JPH0253040B2 - - Google Patents

Info

Publication number
JPH0253040B2
JPH0253040B2 JP60299814A JP29981485A JPH0253040B2 JP H0253040 B2 JPH0253040 B2 JP H0253040B2 JP 60299814 A JP60299814 A JP 60299814A JP 29981485 A JP29981485 A JP 29981485A JP H0253040 B2 JPH0253040 B2 JP H0253040B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
group
amino
carbon atoms
factor
methyl
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
JP60299814A
Other languages
English (en)
Other versions
JPS63300A (ja
Inventor
Rarusu Gundoro Suensen
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
DSM Nutritional Products AG
Original Assignee
Pentapharm AG
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Pentapharm AG filed Critical Pentapharm AG
Publication of JPS63300A publication Critical patent/JPS63300A/ja
Publication of JPH0253040B2 publication Critical patent/JPH0253040B2/ja
Granted legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/06—Dipeptides
    • C07K5/06008—Dipeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/06017—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/06026—Dipeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atom, i.e. Gly or Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0804—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0802—Tripeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/0812—Tripeptides with the first amino acid being neutral and aromatic or cycloaliphatic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/08—Tripeptides
    • C07K5/0819—Tripeptides with the first amino acid being acidic
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C07K5/04—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof containing only normal peptide links
    • C07K5/10—Tetrapeptides
    • C07K5/1002—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral
    • C07K5/1005—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic
    • C07K5/1008—Tetrapeptides with the first amino acid being neutral and aliphatic the side chain containing 0 or 1 carbon atoms, i.e. Gly, Ala
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/34—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase
    • C12Q1/37—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving hydrolase involving peptidase or proteinase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/56—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving blood clotting factors, e.g. involving thrombin, thromboplastin, fibrinogen
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/10—Anilides
    • C12Q2337/12—Para-Nitroanilides p-NA
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q2337/00—N-linked chromogens for determinations of peptidases and proteinases
    • C12Q2337/20—Coumarin derivatives
    • C12Q2337/22—7-Amino-4-methylcoumarin, i.e. AMC, MCA
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/90—Enzymes; Proenzymes
    • G01N2333/914—Hydrolases (3)
    • G01N2333/948—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • G01N2333/95—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99)
    • G01N2333/964—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue
    • G01N2333/96425—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals
    • G01N2333/96427—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general
    • G01N2333/9643—Proteinases, i.e. endopeptidases (3.4.21-3.4.99) derived from animal tissue from mammals in general with EC number
    • G01N2333/96433—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • G01N2333/96441—Serine endopeptidases (3.4.21) with definite EC number
    • G01N2333/96444—Factor X (3.4.21.6)
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S435/00—Chemistry: molecular biology and microbiology
    • Y10S435/81—Packaged device or kit
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S530/00—Chemistry: natural resins or derivatives; peptides or proteins; lignins or reaction products thereof
    • Y10S530/802—Chromogenic or luminescent peptides
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S930/00—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/01—Peptide or protein sequence
    • Y10S930/28—Bound to a nonpeptide drug, nonpeptide label, nonpeptide carrier, or a nonpeptide resin
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/106664—Blood serum or blood plasma standard or control
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/108331—Preservative, buffer, anticoagulant or diluent
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T436/00—Chemistry: analytical and immunological testing
    • Y10T436/10—Composition for standardization, calibration, simulation, stabilization, preparation or preservation; processes of use in preparation for chemical testing
    • Y10T436/109163—Inorganic standards or controls

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Meat, Egg Or Seafood Products (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

【発明の詳細な説明】
技術分野 本発明は、酵素分類3.4.21の特定酵素特に第
ａ因子により非常に容易に分解されるトリペプチ
ド誘導体を酵素特に第ａ因子を定量分析するた
めの基質として使用する方法に関する。 背景技術 第ａ因子は、血液凝固カスケード中で酵素前
駆体第Ｘ因子の活性化により形成され、燐脂質及
びカルシウムイオンと一緒になつて、第因子
（プロトロンビン）をペプチド鎖の２点で蛋白質
分解して、前記因子を、最終的に凝固させる第
ａ因子（トロンビン）に変じる蛋白質分解酵素で
ある。特定の病気例えば肝臓疾患、ビタミン欠乏
症等の際に、かつジクマロール療法において、第
因子の形成は減少されている。この第因子の
合成に関する遺伝的障害により、もちろん第ａ
因子の形成は、相応して減少されている。従つ
て、簡単かつ正確な方法で、血漿中の第ａ因子
を光学的に分析させる直接酵素分析法を自由に得
ることは、重要である。 第ａ因子を分析する主要な方法は次のとおり
である； (a) 生物学的分析法〔Thrombosis and
Bleeding Disorders、Nils U.Bang、Georg
Thieme Verlag196頁（1971年）参照〕：第
因子をラツセル（Russel）まむし毒及びカル
シウムイオンを用いて活性化する。１工程操作
で、プロトロンビンを第因子及び燐脂質の存
在で第ａ因子を用いて活性化してトロンビン
にし、トロンビンはインジケータフイブリノゲ
ンをフイブリンに変える。凝固時間を測定す
る。所要の第因子及びフイブリノゲンは、第
Ｘ因子不含の基質により供給される、凝固時間
は、第因子の活性化の程度により影響され
る。他の条件は一定で、この活性化度は、試料
中の第因子の濃度の係数である。凝固時間は
この実験で主観的に読み取られるので、この生
物学的方法は、粗雑な分析を実施することを可
能とするだけである。更に、処理された血漿が
必要であり、その調製の間に誤ちが起こりう
る。更に、インジケータとしての作用をするフ
イブリノゲンは、直接は形成されないが、活性
化されたトロンビンを経て形成される（間接的
方法）。 (b) 生化学的方法〔“Thrombosis and Bleeding
Disorders”、N.U.Bang、Georg Thieme
Verlag、196〜７頁（1971年）参照〕；試験さ
れるべき第因子調製物が充分に純粋であれ
ば、より正確な分析法が提供されうる。エスナ
フ（Esnouf）及びウイリアムズ（Williams）
（1962年）は、第ａ因子がエステラーゼ活性
を有し、従つて、合成アミノ酸エステルを分解
することを示している。しかしながら、この分
析のためには第因子50〜100μｇが必要であ
る。他方、カルボベンゾキシ−フエニルアニリ
ン−ｐ−ニトロフエニルエステルを用い、単位
時間当りの発生ｐ−ニトロフエノールの量を測
定することにより、低濃度の第ａ因子を測定
することができる。この分析法は次の欠点を有
する：使用エステルは適用PH値８で自己加水分
解し、更に、これは多くの他の酵素にも応答す
るので、第ａ因子に対して特異的ではない。
このエステルは水中に不溶であるから、アセト
ンが必要である。これらのすべての欠点の結果
として、この分析法は不正確であり、経費がか
かる。 (c) 西ドイツ国特許出願公開第2552570号明細書
には、第ａ因子分析用基質として使用される
べきテトラペプチド誘導体が記載されている。
BZ−Ile−Glu−Gly−Arg−pNA・HClが、第
ａ因子により分解されてｐ−ニトロアニリン
を形成するテトラペプチド誘導体の１例として
記載されている。このｐ−ニトロアニリンの形
成は、分光光度法で追跡できる。この第ａ因
子分析法は、前記の生物学的及び生化学的分析
法よりはいくらか正確である。 しかしながら、西ドイツ特許出願公開第
2552570号明細書に記載のテトラペプチド誘導
体は、基質飽和で実施されるべき第ａ因子の
分析を可能とする程度に充分に水性媒体中に可
溶ではない。例えば病的血漿中の測定すべき第
ａ因子の濃度が極めて低い場合には、前記テ
トラペプチド誘導体は、相応する正確な測定値
を得させる程度に充分に敏感ではない。測定す
べき第ａ因子の量が更に血漿を加えることに
より増加したら、血漿蛋白質の影響下にテトラ
ペプチド基質の沈殿が生じるはずであり、その
結果として、酵素分析を実施することが不可能
となるはずである。 発明の開示 ところで、水性媒体中に非常に溶け易く、第
ａ因子に対して意想外に高い敏感性を有する新規
のトリペプチド誘導体を見つけた。 本発明のこのトリペプチド誘導体は、次の一般
式を有する： 〔式中R1は炭素原子数２〜８を有し、ω−位に
１個のアミノ基を有していてよいアルカノイル
基、アルカノイル基中に炭素原子数２〜４を有
し、そのフエニル基はｐ−位で１個のアミノ基で
置換されていてよいフエニルアルカノイル基、４
位でアミノメチル基で置換されていてよいシクロ
ヘキシルカルボニル基、ｏ−又はｐ−位でメチル
基、アミノ基、ハロゲン例えばCl又はBrで置換
されていてよいベンゾイル基、アルコキシ基中に
炭素原子数１〜８を有するアルコキシカルボニル
基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩素で置換さ
れていてよいベンジルオキシカルボニル基、炭素
原子数１〜４を有するアルカンスルホニル基、ｐ
−位でメチル化されていてよいフエニルスルホニ
ル基又はα−又はβ−ナフチルスルホニル基を表
わし、R2は炭素原子数１〜６特に１〜４を有す
る直鎖又は分枝鎖のアルキル基、炭素原子数１〜
２を有するヒドロキシアルキル基、アルキル中の
炭素原子数１〜２を有し、アルコキシ中の炭素原
子数１〜４を有するアルコキシアルキル基、アル
キル中の炭素原子数１〜２を有するベンジルオキ
シアルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜３を
有し、そのアルコキシ基は直鎖又は分枝鎖で炭素
原子数１〜４を有するω−カルボキシアルキル又
はω−アルコキシカルボニルアルキル基、アルキ
ル中に炭素原子数１〜３を有するω−ベンジルオ
キシカルボニルアルキル基又はシクロヘキシル
−、シクロヘキシルメチル−、４−ヒドロキシシ
クロヘキシルメチルフエニル−、ベンジル−、４
−ヒドロキシベンジル−又はイミダゾール−４−
イル−メチル基を表わし、R3は水素又は炭素原
子数１〜４を有する直鎖又は分枝鎖のアルキル基
を表わし、R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、１
−カルボキシ−２−ニトロフエン−５−イル−ア
ミノ、１−スルホ−２−ニトロフエン−５−イル
−アミノ、β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−
β−ナフチルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチル
アミノ、キノン−５−イルアミノ、８−ニトロ−
キノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマル
−７−イル−アミノを表わす（但し、R1がベン
ジルオキシカルボニルでR2がイソプロピル又は
シクロヘキシルであるトリペプチド誘導体を除
く）〕。 アルギニンの強塩基性グアニジノ基は、例えば
鉱酸例えばHCl、HBr、H2SO4又はH3PO4又は
有機酸例えばギ酸、酢酸、プロピオン酸、乳酸、
クエン酸、蓚酸、酒石酸、安息香酸、フタル酸、
トリクロル酢酸又はトリフルオル酢酸でプロトン
化することにより安定化されるのが有利である。
プロトン化の特性は、酵素に対するトリペプチド
基質の敏感性（感受性）に対して影響を有しな
い。 式のトリペプチド誘導体は、次に記載の自体
公知の方法で製造できる： (1) 色原性基R5をＣ−末端アルギニンのカルボ
キシ基に付着させ、他方、そのα−アミノ基を
保護基例えばカルボベンゾキシ又はｔ−ブトキ
シカルボニル基で保護し、アルギニンのδ−グ
アニジンを例えばHClを用いるプロトン化、窒
化又はトジル化により保護する。Ｃ−末端基は
ペプチド鎖の段階的形成の間に保護基としての
役目もする。残りの保護基は、必要に応じて所
望ペプチド鎖が完全に組立てられるまでに、次
のアミノ酸誘導体に付着するために、選択的に
除去することができる。最後に、影響されてい
る基R5以外の残りの保護基をまつたく除去す
ることができる〔例えばMiklos Bodansky等
による“Peptide Synthesis”、Interscience
Publishers、163〜165頁、（1966年）参照〕。 (2) まず、ペプチド鎖を形成し、他方、アルギニ
ンのＣ−末端カルボキシル基を有用なエステル
基例えばメトキシ、エトキシ又はベンジルオキ
シ基で保護する（前記のBodanskyの文献参
照）。選択的にトリフルオル酢酸を用いて除去
すべきｔ−ブトキシ基以外のエステル基はアル
カリ性加水分解により除去することができる。
アルギニンのδ−グアニジル基をプロトン化す
ると、このエステル基はトリプトシンにより除
去され、この場合にラセミ化は起こらない。そ
の後、色原性基R5を導入する。アルギニンの
δ−グアニジノ基をニトロ又はトジル基で保護
し、トリペプチド誘導体のＮ−末端α−アミノ
基をカルボベンゾキシ基又はｐ−メチル、ｐ−
メトキシ又はｐ−クロル−ベンジルオキシカル
ボニル基又はｔ−ブトキシ基で保護する場合
は、これらすべての保護基を同時に除去する。
この除去は、保護されたトリペプチド誘導体を
室温で無水HFで処理することにより達成で
き、結果として、前記のアミノ基及びδ−グア
ニジノ保護基のすべてが除去される。この除去
は、保護されたトリペプチド誘導体が保護基と
してニトロ又はトジル基を含有しない場合は、
室温で氷酢酸中の2NHBrでの処理によつて実
施することもできる。 式のトリペプチド誘導体は、西ドイツ特許出
願公開第2552570号明細書に記載のテトラペプチ
ド誘導体よりも著しく容易に水中に溶け、従つ
て、信頼しうる測定結果を得るために要求される
基質飽和で実施されるべき酵素分析を可能とす
る。更に、式のトリペプチド基質は、西ドイツ
特許公開第2552570号明細書記載のテトラペプチ
ド誘導体よりも著るしく敏感であり、従つて、極
めて低い濃度の第ａ因子を分析するために使用
することもできる。 西ドイツ特許出願公開第7607433号明細書には、
一般式：Ｈ−Ｄ−A1−A2−A3−NH−Ｒ（A1、
A2、A3＝アミノ酸残基）を有し、酵素分類E.
C.3.4.21.の酵素例えばトロンビン及びプラスミン
に対して高い敏感度を有するトリペプチド誘導体
が記載されている。この高い敏感度に、Ｎ−末端
Ｄ−アミノ酸が非置換α−アミノ基を有する事実
に帰因する。実際に、この末端Ｄ−アミノ酸のα
−アミノ基が置換されている場合、即ち、式中の
水素が保護基又は遮断基例えばベンゾイル又はカ
ルボベンゾキシ基で換えられると、酵素分類
3.4.21.の酵素に対するトリペプチド誘導体の敏感
度は著るしく低下される。 これらの発見に基づき、式中のＮ−末端Ｄ−ア
ミノ酸のα−アミノ基が保護基又は遮断基を有す
る式の新規トリペプチド誘導体は酵素分類
3.4.21の酵素により分解されないか又は僅かに分
解されることは予測できた。しかしながら、すべ
ての予測に反して、新規トリペプチド基質は意想
外に第ａ因子に対する非常に高い敏感度を有す
る。 西ドイツ特許出願公開第2552570号明細書に記
載のテトラペプチド誘導体に比べた本発明のトリ
ペプチド基質のもう１つの利点は、実際に、その
合成が簡単かつ経費が安い事実に帰する。 本発明のトリペプチド基質は、酵素分類E.
C.3.4.21.の特定酵素（“Enzyme Nomenclature”
Elsevier Scientific Publishing Company、
Amsterdam1973年238頁以降参照）例えば血漿中
の第ａ因子の定量分析に使用することができ、
第ａ因子を経て、他の生物学的に重要な因子例
えば第因子（第ａ因子のプロ酵素）、第ａ
抗因子（＝抗トロンビン又はヘパリン補因子）
又は血漿中のヘパリンの定量分析にも使用でき
る。 これらの種々の分析は次に記載の方法で実施で
きる： (1) 第ａ因子及び第因子の分析： クエン酸処理したヒト血漿を用い、まず、血
漿中に存在する第因子を第ａ因子に変える
ために、ラツセルまむし毒（RVV＝Russel
viper venom）又はトロンボプラスチン試薬で
活性化する。次の試薬を使用する： 緩衝液 トリス−イミダゾール緩衝液、PH8.4、
イオン濃度0.3； RVV 凍結乾燥したラツセルまむし毒調製物
（Laboratoire Stago、92600 Asnieres Ｓ／
Seine、Franceより提供）をCaCl20.015Mを
含有する緩衝液中に溶解したもの； 基質 蒸留水中に溶かしたCbo−Ｄ−Leu−
Sar−Arg−pNA・AcOH（濃度：２×
10-3M）。 試験キユベツトに、37℃で加熱したRVV0.2
mlを装入し、次いで、クエン酸処理したヒト血
漿0.02mlを装入する。この２種成分を直ちに混
合し、次いで、37℃で60秒間インキユベートす
る。生じる活性混合物を37℃に加熱された緩衝
液1.6mlで稀釈し、２×10-3M基質溶液0.2mlと
混合する。次いで、発生ｐ−ニトロアニリンに
より惹起される混合物の光学密度の変化を
405nｍの波長で分光光度法で測定する。測定
された１分当りの光学密度の増加は、活性化さ
れた血漿中に存在する第ａ因子の量に正比例
する。測定された１分当りの光学密度の増加
は、活性化の結果として、第因子の所定量が
化学量論的に相当量の第ａ因子に変じるの
で、出発血漿中に存在する第ａ因子の量に関
する尺度でもある。 (2) 第ａ抗因子の分析： クエン酸塩処理したヒト血漿をTRIS−緩衝
液で１：10の割合で稀釈することにより試料を
調製する。TRIS−イミダゾール緩衝液中のヘ
パリン溶液（緩衝液１ml当りヘパリン3USP単
位を含有）100μを前記稀釈血漿100μに加
え、混合物を37℃で２分間インキユベートし、
このインキユベートしたものに、１ml当第ａ
因子8.5単位を含有する第ａ因子調製物ダイ
アゲン（Diagen；提供者Diagnostic
Reagents、Thame、英国）を加える。この混
合物を37℃で３分間インキユベートする。この
インキユベートしたものを37℃に加熱した
TRIS−イミダゾール緩衝液0.6mlで稀釈し、直
ちに、37℃に加熱した蒸溜水中の２×10-3Mの
Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−pNa・AcOH（基
質）の溶液100μと混合する。 並行実験で、同じ方法によるが、稀釈された
血漿の代りに同量の緩衝液を用いて盲検試料を
調製した。 双方の試料（被検試料及び盲検試料）に関し
て、405nｍでの光学密度の増加を分光光度法
で測定する。盲検試料の１分当りの光学密度の
増加（△OD盲検／min）と被検試料の１分当
りの光学密度の増加（△OD被検／min）との
間の差は、第ａ抗因子−ヘパリン錯体により
抑制された第ａ因子の量に関する尺度であ
り、従つて血漿中に存在する第ａ抗因子（＝
抗トロンビン）の量の尺度である。 (3) 血漿中のヘパリンの分析： ヘパリン処理した患者の血漿をTRIS−イミ
ダゾール緩衝液で１：10の割合で稀釈すること
により被検試料を調製する。この稀釈した血漿
を37℃で１〜２分間インキユベートし、このイ
ンキユベートしたものに第ａ因子調製物ダイ
アゲン（提供者：Diagnostic Reagents、
Thame、英国）の溶液（１ml当り第ａ因子
8.5単位含有）100μを添加し、混合物を37℃
で３分間インキユベートする。このインキユベ
ート物を37℃に加熱したTRIS−イミダゾール
緩衝液0.6mlで稀釈し、直ちに、蒸留水中の
Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−pNA−AcOH（基
質）の２×10-3M溶液100μと混合する。 並行実験で、同じ方法であるが、稀釈された
ヘパリン処理血漿の代りに相応して稀釈された
正常血漿（ヘパリン不含）同量を用いて、盲検
試料を調製する。 双方の試料に関して405nｍにおけ１分当り
の光学密度の増加を測定する。盲検試料の一分
当り光学密度の増加（△OD盲検／min）と被
検試料の１分当り光学密度の増加（△OD被
検／min）との間の差は、ヘパリン−補因子
（抗トロンビン）に結合したりヘパリンの抑制
活性の尺度である。 第ａ抗因子（＝ヘパリン−補因子又は抗ト
ロンビン）は単独で第ａ因子を抑制する
が、短かいインキユベーシヨン時間（例えば３
分）内に少量の第ａ因子だけが抑制される程
度に遅い。しかしながら、第ａ抗因子がヘパ
リンと接触するなら、２成分は、第ａ因子の
迅速抑制成分であり、短かいインキユベーシヨ
ン時間（例えば３分）内に第ａ因子と完全に
結合する錯体を形成する。 第ａ因子の抑制は、存在するヘパリンの量
に比例するので、充分な第ａ抗因子が存在す
るかぎり、患者の血漿中に存在するヘパリンの
量は、正常血漿で得られる平衡曲線を用いて、
かつ添加したヘパリンの強化作用の理由で、添
加ヘパリンの量を増加することにより測定でき
る。 第ａ因子と本発明のトリペプチド誘導体と
の間の反応で生じた着色された分解生成物Ｈ−
R5（ｐ−ニトロアニリン）の量の測定におい
て、利点は、分解生成物が基質のそれとは異な
るUVスペクトルを有し、長波長の方向にシフ
トしている事実に基づく。本発明の基質は約
310nｍで最大吸収を示し、約13000のモル吸光
係数を示す。405nｍでの基質の吸収は実質的
に０である。基質の酵素的加水分解により形成
される分解生成物即ちｐ−ニトロアニリンは、
380nｍで最大吸収及び約13200のモル吸収係数
を示す。405nｍでの吸光係数は、徐々に、即
ち約10400まで減少する。 色原性基としてβ−ナフチルアミノ、４−メト
キシ−β−ナフチルアミノ、クマル−７−イル−
アミノ基を有する基質の場合に、第ａ因子によ
り形成された分解生成物Ｈ−R5の量を螢光分光
光度法により測定する。第ａ因子、緩衝液及び
基質よりなる試験系において、螢光分解生成物を
300〜400nｍのエネルギーの多い光で連続的に励
起した後に、400〜470nｍでエネルギーの少ない
光を連続的に測定する。単位時間当りに形成され
る分解生成物の量は、存在する第ａ因子活性の
尺度である。定義によれば、１分当りに形成され
る分解生成物の1μモルは、所定の１基質に対す
る第ａ因子の１酵素単位に相当する。 前記の分析法の敏感度は、その量の測定前の分
解生成物Ｈ−R5をジアゾ化合物とのカツプリン
グにより、より強く着色された化合物（この際
R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カルボキ
シ−２−ニトロ−フエン−５−イル−アミノ、１
−スルホ−２−ニトロ−フエン−５−イル−アミ
ノ、５−ニトロ−α−ナフチルアミノ又は８−ニ
トロ−キノン−５−イル−アミノ基である）に変
えることにより、更に増大させることができる。 発明を実施するための最良の形態 次の操作例で、本発明で使用されるトリペプチ
ド誘導体を詳述する。温度は摂氏で示す。 製造例により得られる溶離物及び生成物の分析
は、二酸化珪素ゲル（Merck F254）でコートさ
れたガラスプレートを用いる薄層クロマトグラフ
イにより実施した。薄層クロマトグラムは、次の
溶剤系：ｎ−ブタノール／酢酸／水（３：１：
１）を用いて展開した。 次の略語を使用する： Ｄ−Aadi＝Ｄ−α−アミノ−アジピン酸、 Ac＝アセチル、 Ac2O＝無水酢酸、 AcOH＝酢酸、 Ｄ−Ala＝Ｄ−アラニン、 AOA＝Ｄ−α−アミノ−オクタノイツ
ク酸、 Arg＝Ｌ−アルギニン、 Ｄ−Asp＝Ｄ−アスパラギン酸、 BOC＝ｔ−ブトキシカルボニル、 Bu＝ブチル、 Ｄ−But＝Ｄ−２−アミノ酪酸、 Bz＝ベンゾイル、 Bzl＝ベンジル、 Bz2O＝無水安息香酸、 ChA＝キノニルアミド、 Ｄ−CHA＝Ｄ−３−アシロヘキシルアラニ
ン、 Ｄ−CHG＝Ｄ−２−シクロヘキシルグリシ
ン、 Ｃ−CHT＝Ｄ−３−（４−ヒドロキシシク
ロヘキシル）−アラニン、 ＝核中で置換されたチロシン、 Cbo＝カルボベンゾキシ、 DMF＝ジメチルホルムアミド、 TLC＝薄層クロマトグラフイ又は薄層
クロマトグラム、 Et＝エチル、 Ht3N＝トリエチルアミン、 Gly＝グリシン、 Ｄ−Glu＝Ｄ−グルタミン酸、 Ｄ−His＝Ｄ−ヒスチジン、 HMPTA＝Ｎ，Ｎ，N′，N′，N″，N″−ヘ
キシルメチル−燐酸トリアミド、 Ｄ−Ile＝Ｄ−イソロイシン、 Ｄ−Leu＝Ｄ−ロイシン、 SS＝溶剤系、 MCA＝７−アミド−４−メチルクマリ
ン、 MeO＝メトキシ、 MeOH＝メタノール、 NA＝ナフチルアミド、 Ｄ−Nleu＝Ｄ−ノルロイシン、 Ｄ−Nval＝Ｄ−ノルバリン、 OtBu＝ｔ−ブトキシ、 OpNP＝ｐ−ニトロフエノキシ、 pNA＝ｐ−ニトロアニリド、 Pr＝プロピル、 Ｄ−Ph′Gly＝Ｄ−２−フエニルグリシン、 Ｄ−Phe＝Ｄ−フエニルアラニン、 Sar＝サルコシン＝Ｎ−メチルグリシ
ン、 Ｄ−Ser＝Ｄ−セリン、 TFA＝トリフルオル酢酸、 THF＝テトラヒドロフラン、 Ｄ−Thr＝Ｄ−スレオニン、 Tos＝ｐ−トルエンスルホニル、 Ｄ−Tyr＝Ｄ−チロシン、 Ｄ−Val＝Ｄ−バリン。 他に記載のないかぎり、アミノ酸はＬ−型を有
する。 例 １（製造例） Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−PNa・HBr 1a Cbo−Arg−PNa・HCl 250ml三頚フラスコ中で、真空中P2O5上で乾
燥したCbo−Arg−OH・HCl16.0ｇ（47ｍＭ）
を、無水HMPTA90ml中に、湿気不存在下に
20℃で溶かした。生じる溶液に、室温でまず、
HMPTA10ml中のEt3N4.74ｇ（47.0ｍＭ）の
溶液を加え、次いで、イソシアン酸ｐ−ニトロ
フエニル16.4ｇ（100ｍＭ）（100％過剰）を滴
加した。20℃で24時間の反応時間の後に、
HMPTAの大部分を真空中での蒸溜により除
去した。残分を30％AcOHで数回抽出した。残
分を捨てた。集めたAcOH抽出物を30％AcOH
で平衡にしたセフアデツクスＧ−15のカラムを
通し、30％AcOHで溶離させることにより更に
精製した。トリプシンでの処理によりｐ−ニト
ロアニリンの形成下に分解したAcOH溶離液の
フラクシヨンを凍結乾燥させた。こうして、
SS中でTLCにより示されるような均質である
無定形粉末12.6ｇが得られた。元素分析及び実
験式C20H25H6O5Clからの計算は次の値を示し
た：Ｃ＝51.29％（51.67％）、Ｈ＝5.48％（5.42
％）、Ｎ＝17.92％（18.08％）、Cl＝7.50％
（7.63％）。括弧内の値は計算値である。 1b 2HBr・Ｈ・Arg・pNA 化合物a4.65ｇ（10ｍＭ）を、撹拌下に、
氷酢酸中の2NHBr40mlで、20℃、湿気の不存
在下に45分間処理した。アミノ酸誘導体はCO2
発生下に溶けた。反応溶液を激しい撹拌下に、
無水エーテル250mlに滴加すると、2HBr・Ｈ
−Arg−pNAは沈殿した。エーテル相を吸引
除去し、更に、固相を、副産物として形成され
た臭化ベンジル並びに過剰のHBr及びAcOH
を実質的に除去するために、無水エーテル100
mlで４回洗浄した。残分をMeOH50ml中に溶
かし、Et3Nの添加によりPHを4.5に調節し、溶
液を真空中、30℃で濃縮乾燥させた。得られる
生成物をMeOH75ml中に溶かし、MeOHで平
衡にしたセフアデツクスLH20（交叉結合デキ
ストランゲル）のカラムに通した。溶離液のフ
ラクシヨンか、無定形化合物b4.18ｇ（理論
量の91.6％）が得られ、これは、TLCで示され
るようにSS中で均質であつた。元素分析及び
実験式C12H20N6O3Br2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝31.15％（31.60％）、Ｈ
＝4.35％（4.42％）、Ｎ＝18.84％（18.43％）及
びBr＝34.81％（35.03％）。 1c Cbo−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物1b4.56ｇ（10ｍＭ）を新しく蒸溜した
DMF30ml中に溶かし、この溶液を−10℃まで
冷却し、この溶液に、撹拌下にEt3N1.40ml
（10ｍＭ）を添加した。形成されたEt3N・HBr
を濾去し、少量の冷DMFで洗浄した。この濾
液に、撹拌下にCbo−Gly−OpNP3.65ｇ（11
ｍＭ）を加え、湿気の不存在下に２〜３時間反
応させ、この際、反応溶液の温度は従々に約20
℃に達した。溶液を再び−10℃まで冷却し、
Et3N0.7ml（５ｍＭ）を用いて緩衝させた。反
応溶液を約−10℃で約２時間、かつ室温で３時
間反応させた。この操作をEt3N0.70mlを用い
て繰り返し、16時間後に、反応溶液を真空中、
50℃で濃縮させた。残分を、50％AcOH75ml中
に溶かし、50％AcOHで平衡にしたセフアデツ
クスＧ−15のカラム上でのゲル濾過により精製
した。トリプトシンでの処理によりｐ−ニトロ
アニリンの形成下に分解したAcOH溶離液牢の
フラクシヨンを、真空中40℃で濃縮乾燥させ
た。残分をMcOH150ml中に溶かし、再び濃縮
乾燥させた。生じる残分を真空デシケータ中、
60℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合
物c5.85ｇ（理論量の88.3％）が得られ、こ
れは、TLCで示されるようにSS中で均質であ
つた。元素分析及び実験式C22H28N7O6Brから
計算して、次の値が得られた：Ｃ＝46.33％
（46.65％）、Ｈ＝5.04％（4.98％）、Ｎ＝17.88％
（17.31％）、及びBr＝14.20％（14.11％）。 1d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−pNA 化合物1c4.56ｇ（８ｍＭ）を、撹拌下に氷酢
酸中の2NBr32mlで、20℃で40分間処理した。
ジペプチド誘導体は徐々にCO2の発生下に溶け
た。反応溶液を激しい撹拌下に無水エーテル
250mlに滴加すると、2HBr・Ｈ・Gly−Arg−
pNAが沈殿した。エーテル相を吸引除去し、
更に、固体相を、副産物として形成された臭化
ベンジル並びに過剰のHBr及びAcOHを実質
的に除去するために、無水エーテル100mlで４
回洗浄した。残分をMeOH50ml中に溶かした。
Et3Nを用いてPH値を4.3に調節し、溶液を、真
空中、30℃で濃縮乾燥させた。得られる残分を
MeOH50ml中に溶かし、MeOHで平衡にした
セフアデツクスLH−20のカラム上で精製し
た。トリプトシンでの処理によりｐ−ニトロア
ニリンの形成下に分解したMeOH溶離液のフ
ラクシヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させた。
得られる残分を真空デシケータ中、40℃で
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物d3.78
ｇ（理論量の92.1％）が得られ、これは、TLC
で示されるようにSS中で均質であつた。元素
分析及び実験式C14H23N7O4Brからの計算で、
次の値が得られた：Ｃ＝32.31％（32.77％）、
Ｈ＝4.59％（4.52％）、Ｎ＝19.47％（19.11％）
及びBr＝30.78％（31.14％） 1e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 化合物1d2.57ｇ（５ｍＭ）を新しく蒸溜した
DMF20ml中に溶かし、溶液を−10℃まで冷却
し、この溶液に、撹拌下にEt3N0.70ml（５ｍ
Ｍ）を加えた。形成されたEt3N・HBrを濾去
し、少量のDMFで洗洗浄した。濾液に、Cbo
−Ｄ−Leu−OpNP2.13ｇ（5.5ｍＭ）を−10℃
で、撹拌下に加えた。反応混合物を、湿気の不
存在下に２〜３時間反応させたら、この際、反
応溶液の温度は徐々に約20℃に達した。溶液を
再び−10℃まで冷却し、Et3N0.35ml（2.5ｍＭ）
で緩衝させた。反応溶液を約−20℃で約２時
間、かつ室温で更に３時間反応させた。この工
程を、Et3N0.35mlを用いて繰り返し、16時間
後に反応溶液を真空中、50℃で濃縮させた。残
分を50％AcOH50ml中に溶かし、50％AcOHで
平衡にしたセフアデツクスＧ−15のカラム上で
のゲル濾過により精製した。トリプトシンでの
処理によりｐ−ニトロアニリンを生じながら分
解したAcOH溶離液のフラクシヨンを真空中、
40℃で濃縮乾燥させた。残分をMeOH100ml中
に溶かし、溶液を再び濃縮乾固させた。生じる
残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5で乾燥
させると、無定形化合物1e3.08ｇ（理論量の
90.6％）が得られ、これはTLCで示されるよう
にSS中で均質であつた。元素分析及び実験式
C28H39N8O7Brからの計算により次の値が得ら
れた：Ｃ＝49.06％（49.49％）、Ｈ＝5.82％
（5.78％）、Ｎ＝16.85％（16.49％）、及びBr＝
11.59％（11.76％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ
酸の存在を確認した： Gly：1.00−DLeu：0.99−Arg：0.97。Rf＝
0.62 Rf値は、シリカゲルプレート（Merck No.
254）上で、ｎ−ブタノール：氷酢酸：水＝
３：１：１を用いて測定した。23〜25℃、８〜
10cmの展開距離で展開した。スポツトはUV−
線で、沃素蒸気で、かつ引続くトリプシン水溶
液の吹き付けにより可視にした。すべての生成
物は、これらの可視化により、１個の固有のス
ポツトを示した。トリプシン水溶液での処理の
際に、トリペプチド誘導体の発色性又は螢光性
基は分解されて、肉眼又はUV線で観察できる
分解生成物の色が現われた。本発明によるトリ
ペプチド誘導体は、加熱時に焼結されるので、
厳密な融点を有しない。 例 ２（製造例） Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・HBr 2b 2HBr・Ｈ−Arg−MCA 市販のCbo−Arg−MCA・HCl13.0ｇ（25.9
ｍＭ）を、氷酢酸中の2NHBrの溶液104ml
（208ｍＭ）を用いて、例1bの方法で分解させ
た。乾燥残分をMeOH400ml中に溶かし、セフ
アデツクスLH−20のカラム上で精製した。ト
リプシンでの処理により４−メチル−７−アミ
ノ−クマリンの形成を伴なつて分解した
MeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30℃で
濃縮乾燥させた。生じる残分を、真空中、40℃
でP2O5上で乾燥させると、無定形化合物
2b11.2ｇ（理論量の87.7％）が得られ、これ
は、TLCで示されるようにSS中で均質であつ
た。元素分析及び実験式C16H23N5O3Br2から
の計算により次の値が得られた：Ｃ＝39.40％
（38.90％）、Ｈ＝4.61％（4.70％）、Ｎ＝14.48％
（14.20％）及びBr＝31.90％（32.40％）。 2c Cbo−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2b4.93ｇ（10ｍＭ）及びCbo−Gly−
OpNP3.65ｇ（11ｍＭ）を新しく蒸溜した
DMF75mlに加えた。−10℃に冷却の後に、撹拌
しながら、まずEt3N1.40ml（10ｍＭ）、次いで
0.70ml（５ｍＭ）を添加した。混合物を湿気の
不存在下に、まず−10℃で３時間、次いで室温
で４時間反応させた。反応溶液を再び−10℃ま
で冷却し、Et3N0.70mlで緩衝させ、20℃で１
夜撹拌した。反応混合物を真空中、50℃で濃縮
乾燥させた。残分を50％AcOH200ml中に溶か
し、セフアデツクスＧ−15のカラム上で精製し
た。トリプシンでの処理により４−メチル−７
−アミノ−クマリンを形成しながら分解した
AcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40℃で濃
縮乾燥させた。このようにして得られた残分を
真空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥させ
ると、無定形化合物2c4.98ｇ（理論量の82.5
％）が得られ、これはTLCで示されるように
SS中で均質であつた。元素分析及び実験式
C26H31N6O6Brから計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝51.48％（51.75％）、Ｈ＝5.24％
（5.18％）、Ｎ＝13.70％（13.93％）、及びBr＝
13.14％（13.24％）。 2d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−MCA 化合物2c4.83ｇ（８ｍＭ）を氷酢酸中の
2NHBr32mlを用いて例1d記載の方法で分解さ
せた。生じる粗生成物をMeOH100ml中に溶か
し、セフアデツクスLH−20のカラム上で精製
した。トリプシンでの処理により４−メチル−
７−アミノ−クマリンの形成下に分解した
MeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30℃で
濃縮乾燥させた。得られた残分を真空デシケー
タ中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、無定
形化合物2d4.05ｇ（理論量の92.0％）が得ら
れ、これはTLCによればSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C18H26N6O4Br2から計算
により次の値が得られた：Ｃ＝39.02％（39.29
％）、Ｈ＝4.78％（4.76％）、Ｎ＝15.39％
（15.27％）及びBr＝28.72％（29.04％）。 2e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−MCA・HBr 化合物2d2.75ｇ（５ｍＭ）を例1e記載の方法
でCbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13ｇ（5.5ｍＭ）と
反応させた。生じた粗製化合物を50％AcOH75
ml中に溶かし、セフアデツクスＧ−15のカラム
上で精製した。トリプシンでの処理により４−
メチル−７−アミノ−クマリンの形成下に分解
したAcOH溶離液フラクシヨンを真空中、40℃
で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
60℃でP2O5上で乾燥させると、無定形化合物
2e2.91ｇ（理論量の81.2％）が得られ、これ
は、TLCで示すようにSS中で均質であつた。
元素分析及び実験式C32H42N7O7Brから計算に
より、次の値が得られた：Ｃ＝53.13％（53.63
％）、Ｈ＝6.01％（5.91％）、Ｎ＝13.91％
（13.68％）及びBr＝10.88％（11.15％）。 アミノ酸分析は、正確な割合での予想アミノ
酸の存在を確認した： Gly：1.00−Leu：1.20−Arg：0.98。Rf＝
0.64 例 ３（参考例） Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−DPA・HBr 3a Cbo−Arg−DPA・HCl 乾燥Cbo−Arg−OH・HCl34.48ｇ（0.1モ
ル）を1000ml三頚フラスコ中で、新しく蒸溜し
た無水DMF150mlと無水THF300mlとの混合物
中に20℃で溶かした。−10℃に冷却したこの溶
液に、撹拌下に、湿気不存在下にEt3N10.2ｇ
（0.1モル）を添加した。次いで、この混合物に
THF50ml中のクロルギ酸イソブチル13.65ｇ
（0.1モル）の溶液を20分かかつて滴加し、この
際は、決して−５℃を越えなかつた。−10℃〜
−５℃の温度での10分間の付加的反応の後に、
DMF75ml中の５−アミノ−イソフタル酸ジメ
チル20.92ｇ（0.1モル）の溶液を反応混合物に
30分かかつて滴加し、この際、反応温度を常に
−５℃以下に保持した。反応混合物を−５℃で
更に１時間反応させた。次いで20℃で１夜撹拌
し、引続きEt3N・HClを結晶させるために、−
15℃に冷却した。形成されたEt3N・HClを濾
取し、少量の冷DMFで洗浄した。濾液及び洗
浄液を真空中、50℃で濃縮した。残分を50％
AcOH1000ml中に溶かし、50％AcOHで平衡に
したセフアデツクスＧ−15のカラム上でのゲル
濾過により精製した。トリプシンでの処理によ
り５−アミノ−イソフタル酸ジメチルを形成し
なから分解したAcOH溶離液フラクシヨンを真
空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシ
ケータ中、50℃で、P2O5上で乾燥させると、
無定形化合物3a24.6ｇ（理論量の45.9％）が得
られ、これはTLCで示されるようにSS中で均
質であつた。元素分析及び実験式
C24H30N5O7Clから計算して、次の値が得られ
た：Ｃ＝53.21％（53.78％）、Ｈ＝5.71％（5.64
％）、Ｎ＝13.20％（13.07％）及びCl＝6.52％
6.62％）。 3b 2HBr・Ｈ−Arg−DPA 化合物3a21.44ｇ（40ｍＭ）を例1b記載のよ
うに分解した。慣用の処理の後に、生じた粗生
成物をMeOH250ml中に溶かし、セフアデツク
スLH−20のカラム上でのゲル濾過により精製
した。トリプシンでの処理により５−アミノ−
イソフタル酸ジメチルを形成しながら分解した
MeOH溶離液フラクシヨンを真空中で乾燥さ
せた。残分を真空デシケータ中、40℃で、
P2O5上で乾燥させると、無定形化合物3bが得
られ、これは、TLCで示されるようにSS中で
均質であつた。元素分析及び実験式
C16H25N5O5Br2から計算して、次の値が得ら
れた：Ｃ＝36.82％（36.45％）、Ｈ＝4.67％
（4.78％）、Ｎ＝13.45％（13.28％）及びBr＝
29.85％（30.31％）。 3c Cbo−Gly−Arg−DPA・HBr 化合物3b5.27ｇ（10ｍＭ）を例1c記載の方法
でCbo−Gly−OpNP3.65ｇ（11ｍＭ）と反応
させた。慣用の処理の後に得られた粗生成物を
50％AcOH200ml中に溶かし、セフアデツクス
Ｇ−15のカラム上で精製した。トリプシンでの
処理により５−アミノ−イソフタル酸ジメチル
を形成下に分解したAcOH溶離液フラクシヨン
を真空中で、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真
空デシケータ中60℃で、P2O5上で乾燥させる
と、無定形化合物3c5.29ｇ（理論量の83.0％）
が得られ、これは、TLCで示されるようにSS
中で均質であつた。元素分析及び実験式
C26H33N6O8Brから計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝48.50％（48.99％）、Ｈ＝5.28％
（5.22％）、Ｎ＝12.92％（13.18％）及びBr＝
12.33％（12.53％）。 3d 2HBr・Ｈ−Gly−Arg−DPA 化合物3c5.10ｇ（８ｍＭ）例1d記載の方法で
氷酢酸中の2NHBr32mlを用いて分解した。慣
用処理の後に得られた粗生成物をMeOH100ml
中に溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム
上で精製した。トリプシンでの処理により５−
アミノ−イソフタル酸ジメチルの形成下に分解
したMeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30
℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、40℃でP2O5上で乾燥させると、無定形化
合物3d4.25ｇ（理論量の90.9％）が得られ、こ
れは、TLCで示されるようにSS中で均質であ
つた。元素分析及び実験式C18H28N6O6Br2か
ら計算により、次の値が得られた：Ｃ＝36.85
％（37.00％）、Ｈ＝4.90％（4.83％）、Ｎ＝
14.72％（14.38％）及びBr＝26.95％（27.3％）。 3e Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−DPA−HBr 化合物3d2.92ｇ（５ｍＭ）を例1e記載の方法
でCbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13ｇ（5.5ｍＭ）と
反応させた。慣用処理の後に得られた粗生成物
を50％AcOH100ml中に溶かし、セフアデツク
スＧ−15のカラム上で精製した。トリプシンで
の処理により５−アミノ−イソフタル酸ジメチ
ルの形成下に分解したAcOH溶離液フラクシヨ
ンを真空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真
空デシケータ中、60℃でP2O5上で乾燥させる
と、無定形化合物3e3.11ｇ（理論量の82.9％）
が得られ、これは、TLCで示されるようにSS
中で均質であつた。元素分析及び実験式
C32H44N7O9Brから計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝50.88％（51.20％）、Ｈ＝5.99％
（5.91％）、Ｎ＝13.26％（13.06％）及びBr＝
10.48％（10.64％）。 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ
酸の存在を確認した： Gly：1.00−Leu：1.00−Arg：0.97、Rf＝
0.68 例 ４（製造例） Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−２−NA・HBr 4b 2HBr・Ｈ−Arg−２−NA 市販のCbo−Arg−２・NA・HCl9.40ｇ（20
ｍＭ）を、例1bに記載の方法で氷酢酸中の
2NHBr80mlの溶液を用いて分解した。慣用の
処理の後に得られた生成物をMeOH150ml中に
溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム上で
精製した。トリプシンでの処理により２−ナフ
チルアミンの形成下に分解したMeOH溶離液
フラクシヨンを真空中、30℃で濃縮乾燥させ
た。残分を真空デシケータ中、40℃で、P2O5
上で乾燥させると、無定形化合物4b8.60ｇ（理
論量の93.2％）が得られ、これは、TLCで示さ
れるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C16H23N5OBr2からの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝42.08％（41.67％）、Ｈ
＝5.12％（5.03％）、Ｎ＝14.68％（15.19％）及
びBr＝33.96％（34.65％）。 4c Cbo−Sar−Arg−２−NA・HBr 化合物4b4.6ｇ（10ｍＭ）を例1c記載の方法
でCbo−Sar−OpNP3.80ｇ（11ｍＭ）と反応
させた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50
％AcOH150ml中に溶かし、セフアデツクスＧ
−15のカラム上で精製した。トリプシンでの処
理により２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たAcOH溶離液フラクシヨンを真空中で、40℃
で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
60℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合
物4c4.95ｇ（理論量の84.5％）が得られ、これ
は、TLCで示されるように、SS中で均質であ
つた。元素分析及び実験式C27H33N6O4Brから
計算して、次の値が得られた：Ｃ＝55.72％
（55.39％）、Ｈ＝6.73％（5.68％）、Ｎ＝14.68％
（14.35％）及びBr＝13.42％（13.65％）。 4d 2HBr・Ｈ−Sar−Arg−２−NA 化合物4c4.68ｇ（８ｍＭ）を例1dに記載の方
法で、氷酢酸中の2NHBr28mlを用いて、分解
した。慣用処理の後に得られた粗生成物を
MeOH100ml中に溶かし、セフアデツクスLH
−20のカラム上で精製した。トリプシンでの処
理により２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たMeOH溶離液フラクシヨンを真空中、30℃
で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ中、
40℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形化合
物4d4.08ｇ（理論量の95.8％）が得られ、これ
は、TLCで示されるようにSS中で均質であつ
た。元素分析及び実験式C19H28N6O2Br2から
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝43.9％
（42.87％）、Ｈ＝5.32％（5.30％）、Ｎ＝16.02％
（15.79％）及びBr＝29.68％（30.02％）。 4e Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−２−NA・HBr 化合物4d2.66ｇ（５ｍＭ）を例1eに記載の方
法で、Cbo−Ｄ−Leu−Op−NP2.13ｇ（5.5ｍ
Ｍ）と反応させた。慣用処理により得た粗生成
物を50％AcOH100ml中に溶かし、セフアデツ
クスＧ−15のカラム上で精製した。トリプシン
での処理により２−ナフチルアミンの形成下に
分解したAcOH溶離液の最初の主フラクシヨン
を真空中、40℃で濃縮乾燥させ、真空デシケー
タ中、60℃で、P2O5上で乾燥させた。こうし
て無定形化合物4e3.01ｇ（理論量の86.2％）が
得られ、これは、TLCで示されるように、SS
中で均質であつた。元素分析及び実験式
C33H44N7O5Brから計算により、次の値が得ら
れた：Ｃ＝57.05％（56.73％）、Ｈ＝6.40％
（6.35％）、Ｎ＝14.30％（14.03％）及びBr＝
11.12％（11.44％）。 アミノ酸分析は、予想アミノ酸が正しい割合
で存在することを確認した： Sar：1.00−Leu：1.02−Arg：0.97、Rf＝
0.66 例 ５（製造例） Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−４−MeO−２−
NA・HBr 4b 2HBr・Ｈ−Arg−４−MeO−２−NA 市販のCbo−Arg−４−MeO−２−NA・
HCl10.0ｇ（20ｍＭ）を例1bに記載の方法で氷
酢酸中の2NHBr80mlを用いて分解した。慣用
処理の後に得られた粗生成物をMeOH150ml中
に溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム上
で精製した。トリプシンでの処理により４−メ
トキシ−２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たMeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、
30℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、P2O5上で乾燥させると、無定形化合物
5b8.98ｇ（理論量の91.4％）が得られ、これ
は、TLCで示されるようにSS中で均質であつ
た。元素分析及び実験式C17H25N5O2Br2から
の計算により、次の値が得られた：Ｃ＝41.22
％（41.57％）、Ｈ＝5.19％（5.13％）、Ｎ＝
14.40％（14.26％）及びBr＝32.01％（32.53
％）。 5c Cbo−Sar−Arg−４−MeO−２−NA・
HBr 化合物5b4.91ｇ（10ｍＭ）例1c記載の方法で
Cbo−Sar−OpNP3.80ｇ（11ｍＭ）と反応さ
せた。慣用処理の後に得られた粗生成物を50％
AcOH中に溶かし、セフアデツクスＧ−15のカ
ラムで精製した。トリプシンでの処理により４
−メトキシ−２−ナフチルアミンの形成下に分
解したAcOH溶離液の最初の主フラクシヨンを
真空中、40℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デ
シケータ中、60℃で、P2O5上で乾燥させると、
無定形化合物5c4.86ｇ（理論量の79.0％）が得
られ、これは、TLCにより示されるように、
SS中で均質であつた。元素分析及び実験式
C28H35N6O5Brから計算により次の値が得られ
た：Ｃ＝54.38％（54.64％）、Ｈ＝5.81％（5.73
％）、Ｎ＝13.93％（13.65％）及びBr＝12.75％
（12.98％）。 5d 2HBr・Ｈ−Sar−Arg−４−MeO−２−
NA 化合物5c4.31ｇ（７ｍＭ）を例1dに記載の方
法で氷酢酸中の2NHBr28mlで分解した。慣用
の処理の後に得られた粗生成物をMeOH100ml
中に溶かし、セフアデツクスLH−20のカラム
で精製した。トリプシンでの処理により４−メ
トキシ−２−ナフチルアミンの形成下に分解し
たMeOH溶離液の主フラクシヨンを真空中、
30℃で濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、40℃で、P2O5上で乾燥させると、無定形
化合物5d3.74ｇ（理論量の95.0％）が得られ、
これはTLCで示されるようにSS中で均質であ
つた。元素分析及び実験式C20H30N6O3Br2か
らの計算により次の値が得られた：Ｃ＝43.01
％（42.72％）、Ｈ＝5.44％（5.38％）、Ｎ＝
15.25％（14.95％）及びBr＝28.03％（28.42
％）。 アミノ酸分析は、正しい割合での予想アミノ
酸の存在を確認した： Sar：1.00−Leu：1.01−Arg：0.98 5e Cbo−Ｄ−Leu−Sar−Arg−４−MeO−２
−NA・HBr 化合物5d2.81ｇ（５ｍＭ）を例1eに記載の方
法でCbo−Ｄ−Leu−OpNP2.13ｇ（5.5ｍＭ）
と反応させた。慣用処理の後に得られた粗生成
物を50％AcOH125ml中に溶かし、セフアデツ
クスＧ−15のカラムで精製した。トリプシンで
の処理により４−メトキシ−２−ナフチルアミ
ンの形成下に分解したAcOH溶離液の最初の主
フラクシヨンを、真空中、40℃で濃縮乾燥させ
た。残分を真空デシケータ中、60℃でP2O5上
で乾燥させると、無定形化合物5e2.98ｇ（理論
量の81.8％）が得られ、これはTLCで示される
ようにSS中で均質であつた。元素分析及び実
験式C34H46N7O6Brから計算して、次の値が得
られた：Ｃ＝56.28％（56.04％）、Ｈ＝6.34％
（6.36％）、Ｎ＝13.75％（13.46％）及びBr＝
10.68％（10.97％）。Rf＝0.65 例 ６（製造例） Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH Cbo−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr（例１
で製造した）6.80ｇ（10ｍＭ）を60％MeOH水75
ml中に溶かした。溶液をアセテート型のアンバー
ライトJRA−401のカラム上に注いだ。このカラ
ムを60％MeOH水を用いて溶離させ、HBrをイ
オン交換によりAcOHで換えた。溶離液を真空
中、40℃で濃縮乾燥させた。真空デシケータ中、
40℃で、P2O2上で乾燥の後にブロミド不含のCbo
−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・AcOH6.62ｇ
（理論量の6.62ｇ）が得られた。他の有機酸例え
ばギ酸、プロピオン酸、蓚酸、酒石酸、クエン
酸、乳酸、安息香酸、クロル安息香酸、サリチル
酸又はフタル酸との塩も同じ方法で前記トリペプ
チド誘導体から製造することができる。イオン交
換体は例えば塩酸塩の形のアンバーライトJRA
−401であつてよく、所望の酸塩の形は前記イオ
ン交換体を苛性ソーダ溶液で処理し、次いで、60
％MeOH水中の所望の有機酸とそのナトリウム
塩との１：１−混合物の溶液で処理することによ
り塩基性OH型に変えることができる。 例 ７（製造例） Tos−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr 2HBr−Ｈ・Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA（第３
表例7fに記載の方法で製造）6.26ｇ（10ｍＭ）を
蒸溜したDMF30ml中に溶かした。溶液を−15℃
に冷却し、湿気の不存在下に撹拌しながらまず
Et3N2.80ml（20ｍＭ）かつその後直ちに塩化ト
ジル1.91ｇ（10ｍＭ）を添加した。−15℃での約
２〜３時間の反応時間の後に、反応混合物を、室
温で更に１夜反応させた。反応混合物を再び−15
℃に冷却した。Et3N・HBrとEt3N・HClとの沈
殿混合物を濾去し、少量の冷DMFで洗浄した。
濾液及び洗浄液を集め、真空中50℃で濃縮乾燥さ
せた。残分を50％AcOH75ml中に溶かした。溶液
を50％AcOHで平衡にしたセフアデツクスＧ−15
のカラムで精製させた。トリプシンでの処理によ
りｐ−ニトロアニリンの形成下に分解したAcOH
溶離液の主フラクシヨンを真空中で、40℃で濃縮
乾燥させた。残分をMeOH100ml中に溶かし、溶
液を再び濃縮乾燥させた。残分を真空デシケータ
中、60℃でP2O5上で乾燥させると、無定形化合
物Tos−Ｄ−Leu−Gly−Arg−pNA・HBr6.65
ｇ（理論量の95.0％）が得られ、これはTLCで示
されるようにSS中で均質であつた。元素分析及
び実験式C27H39N8SO7Brからの計算により、次
の値が得られた：Ｃ＝46.85％（46.35％）、Ｈ＝
5.66％（5.62％）、Ｎ＝16.28％（16.02％）、Ｓ＝
4.43％（4.58％）及びBr＝11.22％（11.42％）。Rf
＝0.64 アシル化剤としての塩化トジルを用いる代り
に、相応する量の塩化アセチル、塩化ブチリル、
塩化オクタノイル、安息香酸クロリド、ｐ−メチ
ル安息香酸クロリド、２−クロル安息香酸クロリ
ド、メタンスルホニルクロリド、ｎ−ブタンスル
ホニルクロリド、ベンゼンスルホニルクロリド、
α−ナフタリンスルホニルクロリド、クロルギ酸
メチル、クロルギ酸イソブチル、クロルギ酸オク
チル、無水安息香酸、無水酢酸、フエニル酢酸−
OpNP、フエニルプロピオン酸−OpNP、シクロ
ヘキシルカルボン酸−OpNP、Ｎ−Cbo−４−ア
ミノメチルシクロヘキシルカルボン酸−OpNP、
Ｎ−Cbo−ω−アミノ−ｎ−酪酸−OpNP、Ｎ−
Cbo−ω−アミノオクタノイツク酸−OpNP又は
Ｎ−Cbo−４−アミノメチル安息香酸−OpNPも
使用できる。
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】
【表】 本発明のトリペプチド誘導体の第ａ因子に対
する感受性を次の第４表で数値的に説明し、公知
文献の基質Bz−Ile−Glu（γ−OH）−Gly−Arg
−pNA・HClと比較した：
【表】
【表】
【表】
【表】 第４表に記載の第ａ因子活性の値は、次に記
載の方法で実験的に測定した： ウシ第ａ因子の活性を測定するために、PH
8.4及びイオン濃度0.3を有するTRIS−イミダゾ
ール緩衝液1.8mlを37℃で、水0.5ml中のバイアル
の内容物の溶解により得た第ａ因子製剤ダイア
ゲン（供給者：Diagnostic Reagents Ltd.
Thame英国）の水溶液0.025mlと充分に混合し
た。この混合物に、本発明の基質２×10-3M水溶
液0.2mlを添加した。その後、１分当りの分解生
成物の量（ナノモル）を測定し、第ａ因子１ml
に対する相応する値を計算した。 ヒト第ａ因子の活性測定のために、正常のク
エン酸処理した血漿0.01mlをPH8.4及びイオン濃
度0.3を有し、１ml当りCaCl215ミリモルを含有す
るTRIS−イミダゾール緩衝液中のラツセルまむ
し毒の溶液0.20mlと混合した。混合物を、血漿中
に存在する第因子を活性化し、これを完全に第
ａ因子に変えるために、37℃で75秒間インキユ
ベートした。このインキユベート物に、まず、37
℃に加熱したTRIS−イミダゾール緩衝液（PH
8.4、イオン濃度0.3）を、次いで本発明の基質の
２×10-3M水溶液0.40mlを加えた。その後１分当
りの形成された分解生成物Ｈ−R5の量（ナノモ
ル）を測定し、クエン酸処理した血漿１mlに対す
る相応する値を計算した。

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １ 第ａ−因子を含有する媒体中又は第ａ−
    因子が形成されるか又は消費される媒体中の第
    ａ−因子を定量分析するために、前記媒体を式： 〔式中R1は炭素原子数２〜８を有し、ω−位に
    アミノ基を有していてよいアルカノイル基、アル
    カノイル中に炭素原子数２〜４を有し、そのフエ
    ニル基はｐ−位でアミノ基で置換されていてよい
    フエニルアルカノイル基、４−位でアミノメチル
    基で置換されていてよいシクロヘキシルカルボニ
    ル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミノ又はハロ
    ゲンで置換されていてよいベンゾイル基、アルコ
    キシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシ
    カルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩
    素で置換されていてよいベンジルオキシカルボニ
    ル基、炭素原子数１〜４のアルカンスルホニル
    基、ｐ−位でメチル化されていてよいフエニルス
    ルホニル基又はα−又はβ−ナフチルスルホニル
    基を表わし、 R2は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝
    鎖のアルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシ
    アルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２及び
    アルコキシ中の炭素原子数１〜４を有するアルコ
    キシアルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２
    を有するベンジルオキシアルキル基、アルキル中
    の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコキシ基は
    直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω−
    カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニ
    ルアルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３
    を有するω−ベンジルオキシカルボニルアルキル
    基又はシクロヘキシル−、シクロヘキシルメチル
    −、４−ヒドロキシシクロヘキシルメチル−、フ
    エニル−、ベンジル−、４−ヒドロキシベンジル
    −又はイミダゾール−４−イル−メチル基を表わ
    し、 R3は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖
    又は分枝鎖のアルキル基を表わし、 R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カルボ
    キシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１
    −スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナ
    フチルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミ
    ノ、キノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キ
    ノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマル−
    ７−イル−アミノを表わす〕のトリペプチド誘導
    体（但し、R1がベンジルオキシカルボニルで、
    R2がイソプロピル又はシクロヘキシルであるト
    リペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩と反
    応させ、分光法、スペクトル分光法、螢光分光法
    又は電子化学的方法で、トリペプチド誘導体上の
    第ａ−因子の接触的加水分解作用による単位時
    間当りに形成される着色又は螢光性分解生成物Ｈ
    −R5の量を測定することを特徴とする、媒体中
    の第ａ−因子を定量分析する方法。 ２ R5がｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カル
    ボキシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、
    １−スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミノ又は８−
    ニトロキノン−５−イル−アミノ基である場合
    に、分解生成物Ｈ−R5を、測定の前に、ジアゾ
    化合物とのカツプリングにより、より強く着色さ
    れた化合物に変えることを特徴とする、特許請求
    の範囲第１項記載の方法。 ３ ヒト又は温血動物の血漿を、血漿中に存在す
    る不活性第Ｘ因子を定量的に活性第ａ−因子に
    変えるために、ラツセルまむし毒（RVV）又は
    トロンボプラスチン試薬で処理し、この活性化さ
    れた血漿を緩衝液中の前記トリペプチド誘導体と
    反応させ、トリペプチド誘導体から、第ａ−因
    子の作用により形成された単位時間当りの分解生
    成物Ｈ−R5の量を測定することを特徴とする、
    特許請求の範囲第１項記載の方法。 ４ R5がｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カル
    ボキシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、
    １−スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミノ又は８−
    ニトロキノン−５−イル−アミノ基である場合
    に、分解生成物Ｈ−R5を、測定の前に、ジアゾ
    化合物とのカツプリングにより、より強く着色さ
    れた化合物に変えることを特徴とする、特許請求
    の範囲第３項記載の方法。 ５ ヘパリン処理した血漿水のヘパリンを第ａ
    −因子を経て定量分析するために、予備測定した
    第ａ−因子の量を緩衝液系中で血漿と共にイン
    キユベートし、中和されていない第ａ−因子を
    式： 〔式中R1は炭素原子数２〜８を有し、ω−位に
    アミノ基を有していてよいアルカノイル基、アル
    カノイル中に炭素原子数２〜４を有し、そのフエ
    ニル基はｐ−位でアミノ基で置換されていてよい
    フエニルアルカノイル基、４−位でアミノメチル
    基で置換されていてよいシクロヘキシルカルボニ
    ル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミノ又はハロ
    ゲンで置換されていてよいベンゾイル基、アルコ
    キシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシ
    カルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩
    素で置換されていてよいベンジルオキシカルボニ
    ル基、炭素原子数１〜４のアルカンスルホニル
    基、ｐ−位でメチル化されていてよいフエニルス
    ルホニル基又はα−又はβ−ナフチルスルホニル
    基を表わし、 R2は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝
    鎖のアルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシ
    アルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２及び
    アルコキシ中の炭素原子数１〜４を有するアルコ
    キシアルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２
    を有するベンジルオキシアルキル基、アルキル中
    の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコキシ基は
    直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω−
    カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニ
    ルアルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３
    を有するω−ベンジルオキシカルボニルアルキル
    基又はシクロヘキシル−、シクロヘキシルメチル
    −、４−ヒドロキシシクロヘキシルメチル−、フ
    エニル−、ベンジル−、４−ヒドロキシベンジル
    −又はイミダゾール−４−イル−メチル基を表わ
    し、 R3は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖
    又は分枝鎖のアルキル基を表わし、 R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カルボ
    キシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１
    −スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナ
    フチルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミ
    ノ、キノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キ
    ノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマル−
    ７−イル−アミノを表わす〕のトリペプチド誘導
    体（但し、R1がベンジルオキシカルボニルで、
    R2がイソプロピル又はシクロヘキシルであるト
    リペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩と反
    応させて中和されていない第ａ−因子の量を測
    定し、最初に使用した第ａ−因子の量と残留第
    ａ−因子の量との間の差からヘパリン濃度を測
    定することを特徴とするヘパリン含有血漿中のヘ
    パリンの定量分析法。 ６ R5がｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カル
    ボキシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、
    １−スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミノ又は８−
    ニトロキノン−５−イル−アミノ基である場合
    に、分解生成物Ｈ−R5を、測定の前に、ジアゾ
    化合物とのカツプリングにより、より強く着色さ
    れた化合物に変えることを特徴とする、特許請求
    の範囲第５項に記載の方法。 ７ ヒト血漿中の第Xa−抗因子を第ａ−因子
    を経て定量分析するために、一方で、クエン酸処
    理した血漿を緩衝液溶液で稀釈することにより被
    検試料を調製し、ヘパリン及び次いで第ａ−因
    子をこの稀溶液に添加し、混合物に、式： 〔式中R1は炭素原子数２〜８を有し、ω−位に
    アミノ基を有していてよいアルカノイル基、アル
    カノイル中に炭素原子数２〜４を有し、そのフエ
    ニル基はｐ−位でアミノ基で置換されていてよい
    フエニルアルカノイル基、４−位でアミノメチル
    基で置換されていてよいシクロヘキシルカルボニ
    ル基、ｏ−又はｐ−位でメチル、アミノ又はハロ
    ゲンで置換されていてよいベンゾイル基、アルコ
    キシ基中の炭素原子数１〜８を有するアルコキシ
    カルボニル基、ｐ−位でメトキシ、メチル又は塩
    素で置換されていてよいベンジルオキシカルボニ
    ル基、炭素原子数１〜４のアルカンスルホニル
    基、ｐ−位でメチル化されていてよいフエニルス
    ルホニル基又はα−又はβ−ナフチルスルホニル
    基を表わし、 R2は炭素原子数１〜６を有する直鎖又は分枝
    鎖のアルキル基、炭素原子数１〜２のヒドロキシ
    アルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２及び
    アルコキシ中の炭素原子数１〜４を有するアルコ
    キシアルキル基、アルキル中の炭素原子数１〜２
    を有するベンジルオキシアルキル基、アルキル中
    の炭素原子数１〜３を有し、そのアルコキシ基は
    直鎖又は分枝鎖で炭素原子数１〜４を有するω−
    カルボキシアルキル又はω−アルコキシカルボニ
    ルアルキル基及びアルキル中に炭素原子数１〜３
    を有するω−ベンジルオキシカルボニルアルキル
    基又はシクロヘキシル−、シクロヘキシルメチル
    −、４−ヒドロキシシクロヘキシルメチル−、フ
    エニル−、ベンジル−、４−ヒドロキシベンジル
    −又はイミダゾール−４−イル−メチル基を表わ
    し、 R3は水素又は炭素原子数１〜４を有する直鎖
    又は分枝鎖のアルキル基を表わし、 R5はｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カルボ
    キシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、１
    −スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、β−ナフチルアミノ、４−メトキシ−β−ナ
    フチルアミノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミ
    ノ、キノン−５−イル−アミノ、８−ニトロ−キ
    ノン−５−イル−アミノ、４−メチル−クマル−
    ７−イル−アミノを表わす〕のトリペプチド誘導
    体（但し、R1がベンジルオキシカルボニルで、
    R2がイソプロピル又はシクロヘキシルであるト
    リペプチド誘導体を除く）又は酸とのその塩を添
    加し、他方で、同様な方法であるが、稀釈血漿の
    代りに同量の緩衝液を用い、分解生成物Ｈ−R5
    の形成により生ぜしめられた１分当りの光学密度
    の増加を測定し、第ａ−抗因子ヘパリン錯体に
    より抑制された第ａ−因子の量を、かつこれか
    ら、血漿中に存在する第ａ−抗因子の量を、１
    分当りの盲検試料の光学密度の増加と、１分当り
    の被検試料の光学密度の増加との間の差から測定
    することを特徴とする、ヒト血漿中の第Xa−抗
    因子の定量分析法。 ８ R5がｐ−ニトロフエニルアミノ、１−カル
    ボキシ−２−ニトロフエン−５−イル−アミノ、
    １−スルホ−２−ニトロフエン−５−イル−アミ
    ノ、５−ニトロ−α−ナフチル−アミノ又は８−
    ニトロキノン−５−イル−アミノ基である場合
    に、分解生成物Ｈ−R5を、測定の前に、ジアゾ
    化合物とのカツプリングにより、より強く着色さ
    れた化合物に変えることを特徴とする、特許請求
    の範囲第６項記載の方法。
JP60299814A 1980-02-12 1985-12-28 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法 Granted JPS63300A (ja)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH113080 1980-02-12
CH1130/80-1 1980-02-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JPS63300A JPS63300A (ja) 1988-01-05
JPH0253040B2 true JPH0253040B2 (ja) 1990-11-15

Family

ID=4203192

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP56500604A Expired - Lifetime JPH032879B2 (ja) 1980-02-12 1981-02-06
JP60299814A Granted JPS63300A (ja) 1980-02-12 1985-12-28 媒体中の第Ｘａ−因子、ヘパリン又は第Ｘａ−抗因子を定量分析する方法

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP56500604A Expired - Lifetime JPH032879B2 (ja) 1980-02-12 1981-02-06

Country Status (13)

Country Link
US (2) US4440678A (ja)
EP (1) EP0034122B1 (ja)
JP (2) JPH032879B2 (ja)
AT (1) ATE4702T1 (ja)
AU (1) AU581050B2 (ja)
CA (1) CA1161432A (ja)
DE (1) DE3160903D1 (ja)
DK (1) DK154221C (ja)
ES (1) ES8302780A1 (ja)
IL (1) IL62096A (ja)
NO (1) NO151787C (ja)
WO (1) WO1981002294A1 (ja)
ZA (1) ZA81789B (ja)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8941631B2 (en) 2007-11-16 2015-01-27 Qualcomm Mems Technologies, Inc. Simultaneous light collection and illumination on an active display

Families Citing this family (32)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3244030A1 (de) * 1982-11-27 1984-05-30 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Chromogene verbindungen, verfahren zu ihrer herstellung und ihre verwendung
JPS59112952A (ja) * 1982-12-21 1984-06-29 Taisho Pharmaceut Co Ltd ペプチド誘導体
DE3311287A1 (de) * 1983-03-28 1984-10-04 Behringwerke Ag, 3550 Marburg Verfahren zur fotometrischen bestimmung der aktivierten partiellen thromboplastinzeit und reagenz dazu
DE3484912D1 (de) * 1983-06-03 1991-09-19 Pentapharm Ag Peptidderivate und deren verwendung als substrate zur quantitativen bestimmung von enzymen.
JPS60241900A (ja) * 1984-05-16 1985-11-30 Nitto Boseki Co Ltd 新規な第Ｘａ因子活性測定用基質
DE3504405A1 (de) * 1985-02-08 1986-08-14 Boehringer Mannheim Gmbh, 6800 Mannheim Bestimmung von prokallikrein
GB8504522D0 (en) * 1985-02-21 1985-03-27 Genetics Int Inc Electrochemistry of mediators
FI860043A7 (fi) * 1986-01-06 1987-07-07 Orion Yhtymae Oy Peptidisubstraatit sekä menetelmä endotoksiinin kvantitatiiviseksi määrittämiseksi.
SE8601327D0 (sv) * 1986-03-21 1986-03-21 Kabivitrum Ab Nya peptidderivat
SE461494B (sv) * 1986-03-21 1990-02-19 Thorsman & Co Ab Faestanordning foer en elektrisk kopplingsdosa
EP0255341B1 (en) * 1986-07-29 1993-02-03 Sunstar Kabushiki Kaisha Reagent for testing periodontal diseases
DE3629175A1 (de) * 1986-08-28 1988-03-17 Behringwerke Ag Chromogene verbindungen, verfahren zu deren herstellung und ihre verwendung
US5110727A (en) * 1987-04-03 1992-05-05 Cardiovascular Diagnostics, Inc. Method for performing coagulation assays accurately, rapidly and simply, using dry chemical reagents and paramagnetic particles
US5115099A (en) * 1988-06-14 1992-05-19 Nitto Boseki Co., Ltd. Substrates for determination of enzyme activity and intermediates for synthesis of the substrates as well as process for producing the intermediates
JPH06104079B2 (ja) * 1988-07-14 1994-12-21 日東紡績株式会社 新規な酵素活性測定用基質
WO1990003577A1 (en) 1988-09-30 1990-04-05 The University Of Vermont And State Agricultural College Immunoassays for catalytically-active, serine proteases
US5320945A (en) * 1989-07-14 1994-06-14 Boehringer Mannheim Gmbh Method and reagent for the determination of antithrombin III
WO1991002813A1 (en) * 1989-08-17 1991-03-07 Baxter International Inc. Factor ix chromogenic assay
FR2658519B1 (fr) * 1990-02-19 1995-07-07 Serbio Substrats peptidiques pour identification du facteur xa.
US6348570B1 (en) * 1991-08-16 2002-02-19 Merck & Co., Inc. Chromophore containing compounds and their use in determining interleukin-1β convertase activity
US5308756A (en) * 1991-11-20 1994-05-03 Baxter Diagnostics Inc. Protein S chromogenic assay
US6087119A (en) * 1996-10-31 2000-07-11 Roche Diagnostics Gmbh Method for determining the catalytic activity of factor IXa
US6297024B1 (en) 1998-10-15 2001-10-02 Cell Activation, Inc. Methods for assessing complement activation
US6235494B1 (en) 1999-02-08 2001-05-22 The Scripps Research Institute Substrates for assessing mannan-binding protein-associated serine protease activity and methods using the substrates
ATE314386T1 (de) * 1999-02-23 2006-01-15 Pentapharm Ag Oligopeptidderivate zur elektrochemischen messung der aktivität von proteasen
WO2003022873A1 (de) * 2001-09-10 2003-03-20 Novel Science International Gmbh Organische verbindungen mit biologischer wirkung als thrombinhemmer und ihre verwendung
DE102005003145B4 (de) 2005-01-21 2006-10-19 Dade Behring Marburg Gmbh Stablies, chromogenes Flüssigreagenz und dessen Verwendung in gerinnungsdiagnostischen Tests
EP2333555A1 (de) 2009-12-09 2011-06-15 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Heterogener Gerinnungstest
EP2465941A1 (de) 2010-12-20 2012-06-20 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Verfahren zur simultanen Bestimmung mehrerer Gerinnungsproteasen
EP2484775A1 (de) 2011-02-07 2012-08-08 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Heparin-insensitives Verfahren zur Bestimmung von direkten Gerinnungsfaktorinhibitoren
EP2843416A1 (de) 2013-09-02 2015-03-04 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Kontroll- und Kalibratormaterial für die Bestimmung von direkten Antikoagulanzien
EP3348649A1 (de) 2017-01-16 2018-07-18 Siemens Healthcare Diagnostics Products GmbH Universales kontrollmaterial für gerinnungsfaktorinhibitor-teste

Family Cites Families (13)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
IL42124A (en) * 1972-05-02 1977-02-28 Kabi Ab Substrate for the determination of proteolytic enzymes
US4162941A (en) * 1974-12-05 1979-07-31 Ab Kabi Method for determining a proteolytic enzyme
SE407058B (sv) * 1974-12-05 1979-03-12 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
CH622286A5 (ja) * 1975-06-23 1981-03-31 Pentapharm Ag
SE407571B (sv) * 1975-07-11 1979-04-02 Kabi Ab Nya kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
US4137225A (en) * 1975-07-11 1979-01-30 Ab Kabi Novel chromogenic enzyme substrates
US4061625A (en) * 1975-07-11 1977-12-06 Ab Kabi Novel chromogenic thrombin substrates
SE419871B (sv) * 1975-12-01 1981-08-31 Pharmacia Ab Sett att bestemma aktiviteten hos faktor xa-inhibitor i blod
CH634662A5 (de) * 1976-05-28 1983-02-15 Pentapharm Ag Verwendung von tripeptidderivaten zur quantitativen bestimmung von plasminogen-aktivatoren.
SE437153B (sv) * 1976-12-01 1985-02-11 Kabi Ab Specifika kromogena enzymsubstrat for serinproteaser
SE7801373L (sv) * 1978-02-07 1979-08-08 Kabi Ab Lett spjelkbara substrat for kvantifiering av proteaser
US4275153A (en) * 1978-08-03 1981-06-23 American Hospital Supply Corporation Analytical fluorogenic substrates for proteolytic enzymes
US4229540A (en) * 1979-07-02 1980-10-21 Cutter Laboratories, Inc. Hydrolase purified from human plasma

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8941631B2 (en) 2007-11-16 2015-01-27 Qualcomm Mems Technologies, Inc. Simultaneous light collection and illumination on an active display

Also Published As

Publication number Publication date
IL62096A0 (en) 1981-03-31
JPS56501849A (ja) 1981-12-17
WO1981002294A1 (fr) 1981-08-20
AU581050B2 (en) 1989-02-09
DK154221C (da) 1989-05-22
US4440678A (en) 1984-04-03
AU5220486A (en) 1986-05-15
DE3160903D1 (en) 1983-10-27
NO151787B (no) 1985-02-25
US4480030A (en) 1984-10-30
CA1161432A (en) 1984-01-31
JPS63300A (ja) 1988-01-05
JPH032879B2 (ja) 1991-01-17
EP0034122A1 (de) 1981-08-19
EP0034122B1 (de) 1983-09-21
ZA81789B (en) 1982-03-31
NO151787C (no) 1985-06-05
ES499343A0 (es) 1983-01-16
IL62096A (en) 1986-09-30
DK451981A (da) 1981-10-12
ATE4702T1 (de) 1983-10-15
DK154221B (da) 1988-10-24
NO813418L (no) 1981-10-09
ES8302780A1 (es) 1983-01-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JPH0253040B2 (ja)
US4028318A (en) Chromogenic enzyme substrates
SU1277904A3 (ru) Способ получени трипептидов
EP0046742B1 (en) Peptide substrates for determination of protease activity
US4070245A (en) Substrate for the quantitative determination of proteolytic enzymes
US4016042A (en) Substrate for the quantitative determination of enzymes
JPH0616719B2 (ja) 酵素の検出および測定用色原体基質
US4190574A (en) Substrate for the quantitative determination of plasminogen activators
US4563305A (en) Radiolabelled substrates for assaying mammalian enzymes
US4428874A (en) Tripeptide derivatives
US4510241A (en) Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4448715A (en) Tagged pyroglu-L-Phe-L-Arg derivatives, substrates and assays for kallikrein
US4406832A (en) Peptide-type substrates useful in the quantitative determination of endotoxin
US4568636A (en) Tripeptide derivatives
US4216142A (en) Chromogenic substrates for the proteolytic enzymes
GB2126720A (en) A method for determination of enzyme activity
US4169015A (en) Novel chromogenic thrombin substrates
US4162941A (en) Method for determining a proteolytic enzyme
Rush et al. Fluorogenic substrates for the enkephalin-degrading neutral endopeptidase (Enkephalinase)
DK168574B1 (da) Peptidderivater og salte deraf med mineralsyrer eller organiske syrer samt anvendelsen heraf som substrat til kvantitativ bestemmelse af C1-esterase
JP2560058B2 (ja) 新規なペプチド誘導体
JPH0244840B2 (ja)
JPH0776232B2 (ja) ペプチド誘導体及びその使用方法