JPH10507066A

JPH10507066A - ニワトリ感染性貧血ウイルスワクチン

Info

Publication number: JPH10507066A
Application number: JP8503975A
Authority: JP
Inventors: カーレル・エーシャット、; クリスティアネゾイネ、; ベンジャミンルシオ、; ランディーレンショー、
Original assignee: コーネル・リサーチ・ファウンデーション・インコーポレーテッド
Priority date: 1994-07-06
Filing date: 1995-07-05
Publication date: 1998-07-14
Also published as: US5965139A; WO1996001116A1; EP0769952A1; AU2961195A; US5789567A; EP0769952A4

Abstract

(57)【要約】ニワトリ感染性貧血ウイルスの野性型単離物のゲノムにおける新規配列が記載されている。新規配列によりコードされたポリペプチドＶＰＩのアミノ酸配列も記載されている。さらに、細胞培養適合株に見い出されるＶＰＩの配列と比べ、この単離物のＶＰＩのアミノ酸配列中に位置する新規アミノ酸に関連する該単離物の予測されない性質、およびニワトリ感染性貧血を防除する、ワクチン化のような処置における該新規配列およびそれらのポリペプチドの使用が開示されている。

Description

【発明の詳細な説明】ニワトリ感染性貧血ウイルスワクチン〔１．発明の背景〕１．１発明の分野本発明は、家禽をニワトリ感染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）に対して予防接種するために用いることができる、ＣＩＡＶの新規な特定の株（ＣＩＡ−１）に関する。より具体的には、本発明は、未だ細胞培養に適用されたことがない新規な天然に存在するＣＩＡＶ単離物に関する。該単離物は、細胞培養に適用された株に比較すると、主要なウイルス性ポリペプチドの新規なアミノ酸配列に起因して、潜在的な病原性および細胞親和性における相違を示す。１．２背景および関連技術の説明ニワトリ感染性貧血ウイルス（ＣＩＡＶ）は、マレック病予防接種破壊(Mar ek's disease vaccination break)の研究の際に、1979年に日本で最初に単離された（Yuasa et al.，1979k Avian Dis．23:366-385）。そのとき以来、ＣＩＡＶは全ての家禽生産国において、商業的家禽の中に検出されている（van Bulow et al.,1991，pp.690-699，in Diseases of Poultry，9th edition，Iowa State university press）。ＣＩＡＶは、若いニワトリにおいて、貧血、出血および免疫抑制を特徴とする臨床的疾患を起こすことができる。甲状腺および骨髄の萎縮は、ＣＩＡＶに感染したニワトリの特徴的かつ一貫した病変である。甲状腺、および時としてファブリーキウス(Fabricius)の滑液嚢におけるリンパ球の減少は、免疫抑制、並びに二次的なウイルス感染、細菌感染または真菌感染に対する感受性増大をもたらし、病気の経過を複雑にする。一以上のマレック病ウイルス（ＭＤＶ）、感染性嚢胞病ウイルス、細網内皮症ウイルス、アデノウイルス、またはレトロウイルスによる感染の後、この免疫抑制によって疾病の悪化が生じる。ＣＩＡＶによってＭＤＶの病原性が高められることが報告されてきた（DeBoer et al.，1989，p.2 8，In Proceedings of the 38th Western Poultry Diseases Conference，Tempe ，AZ）。更に、ＣＩＡＶは感染性嚢胞症の兆候を悪化させることが報告されてきた（Rosenberger et al.,1989，Avian Dis．33:707 713）。加えて、老ニワトリにおける無症状のＣＩＡＶ感染は、ブロイラー群における能力減退と相関している（McNulty et al.，1991,A vian Dis．35:263-268）。ＣＩＶＡは、環境的な不活性化および幾つかの普通の殺菌剤に対して高度に耐性であり、この特徴によって病気の伝染性は増強される。養鶏工業に対するＣＩＡＶ感染の経済的な衝撃は、疾病が発生した場合の１０％〜３０％の死亡率、予防接種の失敗、および無症状の感染による感染群の低能力によって表される。ＣＩＡＶは典型的には胚含有卵、およびマレック病ウイルス形質転換ニワトリリンパ芽球細胞系MDCC-MSB-1（MSB-1；Akiyama et al.，1974，Biken J．17:1 05-116）のようなリンパ芽球細胞系に伝染することができるが、ニワトリ胎児繊維芽細胞、ニワトリ腎細胞または他の一次ニワトリ細胞には伝染できない。しかしながら、ＣＩＡ−１株によって証明されたように、全ての株が細胞培養に適用できるわけではない（Lucio et al.，1990，Avian dis．34:146-153）。従って、株の間には生物学的相違が存在する可能性がある。ＣＩＡＶは、直径２５nmの小さな無鞘の十二面体ウイルスであり、2.3kｂの環状一本鎖ＤＮＡからなるゲノムを含んでいる。精製されたウイルス標本には二つのポリペプチドが検出されている。即ち、ＶＰ１と称する約５０キロダルトン（ｋＤa）の主要なポリペプチドと、ＶＰ２と称する２４ｋＤａのポリペプチドである。これらの二つのポリペプチドが一緒になって、ウイルス中和性抗体を産生するための主エピトープを形成する。幾つかの異なったＣＩＡＶ単離物のゲノムＤＮＡが報告されている。ノートボーン等（Noteborn et al.）によって単離物であるＣｕｘ−１の配列が決定され（1991，J．Virol．65:3131-3139；参照として本願に組み込まれる）、51.6ｋＤａ、24.0kＤａおよび13.6ｋＤａのポリペプチドを潜在的にコードする三つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦｓ）が明らかになった。該ＯＲＦ類の上流にはプロモータエンハンサ領域が一つだけ存在し、また該ＯＲＦ類の下流には一つのポリアデニル化信号が存在する。このＣｕｘ−１ゲノムからは、2100塩基の単一の切除されないｍＲＮＡが転写される（Noteborn et al.，1992,Gene 118:267-271）。別のグループもまた、Ｃｕｘ− １株の配列決定を行った。しかしながら、それらの配列データとノートボーン等の配列データとの間には相違があつた（Meehan et al.，1992，Arch．Virol．12 4:301-319：参照として本願に組み込まれる）。U.S.A.で単離された２６Ｐ４株のヌクレオチド配列もまた、Ｃｕｘ −１の配列と比較したときには、多くのヌクレオチドの相違を示した（Claessen s et al.，1991，J．Gen．Virol．72:2003-2006；参照として本願に組み込まれる）。世界中から得られた種々の単離物に見られるヌクレオチド配列の相違にもかかわらず、アミノ酸配列には僅かな相違しか認められていない。これらの理由のために、ＣＩＡＶは高度に保存されたウイルスであると仮定されている。従って、ＣＩＡＶに露出させることは、ニワトリにおいて、それらの子孫をＣＩＡＶ感染から保護する母系抗体を誘導する可能性がある。しかしながら、何れかのＣＩＡＶ株を用いたこのようなワクチン接種は、（卵を介しての）垂直伝播および環境汚染を含む固有の問題を有している。従って、ＣＩＡＶを含む精製されたポリペプチド（類）を免疫原として有するワクチンの開発が望まれている。発明の概要〕本発明に従って、ＣＩＡＶ株であるＣＩＡＶ−１、即ち、非細胞培養適用株に三つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ−１，ＯＲＦ−２，ＯＲＦ−３）が検出された。ＣＩＡＶ−１から得たこの三つのＯＲＦｓを他のＣＩＡＶ単離物、特にプロトタイプである細胞培養適用株Ｃｕｘ−１（Ｃ）株と比較することによって、ＯＲＦ−１によってコードされるポリペプチド（ＶＰ１）が、ＶＰ１におけるコンホメーション変化に潜在的に影響を及ぼす少なくとも４つの独特なアミノ酸変化を含んでいることが明らかになった。ＣＩＡ−１は、培養体中のＭＳＢ−１細胞のコーネル・サブライン(Cornel subline)中で複製できないので、ＶＰ１における一以上の独特なアミノ酸変化が、細胞の病理学（「病原性」）に影響を及ぼすウイルス生物学における相違の原因であるらしい。加えて、ＣＩＡ −１がある種の培養細胞系に感染できないこと（「細胞親和性(cell tropism)」）は、ＶＰ１における一以上のアミノ酸変化がこのような親和性の原因であることを示している。従って、本発明の一つの目的は、この新規な単離物のフェノタイプにおいて観察された相違に含まれるポリペプチド（類）を同定することである。本発明の他の目的は、ＣＩＡＶ感受性の家禽における感染の定着または病気の進行を妨げることによって、ＣＩＡＶ感染を制御するためのアプローチを提供することである。本発明の他の目的は、当該ウイルスに関連した一以上のポリペプチドに対する保護抗体および／または細胞媒介性免疫応答を誘導することによって、ＣＩＡＶにより引き起こされる病気の発生を予防することである。本発明の他の目的は、該ウイルス性ポリペプチドに対する保護抗体および／または細胞媒介性免疫応答であって、前記ポリペプチドは細胞培養適用株におけるよりもＣＩＡＶの野生型株を反映しているような、上記免疫応答を誘発させることである。本発明の他の目的は、夫々のＣＩＡＶポリペプチド（類）をコードする一以上の核酸配列であって、発現のために組換えウイルスベクターに挿入することができ、或いは感受性のニワトリに直接導入することができる核酸配列を提供することである。本発明の他の目的および利点は、以下の説明によって容易に明らかになるであろう。〔３．図面の簡単な説明〕図１は、ＣＩＡ−１ゲノムにおけるＯＲＦ−１，ＯＲＦ−１，ＯＲＦ−３、プロモータエンハンサ領域（Ｐ−Ｅ）およびポリアデニル化信号（ＰＡＳ）の構成を示す模式図である。図２は、ＣＩＡ−１・ＯＲＦ−１によってコードされたポリペプチドに関する親水性プロットである。三つの変化に留意されたい。即ち、位置Ａにおいては、二次構造に２ターン（Ｃ高tＸ−１では３）が存在する。位置Ｂにおいては、ＣＩＡ−１ポリペプチドにおける親水性シフトが示されている。位置Ｃにおいて、ＣＩＡ−１はＣＩＡ−１ポリペプチドに比較して追加のターンを有している。図３は、ＣＩＡ−１・ＤＮＡおよびＣｕｘ−１・ＤＮＡを用いた、種々のキメラウイルスクローンの構築を示す模式図である。図４は、夫々のキメラウイルスクローンでトランスフェクトされた細胞（免疫蛍光試験でＣＩＡＶタンパク産生について陽性）のパーセンテージを、トランスフェクション後の日数に対してプロットして示すグラフである。図５は、ＣＩＡ−１・ＤＮＡおよびＣｕｘ−１を用いた、種々のキメラウイルスクローンの構築を示す模式図である。隣の表は、免疫蛍光試験でＶＰ３について陽性の、ウイルスクローンに感染したＭＳＢ−１（Ｌ）に対するＭＳＢ−１（Ｓ）のパーセンテージを示している。ダッシュは免疫蛍光試験における陰性結果を示しており、ｎｄは免疫蛍光試験が行われなかったことを示している。〔４．発明の詳細な説明〕ＣＩＡＶゲノムは、長さが約2,300ヌクレオチドの環状の一本鎖分子である。これは三つの重なり合ったリーディングフレーム（ＯＲＦ類）からなっており、各リーディングフレームは、ここではＯＦＲ−１，ＯＲＦ−２，ＯＲＦ−３と称され、夫々51.6ｋＤａ（ＶＰ１）、24.0ｋＤａ（ＶＰ２）および13.6ｋＤａ（ＶＰ３）のポリペプチドを潜在的にコードする。ゲノム中に配置されたとき、これら三つのＯＲＦ類は相互に、一部または完全に重なり合っており、同一の上流領域をプロモータおよびエンハンサとして使用し、また該ＯＲＦ類の下流に位置した同一のポリアデニル化信号を使用するように見える（図１）。現在は、ＣＩＡＶがニワトリ感染性貧血を起こすプロセスは僅かしか理解されていない。ＣＩＡ−１が１日齢の感受性のニワトリに導入されると、ＣＩＡ− １は低ヘマトクリット値、骨髄における赤血球およびリンパ球の減少、甲状腺の髄質および皮質のリンパ球（以下ではＴ細胞と言う）の減少、並びに肝臓、心臓および腎臓における炎症性病変を含むニワトリ感染性貧血に特徴的な兆候および病変を起こさせる。該ＣＩＡＶ・ＯＲＦｓによってコードされる一以上のポリペプチドは、感受性細胞への進入を容易にし、および／またはＴ細胞アポトーシスを開始させることによって、ニワトリ感染性貧血の病因における役割を果たす。「独特のアミノ酸変化」の用語は、本明細書および請求の範囲の目的においては、プロトタイプの細胞培養適用株Ｃｕｘ−１（Ｃ）、並びに他の幾つかの細胞培養適用株と比較したときの、ＣＩＡ−１・ＶＰ１アミノ酸配列に存在する一以上の変化またはアミノ酸置換を言う。ここで用いる「ポリペプチド」の用語は、本明細書および請求の範囲の目的においては、生物学的機能を有するアミノ酸鎖を言い、該鎖の特定の長さには言及しない。従って、ポリペプチドはペプチド、オリゴペプチド、並びにＣＩＡＶのＣｕｘ−１、ＣｏｎｎおよびＧＡ株と比較したときのＣＩＡ−１に独特なアミノ酸変化を含むタンパクを呼称するために用いることもある。更に必要であれば、このポリペプチドは、例えばグリコシル化、アミド化、リン酸化、カルボキシル化または置換によって、重要な生物学的機能を変化することなくイン・ビボまたはイン・ビトロで修飾することができる。ポリペプチドにおけるアミノ酸の置換、特に側鎖基の極性および／または電荷に変化を生じるような置換は、該ポリペプチドの二次構造に反映され、従って該ポリペプチドまたは該ポリペプチドを含むビリオンの生物学的活性を変化させることができる。幾つかの細胞培養適用ＣＩＡＶ株と比較したときに、本発明のＣＩＡ−１ポリペプチドであるＶＰ１の推定アミノ酸配列はそのようなアミノ酸置換を示すから、このことは重要である。また、ＣＩＡ−１のＶＰ２およびＶＰ３にもアミノ酸置換が存在する。ここに開示するポリペプチドの機能的均等物、即ち、同じアミノ酸配列または関連アミノ酸の間でのアミノ酸置換もったポリペプチド（即ち、同様の極性および／または電荷を有するもの）は、本発明の範囲内にあるものである。かかる機能的均等物をコードする核酸配列は、本発明の範囲内にあるものである。即ち、核酸配列の調製および修飾のための組換えＤＮＡ技術の分野において周知のように、遺伝コードの縮重は、コドンにおける塩基を置換して、やはり同じアミノ酸をコードする他のコドンを生じさせることを許容する。突然変異誘発、挿入および／または合成を用いて、夫々の機能的に均等なポリペプチドをコードするような、ＯＦＲ−１，ＯＲＦ−１，ＯＲＦ−３の核酸配列誘導体を生成させることができる。こうして、配列ＩＤ番号１〜３に与えられた情報は、当業者が、配列ＩＤ番号１〜３に開示されたポリペプチドの生物学的機能および免疫学的活性を有する機能的に等価なポリペプチドをコードする核酸配列を単離し、同定することを可能にする。本発明に従う方法および手順、並びにウイルス増殖、核酸配列の増幅、クローニング、配列決定、制限酵素分析およびトランスフェクションを含む当業者に公知の方法および手順を用いることによって、他のＣＩＡＶ〜ＤＮＡを取得し、配列ＩＤ番号１〜３に開示した本発明のポリペプチドと機能的に均等なポリペプチドをコードできるＯＲＦ類を同定することができるであろう。加えて、配列ＩＤ番号１〜３に開示した核酸配列のフラグメント（即ち、ＤＮＡサブ配列）は、配列ＩＤ番号１〜３に開示したポリペプチドの一以上の免疫反応性／抗原決定基および／または前記ポリペプチドと均等な生物学的機能に関連した決定基を有するペプチド（開示されたポリペプチドのサブ配列で、ＣＩＡ−１の一以上のアミノ酸変化を含むもの）をコードするために用いることができる。こうして、本発明の範囲内に含まれるポリペプチドには、本発明で開示するＣＩＡ −１の夫々のポリペプチドにおける一以上のアミノ変化を特に含み、且つニワトリにおいて免疫応答を誘発する能力を含むポリペプチドに特徴的な、一以上の決定基を有するポリペプチドが含まれる。本発明の核酸配列のこのような修飾、およびこれらがコードするポリペプチドについては、以下の具体的な態様において更に詳細に説明する。本発明は特に、ＣＩＡＶ単離物であるＣＩＡ−１から得たＯＲＦ−１と、その遺伝子産物ＶＰＩの同定および特徴付けに関する。ＣＩＡ−１はニワトリの中で増殖し、感染したニワトリの細胞は該ウイルスの単離に用いられる。一方、Ｃｕｘ−１、ＧＡおよびＣｏｎｎのような他のＣＩＡＶ株はイン・ビトロの細胞培養において増殖することができ、且つそようようにして増殖された。これらＯＲＦ類の相対的な配置は図１に示されている。ＤＮＡを単離した後、クローニング、配列決定および発現を容易にするために、ポリメラーゼ連鎖反応によって増幅した。ＣＩＡ−１のＤＮＡ配列から、三つのオープンリーディングフレーム（ＯＲＦ−１、配列ＩＤ番号１；ＯＲＦ−２、配列ＩＤ番号２；ＯＲＦ−３、配列ＩＤ番号３）が同定された。これらは夫々、分子の大きさが約５１ｋＤａ（ＶＰ１）、２４ｋＤａ（ＶＰ２）および１３ｋＤａ（ＶＰ３）のポリペプチドをコードすることができる。ニワトリ感染性貧血に罹患したニワトリを治療する有効な薬剤がなく、また当該ウイルス自体をワクチンに用いると垂直伝播のような問題があるため、ニワトリ感染性貧血を制御するための別のアプローチを考慮しなければならなかった。本発明の一つの態様は、ＣＩＡＶに感染した細胞における続発症の発生を阻害することによって、ニワトリ感染性貧血の発生を抑制することである。従って、この態様の一つの変形においては、ニワトリを免疫感作して、ＣＩＡＶによる感染および／またはＴ細胞アポトーシスの開始を阻止するような免疫反応を誘導するために、本発明の一以上の新規なポリペプチドが用いられる。この態様の他の変形においては、ＶＰ１，ＶＰ２またはＶＰ３の一以上をコードするＤＮＡを、ニワトリの組織または孵卵１７〜２１日の胚の中に直接注入することができる。この態様の他の変形においては、三つのＯＲＦ類の一以上を、それ自身がワクチンとして有用な何れかのベクターの中へ或る向きで挿入して、一以上の制御要素に機能的に連結することができ、或いはその中で夫々のＯＦｒが発現されて夫々のポリペプチドが産生されるような生の若しくは弱独化された微生物中に導入することができる。こうして、例えば、卵中(in ovo)の胚に接種するか、或いは孵化後のニワトリに直接接種し得る組換えウイルスワクチンベクターを構築することができる。この態様の更に別の変形においては、三つのＯＲＦ類の一以上をプラスミドベクターに挿入することができる。この組換えプラスミドは、イン・ビボでの転写が誘導性プロモータまたは構成プロモータによって調節されるように構築される。該組換えプラスミドは、次いで卵中の胚に注入されるか、或いは孵化後のニワトリに直接注入される。この態様の他の変形には、三つのＯＲＦ類の一以上を発現するトランスジェニックニワトリを発生させることが含まれるが、ここでの転写は誘導性プロモータまたは構成的プロモータの制御下にある。本発明の第二の態様は、配列ＩＤ番号１〜３に開示したポリペプチドの一以上を用いたワクチン接種に関する。この態様の一つの変形においては、ヒヨコまたはニワトリが、ＣＩＡＶ抗原の攻撃またはＣＩＡＶに感染した細胞を認識するような免疫応答を誘導することによって保護を誘発する、一以上のポリペプチドを含有したるワクチンで免疫感作される。この態様の他の変形においては、ここに開示したポリペプチドから誘導された（ＣＩＡ−１に見られる一以上のアミノ酸変化を含む）一以上のペプチドが、ワクチン組成物中の免疫原として用いられる。或いは、該ワクチンは、夫々のポリペプチドが発現されるように強力なプロモータの制御下にある一以上のＯＲＦ類を含むベクター、例えば組換えウイルスベクターを含有していてもよい。この態様の他の変形において、該ワクチンは、一以上のＯＲＦ類のヌクレオチド配列フラグメントを含む組換えベクターのようなベクターを含有しており、ここで該ヌクレオチド配列フラグメントは、液性免疫応答を誘導するエピトープ（略１５アミノ酸）または細胞媒介性免疫応答を誘導するエピトープ（略９アミノ酸）をコードしており、ＣＩＡ−１における一以上のアミノ酸変化を含んでいる。液性免疫を誘導するエピトープを含む領域の決定は、親水性度および二次構造の分析に基づくことができる（例えば、Hopp et al.，1981，Proc．Natl．Acad．Sci.USA 78:3824-3828；Chou et al.，1978，Ad v．Enzymol．Relat．Areas Mol．Biol.47:45-148を参照されたい）。同様に、細胞媒介性免疫に重要なエピトープの決定は、両親媒性(amphilicity)を含むアミノ酸構造の分析に基づいて導くことができる（例えば、Berzofsky，1987，Science 235:1059-1062を参照されたい）。カテプシンＤのような或る種の酵素を用いたポリペプチドの開裂は、抗原提示細胞の表面にある腫瘍組織適合性複合体によって認識されるアミノ酸残基をもった、ＮＨ２末端フラグメント／ペプチドを生成することが知られている（Van Noort et a l.，1989，J.Biol．Chem．264:14159，1989）。例１ ORFs-1-3の単離と特徴付け細胞培養適応化株のCux-1(C)（Chandratilleke et al.，1991，Avian Dis.35: 854-862）、GA（Goodwin et al.，1989，pp.21-23 in Proc．38th Western Poul try Disease Conference，Temple，AZ）及びconnを、ウイルスゲノムDNAの単離源として利用した。これらの株を、マレック（Marek）病ウイルスで形質転換したT細胞株のMDCC-MSB-1で培養した（MSB-1; Yuasa，1983，Natl．Inst．Anim．H ealth Q．23:13-20）。Cornel亜株であるMSB-1細胞中では複製しない、生後一日のニワトリで増殖させた、CIA-1単離体（CIAV-1のCux-1株，Conn株，及びGA株とは対照的に）を、ウイルスゲノムDNAの源として利用した。CIAVに対する抗体がないことが実験的に示されている、上記の生後一日のニワトリを筋肉内注射した（Lucio et al.，1990，同上）。感染したこれらのニワトリから肝臓細胞、胸腺細胞、及び骨髄を得て、これよりCIA-1を単離した。 Hirtの方法（1967，J．Mol．Biol．26:365-369）により、ウイルスを感染済み MSB-1細胞より単離した。この方法では、感染細胞をドデシル硫酸ナトリウムでの処理することと、それに続いて高分子量細胞性DNAの高塩濃度（1M NaCl）での沈殿とが行なわれる。次いで低分子量ウイルスRF（複製型；二本鎖）DNAを溶解緩衝液より、フェノ−ル・クロロホルム抽出及びエタノ−ル沈殿により精製した。感染組織を単離し、細胞を１０％の懸濁液にし、その細胞懸濁液を１０分間ボイルし、その懸濁液を１時間、1ml当たり100μgのプロテイナ−ゼKで５０℃でインキュベーションし、次いでその酵素を９５℃で１０分間不活化し、低分子量RF DNAをフェノ−ル・クロロホルム抽出とエタノ−ル沈殿させて、ウイルスをCIA-１に感染したニワトリの細胞より単離した。 DNAの増幅は商業的に可能な、どのような方法によっても可能である。例えばポリメラ−ゼ連鎖反応（PCR）によりDNAを増幅することも可能である。プライマが一旦標的DNAの反対側の鎖にハイブリダイズすれば、温度を上げ、二つのプライマに挟まれているDNAの特異的部分を、熱安定性のDNAポリメラ−ゼで複製させることができる。次いでこの反応を温度サイクルにかけ、それぞれのサイクルにおいて、二つのプライマに挟まれた配列に一致するDNAを倍増して、CIAV DNAの特異的配列の増幅が起きる。 CIAVの全ての株のゲノムは、ソワネ（Soine）らの方法（1993，Avian Dis．37 :467-476;これをここで開示することで本願に組み込む）により、ポリメラ−ゼ連鎖反応を利用してRF DNAより増幅させることができる。一組のプライマ（配列認識番号４及び５）を使用して、RF DNAの１５００塩基対を増幅させた。二組目のプライマ（配列認識番号６及び７）を使用してRF DNAの残りの８００塩基対を増幅させた。反応は以下のようにして行った。増幅させるDNA（約1μgのゲノムD NA）を0.5mlのマイクロチュ−ブに分配し、以下のものを具備した反応混合液で容量を100μlに調節した：0.2mM dNTPs(dATP，dCTP，dGTP，dTTP)、１μMの+及び-のオリゴヌクレオチドプライマ、２単位の熱安定性DNAポリメラ−ゼ、及び緩衝液（50mM KCl，10mM Tris-HCl pH8.3，0.15mM MgCl2，0.001%(wt/vol)ゼラチン）。約70μlの鉱物油をそれぞれのチュ−ブに加えて重層して、次いでチュ− ブを温度サイクラ−へかけた。ウイルスDNAの増幅には慨して、３０から３５サイクルで十分である。熱サイクルは９４℃、５分の長い熱変性ステップで始めた。DNAの増幅は３０サイクルで行い、始めの５サイクルは９４℃の熱変性１分、６５℃のアニ−リング２分、７２℃の伸長２分であった。次の５サイクルは、９４℃で１分、６０℃で１分、７２℃で２分であった。この後に最後の伸長ステップを７２℃で５分間行った。増幅産物のクロロホルム抽出の後、得られた産物のサイズはアガロ−スゲル電気泳動で調べることができる。増幅され、精製された１５００塩基対及び８００塩基対の断片を次いで、EcoR I及びBmHIの両方で消化し、ともに連結した。これを次いで、EcoRIで消化した後にEcoRIで消化済みのpBleuscriptKSIIヘクロ−ニングした（Soine et al.，1993 ，同上）。このプラスミドを使用して、大腸菌（E.coli）株DH5αを形質転換した。それぞれのクロ−ンであるCux-1、GA、conn、及びCIA-1の配列を鎖終結法（ chain termination methods）で決定した（Sanger et al.，1977，Proc．Natl． Acad．Sci．USA74：5463-5467）。+または-鎖のどちらかでオ−バ−ラップした配列伸長部分を提供するサブクロ−ンを構築して、T3及びT7プロモ−タプライマ部位を利用して配列決定を行った。まず異なるサブクロ−ンを配列決定して、ポリメラ−ゼ連鎖増幅でのクロ−ニングが変異を生じていないかどうかを決定した。しかしながら違いは見られなかった。ヌクレオチド配列を分析するのに、CIA-1、GA、Conn、及びCux-1(C)のそれぞれの配列を、ノテボ−ン（Noteborn）らが決定した配列と比較した（Cux-1(N):1 991、同上）。CIA-1ゲノムクロ−ンは、Cux-1(C)と比較すると、４２ヌクレオチドの違いがあり、そのうちの３６は３つのタンパク質読み取り枠の中にあった。最も大きな変化はCIA-1のプロモータ・エンハンサ領域にあり、繰り返し単位（以下の配列を有する繰り返し単位：CGTACAGGGGGGTACGTCATC）は５ではなくてわずかに４つしかなく、その結果としてCux-1(C)の2319塩基対と比較してCIA-1は2 298塩基の長さを有していた。一番目の繰り返しは、両方の鎖の144番目のヌクレオチドより始まっていた。CIA-1及びCux-1(N)に関して、制限酵素FokI認識部位を分析することにより、３番目の繰り返しを欠失していることが判明した。細胞培養適応株であるGA、Conn、Cux-1(C)はそれぞれコ−ド領域の３、５、１ヌクレオチドが変化していた。これらの３つの株は全て、プロモ−タ・エンハンサ領域で５つの繰り返し単位を有することが示され、繰り返しの培養により５番目の繰り返しが選択されていることを示唆している。 CIA-1のプロモ−タ・エンハンサ領域に関して、既知の転写因子の結合部位を検索した。転写因子結合部位は以前に記載されたものと相関し（Noteborn et al .，同上；Meehan et al.，1992，同上）、TF II D(部位：ヌクレオチド301-308) 、CCAAT-TF （ヌクレオチド239-245）、SP1(ヌクレオチド284-289)、ATF(ヌクレオチド157-1 62、178-183、211-216、232-237)、CREB(ヌクレオチド270-276)が含まれる。ポリAシグナルはタンパク質読み取り枠の下流に位置していた（ヌクレオチド2266- 2271）。ポリペプチドVP1，VP2，VP3の完全なアミノ酸配列はそれぞれ、配列認識番号1 -3に記載されている。CIA-1とCux-1(C)のタンパク質読み取り枠の推定のアミノ酸配列を、CIAVの細胞培養適応株のその他の既知の配列と比較すると（表１）、 CIA-1のORF−１がコ−ドしているVP1の中に４つのユニ−クな変異があり、VP2中に、CIAVの細胞培養適応株のほとんどにおいて存在しない１アミノ酸の変異があり、更にVP3中に、CIAVの細胞培養適応株のほとんどにおいて存在しない１アミノ酸の変異があることがことが明らかになった（下線部）。例２ CIA-1の生物学的特徴 CIA-1は、MSB-1のコ−ネル（Cornell）亜株（Lucio et al.,1990，同上）、及びCU147細胞（Lucio，未発表）中で複製できない。後者の細胞株はMSB-1(L)細胞に比べてより複製に感受性である。CIA-1のVP1ポリペプチド中で見られる一つ以上のアミノ酸配列の差異は、CIA-1が細胞培養中で複製しないことに関わっていると推定されている。例えば、CIA-1のタンパク質読み取り枠−１がコ−ドする５０kDaのポリペプチド、VP1中には４つのアミノ酸変異が分かっている。この５０kDaのポリペプチドはウイルスのカプシドタンパク質であると考えられている(Todd et al.， 1990,J．Gen．Virol．71:819-823)。よって、例えばカプシドタンパク質中のコンホメ−ション変化は吸着とウイルスの感受性細胞への穿通が含まれるプロセスや、その後のウイルスゲノムのアンコ−ティングに影響を与える。VP1中のアミノ酸変異と、細胞培養中での複製の欠損とを関連づけるために、CIA-1 RF（二本鎖環状）DNAを使用した実験を行った。対照として、Cux-1RF DNAの形質転換をパラレルで行った。感染性クロ−ンからのウイルスRF DNAは、感受性の細胞へ形質移入されると、複製と転写を始めるはずである。よってウイルスの複製は、感染細胞中でのウイルスタンパク質の産生により証拠付けられる（免疫抗体法のような方法で）。感染細胞中のウイルスDNAが存在し、ウイルスタンパク質が欠失しているということは、CIA-1のVP1中にある一つ以上のユニ−クなアミノ酸のにより、CIA-1が細胞培養中で複製できないという証拠である。形質移入は300V、960μFのキャパシタンスでの、エレクトロポレ−タを使用した電気穿孔法で行った（Schat et al.，1992，Avian Dis．36:432-439;この開示は本願で参照することで本願に組み込む）。形質移入前にMSB-1細胞を遠心しながら、細胞分離グラジエントに２４時間かけた。電気穿孔の前にこの細胞をPBS で一回洗浄し、LMを基本とした無血清培地に再懸濁して濃度を1Ｘ10⁶／mlとした。電気穿孔法では10μlのCIAV(CIA-1またはCux-1の何れか)RF DNA（水）を400μ lの細胞懸濁液に加えた。電気穿孔法のすぐ前とすぐ後で、細胞を１０分間氷の上に置いた。LBを基本とした、１０％血清添加培地で細胞を希釈して４mlにし、次いで24穴のプレ−トへ移した。形質移入後１４日目に、細胞を3000rpmで30分間遠心し、細胞及びその他の粒子を沈殿させた。上清液の一部を90,000Xgで5時間超遠心して、その沈殿を保存した。この沈殿、及び元の細胞培養上清液を使用して、24穴中のMSB-1細胞を感染させた。 LacZ遺伝子を有する、５μgのプラスミドpNL1（またはpRC/LTRLacZ）（Schat et al.，1992，Avian Dis．36:432-439）をCIAV RFDNAとともに形質移入して、電気穿孔法の効率を決定した。LacZ発現は、基質５−ブロモ−４−クロロ−３− インドリル−β−D−ガラクトピラノシド（X-gal）を形質移入後２日目に使用して、βガラクトシダ−ゼ活性を測定して決定した。細胞を洗浄し、PBS中に濃度1Ｘ10⁷細胞/ mlで懸濁した。細胞を5Ｘ10⁴でスライドにのせて風乾して、0.2%(v/v)のグルタルデヒド、2％（ｖ／ｖ）ホルムアルデヒド、及び2mMのMgCl₂を含んだ0.05Mのリン酸緩衝液（pH7.4）で固定した。次いで細胞を以下のものを含有する溶液(0.05 Mのリン酸緩衝液（pH7.4）)中で最高16時間37℃でインキュベーションした：0.5 mgX-gal/ml、5mMフェリシアニド（ferricyanide）カリウム、5mM フェロシアニド（ferrocyanide）カリウム、及び2mM MgCl₂。 CIAV RF DNAで形質転換した、MSB-1（L）細胞のコ−ネル亜株を、ウイルスタンパク質の産生に関し、免疫抗体法で形質移入後３日おきに調べた。CIAV DNA以外でエレクトロポレ−ションした、MSB-1（L）細胞のコ−ネル亜株を、陰性の対照として使用した。形質移入した細胞をPBSで一回洗浄し、次いで一つのウェルにつき5Ｘ10⁴の細胞を、12穴のスライへ落として風乾した。室温のアセトンでの 10分間の固定化後、細胞を室温で30分間モノクローナル抗体51.3（CIAVのタンパク質VP3に特異的）とインキュベーションした（Chandrattilleke et al.，1991 ，同上）。この抗体を使用して、CIA-1に感染したニワトリの胸腺組織中にウイルス抗原が存在することが証明された（Hu et al.，1993，Avian Dis．37:157-1 69,及び37:492-500)。スライドをPBSで洗浄し、次いでFITC接合化ウサギ抗マウス抗体で30分間インキュベーションした。二回目の洗浄後、スライドをグリセリン緩衝液（90%グリセリン、10％Tris-HCl緩衝液pH8.7）でマウントし、蛍光を顕微鏡下で調べた。環状化したCux-1 RF DNAでMSB-1細胞のコ−ネル亜株を形質移入すると、形質移入後5日目に特異的蛍光が起きた。陽性細胞は、形質移入後15日目まで増加した。形質移入後に感染性ウイルスが回収できるかどうかを確認するために、形質移入後15日目の上清液を、MSB-1細胞への感染のための接種液として利用した。更に、MSB-1細胞を、超遠心で沈殿化した物質で感染させた。それぞれの場合、ウイルス陽性細胞は免疫蛍光により検出することが可能である。沈殿化した物質で感染させた細胞は形質移入後、上清を接種液として使用して感染させた細胞に比べて、5日前から免疫蛍光に関して陽性であった。これとは対照的に、CIA-1 RF DNAによるMSB-1細胞のコ−ネル亜株の形質移入は、何度行ってもウイルス複製を確立することができなかったが、これは免疫蛍光の欠如で証明される。しかしながら、0.01から0.03％のMSB-1細胞はβ−ガラクトシダ−ゼに関して陽性であり、これはpNL1が存在していて、そのために形質移入は適切であったことを示している。ポリメラ−ゼ連鎖反応を利用して、CIA-1 DNAが電気穿孔法でMSB-1(L)細胞にうまく形質移入されたことを確認した。形質移入後6日目に、形質移入された細胞をPBSで３回洗浄し、DNAを抽出した。DNA増幅のテンプレ−トとして100ngのDN Aを使用した。配列認識番号４及び５に示されているプライマを使用して、1.5kb のゲノムの断片を増幅した。形質転換しなかったMSB-1細胞より抽出したDNAを、陰性対照とした。増幅の条件は、増幅された断片のサイズの確認のためのアガロ −スゲル電気泳動法とともに、以前に記載されている（例えば、Soine et al.， 1993,同上；及び例１を参照）。形質移入後6日目で、疑似形質移入したMSB-1細胞ではなく、Cux-1RF DNAで形質移入した細胞は、CIAV DNAに関して強く陽性を示したが、これは増幅された1500bpのDNA断片がアガロ−スゲル中で臭化エチジウム染色で視覚化されているこで示されている。CIA-1 RF DNAで形質移入された細胞もまた、CIAV DNAに関して陽性であったが、増幅された1500bpの断片の量は Cux-1に感染した細胞に関して視覚化されたものよりも少なかった。しかしながら、CIA-1 RF DNA由来の増幅された1500bpの断片が存在することは、ウイルスDN Aが少なくとも形質移入された細胞の一部で存在していることを示している。例３ CIA-1生物学-ウイルス複製、及び細胞病理に影響を与えるポリペプチドの同定この態様は、キメラのCIAVウイルスを構築することに向けられていて、細胞培養適応株の原形であるCux-1と比較した時に、CIA-1 VP1のユニ−クなアミノ酸配列が、CIA-1に感染した細胞の病理と、その細胞中におけるウイルス複製とに関しての差異の主要なメディエ−タであるかどうかを確認するためのものである。 MSB-1細胞では、CIA-1はCux-1(C)単離株に比べて細胞変性が顕著に低いことが分かった。図４に示されているように、等しいMOI（感染多重度）での感染においては、Cux-1の感染は感染後4から6日後で高レベル（60-90％）での細胞感染を起こした。これとは対照的に、CIA-1による感染では、同等のレベル（60-90％）に達するには通常10-14 日間かかる。CIAVのCux-1株(Noteborn et al.，1991，同上)から単離したDNA、及びCIA-1由来のDNAを種々の制限酵素の組み合わせで消化して、Cux-1DNA及びCI A-1DNAの特異的部分をともに連結して４つのCIAVウイルスのキメラクロ−ンを構築した（図３）。Cux-1の配列のヌクレオチドの番号付けは、報告されているCux -1の配列と、番号付けを参照して行った（Noteborn et al.，1991,同上）。CIA- 1配列の番号付けは配列認識番号１に記載のCIA-1の配列と、番号付けを参照して行った。図３に示されているように、キメラのウイルスクロ−ンpCIA/Cux S-B、及びpC ux/CIA S-Bは、Cux-1 DNA、及びCIA-1 DNAをSacI及びBamHIで消化して形成させた。すなわちSacI部位（5’末端はヌクレオチドの868）よりBamHI部位（3’末端はヌクレオチドの1507）まで続く、Cux-1のヌクレオチド配列をCux-1より取り除き、ついでCIA-1のSacI部位（3’末端はヌクレオチドの846）とCIA-1のBamHI（5 ’末端はヌクレオチドの1487）とで、CIA-1配列へ連結して、pCIA/Cux S-Bを形成させた。同様に、SacI部位（5’末端はヌクレオチドの847）からBamHI部位（3 ’末端はヌクレオチドの1486）までのCIA-1ヌクレオチド配列をCIA-1配列より取り除き、次いでCux-1のSacI部位（3’末端はヌクレオチドの867）とCux-1のBamH I（5’末端はヌクレオチドの1508）とで、Cux-1へ連結して、pCux/CIA S-Bを形成させた。図３に示されているように、キメラのウイルスクロ−ンpCIA-/Cux N-B、及びp Cux/CIAN-Bは、Cux-1 DNA、及びCIA-1 DNAを、NheI及びBamHIで消化して形成させた。すなわち、NheI部位（5’末端はヌクレオチドの1192）からBamHI部位（3 ’末端はヌクレオチドの1507）までの、Cux-1のヌクレオチド配列をCux-1配列より取り除き、次いでCIA-1のNheI部位（3’末端はヌクレオチドの1171）とCIA-1 のBamHI部位（5’末端はヌクレオチドの1487）とで、CIA-1配列へ連結し、pCIA/ Cux N-Bを形成させた。同様に、、NheI部位（5’末端はヌクレオチドの1172）からBamHI部位（3’末端はヌクレオチドの1486）までの、CIA-1のヌクレオチド配列をCIA-1配列より取り除き、次いでCux-1のNheI部位（3’末端はヌクレオチドの1191）と、Cux-1のBamHI部位（5’末端はヌクレオチドの1508）とで、Cux-1配列へ連結して、pCux/CIA N-Bを形成した。全てのキメラクロ−ンの構築はヌクレオチド配列決定により確認した。例２に記載の方法にそって、これらのキメラウイルスクロ−ンを別個にMSB-1 細胞へ導入した。感染したそれぞれのMSB-1細胞を次いで、ウイルス複製に関して、免疫蛍光によるウイルスタンパク質産生の検出で調べた（例２を参照）。ウイルスタンパク質がないことは、そのキメラクロ−ンが培養細胞中で複製できないことの証明である。図４は、それぞれのキメラウイルスクロ−ンで形質移入され、CIAVタンパク質産生に関して陽性であることが免疫蛍光により示されている細胞を示すグラフであり、形質移入後の日数に対してプロットされている。CIA- 1、キメラクロ−ンCux/CIA S-B、及びキメラクロ−ンCux/CIA N-Bを含む細胞と比較すると、Cux-1、キメラクロ−ンCIA/Cux S-B、及びキメラクロ−ンCIA/Cux N-Bは、形質移入後数日間より早くから、より高い割合の細胞でCIAVタンパク質産生／ウイルス複製を陽性にすることが図４から証明される。これらの観察に基づいて、以下のことが結論できる：a)Cux-1 VP1のアミノ酸配列と比較したときの CIA-1 VP1のアミノ酸配列の差異は、観察されるCIA-1感染の表現型の差異の原因である；b)そのようなアミノ酸配列の差異は、CIA-1 VP1の139位及び/または144位（超可変領域と推定される）のユニ−クなアミノ酸に位置づけられ、さらにCIA-1の表現型の差異の主要なメディエ−タである（Cux-1と比較してCIA-1 に感染した鎖異母の病理とその細胞内でのウイルス複製における差異）。例４ CIA-1の生物学−細胞親和性に影響を与えるポリペプチドの同定細胞培養適応型でない幾つかの単離体（野生型）は、細胞培養適応型のCIAVを継代するのに使用する細胞株中では複製しない。このような細胞親和性の基礎は明らかではない。この態様は、キメラのCIAVウイルスの構築に向けられていて、細胞培養適応株の原形であるCux-1と比較した時に、CIA-1 VP1のユニ−クなアミノ酸配列が、CIA-1の細胞親和性における差異の主要なメディエ−タであるかどうかを確認するためのものである。例２及び３に記載の方法にそって、キメラウイルスクロ−ン（CIA-1とCux-1のキメラ）を構築し、次いで別個にMSB-1細胞の二つの異なる亜株へ導入した（図５）。図５の左側には、上記のキメラウイルスクロ−ンの構築に使用した制限酵素、及びCIA-1とCux-1(C)との間に移された制限断片が示されている。図５に隣接する表は、免疫蛍光アッセイでVP3に関して陽性であった細胞の、選択した時点における割合を示している。形質移入された細胞を二日毎に分けて、9から10 代間継代し、１から３日毎に免疫蛍光法で調べた。ウイルスクロ−ンによるMSB-1(L)細胞の形質移入でうまくいったものは、形質移入後60時間における、免疫蛍光で陽性である細胞を観察することにより確認した。しかしながら多くの場合には、検出可能なVP3発現は一過性であって、また増殖性感染は起きなかった。図５に示されているようにCIA-1も、CIA-1のいかなるキメラウイルスクロ−ンも、MSB-1細胞で感染を解しすることができなかった。故に、CIA-1VP1領域は、MSB-1(L)細胞でのウイルス複製、及び該細胞の再感染をブロッキングするのに十分である。図５に更に示されているように、CIA-1ゲノムの一部を含む、Cux-1に基づいたキメラはMSB-1細胞で感染を開始することができたが、VP1コ−ド領域の最初の３分の１を具備したCIA-1配列を含むキメラウイルスクロ−ンは例外であった。これらの観察より、以下のことが結論される： a）Cux-1のVP1のこの領域をCIA-1配列で置き換えると、（MSB-1(L)細胞で）非感染性のクロ−ンが生じる；b)Cux-1のVP1と比較したときの、CIA-1 VP1のアミノ酸配列の差異は、CIA-1感染において観察される表現型の差異（またはその差異がないこと）の原因である；c)NheIからBamHIまででコ−ドされるVP1ポリペプチドの部分は病原性に関わる可能性のある主要なメディエ−タであるという発見とは異なり、SacIからBamHIまででコ−ドされるVP1ポリペプチドの部分（アミノ酸配列の差異）は、CIA-1がMSB-1(L)細胞を感染できないことを決定する主要なメディエ−タである。 MSB-1の別の亜株であるMSB-1(S)を使用して、CIA-1、またはCIA-1のＶＰ１のコ−ド領域の少なくとも３分の１を具備した制限断片を含むキメラクロ−ンが、MSB-1(L)細胞を感染できないのは、ウイルス複製のブロックのためか、または形質移入後に形成したウイルス粒子がMSB-1細胞を感染することができないためなのかを調べた。図５に示されているように、全てのキメラクロ−ンは、直接形質移入されるとMSB-1(S)細胞を感染することが可能である。この実験では、感染済み MSB-1(L)細胞の培養上清を、形質転換後60時間後に回収し、フイルタ−（0.2μm ）にかけ、MSB-1(S)細胞のそれぞれの培養へ加えた。図５に対応した表で示されているように、CIA-1、及びVP1の全長をコ−ドしているCIA-1配列の全てを含むキメラウイルスクロ−ンはともに、MSB-1(S)細胞ないで感染を起こすことができなかった。このことは、感染したMSB-1(L)細胞内でウイルス複製のブロックが起きていることを示唆している。しかしながら、ある場合には、MSB-1(S)細胞内で感染が検出された。これはMSB-1(L)細胞の感染上清の幾つかは（すなわちCIA-1 VP1のコ−ド領域の一部を含むキメラウイルスクロ−ンの幾つかで形質移入されたもの）感染性の細胞外ウイルスを含んでいて、よってMSB-1(L)細胞内での複製が起きた。例５ CIA-1ポリペプチドの発現この態様は、それぞれのポリペプチドをコ−ドしている、CIA-1タンパク質読み取り枠1-3のそれぞれが、ファ−ジベクタやプラスミドを含む種々のベクタに別個で、または一緒に挿入されうることを示している。CIA-1ポリペプチド、またはそのペプチドであってCIA-1中に一つもしくはそれよりも多いアミノ酸変異を有する免疫原性エピト−プを含んでいるもの（ここでは単にペプチドと呼ぶ）をそれぞれうまく発現するには、遺伝子（タンパク質読み取り枠）または遺伝子断片でCIA-1ポリペプチドのエピト−プをコ−ドしているものか、またはベクタ自身が、発現に使われる特異的な宿主系に適合して認識される転写と翻訳に必要な配列を含むことが必要である。CIA-1ポリペプチドまたはペプチドをコ−ドするDNAは、本願の例１に例示されているプライマ配列と方法を使って合成することも配列を決定することも可能である。多くの宿主系を利用して、CIAポリペプチド、またはペプチドを発現することが可能であり、これらの宿主系には以下のもの含まれるが、これらのみには限定されない：バクテリオファ−ジベクタ、プラスミドベクタ、またはコスミドDNAで形質転換された細菌；酵母ベクタを有する酵母；真菌ベクタを有する真菌；ウイルス（例えばバキュロウイルス）で感染した昆虫細胞；プラスミド、またはウイルス発現ベクタで形質移入された、または組み換えウイルスで感染したニワトリの細胞；プラスミドまたはウイルス発現ベクタで形質移入された、または組み換えウイルス（例えばワクシニアウイルス、アデノウイルス、アデノ随伴ウイルス、レトロウイルス）で感染した哺乳類細胞.。上記した方法を含む、分子生物学分野で知られる方法を利用して、種々のプロモ−タとエンハンサをベクタ、またはCIA-1ポリペプチドをコ−ドするDNA配列へ導入して、ペプチドの組み換え発現を増大させた（増大した発現が使用した宿主系と適合する（例えば非毒性）である場合）。よって重要なことであるが、DNA 配列は、CIA-1ポリペプチドをコ−ドする遺伝子、または機能性のエピト−プをコ−ドする、前記遺伝子のいかなる部分／断片であって、CIA-1において一つ以上のアミノ酸変異を有するものからなることが可能である。更に前記DNAは、例えばその他のウイルスカプシドタンパク質、その他の細菌性、真菌性、寄生虫性、またはウイルス性抗原のような、その他の抗原をコ−ドするDNAに融合させて、より改良されたワクチン組成物としての利用のために、遺伝的に融合させた多価の抗原を創製することも可能である。プロモ−タの選択は、使用する発現系に依存するであろう。プロモ−タはその強度、すなわち転写を行わせる能力において異なっている。一般的には、クロ− ン化した遺伝子の発現には、高いレベルでの遺伝子の転写と、遺伝子産物の発現のために、強いプロモ−タを使用することが望まれる。例えば、細菌、ファ−ジ、またはプラスミドのプロモ−タのような、大腸菌を包含する宿主細胞系で高いレベルの転写が観察されることが知られるプロモータには、lacプロモータ、trp プロモータ、recAプロモータ、リボソームRNAプロモータ、P_R及びP_Lプロモータ、lacUV５、ompF、bla、lpp等が含まれるが、これらを使用して、Eアミノ酸配列をコードする挿入DNAの転写を提供することが可能である。哺乳類細胞を宿主として利用するときには、シミアンウイルス（SV40）の初期または後期プロモータや、メタロチオネインーI（MT-1）のようなプロモータを利用する。更に、もしCIA-1ポリペプチドが宿主細胞に対して致死的または有毒であるならば、その宿主細胞株／系統、及び発現ベクタは、プロモータの作用が特異的に誘導されるまでは阻止されるようにして選択することができる。例えばある種のオペロンでは、特異的誘導剤の添加が、挿入DNAの効果的な転写に必須である（例えばl acオペロンはラクトースまたはイソプロピルチオ-β-D-ガラクトシドの添加で誘導される）。trpオペロンのような種々のオペロンは異なる制御機能下におかれている。trpオペロンはトリプトファンが増殖培地中にないときに誘導される。P_L プロモータは、温度感受性のラムダリプレッサーを含む宿主細胞内で温度が上昇すると誘導される。このようにしてプロモータ制御性の転写のうち95％を越えるものが、非誘導細胞内では阻止される。よって、組み換えCIA-1ポリペプチド、またはペプチドの発現は、CIA-1ポリペプチドまたはペプチドをコードしている挿入したDNAの発現が誘導されないないようにし、尚且つ細胞が適切な密度にまで増殖培地中で増殖したときに、プロモータを誘導して挿入DNAを発現させるような条件で、形質移入、または形質転換された細胞を培養することで制御できる。効果的な遺伝子の発現や、メッセージの翻訳のための、その他の制御配列には、エンハンサ及び制御シグナルが含まれる。エンハンサ配列は、その存在位置と、近傍の遺伝子に関しての向きに関して比較的独立して転写効率を上昇させるDN A配列である。よって、使用する宿主発現ベクタ系に依存して、エンハンサは、C IA-1ポリペプチドをコードした挿入遺伝子の上流や下流に置いて、転写効率を上昇させることができる。本願の例１で例示されたように、種々の転写因子の結合部位のような、その他の特異的制御配列で、CIA-1ポリペプチドをコードする遺伝子の発現に影響を与えることが可能なものが同定された。上記の制御部位、及び転写または翻訳の開始シグナルのようなその他の制御部位を使用して、CIA-1 ポリペプチド、またはその遺伝子の断片をコードする遺伝子の発現を制御することが可能である。本願で記述した、DNA配列の挿入のための組み換えDNA技術を利用して、上記の制御配列を、CIA-1ポリペプチドをコードしているDNA配列へ挿入することが可能である。よって、ポリペプチドをコードするタンパク質読み取り枠、またはペプチドをコードするタンパク質読み取り枠を含むCIA-1特異的DNA配列は、プロモータ、制御（control and regulatory）配列に対して特異的な部位で、そのプロモータを有する発現ベクタに連結させて、その組み換えベクタが宿主細胞へ導入されたときに CIA-1特異的DNA配列（例：ORF-1，ORF-2,またはORF-3）を宿主細胞内で発現させることが可能である。例えば、制御（regulatory）配列を有するDNA配列は、ベクタのプロモータと、CIA-1ポリペプチドの発現を許容するコントロール配列に対する関連または配向性を有して連結することが可能である。この組み換えベクタを次いで、適切な宿主細胞へ導入してその宿主細胞を選択し、前記組み換えベクタを有する細胞をスクリーニングする。選択とスクリーニングは当該技術分野で知られる方法で行うことができるが、それにはプラスミド中に存在する標識遺伝子（例：薬剤抵抗性標識）の検出、CIA-1特異的エピトープに対して作成された抗血清を使用したCIA-1特異的エピトープ産生の免疫スクリーニング、及び宿主細胞のDNAを、本願及びソワネ（Soine，1993，同上）が記載した方法と、一つ以上のオリゴヌクレオチドでのCIAV特異的ヌクレオチド配列のプロービングが含まれる。遺伝子工学的技術を使用して、ORF1-3がコードするCIA-1ポリペプチドの特徴付け、修飾、及び/または適応化行わせることも可能である。例えば、免疫原性領域の外側の領域でポリペプチド断片を修飾するための部位特異的突然変異導入は、精製をより簡単にするためのサブ断片の可溶性を増大させることができる。更に、遺伝子工学的技術を使用して、CIA-1における一つ以上のアミノ酸変異を有するCIA-1ポリペプチドのアミノ酸配列の一部をコードするDNA配列を作りだすことが可能である。例えば、配列認識番号1-3に開示されている配列から、その制限酵素、またはどのような制限酵素の組み合わせを使ってCIA-1ペプチドをコードする配列を作成できるかを決定できる。制限酵素の選択は、得られるポリペプチド、またはペプチドの免疫能力を破壊しないように行うことができる。タンパク質の抗原性部位はその大きさがまちまちであるが、約７から約１４のアミノ酸からなる。故にCIA-1のORF1-3の何れかでコードされる大きさのポリペプチドは、多くの別個の抗原部位を含むことが可能であり、それゆえに多くの遺伝子断片配列は、CIA-1の一つ又はそれよりも多いアミノ酸変異を有する、CIA-1ポリペプチドの抗原性エピトープをコードすることが可能である。CIA-1 ORF-1の親水性プロットを図２に示してある。結果として、図１及び配列認識番号１をガイドとして使用すると、制限酵素の組み合わせにより、CIA-1中に一つ以上のアミノ酸変異を含む、一つ以上の抗原性エピトープを具備したCIA-1 ORF-1，ORF-2，ORF-3甫異的アミノ酸配列（ポリペプチドまたはペプチド）の産生を、適切なベクタに挿入された時に行わせることが可能なDNA配列を創製することが可能である。この態様を更に例示するため、CIA-1 ORF-1，ORF-2，及びORF-3は、別個にバキュロウイルスベクタヘクローニングすることが可能である。それぞれのORFは、バキュロウイルスのポリヘドリンプロモータ、多クローニング部位、etlプロモータ制御下のベータガラクトシダーゼを有するトランスファープラスミドへサブクローニングすることが可能である。例１に記載のプラスミドのサブクローンから、約650塩基対のXhoI-NotI制限断片でORF-2を含むものを、トランスファーベクタの対応した部位へサブクローニングすることが可能である。得られる組み換えプラスミドは、次いで野生型のオートグラファ・カルホルニカ・核・ポリヘドロシスウイルス（Autographa calfornica nuclear polyhedrosis virus，AcMN PV）のゲノムDNAとともに、昆虫細胞用に、改変したリン酸カルシウム沈殿法を利用して、フオール・アーミー・スポドプテラ・フルギペルダ（Fall Army Spod optera Frugiperda）細胞株SF21へ形質移入することが可能である。発現した組み換えウイルスのプラークは次いで、プラークアッセイとX-galによる染色により昆虫細胞の単相培養中で同定することが可能である。組み換えAcMNPV-ORF-3の構築は、同様の方法で行うことが可能である。例えば約365塩基対でORF-3を含む、XhoI-NotI制限断片は、トランスファープラスミドの対応する部位へサブクローニングすることが可能である。例６ CIA-1ポリペプチド、またはペプチドの精製 ORF-1、ORF-2、若しくはORF-3によりコードされるCIA-1ポリペプチド、または CIA-1において一つ以上のアミノ酸変異を有する免疫原性エピトープを含むペプチドは、ワクチン組成物中の免疫原として使用するために精製することが可能である。発現ベクタ系で産生させた組み換えCIA-1ポリペプチドまたはペプチドは当該技術分野で知られる方法により精製することができるが、この方法には界面活性剤による抽出、クロマトグラフィー（例：イオン交換、アフィニティー、免疫アフィニティー、またはサイジングカラム）、差動遠心（differencial centrifugation）、差動可溶性、またはその他の標準的なタンパク質精製方法が含まれる。宿主細胞発現系調整物からのCIA-1ポリペプチドの免疫精製は、当該技術分野で知られる免疫アフィニティ−クロマトグラフィ−を使って行うことができる。このポリペプチドのエピト−プに特異的なモノクローナル抗体をグロマトグラフの担体に連結させてアフィニティ−担体を形成させることができる。上記のエピト−プを含む、ポリペプチドまたはペプチドを含んだ調整物を次いで、アフィニティ−担体とインキュベーションして、抗体を上記のポリペプチドまたはペプチドに結合させる。アフィニティ−担体を次いで洗浄して、結合していない組成物を除去し、上記のポリペプチドまたはペプチドをアフィニティ−担体より溶出して、精製したポリペプチドまたはペプチド調整物を得る。精製したポリペプチドは、当該技術分野で知られる方法により化学的または酵素的に開裂させてペプチドにさせることが可能である。あるいは、CIA-1ポリペプチドのペプチドは、配列認識番号1-3に記載の推定のアミノ酸配列を使って化学的に合成させることも可能である。本願においてオリゴペプチドは、配列認識番号1-3に開示されているポリペプチドのいずれかであって、単体として、または化学的に連結されたものとして合成されるアミノ酸配列の一部に一致する、一連のペプチドとして定義される。このようなペプチドまたはオリゴペプチドは、当該技術分野で知られる幾つかのペプチド合成方法のうち一つを使って行うことができるが、それらにはtert-ブチルオキシカルボニルアミノ酸（Mitchell et al.，1978，J．Org．Chem．43:2845-2852 ）を使った標準的な固相ペプチド合成方法、9-フルオレニルメチルオキシカルボニルアミノ酸をポリアミド支持体上で使用するもの（Dryland et al.，1986，J ．Chem．So．Perkin Trans．I，125-137）、ペプスキャン合成法（Geysen et al .，1987，J．Immunol．Methods 03:259; 1984 Proc．Natl．Acad．Sci．USA 81 :3998）、または標準的な液相ペプチド合成方法がある。アミノ酸の欠失または置換（アミノ酸の伸長と付加を含む）のようなペプチドまたはオリゴペプチドの修飾、及びその他のものは、そのペプチドまたオリゴペプチドの免疫学的特徴を破壊しないようにして行うことが可能である。特に、CIAポリペプチドのアミノ酸配列の一つ以上のアミノ酸は、機能的に同等なアミノ酸で置換することで変異させて、タンパク質、ペプチド、またはオリゴペプチドの物理化学的な挙動において見られる差異がないような変化をおこさせることが可能である。例７ワクチン製剤の組成と方法本発明におけるこの態様は、CIAVにより引き起こされる感染の予防または治療用の能動免疫のための、予防及び/または治療用のワクチン中の免疫原として使用する、ORF-1、ORF-2、またはORF-3がコ−ドするCIA-1ポリペプチド、及び/またはそのペプチドを提供する。一つ以上のCIA-1ポリペプチドは、細胞培養適応株ではないために、ワクチン製剤中の抗原として有益である。細胞培養中にCIAV 株に変化が起きていることが分かっている（Meehan et al.，1992，Arch．Virol ．124:301-319；Todd et al.，1995 Avian Pathol．24:171-188）。ウイルス学の分野では抗体による中和は、初期分離株と細胞培養適応株との間ではかなり異なっていることが分かっている（Massola et al.，1994，J．Infect．Dis．169: 48-54）。よって幾つかの場合には、初期分離株かたら作成したワクチン抗原は、動物がでくわすウイルス株に対する保護反応を誘導することにおいてより効果的である。好ましい態様はCIA-1のVP1とVP2の両方を具備するワクチンである。ワクチンの開発用に、免疫原を具備したCIA-1特異的アミノ酸配列は、CIA-1ポリペプチド、またはペプチドを発現する組み換えベクタを含んだ宿主から精製することが可能である。このような宿主には細菌の形質転換体、酵母の形質転換体、糸状真菌の形質転換体、またはCIA-1特異的アミノ酸配列をコ−ドするベクタで感染または形質移入した培養細胞が含まれるが、これらには限定されない。CIA- 1ポリペプチドの一部に一致し、CIA-１中に一つ以上の変異を有しているペプチドまたはオリゴペプチドは、それぞれのCIA-1ポリペプチドを化学的、または酵素的に開裂させるか、あるいはそれぞれのCIA-1のORFのヌクレオチド配列から推定したアミノ酸配列を参照して、当該技術分野で知られる方法により化学的に作成することも可能である。あるいは、ペプチド、またはオリゴペプチドは、組み換えベクタより作成することが可能である。別の場合には、CIA-1ポリペプチド、ペプチド、またはオリゴペプチドの免疫原は、ワクチン製剤中に、関連した免疫物質として治療的に有効な量で含まさせて、免疫反応を惹起させる。ワクチン製剤で動物をワクチン接種する多くの方法が知られている。これらには皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、接眼、鼻腔内、及び経口投与が含まれるが、これらには限定されない。ワクチンは更に、溶液、ポリマ−、またはリポソームのような生理学的な単体、及びアジュバント、あるいはこれらの組み合わせを具備することが可能である。種々のアジュバントがワクチン製剤とともに使われる。アジュバントは、ワクチン抗原が単独で投与されるときよりも、より長くて高いレベルの免疫を、より少量のワクチン抗原またはより少ない投与回数で得るのを助ける。アジュバントの作用機序は複雑で完全には理解されていない。しかしながらサイトカインの産生刺激、貧食作用、及び網膜内皮系のその他の活性と同様に、抗原の遅延型放出、及び分解/プロセッシングによる免疫認識の促進を通しての免疫調節が関与する可能性がある。アジュバントの例には、不完全フロイトアジュバント、アジュバント65（ピ−ナッツオイル、モノオレイン酸マンニド（mannide monooleate）、及びモノステアリン酸アルミニウムが含まれる）、油のエマルジョン、Ribiアジュバント、プルロニックポリオール（pluronic polyols）、ポリアミン、アブリジン（Avridine）、キルA（Quil A）、サポニン、MPL、QS-21、及び水酸化アルミニウムやリン酸アルミニウムのような鉱物ゲルが含まれる。本発明のこの方法の別の態様には、ハプテン、すなわちそれ自身では免疫反応を惹起することができない物質としての、CIA-1特異的アミノ酸配列の産生が関わる。このような場合には、ハプテンを、免疫系に露出されると連結したハプテンに対して免疫原性を与える担体またはその他の免疫原性分子に、共有結合させることが可能である。よって、このようなCIA-1特異的ハプテンで、担体分子に連結されているものは、ワクチン製剤中での免疫原となりえる。この態様の別の方法は、生の、組み換えウイルスワクチン、細菌ワクチン、組み換えの中和細菌ワクチン、または不活化した組み換えウイルスワクチンの何れかであって、CIAVによる感染に対しての予防に使われるものを提供する。ワクチンに使用される組み換え体の微生物（細菌またはウイルス）は、ポリペプチドが発現するための強力なプロモ−タ制御下にあるCIA-1 ORFを含んだウイルスベクタを具備することが可能である。このようなウイルスベクタで当該技術分野で知られるものの例には、非発癌性のマレック病ウイルス（MDV）、生の中和済み感染性喉頭気管炎（laryngotracheitis）ウイルス、中和したニワトリポックスウイルス、または中和したシチメンチョウヘルペスウイルス、改変してその他の生物体由来のワクチン抗原を発現できる感染性のウイルスが含まれる。あるいは、微生物は中和したサルモネラ菌株（Stocker et al.，U.S.Patent Nos．5,210,035; 4,837,151; 4,735,801；Curtiss et al.，1988，Vaccine 6:155-160）。生の組み換え体微生物であって中和したもの、またはそれ自身では発病させないような処理を施したものを使用して、ニワトリやヒヨコを免疫する。宿主細胞内で続いて起こる組み換え微生物の複製は、CIA-1抗原のエピト−プを具備したワクチン抗原による免疫系の連続的な刺激を提供し、それによって長期間持続する免疫が提供される。免疫反応が、引き続いて起こった複製に対して保護的である時には、生ワクチン自体は、CIAVに対しての保護ワクチンとして使用することが可能である。更に、保護抗体はその子孫へ垂直に伝達される。この態様におけるこの方法を例示するために、例1及び3で例示した分子生物学的手法を使い、CIA-1 ORF-1、CIA-1 ORF-2、またはCIA-1 ORf-3の何れかを、ウイルスベクタゲノムDNA中の、ポリペプチドの発現を許容する部位（すなわち発現に必要な一つ以上の制御配列に機能するように連結する）であるが、ウイルスベクタの複製または増幅には負の影響を与えないようにして上記のウイルスベクタゲノムDNAに挿入することが可能である。得られる組み換えウイルスはワクチン製剤中の免疫原として使用することが可能である。免疫原として使用する前に当該技術分野で知られる化学的な方法などで、組み換えウイルスを不活化すること以外が同じである同様の方法を使用して、不活化した組み換えウイルスワクチン製剤を構築することが可能である。更に、一つ以上の組み換えCIA-1ポリペプチドは、ニワトリ感染性貧血ウイルスや、その他の家禽の疫病に対する複合ワクチン中の多価抗原の一つとなることができる。複合ワクチン中で有益な抗原、それに対応する病原体と引き起こされる疫病の例は、獣医学分野では知られている。例えば複合ワクチンには、以下のものを含ませることが可能である：感染性喉頭気管炎を引き起こす感染性喉頭気管炎ウイルスの抗原をコ−ドする遺伝子；伝染性上皮腫を引き起こすニワトリポックスウイルスのウイルス性赤血球凝集素糖タンパク質をコードする１コピ−以上の遺伝子;HN 抗原をコ−ドする遺伝子と、ニュ−キャッスル病を引き起こすニュ−キャッスル病ウイルスのF抗原をコ−ドする遺伝子の両方または何れかの、１以上のコピー；マレック病ウイルスの糖タンパク質B（gB）、L1またはA4の何れかをコードする、１コピ−以上の遺伝子。この態様の別の変形例においては、当該技術分野で知られる方法を使用して、 CIA-1 ORF1-3配列の何れか、またはそれらの組み合わせを、ワクチンとして有益ないかなるウイルスベクタへも挿入することが可能であるが、ここでのORFの転写は、構成的プロモ−タの制御下にある。この組み換えウイルスワクチンベクタは、卵内（in ovo）での胎仔へか、または孵化後に直接ヒヨコへの何れかで接種することが可能である。この態様の更に別の変形例においては、当該技術分野で知られる方法を使用して、ORF配列をプラスミドベクタへ挿入する。このプラスミドベクタを、SV40由来のような複製起点、及びCIAVプロモ−タ・エンハンサ、 MDVプロモータ、または当該技術分野で知られるその他のウイルス性転写制御配列のような真核細胞性のプロモ−タや転写制御配列を有し、それらが機能するようにORF配列へ連結させて構築する。この組み換えプラスミドは、生体内でのORF の転写が、誘導性プロモ−タ、または構成的プロモ−タの何れかで制御される。この組み換えプロモ−タを次いで、卵内で胎仔に、または解化後に直接ニワトリに注入する。動物への直接的な遺伝子導入により、外来性遺伝子の血管内皮細胞中、並びに主要器官の組織中での発現が得られることが、発現プラスミド：リポソ−ム複合体を静脈内接種のような、当該技術分野の方法で証明された（Zhu et al.，1993，Science 261:209-211）。ベクタDNAを標的細胞へ輸送するその他の効果的な方法は、当該技術分野で知られている。一つの例としては、精製した組み換えプラスミドDNAでウイルス遺伝子を含むものを使用して、ニワトリに接種して（非経口的（parentally）、経粘膜的、または遺伝子銃免疫的）、保護免疫反応を誘導する（Fynan et al.，1993,Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:11478-1 1482）。核酸分子（組み換えプラスミドまたはウイルスベクタ）は、薬学的に許容される担体中、または希釈剤中にいれて投与することができ、ワクチンの効果を促進する化合物を含んでいてもよい。これらの付加的化合物には免疫反応を修飾、促進するアジュバント、または細胞による核酸の取り込みを増大させるその他の化合物が含まれるが、これらには限定されない。別の例では、ヒヨコまたは胎仔から取り除いた細胞を、形質移入、若しくは当該技術分野で知られる標準的な方法でエレクトロポレ−ションし、ベクタDNAを標的細胞へ導入する。ベクタDNAを含む細胞は、neo遺伝子のような選択標識をベクタ中へ取り込み、G418のような対応した選択培地中で細胞を増殖させることで、ベクタDNAを含まない細胞から選択することができる。CIA-1 ORF転写産物の発現用の組み換え発現ベクタを有する、選択された細胞を次いで、ヒヨコまたは胎仔へ再導入することが可能である。この態様の別の変形例には、一つ以上のCIA-1 ORFにコ−ドされるポリペプチドを発現する、トランスジェニックなニワトリを開発することにあるが、ここでポリペプチドの産生は、誘導性プロモ−タ、または構成的プロモ−タの制御下にある。トランスジェニックなニワトリを作成するための、当該技術分野で知られる方法には、マイクロインジェクション、ウイルス感染、または胎仔幹細胞トランスファ−により、ニワトリの生殖細胞株へ遺伝物質の導入がある。CIA-1ポリペプチドへ転写翻訳される配列のような遺伝物質を導入すると、その遺伝物質がインテグレ−トしたものを有する系統が得られる。トランスジェニック体の検出は組織細胞を単離し、その単離した細胞をサザンブロット分析により導入遺伝子のインテグレ−ションを調べるか、またはCIA-1 ORFのポリペプチドへの発現に関して、単離した組織の免疫蛍光を行うことで可能である。本発明に関して本願で詳細に記載するが、例はあくまで例示するためのものであることを理解する必要がある。本発明の態様の他の修飾であって、分子生物学、獣医学、及び関連した分野の当業者に自明であるものは、本願の請求の範囲に示した請求項の範囲に含まれる。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ルシオ、ベンジャミンアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14850、イサカ、シャーリン・ロード 110 (72)発明者レンショー、ランディーアメリカ合衆国、ニューヨーク州 14850、イサカ、フォーレスト・ホーム・ドライブ・ナンバー11 440

Claims

【特許請求の範囲】１．ニワトリ感染性貧血ウイルスポリペプチドをコードする単離され、精製された核酸分子であって、該核酸分子は、配列認識番号１からなるヌクレオチド配列からなることを特徴とする核酸分子。２．該配列が、配列認識番号１のヌクレオチド位置８３２−２１７８の間に位置するオープンリーディングフレームからなる請求項１記載の核酸分子。３．（ａ）配列認識番号１；（ｂ）配列認識番号１のヌクレオチド位置８３２−２１７８の間に位置するオープンリーディングフレーム；および（ｃ）アミノ酸位置２２におけるＡｓｎ、アミノ酸位置７５におけるＩｌｅ、アミノ酸位置１４４におけるＧｌｎからなる群の中から選ばれる、ＣＩＡ −１ポリペプチドＶＰ１における１またはそれ以上のアミノ酸差異をコードする（ａ）もしくは（ｂ）のＤＮＡ断片からなる群の中から選ばれるＤＮＡ配列からなる、単離され、精製された核酸分子。４．該核酸分子が、発現制御エレメントに作動的に結合されている請求項１記載の核酸分子。５．該核酸分子が、発現制御エレメントに作動的に結合されている請求項２記載の核酸分子。６．該核酸分子が、発現制御エレメントに作動的に結合されている請求項３記載の核酸分子。７．請求項１記載の核酸分子であって１またはそれ以上の発現のための制御エレメントに作動可能に結合しているものを含有する組み換え体ベクター。８．請求項２記載の核酸分子であって１またはそれ以上の発現のための制御エレメントに作動可能に結合しているものを含有する組み換え体ベクター。９．請求項３記載の核酸分子であって１またはそれ以上の発現のための制御エレメントに作動可能に結合しているものを含有する組み換え体ベクター。１０．該ベクターが、マレク病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびターキーのヘルペスウイルスからなる群の中から選ばれるウイルスベクターである請求項７記載の組み換え体ベクター。１１．該ベクターが、マレク病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびターキーのヘルペスウイルスからなる群の中から選ばれるウイルスベクターである請求項８記載の組み換え体ベクター。１２．該ベクターが、マレク病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびターキーのヘルペスウイルスからなる群の中から選ばれるウイルスベクターである請求項９記載の組み換え体ベクター。１３．請求項７のベクターを含有する宿主細胞。１４．請求項８のベクターを含有する宿主細胞。１５．請求項９のベクターを含有する宿主細胞。１６．請求項４記載の核酸分子により形質転換された宿主細胞。１７．請求項５記載の核酸分子により形質転換された宿主細胞。１８．請求項６記載の核酸分子により形質転換された宿主細胞。１９．配列認識番号１、もしくは配列認識番号２と組み合わされた配列認識番号１からなる群の中から選ばれる少なくとも１のニワトリ感染性貧血ウイルスポリペプチドの免疫学的効果量を含有するワクチン製剤。２０．該少なくとも１種のポリペプチドが、（ａ）配列認識番号１に示されるＯＲＦ−１；（ｂ）配列認識番号２に示されるＯＲＦ−２；（ｃ）（ａ）と（ｂ）との組み合わせからなる群の中から選ばれるヌクレオチド配列を含有する発現ベクターを含むように遺伝子工学処理された宿主細胞システムから組み替えにより産生されたものであり、該宿主細胞は、バクテリア、イースト、糸状菌、昆虫細胞系、鳥細胞および哺乳類細胞系からなる群の中から選ばれるものである請求項１９記載のワクチン製剤。２１．薬学的担体をさらに含有する請求項１９記載のワクチン製剤。２２．ヌクレオチド配列を含有する組み換え体ベクターをさらに含み、該ヌクレオチド配列は該少なくとも１種のポリペプチドをコードしかつ発現制御エレメントに作動的に結合され、および該ベクターはウイルスベクターおよびプラスミドからなる群の中から選ばれるものである請求項１９記載のワクチン。２３．該ウイルスベクターが、マレク病ウイルス、感染性喉頭気管炎ウイルス、鶏痘ウイルスおよびターキーのヘルペスウイルスからなる群の中から選ばれる生存弱毒ウイルスを包含する請求項２２記載のワクチン。２４．ワクチンが、結合されたワクチンであって、発現制御エレメントに作動的に結合されかつニワトリ感染性貧血以外の家禽ウイルス病に対して有用な抗原の１またはそれ以上をコードする１またはそれ以上のヌクレオチド配列をさらに包含し、該ウイルス病が、感染性喉頭気管炎、鶏痘ウイルス、ニューカッスル病およびマレク病からなる群の中から選ばれるものである請求項２２記載のワクチン製剤。２５．ワクチンが、混合ワクチンであって、発現制御エレメントに作動的に結合されかつニワトリ感染性貧血以外の家禽ウイルス病に対して有用な抗原の１またはそれ以上をコードする１またはそれ以上のヌクレオチド配列をさらに包含し、該ウイルス病が、感染性喉頭気管炎、鶏痘ウイルス、ニューカッスル病およびマレク病からなる群の中から選ばれるものである請求項２３記載のワクチン製剤。２６．予防的効果量の請求項１９記載のワクチン製剤を投与することを特徴とする、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。２７．予防的効果量の請求項２０記載のワクチン製剤を投与することを特徴とする、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。２８．予防的効果量の請求項２１記載のワクチン製剤を投与することを特徴とする、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。２９．予防的効果量の請求項２２記載のワクチン製剤を投与することを特徴とする、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。３０．予防的効果量の請求項２５記載のワクチン製剤を投与することを特徴とする、ニワトリ感染性貧血ウイルスに対して家禽を免疫化する方法。３１．単離され、実質的に生成されたニワトリ感染性貧血ウイルスポリペプチドであって、該ポリペプチドは配列認識番号１に示されたアミノ酸配列からなるポリペプチド。３２．請求項３１記載のポリペプチドの単離され、実質的に生成されたペプチドであって、該ペプチドは、アミノ酸位置２２のＡｓｎ、アミノ酸位置７５のＩ１ｅ、アミノ酸位置１３９のＧｌｎおよびアミノ酸位置１４４のＧｌｎからなる群の中から選ばれる１またはそれ以上のアミノ酸を含有する、配列認識番号１の一部からなるペプチド。３３．該ポリペプチドが、該ポリペプチドをコードするＤＮＡ配列の発現を規制するヌクレオチド配列を含有するベクターを含むように遺伝子工学処理された宿主細胞システムから培養された細胞から組み替え的に産生されたものである請求項３１記載のポリペプチド。３４．該宿主細胞システムが、バクテリア、イースト、糸状菌、昆虫細胞系、哺乳類細胞および鳥細胞からなる群の中から選ばれるものである請求項３３記載のポリペプチド。