JP2000503002A - 細菌汚染除去方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 グラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルの減少方法が開示されている。この方法は、浸透圧衝撃及び／又はついで溶液としてのリゾチーム及び／又は溶液としてのナイシンのどちらかと組合わされた、低濃度のアルカリ金属オルトリン酸塩溶液での処理に関わるものである。この組合わせ方法は、細菌の効果的殺菌率の範囲を拡大する上で相乗効果があり、これによって以前の技術よりも多い所望の加工パラメーターを利用することができ、この方法は特に食品加工に適している。

Description

【発明の詳細な説明】 細菌汚染除去方法 本発明は、細菌のレベルを低下させる方法、特に食物によって運ばれるヒト病 原体、及び腐敗（ｓｐｏｉｌａｇｅ）微生物に関する。この方法は、食品加工、 あるいはまた、衛生に必要とされる条件が、細菌レベルを制御すべきことである ような場合に適している。この方法は、グラム陰性菌とグラム陽性菌の両方に対 して効果がある。この方法を実施するためのキットも特許請求される。 ＰＣＴ特許出願ＷＯ ９３／００８２２号（ＭＡＦＦ）は、浸透圧衝撃処理と 、冷ショック及び／又は酵素リゾチームへの暴露とを組合わせて用いた、細菌の 破壊方法を開示している。リゾチームは、ある種のグラム陽性菌に対して効果が あることはよく知られているが、この組合わせ処理方法は、グラム陰性菌種への 利用にまで及んでいる。しかしながらこの組合わせ処理は試験管内では効果があ るが、この方法が実際の食品加工条件下で用いられた場合、サルモネラ菌に対し ては十分な効果はない。 米国特許第５，０６９，９２２号において、サルモネラ菌の成長を制御するた めの家禽の死体処理方法が開示されている。この方法は、内臓が抜かれ、毛が毟 られた家禽を、アルカリ金属オルトリン酸塩、例えばオルトリン酸三ナトリウム （ＴＳＰ）、あるいは少量の塩基性試薬、例えば炭酸ナトリウムと組合わされた アルカリオルトリン酸塩を含む溶液で処理する方法である。ＴＳＰは、米国食品 医薬品局（ＵＳ Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）によ って安全と認められたものであり、多くの食品の成分であるが、前記引例の米国 特許に開示されたＴＳＰ方法は、現在用いるには、いくつかの欠点がある。第一 に、これには高いＴＳＰ濃度（約０．４Ｍ）が必要であり、従って高いｐＨ（約 ０．４Ｍでほぼ１２．５）が必要である。これは鳥肉及びその他の食品処理の許 容性を減らすことがある。第二に、これはグラム陽性腐敗菌に対して効果がなく 、ある種のグラム陰性菌、例えばカンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅ ｒ）に対しての効果は疑問である。 驚くべきことに、ヒト病原菌、及び／又は腐敗菌で汚染されていることもある 製品、例えば食料品の処理方法が、本発明者らにより発見された。この方法は、 グラム陰性菌の破壊に非常 に効果が高く、またグラム陽性菌のレベルをも減少させるものである。この方法 は、病原菌、例えばサルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）及びカンピロバクター の破壊に特に有用である。これらの細菌はこれまで、食料品に用いうる汚染除去 方法に対して比較的耐性のあったものである。 本発明によれば、サンプル中のグラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルを減少 させる方法であって、サンプルを、三アルカリ金属オルトリン酸塩の０．０００ ５〜０．２Ｍ溶液で処理する方法が提供される。前記処理は、次のさらなる処理 の１つ又はそれ以上と組合わされる： ａ）サンプルを浸透圧衝撃に付すこと； ｂ）前記三アルカリ金属オルトリン酸塩での処理後、ペプチドグリカンを分解 する酵素にサンプルを暴露すること；及び ｃ）三アルカリ金属オルトリン酸塩での前記処理後、バクテリオシンへサンプ ルを暴露すること。 さらなる処理の好ましい組合わせは、工程（ａ）と、工程（ｂ）又は工程（ｃ ）のどちらかとを組合わせることである。 ここに開示された組合わせ処理は、グラム陽性菌の破壊に効果があることが本 発明者らによって発見された。グラム陽性菌 に対しては、三アルカリ金属オルトリン酸塩それ自体では効果がないが、グラム 陰性菌、例えばサルモネラ及びカンピロバクターには効果がある。驚くべきこと に、三アルカリ金属オルトリン酸塩方法とその他の方法の１つ又はそれ以上との 組合わせの効果は、次の点において相乗作用がある。すなわち別々のこれらの方 法のどれよりも細菌の破壊範囲が大きいだけでなく、以前に用いられているもの より低い濃度のアルカリ金属オルトリン酸塩でも作用するという点である。実際 、これらは、第二処理段階無しで用いられた場合には、非致死的なものであろう 。従って０．０００５〜０．２Ｍ、適切には０．００１〜０．２Ｍ、好ましくは ０．００５〜０．０１Ｍの三アルカリ金属オルトリン酸塩濃度で十分である。こ のように、比較的低い濃度の三アルカリ金属オルトリン酸塩を用いることができ るので、処理溶液のｐＨを低下させ、従ってこのことによって、この処理は、食 物汚染除去の用途として用いるのにさらに魅力あるものになる。 特定のケースに効果があるＴＳＰの正確な最低濃度は、サンプルの種類に依っ て様々であろう。例えばここで後に示されるように、有意量で血清が存在すると 、必要とされる前記範囲内 で、ＴＳＰの濃度レベルに影響を与えることもある。しかしながらこれは、最小 量のＴＳＰが必要であると考えられた場合、特定のケースに用いられる通常の方 法で、決定することができる。 本発明は、以前に開示された浸透圧衝撃＋リゾチーム処理を超えるさらなる利 点を有する。その理由は、本発明が殺菌を促進する栄養素の存在に依らず、処理 方法が、４〜５０℃の温度に顕著には依存していないからである。さらに、本発 明を用いた場合、鶏の皮の表面から洗い流された微生物は、非常に殺菌処理を受 けやすくなっていることが分り、その結果生じた処理溶液はあまり細菌を含んで いなかった。このことは、鳥肉加工における死体間の交差汚染を減少させる上で 重要であろう。 浸透圧衝撃は、低浸透圧衝撃（hypo-osmotic shock）であるのが適切である。 この低浸透圧衝撃では、水が細胞、特に細菌細胞に入るようにされる。低浸透圧 衝撃の前に、好ましくは高浸透圧（hyper-osmotic）衝撃を行なう（この場合、 水が細胞から出るようにされる）。浸透圧衝撃は、ＷＯ ９３／００８８２２号 に記載された方法を用いて行なうことができる。この特許の開示は、ここに引用 して組込まれる。特に浸透圧衝撃は、 ０．９９７又はこれ未満の水分活性（ｗａｔｅｒ ａｃｔｉｖｉｔｙ）（ａ_w） を有する第一溶液にサンプルを暴露し（これは高浸透圧衝撃を誘発する）、つい で前記第一溶液のものより高い溶液にサンプルを暴露して（これはついで低浸透 衝撃を生じる）、サンプル中に誘発することができる。 有利には第一溶液は、水分活性が０．９９２〜０．９６、より好ましくは０． ９７４〜０．９６の範囲にある。５秒〜３０分、より好ましくは３０秒〜２０分 、最も好ましくは１〜１０分の間、これを用いるのが適切である。 前記第一溶液は適切にはＮａＣｌを、例えば約０．８Ｍの濃度において、０． ９９７又はそれ以下の水分活性を生じるのに十分な濃度で含んでいる。第二溶液 のａ_wは適切には０．９９９程度である。サンプルは、所望の低浸透圧衝撃を生 じるのに十分な時間、この溶液に暴露される。この時間は実際には非常に短くて もよく、数秒程度であってもよい。しかしながら長時間の暴露も、反応に悪影響 は与えない。一般に５秒〜２時間の暴露時間が都合がよく、より特定すれば１０ 分〜１時間、例えば約３０分であってもよい。 第二溶液は、第一溶液とは別に調製されて用いられてもよい。 あるいはこの溶液は、適切な希釈剤、例えば水を第一溶液に導入することによっ て作られてもよい。 好ましい実施態様において、前記第一溶液は、０．００１〜０．２Ｍの三アル カリ金属オルトリン酸塩を含んでおり、従ってこの試薬による処理が、浸透圧衝 撃処理と組合わされる。 さらには第二溶液は、これらのさらなる処理と浸透圧衝撃処理とを組合わせる ために、前記工程（ｂ）及び（ｃ）に用いられる試薬を含んでいてもよい。 本発明の方法に用いられるペプチドグリカンを分解する適切な酵素は、ヒトに 有害ではない酵素であり、特定の例はリゾチームである。リゾチームは、適切に は、水性溶液の形態でサンプルに対して用いられる。この溶液は、例えば濃度が 少なくとも１μｇｍｌ^-1であり、好ましくは少なくとも５μｇｍｌ^-1である。こ のようなリゾチーム溶液は、凍結乾燥された卵白溶液の形態で準備されるのが都 合が良い。この溶液の濃度は少なくとも０．１ｍｇｍｌ^-1である。 リゾチームでのさらなる処理は特に効果的であることが、本発明者らによって 発見された。リゾチームは、少なくとも１μｇｍｌ^-1、好ましくは少なくとも５ μｇｍｌ^-1の濃度で、三 アルカリ金属オルトリン酸塩での処理後に、濯ぎ用の水に加えられてもよい。あ るいはまたリゾチーム処理は、リゾチームをより高いａ_wの第二溶液へ加えて、 浸透圧衝撃処理と組合わされ得る。 適切にはバクテリオシンもまた、ナイシン及びペジオシン（ｐｅｄｉｏｃｉｎ ）のように、ヒトが消費するのに適していると考えられているものである。好ま しくは本発明の方法にはナイシンが用いられる。適切なナイシン処理溶液は、ナ イシンを、少なくとも０．１μＭ、好ましくは１μＭ又はそれ以上の濃度で含ん でいる。好ましい実施態様において、サンプルは、三アルカリ金属オルトリン酸 塩の処理後であって、ナイシンを含む溶液での処理前に、水で濯がれる。 この組合わせ処理におけるナイシンの使用の特別な利点は、ナイシンがまた、 グラム陽性微生物、例えばＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓを殺す 上で特に効果的であるということである。これはさらに、その他の組合わせ処理 よりも優れた殺菌率を生じる。 従ってナイシンでのさらなる処理は、グラム陽性菌による汚染がある場合に特 に効果的である。 本発明の方法の利用において、特に鳥肉の処理において、ＴＳＰ濃度の制御は 、酵素又はバクテリオシン処理、特に各々、リゾチーム又はナイシン処理のｐＨ に悪影響が及ぼされるのを防ぐために望ましい。この処理を最適化するために、 リゾチーム又はナイシン溶液を酸性化するのが望ましいであろう。 従って適切には、バクテリオシンの処理溶液又は酵素溶液は、例えば約ｐＨ５ ．０まで酸性化される。これは、溶液へ酸を含ませることによって実施すること ができる。酸は好ましくは有機酸、例えば乳酸である。乳酸は適切には、少なく とも０．２５ｍＭの濃度で存在する。 本発明の方法に用いられるのに適切な三アルカリ金属オルトリン酸塩は、リン 酸三ナトリウムである。 サンプルは適切には食料品の一部である。但しこれはまた、その他の消費しう る製品、例えば薬品、化粧品、及び洗面所用品であってもよい。しかしながらこ れはまた、機械、器具、又は家庭用品、例えばパイプ製品（ｐｉｐｅｗｏｒｋ） の表面、あるいは作業表面、例えば調理用表面、又は細菌の存在が問題になるよ うな「クリーンルーム」の表面であってもよい。 用いられる処理方法は、用いられるサンプルの種類及び溶液 の種類に依るものである。しかしながらこれらの処理は、適切には、例えばサン プルを溶液に浸漬して、あるいは処理溶液でサンプルを洗浄して、特にスプレー 洗浄して、あるいはこれらを組合わせて実施することができる。例えばサンプル が、長時間処理溶液に暴露されるような処理が必要な場合、高浸透圧衝撃を誘発 するために、０．９９７より低い水分活性を有する溶液が用いられているならば 、浸漬が最も便利な選択肢であろう。しかしながら適切には、例えば静電気噴霧 技術を用いて、あるいは被覆形成薬品、例えば界面活性剤を使用前に溶液中に含 ませることによって、適切なスプレー洗浄溶液を調製することができる。 従って好ましい実施態様において、三アルカリ金属オルトリン酸塩を０．００ ０５〜０．２Ｍ、適切には０．００１〜０．２Ｍの範囲の濃度で含む第一溶液で サンプルを処理する。前記溶液は、水分活性（ａ_w）が０．９９７又はそれ未満 である。ついでサンプルを、ペプチドグリカン又はバクテリオシンを分解する酵 素の第二溶液で処理する。前記第二溶液は、ａ_wが前記第一溶液より高い。 適切にはサンプルは、前記第一及び第二溶液に連続的に浸漬 されるが、例えば第一溶液への浸漬、ついでスプレー洗浄による第二溶液への浸 漬という代替方法も用いることができる。 好ましい方法において食料品のサンプルは、０．０００５〜０．２Ｍ、適切に は０．００１〜０．２Ｍ、好ましくは０．００５〜０．０１Ｍの範囲の濃度でＴ ＳＰ溶液中に、好ましくは約０．８Ｍの濃度の塩化ナトリウム溶液と共に、４〜 ５０℃、好ましくは３７℃の温度で浸漬し、ついでリゾチーム溶液でスプレー洗 浄する。このリゾチーム溶液は適切には、＞１０μｇｍｌ^-1の濃度である。リゾ チーム溶液は、凍結乾燥された卵白の形態で、約０．１ｍｇｍｌ^-1の濃度で準備 されてもよい。この好ましい方法は、野菜材料、例えばレタスに付いているグラ ム陰性菌の殺菌に高い効果がある。 もう１つの好ましい方法において、食料品サンプルを、０．００１〜０．２Ｍ 、好ましくは０．００５〜０．０１Ｍの範囲の濃度のオルトリン酸三ナトリウム 溶液中に、４〜５０℃、好ましくは３７℃の温度で浸漬し、ついで１μＭより高 い濃度のナイシンでスプレー洗浄する。 本発明の処理は、温度とはかなり無関係であるが、三アルカリ金属オルトリン 酸塩での処理及びその他の処理が、４〜５０℃、 好ましくは約３７℃の温度で実施されるのが好ましい。 前記方法を実施するためのキットが、本発明のもう１つの側面である。これら のキットは、三アルカリ金属オルトリン酸塩及び下記要素の１つ又はそれ以上を 含んでいてもよい：。 ａ）細胞内に浸透圧衝撃を誘発するために用いることができる試薬； ｂ）ペプチドグリカンを分解することができる酵素；及び ｃ）バクテリオシン。 試薬は、それ自体が適切な処理溶液をつくるための説明書と共に提供されても よく、あるいは既製の水溶液として提供されてもよい。キットの成分は、様々な 容器、例えば多品目パック容器に別けられているものである。 前記方法に従って処理された製品、特にこのように処理された食料品が、この 発明のもう１つの側面を構成する。 本発明の方法はここでさらに、次の非限定的な実施例を参照して例証される。 実施された作業として、次の調査が行なわれた： （ｉ）ＴＳＰと、浸透圧衝撃及び／又はリゾチーム処理とを組合わせる効果 （ｉｉ）ＴＳＰ及び浸透圧衝撃／リゾチーム組合わせ処理との、食品表面（鶏 の皮及びレタス）へ付着した微生物の殺菌に対する効果 （ｉｉｉ）殺菌手順において、リゾチームを補足するか又はこれと代えるため に、ナイシンを用いた場合の効果。 用いられた微生物は、Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ、Ｌｉｓｔｅｒｉａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ、Ｐｓｕｅｕｄｏｍｏｎａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃ ｅｎｓ、サルモネラ ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ、カンピロバクター ｊｅｊｕｎ ｉ、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓであった。 細菌の準備 カンピロバクター ｊｅｊｕｎｉ（ＮＣＴＣ １１６２６）、Ｌｉｓｔｅｒｉ ａ ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓ（ＮＣＴＣ７９７３）、Ｐｓｕｅｕｄｏｍｏｎ ａｓ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（ＮＣＴＣ １００３８）、サルモネラ ｅｎｔ ｅｒｉｔｉｄｉｓ（ＮＣＴＣ ６６７６）、及びＳｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ（ＮＣＴＣ ８５３２）は、英国コリンデールのナショナル・コ レクション・オブ・タイプ・カルチャーズ（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｃｏｌｌｅｃｔ ｉｏｎ ｏｆ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅｓ，Ｃｏｌｉｎｄａｌｅ，ＵＫ）から、凍結乾燥培養 物として入手した。Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉ（ＮＣＩＭＢ ９４８５） は、キングスカレッジのディビジョン・オブ・ライフ・サイエンシーズ・コレク ション（Ｄｉｖｉｓｉｏｎ ｏｆ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ Ｃｏｌｌｅｃ ｔｉｏｎ，Ｋｉｎｇ’ｓ Ｃｏｌｌｅｇｅ）から入手した。 実験のための接種物を準備するために、凍結防止剤グリセロール（最終濃度１ ５％ｖ／ｖ）を、初期静置相培養物に添加した。ついで培養物の１ｍｌアリコー トを、滅菌低温管（ｃｒｙｏｔｕｂｅｓ）に分配し、−７０℃で貯蔵した。 Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ以外は、ブレイン・ハート・インフュージョン肉汁（オクソ イド社（Ｏｘｏｉｄ））又は栄養寒天プレート（オクソイド社）で、３７℃又は ３０℃（Ｐｓｕｅｕｄｏｍｏｎａｓのみ）で、細菌を好気的に成長させた。肉汁 培養物は、振動インキュベーターで、２５ｍｌ媒質が入っている２５０ｍｌフラ スコで成長させた。Ｃ．ｊｅｊｕｎｉは、１０％ウマ血清（オクソイド社）及び ０．２５％イースト抽出物（オクソイド社）で集積された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ） ブレイン・ハート・イ ンフュージョン肉汁（オクソイド社）２５ｍｌの入っている７０ｍｌ組織培養ビ ンで、又は血液寒天プレート（オクソイド血液寒天ベースＮｏ．２中の７％ｖ／ ｖウマ血（オクソイド社））で、静置的に成長させた。培養物を、３７℃で１０ ％（ｖ／ｖ）ＣＯ₂、及び１０％（ｖ／ｖ）Ｏ₂雰囲気でインキュベートした。こ れらは、ガスジャー及びガス発生キット（オクソイド社ＢＲ ６０）を用いて得 られたものである。 実施例１：懸濁細胞内殺菌 様々な温度及び血清の存在下又は血清の不存在下において、ＴＳＰ及びリゾチ ーム及び／又は浸透圧衝撃での処理に付されたグラム陰性微生物及びグラム陽性 微生物に関して実施された、効果的な細胞内殺菌に関して、次のようなテストを 行なった。 採用された方法論は、ＷＯ ９３／００８２２号の開示に基づくものであった 。この特許はここに引用して組込まれており、この特許は、次のことを指摘して いるものである。すなわち（ｉ）初期静置相細胞は、浸透圧衝撃／リゾチーム処 理に最も耐性があった；（ｉｉ）０．８ＭのＮａＣｌが、テストされたグラム陰 性微生物すべてに関して、この系において最大又は最大に近い殺菌効果を与えた ；（ｉｉｉ）各々１０分及び３０分 間の高浸透圧衝撃及び低浸透圧衝撃への暴露が、リゾチームをグラム陰性細胞に 近付くようにさせるのに適切であり、これ以上長い処理時間は商品として許容で きないものであろう；（ｉｖ）浸透圧衝撃を受けたグラム陰性細胞において、２ ０μｇｍｌ^-1のリゾチームが、ほぼ最適な細胞内殺菌を生じた。 一晩経過した肉汁培養物を、新しい培地で１／２５希釈し、初期静置相になる まで同様に成長させた（約４時間のインキュベーション）。ＥＥＬ比色計を用い て５５０ｎｍで、培養物光学濃度を追跡して成長を監視した。静置相培養物を１ ／１００希釈して、適切なテスト培地にした。この培地は、ＴＳＰ、ＴＳＰ＋塩 化ナトリウム（ＮａＣｌ）、ＴＳＰ＋熱不活性化されたコウシの新生児の血清（ ５０％ｖ／ｖまで；ギブコ社（Ｇｏｂｃｏ））、及びＴＳＰ＋ＮａＣｌ及び血清 を含んでおり；ＴＳＰとＮａＣｌの濃度は様々であり、結果の表に示されている 。テスト培地で１０分間、４℃又は３７℃でインキュベーションを行なった後、 細胞懸濁液をさらに、蒸留水、又は２０μｇｍｌ^-1リゾチームを含む蒸留水（Ｓ ｉｇｍａ Ｌ６８７６）中に希釈した（１／１００）。さらに３０分間のインキ ュベーション後、細胞を適宜、脱イオン水中に希釈し、栄養寒天上で培養した。 プレートを３７℃又は３０℃で４８時間までインキュベートし（Ｐｓｅｕｄｏｍ ｏｎａｓのみ）、細胞内殺菌を評価した。 結果を表１〜８に示す。下記表において、用いられている注釈は次の通りであ る。 ｎｓ：生存は検出されない；細胞殺菌率＞９９．７％^* ：当初処理溶液、すなわちＴＳＰ、ＮａＣｌ、ＴＳＰ＋ＮａＣｌ、又は水のｐ Ｈ 表１及び３は、各々、グラム陰性微生物及びグラム陽性微生物への３７℃での 結果を示しており、表２及び４は４℃での結果を示している。テストされたＴＳ Ｐ濃度は、グラム陰性微生物の場合、０．０Ｍ〜０．００５Ｍであり、グラム陽 性微生物の場合、０．０Ｍ〜０．１０Ｍであった。 結果（表１、３７℃、表２、４℃）は、グラム陰性細胞が、浸透圧衝撃の不存 在下ではリゾチームに耐性があることを確認している。浸透圧衝撃又はＴＳＰ（ ０．００２Ｍまで）のみも、比較的低い殺菌率を生じる。浸透圧衝撃とリゾチー ム処理との組合わせは、Ｅ．ｃｏｌｉ及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓについて 、ＷＯ ９３／００８２２号によって予告されているように、高い殺菌率を生じ た。 ３７℃においてはすべての場合に、低濃度のＴＳＰ（０．００１又は０．００ ２Ｍ）が浸透圧衝撃と組合わされて用いられた場合、その後のリゾチーム処理の 不存在下においてさえ、生存細胞はまったく検出されなかった。浸透圧衝撃の不 存在下におけるＴＳＰ処理はまた、ついでリゾチームへ暴露された細胞内殺菌を も強化した。ＴＳＰ（０．００２Ｍまで）で処理された細胞懸濁液のｐＨは、＜ １０であった。従ってこれらの結果は、 ＴＳＰ処理が３７℃においてリゾチームか浸透圧衝撃処理のどちらかと組合わさ れた時の、細胞内殺菌率の顕著な改良を示している。 ４℃における結果（表２）は、これより高い温度における結果と本質的に同様 であった。しかしながらカンピロバクターは、テストされたその他の細菌よりも 耐性があることが証明された。カンピロバクターの細胞内殺菌率は、リゾチーム 処理によって増加せず、浸透圧衝撃と組合わされた場合、カンピロバクターの数 を検出できないレベルまで減少させるには、０．００５ＭのＴＳＰが必要であっ た。それにもかかわらず、カンピロバクターの場合でさえ、ＴＳＰ殺菌率は浸透 圧衝撃によって明らかに促進された。 浸透圧衝撃処理のみでは、３７℃及び４℃において、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇ ｅｎｅｓ又はＳｔ．ａｕｒｅｕｓの生存力にほとんど又は全く効果がなかった（ 各々表３及び４）。しかしながらリゾチーム（２０μｇｍｌ^-1）は、Ｌ．ｍｏｎ ｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの生存物数（ｖｉａｂｌｅ ｃｏｕｎｔ）を８４〜９９％ 減少させた。殺菌率は、温度依存性のようであった。すなわち４℃より３７℃の 方が高い。Ｌｉｓｔｅｒｉａの場合、 ＴＳＰ（＞０．０５Ｍ）処理とその後のリゾチーム処理とを組合わせると、どち らかの単独処理の場合より、有意に高い殺菌率を生じた。浸透圧衝撃も、ＴＳＰ によって、特に３７℃において殺菌率を高めた（ＮａＣｌ処理の存在下及び不存 在下における０．００５〜０．０５Ｍ ＴＳＰによる殺菌率参照；表３及び４） 。従って浸透圧衝撃／リゾチーム処理との組合わせにおいて、ＴＳＰは、非常に 低い濃度のＴＳＰ（０．００５Ｍ）での最大限の殺菌率を生じた（生存物は検出 されなかった；殺菌率＞９９．７％）。 Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓは、この処理が浸透圧衝撃と組合わされた場合、ＴＳＰに 対してより感受性が高かった。しかしながらＬ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの 場合に得られた結果とは対照的に、リゾチームへの暴露は、ＴＳＰ及び／又は浸 透圧衝撃処理後、殺菌率を高めなかった。しかしながらＳｔ．ａｕｒｅｕｓは、 低濃度のナイシンに対して顕著に感受性があった（実施例３参照）。 ＴＳＰ／浸透圧衝撃／リゾチーム組合わせ殺菌処理への血清の存在の効果は、 ５０％ｖ／ｖ血清＋ＴＳＰ及びＮａＣｌ中で細胞をインキュベートし、その後、 細胞懸濁液をリゾチーム溶 液中に希釈して測定された。３７℃において（表５）、グラム陰性菌Ｃ．ｊｅｊ ｕｎｉ、Ｅ．ｃｏｌｉ、Ｐ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ、及びＳ．ｅｎｔｅｒｉｔ ｉｄｉｓの１００％殺菌率が得られた。しかしながら必要なＴＳＰ濃度（５〜１ ０ｍＭ）は、血清を含まずに懸濁された細胞の場合より高かった。血清の存在は 、ＴＳＰ（５〜１０ｍＭ）／ＮａＣｌ処理溶液のｐＨを、８〜９まで下げた。４ ℃において（表６）、同様な結果が得られたが、但し、Ｓ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄ ｉｓの場合は、１０ｍＭ ＴＳＰでの組合わせ処理（ＴＳＰ／浸透圧衝撃／リゾ チーム）において、９０％の殺菌率が得られた。ＴＳＰ／浸透圧衝撃／リゾチー ム組合わせ手順において５０ｍＭ ＴＳＰを用いて、血清の存在下において、グ ラム陽性菌Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓの１００％殺菌率が４℃及び３７℃ で得られた。リゾチーム処理を用いない場合、殺菌率は各々７８％及び９８％で あった。さらにＳｔ．ａｕｒｅｕｓは、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔｏｇｅｎｅｓよりも 耐性があった。３７℃において、１００％殺菌率を生じるには１５０ｍＭのＴＳ Ｐ濃度が必要であった。殺菌率は、浸透圧衝撃又はリゾチーム処理によって、有 意には高められなかった。４℃において、Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓは、 ＴＳＰ（≧１５０ｍ）及びＴＳＰ（≧１５０ｍ）を用いた組合わせ処理に対して 耐性があった（＜２０％殺菌率）。 実施例２：食物表面に付着した細胞内殺菌率 浸透圧衝撃及び／又はその後のリゾチーム処理の存在下又は不存在下における 、様々な濃度のＴＳＰについて、鶏の皮に付着したグラム陰性微生物（Ｅ．ｃｏ ｌｉ、及びＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ）に対して行なわれた効果的殺菌につい て、次のようなテストを実施した。 テスト細菌の一晩経過した培養物を、新しい培地で１／２５希釈し、前記のよ うに、初期静置相まで成長させた（約４時間のインキュベーション）。用いられ た実験食物表面は、鶏の皮サンプル１ｇ（翼又は腿部から取り除いたものであっ て、地域のスーパーマーケットで購入したもの）；及びレタスの葉の円形切片（ 直径３ｃｍ）であった。食物サンプルを、初期静置相培養物中に３０分間浸漬し 、ついで冷たい空気流中で３分間乾燥させた。あるいはサンプルの表面に、テス ト培養物２０μｌを植え付け、３０分間空気乾燥させた。 植付られたテストサンプルを、１０ｍｌ ＴＳＰ溶液、１０ｍｌ ＴＳＰ＋０ ．８Ｍ ＮａＣｌ、０．８Ｍ ＮａＣｌ又は 蒸留水に、適宜、浸漬する。室温、４℃、又は３７℃において１０分間、回転震 盪器（ｓｈａｋｅｒ）でインキュベーションした後、サンプルを振動させて過剰 な液体を除去し、ついで蒸留水、又は１００μｇｍｌ^-1リゾチームを含む蒸留水 （ＳｉｇｍａＬ６８７６）中に浸漬した。さらには、いくつかの実験において、 ナイシン（３．３３×１０^-5Ｍ）又は乳酸（２．５×１０^-3又は１０×１０^-4Ｍ ）を、最終処理溶液に加えた。あるいは最終処理の前に水による追加の濯ぎを加 えた。３０分間のインキュベーション後、サンプルを個別に２時間、５０ｍｌの 蒸留水でストマッカー（Ｃｏｌｗｏｒｔｈ ８０）においてストマック（消化し た）（ｓｔｏｍａｃｈ）した。ストマックサンプルの連続的な希釈、及び指示さ れている場合には処理流体を、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉのみに関して、平板計数寒天（ オクソイド社）、又は血液寒天上で培養した。プレートを前記のようにインキュ ベートして、細胞内殺菌率の割合を計算し、表９及び１０に記録した。 ^* 当初処理溶液は、ＴＳＰ、ＴＳＰ＋ＮａＣｌ、又は水であった。^** 最終処理溶液は、リゾチーム溶液又は水であった。 ^* 当初処理溶液、すなわちＴＳＰ、ＮａＣｌ、ＴＳＰ＋ＮａＣ ｌ、又は水のｐＨ 用いられたＴＳＰ濃度は比較的高く、これは例えば皮の表面に存在するような 、高い有機物負荷の存在下に懸濁された微生物を殺菌するのに必要とされる濃度 に基づいている。 この結果は、ＴＳＰと浸透圧衝撃処理との間の相乗作用を示している。しかし ながら、ＴＳＰ及びＴＳＰ／浸透圧衝撃処理はこの場合、おそらくはＴＳＰのリ ゾチーム溶液へのキャリーオーバー（持ち越し）（ｃａｒｒｙ ｏｖｅｒ）によ って、リゾチームへの感受性を有意には高めないようであった。これはアルカリ 性になった。 比較的低いＴＳＰ濃度（０．００２〜０．０１Ｍ）を用いて、実験を室温で繰 り返した。これらの実験において、皮の表面は、 培養物中に浸漬されるのではなく、これに直接テスト微生物を植え付けた。これ は微生物が皮サンプルの下側へ付くのを最小限にするためであった。このような 場合、これらは脂肪質によって閉塞されやくすなるであろう。結果を表１１及び １２に示す。 ^* 当初処理溶液、すなわちＴＳＰ、ＮａＣｌ、ＴＳＰ＋Ｎａ ｌ、又は水のｐＨ ^* 当初処理溶液、すなわちＴＳＰ、ＮａＣｌ、ＴＳＰ＋ＮａＣ ｌ、又は水のｐＨ 結果（表１１）は、これらの低いＴＳＰ濃度において、ＴＳＰ／リゾチーム、 ＴＳＰ／浸透圧衝撃、及びＴＳＰ／浸透圧衝撃／リゾチーム処理の間に相乗作用 があったことを示している。０．００２Ｍ ＴＳＰ（約ｐＨ９）での処理後の最 大細胞殺菌率は９７％であった。これは、皮表面に植え付けられ、１０分間０． ４Ｍ ＴＳＰ（ｐＨ１２．５）のみで処理された細胞についてのものに匹敵する 。リゾチーム処理溶液のｐＨは、すべての場合に＜７であった。 用いられたＴＳＰ濃度（０．０１Ｍまで）において、鶏の皮に付着したＳ．ｅ ｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓ細胞の最大殺菌率は９５％であり（表１２）、ＴＳＰ／リ ゾチーム及びＴＳＰ／浸透圧衝撃処理間の相乗作用のなんらかの徴候があった。 最終洗浄溶液中のリゾチーム活性へのＴＳＰキャリーオーバーの効果の可能性を テストするために、２．５又は０．２５ｍＭ乳酸を用いて溶液を酸性化した。こ れらの濃度において、リゾチーム溶液のｐＨ、及びリゾチームを用いない対照は 、約５．０（２．５ｍＭ乳酸）及び６．５（０．２５ｍＭ乳酸）まで減少した。 しかしながら細胞殺菌率は、０．０１Ｍ ＴＳＰ／ＮａＣｌでの処理後に増加し なかった。この場合、ついで２．５ｍＭ乳酸中 リゾチームで処理されたサンプルにおいて、細胞殺菌率は９４〜９９％まで上昇 した。この殺菌率の上昇は、部分的には、増加したｐＨ衝撃によるものであろう 。 鶏表面に対比させる表面として、レタスを用いた。付着したＥ．ｃｏｌｉの殺 菌率は、特に比較的低い（０．０１Ｍより低い）ＴＳＰ濃度において、ＴＳＰと その後のリゾチーム処理との間に顕著な相乗作用を示した。より高い濃度におい て、リゾチームの効果はあまり顕著ではなかった。レタスの葉での結果はまた、 特に０．０１Ｍ ＴＳＰ（テストされたうちで最高の濃度）において、ＴＳＰと 浸透圧衝撃処理との間に相乗作用を示した。レタス上のＥ．ｃｏｌｉの最大殺菌 率は、ＴＳＰ／リゾチーム及びＴＳＰ／浸透圧衝撃の組合わせ処理の両方の場合 、＞９９％であった。従って鶏の皮を用いて観察された結果とは対照的に、レタ スに関するデータは懸濁細胞に関して得られたデータにはるかに近かった。この ことは、表面への付着プロセスが、用いられた処理に対する保護をそれ自体で生 じるのではなく、表面の性質が生存にとって非常に重要なものであることを意味 する。レタスに付着したＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓを用いて、単回実験も行な った。結果は、Ｅ．ｃｏｌｉの場合の 結果と質的に同様であった。但し細胞内殺菌率は一般にこれより少なかった。 実施例３：ナイシンの殺菌効果 ナイシン、又はナイシン＋リゾチームを用いて、リゾチームに関して前記され たものと同様な実験を実施した。ナイシンは、凍結乾燥粉末として得られた（Ｎ ａＣｌ及び変性ミルク固体との２．５％ナイシン；シグマ社）。これは水に溶解 され、保存溶液（３ｍＭ）として凍結貯蔵された（−７０℃）。解凍後、薄膜濾 過によってこれを滅菌し、０．１１４μＭ〜３４．２μＭの濃度で用いた。結果 を表１３〜１５に示す。 示されている結果は、様々な温度でＴＳＰ中でインキュベートされ、室温でナ イシン溶液（１．１４μＭ）中に希釈（１：１０）された細胞に関するものであ る。 ^* 水による濯ぎは省略した。 示された結果は、３７℃でＴＳＰ中でインキュベートされ、水で素早く濯がれ （５秒）、３７℃でナイシン溶液（３４．２μＭ）又は蒸留水に移された、皮の 表面で乾燥された細胞に関するものである。 ^* 鶏の皮のサンプルの添加後 示されている結果は、３７℃でＴＳＰ中でインキュベートされ、（Ａ）水中で 素早く（５秒）濯がれ、３７℃でナイシン（３μＭ）又はナイシン＋リゾチーム （１００μｇｍｌ^-1）に移されるか、あるいは（Ｂ）２．５ｍＭ乳酸中ナイシン に移された、皮の表面で乾燥された細胞に関するものである。 表１３は、様々な濃度のＴＳＰで既に処理された懸濁細胞への１．１４μＭナ イシンの効果を示している。細胞は、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉ（４℃及び３７℃）、Ｅ ．ｃｏｌｉ（３７℃）、及びＰ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｓ（室温及び３７℃）で あった。３７℃で実施された実験において、ナイシンは、低いＴＳＰ濃度のみ（ 微生物に従って０．５〜１．０ｍＭ）で既に処理されている細胞の高い殺菌率（ ７ログまで）を引起こした。用いられた条件下において、ナイシン又はＴＳＰ処 理は、単独で用いられた場合、有意の細胞死は引起こさなかった。さらには、よ り高いＴＳＰ濃度において、単独のＴＳＰ処理がいくつかの細胞死を引起こした が、ＴＳＰとナイシンとの間の顕著な相乗作用は明白であった。用いられた条件 下において、ナイシンは、ＴＳＰ処理済み細胞と未処理細胞との両方において、 Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓの高い殺菌率を生じた（表１３）。 表１４は、Ｅ．ｃｏｌｉ細胞が、鶏の皮の外側表面上で乾燥しているような実 験の結果を示している。ナイシンは、０．０１及び０．００５Ｍ ＴＳＰで既に 処理されている細胞の３７℃での殺菌率を顕著に高めたことが分る。０．０５Ｍ ＴＳＰにおいて、殺菌率は、ナイシンの存在下及び不存在下においても 同様であった（データは示されていない）。低いＴＳＰ濃度への暴露後のナイシ ンによる細胞内殺菌率は、ＴＳＰ処理後、及びナイシン溶液への浸漬の直前、水 での素早い濯ぎの導入によって、さらに高められた。０．００５Ｍ ＴＳＰでの 細胞内殺菌率は、一定して＞９９％であった。さらにナイシン処理と組合わされ た０．００５Ｍ ＴＳＰを用いて得られたＥ．ｃｏｌｉの高い殺菌率は、ナイシ ンを用いない非常に高いＴＳＰ濃度（０．４Ｍ）で見られるものに匹敵するもの であった。同様に高い殺菌率（９９％）も、Ｃ．ｊｅｊｕｎｉの場合に見られた （表１４）。それにもかかわらずＳ．ｅｎｔｅｒｉｔｉｄｉｓはより耐性があり 、９７％までの殺菌率が見られた（表１４）。（用いられた条件下において、ナ イシンは、グラム陽性菌Ｓｔ．ａｕｒｅｕｓの殺菌率において、非常に効果が高 かった。ＴＳＰでの先行処理の不存在下では、殺菌率は＞９９．９％であった（ 表１４）。 表１５（Ｂ）は、乳酸がナイシン洗浄液中に組込まれた場合の、サルモネラの 殺菌率に対する効果を示している。酸性ｐＨ（約ｐＨ５．０）を確保するために 乳酸が添加された。これはナイシン活性に最適に近いものであった。ナイシンの 存在下に おける細胞内殺菌率は９９％まで増加した。しかしながら潜在的に興味深いとこ ろであるが、ナイシンの不存在下における殺菌率は同様に高く、これはｐＨ衝撃 を増すことが、細胞死のかなり大きな原因であることを示唆している。 表１５（Ａ）は、テスト系として鶏の皮に付着したＥ．ｃｏｌｉに対するＴＳ Ｐ及び浸透圧衝撃／ＴＳＰ組合わせ処理後のリゾチーム＋ナイシンの効果を示し ている。３７℃で実施された実験において、ナイシンとリゾチームの両方は、Ｔ ＳＰ処理された鶏の皮の生存物数を＞９０％減少させた。しかしながら皮をナイ シン＋リゾチームで処理した場合に、殺菌率はこれ以上は改良されなかった。 室温と３７℃の両方において、ナイシン及び／又はリゾチーム処理の前の浸透 圧衝撃／ＴＳＰの組合わせ処理を用いた実験において、同様な結論に達した。９ ５％までの殺菌率が得られた。しかしながらこのデータとリゾチーム又はナイシ ンのみについてのデータの比較は、組合わせによる殺菌効果の増加を示さなかっ た。ナイシン及びリゾチームが拮抗的に作用しているか、あるいはこれらが同じ 細胞個体群に影響を与えている可能性がある。 鶏を用いた実験において、ナイシンを含む最適な組合わせ処理は、高い細胞殺 菌率を生じた。これらの実験において、自然界で得られた細菌の存在による細胞 内殺菌が過小評価されていることもありえた。従ってγ−照射によって滅菌され た鶏の部分を用いて、いくつかの実験を繰り返した。さらに、ＴＳＰ＋浸透圧衝 撃及びナイシン処理の組合わせの効果が測定された。すなわち鶏の皮は、ＮａＣ ｌの存在下にＴＳＰに暴露され、ついでナイシン溶液に移された。結果を表１６ に示す。 示されている結果は、３７℃でＴＳＰ（５ｍＭ）、ＮａＣｌ（０．８Ｍ）、又 はＴＳＰ＋ＮａＣｌ中でインキュベートされ、ナイシン（３３．３μＭ）溶液に 移された、皮の表面で乾燥された細胞に関するものである。ＴＳＰが用いられた 場合、短時間の水による濯ぎ（５秒）を、ナイシン溶液へ移す直前に行なった。 グラム陰性菌に関して、ＴＳＰ−ナイシン処理について測定された殺菌率（≧ ９７％）は一般に、滅菌されていない鶏を用いた実験において測定されたものよ り高かった（表１４及び１６参照のこと）。同様に浸透圧衝撃−ナイシン処理の 場合、同様に高い殺菌率（≧８５％）が見られた（表１６）。しかしながらＴＳ Ｐ＋浸透圧衝撃及びナイシン処理の組合わせが最も効果的であった（細胞殺菌率 ＞９９％）。用いられた条件下において、この処理はまた、Ｌ．ｍｏｎｏｃｙｔ ｏｇｅｎｅｓ及びＳｔ．ａｕｒｅｕｓ（グラム陽性種）の生存物数を、約５ログ サイクル減少させた（表１６）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９７年１１月１７日（１９９７．１１．１７） 【補正内容】 請求の範囲 １．サンプル中のグラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルを減少させる方法であ って、三アルカリ金属オルトリン酸塩の０．０００５〜０．２Ｍ溶液でサンプル を処理することを含み、前記処理が、次のステップのうちの１つ又はそれ以上を 含むさらなる処理と組合わされる方法： ａ）サンプルを浸透圧衝撃に付すこと、 ｂ）三アルカリ金属オルトリン酸塩での前記処理後、ペプチドグリカンを分解 する酵素に、サンプルを暴露すること；及び ｃ）三アルカリ金属オルトリン酸塩での前記処理後、バクテリオシンへサンプ ルを暴露すること。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ， ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，Ｒ Ｕ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者 ダ・シルバ・カルネイロ・デ・メロ，アレ キサンドラ・マリア イギリス国、ロンドン・ダブリユ・８・ ７・エー・エイチ、カンプデン・ヒル・ロ ード、デイビジヨン・オブ・ライフ・サイ エンシズ、キングス・カリツジ・ロンドン （番地なし)

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．サンプル中のグラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルを減少させる方法であ って、三アルカリ金属オルトリン酸塩の０．０００５〜０．２Ｍ溶液でサンプル を処理することを含み、前記処理が、次のさらなる処理のうちの１つ又はそれ以 上と組合わされる方法： ａ）サンプルを浸透圧衝撃に付すこと、 ｂ）三アルカリ金属オルトリン酸塩での前記処理後、ペプチドグリカンを分解 する酵素に、サンプルを暴露すること；及び ｉｉ）三アルカリ金属オルトリン酸塩での前記処理後、バクテリオシンへサン プルを暴露すること。 ２．さらなる処理が、工程（ａ）、及び工程（ｂ）又は工程（ｃ）を含んでいる 、請求項１に記載の方法。 ３．前記サンプルを浸透圧衝撃に付すことを含んでおり、前記浸透圧衝撃は、低 浸透圧衝撃を含んでいる、請求項１又は２に記載の方法。 ４．前記低浸透圧衝撃の前に、高浸透圧衝撃を実施する、請求項３に記載の方法 。 ５．前記浸透圧衝撃処理は、０．９９７又はそれ以下の水分活性（ａ_w）を有す る第一溶液にサンプルを暴露する工程、ついで前記第一溶液より高いａ_wの溶液 にサンプルを暴露する工程を含む、請求項４に記載の方法。 ６．前記第一溶液は、０．９９７又はそれ以下の水分活性を生じるのに十分な濃 度で、ＮａＣｌを含んでいる、請求項５に記載の方法。 ７．前記第一溶液は、０．０００５〜０．２Ｍの三アルカリ金属オルトリン酸塩 を含んでいる、請求項５又は６に記載の方法。 ８．ペプチドグリカンを分解する酵素に、サンプルを暴露する工程を含み、前記 酵素がリゾチームを含んでいる、請求項１〜７のうちの一項に記載の方法。 ９．サンプルが、少なくとも１μｇｍｌ^-1の濃度のリゾチーム溶液で処理される 、請求項７に記載の方法。 １０．リゾチームが、少なくとも０．１ｍｇｍｌ^-1の濃度にある凍結乾燥卵白の 溶液の形態で提供される、請求項８に記載の方法。 １１．サンプルがバクテリオシンに暴露され、前記バクテリオシンがナイシン又 はペドシンから選ばれる、請求項１〜１０の うちの一項に記載の方法。 １２．バクテリオシンがナイシンである、請求項１１に記載の方法。 １３．サンプルが、少なくとも０．１μＭの濃度のナイシンを含んでいる溶液で 処理される、請求項１２に記載の方法。 １４．ナイシンを含んでいる溶液での処理前に、サンプルを水で濯ぐ、請求項１ ３に記載の方法。 １５．バクテリオシン又は酵素溶液が酸性化される、請求項８〜１４のうちの一 項に記載の方法。 １６．溶液が、約ｐＨ５．０まで酸性化される、請求項１５に記載の方法。 １７．溶液が、乳酸の添加によって酸性化される、請求項１５又は１６に記載の 方法。 １８．乳酸は、少なくとも０．２５ｍＭの濃度で存在する、請求項１７に記載の 方法。 １９．三アルカリ金属オルトリン酸塩が、リン酸三ナトリウムである、請求項１ 〜１８のうちの一項に記載の方法。 ２０．三アルカリ金属オルトリン酸塩溶液の濃度は、０．００１〜０．０２Ｍで ある、請求項１〜１９のうちの一項に記載の方 法。 ２１．三アルカリ金属オルトリン酸塩溶液の濃度は、０．００５〜０．０１Ｍで ある、請求項２０に記載の方法。 ２２．サンプルが、消費しうる製品又は表面を含んでいる、請求項１〜２１のう ちの一項に記載の方法。 ２３．サンプルが食料品の一部を含んでいる、請求項２２に記載の方法。 ２４．処理工程は、サンプルを処理溶液に浸漬することによって実施される、請 求項１〜２３のうちの一項に記載の方法。 ２５．処理工程が、サンプルを処理溶液でスプレー洗浄することによって実施さ れる、請求項１〜２４のうちの一項に記載の方法。 ２６．三アルカリ金属オルトリン酸塩を０．０００５〜０．２Ｍの濃度で含む第 一溶液でサンプルを処理するが、前記溶液は０．９９７又はそれ以下の水分活性 （ａ_w）を有するものであり、ついでペプチドグリカン又はバクテリオシンを分 解する酵素の第二溶液でサンプルを処理するが、前記第二溶液は、前記第一溶液 より高いａ_wを有するものである、請求項１に記載の方法。 ２７．サンプルが前記第一溶液と第二溶液に連続して浸漬される、請求項２５に 記載の方法。 ２８．食料品の一部分におけるグラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルを減少さ せる方法であって、この部分を、４〜５０℃の温度において、０．０００５〜０ ．２Ｍの濃度のリン酸三ナトリウム及び約０．８Ｍの濃度の塩化ナトリウムの溶 液中に浸漬し、ついでリゾチーム溶液でスプレー洗浄することを含んでいる方法 。 ２９．食料品の一部分におけるグラム陰性菌及びグラム陽性菌のレベルを減少さ せる方法であって、この部分を、４〜５０℃の温度において、０．０００５〜０ ．２Ｍの濃度のリン酸三ナトリウムの溶液中に浸漬し、ついで１μＭより高い濃 度のナイシンでスプレー洗浄することを含んでいる方法。 ３０．三アルカリ金属オルトリン酸塩、及び下記成分の１つ又はそれ以上を含む 、請求項１〜２９のうちの一項に記載の方法を実施するためのキット： ａ）細胞中に浸透圧衝撃を誘発するために用いることができる試薬； ｂ）ペプチドグリカンを分解することができる酵素；及び ｃ）バクテリオシン。 ３１．成分が水溶液の形態である、請求項３０に記載のキット。 ３２．請求項１〜２９のうちの１つに記載の方法によって処理された製品。 ３３．食料品を含む、請求項３２に記載の製品。