JP2000503545A

JP2000503545A - 新規な抗原提示細胞、その調製方法、および細胞性ワクチンとしてのその用途

Info

Publication number: JP2000503545A
Application number: JP9541583A
Authority: JP
Inventors: チョクリ，モハメッド; バルトラン，ジャック; ローム―ルモン，ジャン―ルー
Original assignee: イ・デ・エム・イミュノ―デジネ・モレキュル
Priority date: 1996-05-21
Filing date: 1997-05-15
Publication date: 2000-03-28
Anticipated expiration: 2017-05-15
Also published as: DK0925356T3; JP3428025B2; DE69734989D1; US20020192192A1; AU732536B2; DE69734989T2; EP0925356B1; WO1997044441A1; AU2961597A; ATE314460T1; US20020192193A1; EP0925356A1; US20020182725A1; AU732536C; EP0808897A1; ES2256886T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、以下の性質を有することを特徴とする単球誘導抗原提示細胞(ＭＤ−ＡＰＣ）に関する：それらはその表面上に：約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４、＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６、５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示し；それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており；それらは食作用特性を示し、それらは同種のリンパ球の増殖を刺激する特性を有する。

Description

【発明の詳細な説明】新規な抗原提示細胞、その調製方法、および細胞性ワクチンとしてのその用途本発明は、新規な抗原提示細胞、その調製方法、および細胞性ワクチンとしてのその用途に関する。マクロファージは、Metchnikoffによるそれらの記載（Immunity in Infective Diseases，Cambridge Press，1905）以来、非常に効果的に食菌し（内なるものとし）、外因性の粒子（抗原、細胞砕片、細菌）を消化する細胞として認識されている。それらはまた種々の免疫エフェクターモノカインも分泌する。それらは、したがって、非特異的な、および特異的な免疫応答の開始に中心的な役割を有している。培養物内で血液単球から分化した多量のヒトマクロファージの回収は、既に記載されている（国際出願番号ＰＣＴ／ＥＰ９３／０１２３２、参考文献１〜６）。これらのマクロファージは、代表的な抗原および機能を発現し、十分に特徴付けされている（参考文献７〜１４）。ＩＮＦγの存在下で活性化されるマクロファージ（マクロファージ活性化キラーMacrophage Activated Ki11ers：ＭＡＫ）は、たとえ低いエフェクター／標的比でも、選択的な細胞増殖抑制および細胞傷害性を多数のヒト腫瘍に誘導する。ネズミモデルにおいては、腫瘍内およびその近辺に局所的に与えられたネズミの活性化されたマクロファージは、腫瘍塊に浸潤し、腫瘍の増殖を阻害し、そして転移の進行を低下させた。ヒトマクロファージもまた、ヌードマウスもしくはＳＣＩＤマウスに移植されたヒト腫瘍の増殖を阻害する；この効果は、少数（1００万ＭＡＫ未満）のマクロファージを肉眼で見える腫瘍を持つマウスに局所的にあるいは全身に注射した後に達成された（参考文献１５〜２０）。転移癌を持つ患者には、全身的にまたは非経口的に、１０⁸〜４×１０⁹の自己由来のＭＡＫを注射した。殺腫瘍性の単球（ＡＫＭ）もまた大腸癌の患者に非経口的に注射した。ＭＡＫの臨床的寛容性は、些細な副作用（例えば、微熱および悪寒）はあるものの自己免疫反応も急性期反応もなく優れていた。完全な抗腫瘍応答は報告されていなかった;改良された予後と延長された疾患のない間隔は、ＡＫＭの非経口的注射の後に記載されたが、腫瘍壊死、安定化、腹水流体の減少および化学療法抵抗性の変化はＭＡＫ療法の後に見られた（参考文献２１〜２６）。これらのマクロファージの認識されている限界は、それらが、ＭＨＣクラスＩ制限細胞傷害性Ｔリンパ球（ＣＤ８＋）の刺激による特定の外因性の抗原もしくは腫瘍に対する特異的な免疫応答の感作において、非常に有力というわけではないということである。それらは、抗原がＭＨＣクラスII分子との関係においてヘルパーＴリンパ球（ＣＤ４＋）に提示されるのにより効果的である。しかしながら、これらのマクロファージは食細胞の外因性経路により可溶性抗原をプロセスし提示する能力を有するが、高濃度のタンパク質または抗原を必要とする（参考文献３８〜４２、４５〜４７、５０）。食作用、消化、プロセシングおよび提示というこれらの機能を高いレベルで発現する細胞は、細胞性ワクチンの開発に必要とされる。樹枝状細胞は、その形態（樹状突起）および２，３の膜抗原により特徴付けられ、組織内に存在する専門的な抗原提示細胞と考えられている。それらは、一次Ｔリンパ球免疫応答の刺激のための最も有力な細胞である(参考文献４３〜４４、４７〜４９、＋Dendritic cells in fundamental and clinical immunology． 1995,Prenum Press N.Y.，Banchereau and Schmitt Editors）。樹状細胞前駆体は骨髄から生じ、血液およびリンパ液に見出すことができる。これらの起源から誘導される樹状細胞は、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ４＋ＴＮＦの存在下での培養により得ることができる。それらは、次いで、それらの成熟段階および微環境に関連した相違を示すようになる。血液から誘導できる樹状細胞は、同種間の混合リンパ球反応を誘導し、ナイーブなＴリンパ球を刺激するのに最も有力である。しかしながら、これらの従来からある樹状細胞は得ることが技術的に比較的困難で、僅かに食菌するだけである。マクロファージとは対照的に、それらはＣＤ１４およびＣＤ６４（高親和性Ｆ γレセプター）を発現しない。樹状細胞によるわずかな食菌と特定の抗原のプロセシングという問題を迂回するため、これらの細胞をＭＨＣ−Ｉに固定した小ペプチドを用いてパルスし、新しい抗原性ペプチドに対する一次免疫応答とワクチン接種を誘導した（参考文献５１）。 in vitro 分化によって樹状細胞を得るには、ＧＭ-ＣＳＦ、およびＩＬ４（参考文献４４）またはＩＬ１３（参考文献４９）であり得る第２のサイトカイン、それにＴＮＦの存在が必要である。本発明の１つの目的は、高い食作用と効果的な抗原提示をする細胞を提供することである。本発明の別の目的は、ヒト血液単球から誘導した非常に有力な抗原提示細胞を提供することである。本発明の別の目的は、膜レセプターを提示し、二重特異性抗体の使用による標的化と増加した抗原提示を可能にする細胞を提供することである（参考文献２７〜３１、３７）。本発明の別の目的は、遺伝子治療に用いられるｃＤＮＡによってトランスフェクションすることができる細胞を提供することである（参考文献３２〜３６）。本発明の別の目的は、ヒトの血液から、高い食作用、消化活性を有するマクロファージ系統の細胞を回収し、ＭＨＣクラスＩおよびIIの抗原提示をプロセスする方法を提供することである（参考文献４６、５０、５２）。本発明の別の目的は、上で定義した細胞を得ることを可能にする再現可能な方法を提供することであって、該方法は外因性サイトカイン、規定の培地および細胞のプロセッサーを構成するレシピエントの組み合わせを必要としない。本発明の別の目的は、マクロファージの高い食作用、プロセシング、ＭＨＣ-I Iペプチド提示、および樹状細胞の提示のための高レベルのアクセサリー分子による有力なＭＨＣ−ＩＴリンパ球刺激を示す細胞性ワクチンを提供することである。本発明は、以下の特徴を有するマクロファージ： −それらはそれらの表面上に：＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ６４を提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリーにより決定される、 −以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す:該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、マクロファージを２時間培養し、酵母を１／１０のマクロファージ／酵母の比で加え、そして３７℃、 (MGG)染色により固定し、そして食細胞マクロファージのパーセントは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートで、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl中２×１０⁵に対してマクロファージを１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³から２×１０⁵まで増加させて添加することにより行い、３７℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、例えば、テトラゾリウム塩ＷＳＴ −１（Boehringer Mannheim，Germany）（僅かに赤色）からホルモザン（Formoz an）（暗赤色）への加水分解のような比色法により評価した、に関する。より一般的には、本発明は、単球誘導抗原提示細胞（ＭＤ−ＡＰＣ）、特に以下の性質を有するマクロファージ： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、 −以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す:該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、ＭＤ−ＡＰＣを２時間培養し、酵母を１／１０のＭＤ−ＡＰＣ／酵母の比で添加することにより行い、そして３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜３時間インキュベーションし、May− セントは例えば、顕微鏡分析により定量する、 −以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対してＭＤ−ＡＰＣを１ウェルあたり培地１００μl 中（２×１０³から２×１０⁵まで）増加させて添加することにより行い、３７℃ で５日間インキュベーシヨンした後、細胞増殖を、ＤＮＡ合成の間のBrdu取り込みのＥＬＩＳＡ法（Boehringer mannheim，Germany）による測定により評価した、に関する。本発明の関連において、「マクロファージ」という表現は、マクロファージだけでなく、単球から誘導した抗原提示細胞も意味し、それは以後ＭＤ−ＡＰＣにより意味される。「実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けている」という表現は、そのような表面抗原がないということか、あるいはこれらの表面抗原にはかすかな強度しかないということのいずれかを意味し、該かすかな強度は、免疫蛍光分析で決定される場合そのような表面抗原の存在において得られる強度の１／１０より低いか、該強度は２０より低いかである。これ以後のこのテキストでは、「表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在」としばしばいわれるが、それは、上に説明したように、「実質的にそのような抗原が欠けている」として理解される（２０より低い強度）。本発明はまた、ＭＤ−ＡＰＣに関するが、それらはその表面上に抗原ＭＨＣ− IIを、例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で約１００〜約６００の強度で提示する。本発明はまた、例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で表面抗原ＣＤ８３が実質的に欠けているマクロファージにも関する。「表面抗原ＣＤ８３が実質的に欠けている」という表現は、２０より低い強度に対応する。本発明のＭＤ−ＡＰＣは、以下の試験で測定されるような粘着性の性質を示す：ＭＤ−ＡＰＣを２時間、培養培地（I.M.D.M.またはR.P.M.I.）中で、プラスチックフラスコ上で培養し、粘着細胞のパーセント（％）を例えば顕微鏡分析により定量する。培養培地I.M.D.M.およびR.P.M.I.は市販されている。本発明はＭＤ−ＡＰＣの培養に関し、ここで： −約１０〜約５０％のＭＤ−ＡＰＣがそれらの表面上にＣＤ１４を提示し、 −約１０〜約５０％のＭＤ−ＡＰＣがそれらの表面上にＣＤ６４を提示し、 −約８０〜約１００％のＭＤ−ＡＰＣがそれらの表面上にＭＨＣ−IIを提示し、 −約７０〜約１００％のＭＤ−ＡＰＣが粘着特性を示し、 −約３０〜約１００％のＭＤ−ＡＰＣがそれらの表面上にＣＤ８０およびＣＤ８６を提示し、 −約３０〜約１００％のＭＤ−ＡＰＣが高い食作用特性を示し、上記の性質を有する各マクロファージは、そのような性質が上で特定した強度にしたがって発現されるようなものである。本発明はまた、単核細胞を、ヒスタミンもしくはヒスタミンアゴニスト（Ｈ₁ が活動中）およびＨ₂アンタゴニストを含む培養培地中で、「さらなる」ＧＭ− ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで、培養することを含むマクロファージの組成物の調製方法にも関する。本発明はまた、単核細胞を、レヤプターを単核細胞の膜上に有する化学的リガンド、例えば、ヒスタミンもしくはヒスタミンアゴニスト（Ｈ₁が活動中）およびＨ₂アンタゴニストを含む培養培地中で、「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで、培養することを含むＭＤ−ＡＰＣの組成物の調製方法にも関する。ヒスタミンアゴニストの例は２メチルーヒスタミンである。「さらなる」という表現は、標準的な条件では培地に添加されるＧＭ−ＣＳＦはないという事実に対応するが、これは得られるＭＤ−ＡＰＣの収率および機能を増加させるために外因性のＧＭ−ＣＳＦを添加することができるという事実を排除するものではない。Ｈ₂アンタゴニストの例として、シメチジン（cimetidine）だけでなくチオチジン（tiotidine）、ブリマミド（burimamide）、メチアミド（metiamide）、ラニチジン（ranitidine）も引用することができる。単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にする他の化学的リガンドの例として、脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのリガンドを引用することができる。本発明はまた、方法にも関し、ここで、培養培地は化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦなしで含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜約１０^-6M、好ましくは約１０^-4Mの濃度で、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは約１０^-4M〜約１０^-9M、好ましくは約１０^-6M の濃度で存在する。膜レセプターに対するヒスタミンもしくはシメチジンまたは他の化学的リガンドの濃度が所定の範囲の低い方の値よりも低い場合、実質的な効果はなく、すなわちヒスタミンおよびシメチジンが存在せずに培養された細胞と１０％未満の違いしかない。ヒスタミンもしくはシメチジンの濃度が所定の範囲の高い方の値よりも高い場合、培養培地は毒性となる。さらなるＧＭ−ＣＳＦを培養培地に入れない場合、ＭＤ−ＡＰＣによってinsi tuで分泌されたＧＭ−ＣＳＦは、約５〜約５００U/ml の濃度で存在してよい。本発明はまた、方法にも関し、ここで、培養培地は化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜約１０^-6M、好ましくは約１０^-4M の濃度で、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは約１０^-4M〜約１０^-9M 、好ましくは約１０^-6M の濃度で、そしてさらなるＧＭ−ＣＳＦは約５０U/ml〜約１,０００U/ml、好ましくは約５００U/ml の濃度で存在する。さらなるＧＭ−ＣＳＦを培地内に入れる場合、ＧＭ−ＣＳＦの全濃度は約５０ U/ml〜約２,０００U/ml、そして好ましくは約５０U/ml〜約５００U/ml である。本発明の特定の態様によると、培養培地は以下の要素：ＩＬ４、ＩＬ１０、ＴＮＦのような外因性のサイトカイン、を含まない。本発明はまた： −白血球の、健康な供与者または患者由来の、アフェレーシスならびにアフェレーシス産物からの血小板および抗凝固物質の除去による末梢血からの単離、 −顆粒球が１０％未満、赤血球が５％未満しかないようにするための、単核細胞（単球＋リンパ球）の、赤血球および顆粒球からの単離、 −前工程で得られた単核細胞を、単核細胞の化学的リガンド（例えば、ヒスタミンもしくはヒスタミンのアゴニスト)、Ｈ₂アンタゴニスト（例えば、シメチジン）を、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで含む適切な培地に入れ、分化したＭＤ−ＡＰＣを得るのに十分な時間、好ましくは約５〜１５日間培養し、可能ならばＭＤ−ＡＰＣをリンパ球から分離し、そしてＭＤ−ＡＰＣあるいはＭＤ−ＡＰＣとリンパ球を回収すること、を包含する方法にも関する。本発明は、ＭＤ−ＡＰＣの培養培地に： −粗製の抗原、例えば、自己由来の腫瘍膜、殺傷された腫瘍細胞、細菌のキャプシド、核酸から取り除かれたウイルスのホモジネート −それに対して免疫応答が望まれる特定のペプチド、 −マクロファージの、ＭＤ−ＡＰＣ膜上で提示され、それに対して免疫応答が望まれる関連するペプチドまたはタンパク質をコードする物質によるトランスフェクションを可能にするベクターに連結されたｃＤＮＡもしくは遺伝的物質（例えば、グルコン酸化ポリリジン)、または、 −一方でＭＤ−ＡＰＣの表面抗原または表面レセプターを、他方でそれに対して免疫応答が望まれる関連する抗原を標的化する、二重特異性抗体、が添加される方法にも関する。本発明はまた、上記の本発明の方法にしたがえば得られやすいＭＤ−ＡＰＣにも関する。本発明はまた、活性物質として、本発明のＭＤ−ＡＰＣを含む医薬組成物にも関する。本発明はまた、活性物質として、本発明のＭＤ−ＡＰＣを含む細胞性ワクチン組成物にも関する。本発明はまた、単球の、本発明のＭＤ−ＡＰＣへの成長および分化に必須の要素、および加えて、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミン、シメチジンをＧＭ−ＣＳＦを組み合わせてもしくは組み合わせないで含む培地にも関する。単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にする他の化学的リガンドの例としては、解毒したＬＰＳ(例えば、脂質Ａ、Ｃ３)、および補体レセプターの他のリガンド、タキソール、酸化還元物質（例えば、フラベノイドまたはポリフェノール)、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターに対するリガンドを引用することができる。本発明はまた： −混入物のないリンパ球および単球の回収のための手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液およびマクロファージの保存のための可能な適切な手段、 −単球および可能ならばリンパ球のための、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストを、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで含む培養物を調製するための手段、 −培養細胞のトランスフェクションのための可能な手段および抗原をＭＤ−ＡＰＣに対して標的化するための手段、を含む細胞プロセッサーまたはキットにも関する。ＭＤ−ＡＰＣの保存に関して、それは、凍結手段、例えば、自己由来のもしくはＡＢ＋血清の存在下の１０％グリセロールもしくはD.M.S.O．（ジメチルスルホキシド）、を含むことができる。本発明は： −白血球濃縮物を得るための血液の回収および遠心分離のための手段、 −他の白血球細胞からリンパ球および単球を分離し、赤血球の混入を排除するための手段、 −ＭＤ−ＡＰＣ、および可能ならばリンパ球のための、補体および単核細胞の特定の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストをＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで一緒に含む培養培地、 −マクロファージの保存のための適切な手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、を含む上記の細胞プロセッサーまたはキットにも関する。本発明はまた、細胞治療において同時に、別々にまたは連続して用いるための、本発明のＭＤ−ＡＰＣ、およびリンパ球を合わせた調製物としての生成物にも関する。本発明はまた、ＭＤ−ＡＰＣおよび細胞数にして発現されたＭＤ−ＡＰＣの少なくとも２０〜５０％の比のリンパ球を含む上記の生成物にも関する。本発明はまた、本発明のＭＤ−ＡＰＣの抗原、および腫瘍細胞の抗原または該ＭＤ−ＡＰＣに対して標的化される病原体の抗原を認識しやすい二重特異性抗体にも関する。本発明はまた、適切な量の本発明のＭＤ−ＡＰＣ、好ましくは約１０⁸〜約５ ×１０⁹のＭＤ−ＡＰＣの投与を含む臨床的処置方法にも関する。本発明は、培養物由来のリンパ球の、約４×１０⁹〜約１０×１０⁹のリンパ球の投与を含む、任意の障害の処置方法にも関する。本発明はまた、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンレセプターのアゴニスト、特にヒスタミン、およびＨ₂アンタゴニスト、特にシメチジンの、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせない、以下の性質： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、 −以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す：該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、ＭＤ−ＡＰＣを粘着細胞を選択するために２時間培養し、酵母を酵母に対するＭＤ−ＡＰＣの比が１／１０で加え、そして３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜３時間インキュベーショＡＰＣのパーセントは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −例えば、以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレートで、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対してＭＤ−ＡＰＣを１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵まで異なる数で添加することにより行い、３７ ℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、例えば、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−１（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解のような比色法により評価した、を有するＭＤ−ＡＰＣの調製のための使用にも関する。本発明の単球誘導抗原提示細胞およびＭＤ−ＡＰＣは以下のようにして得ることができる：ａ）アフェレーシスによる血液からの白血球の単離および遠心分離による血小板の除去。集めた細胞が顆粒球を＜１０％およびへマトクリットを＜５％しか有さないならば、それらは培養内にそのように接種することができる。あるいは、単核細胞はまず、密度１．０７７のFicoll Paqueでの遠心分離により調製されなければならない。ｂ）単核細胞は、次いで、５〜１５日間、疎水性バッグであるエチレンビニルアセテート(E.V.A.，Stedim)、またはポリプロピレン（Life Cell、 Baxter）中で、３７℃、５％ＣＯ₂で培養される。細胞は５．１０⁶/ml でI.M.D. M.に（先のように）、あるいはヨードメタシン（５×１０^-6M）、メルカプトエタノール（３×１０^-5M）、非必須アミノ酸（１％、Gibco）および２〜５％の再構成された自己由来のまたはＡＢ＋血清を補充した同等の培地に、以下のものと一緒に接種される：ＧＭ−ＣＳＦ、単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にする５００U/ml の化学的リガンド、例えば、脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのリガンド；リガンドの例としては、ヒスタミン（１０^-4M）、シメチジン（１０^-6M）、またはヒスタミンの他のＨ₂アンタゴニスト、またはいかなる外因性サイトカインも存在せずにヒスタミン、シメチジン。内因性サイトカインはリガンドによって刺激された細胞により放出される。・および外因性抗原、ペプチドもしくは関連する抗原をコードするトランスフェクタント（ｃＤＮＡ＋ベクター）。ｃ）培養後、特異的単球誘導抗原提示細胞（ＭＤ−ＡＰＣ）を遠心分離し、洗浄し、そして患者への注射のために再懸濁し、抗原に対する体液性および細胞性免疫を誘導する。細胞性ワクチンの特異性は、以下のものの１つにより in vitro の培養中に達成される：ａ）上記のｂ）で説明したようなＭＤ−ＡＰＣの、粗製の抗原、例えば、自己由来の腫瘍膜、細菌キャプシド、核酸から除去されたウイルスホモジネートの存在下での培養；ｂ）上記のｂ）で説明したようなＭＤ−ＡＰＣの、それに対して免疫応答が有益である特定のペプチドの存在下での培養、ｃ）または、上記のｂ）で説明したようなＭＤ−ＡＰＣの、膜上に提示されるＭＤ−ＡＰＣの関連するペプチドまたはタンパク質をコードする物質によるトランスフェクションを可能にするベクターに連結されたｃＤＮＡまたは遺伝的物質（例えば、グルコン酸化されたポリフィジン）の存在下での培養。特定の細胞性ワクチンを得るためには、マクロファージ培養の分化段階の最後に、一方で膜抗原またはＭＤ−ＡＰＣの表面レセプターを、他方で関連する抗原をを標的化する二重特異性抗体を添加することも可能である。好ましい実施態様によると、本発明の方法は以下の工程： −アフェレーシス産物（すなわち濃縮された白血球）を得るための、健康な被検体または患者の血液からのアフェレーシスによる白血球の単離、 −白血球が豊富な産物を得るための、例えば、アフェレーシス産物の遠心分離による血小板除去、 −白血球が豊富な産物中の、一方で単核細胞の、他方で混入している赤血球および顆粒球の分離、 −分化した単球誘導抗原提示細胞（ＭＤ−ＡＰＣ）を得るための、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンおよびＧＭ−ＣＳＦを含む培地中での、約５〜１５日間の単核細胞（単球＋リンパ球）の培養、を含む。リンパ球は培養工程の前に単球から分離することができる。リンパ球は培養工程の後にＭＤ−ＡＰＣから分離することができる。本発明の方法において、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンが、１０^-2M〜約１０^-6M、好ましくは約１０^-4Mの濃度で用いられる。本発明の方法において、ＧＭ−ＣＳＦは、約５０〜約１,０００U/ml、特に約１００〜約５００U/mlの濃度で用いられる。本発明の方法において、培養培地は、非常に低いエンドトキシン含量のために選択されるRPMI、IMDM、MEM、またはDMEMである。これらの培地は市販されている。好都合には、培養培地はインドメタシン（もしくは別のシクローオキシゲナーゼ阻害剤）および／またはシメチジン（ヒスタミンＨ₂アンタゴニスト）および／または単核細胞の別の化学的リガンドを含有する。本発明のＭＤ−ＡＰＣを調製するための好都合な方法は以下のとおりである：アフエレーシス健康な被検体または患者由来の白血球は、Cobe-Spectra連続フロー血液細胞セパレーターを用いて顆粒球の混入を低く抑えて（＜１０％、および赤血球５％未満）アフェレーシスにより末梢血から分離される。アフェレーシス産物は１０分間２８０ｇで血小板の混入を低下させるため遠心分離される。血小板が豊富な血漿は除去され、白血球ペレットは、０．１％グルコース、０．１７％ＰＯ₃ＨＮａ₂・２Ｈ₂Ｏ、０．２７％ＰＯ₃Ｈ₂Ｎａ、０．１４％ＮＨ₄Ｃｌ、０．７８％ＮａＣｌを含むリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（ＴＳ７４５溶液laboratoireBruneau ，France）で再懸濁される。濃縮された白血球ペレットは、平均７〜１．５×１０¹⁰白血球で得られる（単核細胞の５０％）。単核細胞の単離収集した白血球が１０％より多い顆粒球混入および／または５％のヘマトクリットであるならば、ヒト単核細胞は、赤血球から、および混入している顆粒球から、１５分間１,０００ｇで、密度１．０７７のFicoll Paque（Pharmacia）を用いてＣＯＢＥ２９９１またはStericellプロセッサーで分離される。カルシウムおよびマグネシウムを含まないリン酸緩衝生理食塩水で３回洗浄した後、単球はチヤネライザー（channelyser）分析（Coulter Margency-France）によって示されるように、約２０％〜約５０％の純度で得られる。培養分化したヒトＭＤ−ＡＰＣは、E.V.A．（エチレンビニルアセテート、STEDIM 、Aubagne）またはポリプロピレン（lifecell-Baxter）の疎水性バッグでの３７ ℃、５％ＣＯ₂、９５％湿度の雰囲気での単核細胞の培養物中で５〜１５日で得られる。全単核細胞は、Iscove 改変培地（I.M.D.M.，(Gibco)）で、またはぺニシリン（１００U/ml）、ストレプトマイシン（１００μg/ml）、Ｌ−グルタミン（２mM、Gibco）、ピルビン酸（２mM,.Gibco）、インドメタシン（５×１０^-6M 、Sigma）、シメチジン（１０^-8〜１０^-4M）、ヒスタミン（１０^-6〜１０^-2または他の化学的リガンド）、メルカプトエタノール（３×１０^-5、Gibco）、非必須アミノ酸（１％、Gibco）、および２〜５％の自己由来のもしくはＡＢ型の血清を補充した同等の培地で、５×１０⁶細胞／mlで接種される。ＧＭ−ＣＳＦの添加（５００U/mL、SANDOZ）は比較実験において行われた。好ましい実施態様によると、本発明の方法は、死んだ腫瘍細胞を単球と同時に培養培地に添加するが、どちらの細胞も好ましくは同じ患者由来であり、好ましくは１mlあたり約１００万の死んだ腫瘍細胞の割合で、該死んだ腫瘍細胞はマクロファージと同時にプロセスされるような方法である。死んだ腫瘍細胞は、次いで、白血球と同時に、約１×１０⁶/mlの量でプロセスされ得る。この方法は、腫瘍に特異的なＭＤ−ＡＰＣおよびリンパ球を得ることを可能にし、これらの特定の腫瘍細胞に対する免疫応答をin vivoで非常に効率的に誘導する。本発明はまた、上で定義した方法により得られやすいＭＤ−ＡＰＣにも関する。本発明はまた、活性物質として上で定義したＭＤ−ＡＰＣを含む医薬組成物にも関する。本発明はまた、単球が本発明のＭＤ−ＡＰＣへ成長し分化するのに必要な要素、さらには単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよびＧＭ−ＣＳＦを含む培地にも関する。本発明の単球誘導抗原提示細胞は、以下： −混入物のないリンパ球および単球の回収のための手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液およびＭＤ−ＡＰＣの保存のための可能な適切な手段、 −単球および可能ならばリンパ球のための、単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンおよび／またはＧＭ−ＣＳＦを含む培養物を調製するための手段、を含む細胞プロセッサーまたはキットの一部であり得る。本発明の好都合な実施態様によると、この細胞プロセッサーまたはキットは： −白血球濃縮物を得るための血液の回収および遠心分離のための手段、 −他の白血球細胞からリンパ球および単球を分離し、赤血球の混入を排除するための手段、 −ＭＤ−ＡＰＣ、および可能ならばリンパ球のための、補体および特におよび／またはＧＭ−ＣＳＦおよび可能ならばインドメタシンおよび／またはシメチジンを含む培養培地、 −ＭＤ−ＡＰＣの保存のための適切な手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、を含む。本発明はまた本発明によるＭＤ−ＡＰＣ、およびリンパ球を、養子免疫治療における同時の、別々のまたは連続する使用のための、合わせた調製物として含む生成物にも関する。好都合な実施態様によると、上で定義した本発明の生成物は、ＭＤ−ＡＰＣと、細胞数にして発現されたＭＤ−ＡＰＣの少なくとも２０％〜５０％の割合のリンパ球を含むことを特徴とする。この実施態様において、ＭＤ−ＡＰＣおよびリンパ球はどちらも患者に注射される。本発明はまた、本発明のＭＤ−ＡＰＣの抗原、例えば、ＦＣγＲＩ（ＣＤ６４）および関連する抗原の抗原を認識しやすい二重特異性抗体にも関する。二重特異性抗体は、Chokri et al．Res．Immunol．143（1992）に記載されたようにして調製してもよい。二重特異性抗体は、本発明のＭＤ−ＡＰＣと同時に注射してもよいし、あるいは注射の前にＭＤ−ＡＰＣとプレインキュベーションしてもよい。本発明はまた、本発明の適切な量のＭＤ−ＡＰＣを、好ましくは約１×１０⁸ 〜約５×１０⁹のＭＤ−ＡＰＣの量で、投与することを含む癌および病原体の治療方法にも関する。図面の説明：図１ａは、アジュバントとしてヒスタミン（１０^-4M）およびシメチジン（１０^-6M）の存在下で、ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml）ありまたはなしで回収された本発明のＭＤ−ＡＰＣにより誘導された同種Ｔ細胞増殖を、ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml）のみの存在下での標準的なマクロファージと比較して示す。図１ｂは、ＧＭ-ＣＳＦか、ＧＭ−ＣＳＦ＋ＩＬ−１３の存在下で回収されたＭＤ−ＡＰＣによる刺激を示す。図１ａにおいて、吸光度（450nm〜690nm）は、本発明のＭＤ−ＡＰＣと応答物であるリンパ球細胞との間の比に対してプロットされている。明るい点模様の棒は５００U/ml のＧＭ−ＣＳＦの存在に対応し、薄い灰色の棒はヒスタミン（１０^-4M）およびシメチジン（１０^-6M）の存在に対応する。濃い灰色の棒は、ヒスタミン（１０^-4M）およびシメチジン（1０^-6M）と組み合わせたＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml）の存在に対応する。結果は、同種のリンパ球の増殖を刺激するＭＤ−ＡＰＣの能力が非常に増加したことを示す。ＭＤ−ＡＰＣによるリンパ球の同種増殖の刺激は非常に有力である（少なくとも、標準的なマクロファージに関して２００％増加した）。ヒスタミン／シメチジン効果またはＩＬ−３効果とＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせは、この活性を強化することができる（マクロファージによる誘導に関して、最大で３００％の増加）。図１ｂにおいて、吸光度（450nm〜690nm）は、本発明のＭＤ−ＡＰＣと応答物であるリンパ球細胞との間の比に対してプロットされている。黒い丸の曲線は、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−１３の存在に対応し、そして白い丸の曲線はＧＭ−ＣＳＦの存在に対応する。例：本発明のＭＤ−ＡＰＣの調製：１−アフェレーシス：健康なドナーもしくは患者由来の末梢血から、ＣＯＢＥ spectra 血液細胞セパレータを用いて、できるだけ顆粒球の混入を低く抑えて、白血球を単離する。アフェレーシス産物を、リン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）（最終容量＝４５０ml）で希釈する。アフェレーシス産物を１０分間２８０ｇで遠心分離して、血小板と抗凝固物質を除去する。２−単核細胞の単離: 集めた細胞が、＞１０％の顆粒球混入および／または＞５％のへマトクリットを有するならば、それらを、のFicoll（密度＝１．０７７）で遠心分離し、赤血球および顆粒球を除去すべきである。３−培養単球誘導抗原提示細胞（ＭＤ−ＡＰＣ）は、単核細胞の、ＥＶＡ（エチレンビニルアセテート/STEDIM）の疎水性バッグまたは同様のバッグ（Teflon）内での、３７℃、５％ＣＯ₂、湿潤雰囲気での培養の５〜１５日後に得られる。単核細胞は５×１０⁶細胞/mlで、Iscove 改変培地（I.M.D.M.-Gibco）に、またはヒスタミン（１０^-4）またはアナログおよびシメチジン（１０^-6）または同様のＨ₂ アンタゴニストのような単核細胞のリガンドに加え、ＧＭ−ＣＳＦ（５００U/ml ）の存在下または無しで、（PCT/EP93、第７頁参照）により補充した同様の培地に接種する。単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にする他の化学的リガンドの例として、脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのリガンドを引用することができる。４−特徴付けおよび機能性ａ−フローサイトメトリーＭＤ−ＡＰＣの成熟後、得られた細胞の表現型分析を、膜タンパク質に対するネズミのFITCまたはP.E.で標識したモノクローナル抗体を用いるフローサイトメトリーにより行なった。ｂ−混合したリンパ球反応（ＭＬＲ）ＭＤ−ＡＰＣに対するＴ細胞応答の誘導を評価するため、同種の最初のＭＬＲを９６ウェルのマイクロタイタープレートで異なる数のＭＤ−ＡＰＣを軟膜から精製した２×１０⁵個の同種のＴ細胞に対して添加することにより行なった。３７℃で５日間後、細胞増殖を、ＷＳＴ−１のような比色法により評価した。ｃ−食作用得られた異なる細胞の食作用能力をホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価した。手短に言うと、細胞を２時間培養して粘着細胞を選択した。酵母を１／１０のマクロファージ／酵母の比で添加し、３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜た。食作用細胞のパーセントは顕微鏡分析により定量した。結果を表１、表２および表３にまとめる。表１は、ヒスタミン（１０^-4M）およびシメチジン（１０^-6M）の（ａ）、およびアジュバントとしてさらにＧＭ−ＳＣＦ（５００U/ml）の存在下で（ｂ）、疎水性バッグ内での単核細胞の培養の５〜１１日後に、多量のＭＤ−ＡＰＣの回収があることを示す。標準的な条件での成熟マクロファージの産生と比較して、ＭＤ−ＡＰＣ細胞の回収は同じオーダーであった。この表は異なる条件下での培養中（６日間）に生成されたＭＤ−ＡＰＣのフローサイトメトリーによる免疫蛍光プロファイル分析に対応する。ヒスタミン（１０^-4M）およびシメチジン（１０^-6M）条件下（ａ）で得られた細胞は、マクロファージマーカー（ＣＤ１４、ＣＤ６４、およびＨＬＡ−ＤＲ）に対して陽性である。ＧＭ−ＣＳＦとの組み合わせ（ｂ）はＭＤ−ＡＰＣの表現型プロファイルを変えない。それらはまた、ＣＤ５４およびＣＤ５８を明らかに発現する。ＣＤ８０（Ｂ７．１）およびＣＤ８６（Ｂ７．２）もまた、それらの膜上で発現されるが、レベルは低い。対照的に、ＣＤ１ａ、ＣＤ１ｃ、およびＣＤ８３は、樹状細胞の陽性マーカーであり、ＭＤ−ＡＰＣによって弱く発現される。これらのデータから、本発明の培養系で生成される抗原提示細胞は樹状細胞とは異なることを確認することができる。ＭＤ−ＡＰＣを、ホルマリン固定酵母を用いてその食作用能力についてテストの後、細胞内粒子を顕微鏡分析により定量する。ヒスタミン／シメチジン存在下（ａ）で生成したＭＤ−ＡＰＣは食作用の重要な能力を示し（６０％）、この能力は培養物中のＧＭ−ＣＳＦ存在下で増加する（８０％）（ｂ）。上記の結果から、ヒスタミンおよびシメチジン存在下でＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは無しでほぼ１週間培養されたヒト単核細胞は、成熟抗原提示細胞に分化することが示された。培養中に、これらの細胞は高レベルのアクセサリー機能様のものを獲得する。本発明の結果は、本発明の培養系から得られたＭＤ−ＡＰＣは、樹状細胞（ＤＣ）とは異なることを示すが、それはＤＣがＦＣ（ＣＤ６４）レセプター陰性で、接着性が乏しく食作用のない細胞であり、少ない数のリソソームのみを有すると記載されていたからである。対照的に、本発明のＭＤ−ＡＰＣは：（ａ）高い接着能力を示し、（ｂ）重要な食作用およびプロセシング作用を示し、（ｃ）高レベルのＨＬＡ−ＤＲ膜抗原、および低レベルのＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃ（樹状細胞によって強く発現される）を発現する、（ｄ）ＣＤ５４、ＣＤ５８、ＣＤ８０およびＣＤ８６膜抗原に対しても陽性である、（ｅ）同種のＭＬＲ反応においてＴ細胞増殖を刺激し、このことは、先行技術によって得られるマクロファージよりもはるかに優れている。表４は、一方で本発明のＭＤ−ＡＰＣ、他方で樹状細胞の特徴づけの比較をまとめたものである。表５６日間培養の後回収された本発明のＭＤ−ＡＰＣの完全な表現型特徴づけをまとめたものである（フローサイトメトリーによる分析）

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年６月８日（１９９８．６．８）【補正内容】請求の範囲１．以下の性質を有するＭＤ−ＡＰＣ： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４Ｏおよびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度が、例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、−以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す:該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、マクロファージを２時間培養し、酵母を１／１０のマクロファージ／酵母の比で加え、そして３７℃ (MGG)染色により固定し、そして食細胞ＭＤ−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、例えば、テトラゾリウム塩ＷＳＴ −１（Boehringer Mannheim，Germany）（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解のような比色法により評価した。２．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、平均強度が約１００〜約４００の抗原ＭＨＣ−ＩＩをその表面上に提示する、請求項１記載のＭＤ−ＡＰＣ。３．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、実質的に表面抗原ＣＤ８３を欠いている請求項１または２のいずれか１項に記載のＭＤ−ＡＰＣ。４．以下の試験：マクロファージを２時間、プラスチックフラスコでの培養培地（I.M.D.M.または R.P.M.I.）内で培養し、接着細胞のパーセンテージ（％）を、例えば、顕微鏡分析により定量する、による測定で、接着特性を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣ。５．−ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ１４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ６４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％がその表面に抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約８０％〜約１００％がその表面に抗原ＭＨＣ−IIを提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約７０％〜約１００％が接着特性を示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％が食作用特性を示し、各ＭＤ−ＡＰＣは、上記の特性が請求項１〜４のいずれか１項に特定されたような強度で発現されるような該特性を有する、ＭＤ−ＡＰＣ培養。６．ヒスタミンまたはヒスタミンアゴニストおよびＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むか、あるいは脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのような、単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にするほかの化学的リガンドを含む培養培地中での単核細胞の培養を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣを含む組成物の調製方法。７．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦなしで含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4Mの濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^-6Mの濃度で存在する、請求項６記載の方法。８．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4Mの濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^-6Mの濃度で存在し、そしてさらなるＧＭ−ＣＳＦは約５０U/ml〜約２,０００U/ml、好ましくは約５００U/ml の濃度で存在する、請求項６記載の方法。９.−白血球の、健康な供与者または患者由来の、アフェレーシスならびにアフェレーシス産物からの血小板および抗凝固物質の除去による末梢血からの単離、 −顆粒球が１０％未満、赤血球が５％未満しかないようにするための、単核細胞（単球＋リンパ球）の、赤血球および顆粒球からの単離、 −前工程で得られた単核細胞を、ヒスタミンもしくはヒスタミンのアゴニスト、シメチジンのようなＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで含む適切な培養培地に入れ、分化したＭＤ−ＡＰＣを得るのに十分な時間、好ましくは約５〜１５日間培養し、可能ならばＭＤ−ＡＰＣをリンパ球から分離し、そしてＭＤ−ＡＰＣあるいはマクロファージとリンパ球を回収すること、を包含する、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。１０．ＭＤ−ＡＰＣの培養培地に： −粗製の抗原、例えば、自己由来の腫瘍膜、殺傷された腫瘍細胞、細菌のキャプシド、核酸から取り除かれたウイルスのホモジネート、 −それに対して免疫応答が望まれる特定のペプチド、 −マクロフアージの膜上で提示され、それに対して免疫応答が望まれる関連するペプチドまたはタンパク質をコードする物質によるＭＤ−ＡＰＣのトランスフェクシヨンを可能にするベクターに連結されたｃＤＮＡもしくは遺伝的物質（例えば、グルコン酸化ポリリジン）、または、 −一方でＭＤ−ＡＰＣの表面抗原を、他方でそれに対して免疫応答が望まれる関連する抗原を標的化する、二重特異性抗体、が添加される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。１１．請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法によって得られやすいＭＤ−ＡＰＣ。１２．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む医薬組成物。１３．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む細胞性ワクチン組成物。１４．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣへの単球の成長および分化に必要な要素、さらに、例えば、ヒスタミン、シメチジンのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ-ＣＳＦを組み合わせてまたは組み合わせないでを含む培地。１５．−リンパ球および単球を混入物なしに回収するための手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、およびＭＤ−ＡＰＣの保存のための可能な適切な手段、 −単球および可能ならばリンパ球の培地であって、例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含む培地を調製するための手段、 −可能ならば培養細胞のトランスフェクションのための手段および抗原をＭＤ− ＡＰＣに標的化するための手段、を含む細胞プロセッサーまたはキット。１６．−白血球濃縮物を得るための血液の回収および遠心分離のための手段、− リンパ球および単球を他の白血球細胞から分離し、赤血球細胞の混入を排除するための手段、 −補体、および特に例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ-ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むＭＤ−ＡＰＣおよび可能ならばリンパ球の培養培地、 −ＭＤ−ＡＰＣの保存のための適切な手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、を含む、請求項１５記載の細胞プロセッサーまたはキット。１７．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣ、およびリンパ球を、細胞治療における同時の、別々の、または連続した使用のための、合わせた調製物として含む生成物。１８．ＭＤ−ＡＰＣ、および細胞数にして発現したＭＤ−ＡＰＣの少なくとも２０〜５０％の割合のリンパ球を含むことを特徴とする請求項１７記載の生成物。１９．適切な量の請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣ、好ましくは約１０⁸〜５×１０⁹の量のＭＤ−ＡＰＣの投与を含む臨床的治療方法。２０．約４×１０⁹〜１０×１０⁹の量のリンパ球の投与を含むいかなるものであってもよい障害の治療のための請求項１９記載の方法。２１．単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンのアゴニスト、特に、ヒスタミン、およびＨ₂アンタゴニスト、特にシメチジンの、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせない、以下の特性を有するＭＤ−ＡＰＣの調製のための使用： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、 −それらは以下の試験により決定されるような高度の食作用の特性を示す：該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、接着細胞を選択するためＭＤ−ＡＰＣを２時間培養し、酵母を１／１０のＭＤ−ＡＰＣ／酵母の比で加え、そして３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜３時間イン細胞ＭＤ−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、ーそれらは以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７ ℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ− １（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解、あるいはＤＮＡ合成の間のBrduの取り込みのような比色法により評価した。【手続補正書】【提出日】１９９９年２月２３日（１９９９．２．２３）【補正内容】請求の範囲１．以下の性質を有するＭＤ−ＡＰＣ： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度が、例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、−以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す：該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、マクロファージを２時間培養し、酵母を１／１０のマクロファージ／酵母の比で加え、そして３７℃ 、 (MGG)染色により固定し、そして食細胞ＭＤ−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、例えば、テトラゾリウム塩ＷＳＴ −１（Boehringer Mannheim，Germany）（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解のような比色法により評価した。２．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、平均強度が約１００〜約４００の抗原ＭＨＣ−ＩＩをその表面上に提示する、請求項１記載のＭＤ−ＡＰＣ。３．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、実質的に表面抗原ＣＤ８３を欠いている請求項１または２のいずれか１項に記載のＭＤ−ＡＰＣ。４．以下の試験：マクロファージを２時間、プラスチックフラスコでの培養培地（I.M.D.M.または R.P.M.I.）内で培養し、接着細胞のパーセンテージ（％）を、例えば、顕微鏡分析により定量する、による測定で、接着特性を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣ。５．−ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ１４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ６４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％がその表面に抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約８０％〜約１００％がその表面に抗原ＭＨＣ−IIを提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約７０％〜約１００％が接着特性を示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％が食作用特性を示し、各ＭＤ−ＡＰＣは、上記の特性が請求項１〜４のいずれか１項に特定されたような強度で発現されるような該特性を有する、ＭＤ−ＡＰＣ培養。６．ヒスタミンまたはヒスタミンアゴニストおよびＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むか、あるいは脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのような、単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にするほかの化学的リガンドを含む培養培地中での単核細胞の培養を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣを含む組成物の調製方法。７．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦなしで含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4M の濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^- ⁶ Mの濃度で存在する、請求項６記載の方法。８．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4M の濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^-6M の濃度で存在し、そしてさらなるＧＭ−ＣＳＦは約５０U/ml〜約２, ０００U/ml、好ましくは約５００U/ml の濃度で存在する、請求項６記載の方法。９.−白血球の、健康な供与者または患者由来の、アフェレーシスならびにアフェレーシス産物からの血小板および抗凝固物質の除去による末梢血からの単離、 −顆粒球が１０％未満、赤血球が５％未満しかないようにするための、単核細胞（単球＋リンパ球）の、赤血球および顆粒球からの単離、 −前工程で得られた単核細胞を、ヒスタミンもしくはヒスタミンのアゴニスト、シメチジンのようなＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで含む適切な培養培地に入れ、分化したＭＤ−ＡＰＣを得るのに十分な時間、好ましくは約５〜１５日間培養し、可能ならばＭＤ−ＡＰＣをリンパ球から分離し、そしてＭＤ−ＡＰＣあるいはマクロファージとリンパ球を回収すること、を包含する、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。１０．ＭＤ−ＡＰＣの培養培地に： −粗製の抗原、例えば、自己由来の腫瘍膜、殺傷された腫瘍細胞、細菌のキャプシド、核酸から取り除かれたウイルスのホモジネート、 −それに対して免疫応答が望まれる特定のペプチド、 −マクロファージの膜上で提示され、それに対して免疫応答が望まれる関連するペプチドまたはタンパク質をコードする物質によるＭＤ−ＡＰＣのトランスフェクションを可能にするベクターに連結されたｃＤＮＡもしくは遺伝的物質（例えば、グルコン酸化ポリリジン)、または、 −一方でＭＤ−ＡＰＣの表面抗原を、他方でそれに対して免疫応答が望まれる関連する抗原を標的化する、二重特異性抗体、が添加される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。１１．請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法によって得られやすいＭＤ−ＡＰＣ。１２．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む医薬組成物。１３．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む細胞性ワクチン組成物。１４．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣへの単球の成長および分化に必要な要素、さらに、ヒスタミン、シメチジンのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ−ＣＳＦを組み合わせてまたは組み合わせないでを含む培地。１５．−リンパ球および単球を混入物なしに回収するための手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、およびＭＤ−ＡＰＣの保存のための可能な適切な手段、 −単球および可能ならばリンパ球の培地であって、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含む培地を調製するための手段、 −可能ならば培養細胞のトランスフェクションのための手段および抗原をＭＤ− ＡＰＣに標的化するための手段、を含む細胞プロセッサーまたはキット。１６．−白血球濃縮物を得るための血液の回収および遠心分離のための手段、 −リンパ球および単球を他の白血球細胞から分離し、赤血球細胞の混入を排除するための手段、 −補体、および特に例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ-ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むＭＤ−ＡＰＣおよび可能ならばリンパ球の培養培地、 −ＭＤ−ＡＰＣの保存のための適切な手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、を含む、請求項１５記載の細胞プロセッサーまたはキット。１７．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣ、およびリンパ球を、細胞治療における同時の、別々の、または連続した使用のための、合わせた調製物として含む生成物。１８．ＭＤ−ＡＰＣ、および細胞数にして発現したＭＤ−ＡＰＣの少なくとも２０〜５０％の割合のリンパ球を含むことを特徴とする請求項１７記載の生成物。１９．約１０⁸〜５×１０⁹の量の請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを含む臨床的治療用組成物。２０．約４×１０⁹〜1０×１０⁹の量のリンパ球を含むいかなるものであってもよい障害の治療のための請求項１９記載の組成物。２１．単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンのアゴニスト、特に、ヒスタミン、およびＨ₂アンタゴニスト、特にシメチジンの、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせない、以下の特性を有するＭＤ−ＡＰＣの調製のための使用： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、 −それらは以下の試験により決定されるような高度の食作用の特性を示す：該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、接着細胞を選択するためＭＤ−ＡＰＣを２時間培養し、酵母を１／１０のＭＤ−ＡＰＣ／酵母の比で加え、そして３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜３時間イン細胞ＭＤ−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、− それらは以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７ ℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ− １（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解、あるいはＤＮＡ合成の間のBrduの取り込みのような比色法により評価した。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/00 Ｈ 39/00 39/02 39/02 45/00 45/00 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ０７Ｋ 14/705 Ｃ１２Ｐ 21/02 ＣＣ１２Ｎ 5/10 Ｇ０１Ｎ 33/53 ＹＣ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 5/00 ＢＧ０１Ｎ 33/53 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ (72)発明者ローム―ルモン，ジャン―ルーフランス国、エフ―75003 パリ、リュ・ドゥ・エス、８

Claims

【特許請求の範囲】１．以下の性質を有するＭＤ−ＡＰＣ： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０およびＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度が、例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリ−分析により決定される、 −以下の試験により決定されるような食作用の特徴を示す:該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、マクロファージを２時間培養し、酵母を１／１０のマクロファージ／酵母の比で加え、そして３７℃、 (MGG)染色により固定し、そして食細胞ＭＤ−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７℃で５日間インキュベーシヨンした後、細胞増殖を、例えば、テトラゾリウム塩ＷＳＴ −１（Boehringer Mannheim，Germany）（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解のような比色法により評価した。２．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、平均強度が約１００〜約４００の抗原ＭＨＣ−ＩＩをその表面上に提示する、請求項１記載のＭＤ−ＡＰＣ。３．例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析による測定で、実質的に表面抗原ＣＤ８３を欠いている請求項１または２のいずれか１項に記載のＭＤ−ＡＰＣ。４．以下の試験：マクロファージを２時間、プラスチックフラスコでの培養培地（I.M.D.M.または R.P.M.I.）内で培養し、接着細胞のパーセンテージ(％)を、例えば、顕微鏡分析により定量する、による測定で、接着特性を示す、請求項１〜３のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣ。５．−ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ１４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約１０％〜約５０％がその表面に抗原ＣＤ６４を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％がその表面に抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６を提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約８０％〜約１００％がその表面に抗原ＭＨＣ−IIを提示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約７０％〜約１００％が接着特性を示し、 −ＭＤ−ＡＰＣの約３０％〜約１００％が食作用特性を示し、各ＭＤ−ＡＰＣは、上記の特性が請求項１〜４のいずれか１項に特定されたような強度で発現されるような該特性を有する、ＭＤ−ＡＰＣ培養。６．ヒスタミンまたはヒスタミンアゴニストおよびＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、「さらなる」ＧＭ-ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むか、あるいは脂質Ａ、Ｃ３のような解毒化したＬＰＳおよび補体レセプターの他のリガンド、タキソール、フラベノイドまたはポリフェノールのような酸化還元物質、ＣＤ４０、ＴＮＦレセプターもしくはビタミンＤ３レセプターのような、単核細胞と相互作用し、ＭＤ−ＡＰＣへの分化を可能にするほかの化学的リガンドを含む培養培地中での単核細胞の培養を含む、請求項１〜５のいずれか１項記載のＭＤ−ＡＰＣを含む組成物の調製方法。７．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦなしで含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4M の濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^-6M の濃度で存在する、請求項６記載の方法。８．培養培地が、例えば、ヒスタミンおよびシメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを「さらなる」ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせて含み、ヒスタミンは約１０^-2M〜１０^-6M、好ましくは約１０^-4M の濃度で存在し、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストは、約１０^-4M〜１０^-9M、好ましくは約１０^-6M の濃度で存在し、そしてさらなるＧＭ−ＣＳＦは約５０U/ml〜約２, ０００U/ml、好ましくは約５００U/ml の濃度で存在する、請求項６記載の方法。９.−白血球の、健康な供与者または患者由来の、アフェレーシスならびにアフェレーシス産物からの血小板および抗凝固物質の除去による末梢血からの単離、 −顆粒球が１０％未満、赤血球が５％未満しかないようにするための、単核細胞（単球＋リンパ球）の、赤血球および顆粒球からの単離、 −前工程で得られた単核細胞を、ヒスタミンもしくはヒスタミンのアゴニスト、シメチジンのようなＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてもしくは組み合わせないで含む適切な培養培地に入れ、分化したＭＤ−ＡＰＣを得るのに十分な時間、好ましくは約５〜１５日間培養し、可能ならばＭＤ−ＡＰＣをリンパ球から分離し、そしてＭＤ−ＡＰＣあるいはマクロファージとリンパ球を回収すること、を包含する、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。１０．ＭＤ−ＡＰＣの培養培地に： −粗製の抗原、例えば、自己由来の腫瘍膜、殺傷された腫瘍細胞、細菌のキャプシド、核酸から取り除かれたウイルスのホモジネート、 −それに対して免疫応答が望まれる特定のペプチド、 −マクロファージの膜上で提示され、それに対して免疫応答が望まれる関連するペプチドまたはタンパク質をコードする物質によるＭＤ−ＡＰＣのトランスフェクションを可能にするベクターに連結されたｃＤＮＡもしくは遺伝的物質（例えば、グルコン酸化ポリリジン）、または、 −一方でＭＤ−ＡＰＣの表面抗原を、他方でそれに対して免疫応答が望まれる関連する抗原を標的化する、二重特異性抗体、が添加される、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。１１．請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法によって得られやすいＭＤ−ＡＰＣ。１２．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む医薬組成物。１３．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣを活性物質として含む細胞性ワクチン組成物。１４．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣへの単球の成長および分化に必要な要素、さらに、例えば、ヒスタミン、シメチジンのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ−ＣＳＦを組み合わせてまたは組み合わせないでを含む培地。１５．−リンパ球および単球を混入物なしに回収するための手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、およびＭＤ−ＡＰＣの保存のための可能な適切な手段、 −単球および可能ならばリンパ球の培地であって、例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドをＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含む培地を調製するための手段、 −可能ならば培養細胞のトランスフェクションのための手段および抗原をＭＤ− ＡＰＣに標的化するための手段、を含む細胞プロセッサーまたはキット。１６．−白血球濃縮物を得るための血液の回収および遠心分離のための手段、 −リンパ球および単球を他の白血球細胞から分離し、赤血球細胞の混入を排除するための手段、 −補体、および特に例えば、ヒスタミン、シメチジンまたはＨ₂アンタゴニストのような単核細胞の化学的リガンドを、ＧＭ-ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせないで含むＭＤ−ＡＰＣおよび可能ならばリンパ球の培養培地、 −ＭＤ−ＡＰＣの保存のための適切な手段、 −適切な緩衝液および洗浄溶液、を含む、請求項１５記載の細胞プロセッサーまたはキット。１７．請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣ、およびリンパ球を、細胞治療における同時の、別々の、または連続した使用のための、合わせた調製物として含む生成物。１８．ＭＤ−ＡＰＣ、および細胞数にして発現したＭＤ−ＡＰＣの少なくとも２０〜５０％の割合のリンパ球を含むことを特徴とする請求項１７記載の生成物。１９.請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣの抗原、および該ＭＤ−ＡＰＣに対して標的化される腫瘍細胞もしくは病原体の抗原を認識しやすい二重特異性抗体。２０．適切な量の請求項１〜５のいずれか１項または請求項１１記載のＭＤ−ＡＰＣ、好ましくは約１０⁸〜５×１０⁹の量のＭＤ−ＡＰＣの投与を含む臨床的治療方法。２１．約４×１０⁹〜１０×１０⁹の量のリンパ球の投与を含むいかなるものであってもよい障害の治療のための請求項２０記載の方法。２２．単核細胞の化学的リガンド、例えば、ヒスタミンのアゴニスト、特に、ヒスタミン、およびＨ₂アンタゴニスト、特にシメチジンの、ＧＭ−ＣＳＦと組み合わせてまたは組み合わせない、以下の特性を有するＭＤ−ＡＰＣの調製のための使用： −それらはその表面上に：＊約５〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ１４およびＣＤ６４＊約２０〜約２００の平均強度の抗原ＣＤ８０およびＣＤ８６＊５０〜５００の平均強度の抗原ＣＤ４０およびマンノースレセプターを提示する、 −それらは実質的に表面抗原ＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃが欠けており、ＣＤ１４、ＣＤ６４、ＣＤ８０、ＣＤ８６のそれぞれの存在および平均強度、ならびにＣＤ１ａおよびＣＤ１ｃの非存在は例えば、免疫蛍光染色およびフローサイトメトリー分析により決定される、 −それらは以下の試験により決定されるような高度の食作用の特性を示す:該食作用能力はホルマリン固定した酵母の取り込みにより評価され、例えば、接着細胞を選択するためＭＤ−ＡＰＣを２時間培養し、酵母を１／１０のＭＤ−ＡＰＣ／酵母の比で加え、そして３７℃、５％ＣＯ₂雰囲気下で２〜３時間イン細胞MD−ＡＰＣのパーセンテージは例えば、顕微鏡分析により定量される、 −それらは以下の試験により決定されるような同種リンパ球の増殖の刺激という特性を有する：同種のはじめに混合されたリンパ球反応（ＭＬＲ）を、９６ウェルのマイクロタイタープレート中で、軟膜から精製した同種のＴ細胞が１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０⁵に対して異なる数のＭＤ−ＡＰＣ（１ウェルあたり培地１００μl 中２×１０³〜２×１０⁵）を添加することにより行い、３７℃で５日間インキュベーションした後、細胞増殖を、テトラゾリウム塩ＷＳＴ −１（僅かに赤色）のホルモザン（暗赤色）への加水分解、あるいはＤＮＡ合成の間のBrduの取り込みのような比色法により評価した。