JP2000503201A - 動物飼料および貯蔵牧草の処理における微生物とその利用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 ラクトバシラス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）（ＮＣＩＭＢ取得番号４０７８８）の発酵により得られる抗菌効果を動物飼料に添加することを含み、この効果が通常発酵中に産生される脂肪酸に加えることによって得られるものであり、この効果が上記腐敗菌の生育を妨害する能力により特徴付けられる、酵母、かびおよび胞子形成バクテリアから選ばれる腐敗菌の生育を受け易い貯蔵牧草または動物飼料の処理方法。この効果は、１０分間の加熱を受けたとき８０℃では安定で、１２０℃では失活する物質によるものであってもよい。

Description

【発明の詳細な説明】 動物飼料および貯蔵牧草の処理における微生物とその利用発明の分野 本発明は動物飼料および貯蔵牧草の処理における微生物とその利用に関する。発明の背景 酵素や微生物を利用することにより動物の性能や動物が摂取する飼料の価値を 改良しあるいは高めることができる。例えば、国際特許公開公報ＷＯ-Ａ-９２１ ０９４５号には調製された貯蔵牧草の価値を高めるためにこれらを組み合わせて 利用することが記載されており、また国際特許公開公報ＷＯ-Ａ-９６１７５２５ 号は微生物を用いる動物の性能改善に関するものである。酵素を揮発性脂肪酸を 産生する微生物と組み合わせ使用する効果についても記載している。この場合、 貯蔵牧草の保存がよりよく行われ、動物の性能改善がよりよく行われ、また発生 物質が少ないことも示されている。国際特許公開公報ＷＯ-Ａ-９５０３３９６号 には、貯蔵牧草の発酵中に好ましい揮発性脂肪酸のプロフィールが得られる場合 はいくつかの利益が得られることが示されている；サイロの留め金をはずすと熱 発生の減少が生じないため望ましくないことも見いだされている。 貯蔵牧草およびそれに関連した農作物は最近の数年にわたって多数の異なるプ ロセスが決定されるところまで発展してきた：（ｉ）乾燥残分が特に少ない、例 えば２５％未満の若い草（英国、アイルランド、スカンジナビアに共通）を生牧 草にすること（ensiling）、（ii）乾燥残分のより高い、より成熟した牧草（英 国）を生牧草にすること、萎れされることにより得られる乾燥残分が高いが若い 牧草（オランダ）を生牧草にすること;および（iii）ストーバ（stova）と軸を 含む通常乾燥残分が約３５％であるトウモロコシ全体、および収穫穀草全体、例 えば乾燥残分４５〜５０％の小麦全体を生牧草にすること。 特にケース（ii）および（iii）の場合には、正規の方法ではひとつの大きな 問 題がおこる。これは好気性腐敗（aerobic spoilage）として知られている現象で ある。この現象はよく理解されてはいない。多数の異なる見解があるが、好気性 腐敗の工程はいくつかの相に分けることができる。このように酵母、時には酢酸 バクテリアが保存している有機酸を呼吸し始める初期相がある。ｐＨの初期上昇 に続いて、桿菌の活性化が明らかである第２の相があり、これは温度上昇を伴う 。さらに別の相では真菌を含む種々の微生物の活動が含まれている。 乾燥残分がかなりの量、即ち３０％を越える貯蔵牧草の場合には、腐敗の問題 は特に重大である。一旦サイロの留め金をはずし、空気にさらされると多かれ少 なかれ腐敗が見られる。発明の要旨 本発明は、少なくとも一部は、空気を導入して暴露した場合に拘束物中に生じ る熱発生に密に関係しているものとして、好気性腐敗を確認することに基づいて いる。このような貯蔵牧草の腐敗試験の結果、高濃度の好熱性グラム陽性菌、酵 母および桿菌や真菌を含むバクテリアの存在が示された。これは堆肥化の場合と 同様、明らかに第２次発酵の発生を示している（第１次発酵は生牧草化プロセス である）。この発酵段階では、酵母とかびが中心である。腐敗を防止するために 、滅するまたは抑制する必要がある主たる３つの微生物のカテゴリーがあり、そ れは胞子形成バクテリア、酵母および真菌であるように見える。ひとつのカテゴ リーを除くだけではその他のカテゴリーを増殖させ、腐敗を防ぐことはできない 。 本発明では、腐敗防止の効用は少なくとも第１の例では好気性腐敗を開始する 微生物、特に酵母、および貯蔵牧草表面の真菌を妨害する物質について確認され てきた。これを可能にする微生物は他の腐敗微生物の増殖を防ぐことができ、ス クリーニングによって確認できるかもしれない。 この要求にかなうラクトバチラス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）種の 微生物は１９９６年２月１３日にナショナル・コレクション・オブ・インダスト リアル・アンド・マリン・バクテリア（National Collection of Industrial an d Marine Bacteria）（以下、ＮＣＩＭＢとも略記する）寄託されている。その 取得番号は４０７８８である。 以下により詳細に説明するように、この微生物は、発酵において通常産生され る酢酸、プロピオン酸、乳酸のような揮発性脂肪酸産生能力を持つ微生物と異な りおよび／またはそれ以上の驚異的な効果を有する。この微生物は抗菌性物質を 産生しまたは種々の腐敗菌の生育を妨害する能力を特徴とする効果を発揮するも のであり、８０℃で安定であり１２０℃で失活する。このような物質（おそらく 蛋白質様であろうと思われる）はいずれも他の微生物によっても産生されると仮 定するのが合理的であろう。通常の知識を有する当業者であれば、本明細書の情 報を得ることにより、寄託されている以外の与えられた微生物が同じ物質を産生 するかどうかを確認することは可能であろう。 物質は通常の知識を有する当業者にとって公知の方法により単離され、精製さ れるかもしれない。物質はそのものとして動物飼料または貯蔵牧草を処理するた めに直接用いられるかもしれない。言い換えれば、本発明の方法では微生物をそ のものとして用いることは必要ないかもしれない。発明の詳細な説明 本発明を説明するために、ある微生物についてほぼ正常な貯蔵牧草の発酵を行 うことのできるとともに、好気性腐敗に関係すると思われる他の微生物を妨害す ることのできる物質を産生することができることを確認した。更に、収穫小麦全 体、トウモロコシおよび貯蔵牧草に接種したとき、この微生物は貯蔵牧草を良好 に保存し、そこでは好気性腐敗および発熱を伴う二次発酵の発生を減じまたは防 止する。このようにこの微生物は貯蔵牧草中で見られる発酵条件下で妨害物質を 産生することができるようにみえる。（ラクトバチラス・プランタラムを含む接 種物質を使用しまたは使用しないで）十分発酵した貯蔵牧草中で通常得られる揮 発性脂肪酸のプロフィルでは好気性腐敗の発生を防止することが不充分であるこ とが分かっている。 妨害物質は二次的代謝産物であるかも知れないと思われる。したがって、貯蔵 牧草中で使用する場合、貯蔵牧草をあまり早く開放しすぎれば十分な効果は得ら れないかもしれない。貯蔵牧草は好ましくは少なくとも３０日、より好ましくは 例えば少なくとも４５日といったより長期間開放しないことである。最適期間は 、 例えば、特に貯蔵牧草の量、および生牧草にされる材料の性質に依存する。 本発明では、生牧草にするに好適な材料は好気性腐敗を受けやすいものであれ ば何でもよい。この材料には、通常乾燥残分が少なくとも２５重量％のものが含 まれる。このような材料にはライムギまたは伝統的な牧草、トウモロコシ、アル ファルファ、萎れた牧草、小麦、大麦または他の穀草の全体が含まれる。貯蔵牧 草は梱（こり）（特に、好気性腐敗を受け易い形態である）の形態であってもよ い。また、本発明は好気性腐敗を受け易い何らかの動物飼料、それは固体であっ ても液体であってもよく、例えばブタ、家禽または反芻動物用の飼料に使用して もよい。 本発明に関連した活性は、ラクトバチラス・ブクネリの他の系、ラクトバチラ スの他の種、例えばラクトバチラス・ケフィル（Ｌ.ｋｅｆｉｒ）、ラクトバチ ラス・パラケフィル（Ｌ.ｐａｒａｋｅｆｉｒ）、およびラクトバチラス・パラ ブクネリ（Ｌ.ｐａｒａｂｕｃｈｎｅｒｉ）、およびまた他の属のものでも見い だされるかもしれない。これは本発明の情報に基づいて日常的な実験により証明 され得る。 この活性は種々の腐敗菌の生育を妨げる点で価値がある。このような微生物の 例としては、リステリア（Listeria）微生物、バチラス・エス・ピー・ピー（Ba cillus spp.）、ギレルモンデラ・セレノスポラ（Guillermondella selenospora ）、トリコデルマ・ロンギブラキアタム（Trichoderma longibrachiatum）、ア スぺルギルス・ニガー（Aspergillus niger）、モナスカス（Monascus）、ペニ シリウム・ロケフォルティ（Penicillium roquefortii）、フサリウム・エス・ ピー・ピー（Fusarium spp.）、およびサルモネラのような腸バクテリアが挙げ られる。 選ばれた微生物を液体培地中で生育し、発酵培養液を細胞と分離した。この培 養液は、次に必要とする効果、即ち熱的に安定な貯蔵牧草を提供できる妨害物質 が存在するかどうかを確認する試験で使用した。 実験は腐敗過程を典型的に示す３種類の代表的な微生物、即ちバチラス、酵母 および真菌を用いて行った。揮発性脂肪酸である乳酸、酢酸、プロピオン酸の塩 のいくつかの組み合わせについても試験した。選ばれた微生物の少しのものから の抽出物だけが望ましい妨害結果を生じた。これはバクテリアは標的微生物に対 して妨害性を有する１種またはそれ以上の物質を産生することができることを示 している。 このような微生物が実際に好気性腐敗を防止することができることを示すため に、更に実験を行った。微生物を常套の手段で培養し、約１０ｋｇのバッチ中の 牧草または全体小麦に再接種した。この場合微生物は、生牧草される物質では典 型的な通常の生牧草化発酵とは異なる発酵を行った。この発酵の性質は十分に理 解されないが、気体、多分ＣＯ₂としての乾燥残分の損失（約４％）は、これが 部分的に不均質発酵している発酵であるかも知れないことを示している。このよ うにして製造された貯蔵牧草は、ほぼ正常な貯蔵牧草に似た揮発性脂肪酸プロフ ィルを有することがわかった。この微生物を酵素と組み合わせて接種することに より製造した貯蔵牧草が望ましい結果を提供するという証拠はなかった。しかし このようにして製造した貯蔵牧草を約０.５ｍ×０.２５ｍ×０.１ｍの大きなプ ラスチクックボックスに入れた。ボックスにはほぼ半分ほど満たした。好気性腐 敗の熱発生の開始段階を記録するために熱電対を貯蔵牧草中に置いた。それぞれ のボックスは優れた換気装置を備えたオープン・ラボに置いた。 このような一つの実験結果を下記実施例１に示した。この結果によると明らか に正常な貯蔵牧草発酵を示しているが、微生物に対する顕著な抗菌活性効果を示 し、処理された貯蔵牧草は熱安定であり、少なくとも１０日間環境温度（２０℃ ）を維持した。コントロールおよび他の処理を行ったものでは、温度は３５℃以 上に上昇した。実施例 １ 穀草小麦全体を、凍結乾燥した細胞および酵素からなるフォーミュレーション で処理した。フォーミュレーションは４.８７％のラクトバチラス・ブクネリ（ ＮＣＩＭＢ取得番号４０７８８）、β-グルカナーゼ、キシラナーゼおよびガラ クトマンナナーゼを含む１０.６７％の酵素類、８０.０９％のグラニュー糖、３ .１３％のドリマラン・グリーン（Drimalan green）BGE および１.２５％のシパ ーナット（Sipernat）50Sを含んで構成されていた。これらの数値は凍結乾燥し たセル濃度、３×１０¹¹／ｇのラクトバチラス・ブクネリ濃度を基にしている。 この薄緑色の、自由に流動する粉末フォーミュレーションを１００リットルの水 に溶解し、青刈飼料２５トンを処理するために、１トン当たり４リットルの割合 でスプレーして用いた。生存数は作物小麦全体の１ｇ当たり５×１０⁴ｃｆｕで あった。 コントロールとして、ペディオコッカス・ペントサセウス（Pediococcus oent osaceus）（ＮＣＩＭＢ取得番号１２４５５）およびラクトバチラス・プランタ ラム（Lactobacillus plantarum）（ＮＣＩＭＢ取得番号１２４２２）を含む在 来の貯蔵牧草接種物質を用いた。これは貯蔵牧草処理で慣例的に用いられていた 代表的な微生物であり、下記に「標準接種物質」として記載している。 標準の発酵工程を行うことができるように、排気口を備えた発酵樽中にフォー ミュレーションを入れた。内容物を１３０日間解析したのち試験し、それから好 気性安定性を実施した。発酵プロフィル 処理 DM（％） ｐＨ CP（％） ME(MJ/Kg) NH₃（％） 未処理 49.6 4.1 12 10.6 0.11 標準接種物質 50.3 3.9 10 10.7 0.12 試験微生物 51.0 4.0 10.4 10.1 0.11生成物プロフィル 乳酸塩 酢酸塩 酪酸塩 エタノール 未処理 41 1 0 6 標準接種物質 45 5 0 3 試験微生物 35 4 0 6 温度上昇（℃） 処理（時間） 0 50 100 150 200 250 未処理 17 17 17 35 34 25 標準接種物質 17 17 17 25 27 36 試験微生物 17 17 17 17 17.5 18 小スケールではあるが、これらの結果は、この機構は揮発性脂肪酸のプロフィ ルにも揮発性脂肪酸の濃度にも依存しないことを証明している。実施例２ ビグベイル（Bigbale）牧草の貯蔵牧草を調製し、実施例１と同様のフォーミ ュレーションで、更にアミラーゼを、青刈飼料１×１０⁵ｇの供給において牧草 ｌｇ当たり１×１０⁵cfuとなるように加えて処理した。コントロール貯蔵牧草お よびラクトバチラス・ブクネリ株で処理した貯蔵牧草を試験し、生牧草化２８日 、６３日および１１３日後に解析した。ビグベイル貯蔵牧草の組成は次の通りで あった: ２８日 ６３日 １１３日 乾燥残分(g/kg) 335 373 361 367 328 337 ｐＨ 4.48 4.57 4.42 4.49 4.40 4.47 乳酸塩(g/kg DM) 54 54 66 59 78 71 酢酸塩 11 13 15 19 21 27 プロピオン酸塩 0.7 0.7 O.6 0.7 0.8 1.0 エタノール 8 8 7 8 9 10 NH₃-N（％N） 9 8 11 10 12 12 好気性腐敗安定性 138 178 187 222 150 ＞189 （時間） 実施例２の結果もまた、コントロールと本発明の間の違いは単に特定の揮発性 脂肪酸プロフィルの産生によるものでないことを証明している。更に空気に暴露 した場合の貯蔵牧草の安定性は時間と共に増加することを示している。これは微 生物ラクトバチラス・ブクネリおよび類似活性を有する他の微生物が特定モード で作用することを示している。 上記の結果から、その作用機構は、発酵過程中に於ける選ばれた微生物による 少なくとも１種の抗菌性物質を産生するものであるように見える。抗菌性物質の 特性を明らかにするために選ばれた、微生物の発酵ブロスの上澄み中に産生され た物質が高範囲の微生物に対して妨害を行うということを証明する実験を行った 。この物質は８０℃で１０分間の熱処理に対して安定であったが、１２０℃で１ ０分間の熱処理により失活した。また発酵ブロス中に存在する揮発性脂肪酸も選 ばれた腐敗菌に対しては無視し得るほどの効果しかまたはまったく効果がないよ うであった。実施例 ３ 発明の機構は、更に、フラスコ培養で２４時間および４８時間培養したのちに 培養液上澄みを調製して一連の実験を行うことによって証明された。この上澄み を貯蔵牧草で発生するような発酵の好気性腐敗において活性を有することが知ら れている特定の微生物関して試験を行った。この実験では、注意を、酵母および かびのカテゴリーに入る微生物に集中した。上澄み液の効果を、かび類、フサリ ウム・オキシスポラム（Fusarium oxysporum）（ＩＭＩ ２３６４４１）、ムカ ー・ラセモサス（Mucor racemosus)（ＩＭＩ １０３７３０）、アスペルギルス ・ニガー（Aspergillus niger）（ＩＭＩ ０９６２１５）、カルドスポラム・ ヘルバラム（Caldosporum herbarum）（ＩＭＩ ０９６２２０）、ペニシリウム ・イクスペンサム（Penisillium expansum）（ＩＭＩ ３１５９０２）およびト リコデルマ・ハルザニウム（Trichoderma darzanium）（ＩＭＩ ２７５９５０ ）、および酵母類、カンディダ・クルーセイ（Candida krusei）（ＡＴＣＣ６２ ４０３）、ギリエルモンデラ・セレノスポラ(Guilliermondella serenospora)（ ＡＴＣＣ １０６２９）、デブラリョマイセス・ハンセニイ（Debraryomyces ha nsenii）（ＡＴＣＣ ９３６４）およびピチア・サブペリコサ（Pichia subpelli cos a）（ＡＴＣＣ １６７６６）について試験した。 それぞれの場合に、対象微生物の生育が妨害されることが証明された。加えて 、４８時間の培養後のブロスから調製した上澄みの場合は２４時間培養の場合よ りも優れた妨害活性を示した。このことは、抗菌効果は細胞生育サイクルの後期 で産生されること、または抗菌効果は時間と共に蓄積されること、またはどちら の可能性も起こりうることを示している。このように、抗菌効果は各世代で、加 速的に蓄積されるかもしれない。したがって、好ましくは、現場では、発酵を最 適な方法で行うべきであり、発酵を抗菌効果が最大に蓄積される時間まで継続す べきである。現場では抗菌効果を産生するに要する時間は条件によって、および 生牧草にしようとしている青刈飼料の性質によって変化するであろう。実施例 ４ 好気性腐敗の妨害に及ぼす時間の効果を証明するために、実施例１のように貯 蔵牧草を作製した。次いで好気性腐敗安定性を測定した。７日時点では貯蔵牧草 の安定性は乏しく、発熱の発生はコントロールと同じように生じた。１００日で は安定性が確保された。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ， ＥＥ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，Ｋ Ｐ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＶ ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ， ＰＬ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，Ｔ Ｍ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者 マン，スティーブン・フィリップ イギリス、シービー２・５キューキュー、 ケンブリッジシャー、ハーストン、ロンド ン・ロード20番 (72)発明者 スプールストラ，シールク・エフ オランダ、エヌエル―8200アーベー・レリ ースタット、ポストブス65、ルンダーウェ ッヒ２番、インスティテュート・フォー ル・ディールホウデレイ・エン・ディール ヘゾントヘイト

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． ラクトバシラス・ブクネリ（Lactobacillus buchneri）（ＮＣＩＭＢ取 得番号４０７８８）の発酵により得られる抗菌効果を動物飼料に添加することを 含み、この効果が通常発酵中に産生される脂肪酸に加えることによって得られる ものであり、この効果が上記腐敗菌の生育を妨害する能力により特徴付けられる 、酵母、かびおよび胞子形成バクテリアから選ばれる腐敗菌の生育を受け易い動 物飼料の処理方法。 ２． 請求項１に記載の抗菌効果を加えることを含む貯蔵牧草の処理方法。 ３． 貯蔵牧草が伝統的な牧草、例えばライムギである請求項２に記載の方法 。 ４． 貯蔵牧草がトウモロコシである請求項２に記載の方法。 ５． 貯蔵牧草がアルファルファである請求項２に記載の方法。 ６． 貯蔵牧草が萎れた牧草である請求項２に記載の方法。 ７． 貯蔵牧草が収穫穀草全体、例えば小麦または大麦である請求項２に記載 の方法。 ８． 上記効果が生牧草化に際して加えられる請求項２〜７のいずれかに記載 の方法。 ９． 貯蔵牧草を少なくとも３０日間保持することを含む請求項２〜８のいず れかに記載の方法。 １０． 貯蔵牧草が梱（こり）の状態にある請求項２〜９のいずれかに記載の 方法。 １１． 発酵に際して上記効果を生み出す能力を有する微生物を飼料または貯 蔵牧草に添加することを含む上記いずれかの請求項に記載の方法。 １２． 微生物が乾燥残分含有量４５％の収穫小麦全体の貯蔵牧草の温度が２ ００時間にわたって１７℃から４℃を越えて上がるのを防止する能力を有する請 求項１１に記載の方法。 １３． 微生物がラクトバシラス属に属するものである請求項１０または１１ に記載の方法。 １４． 微生物がラクトバシラス・ブクネリ、ラクトバシラス・パラブクネリ （L.buchneri）、ラクトバシラス・ケフィール（L.kefir）またはラクトバシラ ス・パラケフィール（L.parakefir）である請求項１３に記載の方法。 １５． 微生物がラクトバシラス・ブクネリである請求項１３に記載の方法。 １６． 微生物がラクトバシラス・ブクネリ、ＮＣＩＭＢ取得番号４０７８８ である請求項１３に記載の方法。 １７． 上記効果が、１０分間の加熱を受けた時、８０℃で安定で１２０℃で は失活することを特徴とする抗菌物質を含む上記いずれかの請求項に記載の方法 。 １８． 請求項１７に記載の抗菌物質を添加した動物飼料。 １９． 請求項１１から１６のいずれかに記載の微生物を添加した動物飼料。 ２０． 請求項１７に記載の抗菌物質を添加した貯蔵牧草。 ２１． 請求項１１から１６のいずれかに記載の微生物を添加した貯蔵牧草。 ２２． ＮＣＩＭＢ取得番号４０７８８のラクトバシラス・ブクネリ。