JP2000503533A - 蛍光消光基質を用いたタンパク質分解酵素のアッセイ方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 （ａ）酵素を含有する試料を式Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−ＣａｒまたはＦｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒである固定化蛍光消光ペプチドとインキュベートし、上記式中、Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特定の切断部位を含むペプチド鎖であり、Ｆｌｕは、発蛍光団であり、Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であり、Ｓｐａは、直接結合またはスペーサー鎖であり、そしてＣａｒは、非水溶性及び／または高分子の担体であり、（ｂ）場合によっては、担体物質から液体を分離し、（ｃ）該担体物質に照射し、蛍光を測定する、ことを含んでなるタンパク質分解酵素のアッセイ方法が開示される。また、そのようなアッセイ、特にアグレカナーゼ、並びにメタロプロテイナーゼ−１、−３及び−１３活性のアッセイに使用するための特定のアミノ酸配列を含む固定化基質も開示される。

Description

【発明の詳細な説明】 蛍光消光基質を用いたタンパク質分解酵素のアッセイ方法 本発明は、蛍光標識及び蛍光消光剤を有する基質の使用を含んでなるタンパク 質分解酵素のアッセイ方法に関する。 酵素により特異的に切断され、そしてその切断部位の片側に発蛍光団、もう片 側に蛍光消光剤を担持するペプチドを用いるタンパク質分解酵素の蛍光アッセイ は、当該技術分野で知られている。例えば、ＥＰ−Ａ−第４２８０００号は、ウ イルスのタンパク質分解酵素の検出のための蛍光消光基質を開示しており、これ らの基質は、ウイルスのプロテアーゼにより特異的に切断することができ、５− （２−アミノエチルアミノ）ナフタレン−１−スルホン酸（Ｅｄａｎｓ）のよう な蛍光供与体及び４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸（Ｄａｂｃ ｙｌ）のような消光剤を結合したペプチド配列からなる。特定のタンパク質分解 酵素と接触すると、このペプチドは切断され、蛍光供与体は消光受容体から離さ れ、その結果、照射により、特定の酵素活性の尺度である検出可能な蛍光が生じ る。レトロウイルスのプロテアーゼの検出のための同様な系が、ＥＰ−Ａ−第４ ３５８４５号に開示されている。マトリックスメタロプロテイナーゼ−３（ＭＭ Ｐ−３）により選択的に加水分解することができ、そして発蛍光団及び消光剤と してそれぞれ置換されたクマリン及び２，４−ジニトロフェニルを結合した蛍光 源基質が、Ｎａｇａｓｅ等、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９、２０９５２−２ ０９５７（１９９４）により記述されている。Ｅｄａｎｓ／Ｄａｂｃｙｌ系を用 いたそのような内部的に消光された蛍光源プロテアーゼ基質の一般的な調製方法 は、Ｍａｇｇｉｏｒａ等、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．３５、３７２７ −３７３０（１９９２）により記述されている。 これらの既知の基質及び方法により、タンパク質分解酵素を適当な精度でアッ セイすることができるけれども、蛍光源プロテイナーゼ基質を用いる既知の基質 及び方法は、精製された系で適用されており、複雑な生物学的媒質（例えば、細 胞培養培地、滑液及び他の組織間液）ではほとんど適用されていない。これらの 基質及び方法は、精製された系より複雑な溶液の蛍光または光吸収成分による妨 害を受けると思われている。本発明により、固定化蛍光消光基質を用いた、タン パク質分解酵素を定量的にアッセイするための方法が提供される。 例えばマイクロタイタープレート上の、固定化蛍光消光基質を用いると、タン パク質分解切断後に蛍光フラグメントは、不溶性担体に結合したまま残る。従っ て、反応混合物（例えば血液）の妨害成分を容易に洗浄して除くことができ、実 際の測定に使用するためのきれいな溶液が得られる。その結果、タンパク質分解 酵素活性のより高感度で、信頼性の高い評価が得られる。 タンパク質分解酵素の小さいペプチド基質は、α２−マクログ・ロブリン（α ２ＭＧ）により阻害されるマトリックスメタロプロテイナーゼでの場合のように 、プロテイナーゼとインヒビターの高分子量複合体によりなお加水分解される可 能性があるという難点がある。ＭＭＰ−α２ＭＧ複合体は、プロテオグリカン、 血漿タンパク質及びコラーゲンタンパク質のような高分子量の生理学的基質を加 水分解することはできないので、可溶性のペプチド基質は、実際のタンパク質分 解活性を高く見積もりすぎる。固定化蛍光消光プロテイナーゼ基質は、この不都 合な点に束縛されず、すなわち、固定化の結果、これらはＭＭＰ−α２ＭＧ複合 体 によりそれ以上転化されない。この場合及び以下に述べる全ての場合において、 「固定化」は、不溶性担体に限定されない。また、アルブミンのような可溶性担 体及びあらゆる方法により得られる高分子も適用できる。これに関連して、高分 子は、５ｋＤａより大きい、特に１０ｋＤａより大きい分子量を有すると理解さ れる。 固定化方法の別の特徴は、アッセイを実施する前に担体（マイクロタイタープ レート、紙または他のストリップ）を乾燥できることである。これは、試験者の 最小限の作業を必要とする再現性のある簡便なアッセイキットを開発することが できるという利点を与える。より重要なことは、「乾燥形態のアッセイ」は、試 料を希釈せずにタンパク質分解活性を評価することができ、すなわち、試料を担 体に直接添加することができる。従って、可逆的合成インヒビターを含有するタ ンパク質分解酵素を含む生物学的試料の希釈が避けられる。そのような試料の希 釈は、タンパク質分解酵素とインヒビターの平衡を乱し、その結果、間違った結 果のデータが得られると思われるので、これは利点である。 蛍光消光基質の固定化は、プロテイナーゼの酵素活性を評価するさらなる新規 な可能性を提供する。 １）アクリレートゲルに固定化される場合、ザイモグラフィー型のアッセイ（Ｈ ａｎｅｍａａｉｊｅｒ等、Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．（１９９３）２９６、８０３− ８０９を参照）を実施することができ、すなわち、まず、タンパク質分解酵素及 びそれらのプロ型を分子量に基づき分離する。ドデシル硫酸ナトリウムのような 電気泳動成分を洗浄して除いた後、プロテイナーゼ及びプロ型は再生し、活性に なる。固定化蛍光消光基質を用いて、蛍光の増加が見られる。通常のザイモグラ フィーに対する利点 は、ペプチドがより一般的な基質であること（例えば、含まれる基質のゼラチン 、カゼイン等によりアッセイが１種の（群の）酵素に対して多かれ少なかれ特異 的になる通常のザイモグラフィーと比べて、１枚のゲル内でいくつかのＭＭＰ及 びプロ型を検出することができる）；適切なペプチド配列を選択することにより 、特定のプロテイナーゼに対する選択性を得ることができることである。合成ペ プチドは、それら自体、生理学的基質よりはるかに大きい範囲の基質を用いるこ とを可能にし、すなわち、限られた供給源の例えばコラーゲンが利用できる。さ らに、固定化蛍光消光基質は、（「終点の」通常のザイモグラフィ一法と異なり ）蛍光の連続測定を可能にする。従って、後期及び初期の時点でそれぞれ蛍光を 測定することにより、過剰量の他のプロテイナーゼの存在下で低いレベルのプロ テイナーゼを検出することができる。蛍光は高感度で測定することができるので 、蛍光消光ザイモグラフィーは、非常に感度の高い技術である。さらに、これは 定量的な方法であり、そして通常のザイモグラフィーでの場合のように、シグナ ルの減少よりむしろシグナルの増加により測定する。 ２）固定化蛍光消光ペプチドを細胞培養系に適用することができ、すなち、蛍光 消光ペプチドで被覆した培養プレート上の生育細胞は、培養細胞によるタンパク 質分解酵素の生産の評価を可能にする。また、細胞移動を調べるために、これら のペプチドを物理的（非共有結合的）に結合することもできる。 ３）蛍光消光基質と組織を接触させることにより、蛍光消光ペプチドを組織切片 に適用することができ、すなわち、蛍光顕微鏡により、細胞レベルでタンパク質 分解酵素活性を測定をすることができる。この応用は、 蛍光生成物の拡散を減少するために、好ましくはポリビニルアルコールまたはア ガロースのような粘性媒質中に、溶解した基質を用いて実施することができる。 最も理想的には、この基質は、組織学的担体を被覆するために用いられる高分子 に共有結合的に結合されるか、または担体に直接共有結合的に結合される。 プロテイナーゼは、細胞外マトリックスの各種成分の酵素消化を通して、生理 学的及び病理学的過程中の組織再編に関与することが知られている。活性タンパ ク質分解酵素の変異体は、例えば、アテローム動脈硬化症、軟骨及び骨のターン オーバー（ｔｕｒｎｏｖｅｒ）、並びに創傷治癒において、細胞外マトリックス の局所的蓄積または再吸収を調節する可能性がある。免疫組織学によるタンパク 質分解酵素の検出により、プロテイナーゼの局所的な量を評価することができる 。しかしながら、利用できる抗体は、酵素のプロ型、活性型及び阻害型の間を識 別しない。既知の免疫学的検出技術を用いるよりむしろタンパク質分解酵素の局 所的酵素活性を評価する方法論がある方がより適切である。そのような活性アッ セイが、最近、インサイチューザイモグラフィーを用いてＧａｌｉｓ等（ＦＡＳ ＥＢ Ｊ．、９（１９９５）９７４−９８０）により記述されている。ＳＤＳ− ＰＡＧＥ形態のザイモグラフィーのように、これは、「終点」アッセイである。 固定化蛍光消光基質は、活性プロテイナーゼの顕微鏡位置測定に用いるためにま さに好適であり、これは、そのような使用が、（１）局所的測定を可能にし、（ ２）時間的測定を可能にし、（３）定量的方法であり、（４）シグナルの減少よ りむしろシグナルの増加を測定し、（５）（組織切片が与えている）蛍光を連続 的に測定しながら、組織切片を除くことを可能にし、（６）実施するのが 比較的容易であり、（７）実質的にあらゆるバッファーで適用できるからである 。項目２、４、５、６及び７に関して、固定化蛍光消光基質は、Ｇａｌｉｓ等に より記述されたインサイチューザイモグラフィ一形態より優れている。 本発明の方法は、 （ａ）酵素を含有する試料を式 Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒ または Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ 上記式中、 Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特異的切断部位を含むペプチド鎖であり、 Ｆｌｕは、発蛍光団であり、 Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であ り、これは、Ｆｌｕと同じ基であってもよく、 Ｓｐａは、直接結合またはスペーサ一鎖であり、そして Ｃａｒは、不溶性及び／または高分子の担体である、 で示される固定化蛍光源ペプチドとインキュベートし、 （ｂ）場合によっては、担体物質から液体を分離し、 （ｃ）該担体物質に照射し、蛍光を測定する ことを含んでなる。 上に定義される記号Ｆｌｕ、Ｓｕｂ、Ｑｕｅ、Ｓｐａ及びＣａｒ以外に、以下 の略語が本明細書で用いられる。 Ａａｄ α−アミノアジピン酸 Ａｂｕ α−アミノ酪酸 Ｃｈａ β−シクロヘキシルアラニン Ｄａｂｃｙｌ ４−（４−ジメチルアミノフェニルアゾ）安息香酸 ＤＭＦ ジメチルホルムアミド ＤＭＳＯ ジメチルスルホキシド ＤＮＰ ジニトロフェニル Ｅｓｃａ ε−アミノカプロン酸 Ｅｄａｎｓ ５−（２−アミノエチルアミノ）ナフタレン−１−スル ホン酸 ＥＤＴＡ エチレンジアミン四酢酸 ＥＧＳ エチレングリコールービス（スクシンイミジルスクシネ ート） Ｅｍｃ Ｓ−メルカプトエチルシステイン Ｆｍｏｃ ９−フルオレニルメトキシカルボニル Ｇａｂａ γ−アミノ酪酸 ＨＰＬＣ 高速液体クロマトグラフィー Ｈｓｅ ホモセリン（α−アミノ−γ−ヒドロキシ酪酸） Ｈｙｐ ４−ヒドロキシプロリン Ｍｃａ ７−メトキシクマリン−４−酢酸 Ｍｃｃ ７−メトキシクマリン−３−カルボン酸 ＭＭＰ マトリックスメタロプロテイナーゼ Ｎｍａ Ｎ−メチルアントラニル酸 ＮＭＭ Ｎ−メチルモルホリン ＮＭＰ Ｎ−メチルピロリドン Ｎｌｅ ノルロイシン（α−アミノカプロン酸） Ｎｖａ ノルバリン（α−アミノ吉草酸） Ｏｒｎ オルニチン（α，δ−ジアミノ吉草酸） ＰＡ プラスミノーゲンアクチベーター ＰＡＧＥ ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ＰＢＳ リン酸緩衝食塩水 ＳＤＳ ドデシル硫酸ナトリウム Ｓｅｃ Ｓ−エチルシステイン（α−アミノ−β−エチルチオ− プロピオン酸） Ｓｍｃ Ｓ−メチルシステイン（α−アミノ−β−メチルチオ− プロピオン酸） ＴＦＡ トリフルオロ酢酸 Ｔｒｉｓ トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン 本発明の方法において、ペプチド鎖Ｓｕｂは、アッセイ下の特定のタンパク質 分解酵素活性に従って選択される。現在知られているタンパク質分解酵素は、セ リンプロテアーゼ（ＥＣ番号 ３．４．２１）、システインプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２２）、アスパルティックプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２３）及びメ タロプロテアーゼ（ＥＣ ３．４．２４）に分けることができる。例えば、マト リックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）では、切断部位はＧｌｙ−Ｌｅｕであ り、そしてＭＭＰ酵素により認識されるアミノ酸配列は、Ｐｒｏ−Ｘａｘ−Ｇｌ ｙ−Ｌｅｕ、特にＰｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ−ＬｅｕまたはＰｒｏ−Ｌｅｕ−Ｇｌ ｙ−Ｌｅｕであってもよく、上記式中、Ｘａｘはあらゆるアミノ酸である。別の 例として、プラスミンは、リシンのカルボキシル官能基で特異 的に切断し、そして特定配列は、例えば、Ｉｌｅ−Ｐｈｅ−Ｌｙｓ−Ｘａｙであ ってもよい。これら及び他の特定のプロテアーゼ基質配列は、当該技術分野で知 られている。臨床的に重要なプロテアーゼは、以下のもの、すなわち、第VIIａ 因子、第IXａ因子、第Ｘａ因子、ＡＰＣ、トロンビン、ｔ−ＰＡ、ｕ−ＰＡ、プ ラスミン、トリプシン、キモトリプシン、エンテロキナーゼ、ペプシン、カテプ シン、アンジオテンシン変換酵素、マトリックスメタロプロテイナーゼ（コラゲ ナーゼ、ストロメリシン（ｓｔｒｏｍｅｌｙｓｉｎｓ）、ゼラチナーゼ）、エラ スターゼ、Ｃｉｒ及びＣｉｓを含んでなる。 関連した基質特異性を有するいくつかのプロテアーゼは、以下の通りである。 カテプシンＣ：ポリペプチドからのＮ末端ジペプチドの連続的除去を触媒するシ ステインプロテアーゼ。この反応速度は、最後から２番目（ｐｅｎｕｌｔｉｍａ ｔｅ）のアミノ酸により決定され、親水性及び疎水性残基が適切とみなされる。 Ｎ末端のＬｙｓまたはＡｒｇにより、分解は阻止される。第二または第三のアミ ノ酸がＰｒｏの場合も切断が妨げられる。 キモトリプシン：Ｔｙｒ、Ｐｈｅ及びＴｒｐのＣ末端でペプチド結合を特異的に 加水分解するセリンエンドペプチダーゼ。Ｌｅｕ、Ａｌａ、Ａｓｐ及びＧ１ｕは 、より低い速度で切断される。作用を受けやすいアミノ酸のアミド及びエステル にも作用する。 エラスターゼ：Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｇｌｙ及びＳｅｒのような電荷を持た ない非芳香族側鎖を有するアミノ酸のＣ末端側でペプチド結合を加水分解するセ リンエンドペプチダーゼ。 第Ｘａ因子：配列−Ｉｌｅ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ−Ｘａｚ（Ｘａｚはあらゆ るアミノ酸である）内のＡｒｇのカルボキシル側でペプチド結合を特異的に加水 分解するセリンエンドペプチダーゼ。 カリクレイン：特にＰｈｅ−（またはＬｅｕ−）−Ａｒｇ−Ｘａｚ結合で、Ａｒ ｇのカルボキシル側でペプチド及びエステル結合を選択的に加水分解するセリン エンドペプチダーゼ。 ペプシン：広い特異性を有するアスパルティックエンドペプチダーゼ。 別の疎水性残基に結合しているＰｈｅ、Ｍｅｔ、ＬｅｕまたはＴｒｐのカルボキ シル側で選択的に結合を切断する。Ｔｙｒ−Ｘａｚ結合は、比較的耐性である。 プラスミン：ＬｙｓまたはＡｒｇのカルボキシル側でペプチド及びエステル結合 を加水分解するセリンエンドペプチダーゼ。 スブチリシン：大部分のペプチド結合、特にＡｓｐ、Ｇｌｕ、Ａｌａ、Ｇ１ｙ及 びＶａｌに隣接するものを切断する非特異的セリンエンドペプチダーゼ。 サーモリシン：Ｉｌｅ、Ｌｅｕ、Ｍｅｔ、Ｐｈｅ、Ｔｒｐ及びＶａｌのような大 きい側鎖を有する疎水性アミノ酸のアミノ基を含むペプチド結合を加水分解する 非特異的Ｚｎ−メタロペプチダーゼ。疎水性アミノ酸のＣ末端にＰｒｏが存在す る場合、前者のＮ末端での切断を妨げる。 トロンビン：塩基性アミノ酸のＡｒｇ及びＬｙｓのカルボキシル側でタンパク質 及びペプチドを特異的に加水分解するセリンエンドペプチダーゼ。Ａｒｇ及びＬ ｙｓのアミド及びエステル結合も同様に切断される。 トリプシン：塩基性アミノ酸のＡｒｇ及びＬｙｓのカルボキシル側でタンパク質 及びペプチドを特異的に加水分解するセリンエンドペプチダー ゼ。Ａｒｇ及びＬｙｓのアミド及びエステル結合も切断される。 本方法は、例えば、アグレカナーゼ（ａｇｇｒｅｃａｎａｓｅ）活性をアッセ イするために適している。そのようなアッセイで用いることができる（以下に▲ で示される）既知のアグレカナーゼ切断部位は、以下のもの、 を含む。 これらの配列は、それぞれ配列番号１−９を有する。 これらの配列で、下線を引いた部分は、場合によっては保存突然変異、例えば 、Ｇｌｙの代わりにＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ；Ｌｅｕの代 わりにＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、ＩｌｅまたはＮｌｅ；Ａｌａの代わり にＧｌｙ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＩｌｅまたはＮｌｅ；Ｇｌｕもし くはＧｌｎの代わりにＧｌｎ／Ｇｌｕ、Ａｓｎ／ＡｓｐまたはＡａｄ；Ａｒｇの 代わりにＬｙＳ、Ｏｒｎ、ＨｉｓまたはＴｒｐを含んで、存在しなければならな い。好ましくは下線を 引いた部分のどちらか一方の側にもう１個のアミノ酸、特にどちらか一方の側に もう２個、そして場合によってはもう３個のアミノ酸が、同様に場合によっては 保存突然変異を含んで、存在する。配列ＳｕｂまたはＣａｒまたはＳｐａのいず れかで関係するアグレカンに相当する例えば５０−１５０アミノ酸のさらなる部 分配列を基質中に含むことは、しばしば有益である。アグレカンでは、そのよう なさらなる配列は、切断部位に関してＣ末端領域に由来する。例としては、配列 番号１０に示されるヒトアグレカン配列３８２−４７７であり、１個以上の突然 変異を含んでもよい。 本方法は、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼによるアグレカンの分 解をアッセイするためにも適している。（そのようなアッセイに用いることがで きる（以下に▲で示される）既知のＭＭＰ切断部位は、配列：³³⁴ Ａｓｐ−Ｐｈｅ−Ｖａｌ−Ａｓｐ−Ｉｌｅ−Ｐｒｏ−Ａｓｎ▲Ｐｈｅ−Ｐｈ ｅ −Ｇｌｙ−Ｖａｌ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−³⁴⁸Ｇｌｕ（配列番号１１）（ヒトアグ レカン、ＭＭＰ−１、−２、−３、−７、−８、−９及び−１３による切断）を 含む。この基質配列中で、下線を引いた部分は存在しなければならず、（例えば 、Ｈｙｐによる）³³⁹Ｐｒｏ及び（例えば、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＣｈａによる ）³⁴²Ｐｈｅの保存交換は許される。好ましくは、下線を引いた部分のどちらか 一方の側にもう１個のアミノ酸、特にどちらか一方の側にもう２個、そして場合 によってはもう３個のアミノ酸が存在する。ここでもまた、切断部位のＮ末端側 及びＣ末端側の両方に由来することができる、関係するアグレカンに相当する例 えば５０−１５０アミノ酸のさらなる部分配列を含むことは、有 益である可能性がある。 本方法は、例えば、マトリックスメタロプロテイナーゼ活性をアッセイするた めにも適している。例えばＭＭＰ−１３のアッセイに特に用いることができる切 断部位は、配列Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含み、ここで、Ａｌａ及びＧ ｌｙは、別の脂肪族アミノ酸で置換されていてもよく、そしてＳｅｒは、別のヒ ドロキシ−脂肪族または脂肪族アミノ酸で置換されていてもよい。従って、ＭＭ Ｐ−１３の選択的基質は、例えば、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ− Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｙ−Ａｌａ−Ａｒｇ▲Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎ ｓ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１２）であってもよい。ＭＭＰ−１３ のアッセイに特に用いることができる別の切断部位は、配列Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｌ ｅｕ−Ｇｌｕを含み、ここで、Ａｒｇは、別の正に荷電したアミノ酸または類似 体で置換されていてもよく、そしてＧｌｙ及び／またはＬｅｕは、別の脂肪族ア ミノ酸で置換されていてもよい。従って、ＭＭＰ−１３の選択的基質は、例えば 、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ▲Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａ ｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂であってもよい。 同様に、ストロメリシン（ＭＭＰ−３）の選択的蛍光消光基質として、Ｄａｂ ｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ａｒｇ−Ｐｒｏ−Ｌｙｓ−Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ▲Ｎｖａ −Ｔｒｐ−Ａｒｇ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号 １３）を用いることができ、このアミノ酸配列は、Ｎａｇａｓｅ等（Ｎａｇａｓ ｅ Ｈ、Ｆｉｅｌｄｓ ＣＧ、Ｆｉｅｌｄｓ ＧＢ、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２６９（１９９４）２０９５２−２０９５７）によりＭＭＰ−３に非常に選択的 であることが見いだ された。配列（Ｐｒｏ）−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−（Ａｒｇ）は、可 能な保存的変異を含んで、存在しなければならない。 また、間質コラゲナーゼ（ＭＭＰ−１）の酵素活性をアッセイするための選択 的基質として、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ▲Ｓｍｃ−Ｈ ｉｓ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１４ ）を用いることができ、アミノ酸配列、Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓは、Ｍ ｃＧｒｅｅｈａｎ等（ＭｃＧｒｅｅｈａｎ ＧＭ、Ｂｉｃｋｅｔｔ ＤＭ、Ｇｒ ｅｎｎ Ｍ、Ｋａｓｓｅｌ Ｄ、Ｗｉｓｅｍａｎ ＪＳ、Ｂｅｒｍａｎ Ｊ．、 Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６９（１９９４）３２８１４−３２８２０）により 天然の配列Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ−Ｔｒｐより優れた基質であることが見いだ された。Ｃｈａの代わりにＬｅｕ；Ａｂｕの代わりにＧｌｙまたはＡｌａ；Ｓｍ ｃの代わりにＬｅｕ、ＳｅｃまたはＥｍｃ：そしてＨｉｓの代わりにＴｒｐのよ うなその変異体も有用である。 発蛍光団（Ｆｌｕ）は、置換メルカプト酸のような、ペプチド配列に結合する ことができる置換アミノ酸または別の置換基であることができ、このアミノ酸の 側鎖または他の基が蛍光部分を保有する。置換アミノ酸は、蛍光部分がアミノ基 で結合されるリシン、オルニチンもしくは他のα，ω−ジアミノ酸、または蛍光 部分が末端のカルボキシル官能基により結合されるＧｌｕ、ＡｓｐもしくはＡａ ｄ、または蛍光部分をチオール官能基を介して結合するシステインもしくは他の チオール含有アミノ酸であってもよい。 ペプチド鎖の側鎖で結合する代わりに、発蛍光団は、２つのアミノ酸の間に結 合していてもよく、従って、ペプチド鎖中に位置してもよい。 この態様において、発蛍光団は、片方の末端に例えば、アミノ、メルカプトまた はヒドロキシ官能基を、そしてもう片方の末端にカルボキシ官能基を含むことが できる。 基質中に用いられる発蛍光団は、当該技術分野で知られている。好適な発蛍光 団は、上記のＥｄａｎｓ及び他のアミノナフタレンスルホン酸、クマリン、７− メトキシクマリン−４−酢酸（Ｍｃａ）または７−メトキシクマリン−３−カル ボン酸（Ｍｃｃ）のような置換されたクマリン、トリプトファン、Ｎ−メチルア ントラニル酸（Ｎｍａ）を含んでなる。発蛍光団は、例えば２５０と４００ｎｍ の間の励起波長及び例えば３７０と５５０ｎｍの間の発光波長を有することがで きる。 消光剤（Ｑｕｅ）を特定の基質配列に、例えば、そのカルボキシル官能基を使 って、場合によってはω−アミノ−アルカン酸、特にγ−アミノ酪酸（Ｇａｂａ ）、ε−アミノカプロン酸（Ｅａｃａ）、オルニチンまたはリシンのような１個 以上のスペーサーアミノ酸を介して結合することができる。消光剤が発蛍光団と 担体の間に配置される場合（式Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ）、Ｆ ｌｕに関して上に記述したように、アミノ酸の側鎖または２個のアミノ酸の間に これを結合することができる。 基質中に用いられる消光剤は、当該技術分野で知られている。好適な消光剤 は、上記のＤａｂｃｙｌ及び他のアミノフェニルアゾベンゾイル誘導体並びにジ ニトロフェニル（ＤＮＰ）及び誘導体を含む。好ましくは、消光剤は、発蛍光団 の発光波長に相当する吸収波長を有する。それ故、消光剤と発蛍光団は、一致す る。発蛍光団と消光剤の好適な組み合わせの例は、Ｅｄａｎｓ／Ｄａｂｃｙｌ、 クマリン／ＤＮＰ、トリプ トファン／ＤＮＰ及びＮｍａ／ＤＮＰである。蛍光の消光は、２つの同一な発蛍 光団間でも起こることができるので、Ｑｕｅ＝Ｆｌｕの場合にも効率のよい消光 を得ることができる。発蛍光団及び消光剤は、これら２つの間の分子内エネルギ ー移動が可能であるような距離で配置されなければならない。発蛍光団と消光剤 の間のアミノ酸鎖が４−１０アミノ酸、特に５−８アミノ酸を含んでなる場合、 または発蛍光団と消光剤の間の間隔がそのような鎖の距離に相当する場合、通常 、この要求は満たされる。 スペーサー鎖Ｓｐａは、直接結合、１個以上の原子の鎖、または基質ペプチド と不溶性担体の間に十分な距離を与えるぺプチドもしくは他の鎖であってもよい 。スペーサー鎖は、例えば、Ｅｓｃａのような１個以上のω−アミノ酸を含んで なることができる。スペーサー鎖は、その末端に、不溶性担体に共有結合または 他の（例えば、ビオチン／アビジン）カップリングをすることができる基を含む 。担体とのカップリングは、アミノ、チオールまたはカルボキシル官能基とカッ プリングするホモ（ｈｏｍｏ−）または二官能基架橋剤により樹立することがで きる。好適な架橋またはカップリング剤は、グルタルジアルデヒド及び市販され ているアミノ−、スルホ−またはカルボ−結合試薬を含む。また、ポリアクリレ ートマトリックスに混合することができるアクリレート誘導体によりカップリン グを実施することもできる。 スペーサー及び担体は、好ましくは、基質鎖にそのカルボキシル末端で結合さ れる。スペーサー鎖の末端のカップリング基がスペーサー鎖のアミノ末端に結合 することが必要な場合、例えば、リシンまたは他のα，ω−ジアミノ酸の導入に より、アミノ酸鎖の「極性」を逆にするこ とができる。例えば、好適なスペーサー鎖はリシン残基からなり、そのω−アミ ノの位置でこれにＥａｃａ残基が結合し、次にそれにアクリロイル基が結合する 。 不溶性及び／または高分子の担体Ｃａｒは、生化学アッセイに用いられるあら ゆる通常の固形担体を含んでなることができる。これらは、例えば被覆後の、マ イクロタイタープレート、紙片、合成ポリマーストリップ、ビーズ、樹脂、アク リレートマトリックス（例えば、ゲル）、ガラス、及びタンパク質を含む。 また、不溶性及び／または高分子の担体Ｃａｒは、天然の酵素基質のモデルと して基質を用いるために、高分子の、分散したまたは可溶性の構造を含んでなる こともできる。これは、インヒビター等により決定される酵素活性を測定する場 合に特に有用であり、すなわち、高分子の担体を有さない比較的小さい合成基質 は、阻害複合体の存在にかかわらず切断され、従って、「天然の］高分子基質に 利用できない活性を測定する可能性がある。 上記の配列Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒは、上記,のような高分 子の、分散したまたは可溶性の基質として用いられる場合を除いて、しばしば、 配列Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒより好ましい。 典型的な配列において、複数の基Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−が単一の 担体に結合され、式（Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ）_n−Ｃａｒを生じる。 高密度の発蛍光団が存在する例外的な場合（例えば、ｎ≧２０、例えば５０と１ ００の間の場合）には、Ｑｕｅ基なしに効率のよい消光を得ることができる。 本発明の方法は、各種態様における酵素アッセイ、すなわち、１）ザイモグラ フィー形態の酵素活性の測定（アクリレートゲル中／上に固定された基質）；２ ）希釈されない生物学的試料をアッセイすること、及び生物学的マトリックスの 妨害成分を容易に洗浄して除くことを可能にする、マイクロタイタープレート中 及び他の固形担体上または中の酵素測定；３）組織切片のタンパク質分解酵素活 性の評価（組織学）；４）天然の高分子基質に似た溶液または分散液中の酵素測 定を可能にする。 本発明の方法を用いてアッセイされるタンパク質分解酵素は、セリンプロティ ナーゼ、システインプロテイナーゼ、アルパルティックプロテイナーゼ及びメタ ロプロテイナーゼを初めとする全てのプロテアーゼを含んでなる。本方法は、エ ンドプロテイナーゼで特に有用である。本発明の方法でアッセイされるプロテイ ナーゼの好ましい種類は、コラゲナーゼ、ゼラチナーゼ及びストロメリシンを初 めとするマトリックスメタロプロテイナーゼ（ＭＭＰ）を含んでなる。ＭＭＰは 、それぞれ、細胞移動、軟骨の分解及び基底膜の分解、並びに転移により、創傷 治癒、慢性関節リウマチ及び変形性関節症、腫瘍の侵潤及び血管形成において役 割を果たしており、従って、これらの酵素の活性は、これらの疾患の重要な指標 である。本発明の方法の重要な利点は、基質がザイモグラフィー形態でアクリル アミドゲル上または中に固定される場合、活性のある酵素（ＭＭＰ）だけでなく 、プロ酵素も検出できることである。 調べているプロテイナーゼのアッセイの前に、例えば、特異的抗体もしくは他 の選択的結合剤を用いて他のタンパク質分解酵素を選択的に除去することにより 、（抗体もしくは他の選択的結合技術を用いて）調べているプロテイナーゼを選 択的に結合し、続いて結合しない酵素を分離 することにより、または他のタンパク質分解酵素の選択的インヒビターを添加す ることにより、または調べているプロテイナーゼの選択的インヒビターを添加す ることにより、本発明の方法をさらに改善することができ、この後者の場合、測 定される全活性から阻害後に測定される活性を引くことにより最終結果が得られ る。全てのそのようなアッセイは、試料の前処理なしに、またはプロ酵素の活性 化を初めとするあらゆる形態の生物学的試料の前処理をして、酵素活性を測定す ることを含む。 実施例 実施例１：蛍光源ペプチドの合成 Ｆｍｏｃ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−ＯＨの合成 １０ｍｌ ＤＭＦ中のＦｍｏｃ−Ｇ１ｕ（ＯＨ）−Ｏ−ｔｅｒｔ−ブチル（１ ．７ｇ、４ｍｍｏｌ）、Ｅｄａｎｓ（１．０７ｇ、４ｍｍｏｌ）及びベンゾトリ アゾール−１−イルオキシートリス（ジメチルアミノ）−ホスホニウムヘキサフ ルオロリン酸塩（１．７７ｇ、４ｍｍｏｌ）の撹拌溶液に、室温でジ−イソプロ ピルエチルアミン（２ｍｌ、１２ｍｍｏｌ、ＣａＨ₂から蒸留した）を添加した 。２時間後に反応が完了した（トルエン／酢酸、９／１、ｖ／ｖを用いたシリカ 薄層クロマトグラフィー）。この反応混合物に、５０ｍｌのＣＨ₂Ｃｌ₂及び５０ ｍｌの０．５Ｍ ＫＨＳＯ₄を添加した。有機層を０．１Ｍ ＫＨＳＯ₄及びＨ₂Ｏ で洗浄し、ＭｇＳＯ₄で乾燥し、真空中で留去すると、２．８ｇの油状物を生じ た。ｔｅｒｔ−ブチル基を除去するために、１０ｍｌの氷酢酸及び１ｍｌの１２ ＮＨＣｌを添加した。１時間撹拌した後、溶媒を真空中で留去した。ＤＭＦ（２ ｘ １０ｍｌ）と共に留去する（ｃｏ−ｅｖａ ｐｏｒａｔｉｏｎ）ことにより微量の酢酸を除いた。この生成物を逆相ＨＰＬＣ （ＲＰ−ＨＰＬＣ）により４５％の収率で精製した（Ｈ₂Ｏ中０．１％のＴＦＡ 中のアセトニトリル勾配を用いたＣ１８カラム）。蛍光消光Ｄａｂｃｙｌ／Ｅｄａｎｓペプチドの合成 テンタゲル（ｔｅｎｔａｇｅｌ）Ｓ ＡＣを用いて自動化多重（ｍｕｌｔｉｐ ｌｅ）合成機で固相化学により１０μｍｏｌの規模で基質を合成した（処理量０ ．２μｅｑ、粒度９０μｍ）。ＮＭＰ中の０．６７ＭＰｙＢＯＰ（ベンゾトリア ゾール−１−イル−オキシ−トリス−ピロリジノ−ホスホニウムヘキサフルオロ リン酸塩）９０μｌ、ＮＭＰ中のＮＭＭ（Ｎ−メチルモルホリン）（２／１、ｖ ／ｖ）２０μｌ及びＮＭＰ中の適当なＦｍｏｃ−アミノ酸の０．６Ｍ溶液１００ μｌの混合物を添加することにより、繰り返しカップリングを実施した。Ｆｍｏ ｃ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−ＯＨのカップリングを１０倍過剰で３時間実施した 。２５０μｌのＮＭＰ中１０等量のｐ−（ｐ−ジメチルアミノ−フェニルアゾ） 安息香酸、１０等量のＰｙＢＯＰ及び２０等量のＮＭＭの懸濁液を用いて、Ｄａ ｂｃｙｌ部分を３時間結合させた。２００μｌのＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ（１９／１、ｖ ／ｖ）を反応容器に添加することにより（５分間隔で６回）、樹脂からの切断及 び保護基の除去を実施した。最初のＴＦＡ／Ｈ₂Ｏの添加の３時間後に、１０ｍ ｌのエーテル／ペンタン（１／１、ｖ／ｖ）を添加し、−２０℃に冷却すること により、合わせた濾過液からペプチドを沈殿させ、その後、遠心分離（−２０℃ 、２，５００ｇ、１０分）によりペプチドを単離した。続いて、ＳｕｐｅｒＰａ ｃ Ｐｅｐ−Ｓ１５μｍ９．３ ｘ ２５０ｍｍカラムを用いたＲＰ−ＨＰＬＣに よりペプチドを精製した。ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏ中０．１％ のＴＦＡ中のアセトニトリル勾配）により、そしてＴＯＦ−ＭＡＬＤＩ質量分析 法により、ペプチドの純度及び同一性を定めた。 このようにして、約１００アミノ酸の担体タンパク質に結合される、アグレカ ナーゼの蛍光消光基質として蛍光消光Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｉｌｅ−Ｔｈｒ −Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ▲Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（Ｅｄａ ｎｓ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１５）を、そしてＭＭＰの基質とし てＤａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲Ｒ（Ｒの例：−Ｌｅｕ− Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１ ６）；−Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ｇｌｙ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配 列番号１７）；−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配 列番号１８）；−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ｇｌｙ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配 列番号１９）；−Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ｇｌｙ−ＮＨ₂（末端のＬｙ ｓを含まない配列番号１９）；▲、切断部位）を合成した。さらに、ＭＭＰ−１ ３の選択的基質としてＲ＝Ａｌａ−Ａｒｇ▲−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｇｌｕ（Ｅｄａ ｎｓ）−Ｉｌｅ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号２０）を調製した。さらに、ＭＭＰ −１３の選択的基質としてＤａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ▲ Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号２１）を合 成した。この後者の配列で、Ｌｅｕは、置換または欠失さえしていてもよい。 実施例２：蛍光消光ペプチドのシリカビーズ上への固定化 １．０ｍｌの蛍光消光ペプチド溶液（Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌ ｎ−Ｇｌｙ▲Ｒ；リン酸緩衝食塩水中２５μＭ、Ｒは固定化の ために用いるリシン残基を含む）に、１０ｍｇのアミノプロピルシリカビーズ（ ４０μｍの直径、グラム当たり１．４ｍｍｏｌのアミノ基）を添加した。室温で １５分の混合後、２０μｌのＥＧＳ溶液（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）を添加した。反 応を測定するために、上清のＡ４７０（Ｄａｂｃｙｌの吸収極大）の減少を用い た。Ａ４７０の減少が止まるまで、カップリングを続けた。遠心分離及び上清の 除去後、ビーズをＰＢＳ（１．５ｍｌ）、０．１％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢ Ｓ（１．５ｍｌ）、１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５；１．２ｍｌ）及びイ ンキュベーションバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ ７．６；１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１μＭ ＺｎＣｌ₂、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５；１ ．０ｍｌ）で連続して洗浄した。 ペプチドをつけたシリカビーズを活性化ゼラチナーゼの混合物（ＭＭＰ−２及 びＭＭＰ−９）とインキュベーションすると、ＲＰ−ＨＰＬＣ（Ｈ₂Ｏ中０．１ ％のＴＦＡ中のアセトニトリル勾配を用いたＣ１８カラム）により確認されるよ うに、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙフラグメントがビーズ から上清中に効率よく遊離された。 実施例３：蛍光消光ペプチドのガラススライド上への固定化 ガラス顕微鏡スライドを２０％Ｈ₂ＳＯ₄、水（２回）、０．１Ｎ ＮａＯＨ及 び水で洗浄することにより完全にきれいにした。乾燥後、これらのガラススライ ドを３−アミノプロピルトリエトキシシラン中に室温で４分間置き、水及びＰＢ Ｓ（２回）ですすいだ。穏やかに撹拌しながら、ガラススライドを蛍光消光基質 （例えば、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲Ｌｅｕ−Ｐｈｅ −Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｅｄａ ｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１６）またはＤａｂｃｙｌ−Ｇａｂ ａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲Ｌｅｕ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ −ＮＨ₂（配列番号１８）；１．０ｍｌのＰＢＳ中２５μＭ）の溶液に浸し、続 いて、これに２０μｌのＥＧＳ（ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）を添加した。Ａ４７０の 測定により、室温で３時間以内にカップリングが完了したことが示された。ＰＢ Ｓ中のグリシン（５０ｍＭの最終濃度、１．０ｍｌ）を１時間添加することによ り、過剰のＥＧＳから生じるＮ−ヒドロキシ−スクシンイミジル基のブロッキン グを実施した。全ての工程を周囲温度で実施した。 組織切片中のＭＭＰ活性を検出するために、蛍光消光基質で被覆したガラスス ライドを以下のように用いた。すなわち、ウサギ頭蓋冠（ｃａｌｖａｒｉａｌ） 骨膜のクリオスタット切片（５μｍ）を基質で被覆したガラススライド上に置き 、インキュベーションバッファー（５０ｍＭＴｒｉｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭ Ｃ ａＣｌ₂、１μＭ ＺｎＣｌ₂、１ｍＭ ４−アミノフェニル水銀アセテート）中、 湿気の多い大気中で３７℃でインキュベートした。蛍光の発生を蛍光顕微鏡を用 いて追跡した。時間と共に、はっきり識別できる蛍光スポットとして、組織があ る場所で蛍光の増加が見られた（図１）。組織で覆われていないガラスの位置で は、蛍光を検出できなかった。ＥＤＴＡまたは合成のＭＭＰインヒビターの存在 下でインキュベートした組織切片は、かなり弱い蛍光を示した。さらに、４−ア ミノフェニル水銀アセテートで活性化されなかった組織切片の蛍光は、４−アミ ノフェニル水銀アセテートで活性化された組織切片のものより弱かった。 実施例４：ウシ血清アルブミンに結合した蛍光消光基質 上に記述したように、ＥＧＳ（最終濃度０．５ｍＭ；最終容量、２ｍｌ）によ り蛍光消光基質（例えば、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲ Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇ１ｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配 列番号１６）；最終濃度、ＰＢＳ中２５μＭ）をウシ血清アルブミン（ＢＳＡ； ＰＢＳ中２ｍｇ／ｍｌの最終濃度）に結合させた。ＭＭＰ−９とＢＳＡ−基質の インキュベーションのＲＰ−ＨＰＬＣ分析（０．１％ＴＦＡ／Ｈ₂Ｏ中のアセト ニトリルの直線勾配）により、タンパク質を結合した基質のタンパク質分解が確 認され、すなわち、タンパク質の沈殿後、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇ ｌｎ−Ｇｌｙフラグメントが上清中に検出された。 実施例５：α２−マクログロブリン複合ＭＭＰにより転化されない蛍光消光ＭＭＰ基質 トリエチルアミン（ＤＭＳＯ中１００ｍＭ、１０μｌ）の存在下で室温で３０ 分間、蛍光消光基質（例えば、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌ ｙ▲Ｌｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂ （配列番号１６）；１ｍＭ ＤＭＳＯ、２００μｌ）をＮ−スクシンイミジル− Ｓ−アセチルチオアセテート（ＤＭＳＯ中１０ｍＭ、５０μｌ）で誘導体化した 。８０ｎｍｏｌの誘導基質の脱アセチル化後（２０μｌの水に溶解し、２５ｍＭ ＥＤＴＡ及び０．５Ｍヒドロキシルアミンを含んでなる２５μｌのリン酸ナト リウムバッファー、５０ｍＭ、ｐＨ ７．５と室温で１５分間反応させた）、１ ０μｌのマレイミド活性化オボアルブミン（１０ｍｇ／ｍｌ；Ｐｉｅｒｃ ｅ）を添加した。室温で２時間後、Ｌ−システイン（１０μｌ、水中２０ｍＭ） の添加により、過剰のマレイミド−オボアルブミンを不活性化した。水及びイン キュベーションバッファー（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ、 pＨ ７．６、１５０ｍＭ Ｎ ａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１μＭ ＺｎＣｌ₂、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５）に 対して透析（１０ｋＤａカットオフ膜）した後、ＭＭＰ−１３（０．５ｎＭ）に よるオボアルブミン結合基質の転化を蛍光の増加の割合（励起、３６０ｎｍ；発 光、４９０ｎｍ；時間当たりの蛍光単位）により測定した。 過剰のα２−マクログロブリンの存在下で（５ｎＭ；ＭＭＰ−１３と２５℃で ２時間前もってインキュベートした）、α２−マクログロブリンを欠いたインキ ュベーションに比較して、オボアルブミン結合基質の５％未満が分解された。こ のことは、担体に結合した蛍光消光基質を用いたアッセイが、α２−マクログロ ブリンと複合することによるＭＭＰ活性の阻害を反映することを示す。 実施例６：蛍光消光ペプチドのポリアクリルアミド中への混合 無水ＤＭＳＯ（５ｍＭ）に溶解した７５ｎｍｏｌのＮ−（６−スクシンイミジ ルオキシ−６−オキシヘキシル）−アクリルアミドまたはＮ−（４−スクシンイ ミジルオキシ−４−オキシブチル）−６−アクリルアミド−ヘキサンアミド、及 び７５ｎｍｏｌのトリエチルアミン（無水ＤＭＳＯ中２５ｍＭ）の添加により、 蛍光消光基質（例えば、Ｄａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲Ｌ ｅｕ−Ｐｈｅ−Ａｌａ−Ｇｌｕ（Ｅｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列 番号１６）及びＤａｂｃｙｌ−Ｇａｂａ−Ｐｒｏ−Ｇｌｎ−Ｇｌｙ▲Ｌｅｕ−Ｇ ｌｕ（Ｅ ｄａｎｓ）−Ａｌａ−Ｌｙｓ−ＮＨ₂（配列番号１８）；１００μｌのＤＭＳＯ 中２５ｎｍｏｌ）をそのアクリレート誘導体に誘導する。この反応を室温で実施 し、３時間後に完了した（ＲＰ−ＨＰＬＣ）。 蛍光消光ペプチドのアクリレート誘導体をＲＰ−ＨＰＬＣ（０．１％ＴＦＡ／ Ｈ₂Ｏ中のアセトニトリル勾配）により精製した。凍結乾燥後、１２．５ｎｍｏ ｌのアクリレート誘導体を（１ゲルに対して）３ｍｌの１０％アクリルアミド／ ビスアクリルアミド溶液（７５／２、ｖ／ｖ）と混合し、続いて、標準的な方法 に従ってＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルを作った。不活性プロ型を初めとする、マトリッ クスメタロプロテイナーゼまたはその混合物を含む試料を添加し（２０μｌ）、 続いて通常のＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動（ゲル当たり８ｍＡ、４℃、４時間）を 実施した。電気泳動後、アクリルアミドゲルを洗浄バッファー（５０ｍＭＴｒｉ ｓ、ｐＨ ７．６、５ｍＭＣａＣｌ₂、１μＭ ＺｎＣｌ₂、２．５％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００）で３回３０分間、そしてインキュベーションバッファー（５０ｍ Ｍ Ｔｒｉｓ、ｐＨ ７．６、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＣａＣｌ₂、１μＭ ＺｎＣｌ₂、０．０１％Ｂｒｉｊ−３５）で２回１０分間洗浄した。インキュベ ーションバッファー中３７℃でゲルを一晩インキュベーションした後、ゲルをＵ Ｖ光（３６６ｎｍ）下に置くと、マトリックスメタロプロテイナーゼ及びそれら のプロ型に相当する分子量の蛍光バンドが見られた（図２）。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】１９９８年１月９日（１９９８．１．９） 【補正内容】 請求の範囲 １． （ａ）酵素を含有する試料を式 Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒ または Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ 上記式中、 Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特定の切断部位を含むペプチド鎖であり、 Ｆｌｕは、発蛍光団であり、 Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であ り、 Ｓｐａは、直接結合またはスペーサー鎖であり、そして Ｃａｒは、非水溶性及び／または高分子の担体である、 で示される固定化蛍光消光ぺプチドとインキュベートし、 （ｂ）場合によっては、担体物質から液体を分離し、 （ｃ）該担体物質に照射し、蛍光を測定する ことを含んでなるタンパク質分解酵素のアッセイ方法。 ２． ＦｌｕがＥｄａｎｓのようなアミノナフタレンスルホン酸基であり、そ してＱｕｅがＤａｂｃｙｌのようなアミノフェニルアゾベンゾイル基である、請 求の範囲１の方法。 ３． Ｃａｒがポリアクリレートまたはポリアクリルアミドである、請求の範 囲１または２の方法。 ４． Ｓｕｂがアミノ酸配列Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａｅを含み、ここで 、Ｘａｂはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂ ｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘａｄはあらゆるア ミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕであ り、そしてＸａｅはあらゆるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａ ｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ、特にＡｒｇまたはＧｌｙである、アグレカ ナーゼ活性をアッセイするための、請求の範囲１−３のいずれかの方法。 ５． Ｓｕｂがアミノ酸配列Ｘａｉ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｘａｊを含み、ここで、 Ｘａｉはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＨｙｐであり、そしてＸａ ｊはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＣｈａである 、マトリックスメタロプロテイナーゼによるアグレカン分解をアッセイするため の、請求の範囲１−３のいずれかの方法。 ６． Ｓｕｂが、アミノ酸配列Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｘａｇを含み、ここ で、Ｘａｄはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａ １であり、Ｘａｆはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであり、 そしてＸａｇはあらゆるアミノ酸、好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ またはＨｓｅである、あるいは、アミノ酸配列Ｘａｍ−Ｘａｎ−Ｘａｏ−Ｇｌｕ を含み、ここで、Ｘａｍはあらゆるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒ ｎ、ＨｉｓまたはＴｒｐ、特にＡｒｇであり、Ｘａｎはあらゆるアミノ酸、好ま しくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌ、特にＧｌｙであり、Ｘａｏは、あ らゆるアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮＶａ、ＬｅＵ、Ｎｌｅ またはＩｌｅ、特にＬｅｕである、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３活 性をアッセイするための、請求の範囲１−３のいずれか の方法。 ７． 該固定化ペプチドが、ガラスプレートのような固形担体に共有結合的ま たは非共有結合的に結合している、組織切片中のプロテイナーゼ活性をアッセイ するための、前述の請求の範囲のいずれかの方法。 ８． 式 Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒ または Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ 上記式中、 Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特定の切断部位を含むペプチド鎖であり、 Ｆｌｕは、発蛍光団であり、 Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であ り、 Ｓｐａは、直接結合またはスペーサー鎖であり、そして Ｃａｒは、ガラスもしくはポリマービーズ、ガラスプレート、マイクロタイター プレート、紙もしくは合成ポリマーストリップ、またはアクリレートもしくはア クリルアミドゲル及びタンパク質から選択される不溶性及び／または高分子の担 体である、 で示される蛍光消光ペプチドを含んでいる、タンパク質分解酵素をアッセイする ための固定化基質で。 ９（１１）． 以下の配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｇｌ ｕ−Ｇｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｇｌｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａ１ ａ−Ｇｌｙ及びＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのい ずれか、特に配列Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ａｒｇを含んでなる、アグレカナー ゼ活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １０（１３／１５）． アミノ酸配列Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｌｅｕを含ん でなり、ここで、ＸａｄはＰｒｏまたはＨｙｐであり、そしてＸａｆはあらゆる アミノ酸、特にＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌである、マトリックスメタ ロプロテイナーゼ−１３活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １１（９／１６）． アミノ酸配列Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａｅ、を含ん でなり、ここで、Ｘａｂはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂ ｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、特にＧｌｙ、Ｇｌｎまたは Ｇｌｕであり、ＸａｄはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ 、特にＧｌｙまたはＡｌａであり、そしてＸａｅはあらゆるアミノ酸、好ましく はＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、ＡｂＵ、Ｖａｌ、ＮＶａまたはＬｅｕ、特にＡｒｇ またはＧｌｙであり、これに蛍光標識及び好ましくは消光基も結合している、ア グレカナーゼ活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １２（１０／１６）． アミノ酸配列Ｘａａ−Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａ ｅ−Ｘａｆを含んでなり、ここで、ＸａａはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、Ｓｅｒま たはＴｈｒであり、そして／またはＸａｆはＧｌｙ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり 、そしてＸａｂ、Ｘａｄ及びＸａｅは請求の範囲１１に定義したとおりである、 請求の範囲１１のオリゴペプチド。 １３（１２／１６）． アミノ酸配列Ｘａｈ−Ｘａｉ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｘａ ｊ−Ｘａｋを含んでなり、ここで、Ｘａｈはあらゆるアミノ酸、特にＡｌａ、Ａ ｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは最も特に Ｉｌｅであり、Ｘａｉはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＨｙｐであ り、Ｘａｊはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＣｈ ａであり、そしてＸａｋはあらゆるアミノ酸、特にＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎ ｖａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕまたは最も特にＧｌｙであり、これに蛍光標識及び好まし くは消光基も結合している、マトリックスメタロプロテイナーゼによるアグレカ ン分解活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １４（１３／１６）． アミノ酸配列Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｘａｇ、特に 配列Ａｌａ−Ａｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含んでなり、ここで、Ｘａｄはあらゆる アミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌであり、Ｘａｆはあ らゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであり、そしてＸａｇは脂肪族 アミノ酸、好ましくはＳｅｒ、ＴｈｒＡｌａ、ＡｂｕまたはＨｓｅであり、これ に蛍光標識及び好ましくは消光基も結合している、マトリックスメタロプロテイ ナーゼ−１３活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １５（１５／１６）． アミノ酸配列Ｘａｌ−Ｘａｍ−Ｘａｎ−Ｘａｏ−Ｘａ ｐ−Ｘａｑを含んでなり、ここで、Ｘａｌはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｒ ｏまたはＨｙｐであり、ＸａｍはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＨｉｓまたはＴｒｐ 、特にＡｒｇであり、ＸａｎはＧ１ｙ、Ａ１ａ、ＡｂｕまたはＶａｌ、特にＧｌ ｙであり、Ｘａｏはあらゆるアミノ酸または直接結合、好ましくはＧｌｙ、Ａｌ ａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＩｌｅ、特にＬｅｕであり 、Ｘａｐは、アミノ基に結合することができるアミノ酸、好ましくはＡｓｐ、Ａ ａｄまたは特にＧｌｕであり、そしてＸａｑはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧ ｌｙ、 Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＩｌｅ、特にＡｌａで あり、これに蛍光標識及び好ましくは消光基も結合している、マトリックスメタ ロプロテイナーゼ−１３活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １６． 蛍光標識を有し、好ましくは消光基も有する、請求の範囲９または１ ０のオリゴペプチド。 １７． アミノ酸配列Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓを含んでなり、好まし くは配列Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａを含んでなり、これ に蛍光標識及び消光基が結合している、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１ （間質コラゲナーゼ）の基質としての標識オリゴペプチド。 １８． アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐを含んでなり、好まし くは配列Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇを含んでなり、これ に蛍光標識としてＥｄａｎｓ及び消光基としてＤａｂｃｙｌが結合している、マ トリックスメタロプロテイナーゼ−３（ストロメリシン）の基質としての標識オ リゴペプチド。 １９． 非水溶性の担体またはタンパク質に結合した、場合によっては複数コ ピーの、請求の範囲９−１８のいずれかのオリゴペプチド。

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． （ａ）酵素を含有する試料を式 Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒ または Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ 上記式中、 Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特定の切断部位を含むぺプチド鎖であり、 Ｆｌｕは、発蛍光団であり、 Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であ り、 Ｓｐａは、直接結合またはスペーサー鎖であり、そして Ｃａｒは、非水溶性及び／または高分子の担体である、 で示される固定化蛍光消光ぺプチドとインキュベートし、 （ｂ）場合によっては、担体物質から液体を分離し、 （ｃ）該担体物質に照射し、蛍光を測定する ことを含んでなるタンパク質分解酵素のアッセイ方法。 ２． ＦｌｕがＥｄａｎｓのようなアミノナフタレンスルホン酸基であり、そ してＱｕｅがＤａｂｃｙｌのようなアミノフェニルアゾベンゾイル基である、請 求の範囲１の方法。 ３． Ｃａｒがポリアクリレートまたはポリアクリルアミドである、 請求の範囲１または２の方法。 ４． Ｓｕｂがアミノ酸配列Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａｅを含み、ここで 、Ｘａｂはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂ ｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、Ｘａｄはあらゆるア ミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕであ り、そしてＸａｅはあらゆるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａ ｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ、特にＡｒｇまたはＧｌｙである、アグレカ ナーゼ活性をアッセイするための、請求の範囲１−３のいずれかの方法。 ５． Ｓｕｂがアミノ酸配列Ｘａｉ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｘａｊを含み、ここで、 Ｘａｉはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＨｙｐであり、そしてＸａ ｊはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＣｈａである 、マトリックスメタロプロテイナーゼによるアグレカン分解をアッセイするため の、請求の範囲１−３のいずれかの方法。 ６． Ｓｕｂが、アミノ酸配列Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｘａｇを含み、ここ で、Ｘａｄはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａ ｌであり、Ｘａｆはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであり、 そしてＸａｇはあらゆるアミノ酸、好ましくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、Ａｂｕ またはＨｓｅである、あるいはアミノ酸配列Ｘａｍ−Ｘａｎ−Ｘａｏ−Ｇｌｕを 含み、ここで、Ｘａｍはあらゆるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ 、ＨｉｓまたはＴｒｐ、特にＡｒｇであり、Ｘａｎはあらゆるアミノ酸、好まし くはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌ、特にＧｌｙであり、Ｘａｏはあらゆ るアミノ酸、好ましくはＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまた はＩｌｅ、特にＬｅｕである、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１３活性を アッセイするための、請求の範囲１−３のいずれかの 方法。 ７． 該固定化ペプチドが、ガラスプレートのような固形担体に共有結合的ま たは非共有結合的に結合している、組織切片中のプロテイナーゼ活性をアッセイ するための、前述の請求の範囲のいずれかの方法。 ８． 式 Ｑｕｅ−Ｓｕｂ−Ｆｌｕ−Ｓｐａ−Ｃａｒ または Ｆｌｕ−Ｓｕｂ−Ｑｕｅ−Ｓｐａ−Ｃａｒ 上記式中、 Ｓｕｂは、該タンパク質分解酵素の特定の切断部位を含むペプチド鎖であり、 Ｆｌｕは、発蛍光団であり、 Ｑｕｅは、発蛍光団により出される蛍光放射を吸収することができる消光剤であ り、 Ｓｐａは、直接結合またはスペーサー鎖であり、そして Ｃａｒは、ガラスもしくはポリマービーズ、ガラスプレート、マイクロタイター プレート、紙もしくは合成ポリマーストリップ、またはアクリレートもしくはア クリルアミドゲルから選択される不溶性及び／または高分子の担体である、 で示される蛍光消光ペプチドを含んでいる、タンパク質分解酵素をアッセイする ための固定化基質。 ９． アミノ酸配列Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａｅを含んでなり、ここで、 Ｘａｂはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖ ａ、Ｌｅｕ、ＧｌｕまたはＧｌｎ、特にＧｌｙ、Ｇｌ ｎまたはＧｌｕであり、Ｘａｄはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ 、Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ、特にＧｌｙまたはＡｌａであり、そし てＸａｅはあらゆるアミノ酸、好ましくはＡｒｇ、Ｇｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖ ａｌ、ＮｖａまたはＬｅｕ、特にＡｒｇまたはＧｌｙである、アグレカナーゼ活 性の基質としての標識オリゴペプチド。 １０． アミノ酸配列Ｘａａ−Ｘａｂ−Ｇｌｕ−Ｘａｄ−Ｘａｅ−Ｘａｆ、こ こで、ＸａａはＧｌｕ、Ｇｌｎ、Ａｌａ、ＳｅｒまたはＴｈｒであり、そして／ またはＸａｆはＧｌｙ、ＧｌｕまたはＧｌｎであり、そしてＸａｂ、Ｘａｄ及び Ｘａｅは請求の範囲８に定義したとおりである、を含んでなる請求の範囲９のオ リゴペプチド。 １１． 以下の配列、Ｇｌｙ−Ｇｌｕ−Ａ１ａ−Ａｒｇ、Ｌｅｕ−Ｇｌｕ−Ｇ ｌｙ−Ａｒｇ、Ｇｌｕ−Ｇ１ｕ−Ｇｌｙ−Ｌｅｕ、Ｇｌｎ−Ｇｌｕ−Ａｌａ−Ｇ ｌｙ及びＧｌｎ−Ｇｌｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙのいずれか、特に配列Ｇｌｙ−Ｇｌｕ −Ａｌａ−Ａｒｇを含んでなる、請求の範囲９のオリゴペプチド。 １２． アミノ酸配列Ｘａｈ−Ｘａｉ−Ａｓｎ−Ｐｈｅ−Ｘａｊ−Ｘａｋを含 んでなり、ここで、Ｘａｈはあらゆるアミノ酸、特にＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、 Ｎｖａ、Ｌｅｕ、Ｎｌｅまたは最も特にＩｌｅであり、Ｘａｉはあらゆるアミノ 酸、好ましくはＰｒｏまたはＨｙｐであり、そしてＸａｊはあらゆるアミノ酸、 好ましくはＰｈｅ、Ｔｙｒ、ＴｒｐまたはＣｈａであり、そしてＸａｋはあらゆ るアミノ酸、特にＡｌａ、Ａｂｕ、Ｖａｌ、Ｎｖａ、Ｉｌｅ、Ｌｅｕまたは最も 特にＧｌｙである、マトリックスメタロプロテイナーゼによるアグレカン分解活 性の基質としての標識オリゴペプチド。 １３． アミノ酸配列Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｘａｇ、特に配列Ａｌａ−Ａ ｒｇ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒを含んでなり、ここで、Ｘａｄはあらゆるアミノ酸、好ま しくはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌであり、Ｘａｆはあらゆるアミノ酸、 好ましくはＧｌｙまたはＡｌａであり、そしてＸａｇはあらゆるアミノ酸、好ま しくはＳｅｒ、Ｔｈｒ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＨｓｅである、マトリックスメタ ロプロテイナーゼ−１３活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １４． アミノ酸配列Ｘａｃ−Ｘａｄ−Ａｒｇ−Ｘａｆ−Ｘａｇを含んでなり 、ここで、ＸａｃはＧｌｕ以外のアミノ酸であり、そしてＸａｄ、Ｘａｆ及びＸ ａｇは請求の範囲１３に定義したとおりである、マトリックスメタロプロテイナ ーゼ−１３活性の特異的基質としての請求の範囲１３のオリゴペプチド。 １５． アミノ酸配列Ｘａｌ−Ｘａｍ−Ｘａｎ−Ｘａｏ−Ｘａｐ−Ｘａｑを含 んでなり、ここで、Ｘａｌはあらゆるアミノ酸、好ましくはＰｒｏまたはＨｙｐ であり、ＸａｍはＡｒｇ、Ｌｙｓ、Ｏｒｎ、ＨｉｓまたはＴｒｐ、特にＡｒｇで あり、ＸａｎはＧｌｙ、Ａｌａ、ＡｂｕまたはＶａｌ、特にＧｌｙであり、Ｘａ ｏはあらゆるアミノ酸または直接結合、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、Ａｂｕ、Ｖ ａｌ、Ｎｖａ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＩｌｅ、特にＬｅｕであり、Ｘａｐは、ア ミノ基に結合することができるアミノ酸、好ましくはＡｓｐ、Ａａｄまたは特に Ｇｌｕであり、そしてＸａｑはあらゆるアミノ酸、好ましくはＧｌｙ、Ａｌａ、 Ａｂｕ、Ｖａｌ、ＮＶａ、Ｌｅｕ、ＮｌｅまたはＩｌｅ、特にＡｌａである、マ トリックスメタロプロテイナーゼ−１３活性の基質としての標識オリゴペプチド 。 １６． 蛍光標識を有し、好ましくは消光基も有する、請求の範囲９−１５の いずれかのオリゴペプチド。 １７． アミノ酸配列Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓを含んでなり、好まし くは配列Ｐｒｏ−Ｃｈａ−Ａｂｕ−Ｓｍｃ−Ｈｉｓ−Ａｌａを含んでなり、これ に蛍光標識及び消光基が結合している、マトリックスメタロプロテイナーゼ−１ （間質コラゲナーゼ）活性の基質としての標識オリゴペプチド。 １８． アミノ酸配列Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐを含んでなり、好まし くは配列Ｐｒｏ−Ｖａｌ−Ｇｌｕ−Ｎｖａ−Ｔｒｐ−Ａｒｇを含んでなり、これ に蛍光標識としてＥｄａｎｓ及び消光基としてＤａｂｃｙｌが結合している、マ トリックスメタロプロテイナーゼ−３（ストロメリシン）活性の基質としての標 識オリゴペプチド。 １９． 非水溶性の担体またはタンパク質に結合した、場合によっては複数コ ピーの、請求の範囲９−１８のいずれかのオリゴペプチド。