JP2000504206A

JP2000504206A - 新規形態のアンフィレグリン、その製造方法および使用方法、ならびにそれを含む組成物

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Publication number: JP2000504206A
Application number: JP09523333A
Authority: JP
Inventors: デレーイ，ベルナルト; レイマッケルス，ヨス; ファン・ヘオフェルスウィン，ヒューゴ
Original assignee: Innogenetics NV SA
Current assignee: Fujirebio Europe NV SA
Priority date: 1995-12-22
Filing date: 1996-12-23
Publication date: 2000-04-11
Also published as: WO1997023507A2; WO1997023507A3; EP0871663A2; AU1378897A; CA2237543A1; US6204359B1; AU719526B2

Abstract

(57)【要約】本発明は、ＡＲ９７−１８７という新規形態のアンフィレグリンの発見に関連する。新規形態は、そのＮ末端に４個のさらなるアミノ酸を含むという点で、これまで説明されてきたアンフィレグリン形態とは異なる。また、ヘパリン存在下においてその生物学的活性が完全には低下しないという点で、ヘパリンとの相互作用に関してこれまで説明されてきた形態とは異なる。可能には、分化中のケラチノサイトによりＡＲ９７−１８７を製造する。ＡＲ９７−１８７は傷の治癒、皮膚疾患および癌を包含する種々の症状の治療のための興味ある治療剤である。

Description

【発明の詳細な説明】新規形態のアンフィレグリン、その製造方法および使用方法、ならびにそれを含む組成物本発明は、創傷の治癒因子の分野に関する。より詳細には、本発明は、ケラチノサイトにより産生される新規形態のアンフィレグリン（amphiregulin）、ならびにそのアナログ、それらの製造方法、それらの使用に関し、より詳細には、創傷の治癒、皮膚疾患および癌を包含する種々の症状の治療におけるそれらの使用に関する。発明の背景皮膚の創傷後、１の目的は出来る限り早く傷口を閉じることである。このことは、感染の危険性および体液の損失を抑えるために、特に、過度の熱傷の場合に重要である。過去数十年にわたり開発されたいくつかの縫合および移植法は別として、培養された表皮シートの使用が注目を集めている。この方法は、患者自身の皮膚由来（自己由来のシート）または他のドナー由来（同種シート）の生きたケラチノサイトの層状シートで傷を覆うことを可能にする。興味深いことに、同種ケラチノサイトのシートは受容者の傷における生存時間が限られていることが示されているが、それらは、裂け目のある厚いメッシュ状の自己移植片と組み合わせて使用した間合い、あるいは部分的に深い傷に適用した場合、自己由来のシートと同じ臨床的効果を有する。このことは、ケラチノサイトにより産生される傷治癒因子の存在を仮定することにより説明されている。これらの因子は、傷に存在する種々のタイプの細胞の増殖および／または移動を刺激することにより、傷の修復プロセスを促進する。かくして、メッシュ状の皮膚自己移植片または表皮付属器官（例えば、汗腺、毛胞）に存在するケラチノサイトからの増殖により、新たな自己由来の表皮が形成されうる。培養されたケラチノサイトのシートは多くの場合臨床的に成功し、時々、生命を救うものであるが、多くの明かな不利な点を有する。それらは製造するには極端に高価で時間のかかるものであり、輸送、適用および長期保存が困難である。それゆえ、生きた細胞自体を用いる必要のない、ケラチノサイト由来の傷修復因子に直接基づく傷の治療を開発することが望ましい。傷の治癒の分野において潜在的に治療丈の興味を抱かせるいくつかの増殖因子がケラチノサイトにおいて同定され、あるいはすでに単離されている。これらは、特に、ＴＧＦ−α、ｂＦＧＦ、アンフィレグリンおよびＨＢ−ＥＧＦを包含する。しかしながら、現在に至るまで、これらの因子は生きたケラチノサイト培養物において同じ臨床的能力を示すことは証明されていなかった。特に興味深い１のファクターはアンフィレグリン（ＡＲ）である。これは約２０ｋＤａのヘパリン結合糖蛋白であり、もともと、ホルボール処理したＭＣＦ− ７ヒト乳癌細胞から精製されたものである。該因子は増殖因子のＥＧＦ−ファミリーに属し、いくつかの細胞タイプ（ケラチノサイトおよびいくつかの繊維芽細胞系を包含）の増殖を刺激し、一方では他の細胞（多くの癌細胞系を包含）の増殖を抑制する（Shoyab et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6528-6532(1988);Sh oyab et al.，Science 243，1074-1076(1989)）。ＡＲの配列決定により２つの形態の存在が明らかとなり、それぞれ７８個および８４個のアミノ酸を含んでいる（Shoyab et al.,Science 243，1074-1076(1989);P1owman et al.,Mol.Cell.B iol．10，1969-4981(1990)）。これら２つのサブ形態のＮ末端はプレ蛋白配列の残基１０１および１０７において存在することが報告され（開始メチオニンを残基１とした場合）、Ｃ末端はプレ蛋白ま配列の残基１８４において存在することが報告された。しかしながら、最近の研究により、Ｃ末端プロセッシング部位は初めに報告されたものよりもおそらく少なくとも２アミノ酸下流に位置していることが明かとなった（Adams et al.,Biochim.Biophys.Acta 1266,83-90(1994);T hompson et al.,J.Bio1.Chem.271，17927-17931(1996)）。このことは、公表されたアンフィレグリンのサブ形態の全長はそれぞれ少なくとも８０および８６アミノ酸であることを意味する。混乱を避けるために、以後我々は、サブ形態をそれらの各Ｎ末端およびＣ末端の終点に関して命名することにする（プレ蛋白の開始メチオニンを残基１とする）。グリコシレーションは分子の生物学的活性にとり重要でないと思われる(Shoyab et al.,Proc.Natl.Acad.Sci. USA 85，6528-6532(1988)）。最近の研究により、主要ケラチノサイトオートクリン因子もアンフィレグリンであることが明かとなった(Cook et al.,Mol.Cell. Biol.，11,2547-2557(1991);Cook et al.，In Vitro Cell．Dev．Biol．28A,218 -222(1992);Piepkorn et al.,J.Cell.Physiol.159,114-120(1994))。培養ケラチノサイトのならし培地においても、プレ蛋白の残基１０１および１０７から始まる２つのサブ形態が検出された。ＡＲの特別な特徴は、ヘパリン硫酸の存在下においてその生物学的活性が完全にブロックされるということである。この特性を示す唯一の増殖因子であることが報告されている(Cook et al.,Mol.Cell.Biol. ，11,2547-2557(1991);Cook et al.，In Vitro Cell.Dev.Biol.28A,218-222(199 2)Piepkorn et al.,J.Cell.Physiol.159,114-120(1994)）。ＡＲの単離、特性、クローニングおよび有効な治療用途が、Oncogen(Seatle)に付与された米国特許第５１１５０９６号（１９９２年５月１２日）に開示されている。発明の目的新規形態のアンフィレグリンを単離し特徴づけすることが本発明の目的である。この新規形態のアンフィレグリンのアナログを提供することも本発明の目的である。該新規形態のアンフィレグリンまたはそのアナログを含む組成物を提供することも本発明の目的である。該新規形態のアンフィレグリンの製造方法を提供することも本発明の目的である。本発明の新規形態のアンフィレグリンを有効成分として含む医薬組成物を提供することが本発明のさらなる目的である。該新規形態のアンフィレグリンの使用を含む、疾病の治療方法を提供することが本発明のさらなる目的である。本発明のすべての目的は以下に示す具体例に適合する。発明の概要本発明は、ＡＲ９７−１８７という新規形態のアンフィレグリンの発見に関連する。新規形態は、そのＮ末端に４個のさらなるアミノ酸を含むという点で、これまで説明されてきたアンフィレグリン形態とは異なる。また、ヘパリン存在下においてその生物学的活性が完全には低下しないという点で、ヘパリンとの相互作用に関してこれまで説明されてきた形態とは異なる。可能には、分化中のケラチノサイトによりＡＲ９７−１８７を製造する。ＡＲ９７−１８７は傷の治癒、皮膚疾患および癌を包含する種々の症状の治療のための興味ある治療剤である。発明の詳細な説明より詳細には、本発明は、ＡＲ９７−１８７（またはＡＲ８８）と呼ばれ、新規Ｎ末端アミノ酸配列伸長：ＮＨ₂−ＩＶＤＤ（配列番号：１４）により特徴づけられる、新規形態のアンフィレグリンに関する。実施例の部分において詳細に説明するように、少なくとも９０個のアミノ酸を有し、Ｎ末端はプレ蛋白配列の残基９７から始まる可能性が最も高い新規形態のアンフィレグリンが本発明者らにより同定された。先行技術において、２つの他の形態（それぞれ、プレ蛋白の残基１０１および１０７から始まる）が単離されている。新規形態は、高カルシウム、血清含有培地において培養された層状のケラキトサイト培養物により産生される。特に、細胞の分化状態において、ならびに多層の層状シートを形成する事実において、これらの培養物は先行技術のものとは実質的に異なる。可能には、これらの相違は、これらの培養物が今回同定された新規形態のアンフィレグリンをなぜ産生するのかという１の理由を構成する。用語「層状」は、少なくとも２層の細胞、好ましくは少なくとも３層の細胞、より好ましくは４層の細胞を含むケラチノサイトのシートをいう。該層状ケラチノサイト培養物を得るために用いる培地は、下記成分を必須として含有する：ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（３／１）、１０％ウシ胎児血清、１２ｎｇ／ｍｌ天然マウスＥＧＦ、０.４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、１１ｎｇ／ｍｌコレラ毒素、４.９μｇ／ｍｌトランスフェリン、６μｇ／ｍｌインスリン、１.４ｎｇ／ｍｌトリヨードチロニンおよび０.１３ｍＭアデニン。よって、本発明は、高カルシウム血清含有培地中で培養される多層の層状ケラチノサイト培養物から得られる新規形態のアンフィレグリンにも関する。この新規形態のＡＲ９７−１８７アンフィレグリンの完全配列は、好ましくは下記のものである：もう１つの具体例によれば、本発明は、Ｃ末端が配列番号:１のＣ末端よりも長いまたは短いという点で配列番号：１とは異なる新規アンフィレグリン形態にも関する。「新規形態のアンフィレグリン」なる表現は、アミノ末端に４個のさらなるアミノ酸ＩＶＤＤ（配列番号：１４）を含むアンフィレグリンと解釈すべきである。好ましくは、この新規形態のアンフィレグリンは全部で少なくとも９０個のアミノ酸を有する。配列番号：１の残基５または１１（プレ蛋白配列の残基１０１または１０７に対応）から始まるアンフィレグリンのイソ形態は、例えば、米国特許第５１１５０９６号、Shoyab et al.,Science243,1074-1076(1989)、P1owma n et al.,Mol.Cell.Biol.10,1969-1981(1990)、およびCook et al.,Mol.Cell.Bi ol．11，2547-2557(1991)に記載されている。本発明の新たな形態のアンフィレグリンは下記の驚くべき特性を有することが示されている： − 約５００ないし１０００ｍＭ、好ましくは５５０ないし９００ｍＭの間、より好ましくは６００ないし７５０ｍＭの間のＮａＣｌ濃度でヘパリンアフィニティーカラムから溶離される。このことは、先行技術における未分化のケラチノサイト由来のアンフィレグリン（Cook et al.,Mol.Cell.Biol.11,p.2547-2557(199 1)が約１.７５Ｍで溶離されると記載されている）とは対称的である。 − ヘパリン存在下はほとんど完全に阻害される）においてもその分裂促進活性は完全には消失しない（ＭＣＦ−７由来のアンフィレグリン標品（７８個および８４個のアミノ酸からなる形態のアンフィレグリンを含有）。先行技術のデータは、ＭＣＦ−７由来および分化していないケラチノサイト由来のアンフィレグリンはともに、ヘパリン硫酸によりほとんど完全にブロックされる。 − Ｂａｌｂ３Ｔ３細胞に対する分裂促進活性を有するが、他の形態のアンフィレグリンはこれらの細胞に対して活性を示さない(Shoyab et al.,Proc.Natl.A cad.Sci．USA 85，6528-6532(1988);米国特許第５１１５０９６号）。 − 他の形態のアンフィレグリンとは対照的に、低い撒種密度の軟寒天コロニー形成アッセイにおいてＮＲＫ細胞のコロニー形成を刺激する（Shoyab et al.,Sc ience 243，1074-1076(1989)）。「ヘパリンにより完全には阻害されない」なる表現は、実施例３に記載されるＢａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおいて測定した場合に、１０μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で分裂促進活性が多くとも約８０％、好ましくは多くとも約５０％、さらにより好ましくは多くとも約３０％だけ阻害されることを意味すると理解すべきである。また、このことは、ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログは、ヘパリン存在下において約２０％以上、好ましくは約５０％以上、さらにより好ましくは約７０％以上の活性を維持していることを意味する。これらのヘパリン阻害パーセンテージの測定において、Ｂａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおけるＡＲ９７−１８７または他のアンフィレグリンのイソ形態の濃度は０.２５ないし３ユニット／ｍｌ、好ましくは０.５ないし２.５Ｕ／ｍｌ、さらにより好ましくは１ないし２Ｕ／ｍｌとすべきことが理解されなくてはならない(１ユニットは、１ｎｇ／ｍｌの天然マウスＥＧＦを用いて得られるのと同じ取り込み標識量を生じる分裂促進活性の量と定義する）。「ヘパリンによりほとんど完全に阻害される」なる表現は、実施例３に記載されるＢａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおいて測定した場合に、１０μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で分裂促進活性が少なくとも８５％、好ましくは少なくとも９０％、さらにより好ましくは少なくとも９５％だけ阻害されることを意味すると理解すべきである。また、このことは、ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログは、ヘパリン存在下において約１５％未満、好ましくは約１０％未満、さらにより好ましくは約５％未満の活性を維持していることを意味する。これらのヘパリン阻害パーセンテージの測定において、Ｂａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおけるＡＲ９７−１８７または他のアンフィレグリンのイソ形態の濃度は０. ２５ないし３ユニット／ｍｌ、好ましくは０.５ないし２.５Ｕ／ｍｌ、さらにより好ましくは１ないし２Ｕ／ｍｌとすべきことが理解されなくてはならない（１ユニットは、１ｎｇ／ｍｌの天然マウスＥＧＦを用いて得られるのと同じ取り込み標識量を生じる分裂促進活性の量と定義する）。かかる阻害実験の一例は実施例６および図４において提供される。この例は、ヘパリン不存在下においてＡＲ８７−１９７標品は１／５０希釈された場合に１ .５６Ｕ／ｍｌの活性を生じ、それは１／１６００希釈されたＭＣＦ−７のＡＲ（ヘパリンによりＭＣＦ−７細胞から精製されたアンフィレグリン標品であり、プレ蛋白配列の残基１０１および１０７から開始するイソ形態を含有）により得られる活性（すなわち、１．２５Ｕ／ｍｌ）とほぼ同じである。それにもかかわらず、１０μｇ／ｍｌのヘパリン存在下で、同じ濃度で試験した場合、ＡＲ８７ −１８７標品は残存活性０.５２Ｕ／ｍｌ（すなわち、ヘパリン不存在下の活性の３３％）を有し、一方、ＭＣＦ−７のＡＲ標品はわずか０.０１Ｕ／ｍｌ（すなわち、ヘパリン不存在下の活性の０.８％）しか残存活性を有しない。このことは、上記定義によれば、ＡＲ９７−１８７標品はヘパリンにより完全に阻害されないが、他のアンフィレグリンのイソ形態はほとんど完全に阻害されることを示す。さらに本発明は、上記ＡＲ９７−１８７アンフィレグリンを含む組成物に関する。該組成物はポリペプチド組成物であってもよく、ＡＲ９７−１８７のほかに、当該分野で知られた他のポリペプチドまたは他の成分もしくは賦形剤を含有していてもよい。好ましい具体例によれば、本発明は、ほぼ等量の、プレ配列の残基９７から開始するアンフィレグリンイソ形態およびプレ蛋白配列の残基１０７から開始するアンフィレグリンイソ形態を含有するポリペプチド標品に関する。もう１つの具体例によれば、本発明は、これら４個のさらなるＮ末端アミノ酸が変化せず、該アンフィレグリン活性が大体保持されるように欠失、挿入および／または置換（保存的または非保存的）が行われているＡＲ９７−１８７アンフィレグリンのアナログに関する。該アナログは２５％未満、より好ましくは２０％未満、最も好ましくは１０％未満のアミノ酸が本発明ＡＲ９７−１８７と異なっている。本発明蛋白またはペプチドについて本明細書または請求の範囲に用いる用語「アナログ」は、本明細書に特に示される配列に対して実質的に同じアミノ酸残基配列を有し、１個またはそれ以上の残基が生物学的に等価な残基で保存的に置換されている蛋白またはペプチドを包含する。保存的置換の例は、イソロイシン、バリン、ロイシンまたはメチオニンのごとき１の非極性（疎水性）残基と別の非極性残基との置換、アルギニンおよびリジン間、グルタミンおよびアスパラギン間、グリシンおよびセリン間のごとき１の極性（親水性）残基と別の極性残基との置換、リジン、アルギニンまたはヒスチジンのごとき１の塩基性残基と別の塩基性残基との置換、あるいはアスパラギン酸またはグルタミン酸のごとき１の酸性残基と別の酸性残基との置換を包含する。また、「保存的置換」なる語句は、誘導体化されていない残基に代わる、の化学的に誘導体化された残基の使用も包含するが、得られる蛋白またはペプチドは本発明蛋白またはペプチドと生物学的に等価であることが条件となる。「化学的に誘導体化」とは、機能的側鎖基の反応により化学的に誘導体化されている１個またはそれ以上の残基を有する蛋白またはペプチドをいう。かかる誘導体化分子の例は、遊離アミノ基が誘導体化されてアミン塩酸塩、ｐ−トルエンスクホニル基、カルボベンゾキシ基、ｔ−ブトキシカルボニル基、クロロアセチル基またはホルミル基を形成している分子を包含するが、これらに限らない。遊離カルボキシル基を誘導体化して塩、メチルおよびエチルエステルまたは他のタイプのエステルまたはヒドラジドを得てもよい。遊離ヒドロキシル基を誘導体化してＯ−アセチルまたはＯ−アルキル誘導体を得てもよい。ヒスチジンのイミダゾール窒素を誘導体化してＮ−イムベンジルヒスチジンを得てもよい。また、１個またはそれ以上の天然に存在する２０個のアミノ酸の誘導体を含む蛋白またはペプチドも化学的誘導体に包含される。例えば、プロリンのかわりに４−ヒドロキシプロリンを用いてもよく；リジンのかわりに５−ヒドロキシリジンを用いてもよく；ヒスチジンのかわりに３−メチルヒスチジンを用いてもよく；セリンのかわりにホモセリンを用いてもよく、リジンのかわりにオルニチンを用いてもよい。また、ペプチドが生物学的に本発明蛋白またはペプチドと等価である限り、本発明蛋白またはペプチドは、本明細書に示すペプチド配列と比較して１個またはそれ以上の残基の付加および／または欠失を有する蛋白またはペプチドを包含する。用語「生物学的に等価」は、上で説明したような、活性を大体保持しているポリペプチドまたはペプチドの活性をいう。詳細には、該アンフィレグリンの活性は、上記のごとくヘパリンにより部分的に阻害される分裂促進活性を意味する。あるいはまた、本発明は、ＡＲ９７−１８７の他の活性を大体保持しているアナログにも関する。アンフィレグリンに関して存在することが知られている活性を測定する当該分野において知られた方法(例えば、米国特許第５１１５０９６号、Cook et al.,M ol.Cell.Biol.11,p.2547-2557(1991)、Shoyab et al.,Science 243,p.1074-1076 (1989)およびShoyab et al.,Mol.Cell.Biol．10,p.1969-1981(1990)に記載の方法、これらの文献を参照により本明細書に記載されているものとみなす)により、ＡＲ９７−１８７ポリペプチドおよびそのアナログの活性をアッセイしてもよい。本発明ポリペプチドまたはペプチドは、１０ｎｇ／ｍｌ未満、好ましくは５ｎｇ／ｍｌ未満、より好ましくは１ｎｇ／ｍｌ未満のＥＤ５０を示す場合、強力に分裂促進性であるとみなされる。ＥＤ５０は、細胞の最大刺激の半分を得るのに必要な濃度として定義される。さらに、上記アッセイにおいてＡＲ９７−１８７により得られる最大刺激値は、ＥＧＦの最大刺激用量により得られる値の少なくとも１０％、好ましくは２５％、より好ましくは少なくとも５０％であるべきである。また、ＡＲ９７−１８７またはそのアナログの１個または数個のアミノ酸の欠失、より詳細にはＡＲ９７−１８７（配列番号：１に示す）のＣ末端の欠失を含むペプチドも本発明に含まれ、このようにして長さの異なるペプチドを得ることができる。例えば、該欠失ペプチドは、ＩＶＤＤ（配列番号：１４）Ｎ末端配列を含む限り、６０アミノ酸未満（配列番号：１のアミノ酸１から６０またはそれ未満まで）、５０アミノ酸未満（配列番号：１のアミノ酸１から５０またはそれ未満まで）、４０アミノ酸未満（配列番号：１のアミノ酸１から４０またはそれ未満まで）、３０アミノ酸未満（配列番号：１のアミノ酸１から３０またはそれ未満まで）、または２０アミノ酸未満（配列番号：１のアミノ酸１から２０またはそれ未満まで）からなるものであってもよい。また、ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログのアミノ酸配列中に少なくとも１つの上記Ｃ末端欠失を含むポリペプチド、特に組み換えポリペプチドも本発明に含まれる。また、ＡＲ９７−１８７またそのアナログからなる融合ペプチドも本発明に含まれる。用語「融合ポリペプチド」は、ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログが１個の連続したアミノ酸鎖の一部となっており、そのような鎖は天然に存在しないポリペプチドを意味する。融合ポリペプチドはアンフィレグリンに対して外来性であるアミノ酸配列（異種配列）を含んでいてもよい。用語「ポリペプチドおよびペプチド」は、本発明の残りの部分において混用される。アミノ酸鎖のＮまたはＣ末端のいずれかにおいてポリペプチド化学の分野において知られたいずれかのタイプの修飾によりＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログをさらに修飾してもよい。１個またはそれ以上のアミノ酸のアナログ（例えば、非天然アミノ酸、ＰＮＡ等を包含）を含むポリペプチド、置換された結合ならびに当該分野において知られた他の修飾（ともに天然に存在するものあるいは天然に存在しないもの）を伴うポリペプチドも包含される。ＡＲ９７ −１８７ポリペプチドまたはそのアナログは、グリコシレーション、アセチル化、リン酸化等のごとき発現前修飾を含んでいてもよい。さらなる具体例によれば、本発明は、ケラチノサイトにより産生され、ケラチノサイトから単離されるものとして特徴づけられるＡＲ９７−１８７ポリペプチドに関する。好ましくは、該ケラチノサイトは部分的に分化した、多層の表皮シートの形成を可能にする培地中で培養されたヒトケラチノサイトである。より好ましくは、該ケラチノサイトは実施例の部分において説明するように高カルシウム血清含有培地中で培養される。非ヒトケラチノサイトまたは他の細胞がやはり活性のあるアンフィレグリンのバージョンを産生しうること、ならびにそれらの細胞のインビトロ増殖の産生工程を死体からの直接回収により置き換えることができることが、さらに予想されうる。さらなる具体例において、本発明は、下記精製プロセスにより得ることのできるＡＲ９７−１８７ポリペプチドに関する：（ａ）多層ケラチノサイト培養物から２４時間のならし培地を調製すること、（ｂ）工程（ａ）で得た培地をヒドロキシアパタイトアフィニティーカラムに適用し、約２００ｍＭＮａＣｌでカラムを溶離すること、（ｃ）工程（ｂ）で得たヒドロキシアパタイト溶離物をヘパリンアフィニティーカラムに適用し、約５００ないし１０００ｍＭ、好ましくは５５０ないし９００ｍＭ、より好ましくは６００ないし７５０ｍＭの間のＮａＣｌで溶離して生物学的活性のあるフラクションを集めること、（ｄ）工程（ｃ）で得たヘパリン溶離物をＰｏｒｏｓＨＳカチオン交換カラムに適用し、ｐＨ約７.２におけるＮａＣｌグラジエントでカラムを溶離し、約５００ないし１２００ｍＭ、好ましくは５５０ないし１０００ｍＭ、より好ましくは６５０ないし９００ｍＭの間のＮａＣｌで溶離して生物学的活性フラクションを集めること、（ｅ）工程（ｄ）で得たＰｏｒｏｓＨＳ溶離物をＨＥＭＡＣＭカチオン交換カラムに適用し、ｐＨ約７.２におけるグラジエントでカラムを溶離し、約０.１ないし０.７Ｍ、好ましくは０．１５ないし０.６Ｍ、より好ましくは０.２ないし０.４Ｍの間のＮａＣｌで溶離して生物学的活性フラクションを集めること、（ｆ）工程（ｅ）で得たＨＥＭＡＣＭ溶離物をＺｏｒｂａｘＣ８微小孔ＲＰＣカラムに適用し、０．1％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルのグラジエントでカラムを溶離し、約１６ないし３２％、好ましくは約１８ないし３０％、より好ましくは約２１ないし２７％の間のアセトニトリルで溶離して生物学的活性フラクションを集めること。言及した各カラムまたはクロマトグラフィーマトリックスは、例えば、下記製造業者から供給される。ヒドロキシアパタイトはBio-Rad Laboratories Ltd.(He rcules，CA，USA)kala;takouseiヘパリンおよびＰｏｒｏｓＨＳはPerspective Biosystems（Cambridge,MA,USA）から；ＨｅｍａＣＭカラムはAlltech Assoc iates，Inc．(Deerfield，IL，USA)から、そしてＺｏｒｂａｘＣ８カラムはLC Packings（Amsterdam，The Netherlamds）から得られ、製造業者の指示に従って使用する。精製プロセスの間、実施例３記載のＢａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおいて生物学的活性を測定してもよい。精製手順の重要な態様は、Cookら（Mol.Cell.Biol.11,p.2547-2557(1991)）により用いられた分化していないケラチノサイト培養物から得られた培地とは対照的に、出発物質が層状の多層ケラチノサイト培養物から得られるならし培地であることである。分化したケラチノサイトは、本発明に開示されるアンフィレグリンの新規ＡＲ９７−１８７形態の産生能により、分化していないケラチノサイトと異なる。さらなる具体例によれば、本発明は、組み換え発現されたＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたは上記定義のそのアナログに関する。用語「組み換え発現」は、本発明蛋白が原核細胞、下等真核細胞または高等真核細胞において組み換え発現法により製造されるという事実をいう。用語「下等真核細胞」は、酵母、真菌等のごとき宿主細胞をいう。一般的には、下等真核細胞は単細胞である（必ずしもそうではない）。好ましい下等真核細胞は酵母、特にSaccharomyces、Schizosaccharomyces、Kluyveromyces、Pichia （例えば、Pichia pastoris）、Hansenula（例えば、Hansenula polymorpha）、 Yarowia、Schwaniomyces、Schizosaccharomyces、Zygosaccharomyces 等である。Saccharomyces cerevisiae、S．carlsbergensisおよびK．lactisは最も通常に用いられる酵母宿主であり、便利な真菌宿主である。用語「原核細胞」はE．coli、Lactobacillus、Lactococcus、Salmonella、Strep tococcus、Bacillus subtilisまたはStreptomycesのごとき宿主をいう。これらの宿主もまた本発明に含まれると考えられる。用語「高等真核細胞」は、哺乳動物、爬虫類、昆虫等のごとき高等動物由来の宿主細胞をいう。現在好ましい高等真核宿主細胞はチャイニーズハムスター（例えば、ＣＨＯ）、サル（例えば、ＣＯＳおよびＶｅｒｏ細胞）、ハムスター胎児腎臓（ＢＨＫ）、ブタ腎臓（ＰＫ１５）、ウサギ腎臓１３細胞（ＲＫ１３）、ヒト骨肉腫細胞系１４３Ｂ、ヒト細胞系ＨｅＬａおよびＨｅｐＧ２のようなヒト肝癌細胞系、ならびに昆虫細胞系（例えば、Spodoptera frugiperda）ゆらいのものである。宿主細胞は懸濁液またはフラスコ培養物、組織培養物、器官培養物等として提供される。また、宿主細胞はトランスジェニック動物であってもよい。よって、本発明は、該ＡＲ９７−１８７または上で定義したそのアナログをコードしている組み換えポリヌクレオチドまたは組み換え核酸にも関する。用語「組み換えポリヌクレオチドまたは組み換え核酸」は、ゲノムのポリヌクレオチドまたは核酸、ｃＤＮＡ、半合成または合成のものを意味し、その起源または遺伝子操作法により、（１）本来結合しているポリヌクレオチドの全体または一部分に結合していないもの、（２）本来結合しているもの以外のものに連結しているもの、あるいは（３）本来存在しないものがある。さらに本発明は、適当な調節配列の制御下にある該組み換えポリヌクレオチドまたは核酸を含む組み換えベクターに関する。さらに本発明は、ＡＲ９７−１８７またはそのアナログをコードしている核酸を担持している組み換えベクターで形質転換された組み換え宿主細胞に関する。用語「ベクター」は、所望の読み枠をの複製および／または発現を提供する配列をさらに含むレプリコンである。「レプリコン」は遺伝学的エレメントであり、例えば、プラスミド、染色体、ウイルス、コスミド等であり、細胞中のポリヌクレオチド複製の自律的単位として挙動するものであり、すなわち、それ自身の制御下で複製しうるものである。種々のベクターを用いてＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログの組み換え発現物を得てもよい。典型的には、酵母およびグリコシレーション変異株のごとき下等真核細胞をプラスミドで形質転換するか、あるいは組み換えウイルスで形質転換する。ベクターは宿主内で独立して複製可能であるか、あるいは宿主細胞のゲノム中に組み込まれうる。高等真核細胞をベクターで形質転換してもよく、あるいは組み換えウイルス、例えば組み換えワクシニアウイルスに感染させてもよい。外来ＤＮＡをワクシニアウイルス中に挿入するための方法およびベクターは当該分野においてよく知られており、例えば、同種組み換えが上記挿入に用いられる。種々のウイルスプロモーター配列、可能ならばターミネーター配列およびポリ（Ａ）付加配列、可能ならばエンハンサー配列および可能ならば増幅配列（これらすべては哺乳動物での発現に必要である）は当該分野において利用可能である。バキュロウイルスAutographa californica核多角体ウイルス（ＡｃＮＰＶ）由来の昆虫発現トランスファーべクターも知られており、それはヘルパー非依存性ウイルス発現ベクターである。この系由来の発現ベクターは、通常には、強力なウイルス多角体遺伝子プロモーターを用いて異種遺伝子の発現をドライブする。異種ＤＮＡをバキュロウイルスの所望部位中に導入するための異なるベクターならびに方法はバキュロウイルス発現に関する当業者に利用可能である。また、昆虫細胞により認識される翻訳後修飾のための異なるシグナルも当該分野において知られている。用語「制御配列」は、連結されているコーディング配列の発現を行うために必要なポリヌクレオチド配列をいう。かかる制御配列の性質は宿主生物により異なり、原核細胞においてはかかる制御配列は通常、プロモーター、リボソーム結合部位、およびターミネーターを含み、真核細胞においてはかかる制御配列は通常、プロモーター、ターミネーター、およびいくつかの場合にはエンハンサーを含む。用語「制御配列」は、少なくとも、その存在が発現にとり必要であるすべての成分を包含し、また、その存在が有利であるさらなる成分（例えば、分泌を支配するリーダー配列）を含んでいてもよい。用語「プロモーター」は、ｍＲＮＡ生成が隣接構造遺伝子についての通常の転写開始部位から開始するような様式でＤＮＡ鋳型へのＲＮＡポリメラーゼの結合を可能にするコンセンサス配列を含むヌクレオチド配列である。「作動可能に連結」なる表現は、そのように説明された成分が意図された様式で機能しうる関係にあるように並置されていることををいう。コーディング配列に「作動可能に連結された」制御配列は、制御配列に適合した条件下でコーディング配列の発現が行われるように連結されている。「読み枠（ＯＲＦ）」はポリペプチドをコードしているポリヌクレオチド配列の領域であり、ストップコドンを含まない。この領域はコーディング配列の一部または全コーディング配列であってもよい。「コーディング配列」は、適当な調節配列の制御下に置かれた場合、ｍＲＮＡに転写され、あるいはポリペプチドに翻訳されるポリヌクレオチド配列である。コーディング配列の境界は、５’末端のスタートコドンの翻訳および３’末端の翻訳ストップコドンの翻訳により決定される。コーディング配列はｍＲＮＡ、ＤＮＡ（ｃＤＮＡを包含）、および組み換えポリヌクレオチドを包含しうるが、これらに限らない。コーディング配列が配列ＩＶＤＤ（配列番号：１４）の前に開始コドンを置くことにより形成される場合には、発現生成物はそのＮ末端にメチオニンを含むであろう（それゆえ、配列ＭＩＶＤＤから始まる）。ベクター配列中に挿入されたＡＲ９７−１８７またはその所望アナログをコードしている核酸セグメントをシグナル配列に結合してもよい。該シグナル配列は非アンフィレグリン起源のものであってもよく、例えば、哺乳動物細胞での発現にはＩｇＧまたは組織プラスミノゲンアクチベーター（ｔｐａ）のリーダー配列であってもよく、酵母細胞中での発現にはα−接合因子であってもよいが、本発明の特に好ましい構築物は、ＡＲ９７−１８７蛋白の個々の開始点の前のアンフィレグリンｃＤＮＡ中に出現するシグナル配列を含んでいる。該組み換え宿主細胞は上記の原核細胞、または下等真核細胞または高等真核細胞であってよい。用語「組み換え宿主細胞」、「宿主細胞」、「細胞」、「細胞系」、細胞培養物」、および単細胞体として培養された微生物または高等真核細胞系を示す他のかかる用語は、組み換えベクターまたは他のトランスファーポリヌクレオチドの受容者として使用されうる、あるいは使用されてきた細胞をいい、トランスフェクションされた元の細胞の子孫を包含する。単一の親細胞からの子孫は形態またはゲノムもしくは全ＤＮＡ相補物元の親と必ずしも同一でなくてもよいことが理解される。それは自然変異、突然変異または誘発された変異による。さらなる具体例によれば、本発明はグリコシレーションされたＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログ（組み換え生産されたものまたはそうでないもの）に関する。さらなる具体例によれば、本発明はグリコシレーションされていないＡＲ９７ −１８７ポリペプチドまたはそのアナログ（組み換え物またはそうでないもの）に関する。さらに本発明は、ＡＲ９７−１８７または上記定義のそのアナログを含む組成物に関する。より詳細には、本発明は、ＡＲ９７−１８７形態のアンフィレグリンまたは上記のその変種および先行技術の部分に記載した、すでに知られている形態のアンフィレグリンの混合物を含む組成物に関する。本発明の他の好ましい組成物は、ＥＧＦファミリーの増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、ＰＤＧＦイソ形態、ＴＧＦ−βイソ形態またはインスリン様増殖因子に属するいずれかの因子のごとき増殖調節因子と本発明のＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはその変種との混合物を含む。該組成物は少なくとも医薬上活性量の本発明ＡＲ９７−１８７またはそのアナログを含有する。さらなる具体例によれば、本発明は、ＡＲ９７−１８７またはそのアナログの１つを含む組成物または調合品に関し、該組成物は、例えば実施例６に記載のトリチウムチミジン取り込みアッセイにおいてアッセイした場合に、例えばＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイトに対して強力に分裂促進性である。さらなる具体例によれば、本発明は、上記の分裂促進活性がヘパリン（１０μ ｇ／ｍｌ）により完全には阻害されないＡＲ９７−１８７またはそのアナログを含む組成物に関する。さらに本発明は、本発明ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログの製造方法に関する。該方法は、上記組み換えベクターで形質転換された上記の適当な宿主を培養することによりポリペプチドを組み換え発現させることを含む方法であり、下記工程を含む： − 本発明組み換えベクターで形質転換した上記宿主細胞を適当な培地で培養すること − 上記の該ベクター配列を適当な条件下で発現させること、 − 例えば、アフィニティー精製、ゲル濾過、あるいは当該分野において知られた他の適当な方法により、宿主細胞による培養ならし培地または宿主細胞の溶解物から該組み換え蛋白を回収すること。別法として、本発明ペプチドまたはポリペプチドを、古典的な化学合成により製造してもよい。均一溶液または固相において合成を行ってもよい。例えば、均一溶液中での合成方法は、Houbenweyl（"Methoden der organischen chemie"(Me thod of organic chemistry),Wunsh編，第１５−ＩおよびＩＩ巻 Thieme,Stuttg art,1974）により記載されたものを用いてもよい。本発明ポリペプチドまたはペプチドを、例えばAthertonおよびShepard("Solid phase peptide synthesis",IR L press,Oxford，1989)により記載された方法に従って固相において製造してもよい。本発明ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログのもう１つの好ましい製造方法は： − ヒトケラチノサイトを増殖させ、それらを多層シートに分化させること、 − 例えばアフィニティー精製、ゲル濾過、あるいは当該分野において知られた他の適当な方法により、宿主細胞による培養ならし培地または宿主細胞の溶解物からＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログを回収することを含む。さらに本発明は、医薬上許容される賦形剤中のＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログを有効成分として含む医薬に関する。さらに本発明は、医薬として使用されるＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログに関する。さらに本発明は、種々の疾病または傷害状態、より詳細には、皮膚の創傷（熱傷、潰瘍、外科的創傷等を包含）、角膜の創傷、鼓膜の再構築、腸または胃の潰瘍、皮膚科学的疾病、骨の疾病、癌（結腸、前立腺、卵巣、膵臓等）またはアンフィレグリンが必要あるいは有用である他の症状のうちの少なくとも１つの症状の治療方法におけるＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログの使用に関する。また本発明は、有効量のＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログのうち１つを投与することを含む上記いずれかの疾病の治療方法に関する。用語「有効量」は、所望治療を行うのに十分なＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログの量をいう。この量は適用により変更され、種、年齢、個体の全身的状態、治療いすべき症状の重さ、個々のポリペプチドおよびその投与方法により変更されてもよい。常套的な実験を用いて適当な有効量を容易に決定することができる。本発明ポリペプチドを、個々の適用に適すると考えられるいずれかの生理学的に許容される形態として投与してもよい。これには、水性液体中の処方、ゲル、クリームまたは軟膏が包含される。ある目的には、調節放出処方の形態としてポリペプチドを投与して、標的組織または器官が長時間にわたって適当な用量に曝露されるようにすることが特に有利であるかもしれない。多くの調節放出デバイスが当業者に知られている。例えば、ペプチドを微小球に入れ、拡散により、あるいは微小球マトリックスの分解により除々に放出されるようにしてもよい。もう１つの適用形態は、リポソームまたは類似の脂質小胞中にポリペプチドを入れることによる。他の適用には、例えば、皮膚の創傷には、ペプチドを薬用包帯または傷用の膏薬に染み込ませてもよい。かかる微小球または包帯の製造に特に適した材料は、ポリラクチド、コラーゲン、デキストラノマー、ゼラチン、アルギネートまたは他の多糖類等のごとき生分解性材料を包含する。最適な適用形態は、治療すべき個々の症状、所望放出特性、送達すべき用量、予定された組成物の有効期限等により変更されるであろう。さらに本発明は、上記疾病の治療のための医薬の製造のためのＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログの使用に関する。さらに本発明は、本発明ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログに対して特異的に生成された抗体に関する。好ましくは、該抗体はモノクローナル抗体であり、好ましくは、本発明ＡＲ９７−１８７ポリペプチドまたはそのアナログに対して特異的に反応するものである。本発明モノクローナル抗体を、上記の本発明アンフィレグリンポリペプチドまたはそのアナログに対して免疫された動物の脾臓細胞、特にマウスまたはラットの脾臓細胞と、他方、ミエローマ細胞とから古典的方法により得られ、動物の免疫に最初に使用されたポリペプチドを認識するモノクローナル抗体の産生能により選択されうるハイブリドーマにより生成せることができる。本発明に使用される抗体は、酵素、蛍光、または放射性タイプの適当な標識により標識することができる。本発明のこの好ましい具体例によるモノクローナル抗体は、組み換えＤＮＡ法により得られるマウスモノクローナル抗体のヒト化バージョンであって、ＨおよびＬ鎖をコードしているマウスおよび／またはヒトのゲノムＤＮＡ配列に由来するもの、あるいはＨおよびＬ鎖をコードしているｃＤＮＡクローンに由来するものであってもよい。あるいはまた、本発明の、この好ましい具体例によるモノクローナル抗体はヒトモノクローナル抗体であってもよい。かかるヒトモノクローナル抗体は、例えば、ヒト末梢血リンパ球（ＰＢＬ）および重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウス（最近のレビューとしては、Duchosal et al．1992参照）を用いて、あるいは本発明抗体を用いて反応性Ｂ細胞の存在に関して感染または接種された個体のＥＢＶ形質転換リンパ球をスクリーニングすることにより調製される。また本発明は、レパートリークローニング法(Persson et al.，1991)による組み換え抗体の選択のための、本発明蛋白、そのアナログ、またはそれらに由来するペプチドの使用に関する。ある種の病理学的状態は、本明細書記載のアンフィレグリンのイソ形態の発現過剰、発現不足または不適当な発現、あるいは本明細書記載のイソ形態の欠損変種の発現から生じうる。それゆえ、本発明ポリペプチド、ペプチド、本発明ペプチドのフラグメントまたはそれらに対する抗体は、上記疾病をスクリーニングし、モニターする診断目的に有用でもありうる。図面の説明図１：Ｂａｌｂ／ＭＫＴＩＡにおいて試験されるフラクションの分裂促進活性を示すＡＲ９７−１８７標品の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）である。図２：ＲＰＣ−８により精製されたＡＲ９７−１８７標品のＳＤＳ−ＰＡＧＥである。Zorbax C8カラム蛋白から溶離された蛋白をSpeed-vacで乾燥し、１００ｍＭＤＴＴを含有するサンプルバッファー中で復元した。PHASTシステム上の、前以て成形された２０％ＳＤＳ−アクリルアミドゲルにより試料を電気泳動した。分裂促進活性の量（Ｂａｌｂ／ＭＫアッセイにおいて観察され、ユニットとして示される、実施例３参照）を各レーン上に印刷してある。図３：アミノ酸配列および質量分析データのまとめである。ＡＲ９７−１８７の全推定アミノ酸配列を図３ａに示す。６ないし１７ｋＤａのバンドのトリプシン消化ペプチドを連続した線およびペプチド名により示す。ＭＡＬＤＩにより質量シグナルを得た理論上のトリプシンペプチドを、それらの理論質量とともに図３ｂに示す。質量シグナルがＭａｌｄｉの間に得られた１７ｋＤａのバンド上のペプチドを＃で、質量シグナルがＭａｌｄｉの間に得られた６ｋＤａのバンド上のペプチドを＊で示す。ＭＡＬＤＩデータのまとめについては表ＩＩも参照。図４：ａ）ヘパリン（１０ｐｇ／ｍｌ）存在下または不存在下のＢａｌｂ／ＭＫＴＩＡにおけるＡＲ９７−１８７標品（５０、１５０または４５０倍希釈）の活性である。比較のため、ＥＧＦ用量応答曲線を付けてある。ｂ）ヘパリン（１０μｇ／ｍｌ）存在下または不存在下のＢａｌｂ／ＭＫＴＩＡにおけるＭＣＦ−７標品（４００ないし６４００倍希釈）の活性である。比較のため、ＥＧＦ用量応答曲線を付けてある。図５：ａ）ＴＩＡにおけるＡＲ９７−１８７標品（５５、１５０または４５０倍希釈）のＮＲＫ細胞に対する活性である。比較のため、ＥＧＦ用量応答曲線を付けてある。ｂ）ＴＩＡにおける組み換えアンフィレグリン標品（ｒＡＲ７８、E．coli において産生）のＮＲＫ細胞に対する活性である。比較のため、ＥＧF用量応答曲線を付けてある。図６：軟寒天コロニー形成アッセイにおけるＡＲ９７−１８７標品（５０、１５０または４５０倍希釈）の活性である。比較のため、ＥＧＦ用量応答曲線を付けてある。図７：ＴＩＡにおけるＡＲ９７−１８７標品（５０、１５０または４５０倍希釈）および組み換えアンフィレグリン標品（ｒＡＲ７８、E．coliにおいて産生）のＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に対する活性である。比較のため、ＥＧＦ用量応答曲線を付けてある。実施例１．ケラチノサイト培養 RheinwalおよびGreen（Cell 6，331-344，1975）一次ヒトケラチノサイトをメッシュ状の裂け目のある厚い皮膚標本から単離した。細胞を１７５ｃｍ²Falcon フラスコ中のマイトマイシンＣ処理された３Ｔ３支持細胞層に２８０００個／ｃｍ²の密度で撒いた。培地は下記のものであった（ＭＣＥＣ−ｔｏｔという）：ＤＭＥＭ／Ｈａｍ’ｓＦ１２（３／１）、１０％ウシ胎児血清、１０ｎｇ／ｍｌマウスＥＧＦ、０.４μｇ／ｍｌヒドロコルチゾン、９ｎｇ／ｍｌコレラ毒素、５μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、２ｐＭトリヨードチロニンおよび０.１８ｍＭアデニン。集密になった時、ケラチノサイトをトリプシン処理し、２回目の継代のために１／３希釈して再度撒いた。ならし培地の調製には、通常には２回目の継代の終了時の集密多層表皮シートを用いた。熱傷患者の治療には、同じシートをルーチンに使用した。２．ならし培地の調製培養期間の終了時に、層状表皮シートをＰＢＳで３回洗浄し、血清、ＥＧＦ、コレラ毒素、トランスフェリン、トリヨードチロニン、インスリン、ヒドロコルチゾンおよびアデニン不含のＭＣＥＣ−ｔｏｔ培地に移した。３７℃で２４時間後、このならし培地を集め、精製に使用するまで−２０℃で保存した。全体として、７０リットルのならし培地（ＣＭ）を精製のために集めた。３．バイオアッセイＢａｌｂ／ＭＫＴＩＡこのアッセイは、ネズミＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイト中へのトリチウム標識チミジンの取り込みを測定することにより試験因子の分裂促進能を測定するものである。Ｂａｌｂ／ＭＫケラチノサイト（Weissman and Aaronson，Cell 32，599-606, 1993）を、１０％不活性化ＦＣＳ、５ｎｇ／ｍｌＥＧＦ、０.０５ｍＭＣａＣｌ₂および０.０２ｍＭパントテン酸カルシウムを補足したＳＭＥＭの入った４８ウェル組織培養プレート中に２００００個／ウェルの密度で撒く。２４時間後、培地を、０.２ｍＭエタノールアミン、１０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、５μｇ／ｍｌトランスフェリンおよび５μｇ／ｍｌインスリンを添加した４００μＬのＳＭＥＭ／Ｆ１２（７／１）と交換する。２４時間後、培地を除去し、同じ添加物および１００μｌの試験因子を含有する３００μＬのＳＭＥＭ／Ｆ１２（７／１）と交換する。６時間後、細胞をトリプシン処理により集め、取り込まれた標識量を標準的方法により決定する。このアッセイにおいて、１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦを陽性対照として用いる。このアッセイにおいて、生物学的活性１ユニットは、１ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと同量の取り込まれた標識を生じる活性量として定義される。Ｂａｌｂ／３Ｔ３ＴＩＡこのアッセイは、Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞（ＡＴＣＣＣＣＬ−１６３）中へのトリチウム標識チミジン取り込みを測定するものである。この細胞系は、プレ蛋白の残基１０１および１０７から開始するアンフィレグリンのサブ形態には応答しない(Shotb et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85,6528-6532,1988)。細胞を、２％不活性化新生ウシ血清を含有する２００μｌのＤＭＥＭ(Gibco-BRL, カタログ番号３２６００−０８３)の入った９６ウェルプレート中の５０００個／ウェルの密度で撒くこと以外は、上記Ｂａｌｂ／ＭＫＴＩＡと本質的に同様にしてアッセイを行う。２４時間後、培地を、血清不含の１５０μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（Ｆ１２:Gibco-BRL、カタログ番号２１７００−０９１）と交換し、試験試料（５０μｌ）を添加する。２４時間後、１μＣｉのトリチウム化チミジンを添加し、６時間後、細胞を集めて取り込まれた放射性標識を測定する。ＦＢＨＥＣＴＩＡこのアッセイは、ウシ胎児心臓内皮細胞（ＦＢＨＥＣ，ＡＴＣＣＣＲＬ１３９５）におけるトリチウム化チミジンの取り込みを測定するものである。０ .１％ゼラチンで１０分間プレコーティングした９６ウェルプレートであって、２０％ＦＣＳを含有する１００μｌのＤＭＥＭの入った９６ウェルプレートに、１０００個／ウェルの密度で細胞を撒く。６時間後、１００μｌの試料を添加し、６４時間後、培地を除去し、１０％ＦＣＳおよび０.５μＣｉのチルチウム化チミジンを含有する２００μｌのＤＭＥＭと交換する。６時間後、細胞を集め、取り込まれた放射活性を測定した。ＮＲＫ−４９ＦＴＩＡこのアッセイは、ＮＲＫ−４９Ｆ（ＡＴＣＣＣＲＬ１５７０）細胞におけるトリチウム化チミジンの取り込みを測定するものである。５００μｌＤＭＥＭ＋１０％ウシ胎児血清の入った４８ウェルプレートに、１２５００個／ウェルの密度でＮＲＫ−４９細胞を撒き、３７℃で７２時間インキュベーションする。培地を、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウムおよび１０μｇ／ｍｌトランスフェリンを含有する５００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１／１）と交換する。２４時間後、培地を除去し、３０ｎＭ亜セレン酸ナトリウム、１０μｇ／ｍｌトランスフェリン、５μｇ／ｍｌインスリン、１μＭレチノイン酸および０.０１％ＢＳＡを含有する４００μｌのＤＭＥＭ／Ｆ１２（１／１）と交換する。１００μｌの試料を添加する（最終希釈率１／５）。４５時間後、０.５μＣｉのトリチウム化チミジンを添加する。３７℃で２時間インキュベーション後、細胞をトリプシン処理し、取り込み標識量を測定する。軟寒天におけるＮＲＫ−４９細胞のコロニー形成アッセイこのアッセイは、軟寒天に低密度で撒かれたＮＲＫ−４９により形成されるコロニー数を測定するものである。１０％ウシ胎児血清および非必須アミノ酸を含有するＤＭＥＭ中に作成された０.５％寒天の溶液１ｍｌを３７℃において６ウェルプレート中に注ぎ、放置してゲルを室温とする。３７℃において１ｍｌの下記組成物を寒天の上部に注ぐ。該組成物はＤＭＥＭ中に作成された０.３％寒天、１０％ウシ胎児血清および非必須アミノ酸を含有し、さらに３５００個のＮＲＫ−４９Ｆ細胞および１００μｌの試験試料を含有する。室温でゲル化後、ウェルを３７℃で７ないし８日インキュベーションする。このインキュベーション期間後、５個以上の細胞を含むコロニーを顕微鏡分析によりスコア付けする。４．ＡＲ９７−１８７の精製クロマトグラフィー手順ヒトケラチノサイトから得られた１５０リットルのならし培地を集め、さらなる処理を行うまで−２０℃で保存した。特記する場合を除き、すべての精製手順を４℃で行った。すべての場合においてクロマトグラフィーのフラクションをバイオアッセイの間−７０℃で保存し、次の処理工程の直前に融解し、プールした。ヒドロキシアパタイトによる精製１０リットルのならし培地のバッチを融解し、濾過（０.２２μｍ、Millipore 製）により清澄化した。ホスフェートおよびCＨＡＰＳを添加して最終濃度を、それぞれ１０ｍＭおよび０.０５％（ｗ／ｖ）とした。培地のｐＨを７.３に合わせ、溶液を３０ｃｍ／時の速度で８０ｍｌのBiogel HTP(Biorad)（１０ｍＭＫ₂ ＨＰＯ₄／ＫＨ₂ＰＯ₄，０.１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，ｐＨ７.３で平衡化されている）に適用した。１２５ｍｌの平衡化バッファーでカラムを洗浄し、次いで、ステップワイズグラジエント（５０ｍＭホスフェートを３００ｍｌ、２００ｍＭホスフェートを３５０ｍｌ、次いで４００ｍＭホスフェートを４００ｍｌ）を１５ｃｍ／時で適用することにより結合蛋白を脱離させた。４００ｍｌの５００ｍＭホスフェート，ｐＨ７.３，ＣＨＡＰＳ０.１％で樹脂を再生した。溶離物を１０ｍｌのフラクションとして集め、試料を２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７.２，１５０ｍＭＮａＣｌ中に１２倍希釈し、Ｂａｌｂ／ＭＫＴＩＡにおいて１／４８および１／９６希釈してアッセイした。Ｐｏｒｏｓヘパリンによるクロマトグラフィー２００ｍＭで溶離された生物学的活性フラクションをプールし、２０ｍＭＨＥＰＥＳ，０.１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳ，ｐＨ７.２（バッファーＡ）で４倍希釈した。１２Ｌのならし培地に相当する試料を１５３ｃｍ／時の速度で４ｍｌのＰｏｒｏｓヘパリンカラム（５０ｐｍのビーズ、Perseptive Biosystems）（前以てバッファーＡで平衡化）に負荷した。１５０ｍＭＮａＣｌを含むカラムの５倍容のバッファーＡで樹脂を洗浄した。ヘパリンに結合した蛋白を、バッファーＡ中のＮａＣｌグラジエントを適用することにより７６ｃｍ／時の速度で溶離した。グラジエントは（ｉ）カラムの８倍の体積中の１５０ｍＭから７５０ｍＭまでの直線的グラジエント；（ｉｉ）カラムの２倍の体積中の７５０ｍＭで洗浄、次いで（ｉｉｉ）カラムの３倍の体積中の１ＭＮａＣｌでのステップグラジエント。３ＭＮａＣｌを含有するバッファーＡで樹脂を再生した。１ｍｌのフラクションを集め、バイオアッセイ用試料をＰＢＳで６０倍希釈希釈し、アッセイにおいて１／２４０および１／４８０希釈して試験した。強カチオン交換体（ＰｏｒｏｓＨＳ）によるクロマトグラフィー６５０〜７５０ｍＭＮａＣｌでヘパリンクロマトグラフィーから溶離された生物学的活性のあるフラクションをプールした。１７リットルのならし培地に相当する量をバッファーＡで４倍希釈し、３６０ｃｍ／時の速度で９００μｌのＰｏｒｏｓＨＳカラム（２０μビーズ、Perseptive Biosystems）に負荷した。１００ｍＭＮａＣｌを含有するカラムの３倍容のバッファーＡでカラムを洗浄した。バッファーＡ中の１００ｍＭから１Ｍまでの直線的な塩のグラジエント（カラムの１０倍容）を適用することにより結合蛋白を１５０ｃｍ／時で溶離した。洗浄および溶離をＳＭＡＲＴシステム(Pharmacia)で行い、５００μｌのフラクションを集めた。バイオアッセイ試料をＰＢＳで１２０倍希釈し、１／４８０および１／９６０希釈してアッセイした。弱カチオン交換体（ＨＥＭＡＣＭ）によるクロマトグラフィー６５０〜９００ｍＭＮａＣｌでＰｏｒｏｓＨＳから溶離された生物学的活性のあるフラクションをプールし、バッファーＡで７倍希釈した。３０Ｌのならし培地に相当する試料を、１８０ｃｍ／時の速度で８００μｌの弱カチオン交換ＨＰＬＣカラム（ＨＥＭＡＩＥＣＢＩＯＣＭ，４.６ｘ５０ｍｍ）(A1ltech)に負荷した。１００ｍＭＮａＣｌを含有するカラムの１０倍容のバッファーＡでカラムを洗浄し、次いで、バッファーＡ中の１００ｍＭから１ＭＮａＣｌの直線的グラジエント（カラムの１０倍容）で溶離した。洗浄および溶離をＳＭＡＲＴシステム(Pharmacia)で行い、１％（ｗ／ｖ）ＣＨＡＰＳでプレコーティングされたチューブ中に２００μｌのフラクションを集めた。２.５μｌをＰＢＳで希釈し、最終希釈率１／９６０および１／１９２０としてＢａｌｂ／ＭＫバイオアッセイに使用した。微小孔逆相クロマトグラフィーＨＥＭＡＣＭＨＰＬＣカラムから溶離された生物学的活性のあるフラクションをプールし、ＴＦＡを添加して０.１％（ｖ／ｖ）とした。６リットルのならし培地に対応する試料を６０ｃｍ／時の速度で７５μｌの微小孔逆相Ｃ８カラム（０.８ｘ１５０ｍｍ，LC Packings）（支持体として Zorbax C8（５μビーズ）を充填）に負荷した。カラムをカラムの３倍容の平衡化バファー（ＭＱ中０.１％（ｖ／ｖ）ＴＦＡ）で洗浄し、平衡化バッファー中の０から１００％のアセトニトリルの直線的グラジエント（カラムの１４倍容）を適用することにより溶離した。ＣＨＡＰＳでプレコーティングしたエッペンドルフチューブ中の４０μｌの中和バッファー（２０ｍＭＨＥＰＥＳ，ｐＨ７，２）中に２０μｌのフラクションを集めた。２μｌのバイオアッセイ試料をＰＢＳで希釈し、１／１２００および１／１４００の最終希釈を行ってＢａｌｂ／ＭＫバイオアッセイにおいて試験した。ＳＭＡＲＴシステム（Pharmacia）を用いてクロマトグラフィーを行った。活性フラクションは２１ないし２７％アセトニトリルで溶離した。１の逆相クロマトグラフィー（ＲＰＣ）から得られる典型的な溶離プロフィールを図１に示す。全部で５１リットルのならし培地相当分をＲＰＣにより精製し、Ｂａｌｂ／ＭＫアッセイにおいて全部で６９７３ユニットの活性を得た。５．ＰＡＧＥ、質量分析、配列決定ＳＤＳ／ポリアクリルアミドゲル電気泳動 ShaggerおよびVon Jagnov（An．Bioch．166，368-379，1987）の方法に以下の小さな変更を加えてＳＤＳ−ＰＡＧＥを行った。該変更は、分離ゲルを１５％アクリルアミド／ビスアクリルアミド溶液を用いて調製したことである。試料バッファーは４％（ｖ／ｖ）ＳＤＳ、１２％（ｖ／ｖ）グリセロール、０.０５ＭＴｒｉｓ／ＨＣｌ，ｐＨ６.８、０.０１％（ｗ／ｖ）ブロモフェノールブルーを含んでいた。沈殿または凍結乾燥した蛋白試料を、１００ｍＭＤＴＴ含有または不含の試料バッファー中に再懸濁し、５分間煮沸した。蛋白を０.７５ｍｍゲル（１５ｘ１２ｃｍ）に負荷し、トラッキング色素がゲルの最下部に到達するまで電気泳動により分離した。HeukeshovenおよびDernik(Electrophoresis，19889:2 03-209)の方法に従って銀染色法を用いて蛋白を可視化した。別法として、１μ ｌ〜４μｌのスロットを用いて蛋白をＰＨＡＳＴ−システム(Pharmacia)に負荷し、前以て成形された２０％の均一ゲルにより分離した。電気泳動後、電気泳動された蛋白を上記と同じ方法により染色した。ＲＰＣからの活性フラクションを図２に示すようにプールし（プール１〜５）、上記のごとくＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析した。結果（図２）は、活性が主に１７〜１８ｋＤａの二重バンドに対応しており、さらなるバンドが４５ｋＤａおよび６〜４ｋＤのところにも存在した。４５ｋＤａのバンドは生物学的活性には対応せず、６ｋＤａのバンドは１７〜１８ｋＤａのバンドよりもずっと活性が低いが生物学的活性を有していた。蛋白用量 M.M.Bradford(An.Biotech．72，248-254，1976)により記載されたクーマシーブリリアントブルーＧ２５０結合により蛋白濃度を決定した。１.５ｍｌの使い捨てキュベット（Brand）中で、蛋白試料（５０μｌ）を７５０μｌのブラッドフォード溶液（０.０１％（ｗ／ｖ）クーマシーブリリアントブルーＧ−２５０（Sigma）、４.７％（ｗ／ｖ）エタノール（Merck）および８.５％（ｗ／ｖ）リン酸（Merck））中に希釈し、ＭＱ水で１２５０μｌとした。キュベットを倒立させることにより内容物を混合し、ＵＶ−ＶＩＳ１２０５分光光度計（Shimadz u）において、盲検試薬に対して５８５ｎｍで吸光度を測定した。２５ないし７５０μｇ／ｍｌの範囲のウシ血清アルブミンによる標準曲線からの線形回帰分析により蛋白濃度を決定した。キャリブレーション蛋白をＰＢＳ中に調製した。生物学的活性のあるプールの質量スペクトル分析マトリックス補助レーザー脱離イオン化質量スペクトル分析(matrix-assisted laser desorption ionization mass spectrometry;ＭＡＬＤＩ）により、プールしておいた生物学的活性のあるフラクション（図２参照）を分析した。大部分の活性プール物（プール２）において、主要ピークが１２９３７、１１７７６および５８.６Ｄａに検出された。これらの質量は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて観察された１７〜１８および４〜６ｋＤａのダブレットに対応している可能性がある。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける１７〜１８ｋＤａの移動度とスペクトル分析により観察された質量プロフィールとの間の相違は、おそらく、ＳＤＳゲルにおけるアンフィレグリンの異常に遅い移動に関係しているのであろう。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより測定されたＡＲの質量とゲル濾過により質量との間の同様の相違も Shoya bら（Proc.Natl.Acad.Sci．USA 85，6528-6532，1988）により報告されている。トリプシン消化ペプチドの質量スペクトル分析最終精製工程後、やはり異なる蛋白バンドがＳＤＳ−ＰＡＧＥにより観察された。クロマトグラフィー手段によってはこれらを均一にまで精製することは困難であるとわかったので、調製用ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルから異なるバンドを単離することを決定した。ＲＰＣ−クロマトグラフィーから得た生物学的活性フラクションをプールし、ＳＤＳおよびＤＴＴを添加してそれぞれ０.０４％（ｗ／ｖ）および２ｍＭとし、混合物を室温で１時間インキュベーションした。speedvacを用いて試料を１００倍に濃縮し、試料バッファー（ＳＤＳ不含）に再懸濁し、パラフィン油をかぶせて５分間煮沸した。使用したエッペンドルフチューブを２００ μｌの８０％ＡＣＮ−０.１％ＴＦＡで再生して特異的に吸着した蛋白を回収し、上記のごとく処理した。試料をＰＨＡＳＴ−システム（Pharmacia）に負荷し、分離された蛋白バンドをクーマシーブリリアントブルー染色により可視化した。これらのゲルから２つのゾーン（１７〜１８ｋＤａのダブレットを含むゾーンおよび６ｋＤａのバンドを含むゾーン）を切り取った。次いで、これらのバンドを含むアクリルアミドフラグメントをトリプシン消化に付した。なおトリプシンはリジンおよびアルギニン残基の後ろを開裂する（これらの残基の後ろにプロリンがある場合を除く）。次いで、トリプシン消化ペプチドをゲルスライスから溶出し、溶出したものの約１／５００を質量スペクトル分析用に使用した。これにより下記質量を得た（トリプシン自己消化ペプチドに帰属することのできる質量値を除いた）：１７〜１８ｋＤａのダブレット：１１６１，１５９５，２３１６，２４５０，２６１０，４３１３，４７２７，８６１６６ｋＤａのバンド：５６８，１１６０，１３０１，１３２５，１５９６，１６９５，２０８３，２３２３，２４７０トリプシン消化ペプチドのアミノ酸配列ゲルスライスから溶出されたトリプシン消化ペプチドをＣ４Ｖｙｄａｃ(1mm ｘ 250mm)ＲＰＣカラムで分離した。次いで、数個の別個のペプチドのピークをA pp1iedBiosystems 477Aシークエンサーにより自動エドマン分解にかけた。アンフィレグリンイソ形態に帰属されるペプチド配列を表１に示す。アミノ酸配列決定データのまとめを図３に示す。数個のＲＰＣ精製ペプチドをさらにＭＡＬＤＩにかけた。この分析結果を表２に示す。結果の解釈１７〜１８ｋＤａのダブレット：ＳＤＳ−ＰＡＧＥおよび生物学的活性のデータを一緒にして判断すると、主要生物学的活性は１７〜１８ｋＤａのところに移動するダブレットに関連している。表１１７ｋＤａのダブレットについて：６ｋＤａのバンドについて：表１の説明：トリプシン消化後に見いだされたペプチド配列ならびに１７ｋＤａおよび６ｋＤａのバンドとして存在する溶出蛋白のペプチド配列決定表２１７ｋＤａのバンドから得られたペプチドの質量：トリプシン消化混合物消化混合物のＨＰＬＣ分離後のトリプシン消化ペプチド６ｋＤａのバンドから得たペプチド質量：トリプシン消化混合物：消化混合物のＨＰＬＣ分離後のトリプシン消化ペプチド：表２の説明：１７ｋＤａおよび６ｋＤａのバンドとして存在する蛋白のトリプシン消化後に得られたペプチドバンドの、ＨＰＬＣにより個々のペプチドの分離前または後の分子質量。ウシトリプシン、ブタトリプシン、ニワトリリゾチームおよびヒトアンフィレグリンからの理論上のトリプシン消化ペプチドに対応するペプチド質量が太字で印刷してあり、それぞれＴＢ、ＴＰ、ＬＣおよびＡＨで示す。ＭＡＬＤＩ−ＭＳ分析は、これらのバンドの真のサイズはそれぞれ１１７７６および１２９３７Ｄａであることを示す。アミノ酸配列決定結果は、これらの蛋白バンドから得られた大部分のトリプシン消化ペプチドは、Shoyabら（Science 243，1074-1076，1989）により公表されたヒトアンフィレグリン配列に対応している。しかしながら、１のペプチド配列（ＩＶＤＤＳＶ（Ｒ）；配列番号：４を有するペプチドＴ１０）はこれまで公表された最長のアンフィレグリンイソ形態よりも４アミノ酸早い位置から開始している（該最長のイソ形態はプレペプチドの残基１０１から開始し、ＳＶＲＶＥＱ（配列番号：１２）を有する）。このペプチドのＭＡＬＤＩ−ＭＳのピークは分子量８０４Ｄａを示し、このペプチドの理論分子量（８０２Ｄａ）にほぼ対応している。このペプチドＴ１０のＮ末端はトリプシン認識部位には対応しておらず（この領域のプロペプチドの配列は...ＱＩＰＧＹ↓ＩＶＤＤＳＶＲ...（配列番号：１３）であり、↓は推定上の開裂部位を示す）、それは新たな形態のアンフィレグリンの天然のＮ末端に対応していると結論しなければならない。本願においてＡＲ９７−１８７と呼ばれるこの新たな形態は、少なくとも９０個のアミノ酸を含み、上記の残基１０１から始まるイソ形態よりも４アミノ酸早い位置から開始する。さらに、我々は、これまで公表された最短のアンフィレグリンイソ形態に対応するトリプシン消化ペプチド(ＶＶＫＰＰＱＸＫＴＥＳＸＮＴＳＤＸ(配列番号：２)を有するペプチドＴ７およびＶＶＫＰＰＱＸＫＴ（配列番号：３）を有するペプチドＴ８)も検出した（該最短のイソ形態はプレ蛋白の残基１０７から開始し、配列ＶＶＫＰＰＱ（配列番号：１４）を有する;Shoyab et al.,Science 243 ,1074-1076，1989）。未消化の１７〜１８ＫＤａのダブレットに基づいて得られたＭＡＬＤＩ−ＭＳデータにより、これら２つのアンフィレグリンイソ形態に関する１７〜１８ｋＤａのダブレットの同一性も確認した。このことは、これら２つの蛋白の質量がそれぞれ１１７７６Ｄａおよび１２９３７Ｄａであることを示した。これら２つの質量の相違（１１６１Ｄａ）は、プレ蛋白の残基９７から開始するイソ形態（ＡＲ９７−１８７）とプレ蛋白の残基１０７から開始するイソ形態との間の質量の理論的に計算された相違（１１５９Ｄａ）と非常に近いものであった。この相違は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで観察された１７ｋＤａと１８ｋＤａのバンドの間の質量の相違にも近かった。ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける両方のバンドはほぼ同じ強度であり、さらに１１７７６Ｄａおよび１２９３７ＤａのＭＡＬＤＩ−ＭＳのシグナルも同様の強度であるので、我々は、ＡＲ９７−１８７およびプレ蛋白の残基１０７から開始するイソ形態は我々の試料中にほぼ等モル存在していると結論する。配列番号：１中の位置１４の配列ＮＫＴは推定上のＮ−グリコシレーション部位に対応する。ペプチドＴ７、Ｔ８およびＴ１０のエドマン配列決定中に位置１４のＮ残基が検出されないという事実は、この部位がグリコシレーションされるのに必要であることを示す。６ｋＤａバンド：エドマン配列決定は、６ｋＤａのバンドとして存在する蛋白のトリプシン消化ペプチドもアンフィレグリン配列に対応していることを示す。このバンドの質量（ＭＡＬＤＩ−ＭＳにおいて６７８０Ｄａ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおいて約６ｋＤａ）は、プレ蛋白の残基９７、１０１または１０７から開始するイソ形態のいずれかよりもかなり小さいので、我々は、これらのアンフィレグリンイソ形態のうち１つの蛋白分解生成物に関連するものと結論する。この分解生成物は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにおける強度がゲルに負荷した活性量に対応していないので、おそらく活性がわずかであるかまたは無いであろう。この分解生成物は、配列番号：１の残基２７〜４７に存在するＡｒｇ−Ｌｙｓ豊富領域における１回またはそれ以上の開裂により生じたものであると推察される。６．インビトロでのＡＲ９７−１８７含有標品の生物学的活性およびこの活性に対するヘパリンの影響Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞に対する活性精製中にネズミＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイト細胞についてトリチウムチミジン取り込みアッセイにより活性を追跡する。１５０Ｌのならし培地の精製により全部で１００００Ｕの活性が得られ、平均比活性は約６２５Ｕ／μｇであった。 Cooke ら（Mol．Cell．Biol．11，2547-2557、1991）は、これまで知られているアンフィレグリンイソ形態（プレ蛋白の残基１０１または１０７から開始する）の、この細胞タイプおよび他の細胞タイプに対する生物学的活性はヘパリン存在下でほぼ完全に阻害されることを示した。対照的に、ＲＰＣ−８により精製されたＡＲ９７−１８７を含有する標品の残存活性は、１０μｇ／ｍｌのヘパリンの存在下で、ヘパリン不存在下の活性の２１ないし５７％の間であった。対照として、ヘパリンクロマトグラフィーによるＭＣＦ−７由来のアンフィレグリン豊富化標品を対照として付けた（該標品はプレ蛋白の残基１０１および１０７から開始するイソ形態を含む）。同じアッセイ条件下で同じ活性範囲において、予想どおり、ＭＣＦ−７標品はほぼ完全に阻害された（ヘパリン存在下の残存活性はヘパリン不存在下の活性の０ないし１０％）（図４ａ、ｂ参照）。このことは、実際にはアッセイにおけるヘパリン濃度が、残基１０１または１０７から開始するイソ形態（ＡＲ９７−１８７イソ形態ではない）の完全なブロックを行うには十分高かったことを示す。このことは、ＡＲ９７−１８７標品の分裂促進活性は、すでに記載されたアンフィレグリンイソ形態の分裂促進活性とは異なるものであることを示す。ＦＢＨＥ細胞の活性ＦＢＨＥ細胞（ＡＴＣＣＣＲＬ１３９５）によるトリチウムチミジン取り込みアッセイは、ＥＧＦファミリーに属する増殖因子に対して抑制された特異性を有すると考えられる(Zoelen,Prog.in Growth any Factor Res.2,131-152,1990) 。予想どおり、我々のＡＲ９７−１８７標品はこのアッセイにおいて活性を示さなかった。ＮＲＫ細胞のトリチウムチミジン取り込み残基１０１および１０７から開始するアンフィレグリンイソ形態は、デオキシウリジン取り込みアッセイにおいて正常なラット腎臓ＮＲＫ−ＳＡ６細胞に対して活性があることが報告されている（Shoyab et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 8 5,6528-6532,1988）。我々は、トリチウムチミジン取り込みアッセイにおいて、組み換え法による７８アミノ酸のアンフィレグリン標品（E．coli において産生される、プレ蛋白の残基１０７から開始するサブ形態、R&D Systems の２６２− ＡＲ−１００番）ならびに我々のＡＲ９７−１８７標品の、ＮＲＫ−４９Ｆ細胞（別の正常ラット腎臓細胞系）に対する活性を調べた。対照として、天然のマウスＥＧＦを用いた。図５は、組み換えＡＲおよびＡＲ９７−１８７標品の両方がこれらの細胞に対して分裂促進的であることを示す。ＥＧＦ曲線との比較により、１／１５０希釈されたＡＲ標品は約０．２８ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと等価な分裂促進活性を含むであろう。８ｎｇ／ｍlの組み換えアンフィレグリン標品は０.３０９ｎｇ／ｍｌのＥＧＦと同程度の分裂促進活性量を含む。このことは、このアッセイにおいて、１／１５０希釈されたＡＲ９７−１８７標品は約８ｎｇ／ｍｌの組み換えアンフィレグリン標品と同程度の分裂促進活性を有し、１／５０希釈されたＡＲ９７−１８７標品は２４ｎｇ／ｍｌの組み換え法による７８アミノ酸のアンフィレグリン形態に対応することを意味する。軟寒天におけるＮＲＫ細胞のコロニー形成 Shoyabら（Science 243，1074-1076，1988）は、プレ蛋白の残基１０１および１０７から開始するアンフィレグリンのサブ形態はＮＲＫ−ＳＡ＆細胞のコロニー形成に対するインデューサーでないことを報告している。我々は、組み換え法による７８アミノ酸のアンフィレグリン標品（E．coli において産生される、R& D Systems の２６２−ＡＲ−１００番）に関してこのことを確認した（このサブ形態も２ないし１２８ｎｇ／ｍｌの範囲においてＮＲＫ−４９Ｆ細胞のコロニー形成を誘導しなかった)。対照的に、我々のＡＲ８８標品はこれらの細胞のコロニー形成を有意に誘導したが、ＥＧＦよりもずっと誘導が弱かった（図６）。このことは、ＡＲ９７−１８７形態のアンフィレグリンの分裂促進特性が、プレ蛋白の残基１０１から開始するアンフィレグリンのサブ形態の特性とは異なることを確認するものである。Ｂａｌｂ／３Ｔ３細胞に対する活性 Shoyabら（Proc.Nat1.Acad．Sci.USA 85,6528-6532，1988）によれば、８４個および７８個のアミノ酸のイソ形態のアンフィレグリンはネズミＢａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞に対して活性を示さない。ＡＲ９７−１８７がこれらの細胞に対して活性であるかどうかを明かにするため、我々はＲＰＣ−８により精製したＡＲ９７−１８７標品を、１／５０ないし１／６４００の範囲の希釈率のＢａｌｂ／３Ｔ３ＴＩＡにおいてアッセイした。対照として、０.０６３ないし４ｎｇ／ｍｌの範囲のＥＧＦの希釈曲線および０.１６ないし１２０ｎｇ／ｍｌの範囲の組み換えンフィレグリン（E.coliにおいて産生される７８個のアミノ酸のイソ形態であり、プレ蛋白の残基１０１から開始する、R&D Systems の２６２−ＡＲ−１００番）の希釈曲線を付けた。図７に示すように、得られたＡＲ９７−１８７標品は明確な用量−応答効果を示し、ＡＲ９７−１８７が実際にＢａｌｂ／３Ｔ３細胞に対して活性があり、組み換えアンフィレグリンのイソ形態および上記の他のアンフィレグリンイソ形態とは対照的であった。１２０ｎｇ／ｍｌの組み換えアンフィレグリン標品は１／５０希釈されたＡＲ９７−１８７標品の５倍の分裂促進活性を含むはずであるが（ＮＲＫＴＩＡにおける両標品の比較に基づく、上記参照）、それはＢａｌｂ／３Ｔ３細胞を上記対照値以上に有意に刺激しなかった。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｐ 17/02 Ａ６１Ｋ 31/00 ６１７Ｃ 19/08 ６１９Ｄ 27/02 ６２７Ａ 27/16 ６２７Ｈ 35/00 ６３５Ａ６１Ｋ 38/00 39/395 Ｄ 39/395 ＮＣ０７Ｋ 14/47 Ｃ０７Ｋ 14/47 14/485 14/485 16/22 16/22 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｈ 5/10 21/08 Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｔ 21/08 33/53 ＤＧ０１Ｎ 33/50 33/577 Ｂ 33/53 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ａ 33/577 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ファン・ヘオフェルスウィン，ヒューゴベルギー、ベー―9270ラールネ、コルマンストラート62番

Claims

【特許請求の範囲】１．ヘパリン結合特性を有する、Ｎ末端に配列ＩＶＤＤを含むポリペプチドであって、ＩＶＤＤＦＳＶＩＫでないポリペプチド。２．ヘパリン結合特性を有する、Ｎ末端に配列ＩＶＤＤＳＶＲを含むポリペプチド。３．Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞、および／またはＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイトおよび／またはＮＲＫ細胞、および／またはＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞に対して分裂促進活性を有する請求項１または２記載のポリペプチド。４．ヘパリン存在下で完全には阻害されない分裂促進活性を有する請求項１ないし３のいずれかに記載のポリペプチド。５．約０.５ないし約０.８Ｍの間のＮａＣｌでヘパリンカラムから溶離されることをさらに特徴とする請求項１ないし４のいずれかに記載のポリペプチド。６．ケラチノサイト細胞培地または溶解物から得ることのできる請求項１ないし５のいずれかに記載のポリペプチド。７．該ケラチノサイト細胞がヒトの部分的に分化した、層状の、多層になったケラチノサイトである、請求項６記載のポリペプチド。８．配列番号：１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含むポリペプチドであって、Ｂａｌｂ／ＭＫ細胞に対する分裂促進特性を保持しており、この効果を示すことにおいてヘパリンに対してより感受性が低いポリペプチド。９．配列番号：１に示すアミノ酸配列を伴うポリペプチド。１０．配列番号：１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含むポリペプチドおよび／または配列番号：１に示すアミノ酸配列に対する保存的置換を有するポリペプチドであって、配列番号：１のＮ末端配列ＩＶＤＤを含むポリペプチド。１１．配列番号：１に示すアミノ酸配列の少なくとも一部を含む請求項１ないし７のいずれかに記載のポリペプチドであって、アミノ酸残基メチオニンが前にある配列番号：１のＮ末端配列ＩＶＤＤＳＶＲを含むポリペプチド。１２．Ｂａｌｂ／３Ｔ３繊維芽細胞、および／またはＢａｌｂ／ＭＫケラチノサイト、および／またはＮＲＫ細胞、および／またはＳｗｉｓｓ３Ｔ３繊維芽細胞に対して分裂促進活性を有する請求項１ないし１１のいずれかに記載のポリペプチド。１３．請求項１ないし１２のいずれかに記載のグレコシレーションされたポリペプチド。１４．請求項１ないし１２のいずれかに記載のグレコシレーションされていないポリペプチド。１５.請求項１ないし１４のいずれかのポリペプチドを含む融合ポリペプチド。１６．請求項１ないし１５のいずれかのポリペプチドを特異的に認識することをさらに特徴とする、モノクローナル抗体もしくはポリクローナル抗体、またはレパートリークローニングによるスクリーニングにより得ることのできる組み換え抗体の超可変領域、またはファージディスプレイにより得ることのできるペプチドもしくは小型蛋白。１７．少なくとも一部分が配列ＭＩＶＤＤＳＶＲ中に含まれるエピトープを認識し、よって請求項１ないし１５のポリペプチドを特異的に認識する、モノクローナル抗体、またはレパートリークローニングによるスクリーニングにより得ることのできる組み換え抗体の超可変領域、またはファージディスプレイにより得ることのできるペプチドもしくは小型蛋白。１８．ポリクローナル抗体の生成またはモノクローナル抗体の生成またはレパートリークローニングによるスクリーニングにより得ることのできる組み換え抗体のスクリーニングのための、ペプチドＩＶＤＤまたはＭＩＶＤＤＳＶＲを含むポリペプチドの使用（該ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体および組み換え抗体は請求項１ないし１５のいずれかのポリペプチドを特異的に認識する）。１９．医薬として使用される請求項１ないし１５のポリペプチド。２０．医薬として使用される請求項１６または１７の抗体。２１．下記症状のいずれかを治療するための医薬の製造のための請求項１ないし１５のいずれかに記載のポリペプチドの使用：皮膚の創傷（熱傷、潰瘍、外科的創傷、瘢痕形成等を包含）、皮膚の収縮、角膜の創傷または欠損、外科的処置後、鼓膜の再構築、または他の中耳の再構築、慢性耳漏、腸または胃の潰瘍、皮膚科学的疾病、骨の疾病、癌（結腸癌、前立腺癌、卵巣癌、膵臓癌等を包含）、またはアンフィレグリンが必要または有用である他の疾病状態。２２．請求項１ないし１５のいずれかのポリペプチドの異所性発現および／または過剰発現に関連した疾病の治療、詳細には下記疾病の治療のための医薬の製造のための請求項１６または１７のいずれかに記載の抗体の使用：皮膚科学的疾病、瘢痕形成または瘢痕組織形成、皮膚の収縮、腸または胃の潰瘍、骨の疾病、癌（表皮癌、腎臓癌、繊維芽細胞等を包含）。２３．請求項１ないし９のペプチドの脱調節に関連した疾病、または異なる形態のアンフィレグリン間の平衡の脱調節に関連した疾病を検出するための診断薬の製造のための請求項１４または１５のいずれかに記載の抗体の使用。２４．組織培養における表皮細胞の増殖特性を維持あるいは操作するための、請求項１ないし１５のいずれかのポリペプチド、あるいは請求項１６または１７のいずれかの抗体の使用。２５．下記工程：層状の多層表皮シートの形成を可能にする培地中で培養することによりケラチノサイトを増殖させること、あるいは請求項１ないし９に示すポリペプチドを発現する他の細胞を増殖させること、アフィニティークロマトグラフィー、より詳細には請求項１４または１５の抗体を用いる免疫アフィニティークロマトグラフィーにより活性フラクションを精製し回収すること、あるいは例えば下記のものを含む既知精製方法により活性フラクションを精製し回収すること：ゲル濾過法、またはヒドロキシアパタイトアフィニティーカラムを用い、約２００ｍＭでカラムを溶離すること、またはヘパリンアフィニティーカラムを用い、約５００ないし１０００ｍＭの間のＮａＣｌ、好ましくは５５０ないし９００ｍＭの間、より好ましくは６００ないし７５０ｍＭの間のＮａＣｌで溶離して生物学的活性のあるフラクションを集めること、またはカチオン交換カラムを用い、溶離により生物学的活性のあるフラクションを集めること、例えばＰＯＲＯＳＨＳカチオン交換カラムを用い、ｐＨ約７.２において約５００ないし１２００ｍＭの間のＮａＣｌ、好ましくは５５０ないし１０００ｍＭの間、より好ましくは６５０ないし９００ｍＭの間のＮａＣｌで溶離を行うこと、あるいはＨＥＭＡＣＭカチオン交換カラムを用い、ｐＨ約７.２において約０.１ないし０.７Ｍの間のＮａＣｌで溶離すること、あるいはＺｏｒｂａｘＣ８ＲＰＣカラムを用い、０.１％トリフルオロ酢酸中のアセトニトリルのグラジエントで溶離を行い、約１６ないし３２％の間のアセトニトリル、より好ましくは２１ないし２７％の間のアセトニトリルで溶離して生物学的活性のあるフラクションを集めることを含む、請求項１ないし１５のポリペプチドの製造方法２６．請求項１ないし１５に示すアンフィレグリンのバージョンを特異的に認識するモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体を生成させるための、請求項１ないし１５に記載のポリペプチドの使用。２７．請求項１ないし１５の組み換え発現ポリペプチド。２８．請求項１ないし１５のポリペプチドを発現および／または分泌するようにポリ核酸で形質転換された細菌、真菌、または真核細胞宿主。２９．下記工程：所望により、請求項１ないし１５のポリペプチドの最適な産生および／または分泌を可能にする培地中で請求項２８記載の適当な宿主細胞を増殖させること、培地および／または細胞溶解物から該ポリペプチドを回収すること、活性フラクションを精製し回収することを含む、請求項１ないし１５のポリペプチドの製造方法