該配列はその分解を調節することができる、換言すると、抗原の分解中のその産生を促進するか、クラスＩまたはII ＭＨＣ分子への結合を促進する、フランキング領域として知られる領域により結合される。フランキング領域は、その自然環境下でＣＤ８⁺またはＣＤ４⁺Ｔ抗原決定基に隣接するアミノ酸に相当し得る。一般に、それらはいくつかのアミノ酸、特にアラニンまたはリシンからなっていてもよい。本発明による偽粒子は、免疫化のこの方法の安全性から生じる第１の利益を有し、使用されるベクターは非複製性であり、１つのタイプのウイルス蛋白質からなり、免疫抑制された個体にさえ投与できる。本発明による偽粒子の第２の利益は、ヒトパルボウイルスとの交叉反応がないことにあり、従って、このタイプの組換えワクチンの弱い免疫原性を導く可能性のある個体のプレ−免疫化に関連する問題がない。さらに、本発明による偽粒子はベクターの複製を要求せず、免疫欠乏個体におけるその有効性を保持する。さらに、本発明による偽粒子は優れた免疫原性を有し、１回の免疫化のみが必要とされ、従って免疫刺激性アジュバントの非存在下で使用することができる。パルボウイルスは、有利にはＰＰＶ、ＣＰＶ（イヌパルボウイルス）または他の関連ウイルス、例えばＦＰＬＶ（ネコ汎白血球減少症ウイルス）またはＭＥＶ（ミンク腸炎ウイルス）である。抗原決定基は、クラスＩＭＨＣ分子に結合し、Ｔリンパ球細胞障害性を誘導することができる任意の配列から構成されてもよい。特に、ウイルスのＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基、例えばＨＩＶ−１またはＨＩＶ−２、またはインフルエンザウイルス、または腫瘍抗原決定基またはガン細胞により発現されるものであってもよい。有利な実施態様によれば、本発明による偽粒子は、選択された抗原決定基がリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルス（ＬＣＭＶ）の核蛋白質の１１８−１３２領域に含まれるＣＤ８⁺ ＣＴＬ抗原決定基であることを特徴とする。しかしながら、該抗原決定基は、例えば以下の抗原決定基の１種のようなＣＴＬ応答を誘導できる任意の他の抗原決定基であってもよい： − ＨＩＶウイルスのＥｎｖｇｐ１２０、Ｅｎｖｇｐ４１、Ｇａｇｐ１７、Ｇａｇｐ２４、Ｇａｇｐ１５、Ｐｏｌ及びＮｅｆ蛋白質の抗原決定基、及びＳＩＶウイルスのＧａｇ及びｎｅｆ蛋白質及びＨＩＶ−２ウイルスのＧａｇ蛋白質の抗原決定基、ベネット(Venet)及びウォーカー(Walker)(ＡＩＤＳ１９９３、Ｖｏｌ．７、ｓｕｐｐｌ．１、１１９−１２０)により定義される。 − ＭＡＧＥ−１、ＭＡＧＥ−３、ＢＡＧＥ、ＧＡＧＥ−１，２、ＨＥＲ−２／ｎｅｕ遺伝子により発現される蛋白質のような、ヒトにおいて発生する腫瘍により発現される蛋白質の抗原決定基、及びチロシナーゼ、Ｐｍｅｌ１７ｇｐ１００、Ｍｅｌａｎ−ＡＭＡＲＴ−１、及びｇｐ７５ＴＲＰ１のようなメラノサイト分化抗原、ファンデンエインデ(Van Den Eynde)及びブリチャード(Brichard )(Current 0pinion in Immunology，1995，7,674-681)により定義される。ＴＣＤ４⁺ヘルパー応答またはリンホカインを産生する結果となる応答を引き出すために、エピトープはＢ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）のＰｒｅＳ２領域（１２０−１基であることができる。偽粒子は、抗原決定基の組み合わせを含んでもよく、特に： − 少なくとも１種のＣＤ４⁺ Ｔ抗原決定基及び少なくとも１種のＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基 − ＣＤ４⁺ またはＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基のマルチコピーの組み合わせ − ルイス・カルチノーマ(Lewis carcinoma)のＭｕｔＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基の４つのコピーの組み合わせ抗原決定基の組み合わせにより、例えばルイス・カルチノーマのＭｕｔ１抗原決定基のマルチコピーのような同一蛋白質または異なる蛋白質の少なくとも２種の抗原決定基及び好ましくは２と１０の間の抗原決定基を含む組み合わせが理解されるであろう。従って、ＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基のマルチコピーの組み合わせは、異なる蛋白質、例えばリンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスの核蛋白質のＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基とＨＩＶのＥｎｖｇｐ４１ＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基の組み合わせのような少なくとも２種の抗原決定基、好ましくは２と１０の間の抗原決定基を含む。前記組換えウイルス偽粒子は、有利には、ＶＰ２蛋白質及び前記抗原決定基からなるキメラ蛋白質のバキュロウイルスでの発現工程を含むプロセスにより得ることができる。本発明による偽粒子は、より好ましくは、ＬＣＭＶ核蛋白質の少なくとも１種の抗原決定基、またはＨＢＶの少なくとも１種の抗原決定基、または抗原決定基のマルチコピーの組み合わせの、Ｎ末端における存在により修飾されたパルボウイルスＶＰ２蛋白質の自動アセンブリーにより得ることができる。例えば自動アセンブリーや抗原決定基により修飾できるようなＶＰ２と類似の性質を有する任意の他の分子、特に任意の他の蛋白質が、ＶＰ２の代わりに本発明の範囲内で使用できることに注目すべきである。本発明の他の目的は、インビボでの高いレベルのＣＴＬ及び／又はＣＤ４⁺ ヘルパーＴ応答を誘導するための免疫化のための有効量の偽粒子の使用である。投与経路及び個体の体重の関数として選択される本発明による偽粒子の量は、「免疫化のための有効量」の表現により理解されるべきである。、投与量は、有利には個体あたり１０及び５００μｇの間の偽粒子である。本発明の更なる目的は、免疫学的観点から許容される賦形剤および／または希釈剤に偽粒子を含む組成物である。希釈剤として、約ｐＨ７（生理学的溶液）に緩衝化された水溶液を使用できる。有利には、本発明の組成物は、免疫刺激性アジュバントを含まない。にもかかわらず、必要であればミョウバン(alum)であってもよいアジュバントを含んでもよい。本発明による偽粒子は、被験者のリンパ球を偽粒子に接触させることを含む、ウイルスまたは腫瘍感染にかかった被験者に由来するリンパ球の細胞障害性Ｔ応答のインビトロ刺激プロセスで使用することもできる。この場合、該細胞は処置後例えば注射により再度患者に投与される。本発明の他の目的は、本発明の偽粒子をワクチン、好ましくは単回投与ワクチンの製造、特に抗腫瘍または抗ウイルスに使用することである。それは、ワクチンの通常の投与経路、すなわち筋肉内、皮内、皮下または経口経路、またはＣＴＬおよび／またはＣＤ４⁺ Ｔ応答に導く他の任意の経路で投与することができる。本発明は、添付の図面を参照する下記の記載によって、いかなる意味でも限定されることなしに例示される：図１は、pPPV 29プラスミドを得るためのプロセスを示す。図２は、３種の図２（ａ）、２（ｂ）および２（ｃ）を含み、アジュバント無しで、マウスを２段階で、d0およびd21に、それぞれ10および50μgの本発明に従う偽粒子を用いての免疫を示している。d28に、脾細胞を、合成ペプチド118-132 でプレインキュベートされた同系脾細胞によりインビトロで５日間刺激した。細胞障害性Tリンパ球の活性を、培地または合成ぺプチド118-132でプレインキュベートされたP815標的について測定した。結果を、E:T比を横軸として溶解％で示し、この式E/Tはエフェクターリンパ球／標的リンパ球の比を意味する。図２（ａ）は、粒子PPV-29 LCMVで得られた結果を示し、図２（ｂ）は、粒子PPV-30 LC MVで得られた結果を示し、および図２（ｃ）は、修飾しない偽粒子との比較を示す。図３は、７種の図３（ａ）、３（ｂ）、３（ｃ）、３（ｄ）、３（ｅ）、３（ｆ）および３（ｇ）を含み、アジュバント無しで、マウスを２段階で、d0および d21に、本発明に従う偽粒子をそれぞれの用量で、図３（ａ）では50μg、図３（ｂ）では10μg、図３（ｃ）では2μg、図３（ｄ）では0.4μg、図３（ｅ）では0 .08μgを用いる免疫を示している。d28に、脾細胞を、合成ペプチド118-132でプレインキュベートされた同系脾細胞によりインビトロで５日間刺激した。細胞障害性Tリンパ球の活性を、培地または合成ペプチド118-132でプレインキュベートされたP815標的について測定した。コントロールマウスは、d21に、不完全フロイントアジュバント(IFA) 中の100μｇの合成ペプチド118-126（図３ｇ）またはコントロールの偽粒子（図３ｆ）の注射を受けた。結果を、図２と同じように溶解％で示す。図４は、図２と同様に３種の図４（ａ）、４（ｂ）および４（ｃ）を含み、アジュバント無しで、マウスを本発明に従う偽粒子の10μgまたは50μgの一回の注射による免疫を示している。d14に、脾細胞を、合成ペプチド118-132でプレインキュベートされた同系脾細胞によりインビトロで５日間刺激した。細胞障害性T リンパ球の活性を、培地または合成ペプチド118-132でプレインキュベートされたP815標的について測定した。結果を、図２と同じように溶解％で示す。図５は、２つの図５（ａ）及び５（ｂ）を含み、０日及び２１日にＰＢＳで、または中空偽粒子（ＰＰＶ）または配列１１８−１３２を発現するＬＣＭＶ核蛋白質（ＰＰＶ−ＬＣＭＶ）、またはアームストロング−株ウイルス（ＬＣＭＶ− Ａｒｍｓ）で腹腔内（ｉ．ｐ．）注射し、各々２８日及び７０日でのＬＣＭＶによる感染に対するＢＡＬＢ／ｃマウスの保護を示す。マウスの死亡数は毎日追跡し、結果を各バッチの動物中の生存％として表した。図６Ａ〜６Ｄは、HBVのCD4⁺ T PreS:T 抗原決定基、５1E12（６Ａおよび６Ｃ）または52A12（６Ｂおよび６Ｄ）の特異的Tハイブリドーマの、ペプチドPreS:T 、PPV-PreS:T組換え偽粒子またはPPV偽粒子(VP2)の存在下に置かれている、Ｂリンパ腫細胞による刺激（６Ａおよび６Ｂ）あるいは放射線照射された牌細胞（６Ｃおよび６Ｄ）による刺激を示す。図７Ａおよび７Ｂは、インビトロでペプチドPreS:T（図７Ａ）またはPPV(VP2) 偽粒子（図７Ｂ）で刺激された神経節細胞の増殖性応答を示し、該細胞は、0.01 μgのPPV-PreS:Tまたは10μgのPPV(VP2)でアジュバントの不存在下に免疫された DBA/1マウスからのものである。図８Ａおよび８Ｂは、PBS培地中の又は完全フロイントアジュバントの存在下にPPV-PreS:Tで又はPPV(VP2)で免疫され、ペプチドPPV-PreS:T（図８Ａ）又はPP V(VP2)（図８Ｂ）で再刺激されたDBA/1マウスからの神経節細胞の増殖を示す。実施例実施例１：ＬＣＭＶ核蛋白質抗原決定基を含む本発明の偽粒子による、Ｔリンパ球細胞毒性の誘導ＬＣＭＶ核タンパク質の118−132領域に含まれる異種のＣＤ８⁺ ＣＴＬ抗原決定基を、偽粒子の後のフォーメーションを変えることなく、ＰＰＶＶＰ２遺伝子に導入した。開始コドンのみが異なる２つの粒子、ＰＰＶ−２９ＬＣＭＶ及びＰＰＶ−３０ＬＣＭＶが得られた。これらのキメラタンパク質を、ジャーナル・オブ・ジェネラル・ビロロジー（Journal of General Virology）７６：第2 361−2368頁、（1995年）に記載の方法に従って、バキュロウイルス系で生産し、硫酸アンモニウムを用いて昆虫細胞の溶解生成物から沈殿させて精製した。細胞毒性Ｔリンパ球の応答を誘導するこれらの組換え粒子の能力を、ＢＡＬＢ／ｃマウスを用いてin vivoで分析した。材料及び方法＊ＬＣＭＶＣＤ８⁺抗原決定基の、ＶＰ２のＮ末端のＸｈｏＩ部位への挿入図１に示すように、ベクターｐＰＰＶ２９を、マルチネズ等によって記載されたベクタ−ｐＰＰＶ１７（1992,Vaccine，10，684-690）に由来するベクターｐＰＰＶ１７ＲのＸｈｏＩ−ＮｃｏＩフラグメントを消化し、２つのＰＣＲ増幅生成物で置換することによって取得した。ｐＰＰＶ１７Ｒのポリクローニング部位とＶＰ２の開始コドンにあたる領域を除去するためである。ｐＰＰＶ１７は、ポリリンカーにたとえられるＶＰ２クローン遺伝子の方向のみが、ｐＰＰＶ１７Ｒと異なっていた。ＰＣＲ増幅は全て、１ユニットのＤＮＡポリメラーゼ・ベント（DNA polymerase Vent：New England Biolabs）マトリックスとして１０ｎｇのｐＰＰＶ１７Ｒ、１００ｍｍのｄＮＴＰｓ及び８００ｎｇの各プライマーを含む総量１００μｌ中で実施した。増幅は、９３℃で１分間の変性、５０℃で１分間行われるプライマーのアニーリング、及び７２℃で３分間の伸長の２５サイクルで行った。ＰＣＲ生成物を、Ｘｈｏ−Ｉ及びＮｃｏＩで消化され脱リン酸化されたｐＰＰＶ１７Ｒに、クローニングした。該ライゲーション混合物を使用してＥ．ｃｏｌｉＤＨ５細菌を形質転換した。この方法により２つのプラスミドが得られた：ＶＰ２の元のＡＴＧコドンに隣接する一つのＸｈｏ−Ｉクローニング部位を含むｐＰＰＶ２９、及び一つのＸｈｏ−Ｉクローニング部位をもつが、ＡＴＧ開始コドンをもたないｐＰＰＶ３０である。ｐＰＰＶ２９ｍｏｄベクターは次のようにして取得した：ｐＰＰＶ２９をＰｓｔＩで消化することによってＶＰ２遺伝子を得、次いでバキュロウイルス転移ベクター（transfer vector）にサブクローニングするＢａｍＨＩ部位を作るために、それをｐＭＴＬ２４プラスミドのＰｓｔＩクローニング部位に連結した。ＣＤ８⁺抗原決定基と開始コドンをコードし、また２つのＸｈｏＩ部位を含む２つのオリゴヌクレオチドを合成した。それらは、下記に示す配列ＳＥＱＩＤＮｏ．１及びＮｏ.２を有していた：ＳＥＱＩＤＮｏ．１ＳＥＱＩＤＮｏ．２これらの２つの相補的なオリゴヌクレオチドはメドプローブ（Medprobe：ノルウェー）により供給された。それらをポリヌクレオチド・キナーゼＴ４を用いてリン酸化し、７０℃で１５分間アニーリングし、次いでＸｈｏＩで消化された、ＰＰＶ−ＶＰ２をコードする遺伝子を含むｐＰＰＶ２９ｍｏｄプラスミドのＸｈｏＩ部位に連結した。大腸菌ＤＨ５細胞を該ライゲーション混合物で形質転換し、１００μｇ／ｍｌのアンピシリンを含むＬＢ培地の上に播いた（Hanahan，1983，J．Mol．Biol.， 166，557-580)。ＬＣＭＶ挿入物を含む組換体を選択し、挿入された配列の方向及び完全性を測定するために、デオキシ法によりシークエンスを行った。正しい方向でＬＣＭＶ配列を含む組換えクローンを、ｐＰＰＶ２９ｍｏｄ／ＬＣＭＶと名付けた。＊バキュロウイルスでの転移ベクターの調製及び組換えバキュロウイルスの選択ｐＰＰＶ２９ｍｏｄ／ＬＣＭＶベクターをＢａｍＨＩで消化し、バキュロウイルスＰＡｃＹＭ１転移ベクターの単一ＢａｍＨＩ制限酵素部位にサブクローニングして、キメラＶＰ２配列を取得した。組換えクローンを上述のようにして調製し、プラスミドＤＮＡミニプレパレーション法及び制限酵素マッピングによって分析した。挿入された抗原決定基の完全性及びフランキング配列を再確認するために、ポジティブクローンの挿入配列をシークエンスした。最後に、フェノールで精製したＤＮＡを２倍量のエタノールで沈殿させた。こうして得られた組換えクローンをｐＡｃＹＭ１／ＬＣＭＶ／ｐｐｖ２９ｍｏｄと名付けた。組換えバキュロウイルスを得るために、２μｇの精製転移ベクターＤＮＡ及び５００ｎｇのＡｃＲＰ２３１ａｃｚ⁺親ＤＮＡの混合物を、ＤＯＴＡＰトランスフェクション試薬（ベーリンガー、マンハイム）の存在下で、製造業者の使用説明書に従って、Ｓｆ９昆虫細胞に添加した。トランスフェクションは細胞変性効果が完了するまで続けられた。９日後、培養物を回収し、清澄化した上清を使用して、当業界で既に公知の方法及びセドリック（Sedlik）等により記載された方法（J．Gen．Virol.,1995，76，2361-2368）に従って、組換えバキュロウイルスプラークを単離した。組換えクローンを、白色表現型を用いて選別した（白色プラーク：組換体；青色プラーク：野生表現型）。組換えバキュロウイルスを、それ以上青色プラークが検出されなくなるまで精製した。組換えバキュロウイルスＡｃＮＰＶ．ＰＰＶ−ＬＣＭＶについて、高い力価（＞１０⁸）を有するストックウイルスが調製された。ＡｃＰＰ２９−ＬＣＭＶと名付けられたクローンを、１９９５年１２月２０日、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）にＮｏ．Ｖ９５１２２０２２として寄託した。＊組換えタンパク質の分析組換えバキュロウイルスにより、細胞あたり１ｐｆｕの感染レベル（細胞あたり１つのプラークを形成する単位）で、Ｓｆ９細胞を感染させ、感染後７２時間めに該細胞抽出物を収集した。各細胞抽出物にタンパク質解離緩衝液を加え、該混合物を１００℃で５分間加熱して、ＳＤＳ−９％ＰＡＧＥ上で分離した。該ゲルをクマーシーブルーで染色するか、またはセミードライ装置を用いて、２０ボルトで３０分間かけて、ニトロセルロース膜に移した。該膜を、ＬＣＭＶＣＤ８⁺抗原決定基に結合するように意図されたマウス血清（希釈１／１２００）とともに、環境温度で２時間インキュベーションした。洗浄後、固定された抗体を、基質として４−クロロナフトールを用いて、ペルオキシダーゼに結合したプロテインＡ（希釈１／２０００）で、発色するまで検出した。次いで、膜を蒸留水で洗浄して反応を停止させた。クマシーブルーを用いたＳＤＳゲルの染色後、組換えバキュロウイルスで感染させたＳｆ９細胞の抽出物に、６７ＫＤの可視バンドが検出された。観察されたサイズは、キメラＶＰ２−ＬＣＭＶタンパク質について予想されたサイズと一致した。特定のマウス抗血清は、感染細胞の抽出物から得られた６７ＫＤタンパク質と非常に明白に陽性反応を示した。組換えタンパク質の細胞内の局在性を、異なる細胞画分の免疫転移（immunotransfer）によって分析した。これから、キメラＬＣＭＶ−ＶＰ２タンパク質が可溶性の細胞質タンパク質であることが示された。＊粒子の精製Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスで、細胞あたり１ｐｆｕの感染レベルに、感染させた。感染後７２時間めに細胞を収集し、ＰＢＳで洗浄し、次いで２５ｍＭ重炭酸塩溶液中で４℃で浸透圧ショックにより溶解した。細胞破壊物（残骸）を低速遠心分離によって除去した。次いで、抽出物中に含まれる粒子を２０％硫酸アンモニウムの飽和溶液中で沈殿させることにより精製した。沈殿物を１５０００ｒｐｍで１５分間遠心分離し、ＰＢＳ中に再懸濁し、次いで同緩衝液に対して終夜透析を行った。該粒子の実体及び性質をＳＤＳ−ＰＡＧＥ、免疫転移及び電子顕微鏡により確認した。これらの精製粒子は、免疫感作及びリンパ球の細胞毒性（ＣＴＬ）の誘導に使用した。＊マウスの免疫感作本発明の組換えウイルス偽粒子（ＰＰＶ−ＬＣＭＶ）を含む組成物、または空のもの（ＰＰＶ）を、アジュバント非存在下で、マウスに腹膜内投与した。２１日目に、不完全フロインドアジュバント（ＩＦＡ）中の合成ペプチド118-126〔ネオシステム（Neosystem）により供給、ストラスブルグ、フランス〕を皮下注射したマウスを陽性コントロールとした。陰性コントロールには、ＬＣＭＶ抗原決定基を発現しない偽粒子を投与した。＊細胞毒性細胞の誘導最後の免疫感作後７〜１４日目に、免疫マウスから脾臓を採取した。２５×１０⁶の免疫細胞を、純性同系マウスの放射線照射脾細胞２５×１０⁶の存在下、栄養培地（ＲＰＭＩ１６４０、１０％ウシ胎児血清、グルタミン及び抗生物質）を含むフラスコ中で、３７℃、５％ＣＯ₂にて５日間培養した。刺激された細胞を、０．０５μＭの合成ペプチド118- 126又は０．５μＭの合成ペプチド118-132〔いずれもネオシステム（Neosystem ）により供給、ストラスブルグ、フランス〕を用いてin vitroで感作した。＊細胞毒性試験エフェクターリンパ球の細胞毒性活性を５日後に測定した。Ｐ８１５ターゲット細胞を、栄養培地（陰性コントロール）又は合成抗原性ペプチドのいずれか用いて、３７℃で１時間プレ−インキュベーションし、同時に⁵¹Ｃｒで標識した。次いでエフェクターリンパ球を、該標識化細胞とともに、異なるエフェクター／ターゲット比（Ｅ／Ｔ比）で、９６の丸底ウェル付プレートの栄養培地中で、３７℃にて４〜５時間インキュベーションした。ターゲット細胞を同じ条件で、培地と共にインキュベーションして⁵¹Ｃｒの自発的な遊離を測定し、また１Ｎ塩酸と共にインキュベーションして⁵¹Ｃｒの最大遊離を測定した。細胞毒性リンパ球の活性を、溶解したターゲット細胞による⁵¹Ｃｒの放出に対応する培養上清中に存在する放射能をカウントすることによって測定した。この計算を、図２〜５のグラフに示すように、栄養培地（Ｐ８１５）中でインキュベーションしたターゲット細胞、及び合成ペプチド（Ｐ８１５＋ｐ118-132 ）と共にインキュベーションした細胞について行った。結果図２〜５の検討から分かるように、ＬＣＭＶのＣＤ８⁺Ｔ抗原決定基を有する組換え偽粒子１０μｇを１回投与すると、殆ど１００％が、言い換えれば、陽性コントロール合成ペプチド118-126＋ＩＦＡと同じほど大量に溶解した。このことは、本発明の偽粒子がアジュバントの添加なしで高レベルでin vivoでＣＴＬ応答を誘導できることを確認するものである。この誘導は、挿入された抗原決定基に特異的であった。マウスをＬＣＭＶ抗原決定基を発現しない偽粒子を等量用いて免疫化した際に、細胞毒性Ｔ応答が得られなかったからである。こうして誘導された細胞毒性Ｔ細胞は、挿入された抗原決定基に相当するペプチドと共にインキュベーションされたＰ８１５ターゲット細胞を特異的に溶解した。図５は、偽粒子が注射されたマウスが２８日目におけるウイルス感染に対して保護され、また４／５のマウスが７日目も保護されたことを示すものである。実施例２：パルボウイルス偽粒子による、Ｂ型肝炎抗原決定基に対する特異的ＣＤ４⁺Ｔ応答の誘導１）材料及び方法ＰＰＶＶＰ２タンパクのＮ末端へのＨＢＶのPreＳ：Ｔ抗原決定基の挿入ＨＢＶの PreＳ：Ｔ抗原決定基をコードし、次の配列を有する、２つのオリゴヌクレオチドを合成した：ＳＥＱＩＤＮｏ．３：ＳＥＱＩＤＮｏ．４：これらの２つのオリゴヌクレオチドは相補的であり、またｐＰＰＶ３０ベクターに直接クローニングできるように、末端にＸｈｏＩ部位のフランキング配列を２つ含んでいる。該オリゴヌクレオチドはアイソゲン（IS0GEN：オランダ）により供給された。それらをポリヌクレオチドキナーゼＴ４を用いてリン酸化し、７０℃で１５分間アニーリングし、次いでｐＰＰＶ３０の存在下でＸｈｏＩで消化し、１４℃で終夜ホスファターゼで処理した。該混合物を用いて、大腸菌（株ＤＨ５）細胞を形質転換した。コロニーをＥｃｏＲＩ制限酵素及びＨｉｎｄIII制限酵素を用いて分析し、挿入配列の存在を確認した。抗原決定基の配列を含む組換体をシークエンシングして、これらの処理の間に何ら変更又は変異が起こらなかったことを確認した。＊バキュロウイルスでのPreＳ：Ｔ−ＰＰＶ調製物を有する転移ベクターの調製、及び組換バキュロウイルスの産生 PreＳ：Ｔ抗原決定基を正しい方向で含む組換えプラスミドをＢａｍＨＩを用いて消化し、修飾ＶＰ２をｐＡｃＹＭ１転移ベクターにサブクローニングした（マツウラ等.，1987，J．Gen．Virol．68，1233-1250)。当該組換えクローンを前述したようにして分析し、また挿入物の配列をシークエンシングにより確認した。該組換えクローンをｐＡｃＹＭ１／PreＳ：Ｔ−ｐＰＰＶ３０と名付けた。組換えバキュロウイルスを、実施例１に記載したようにして、ＳＦ９昆虫細胞のトランスフェクションにより取得し、高力価を有するウイルスのストックを調製した（＞１０⁸pfu／ml）。該組換えウイルスをＡｃＰＰＶ３０−PreＳ：Ｔと名付けた。それを、１９９６年８月１５日に、ヨーロピアン・コレクション・オブ・アニマル・セル・カルチャー（ＥＣＡＣＣ）にＮｏ．Ｖ９６０８１４１２として寄託した。＊組換えタンパク質の分析及び精製Ｓｆ９細胞を組換えバキュロウイルスＡｃＰＰＶ３０−PreＳ：Ｔに、１ｐｆｕ／ｃｅｌｌの感染レベルで、感染させた（Smith等，1983，Mol．Cell．Biol. ，3，2156-2165）。感染後７２時間目に感染細胞を収集し、次いで、ＳＤＳ存在下９％ポリアクリルアミドゲル上での電気泳動及び免疫転移によって分析した。結果から、修飾された組換えＶＰ２タンパク質の存在が示された。キメラＶＰ２粒子を精製するために、感染細胞を２５ｍＭ重炭酸ナトリウムを用いて溶解し、細胞破壊物（残骸）を遠心分離によって除去し、次いで粒子を含む上清を２０％硫酸アンモニウムを用いて、４℃で２０分間沈殿処理した。ＶＰ２粒子に非常に富んだペレットを遠心分離によって集め、終夜ＰＢＳに対して透析した。精製された粒子は、使用するまで４℃で保存した。＊ＨＢＶのPreＳ：Ｔペプチドを発現する偽粒子による、該ペプチドの特異的Ｔハイブリドーマの刺激Ｂリンパ腫、Ｍ１２Ｃ１０（Ｈ-２^d/q）の１０⁵細胞（図６Ａ及びＢ）又はＤＢＡ／１（Ｈ-２^q）マウスの５．１０⁵放射線照射脾細胞（図６Ｃ及びＤ）を、３７℃で、ＰＰＶ−PreＳ：Ｔ組換え偽粒子若しくはＰＰＶ（ＶＰ２）偽粒子の配列１２０−１３２に相当する種々濃度のペプチドPreＳ：Ｔ存在下で、インキュベーションした。次いで、それを用いて、PreＳ：Ｔペプチドの１０⁵特異的Ｔハイブリドーマ、５１Ｅ１２（６Ａ及び６Ｃ）又は５２Ａ１２（６Ｂ及び６Ｄ）を刺激した。更にそれをＩ−Ａ^q分子により限定（restrict）した。２４時間後、培養上清を除いて、ＩＬ−２のＣＴＬＬ依存株を与えた。３日後、ＣＴＬＬ細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定した。＊ＨＢＶのPreＳ：Ｔペプチドを発現するパルボウイルスのウイルス偽粒子でマウスを免疫感作した後の、アジュバント非存在下での当該ペプチドの特異的増殖応答ＰＰＶ−PreＳ：Ｔ組換えウイルス偽粒子１０μｇ、１μｇ、０．１μｇ若しくは０．０１μｇを皮下注射するか、またはＰＰＶ（ＶＰ２）偽粒子１０μｇを皮下注射することにより、ＤＢＡ／１（Ｈ−２^q）マウスを免疫した。１０日後、排液処理（draining）したガングリオン細胞を、in vitroにて、種々濃度のPr eＳ：Ｔペプチド（図７Ａ）、又は０．５μｇ／ｍｌのＰＰＶ（ＶＰ２）（図７Ｂ）で、再刺激した。４日後、ガングリオン細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定した。＊アジュバントの存在又は非存在下での、ＰＰＶ−PreＳ：Ｔ組換えウイルス偽粒子の、PreＳ：Ｔペプチドの特異的増殖応答を誘導する能力生理食塩溶液（ＰＢＳ）中若しくは完全フロインドアジュバント（ＣＦＡ）を含むエマルジョン中のＰＰＶ−PreＳ：Ｔ組換えウイルス偽粒子１０μｇを皮下注射するか、またはＣＦＡ中のＰＰＶ（ＶＰ２）偽粒子１０μｇを皮下注射することによって、ＤＢＡ／１（Ｈ−２^q）マウスを免疫した。１０日後、排液処理したガングリオン細胞を、in vitroにて、種々濃度のPreＳ：Ｔペプチド（図８Ａ）、又はＰＰＶ（ＶＰ２）（図８Ｂ）で、再刺激した。４日後、ガングリオン細胞の増殖をトリチウム化チミジンの取り込みによって測定した。２）結果ＨＢＶウイルスのPreＳ２領域（配列120-132に相当）に位置するＣＤ４⁺ＴPre Ｓ：Ｔ抗原決定基をパルボウイルスＶＰ２タンパクに導入した。コントロールＰＰＶ（ＶＰ２）又はＰＰＶ−PreＳ：Ｔ組換え偽粒子を精製した。最初に、これらの粒子の抗原性を、in vitroで、PreＳ：Ｔ抗原決定基の特異的Ｔハイブリドーマに対して分析した。図６から分かるように、PreＳ：Ｔ抗原決定基を含むウイルス偽粒子は、これらの特異的ＴハイブリドーマによるＩＬ− ２の産生を非常に強く刺激し、しかもコントロール偽粒子と較べて特有の様式であった。一分子あたりのＰＰＶ−PreＳ：Ｔの有効性を、ペプチドｐ１２０−１３２と比較すると、偽粒子は該ペプチドよりも１００〜１０００倍抗原性が高い。次いで、これらの粒子の免疫原性をin vivoで試験した。これは、粒子単独を種々の用量（０．０１〜１０μｇ）用いるか（図７）、又は粒子１０μｇを完全フロインドのアジュバントの存在又は非存在下で用いるか（図８）のいずれかの方法で行った。これらの実験から、ＰＰＶ−PreＳ：Ｔ偽粒子の非常に強い免疫原性が示され、該偽粒子は、アジュバント非存在下で又低用量（１μｇ単回注射）で、挿入された抗原決定基に対して非常に高い増殖応答を誘導した（図７）。これらの応答は、偽粒子がそれ単独で注射された場合も、それらが完全フロインドアジュバントの存在下で投与された場合と同様に強力であった（図８）。実施例３数個の抗原決定基を含む偽粒子の調製相補的配列を有する２つのオリゴヌクレオチド、ＳＥＱＩＤＮｏ.５及びＳＥＱＩＤＮｏ.６を調製した：ＳＥＱＩＤＮｏ．５（Ｍｕｔ１＋）：ＳＥＱＩＤＮｏ．６（Ｍｕｔ１）：各オリゴヌクレオチドの５’末端は、抗原決定基の数個のコピーを生成するように、互いに結合できる。オリゴヌクレオチドをリン酸化し、次いで混合して７０℃で１５分間加熱した。その後ウシ腸のアルカリホスファターゼで処理したｐＰＰＶ２９ｍｏｄプラスミドに連結して、次いでＸｈｏＩで消化した。当該ライゲーション混合物を用いて、E.coliＤＨ５α細菌を形質転換した。組換えクローンを制限酵素を用いて特徴づけた。１又はそれ以上のコピーが取り込まれていること、又はＭｕｔ１抗原決定基の取り込みがなかったことが、ＢａｍＨＩ／ＨｉｎｄIIIフラグメントのサイズ測定によって検出された。抗原決定基の配列の完全性及びそれらの方向をシークエンシングによって確認した。Ｍｕｔ１抗原決定基の挿入物を含む修飾ＶＰ２遺伝子をＢａｍＨＩにより消化し、バキュロウイルスｐＡｃＹＭ１転移ベクターにサブクローニングした。組換えバキュロウイルスは、Ｂｓｕ３６１によって線状化されたＡｃＲＰ２３ −ｌａｃＺウイルスＤＮＡ５００ｎｇ及び個々の転移ベクター２μｇの、フェルグナー等によって記載されたリポフェクチン処理（1987，Proceedings of the N ational Academy of Sciences，USA,84，7413-7417）を用いた、コトランスフェクションから取得された。組換えウイルスを、それらのＬａｃＺ−陰性表現型によって選別し、プレート上で精製した。次いで、各々の組換えウイルスについて、高力価を有するウイルスストックを調製した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 35/76 Ａ６１Ｋ 35/76 39/12 39/12 39/23 39/23 39/29 39/29 39/295 39/295 Ｃ０７Ｋ 14/015 Ｃ０７Ｋ 14/015 Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者セドリッククリスティーヌフランス国エフ―95100 アルジャントゥーイユリュドュドクトール―ルーク 13 (72)発明者サラセカハビエルスペイン国イー―28041 マドリードサハラ 46 (72)発明者ルクレルククロードフランス国エフ―75015 パリリュデュラントン 20 (72)発明者ロマンリシャールフランス国エフ―75015 パリリュデファボリト２ (72)発明者ルエダパロマスペイン国イー―28011 マドリードカレアントニオウロア１

Claims

【特許請求の範囲】１．少なくとも１種のウイルス構造蛋白質の自動アセンブリーにより構成され、２０と６０ｎｍの間のサイズを有し、略二十面体構造を形成し、前記蛋白質は８〜２５個のアミノ酸の配列を含む少なくとも１種の抗原決定基の存在により修飾され、主要組織適合遺伝子複合体のクラスＩおよび／またはII分子の少なくとも１種と結合することができ、Ｃ３：Ｔ抗原決定基を除き、前記結合がＣＤ８⁺ および／またはＣＤ４⁺Ｔリンパ球により認識されることを特徴とする組換えウイルス偽粒子。２．構造蛋白質が、パルボウイルス科またはその関連ウイルスの少なくとも１種のウイルス蛋白質であることを特徴とする請求項１に記載の偽粒子。３．構造蛋白質が、少なくとも１種のＶＰ２蛋白質であることを特徴とする請求項１及び２のいずれかに記載の偽粒子。４．８〜２５個のアミノ酸の配列は、抗原の分解中のその産生を促進するか、クラスＩまたはII ＭＨＣ分子への結合を促進する配列により隣接されることを特徴とする請求項１〜３のいずれかに記載の偽粒子。５．前記抗原決定基が、少なくとも１種のクラスＩＭＨＣ分子と結合することができる８〜９個のアミノ酸の配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の偽粒子。６．前記抗原決定基が、少なくとも１種のクラスIIＭＨＣ分子と結合することができる８〜２５個のアミノ酸の配列を含むことを特徴とする請求項４に記載の偽粒子。７．前記パルボウイルスが、ＰＰＶ、ＣＰＶ、またはＦＰＬＶまたはＭＥＶのような関連ウイルスであることを特徴とする請求項２〜６のいずれかに記載の偽粒子。８．前記抗原決定基が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスの核蛋白質の抗原決定基であることを特徴とする請求項１〜７のいずれかに記載の偽粒子。９．前記抗原決定基が、リンパ球性脈絡髄膜炎ウイルスの核蛋白質の118-13 2領域に含まれるＣＤ８⁺ ＣＴＬ抗原決定基であることを特徴とする請求項１〜５、７および８のいずれかに記載の偽粒子。１０．前記抗原決定基が、ＨＢＶウイルスの１２０−１３２領域（ＰｒｅＳ２）に含まれるＣＤ４⁺ Ｔ抗原決定基であることを特徴とする請求項１〜４および６〜８のいずれかに記載の偽粒子。１１．少なくとも１種のＣＤ４⁺ Ｔ抗原決定基および少なくとも１種のＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基を含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の偽粒子。１２．ＣＤ４⁺ またはＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基のマルチコピーの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の偽粒子。１３．ルイス・カルチノーマのＭｕｔＣＤ８⁺ Ｔ抗原決定基の４つのコピーの組み合わせを含むことを特徴とする請求項１〜１０のいずれかに記載の偽粒子。１４．パルボウイルスＶＰ２蛋白質及び前記抗原決定基から形成されるハイブリッド蛋白質のバキュロウイルスでの発現工程を含むプロセスにより得ることができることを特徴とする請求項２〜１３のいずれかに記載の偽粒子。１５．前記抗原決定基または前記抗原決定基の組み合わせが、ＶＰ２蛋白質のＮ末端に存在することを特徴とする請求項３〜９のいずれかに記載の偽粒子。１６．生理学的に許容される賦形剤および／または希釈剤中に請求項１〜１５のいずれかに記載の偽粒子を含む組成物。１７．免疫刺激性アジュバントを含まないことを特徴とする請求項１６に記載の組成物。１８．インビボでのＣＴＬ応答、ヘルパーＴ応答及び／又はサイトカインを誘導するための薬物及び／又はワクチンの製造のための請求項１〜１５のいずれかに記載の偽粒子又は請求項１６に記載の組成物の使用。１９．ワクチン、特に抗ウイルスワクチンまたは抗腫瘍薬の製造における請求項１〜１５のいずれかに記載の偽粒子又は請求項１６に記載の組成物の使用。２０．被験者のリンパ球を請求項１〜１５のいずれかに記載の偽粒子に接触させることを含む、ウイルスまたは腫瘍感染に罹った被験者に由来するリンパ球の細胞障害性Ｔ応答のインビトロ刺激プロセス。