JP2000504325A

JP2000504325A - 新規なトロンボポエチンの投与

Info

Publication number: JP2000504325A
Application number: JP9526889A
Authority: JP
Inventors: トーマス，グリフィス・アール
Original assignee: ジェネンテク・インコーポレイテッド
Priority date: 1996-01-25
Filing date: 1997-01-13
Publication date: 2000-04-11
Also published as: AU711639B2; ES2175333T3; WO1997026907A1; PT876152E; DE69712036T2; CA2242417A1; DK0876152T3; DE69712036D1; ES2315255T3; EP1201246A3; EP0876152B1; EP1201246A2; AU1533597A; EP1201246B1; US5879673A; DE69739050D1; ATE216257T1; ATE411039T1; EP0876152A1; DK1201246T3

Abstract

(57)【要約】本発明は、生物学的に活性なトロンボポエチン物質が、該物質の従来報告されている投与と同程度の投与量率で、しかし１日１回または低回数の投与で、実質的な治療効果を生じることができるという、予想外の驚くべき発見に基づく。したがって、本発明の目的は、治療を受けているか、または治療が必要な哺乳動物に、１日１回または低回数、治療に有効な量のトロンボポエチンを投与することにより、血小板減少症を逆転させることに関する。活性物質の好ましい用量は、体重１kg 当たり約１〜約１０μg/kg の範囲である。

Description

【発明の詳細な説明】新規なトロンボボエチンの投与本願、および本願に含まれる事項は、以下の特許出願およびそれらの内容に関連する。１９９４年１２月２８日に出願された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４５５３号（１９９５年７月１３日に国際特許公開第９５／１８８５８号として公開）ならびにそれに参照として引用されているいくつかの特許出願、すなわち、１９９４年１月３日に出願された米国特許出願第０８／１７６,５５３号、１９９４年１月２１日に出願された米国特許出願第０８／１８５，６０７号、１９９４年２月１５日に出願された米国特許出願第０８／１９６，６８９号、１９９４年４月４日に出願された米国特許出願第０８／２２３，２６３号、１９９４年５月２５日に出願された米国特許出願第０８／２４９，３７６号、１９９４年１２月２日に出願された米国特許出願第０８／３４８，６５７号および１９９４年１２月２日に出願された米国特許出願第０８／３４８，６５８号である。発明の分野本発明は、トロンボポエチン、ならびにその生物学的に活性な誘導体およびそのアイソフォームを、血小板減少症を含む免疫疾患および／または造血疾患の処置のために使用する新規な方法に関する。この使用は、そのような物質を、サイトカイン、特にコロニー刺激因子またはインターロイキンと同時投与することを包含する。この使用は、治療が必要な哺乳動物に、治療的に有効な量の該物質を投与することにより、血小板減少症を患っているか、またはその危険がある哺乳動物を処置する方法を含み、かつ該方法に含まれる。発明の背景造血系は、あらゆる哺乳動物の生存に必要であることが知られている、成熟した高度に分化した血液細胞を産生する。これらの成熟細胞には、酸素および二酸化炭素を輸送するよう分化した赤血球、細胞性および体液性の免疫反応を行うＴリンパ球およびＢリンパ球、血餅を形成するよう分化した血小板（plateletまたは thrombocyte）、ならびにスカベンジャーとしておよび感染と闘うためのアクセサリー細胞として分化した顆粒球およびマクロファージが含まれる。これらの分化した成熟血液細胞は全て、主に骨髄に存在する、多能性幹細胞と呼ばれる単一の共通の原始細胞型に由来する。成熟した高度に分化した血液細胞は、哺乳動物の一生を通して、絶えず大量に産生されなければならない。これらの分化した血液細胞の大多数は、わずか数時間〜数週間しか機能的な活性を維持できないよう運命づけられている。したがって、哺乳動物が生存し続けるために必要な、正常な定常状態の血液細胞を維持するためには、これら成熟血液細胞、その原始幹細胞のみならず、原始細胞と成熟細胞との間に存在する全ての中間細胞または特定の系統に方向付けられた前駆細胞系統が継続的に再生されることが必要である。造血系の中心には、多能性幹細胞が存在する。これらの細胞は、比較的少数しか存在せず、増殖により自己再生し、娘幹細胞を産生するか、または一連の分化段階において増加しながら系統限定された前駆細胞へと形質転換され、最終的には高度に分化した成熟血液細胞を形成する。正常な造血細胞系の基本的な原則として、多能性が失われ、系列限定および成熟が得られるにつれ、自己再生能力は減少するようである。したがって、造血細胞スペクトルの一端には、自己再生を行うことができ、様々な系統に特異的に方向付けられた前駆体全てに分化することができる多能性幹細胞が存在する。スペクトルの他方の端には、高度に系統限定された前駆細胞、および自己再生能は失っているが、成熟した機能的活性を獲得した、それらの分化細胞が存在する。幹細胞および系統制限された前駆細胞の増殖および分化は、様々な造血増殖因子またはサイトカインにより慎重に制御されている。したがって、造血増殖因子は、一つまたは複数の系統の増殖および分化に影響を与えることもあり、単一の前駆細胞に他の増殖因子と重複した影響を与えることもあり、または他の因子と共同作用することもある。上記のことより、いかなるものであってもよい血液細胞またはそれらの前駆細胞の生存、増殖、分化または成熟に影響を与える新規な造血増殖因子は、特に、疾患または放射線療法もしくは化学療法により傷害を受けた造血系を再構成するために有用であることが理解されよう。血小板は、血液凝固メカニズムの重要な因子である。血小板減少症と呼ばれる、循環血中の血小板レベルの枯渇は、様々な臨床的状態および疾患で起こり、現れる。臨床上の血小板減少症は、通常、１リットル当たりの血小板数が約１５０× １０⁹より低い状態と定義されている。血小板減少症の主な原因は、血小板の寿命に基づき大きく３つのカテゴリーに分類できる。即ち、１）骨髄による血小板産生の障害、例えば化学療法および放射線療法により引き起こされる血小板減少症、２）脾臓における血小板の枯渇（巨脾腫）、３）末梢循環系における血小板破壊の増加、例えば自己免疫疾患により引き起こされる血小板減少症である。さらに、血小板が少ない血液製剤を大量に急速に投与された患者では、希釈という要因により血小板減少症が起こる場合がある。血小板減少症とその原因についてのより詳細な説明は、Schafner，「Thrombocytepenia and Disorders of Platel et Disfunction」，Internal Medicine,John J.Hutton et al.編,Litt1e,Brown & Co.，Boston/Toronto/London,第３版（1990）および上記の国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４５５３号（国際公開第９５／１８８５８号）を参照のこと。血小板減少症患者の治療法は、臨床的な状態の重篤度および緊急性により決定される。ＨＩＶ関連血小板減少症および非ＨＩＶ関連血小板減少症の治療は類似しているが、多数の異なる治療法が用いられており、未だに治療は臨床的に議論されている。上記のことより、血小板減少症を処置するための一つの方法は、巨核球またはそれらの前駆細胞の血小板産生型への分化および成熟を促進できる物質を得ることであるということが理解されよう。そのような物質の同定には、相当の努力が払われてきた。広く言及されている物資が、本出願の主題である、トロンボポエチン（ＴＰＯ）である。現時点で文献に一般的に見出されるＴＰＯの別名には、血小板産生刺激因子（ＴＳＦ）、巨核球コロニー刺激因子（ＭＫ−ＣＳＦ）、巨核球成長・発育因子、巨核球刺激因子、巨核球増強因子およびｍｐｌリガンドが含まれる。引用された国際特許出願第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４５５３号には、「ＭＰＬリガンド」（ＭＬ）、またはより一般的には「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）と名付けられた単離された哺乳動物巨核球産生増殖および成熟促進タンパク質の同定、単離、製造および使用が開示され、該タンパク質は、巨核球の成熟血小板産生型への増殖、成熟および／または分化を刺激できることが示された。国際特許公開第９５／２６７４６号、第９５／２１９１９号および第９５／２１９２０号も同様に参照のこと。第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４５５３号出願には、治療に有効な量のＴＰＯ物質を哺乳動物に投与することを含む、造血疾患、特に血小板減少症を患っているか、またはその危険のある哺乳動物を治療する方法を含む、関連するＴＰＯの実施態様の様々な面が含まれる。場合により、ＴＰＯは、単独で、またはサイトカイン、特にコロニー刺激因子またはインターロイキンと組み合わされて投与される。該国際特許出願に開示された目的において、ＴＰＯは、血小板減少症の治療用の、ＴＰＯ自体、または完全なＴＰＯと共通の少なくとも一つの生物学的性質を共有する断片を含む、それらの様々な変異体、誘導体またはアイソフォームを含むと、広義に定義されている。該特許出願に記載された様々なＴＰＯ物質の定義との関連において使用される場合、「生物学的性質」とは、ＴＰＯ物質により直接的または間接的に引き起こされる、または行われる、血小板産生活性またはインビボのエフェクターもしくは抗原としての機能もしくは活性を有していることを意味する。該第ＰＣＴ／ＵＳ９４／１４５５３号に開示されているトロンボポエチン物質の治療のための使用に関して、該出願には、薬学的に許容される担体と混合されたＴＰＯ物質の、任意のいくつかの投与形態による投与が記載されている。１日投与量は、体重１kg 当たり、およそ０．１〜１００μg/kg、好ましくはおよそ０．１〜５０μg/kg の範囲であり、好ましくは初回投与量は、体重１kg 当たりおよそ１〜５μg/kg の範囲であると記載されている。該特許出願の教示が意味するところは、血小板数の減少状態が推測された後、または実際にそのような状態になった後、数日〜多日数の期間にわたりそのような投与量率を投与する療法である。臨床投与されたトロンボポエチンの公開されている臨床試験には、血小板減少症を特徴とする症状のためには、１０日間にわたり１日に１回、体重１kg 当たり０．０３〜５．０μg/kg の用量で皮下投与することからなる用量および投与療法が示されている。Abstract 1977，Blood 86（1995）を参照のこと。Abstrac t 1012、1014、および1987，Blood 86(1995)も参照のこと。同様に、エリスロポエチンに与えられた名称、化合物エポエチン・アルファ(e poetin alfa)（アムジェン（Amgen）社よりエポゲン（Epogen）として市販されている）は、赤血球産生を刺激することが示された糖タンパク質である。どのような方法で実施されるにせよ、赤血球が枯渇している患者において赤血球の増殖を刺激するためには、何週間もの間、週に３回、１kg当たり１５０〜３００単位の範囲を越える用量ではじめることからなる用量および投与療法が示されている。アムジェン社がNeupogenとして販売しているフィルガストリム（Filgastrim）は、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）である。それが示す療法は、２週間にわたり、１日当たり５〜１０μg/kgを皮下投与することである。このような逸話的な証拠に基づくと、血小板減少症の影響を逆転させるための、赤血球またはその他の主要血液細胞を増殖させる物質の投与における従来の療法は、血小板減少症に至る症状の発現の後に、そのような治療が必要な患者に、多日数にわたり、毎日治療に有効な量の生物学的物質を継続的に投与するというものである。医師、および特に血小板減少症患者に便利なように、血小板減少症の影響を逆転させるための、有利で、治療効果が同等かまたは優れている、そのような生物学的物質の別の用量および投与療法を開発するという課題がある。発明の要旨本発明は、生物学的に活性なトロンボポエチン物質が、血小板減少症の治療を受けている、またはその治療が必要な患者に、治療に有効な量を、１日１回または低回数投与することにより、治療効果を生じることができるという、予想外の驚くべき発見に基づく。したがって、本発明は、基本的な面において、処置が必要な哺乳動物に、１日１回または低回数の用量で、治療に有効な量のトロンボポエチンを投与することを含む、血小板減少症を患っている、またはその危険のある哺乳動物を処置する方法に関する。好ましい面において、本発明は、治療に有効な量の１回投与に関する。用量に関して「低回数」という語は、治療に有効な量を短期間に複数回投与することを意味する。それは、治療反応、即ち血小板の産生／レベルの増加の開始とは無関係であり、本明細書でそのことが見出された。したがって、基本的な目的として、本発明は、治療に有効な量のトロンボボエチンのただ１回の投与に関する。そのような１回投与は、治療に有効な量の同物質を、従来技術により指示され教示されている、通常の複数回多日数療法で投与した場合に得られる治療効果と同等の治療効果を生じることが見出された。患者へのトロンボポエチンの１回投与は、血小板減少症の治療に治療的に有効であることが見出されているが、低回数（１日）療法を用いてもよい。ただし、その場合には、明白な臨床上の不利は別にしても、相当の、または有意な治療的意義が失われることが理解されよう。１回投与により治療反応の開始が刺激されること、そして、複数回投薬は本発明に含まれており、おそらくそれは臨床的状態および実際により左右されるであろうが、１回または低回数の投与の後の投薬の停止は、治療反応とは無関係であることが本発明において見出された。本発明により、本発明の１回または低回数の投与療法は、患者の体重１kg 当たり、およそ０．１〜１０μg、好ましくはおよそ０．３〜１０μg、より好ましくはおよそ０．５〜１０μg、さらに好ましくはおよそ０．５〜５μg という程度の比較的低い用量率で有効であることが見出された。１回投薬では、体重１kg 当たりおよそ２±１．５μgの全投与が好ましい。低回数投薬では、１回につき、体重１kg当たりおよそ０．５〜１．５μg の投与が好ましい。上記の投与量は、好ましい静脈内投与の場合のものである。皮下経路を介した投与の場合の総用量は、静脈経路の場合のおよそ１〜３倍の範囲、好ましくは約２倍となろう。最適な投薬速度および療法は、疾患の重篤度およびタイプ、体重、性別、食事、投与の時間および経路、他の薬剤、ならびに他の関連する臨床的要因を含む、物質の作用を修飾することが知られている様々な要因を考慮して、診療をする医師により決定される。本発明によると、本発明の療法は、体重１kg 当たりおよそ０．１〜１００μg、好ましくは体重１kg 当たりおよそ０．１〜５０μｇという広い範囲の用量の、本発明のトロンボポエチン物質の、１回または低回数の投与を含む。最も好ましくは、本発明は、体重１kg 当たり約０．１〜約１．０μg、またはより好ましくは体重１kg当たり約０.５〜約５μgの範囲内の用量の、１回または低回数の投与が、同一またはそれ以上の量を、１週間またはそれ以上より長く、多日数にわたり毎日投与する療法による投与と、治療的に同等な治療効果を生じることができるという、予想外の結果から想到された。本発明によると、本発明の生物学的に活性なトロンボポエチン物質は、鼻腔、肺、皮下、および好ましくは静脈を介した経路を含む、様々な経路で投与されうる。全ての場合に、投与経路に応じて、本発明の生物学的に活性なトロンボポエチン物質は、好ましくは、適当な薬学的に許容される担体または賦形剤と組み合わされて投与される。全身投与する場合には、治療用組成物は、発熱物質を含まず、適当な生理的ｐＨ、等張性および安定性を有する非経口投与において許容される溶液中に内含されている必要がある。これらの条件は、一般的に周知であり、当業者に容認されている。簡単に述べると、本発明の物質の投与製剤は、所望の純度を有する化合物を、生理学的に許容される担体、賦形剤および／または安定化剤と混合することにより、保存用または投与用に調製される。そのような物質は、使用される用量および濃度において受容者に対して無毒であり、リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩およびその他の有機酸塩のような緩衝剤；アスコルビン酸のような抗酸化剤；ポリアルギニンのような低分子量ペプチド、血清アルブミン、ゼラチンまたは免疫グロブリンのようなタンパク質；ポリビニルピロリジノンのような親水性重合体；グリシン、グルタミン酸、アスパラギン酸またはアルギニンのようなアミノ酸；セルロースもしくはその誘導体、グルコース、マンノースまたはデキストリンのような、単糖、二糖およびその他の炭水化物；ＥＤＴＡのようなキレート剤；マンニトールまたはソルビトールのような糖アルコール：ナトリウムのような対イオンおよび／または Tween、Pluronics またはポリエチレングリコールのような非イオン性界面活性剤を含む。本発明の生物学的に活性なトロンボポエチン物質は、遊離の酸もしくは塩基の形態として、または薬学的に受容可能な塩として投与することができ、そして容認されている薬学的実践により必要とされるような、生理学的に受容可能なビヒクル、担体、賦形剤、結合剤、保存料、安定化剤、香料などとの化合物にすることもできる。無菌の注射用組成物は、通常の薬学的または薬理学的な実務に従い処方することができる。例えば、水、またはゴマ油、ピーナッツ油もしくは綿実油などの天然に生じる植物油、またはエチルオレエートなどのような合成脂溶性ビヒクル中の活性物質の溶液または懸濁液が望ましい。また、緩衝液、保存料、抗酸化剤なども、容認されている薬学的実務に従い添加することができる。本発明の生物学的に活性なトロンボポエチン物質は、血小板減少症を特徴とする上記疾患および状態の治療において、単独で用いることもできるし、他のサイトカイン、ヘマトポエチン、インターロイキン、増殖因子、または抗体と組み合わせて投与することもできる。したがって、本活性物質は、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＬＩＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、Ｋｉｔリガンド、ＩＬ−６、ＩＬ−１１、ＦＬＴ−３リガンドなどを含むトロンボポエチン活性を含むタンパク質またはペプチドと組み合わせて用いることができる。徐放性製剤の適当な例には、フィルムまたはマイクロカプセルのような成形物の形態の、ポリペプチドを含む固体疎水性重合体の半透マトリクスが含まれる。徐放性マトリクスの例には、ポリエステル、ハイドロゲル［例えば、Langer et al.J.Biomed.Mater.Res.，15: 167-277(1981)およびLanger,Chem.Tec.，12: 98- 105(1982)によって記載されたポリ（２−ヒドロキシエチル−メタクリレート）、またはポリ（ビニルアルコール）］、ポリラクチド（米国特許第３，７７９，９１９号、欧州特許第５８，４８１号）、Ｌ−グルタミン酸とγエチル−Ｌ−グルタミン酸の共重合体（Sidman et al.，Biopolymers，22: 547-556[1983]）、非分解性エチレン−ビニル酢酸（Langerら、前記）、Luprom Depot^TM（乳酸−グリコール酸共重合体およびロイプロリド酢酸からなる注射可能なマイクロスフェア）のような分解性乳酸−グリコール酸共重合体、およびポリ−Ｄ−（−）−３ −ヒドロキシ酪酸（欧州特許第１３３，９８８号）が含まれる。エチレン−酢酸ビニルおよび乳酸−グリコール酸のような重合体は、１００日以上の間分子を放出させることが可能であるが、ある種のハイドロゲルがタンパク質を放出する期間は、それよりも短い。カプセルに包含されたタンパク質が長時間体内に滞留する場合、３７℃で水分に曝されることにより変性または凝集し、その結果、生物学的活性が失われ、おそらく免疫原性が変化する。関与するメカニズムにより、タンパク質の安定化のため、合理的な方法を工夫することが可能である。例えば、凝集のメカニズムがジスルフィド交換による分子間Ｓ−Ｓ結合形成であることが明らかになれば、スルフヒドリル残基を修飾し、酸性溶液から凍結乾燥し、適当な添加物を用いて水分量を調節し、そして特定の重合体マトリクス組成物を開発することにより安定化を達成することができる。徐放性血小板産生タンパク質組成物はまた、リポソームに取り込まれた巨核球産生タンパク質も含む。巨核球産生タンパク質を含むリポソームは、それ自体公知の方法により調製される（ドイツ特許第３，２１８，１２１号;Epstein et al .Proc．Natl．Acad．Sci．USA，82:3688-3698[1985]；Hwang et al．Proc．Natl .Acad．Sci．USA，77: 4030-4034[1980]；欧州特許第５２，３２２号;欧州特許第３６，６７６号；欧州特許第８８，０４６号；欧州特許第１４３，９４９号；欧州特許第１４２，６４１号;日本特許出願第８３−１１８００８号;米国特許第４，４８５，０４５号および第４，５４４，５４５号；ならびに欧州特許第１０２，３２４号）。通常のリポソームは、脂質含量が約３０モル％コレステロール以上であり、巨核球産生タンパク質治療が最適となるよう選択された比率に調整されている、小さな（約２００〜８００Å）単ラメラ型である。ＴＰＯ即ちｍｐｌリガンドの共有結合性修飾の一つの型は、米国特許第４，６４０，８３５号、第４，４９６，６８９号、第４，３０１，１４４号、第４，６７０，４１７号、第４，７９１，１９２号または第４，１７９，３３７号に記載された方法で、種々の非タンパク質性重合体の一つ、例えば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに、ＴＰＯポリペプチドを結合させることを含む。前記の重合体に共有結合したＴＰＯポリペプチドは、本明細書中ではＰＥＧ化したＴＰＯという。ｍｐｌへの結合、および上で定義したような免疫学的および／または生物学的活性の保持について最適な変異体を選択するためには、回収されたＴＰＯ変異体をスクリーニングする必要があることが理解されよう。組換え細胞培養物または血漿における安定性（例えば、タンパク質分解に対する安定性）、ｍｐｌメンバーに対する高親和性、酸化安定性、分泌される量の増加などについて、スクリーニングを行うことが可能である。例えば、ＴＰＯポリペプチドの免疫学的な性質の変化（例えばある特定の抗体に対する親和性）は、競合型イムノアッセイにより測定される。酸化還元安定性または熱安定性、疎水性またはタンパク質分解に対する感受性のようなタンパク質またはポリペプチドの特性の可能な修飾は、当該分野で周知の方法によりアッセイされる。本発明は、本明細書に記載された発明に含まれる関連する面および実施態様全てに関することが理解されよう。これらおよびこれらに関するその他の詳細、ならびに本発明全般は、以下に、より詳細に引き続き説明される本発明の開示の一部をなす。図面の簡単な説明ＦＩＧ．１５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物に、１、２、４または８日間、０．１μ gのｒｍＴＰＯ（３３５）を皮下注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。ＦＩＧ．２５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物に、実験開始から２４時間後に、種々のレベルのｒｍＴＰＯ（３３５）を１回、皮下注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。ＦＩＧ．３５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物の皮下または静脈へのｒｍＴＰＯ（３３５）の１回投与に対する血小板（パネルＡ）および赤血球（パネルＢ）の反応の対数直線表示である。プロットされた細胞数は、実験開始後１４日目の測ＦＩＧ．４５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物に、実験開始から２４時間後に、種々のレベルのｒｍＴＰＯ（３３５）を１回、静脈注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。ＦＩＧ．５５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物に、実験開始から２４時間後に、２０Ｋまたは４０Ｋの分子量のポリエチレングリコール（ｐｅｇ）に結合させた、種々の形態のｒｍＴＰＯ（１５３）を１回、皮下注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。ＦＩＧ．６５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより汎血球減少症にされた動物に、実験開始から２４時間後に、ｒｍＴＰＯ（３３５）または４０Ｋの分子量のポリエチレングリコール（ｐｅｇ）に結合させたｒｍＴＰＯ（１５３）を１回、皮下注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。ＦＩＧ．７５．０Ｇｙのγ線照射およびカルボプラチン（１．２mg）の組み合わせにより、汎血球減少症にされた動物に、実験開始から２４時間後に、ｒｍＴＰＯ（３３５）または４０Ｋの分子量のポリエチレングリコール（ｐｅｇ）に結合させたｒｍＴＰＯ（１５３）を１回で静脈注射した。パネルＡは、２８日間にわたる、治療法に対する血小板の反応を示し、パネルＢおよびＣはそれぞれ赤血球および白血球の反応を示す。パネルＢに示された記号は、３つのパネル全てに対するものである。詳細な説明定義「サイトカイン」とは、細胞間メディエーターとして他の細胞に作用する、ある細胞集団から放出されるタンパク質の総称である。そのようなサイトカインの例は、リンホカイン、モノカイン、および古くから知られているポリペプチドホルモンである。サイトカインには、成長ホルモン、インスリン様増殖因子、Ｎ− メチオニルヒト成長ホルモンを含むヒト成長ホルモン、ウシ成長ホルモン、副甲状腺ホルモン、チロキシン、インスリン、プロインスリン、リラキシン、プロリラキシン、濾胞刺激ホルモン（ＦＳＨ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、および黄体刺激ホルモン（ＬＨ）などの糖タンパク質ホルモン、造血増殖因子、肝臓増殖因子、繊維芽細胞増殖因子、プロラクチン、胎盤性ラクトゲン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ−αおよびＴＮＦ−β）、ミュラー阻害物質、マウスゴナドトロピン関連ペプチド、インヒビン、アクチビン、血管内皮増殖因子、インテグリン、ＮＧＦ−βのような神経増殖因子、インスリン様増殖因子−１およびIIエリスロポエチン（ＥＰＯ）、骨誘導因子（osteoinductive factor）、インターフェロン −α、βおよびγのようなインターフェロン（ＩＦＮ）、マクロファージ−ＣＳＦ（Ｍ−ＣＳＦ）、顆粒球−マクロファージ−ＣＳＦ（ＧＭ−ＣＳＦ）、および顆粒球−ＣＳＦ（Ｇ−ＣＳＦ）のようなコロニー刺激因子（ＣＳＦ）、ＩＬ−１、ＩＬ−１α、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２のようなインターロイキン（ＩＬ）、ならびにＬＩＦ、ＳＣＦ、ＦＬＴ−３リガンドおよびｋｉｔリガンド（ＫＬ）を含む他のポリペプチド因子が含まれる。本明細書で用いられるように、上記の語は、天然起源または組換え細胞培養物に由来するタンパク質を含む。同様に、この語は、例えばアミノ酸配列が１つまたは複数のアミノ酸で異なるか、またはグリコシル化の型または程度が異なる生物学的に活性な等価物を含むものとする。「生物学的に活性な」とは、トロンボポエチン（ＴＰＯ）との関連において用いられるとき、血小板産生活性を示し、再生不良性ブタ血漿から単離された、または組換え細胞培養物中に発現したｍｐｌリガンドのエフェクター機能を共有している、トロンボポエチンまたは血小板産生ポリペプチドを意味する。ｍｐｌの主要な既知のエフェクター機能は、ヒトｍｐｌＰでトランスフェクションされたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの、標識ヌクレオチド（³Ｈ−チミジン）の取り込みの刺激である。ｍｐｌリガンドまたは本明細書中のポリペプチドのもう一つの既知のエフェクター機能は、マウス血小板回復アッセイにおける循環血中血小板への³⁵Ｓ取り込みの刺激能である。ｍｐｌリガンドのさらにもう一つの既知のエフェクター機能は、巨核球の糖タンパク質ＧＰII_bIII_aに特異的な放射標識モノクローナル抗体を用いることにより定量することができる、ヒト巨核球産生をインビトロで刺激する能力である。「ｍｐｌリガンド」、「ｍｐｌリガンドポリペプチド」、「ＭＬ」、「トロンボポエチン」または「ＴＰＯ」は、本明細書において交換可能に用いられ、サイトカインレセプタースーパーファミリーの一員であるｍｐｌに結合する性質を有し、ＭＬの生物学的性質を有するいかなるポリペプチドをも含む。生物学的性質の例としては、ヒトｍｐｌでトランスフェクションされたＩＬ−３依存性Ｂａ／Ｆ３細胞のＤＮＡへの標識ヌクレオチド（例えば、³Ｈ−チミジン）の取り込みを刺激する能力が挙げられる。もう一つの生物学的性質の例は、マウス血小板回復アッセイにおける循環血中血小板への³⁵Ｓの取り込みを刺激する能力である。この定義は、本明細書に記載の再生不良性ブタ血漿のようなｍｐｌリガンド起源もしくはヒトを含む他の動物種のようなその他の起源から単離されたポリペプチド、または組換え法もしくは合成法により調製されたポリペプチドを含み、それらの機能的誘導体、断片、アレル体、アイソフォームおよびアナログを含む変種型も含む。「ｍｐｌリガンド断片」または「ＴＰＯ断片」は、１以上のアミノ酸残基または炭水化物単位が欠失している、天然に生じる成熟完全長ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯ配列の一部である。アミノ酸残基の欠失は、Ｎ末端またはＣ末端または内部を含む、ぺプチドのいずれの部位に起こってもよい。断片は、ｍｐｌリガンドと共通の生物学的性質を少なくとも一つ有している。ｍｐｌリガンド断片は、典型的には、再生不良性ブタ血漿から単離されたリガンド、またはヒトもしくはマウスのリガンドを含む哺乳動物から単離されたｍｐｌリガンドの配列と同一の、少なくとも１０、１５、２０、２５、３０または４０アミノ酸残基の連続配列、特にそのＥＰＯドメインを有している。Ｎ末端断片の代表的な例は、ｈＭＬ₁₅₃ またはＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）である。「ＴＰＯ変種」、「ｍｐｌリガンド変種」もしくは「ｍｐｌリガンド配列変種」、またはＴＰＯと関連した「誘導体」という語などは、本明細書で定義されるように、組換え細胞培養物または再生不良性ブタ血漿から単離されたｍｐｌリガンドもしくはＴＰＯ、またはヒトリガンドと１００％より低い配列同一性を有する、以下に定義されるような生物学的に活性な物質を意味する。通常、生物学的に活性なｍｐｌリガンドまたはＴＰＯの変種は、再生不良性ブタ血漿から単離されたｍｐｌリガンド／ＴＰＯ、またはマウスもしくはヒトの成熟リガンドまたはその断片と少なくとも約７０％、好ましくは少なくとも約７５％、より好ましくは少なくとも約８０％、さらに好ましくは少なくとも約８５％、さらに好ましくは少なくとも約９０％、そして最も好ましくは少なくとも約９５％のアミノ酸配列同一性を有するアミノ酸配列を有する。「キメラ」は、第二の異種ポリペプチドまたは１以上のその断片と融合または結合した、完全長親タンパク質（ＴＰＯまたはｍｐｌリガンド）または１以上のその断片を含むポリペプチドである。キメラは、少なくとも一つの共通の生物学的性質を有している。第二のポリペプチドは、典型的には、サイトカイン、免疫グロブリンまたはそれらの断片である。「生物学的性質」とは、「ｍｐｌリガンド」または「単離されたｍｐｌリガンド」または「ＴＰＯ」のいずれかと組み合わせて用いられる場合、血小板産生活性を有すること、またはｍｐｌリガンドまたは「ＴＰＯ」（天然のまたは変性したコンホメーションの）またはその断片により直接的または間接的に引き起こされる、または行われるインビボのエフェクターまたは抗原としての機能または活性を有していることを意味する。エフェクター機能には、ｍｐｌ結合および任意の担体との結合活性、ｍｐlに対するアゴニスト作用またはアンタゴニスト作用、特に複製を含む増殖シグナルの伝達、ＤＮＡ調節機能、他のサイトカインの生物学的活性の調節、レセプター（特にサイトカイン）の活性化、不活化、アップレギュレーションもしくはダウンレギュレーション、細胞の増殖または分化などが含まれる。抗原機能とは、天然のｍｐｌリガンドまたはＴＰＯに対して生じた抗体と交差反応することができるエピトープまたは抗原性部位を有していることを意味する。ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯポリペプチドの主要な抗原機能は、少なくとも約１０⁶l/モルの親和性で、再生不良性ブタ血漿から単離されたｍｐｌリガンドまたはＴＰＯに対して生じた抗体と結合することである。通常、ポリペプチドは、少なくとも約１０⁷l/モルの親和性で結合する。最も好ましくは、抗原活性を有するｍｐｌリガンドまたはＴＰＯポリペプチドは、上記のエフェクター機能の一つを有するｍｐｌリガンドまたはＴＰＯに対して生じた抗体に結合する。「生物学的性質」を定義するために用いられる抗体は、組換え細胞培養物または再生不良性ブタ血漿から単離されたｍｐｌリガンドまたはＴＰＯを、フロイント完全アジュバント中に処方し、その混合物を皮下注射し、ｍｐｌリガンドまたはＴＰＯの抗体の力価がプラトーに達するまで、混合物を腹腔内注射して免疫反応を追加刺激することにより生じた、ウサギポリクローナル抗体である。「ＰＥＧ化ＴＰＯポリペプチド」という語、または文言上のその変形は、ＴＰＯポリペプチドを、種々の非タンパク質性重合体の一つ、例えば、前述のようなポリエチレングリコール、ボリプロピレングリコールまたはポリオキシアルキレンに結合させることにより、共有結合性修飾されたＴＰＯポリペプチドを意味する。ヒトにおいて、「血小板減少症」とは、血液１リットル当たりの血小板数が約１５０×１０⁹を下回る状態と定義される。「血小板産生活性」とは、巨核球または巨核球前駆細胞の、これらの細胞の血小板産生型への増殖、分化および／または成熟を促進することを含む、生物学的活性と定義される。この活性は、インビボでのマウス血小板回復合成アッセイ、ヒト白血球巨核芽細胞系（ＣＭＫ）に対する抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰII_b III_a）により測定される血小板細胞表面抗原の誘導アッセイ、および巨核芽細胞系（ＤＡＭＩ）における倍数体化の誘導を含む、種々の方法で測定できる。「トロンボポエチン」（ＴＰＯ）は、血小板産生活性を有する、または哺乳動物において血清中の血小板数を増加させることができる化合物と定義される。ＴＰＯは、好ましくは、内因性血小板数を少なくとも１０％、より好ましくは５０％、増加させることができ、最も好ましくはヒトにおける血小板数を血液１リットル当たり１５０×１０⁹より多く上昇させることができる。参照として上記に説明し言及した、ＴＰＯについての文献に現在見出される他の名称、および引用された特許出願書類も参照のこと。本発明の「ｍｐｌリガンド」ポリペプチドまたは「ＴＰＯ」は、高度に精製された実質的に均一なブタｍｐｌリガンドポリペプチドのアミノ酸配列全体の少なくとも７０％の同一性を有し、ブタｍｐｌリガンドポリペプチドの「ＥＰＯドメイン」と少なくとも８０％の配列同一性を有する。場合により、本発明のｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）は、成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）、またはその変種もしくは翻訳後修飾を受けた形態、または成熟ヒトｍｐｌリガンドと約８０％の配列同一性を有するタンパク質である。場合により、ｍｐｌリガンド変種は、成熟ヒトｍｐｌリガンド（ｈＭＬ）の断片、特にアミノ末端または「ＥＰＯドメイン」断片である。好ましくは、アミノ末端断片は、１番目のシステイン残基と４番目のシステイン残基との間のヒトＭＬ配列を実質的に全て保持しているが、その領域外には、実質的な付加、欠失または置換を含んでいてもよい。本実施態様によると、断片ポリペプチドは、下記式により表すことができる。Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）はＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹まで（両端を含む）のヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミノ酸配列を示し、ＸはＣｙｓ⁷のアミノ基、または成熟ＴＰＯ、もしくは該配列にＭｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒ、もしくは該配列のアルギニンからリジンなどのアミノ酸置換体、もしくは例えばプロテアーゼ分解部位（例えば、Ｘａ因子またはトロンビン）を含むリーダー配列などが追加された延長アミノ酸配列の一つまたは複数のアミノ末端アミノ酸残基を示し；そしてＹはＣｙｓ¹⁵¹のカルボキシ末端基、または成熟ＴＰＯもしくはその延長配列の１以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を示す。作製方法ヒトｍｐｌリガンド（ＴＰＯ）遺伝子の単離ｐＲ４５を有するλ−Ｇｅｍ１２中のヒトゲノムライブラリーを、低ストリンジェンシー条件下または高ストリンジェンシー条件下で、ｍｌｐリガンドをコードするヒトｃＤＮＡの３’側半分に相当する断片を用いてスクリーニングすることにより、ＴＰＯ遺伝子のヒトゲノムＤＮＡクローンを単離した。３５ｋｂにわたり重複する２つのラムダクローンを単離した。全長ＴＰＯ遺伝子を含む２つの重複する断片（ＢａｍＨＩおよびＥｃｏＲＩ）をサブクローニングし、配列を決定した。ヒト遺伝子の構造は、ゲノムＤＮＡの７ｋｂ以内の６エキソンからなる。エキソン／イントロン接合部の境界は、哺乳動物遺伝子について確立されているコンセンサス・モチーフと一致している（Shapiro，M.B．et al.，Nucl．Acids．Res .15: 7155［1987]）。エキソン１およびエキソン２には、５’非翻訳配列およびシグナルペプチドの最初の４アミノ酸が含まれる。分泌シグナルの残りおよび成熟タンパク質の最初の２６アミノ酸は、エキソン３にコードされている。カルボキシドメイン全長および３’非翻訳部分ならびに約５０アミノ酸からなるエリスロポエチン様ドメインはエキソン６にコードされている。ｈＭＬ−２（ｈＴＰＯ −２）に見られる欠失に関与している４アミノ酸は、エキソン６の５’末端にコードされている。サザンブロットによるヒトゲノムＤＮＡの解析によると、ＴＰＯの遺伝子は単一コピーで存在する。遺伝子の染色体内の位置は、蛍光インサイチューハイブリダイゼーション（ＦＩＳＨ）により、染色体３ｑ２７−２８であることが決定された。２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製２９３細胞からのＭＬまたはＴＰＯの調製および精製は、実施例１に詳細に記載されている。簡単に説明すると、ＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを、ｐＲＫ５−ｈｍｐｌＩを用いたＰＣＲにより得た。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ．ＯＲＦ（全オープンリーディングフレームをコードするベクター）の制限部位であるＣｌａＩとＸｂａＩとの間にクローニングした。異なるＰＣＲプライマーを用いて同様にしてＥＰＯ相同ドメインをコードする第二のベクターを作成し、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏＥＰＯ−Ｄと名づけられた最終的な構築物を得た。これらの２つの構築物をヒト胎児腎細胞にＣａＰＯ₄法によりトランスフェクションし、ネオマイシン耐性クローンを選択し、コンフルエント状態になるまで増殖させた。これらのクローンの馴化培地へのＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂の発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて確認した。ｒｈＭＬ₃₃₂の精製は、実施例１に記載のようにして行った。簡単に説明すると、B1ue Sepharose（Pharmacia）カラムに、２９３−ｒｈＭＬ₃₃₂馴化培地を適用し、次に、２M尿素を含有する緩衝液でカラムを洗浄し、２M 尿素および1M ＮａＣｌを含む緩衝液で溶出した。次に、ＷＧＡ−Sepharose カラムへ、B1ue Sep harose溶出プールを直接適用し、１０倍カラム容量の２M 尿素および1M ＮａＣｌを含む緩衝液で洗浄し、０．５M Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む同緩衝液で溶出した。Ｃ４−ＨＰＬＣカラム（Synchrom，Inc.）へ、ＷＧＡ−Sephar ose 溶出液を適用し、不連続なプロパノール勾配で溶出した。精製された２９３ −ｒｈＭＬ₃₃₂は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ゲルの６８〜８０ｋＤａの領域に広範なバンドとして移動する。ｒｈＭＬ₁₅₃の精製も、実施例１に記載のようにして行った。簡単に説明すると、ｒｈＭＬ₃₃₂の場合と同様にして、B1ue Sepharoseで、２９３−ｒｈＭＬ₁₅₃ 馴化培地を分離した。上記と同様にして、Blue Sepharose溶出液を、ｍｐｌ−アフィニティカラムへ直接適用した。ｍｐｌ−アフィニティカラムから溶出したｒｈＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂の場合と同一の条件下で、Ｃ４−ＨＰＬＣカラムを通過させることにより、均質になるよう精製した。精製されたｒｈＭＬ₁₅₃は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量が約１８，０００〜２２，０００の２つの主要なバンドおよび２つの小さなバンドに分離される。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞からのＴＰＯの発現および精製ＣＨＯ細胞をトランスフェクションするのに用いた発現ベクターは、以下のように表記される：ｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＯＲＦ（全長またはＴＰＯ₃₃₂ ）、およびｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＥＰＯ−Ｄ（短縮型またはＴＰＯ₁₅₃ ）。ＰＣＲにより、ＴＰＯ全長オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを得た。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬの２つの制限部位（ＣｌａＩおよびＳａｌＩ）間にクローニングし、ベクターｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＯＲＦを得た。ＥＰＯ相同ドメインに対応する第二の構築物は、異なるリバースブライマー（ＥＰＯＤ．Ｓａｌ）を用いて、同様にして作製した。ＴＰＯのＥＰＯ相同ドメインをコードするベクターの最終的な構築物を、ｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＥＰＯ−Ｄと呼ぶ。これらの２つの構築物をＮｏｔＩで直鎖状にし、チャイニーズハムスター卵巣細胞（ＣＨＯ−ＤＰ１２細胞、１９８９年３月１５日公開の欧州特許第３０７，２４７号）にエレクトロポレーションによりトランスフェクションした。ＢＲＬエレクトロポレーション装置（３５０ボルト、３３０ｍＦ）低キャパシタンス）において、１０、２５または５０mg の上記のＤＮＡの存在下で、１０⁷細胞に対してエレクトロポレーションを行った（Andreason,G.L.J.Tissue.Cult.Meth.，1 5，56［1993]）。トランスフェクションの翌日、ＤＨＦＲ選択培地（２mM グルタミン、２〜５％の透析胎児ウシ血清を含み、グリシンは含まない、高グルコースＤＭＥＭ−Ｆ１２５０：５０）へ分注した。１０−１５日後、個々のコロニーを９６穴プレートへ移し、コンフルエント状態になるまで増殖させた。馴化培地中のＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂のこれらのクローンからの発現を、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて確認した。採取したＣＨＯ細胞培養液からのＴＰＯの精製および単離の方法は、実施例２に記載されている。簡単に説明すると、採取した細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、樹脂１リットル当たり１００ｌのＨＣＣＦの割合で、Blue Sepharoseカラム(Phar macia)に適用する。カラムを、３〜５倍カラム容量の緩衝液で洗浄した後、３〜５倍カラム容量の２．０M 尿素を含む緩衝液で洗浄する。次に、３〜５倍カラム容量の２．０M 尿素および１．０M ＮａＣｌ両方を含む緩衝液で溶出する。ＴＰＯを含むBlue Sepharose溶出プールを、次に、Blue Sepharose溶出緩衝液で平衡化した小麦麦芽レクチンSepharoseカラム（Pharmacia）に、樹脂１ml当たり８〜１６ml のB1ue Sepharose溶出液の割合で適用する。その後、２〜３倍カラム容量の平衡化緩衝液で洗浄する。２〜５倍カラム容量の２．０M 尿素および０．５M Ｎ−アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む緩衝液で、ＴＰＯを溶出させる。次に、ＴＰＯを含む小麦麦芽レクチン溶出液を酸性化し、Ｃ₁₂Ｅ₈を最終濃度０．０４％まで添加する。得られたプールを、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラムに、樹脂１ml 当たり約０．２〜０．５mg のタンパク質の負荷量で適用する。タンパク質を０．１％ＴＦＡおよび０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈を含むアセトニトリルの２相の直線勾配で溶出させ、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき、プールを作製する。次に、Ｃ４プールを希釈し、１０，０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフ値を有するアミコン（Amicon）ＹＭまたは同様の限外濾過膜で、約６倍容量の緩衝液に対して透析濾過する。次に、得られた透析濾過物を直接処理するか、またはさらに限外濾過により濃縮する。透析濾過物／濃縮物は、通常、０．０１％Tween-80 の最終濃度に調整される。次に、計算カラム容量の２〜５％と等しい透析濾過物／濃縮物の全部または一部を、０．０１％Tween-80 を含む緩衝液で平衡化した Sephacryl Ｓ−３００ＨＲカラム（Pharmacia）に適用し、クロマトグラフィーを行う。凝集物およびタンパク質分解産物を含まないＴＰＯ含有画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づきプールする。得られたプールを、濾過し、２〜８℃で保存する。微生物における形質転換およびＴＰＯ合成の誘導、ならびにそこで産生されたＴＰＯの単離、精製および再折り畳みの方法大腸菌ＴＰＯ発現べクターの構築は、実施例３に詳細に説明されている。簡単に説明すると、プラスミドｐＭＰ２１ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２は全て、構築物により異なる短いリーダーの下流に、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。リーダーは、主に、高レベルの翻訳開始および迅速な精製のためのものである。プラスミドｐＭＰ２１０ −１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流に、ＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計されており、ＴＰＯの最初の６アミノ酸のコドン使用のみが異なるが、ｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端に２アミノ酸が追加されている、ｐＭＰ２１０−１の誘導体である。上記のプラスミドは全て、トリプトファンプロモーター(Yansure,D.G．et al．Methods in Enzymology 185: 54-60（Goeddel，D．V.，Ed.）Academic Press，San Diego[1990])の誘導により、大腸菌において高レベルのＴＰＯ細胞内発現を生じる。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドを構築する際の中間体である。上記のＴＰＯ発現プラスミドを用いて、ＣａＣl₂熱ショック法(Mandel,M.etal .，J．Mol．Bio1.，53: 159-162，[1970])および実施例３に記載されたその他の方法により、大腸菌を形質転換した。簡単に説明すると、形質転換された細胞を、まず、培養液の吸光度（６００nm）が約２〜３に達するまで、３７℃で培養した。次に、培養液を希釈し、通気培養した後、酸を添加した。さらに１５時間、通気培養を続けた後、細胞を遠心分離により採取した。生物学的に活性な再折り畳みされたヒトＴＰＯまたはその断片を作製するための、以下の単離、精製および再折り畳みの手順は、実施例４に記載されており、ＮおよびＣ末端が延長された型を含む、いかなるＴＰＯ変種の回収にも同様に適用することができる。組換えＴＰＯまたは合成ＴＰＯの再折り畳みに適した他の方法は、大腸菌において不溶型として発現した様々な組換えタンパク質の回収および再折り畳みの方法の一般的な説明が記載された、以下の特許;Builder ら、米国特許第４，５１１，５０２号;Jones ら、米国特許第４，５１２，９２２号；Olson、米国特許第４，５１８，５２６号；およびBuilder ら、米国特許第４，６２０，９４８号を参照のこと。血小板産生活性の測定の方法血小板産生活性は、Ｂａ／Ｆ３ｍｐｌリガンドアッセイ、インビボマウス血小板回復合成アッセイ、ヒト白血球巨核芽細胞系（ＣＭＫ）に対する抗血小板イムノアッセイ（抗ＧＰIIbIIIa）により測定される血小板細胞表面抗原の誘導アッセイ（Sato et al.，Brit．J．Haematol.，72: 184-190[1989]参照）、および巨核芽細胞系（ＤＡＭＩ）における倍数体化の誘導（Oguraetal.,Blood,72(1):49- 60[1988]）を含む、種々のアッセイにより測定することができる。未成熟の大きな非ＤＮＡ合成細胞から、形態学的に同定可能な巨核球への巨核球の成熟には、背景に記載したような、細胞内小器官の出現、膜抗原（ＧＰII_bIII_a）の獲得、内部複製および血小板の放出を含む過程を含む。巨核球成熟の系統特異的なプロモーター（即ち、ｍｐｌリガンド）は、血小板の放出および血小板減少症の軽減をもたらす、未成熟巨核球のこれらの変化の少なくとも一部を誘導すると予想される。したがって、アッセイは、未成熟巨核細胞系、すなわちＣＭＫ細胞およびＤＡＭＩ細胞におけるこれらのパラメータの出現を測定するよう設計されている。ＣＭＫアッセイは、特異的な血小板マーカーＧＰII_bIII_aの出現および血小板の断片化（shedding）を測定するものである。ＤＡＭＩアッセイでは、倍数性の増加が成熟巨核球の特徴であるため、内部複製を測定する。認識可能な巨核球は、２Ｎ、４Ｎ、８Ｎ、１６Ｎ、３２Ｎなどの倍数値を有する。最後に、インビボマウス血小板回復アッセイは、試験化合物（本発明においてはｍｐｌリガンド）の投与が、血小板数を上昇させることを示すために有用である。ＴＰＯ活性を測定するための、さらに２つのインビトロアッセイが開発されている。一つは、ＣＨＯ細胞をｍｐｌ−Ｒｓｅキメラでトランスフェクションし、キメラのｍｐｌ部分をｍｐｌリガンドに曝露した後、Ｒｓｅのチロシンリン酸化をＥＬＩＳＡにより測定する、キナーゼレセプター活性化（ＫＩＲＡ）ＥＬＩＳＡである。もう一つは、ウサギ抗ヒトＩｇＧをコートしたＥＬＩＳＡプレートが、アッセイされるｍｐｌリガンドに結合するヒトキメラレヤプターｍｐｌ−ＩｇＧを捕捉する、レセプターに基づくＥＬＩＳＡである。ｍｐｌリガンド（ＴＰＯ₁₅₅ ）に対する、ビオチン化されたウサギポリクローナル抗体を用いて、ストレプトアビジン−ペルオキシダーゼを用いて測定される結合したｍｐｌリガンドを検出する。トロンボポエチン物質の治療のための使用生物学的に活性な血小板産生タンパク質（ＴＰＯ）は、血小板の産生の障害、枯渇、または破壊の増加による血小板減少症を患う患者において、巨核球産生または血小板産生活性を刺激するための、無菌の医薬製剤または処方物中に使用できる。血小板減少症に関連する骨髄再生不良性（例えば、化学療法または骨髄移植の後の再生不良性貧血）だけでなく、汎発性血管内凝固（ＤＩＣ）、免疫性血小板減少症（ＨＩＶ誘導ＩＴＰおよび非ＨＩＶ誘導ＩＴＰを含む）、慢性特発性血小板減少症、先天性血小板減少症、骨髄形成異常、および血栓性血小板減少症を、本発明の化合物で効率よく治療することができる。さらに、これらの巨核球産生タンパク質は、骨髄増殖性血小板増加症、ならびに炎症状態および鉄欠乏に由来する血小板増加症の治療にも有用であろう。本発明の血小板産生タンパク質（ＴＰＯ）の好ましい使用は、白血病または固形腫瘍を治療するための骨髄傷害性化学療法、自家または同種骨髄移植のための骨髄切除化学療法、骨髄形成異常、特発性再生不良性貧血、先天性血小板減少症、および免疫性血小板減少症における使用である。本発明の血小板産生タンパク質で有用に治療されるさらに他の疾患には、物質、人工表面上の毒性または活性化から生じる血小板の欠損または傷害が含まれる。これらの場合には、本化合物は、「断片化されつつある（shedding）」血小板または新しい「傷害を受けていない」血小板を刺激するために使用することができる。実施例実施例１２９３細胞からのＴＰＯの発現および精製２９３細胞発現ベクターの調製以下のオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いるＰＣＲにより、ＴＰＯの全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを得た。ｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下で、ｐｒｋ５−Ｈｍｐｌを反応の鋳型として用いた。最初の変性は、９４℃で７分間行い、次に増幅(９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間)を２５サイクル行った。最後の伸張は、７２℃で１５分間行った。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＲＫ５ｔｋｎｅｏのＣｌａＩ制限部位とＸｂａＩ制限部位との間にクローニングし、ベクターｐＲＫ５ｔｋｎｅｏ．ＯＲＦを得た。ｐＲＫ５ｔｋｎｅｏとは、チミジンキナーゼプロモーターの調節下でネオマイシン耐性遺伝子を発現するよう改変された、ｐＲＫ５由来のベクターである。ｅｐｏ相同ドメインに対応する第二の構築物は、Ｃｌａ．ＦＬ．Ｆをフォワードプライマーとして用い、以下のリバースプライマーを用いて、同様にして作製した。最終的な構築物を、ｐＲＫ５−ｔｋｎｅｏＥＰＯ−Ｄと名付けた。両構築物の配列を確認した。ヒト胎児腎細胞のトランスフェクションＣａＰＯ₄法を用いて、これらの２つの構築物をヒト胎児腎細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションの２４時間後、０．４mg/ml のＧ４１８の存在下で、ネオマイシン耐性クローンの選別を開始した。１０〜１５日後、個々のコロニーを９６穴プレートに移し、コンフルエント状態になるまで増殖させた。これらのクローンの馴化培地中にＭＬ₁₅₃またはＭＬ₃₃₂（ＴＰＯ１５３またはＴＰＯ３３２）が発現していることを、Ｂａ／Ｆ３−ｍｐｌ増殖アッセイを用いて確認した。ｒｈＭＬ₃₃₂の精製１０mM のリン酸ナトリウム、pH７．４（緩衝液Ａ）で平衡化しておいたBlue Sepharose（Pharmacia）カラムに、３９２−ｒｈＭＬ₃₃₂馴化培地を適用した。次に、それぞれ１０倍カラム容量の緩衝液Ａおよび２M 尿素含有緩衝液Ａでカラムを洗浄した。次に、カラムを、２M 尿素および１M ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで溶出した。次に、緩衝液Ａで平衡化したＷＧＡ−Sepharose カラムヘ、Blue Sep harose溶出プールを直接適用した。次に、ＷＧＡ−Sepharose カラムを、１０倍カラム容量の２M 尿素および１M ＮａＣｌを含む緩衝液Ａで洗浄し、０．５M Ｎ −アセチル−Ｄ−グルコサミンを含む同緩衝液で溶出した。０．１％ＴＦＡで平衡化したＣ４−ＨＰＬＣカラム（Synchrom，Inc.）へ、ＷＧＡ−Sepharose溶出液を適用した。Ｃ４−ＨＰＬＣカラムを、不連続なプロパノール勾配（０〜２５％、２５〜３５％、３５〜７０％）で溶出した。ｒｈＭＬ₃₃₂は、２８〜３０％プロパノール勾配領域に溶出しているのが見出された。精製されたｒｈＭＬ₃₃₂は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、ゲルの６８〜８０kDa の領域に広範なバンドとして移動する。ｒｈＭＬ₁₅₃の精製ｒｈＭＬ₃₃₂の場合と同様にして、Blue Sepharose で、３９２−ｒｈＭＬ₁₅₃ 馴化培地を分離した。上記と同様にして、Blue Sepharose 溶出液を、ｍｐｌ− アフィニティカラムへ直接適用した。ｍｐｌ−アフィニティカラムから溶出されたｒｈＭＬ₁₅₃を、ｒｈＭＬ₃₃₂について記載したのと同一の条件下で、Ｃ４−ＨＰＬＣカラムを通過させることにより、均質になるよう精製した。精製されたｒｈＭＬ₁₅₃は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥで、分子量が約１８，０００〜２１，０００の２つの主要なバンドおよび２つの小バンドに分離される。実施例２ＣＨＯからのＴＰＯの発現および精製１．ＣＨＯ発現ベクターの説明下記のエレクトロポレーションプロトコルにおいて使用される発現ベクターは、以下のように表記される。ｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＯＲＦ（全長またはｈＴＰＯ₃₃₂）、およびｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＥＰＯ−Ｄ（短縮型またはｈＴＰＯ₁₅₃）。２．ＣＨＯ発現ベクターの調製以下の表のオリゴヌクレオチドプライマーを用いたＰＣＲにより、ｈＴＰＯ全オープンリーディングフレームに対応するｃＤＮＡを得た。ＣＨＯ発現ベクターＰＣＲプライマーｐｆｕＤＮＡポリメラーゼ（Stratagene）の存在下で、ＰＲＫ５− ｈｍｐｌＩを反応の鋳型として用いた。最初の変性は、９４℃で７分間行い、次に増幅（９４℃で１分間、５５℃で１分間、７２℃で１分間）を２５サイクル行った。最後の伸張は、７２℃で１５分間行った。ＰＣＲ産物を精製し、プラスミドｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬのＣｌａＩ制限部位とＳａｌＩ制限部位との間にクローニングし、ベクターｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＯＲＦを得た。ＥＰＯ相同ドメインに対応する第二の構築物は、Ｃｌａ．ＦＬ．Ｆ２をフォワードプライマーとして用い、以下のリバースプライマーを用いて、同様にして作製した。最終的な構築物を、ｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＥＰＯ−Ｄと名付けた。両構築物の配列を確認した。本質的には、全長リガンドおよび短縮型リガンドのコーディング配列を、ＣＨＯ発現ベクターｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬの多重クローニング部位に導入した。このベクターは、ＳＶ４０初期プロモーター／エンハンサー領域、マウスＤＨＦＲｃＤＮＡを含む改変スプライスユニット、目的の遺伝子（本件の場合、上記のＴＰＯ配列）を導入するための多重クローニング部位、ＳＶ４０のポリアデニル化シグナルおよび複製開始部位、ならびにプラスミド選択および細菌における増幅のためのβ−ラクタマーゼ遺伝子を含む。３．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃を発現する安定的なＣＨＯ細胞系を樹立するための方法ａ．ＣＨＯ親細胞系の説明本明細書に記載のＴＰＯ分子の発現に用いた宿主ＣＨＯ（チャイニーズハムスター卵巣）細胞系は、ＣＨＯ−ＤＰ１２として知られている（１９８９年３月１５日公開の欧州特許第３０７，２４７号参照）。親系統（ＣＨＯ−Ｋ１ＤＵＸ− Ｂ１１（ＤＨＦＲ−）、L．Chasin 博士の許可を得てスタンフォード大学のFran k Lee 博士から譲り受けた）をプレプロインスリン発現ベクターでトランスフェクションし、この哺乳動物細胞系をクローン選別して、インスリン要求性が減少したクローンを得た。これらの細胞も、ＤＨＦＲマイナスであり、ヌクレオシド（グリシン、ヒポキサンチン、およびチミジン）を添加しない培地で増殖させることにより、ＤＨＦＲｃＤＮＡベクターの存在に関してクローンを選別することができる。安定的に発現するＣＨＯ細胞系を選別するためのこの系は、一般的に使用されている。ｂ．トランスフェクション方法（エレクトロポレーション）直鎖状にしたｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＯＲＦまたはｐＳＶ１５．ＩＤ．ＬＬ．ＭＬＥＰＯ−Ｄプラスミドを、エレクトロポレーション法（Andreason, G.L.J．Tiss．Cult．Meth.，15，56(1993)）を用いてＤＰ１２細胞をトランスフェクションすることにより、それぞれＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃を発現する細胞系を作製した。各プラスミドを切断するため、３つの制限酵素反応混合物を調製した。すなわち、標準的な分子生物学的方法により、１０μg、２５μg および５０μg のベクターを酵素ＮＯＴＩで切断した。この制限部位は、ベクターのＴＰＯリガンド転写ユニットの外側の直鎖化領域の３’に１ヶ所だけ見出される（ＦＩＧ．２３参照）。１００μl反応液を、３７℃で一晩インキュベーションするために調製した。翌日、混合液を、フェノールークロロフォルム−イソアミルアルコール（５０：４９：１）で１回抽出し、約１時間ドライアイス上でエタノール沈殿を行った。次に、微量遠心分離を１５分間行うことにより、沈殿物を回収し、乾燥させた。直鎖状にしたＤＮＡを、標準的な抗生物質および２mMのグルタミンを添加した、５０μlのＨａｍ'ｓＤＭＥＭ−Ｆ１２１：１培地に再懸濁した。ＤＰ１２細胞を培養している懸濁液を回収し、ＤＮＡの再懸濁について記載した培地で１回洗浄し、最終的に、７５０μｌ当たり１０⁷細胞の濃度で同培地に再懸濁した。細胞のアリコート（７５０μｌ）および各直鎖状にしたＤＮＡ混合物を、室温で１時間、一緒にインキュベーションした後、ＢＲＬエレクトロポレーション・チャンバーに移した。次に、各反応混合物について、３５０ボルト、３３０μＦ、低キャパシタンスで、標準的なＢＲＬエレクトロポレーション装置でエレクトロポレーションを行った。エレクトロポレーション後、細胞を５分間装置内に放置し、さらに１０分間氷上でインキュベーションした。エレクトロポレーションを行った細胞を、５m1 のＣＨＯ細胞用の標準的な完全増殖培地（グリシンを含まず、１×ＧＨＴ、２mM グルタミン、および５％胎児ウシ血清を含む、高グルコース含有ＤＭＥＭ−Ｆ１２５０：５０）を含む６０mm の細胞培養皿に移し、５％ＣＯ２細胞培養インキュベーター中で一晩増殖させた。ｃ．選別およびスクリーニングの方法翌日、標準的な方法により、細胞をトリプシンでプレートから剥離し、ＤＨＦＲ選択培地（本発明者らが用いている標準的なＤＨＦＲ選択培地である、２％または５％いずれかの透析ウシ胎児血清を含み、グリシン、ヒポキサンチンおよびチミジンは含まない、上記のＨａｍ'ｓＤＭＥＭ−Ｆ１２１：１培地）を含む１５０mm の組織培養皿へ移した。次に、細胞を、各６０mm 皿〜５／１５０mm 皿に移した。クローンが出現し、９６穴皿へ移すのに適したサイズに達するまで、細胞を１０〜１５日間、３７度／１５％ＣＯ２でインキュベーションした。無菌イエローチップを付けた５０ml にセットしたピペットマンを用いて、４〜５日をかけて、細胞系を９６穴皿へ移した。細胞をコンフルエント状態になるまで（通常３〜５日）増殖させた後、トレーをトリプシン処理し、元のトレーと同一のものを２コピー作製した。これらのコピーのうちの２つを、各ウェル中の細胞を５０μl の１０％ＦＣＳを含むＤＭＳＯで希釈して短期間フリーザーで保存した。５日後、コンフルエント状態のウェル由来の無血清馴化培地サンプルを、第三のトレーで、Ｂａ／Ｆ細胞に基づく活性アッセイによりＴＰＯ発現についてアッセイした。このアッセイで最も高度に発現していたクローンを、保存液から再生し、懸濁液調製、再アッセイおよび保存用に細胞培養群を移すため、２つのコンフルエント状態の１５０mmのＴ型フラスコに規模を拡大した。ｄ．増幅プロトコル上記の選別から得られた最も高力価の細胞系のいくつかに対して、標準的なメトトレキセート増幅法を行い、より高力価のクローンを作製した。ＣＨＯ細胞クローンを増殖させ、２種または３種の細胞数（１皿当たり１０⁵、５×１０⁵、および１０⁵細胞）で、４種のメトトレキセート濃度（即ち、５０nM、１００nM、２００nM および４００nM）で、１０cmの皿に播種した。次に、クローンが確立され、その後のアッセイのため、９６穴皿に移すのに適するようになるまで、これらの培養物を３７度／５％ＣＯ₂でインキュベーションした。このようにして選別されたいくつかの高力価クローンに、さらに高濃度(即ち、６００nM、８００nM、１０００nMおよび１２００nM)のメトトレキセートを与え、上記と同様にして、耐性クローンを確立させた後、９６穴ディッシュに移し、アッセイを行った。４．組換えヒトＴＰＯ₃₃₂およびＴＰＯ₁₅₃を発現する安定的なＣＨＯ細胞系の培養保存されていた細胞を解凍し、無血清培地または血清含有培地で、標準的な細胞増殖法により細胞集団を増殖させる。充分な細胞濃度が得られるまで増殖させた後、細胞を洗浄し、消費された細胞培養上清を除去する。次に、構成的に分泌されたＴＰＯが蓄積するまで、細胞を培養する。この培養は、２５〜４０℃、中性ｐＨ、少なくとも５％のＯ₂溶解量での回分培養、流加培養または連続培養を含む、いかなる標準的な方法により行ってもよい。次に、遠心分離のような機械的な手段により、細胞培養液を細胞から分離する。５．ＣＨＯ培養液からの組換えヒトＴＰＯの精製０．０１M リン酸ナトリウム、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌで平衡化したBl ue Sepharose ６ファストフローカラム（Pharmacia）に、収集された細胞培養液（ＨＣＣＦ）を、樹脂１リットル当たり１００l のＨＣＣＦの割合で、約３００ ml/時間/cm²の一定の流速で、直接適用する。次に、カラムを、３〜５倍カラム用量の平衡化緩衝液で洗浄した後、３〜５倍カラム用量の０．０１M リン酸ナトリウム、pH７．４、２．０M 尿素で洗浄する。その後、３〜５倍カラム用量の０．０１M リン酸ナトリウム、pH７．４、２．０M 尿素、１．０M ＮａＣｌで、ＴＰＯを溶出させる。ＴＰＯを含むBlue Sepharoseプールを、次に、０．０１M リン酸ナトリウム、 pH７.４、２.０M 尿素、１.０M ＮａＣｌで平衡化した小麦麦芽レクチンSephar ose６ＭＢカラム（Pharmacia）に、樹脂１ml 当たり８〜１６ml のBlue Sepharo seプールの割合で、約５０m1/時間/cm²の流速で、適用する。次に、カラムを２〜３倍カラム用量の平衡化緩衝液で洗浄する。その後、２〜５倍カラム用量の０．０１M リン酸ナトリウム、pH７．４、２．０M 尿素、０．５M Ｎ−アセチル− Ｄ−グルコサミンで、ＴＰＯを溶出させる。次に、小麦麦芽レクチン・プールを、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈および０．１％トリフルオロ酢酸（ＴＦＡ）の最終濃度に調整する。得られたプールを、０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈で平衡化したＣ４逆相カラム（Vydac214TP1022）に、樹脂１ml 当たり０．２〜０．５mg のタンパク質の負荷量で、１５７ml/時間/cm² の流速で、適用する。タンパク質を０．１％ＴＦＡ、０．０４％Ｃ₁₂Ｅ₈を含むアセトニトリルの２相からなる直線勾配で溶出させる。第１相は、１５分間に０〜３０％アセトニトリルの直線勾配からなり、第２相は、６０分間に３０〜６０％アセトニトリルの直線勾配からなる。ＴＰＯは、約５０％アセトニトリルで溶出される。ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づき、プールを作製する。次に、Ｃ４プールを、２倍の０．１M リン酸ナトリウム、pH７．４、０．１５ M ＮａＣｌで希釈し、１０，０００〜３０，０００ダルトンの分子量カットオフ値を有するアミコン（Amicon）ＹＭまたは同様の限外濾過膜で、約６倍の０．０１M リン酸ナトリウム、pH７．４、０．１５M ＮａＣｌに対して透析濾過する。次に、得られた透析濾過物を直接処理するか、またはさらに限外濾過により濃縮する。透析濾過物／濃縮物を、０．０１％Tween-80 の最終濃度に調整する。次に、計算カラム容量の２〜５％と等しい透析濾過物／濃縮物の全部または一部を、０．０１M リン酸ナトリウムpH７．４、０．１５MＮａＣｌ、０．０１％T ween-80 で平衡化したSephacryl Ｓ−３００ＨＲカラム（Pharmacia）に適用し、約１７ml/時間/cm²の流速でクロマトグラフィーを行う。凝集物およびタンパク質分解産物を含まないＴＰＯ含有画分を、ＳＤＳ−ＰＡＧＥに基づきプールする。得られたプールを、０．２２μのフィルター、Millex-GV などで濾過し、２〜８℃で保存する。実施例３大腸菌における形質転換およびＴＰＯタンパク合成の誘導１．大腸菌ＴＰＯ発現ベクターの構築プラスミドｐＭＰ２１、ｐＭＰ１５１、ｐＭＰ４１、ｐＭＰ５７およびｐＭＰ２０２は全て、構築物により異なる短いリーダーの下流に、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。リーダーは、主に、高レベルの翻訳開始および迅速な精製のためのものである。プラスミドｐＭＰ２１０ −１、−Ｔ８、−２１、−２２、−２４、−２５は、開始メチオニンの下流に、ＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計されており、ＴＰＯの最初の６アミノ酸のコドン使用のみが異なるが、プラスミドｐＭＰ２５１は、ＴＰＯのカルボキシ末端に２アミノ酸が追加されている、ｐＭＰ２１０−１の誘導体である。上記のプラスミドは全て、トリプトファンプロモーター（Yansura,D.G.et a l.Methods in Enzymo1ogy（Goeddel,D.V.,Ed.）185: 54-60，Academic Press，S an Diego[1990]）の誘導により、大腸菌において高レベルのＴＰＯ細胞内発現を生じる。プラスミドｐＭＰ１およびｐＭＰ１７２は、上記のＴＰＯ細胞内発現プラスミドを構築する際の中間体である。（ａ）プラスミドｐＭＰ１プラスミドｐＭＰ１は、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸の分泌型ベクターであり、５つのＤＮＡ断片を連結させることにより構築した。第一の断片は、短いＭｌｕＩ−ＢａｍＨＩ断片が除去されているベクターｐＰｈｏ２１である。ｐＰｈｏ２１は、ヒト成長ホルモン遺伝子が、大腸菌のｐｈｏＡ遺伝子と置き換わっており、ＭｌｕＩ制限部位がＳＴII シグナル配列のコーディング配列のアミノ酸２０〜２１の位置に組み込まれている、ｐｈＧＨ１（Chang,C.N.et al.,Gene 55 : 189-196(1987)）の誘導体である。次の２つの断片、ＴＰＯアミノ酸１９〜１０３をコードするｐＲＫ５−ｈｍｐｌ由来の２５８塩基対からなるＨｉｎｆＩ−ＰｓｔＩ断片、およびアミノ酸１〜１８をコードする以下のような合成ＤＮＡは、Ｔ４−ＤＮＡリガーゼにより予め連結し、ＰｓｔＩで切断しておいた。第四の断片は、ＴＰＯのアミノ酸１０４〜１５５をコードする、ｐＲＫ５ｈｍｐｌＩ由来の１５２塩基対からなるＰｓｔＩ−ＨａｅIII 断片である。最後の断片は、既に開示されているような（Scholtissek，S．et．al.，NAR 15: 3185[19 87]）転写終結因子までのλを含む、ｐｄｈ１０８由来の、４１２塩基対からなるＳｔｕＩ−ＢａｍＨＩ断片である。（ｂ）プラスミドｐＭＰ２１プラスミドｐＭＰ２１は、ＳＴII シグナル配列の一部を含む１３アミノ酸からなるリーダーの補助により、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。これは、３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。これらの一つ目は、ベクターｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片が除去されたものである。ベクターｐＶＥＧ３１は、ヒト成長ホルモン遺伝子が、血管内皮増殖因子遺伝子に置き換わっている、ｐＨＧＨ２０７−１（de Boer,H.A.et.a l.，in Promotor Structure and Function(Rodriguez，R．L．and Chamberlain, M．J.，Ed)，462，Praeger，New York[1982]）の誘導体である（これと同一のベクター断片は、後者のプラスミドからも得ることができる）。連結のの第二部分は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である。最後の断片は、ＴＰＯの１５５アミノ酸をコードする、ｐＭＰ１由来の、１０７２塩基対からなるＭｌｕＩ−ＳｐｈＩ断片である。（ｃ）プラスミドｐＭＰ１５１プラスミドｐＭＰ１５１は、ＳＴII シグナル配列の７アミノ酸、８ヒスチジン、およびＸａ因子開裂部位を含むリーダーの下流に、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。ｐＭＰ１５１は、３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。これらの一つ目は、ベクターｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片が除去された先に記載したものである。第二の断片は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である：最後の断片は、ＴＰＯの１５４アミノ酸をコードする、ｐＭＰ１１由来の、１０６４塩基対からなるＢｇＬＩ−ＳｐｈＩ断片である。プラスミドｐＭＰ１１は、ＳＴII シグナル配列の数個のコドンが変化していることを除けば、ｐＭＰ１と同一である（この断片は、ｐＭＰ１からも得ることができる）。（ｄ）プラスミドｐＭＰ２０２プラスミドｐＭＰ２０２は、リーダー内のＸａ因子開裂部位が、トロンビン開裂部位に置き換わっていることを除けば、発現ベクターｐＭＰ１５１と極めて類似している。ＦＩＧ．３６に示すように、ｐＭＰ２０２は、３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。これらの一つ目は、前記のｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片が除去された先に記載したものである。第二の断片は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である：最後の断片は、前記のプラスミドｐＭＰ１１由来の、１０６４塩基対からなるＢｇｌＩ−ＳｐｈＩ断片である。（ｅ）プラスミドｐＭＰ１７２プラスミドｐＭＰ１７２は、ＴＰＯの最初の１５３アミノ酸の分泌型ベクターであり、ｐＭＰ２１０を構築する際の中間体である。ｐＭＰ１７２は、３つのＤＮＡ断片を連結することにより調製した。これらの一つ目は、ベクターｐＬＳ３２１ａｍＢから短いＥｃｏＲＩ−ＨｉｎｄＩ部分が除去されたものである。第二の断片は、前記のプラスミドｐＭＰ１１由来の、９４６塩基対からなるＥｃｏＲＩ−ＨｇａＩ断片である。最後の断片は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である。（ｆ）プラスミドｐＭＰ２１０プラスミドｐＭＰ２１０は、翻訳開始メチオニンの後、ＴＰＯの最初の１５３アミノ酸を発現するよう設計されている。このプラスミドは、実際には、ＴＰＯの最初の６コドンで、各コドンの３番目の位置がランダム化されている、プラスミドバンクとして、３つのＤＮＡ断片を連結することにより作製された。これらの一つ目は、前記のベクターｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片が除去されたものである。第二の断片は、まずＤＮＡポリメラーゼ（Klenow）により処理した後、ＸｂａＩおよびＨｉｎＩで消化した、開始メチオニンおよびＴＰＯの最初のランダムな６コドンをコードする、以下のように表される合成ＤＮＡ二本鎖である。第三の配列は、ＴＰＯのアミノ酸１９〜１５３をコードするｐＭＰ１７２由来の８９０塩基対からなるＨｉｎｆＩ−ＳｐｈＩ断片である。約３７００クローンからなるプラスミドｐＭＰ２１０バンクを、高テトラサイクリン（５０μg/ml）含有ＬＢプレート上で再形質転換し、翻訳開始能の高いクローンを選別した（Yansura,D.G．et al.，Methods: A Companion to Methods i n Enzymology 4: 151-158[1992]）。高テトラサイクリン含有プレート上に出現した８コロニーのうち、ＴＰＯ発現が最も高い５つについてＤＮＡ配列決定を行った。（ｇ）プラスミドｐＭＰ４１プラスミドｐＭＰ４１は、ＳＴII シグナル配列の７アミノ酸およびそれに続くＸａ因子開裂部位からなるリーダーに融合した、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現するよう設計されている。このプラスミドは、３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。これらの一つ目は、ベクターｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ−ＳｐｈＩ断片が除去されたものである。第二の断片は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である：連結の最後の断片は、前記のブラスミドｐＭＰ１１由来の、１０６４塩基対からなるＢｇｌＩ−ＳｐｈＩ断片である。（ｈ）プラスミドｐＭＰ５７プラスミドｐＭＰ５７は、ＳｔII シグナル配列の９アミノ酸および二塩基性部位、Ｌｙｓ−Ａｒｇからなるリーダーの下流に、ＴＰＯの最初の１５５アミノ酸を発現する。この二塩基性部位は、プロテアーゼＡｒｇＣによりリーダーを除去するためのものである。このプラスミドは、３つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。これらの一つ目は、ベクターｐＶＥＧ３１から短いＸｂａＩ− ＳｐｈＩ断片が除去されたものである。第二の断片は、以下の配列を有する合成ＤＮＡ二本鎖である。連結の最後の部分は、前記のプラスミドｐＭＰ１１由来の、１０６４塩基対からなるＢｇｉＩ−ＳｐｈＩ断片である。（ｉ）プラスミドｐＭＰ２５１プラスミドｐＭＰ２５１は、カルボキシ末端にＴＰＯのアミノ酸がさらに２つ含まれる、ｐＭＰ２１０−１の誘導体である。このプラスミドは、２つのＤＮＡ断片を連結することにより構築した。一つは、前記のｐＭＰ２１から短いＸｂａＩ−ＡｐａＩ断片が除去されたものである。連結の第二の部分は、ｐＭＰ２１０ −１由来の３１６塩基対からなるＸｂａＩ−ＡｐａＩ断片である。２．ＴＰＯ発現ベクターによる大腸菌の形質転換および誘導上記のＴＰＯ発現プラスミドを用いて、ＣａＣｌ２熱ショック法(Mande1,M.et al.，J．Mol．Biol.，53: 159-162，[1970])により、大腸菌４４Ｃ６株（ｗ３１１０ｔｏｎＡΔｒｐｏＨｔｓＩｏｎΔｃｉｐΔｇａｌＥ）を形質転換した。形質転換された細胞を、まず、培養液の吸光度（６００nm）が約２〜３に達するまで、５０〜pg/ml カルベニシリンを含むＬＢ培地中で３７℃で培養した。次に、ＬＢ培養物を、０．４９％カザミノ酸（w/v）および５０〜g/ml のカルベニシリンを含むＭ９培地で２０倍に希釈した。３０℃で１時間、通気培養した後、インドール−３−アクリル酸を５０g/ml の最終濃度で添加した。さらに１５時間３０℃でこの培養物を生育させ、細胞を遠心分離により採取した。実施例４大腸菌における生物学的に活性なＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の作製生物学的に活性な再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）を作製するための下記の方法は、ＮおよびＣ末端が延長された型を含む、他のＴＰＯ変種の回収にも同様に適用することができる。Ａ．不溶性ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の回収プラスミドｐＭＰ２１０−１によりコードされるＴＰＯ(Ｍｅｔ^-1１−１５３) を発現する大腸菌を、上記のようにして培養する。典型的には、約１００ｇの細胞を、ポリトロン（Polytron）ホモジナイザーを用いて、１（１０倍量）の細胞破壊緩衝液（１０mM Tris、５mM ＥＤＴＡ、pH８）中で再懸濁し、細胞を５０００×ｇで３０分間遠心分離する。洗浄した細胞ペレットを、ポリトロンホモジナイザーを用いて、１Ｌの細胞破壊緩衝液に再び懸濁し、製品説明書に従って、細胞懸濁液を、ＬＨ細胞破壊装置(LH Cell Disruptor) (LH Inceltech,Inc.)またはマイクロフルイダイザー（Microfluidizer）（Microfluidics Internatlonal ）に通過させる。懸濁液を５，０００×ｇで３０分間遠心分離し、再懸濁し、再び遠心分離を行い、洗浄された屈折体ペレットを作製する。洗浄されたペレットは、直ちに使用するか、または−７０℃で保存する。Ｂ．モノマーＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の可溶化および精製上記のペレットを、５倍重量の６〜８M グアニジンおよび２５mMＤＴＴ（ジチオスレイトール）を含む２０mM Tris、pH８に再懸濁し、４℃で１〜３時間または一晩攪拌し、ＴＰＯタンパク質を可溶化する。高濃度の尿素（６〜８Ｍ）も有用であるが、一般的にグアニジンと比較すると収率は低い。可溶化の後、溶液を３０，０００×ｇで３０分間遠心分離し、変性した単量体ＴＰＯタンパク質を含む清澄な上清を得る。次に、上清を、２ml/分の流速で、Superdex ２００ゲル濾過カラム（Pharmacia、２．６×６０cm）上でクロマトグラフィーにかけ、１０m M ＤＴＴを含む２０mM リン酸ナトリウム、pH６．０でタンパク質を溶出させる。１６０ml〜２００ml の間に溶出する、単量体変性ＴＰＯタンパク質を含む画分をプールする。ＴＰＯタンパク質を、半調製用Ｃ４逆相カラム（２×２０cmＶＹＤＡＣ）でさらに精製する。３０％アセトニトリルを含む０．１％ＴＦＡ（トリフルオロ酢酸）で平衡化したカラムに、５ml/分でサンプルを適用する。タンパク質をアセトニトリルの直線勾配（６０分で３０〜６０％）で溶出させる。精製された還元タンパク質は、約５０％アセトニトリルで溶出する。この物質は、生物学的に活性なＴＰＯ変種を得るための再折り畳みに用いる。Ｃ．生物学的に活性なＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）の生成０．１％ＴＦＡ／５０％アセトニトリル４０ml 中に含まれる約２０mg のモノマー還元変性ＴＰＯタンパク質を、最適には以下の試薬を含む再折り畳み緩衝液３６０ml で希釈する。５０mM Tris ０．３M ＮａＣｌ５mM ＥＤＴＡ２％ＣＨＡＰＳ界面活性剤２５％グリセロール５mM 酸化グルタチオン１mM 還元グルタチオン pHは８．３に調整混合後、再折り畳み緩衝液を４℃で１２〜４８時間軽く攪拌し、正しいジスルフィド結合型のＴＰＯ（下記参照）の再折り畳み収率が最大となるようにする。次に、溶液を最終濃度０．２％までＴＦＡで酸性化し、０．４５または０．２２ミクロンのフィルターで濾過し、１１０倍量のアセトニトリルを添加する。次に、この溶液を直接ポンプでＣ４逆相カラムへ通過させ、精製され再折り畳みされたＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）を、上記と同一の勾配プログラムで溶出させる。再折り畳みされた生物学的に活性なＴＰＯは、これらの条件下で４５％アセトニトリルで溶出する。不適切なジスルフィド結合型のＴＰＯはそれよりも先に溶出する。最終的な精製ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルおよび分析用Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより測定した場合、９５％より高い純度を有する。動物実験用に、Ｃ４精製された物質を、生理学的に適合する緩衝液に対して透析した。１５０mM ＮａＣｌおよび０．０１％ Tween 80 を含む等張緩衝液（１０mM 酢酸ナトリウム、pH５．５、１０mM クエン酸ナトリウム、pH５．５、または１０mM リン酸ナトリウム、pH７．４）を用いた。Ｂａ／Ｆ３アッセイにおけるＴＰＯの高い効果のため（最大の半分の刺激が約 3pg/ml で得られた）、多くの異なる緩衝液、界面活性剤および酸化還元条件を用いて、生物学的に活性な物質を得ることが可能である。しかし、ほとんどの条件下では、適切に折り畳まれた物質がほんの少量（＜１０％）しか得られない。商業的な製造工程のためには、少なくとも１０％、より好ましくは３０〜５０％、最も好ましくは＞５０％の再折り畳み収率が望ましい。多くの異なる界面活性剤（Triton Ｘ−１００、ドデシル−β−マルトシド、ＣＨＡＰＳ、ＣＨＡＰＳＯ、ＳＤＳ、サルコシル、Tween 20、Tween 80、ツウィタージェント（Zwitterg ent）３−１４など）が、高い再折り畳み収率をもたらすか否かを調べた。これらの界面活性剤のうち、ＣＨＡＰＳファミリー（ＣＨＡＰＳおよびＣＨＡＰＳＯ）のみが、折り畳み反応において、タンパク質凝集および不適切なジスルフィド形成を制限するために、一般的に有用であることが見出された。１％より高いＣＨＡＰＳレベルが、最も有用であった。収率を最も高めるには、０．１M〜０．５Mの最適なレベルの塩化ナトリウムが必要であった。ＥＤＴＡ（１〜５mM）が存在すると、いくつかの調製物で見られたような、金属触媒による酸化（および凝集）の量が制限された。１５％より高いグリセロール濃度で、最適な再折り畳み条件が得られる。収率を最大にするには、酸化還元試薬の組として、酸化グルタチオンおよび還元グルタチオン両方、または酸化システインおよび還元システイン両方が必須である。一般的に、酸化された試薬が、酸化還元対の還元された試薬メンバーと同等かまたは過剰なモル比の時に、より高い収率が観察された。これらのＴＰＯ変異体の再折り畳みに最適なpH 値は７．５と約９の間であった。有機溶媒（例えば、エタノール、アセトニトリル、メタノール）は、１０〜１５％またはそれ以下の濃度であれば使用できた。それ以上のレベルの有機溶媒は、不適切な再折り畳み型の量を増加させた。一般的には、Tris およびリン酸緩衝液が有用であった。４℃でインキュベーションすることによっても、適切な折り畳まれたＴＰＯのレベルが上昇した。最初のＣ４段階で精製されたＴＰＯ調製物の再折り畳み収率は、典型的には（再折り畳み反応で用いた還元変性ＴＰＯの量に対して）４０〜６０％であった。調製物の純度が低い場合（例えば、Superdex ２００カラムの直後または初期の屈折体抽出の後）でも、活性な物質を得ることはできるが、沈殿が多く生じ、ＴＰＯ再折り畳み過程において非ＴＰＯタンパク質が干渉することにより収率は低い。ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、４個のシステイン残基を有するため、このタンパク質の３種の異なるジスルフィド型を作成することが可能である。１型：システイン残基１−４間および２−３間のジスルフィド２型：システイン残基１−２間および３−４間のジスルフィド３型：システイン残基１−３間および２−４間のジスルフィド再折り畳み条件を決定するための初期の研究において、ＴＰＯタンパク質を含むいくつかの異なるピークを、Ｃ４逆相クロマトグラフィーにより分離した。これらのピークのうちの一つのみが、Ｂａ／Ｆ３アッセイで調べたところ、有意な生物学的な活性を有していた。したがって、その型が選択的に得られるように、再折り畳み条件を最適化した。これらの条件下で、不適切に折り畳まれた型は、得られた全モノマーＴＰＯのうちの１０〜２０％より少なかった。質量分析およびタンパク質配列決定により、生物学的に活性なＴＰＯのジスルフィドパターンは、１−４および２−３（すなわち１型）であることが決定された。Ｃ４で分離された種々のピークのアリコート（５〜１０ナノモル）をトリプシン（１：２５のトリプシン対タンパク質モル比）で分解した。分解混合物を、ＤＴＴ還元の前後に、マトリックスを用いたレーザー脱着質量分析により分析した。還元後、ＴＰＯの大きい方のトリプシンペプチドのほとんどに相当する分子量が検出された。還元されていないサンプルでは、これらの質量のいくつかが存在せず、新たな質量が観察された。新しいピークの質量は、基本的に、ジスルフィド対に関与している個々のトリブシンペプチドの合計に相当していた。したがって、再折り畳みされた生物学的に活性な組換えＴＰＯのジスルフィドパターンを明確に１−４および２−３に帰属することができた。これは、関連分子、エリスロポエチンの既知のジスルフィドパターンと等しい。Ｄ．組換え再折り畳みＴＰＯ（ｍｅｔ１−１５３）の生物学的活性再折り畳みされた精製ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、インビトロアッセイでも、インビボアッセイでも活性を有している。Ｂａ／Ｆ３アッセイでは、Ｂａ／Ｆ３細胞へのチミジン取り込み刺激の最大の半分が、３．３pg/ml（０．３pM ）で達成された。ｍｐｌレセプターを用いたＥＬＩＳＡでは、最大の半分の活性が、１．９ng/ml（１２０pM）で得られた。正常な動物および致死量近いＸ線を照射することにより作製した骨髄抑制動物で、ＴＰＯ（Ｍｅｔ^-1１−１５３）は、新しい血小板の産生を刺激する高い効果を示した（マウス１匹当たり３０ngという低い用量で活性が見られた）。実施例５骨髄抑制（カルボプラチン／放射線照射）マウスのデータ方法動物全ての動物実験は、ジェネンテック社（Genentech Inc.）のInstitutionalCar e and Use Committee の認可を得て行った。実験開始前に、全ての動物について同定のため耳にタグを付け、基線の全血球数（ＣＢＣ）を得た。１０匹の雌Ｃ５７ＢＬ／６マウスからなる群に、¹³⁷Ｃｓ由来の５．０Ｇｙのガンマ線を照射した。６時間以内に、２００μｌの腹腔内注射として、１．２mgのカルボプラチンを投与した。以下は、標準的なマウスモデルにおける組換えマウストロンボポエチン（ｒｍＴＰＯ）を使用するプロトコルおよび結果である。当業者であれば、このモデルをヒトにも読み替えることができることを理解されたい。ヒトトロンボポエチンが、同マウスモデルで試験され、関連のある活性を示したが、種特異性のためレベルは低かった。したがって、以下のプロトコルは、関連のある効果が証明できるよう、マウスにとって適切なマウスＴＰＯ対応物を用いて選択された。マウスプロトコルでヒトＴＰＯを使用しても、程度が異なるだけで、同様の結果が得られると考えられる。明らかなことであるが、ヒトにおけるヒトＴＰＯの使用、他の適当なモデルとの比較を行うためには、ＦＤＡによる臨床試験の承認を待つ必要がある。血液サンプルの調製実験の前、および実験中のある時点で、眼窩洞から４０μＬの血液を採取し、凝固を防ぐために１０ml の希釈剤で直ちに希釈した。採取から６０分以内に、各血液サンプルの全血球数（ＣＢＣ）を、Serrono Baker system 9018 血液分析機で測定した。各用量群の動物の半分のみを一定の日に採血し、したがって、各動物は、異なる時点で採血された。治療法実験１：血小板減少症にされた動物における組換えマウストロンボポエチン（ｒｍＴＰＯ３３５ａａ）に対する反応を決定するため、動物群を１、２、４または８日連続で、０．１μg/日（約５μg/kg/日）で処置した。ｒｍＴＰＯ（３３５ａａ）による処置は、モデルの開始から２４時間後に開始し、１日に１００μ ｌの皮下注射として投与を行った。実験２：このモデルにおけるｒｍＴＰＯ（３３５）の用量反応関係の性質を決定するため、モデルの開始から２４時間後に、動物にｒｍＴＰＯ（３３５）を１回注射した。動物群に、０．０１、０．０３、０．１または０．３μｇのｒｍＴＰＯ（３３５）を、１回の１００μｌの皮下注射として投与した。２つの投与経路を比較するため、４動物群に、静脈経路（外側尾静脈）で同量のｒｍＴＰＯ（３３５）を投与する同時実験を行った。実験３：この実験系は、様々なポリエチレングリコール（ＰＥＧ）と結合した、ＰＥＧ化短縮型ｒｍＴＰＯ分子［ｒｍＴＰＯ（１５３）］の効力を比較するために行った。ｉ．この実験では、血小板減少症動物に、ＰＥＧ化されていないｒｍＴＰＯ（１５３）分子、一つの２０ＫＰＥＧと結合したｒｍＴＰＯ（１５３）分子、または一つの４０ＫＰＥＧと結合したｒｍＴＰＯ（１５３）分子のうちの一つを注射（０．１μｇ皮下）した。 ii．最後の実験では、血小板減少症にされた動物に皮下または静脈経路で、０．１μｇの単一の４０ＫＰＥＧ化ｒｍＴＰＯ（１５３）分子を投与し、その効果を比較した。ｒｍＴＰＯ（３３５）（０．１μg）を陽性対照として用いた。結果準致死量の放射線照射およびカルボプラチンの組み合わせにより、再現性のある反応が得られ、１００％の動物で持続的な血小板減少症が生じた。血小板減少症の最下点は、１０日目に起こり、２１日目〜２８日目までに血小板数は徐々に回復した。この血小板減少症に伴い、顕著な貧血が見られ、その最下点は少し遅れて１４日目〜１７日目に起こり、正常な赤血球数は２８日目までに回復した。白血球数も、実験の経過に伴い減少した。実験１：モデルの開始から２４時間後に０．１μgのｒｍＴＰＯ（３３５）を１回投与することにより、このマウスモデルにおける血小板数の回復が、促進された。この１回のｒｍＴＰＯ（３３５）の投与により、反応の最下点が、１０日目に１９６×１０³±３３×１０³/μlであったのが、７日目に４３４×１０³± ７×１０³/μlに上昇した。血小板数減少の初期速度は、変化しなかったが、回復期ははるかに速く、血小板数は、対照群では２１日目までかかったのに対し、１４日目に正常値にまで回復した。１日目および２日目に０．１μg/日を投与した場合には、さらにある程度の改良が見られたが、これが限界であった。４日または８日連続でｒｍＴＰＯ（３３５）を投与しても、それ以上の改良は見られなかった（ＦＩＧ．１ａ）。血小板数の回復促進に加え、これらの動物に発症する貧血も、１日目にｒｍＴＰＯ（３３５）を１回投与することにより、寛解された。血小板数と同様に、ｒｍＴＰＯ（３３５）を１回より多く投与しても、それ以上の利益は得られなかった（ＦＩＧ．１ｂ）。ｒｍＴＰＯ（３３５）は、血小板数および赤血球数の減少を伴う白血球減少症には効果を示さなかった（ＦＩＧ．１ｃ）。実験２：モデルの開始から２４時間後に１回皮下投与されたｒｍＴＰＯ（３３５）に対する反応は、用量依存的であった。試験した最も低い用量（０．０１μ g）では、血小板の回復には対照と比較して効果が見られなかった。しかし、０．０３μｇを投与したときに反応はほぼ最大になった（ＦＩＧ．２ａ）。この極めて急勾配の用量反応曲線は、１４日目の血小板数を対数直線プロットでプロットした場合によりよく理解できる（ＦＩＧ．３ａ）。同様な急勾配の用量反応は、このモデルの赤血球の回復でも見られる（ＦＩＧ．３ｂ）。ｒｍＴＰＯ（３３５）の静脈内投与でも、同様の用量依存的な反応が得られた。しかし、試験した最も低い用量（０．０１μg）が、静注により投与した場合には、有効であり（ＦＩＧ．４ａ）、すなわち、用量反応曲線が左方にシフトした。シフトは、１桁の半分にも満たないため、この効力の増強は小さい（ＦＩＧ．３ａ）。より重要なことは、両投与経路が、ほぼ同等の最大値を示したことである（ＦＩＧ．３ａ）。皮下および静脈の投与経路は、貧血の回復も、用量依存的に増強した（ＦＩＧ．２ａ、３ｂ、４ｂ）。しかし、皮下投与経路も、静脈投与経路も、試験した用量の範囲では、白血球減少症には効果を示さなかった（ＦＩＧ．２ｃ、４ｃ）。実験３：ｉ．一つの２０ＫＰＥＧまたは一つの４０ＫＰＥＧによるｒｍＴＰＯ（１５３）のＰＥＧ化は、ＰＥＧ化されていない分子と比較して血小板回復の効果が大きかった。全長分子とは異なり、いずれのＰＥＧ化ｒｍＴＰＯ（１５３）分子も、モデルの開始から２４時間後に１回０．１μgを皮下投与した場合、血小板減少症の最下点には影響を与えなかったが、モデルの回復期は大きく促進した（ＦＩＧ．５ａ）。このことは、１４日目に極めて明白に示されており、対照、ＰＥＧ化されていないｒｍＴＰＯ（１５３）、ｒｍＴＰＯ（１５３）＋２０ＫＰＥＧおよびｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０ＫＰＥＧの１４日目の血小板数は、それぞれ、８０×１０³±１５×１０³/μ1、２６８×１０³±６７×１０³/μ1、６９７×１０³±２９７×１０³/μl／および８７８×１０³±３１×１０³/μlであった（ＦＩＧ.５ａ）。同様の曲線が、赤血球の反応にも見られた（ＦＩＧ.５ｂ）。これらのｒｍＴＰＯ（１５３）を基本とした分子はいずれも、このモデルにおいて白血球減少症には効果を示さなかった（ＦＩＧ．５ｃ）。 ii．ｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０ＫＰＥＧ（０．１μg）は、静脈注射でも、皮下注射でも、１回の投与で同様の反応を示した。この実験では、皮下経路では、１０日目の最下点がわずかに変化し、血小板レベルが、対照では２８日目であったのに対し、１４日目に正常なレベルに回復した（ＦＩＧ．６ａ）。物質を静脈内に投与された動物でも、最下点および回復速度に同様の効果が見られた（ＦＩＧ．７ａ）。この４０ＫＰＥＧ化短縮型ｒｍＴＰＯ（１５３）分子に対する反応は、皮下投与した場合（ＦＩＧ．６ｂ）にも、静脈投与した場合（ＦＩＧ．７ｂ）にも、血小板および赤血球両方の回復に関する、ｒｍＴＰＯ（３３５）に対する反応とほぼ同一である。他の全ての実験と同様に、ｒｍＴＰＯ（１５３）＋４０ＫＰＥＧは、皮下経路でも、静脈経路でも、循環血中の白血球レベルには効果を示さなかった（ＦＩＧ．６ｃ、７ｃ）。平行して行った実験で、この分子の１０ＫＰＥＧ化型の使用は、血小板数または赤血球数に関する、ｒｍＴＰＯ（１５３）に対する反応と比較して変化がなかった。以下に、細胞傷害性化学療法を受けているヒト患者における、組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ₃₃₂）による１回投与治療の使用のプロトコルおよび結果を示す。細胞傷害性化学療法を受けているヒト患者における組換えヒトトロンボポエチン（ｒｈＴＰＯ）による１回投与治療集中的な化学放射線療法の前臨床モデルで、ｒｈＴＰＯの１回投与により、血小板数の最下点が上昇し、重篤な血小板減少症の期間が短縮されることが示された。化学療法を受けている癌患者にｒｈＴＰＯを１回投与した、２つの第Ｉ相試験の暫定的な結果を示す。患者および方法：両実験は、０．３、０．６または１．２meg/kg を１回静脈内にボーラス注射した後のｒｈＴＰＯの安全性および血小板の反応を評価するため、２１日間の前化学療法期（サイクル０）に開始した（各実験で１群当たり３人の患者）。その後、選択された次のサイクルで、化学療法後に、患者に同量のｒｈＴＰＯを投与した。第一の試験集団は、進行した悪性腫瘍をもつ患者からなり、それらの患者には、２回の連続的な化学療法サイクルのそれぞれで、チオテパ化学療法（６５ mg/m² ｑ２８ｄ）による救済の翌日にｒｈＴＰＯを投与した。第二の試験では、化学療法を受けたことがない肉腫患者に、ＡＩ化学療法（ドキソルビシン９０mg /m²、１０ｇ/m² ｑ２１ｄ）による誘導処置を施した。サイクル０の後、この試験の患者を、最初の化学療法サイクルの間モニターし、第二サイクルおよびその後のサイクルでは、化学療法（ｄ５）終了の翌日、ｒｈＴＰＯを１回注射した。結果：現在までに、１４人の患者を処置した。ｒｈＴＰＯに対する耐性は良好で、実験物質が原因の重大な副作用は報告されていない。ｒｈＴＰＯに対する抗体は、観察されていない。以下に示すように、サイクル０において、最も低い用量（０．３mcg/kg）の活性は弱く、用量が増加するにつれ活性が増大した。サイクル０の間、最大血小板数は１１日目を中心（７〜１４日）として最大となった。ＷＢＣまたはＨＣＴには有意な変化は見られなかった。骨髄のＦＡＣＳ解析では、０．６mcg/kgを受けた２人の患者のうちの２人で、全てのＣＤ３４＋サブセットが増加していた。これらの患者では、末梢血ＣＤ３４＋細胞の増加も見られ、それにより、ＴＰＯは幹細胞を動員する活性を有している可能性が示された。用量の計算および化学療法後の治療は、現在進行中である。これらの第Ｉ相試験は、総じて、ｒｈＴＰＯの１回投与が、安全であり、よく寛容されていることを示している。０．３、０．６、および１．２mcg/kg という用量レベルで、血小板産生活性の増加が示された。進行中の、より高い用量レベルによる患者の処置により、ｒｈＴＰＯの１回の投与が集中的な化学療法後の血小板減少症の改善において有効であるという仮説が、検証されよう。おわりに本発明を実施するために用いることができる特定の方法を詳細に上記に説明した。このような特定の方法の詳細により、当業者は、本発明の成果の使用において、同一の情報に到達するための代替法を工夫することができよう。したがって、上記の方法がいかに詳細に試験されていようとも、それは、決して本発明の範囲全体を制限するものではなく、本発明の範囲は、合法的な添付の請求の範囲の構築によってのみ決定される。本明細書に引用された全ての書類は、参照として特別に本明細書に組み込まれる。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項【提出日】１９９８年２月１６日（１９９８．２．１６）【補正内容】請求の範囲１．血小板減少症を患っているか、またはその危険がある哺乳動物を処置するための医薬の製造におけるトロンボポエチンの使用であって、該医薬が１日に１回のまたは２回の治療用量で投与されることを特徴とする、使用。２．トロンボポエチンが１回の治療有効用量で投与される、請求項１に記載の使用。３．治療用量が約０．１〜約１００μg/kg の範囲である、請求項１または請求項２に記載の使用。４．治療用量が約０．１〜約１μg/kgの範囲である、請求項１または請求項２に記載の使用。５．治療用量が約０．５〜２±１．５μg/kg の範囲である、請求項１または請求項２に記載の使用。６．治療用量が、それぞれ低回数２回用量投与において、約０．５〜１．５μg/ kgの範囲である、請求項１に記載の使用。７．医薬が、サイトカイン、コロニー刺激因子およびインターロイキンからなる群より選択された、治療に有効な量の物質と組み合わされて投与される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。８．物質がＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１１から選択される、請求項７に記載の使用。９．医薬が静脈内に投与される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。１０．医薬が皮下に投与される、請求項１〜８のいずれか１項に記載の使用。１１．医薬が薬学的に受容可能な担体または賦形剤と組み合わされて投与される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。１２．担体または賦形剤がキレート剤を含む、請求項１１に記載の使用。１３．キレート剤がＥＤＴＡである、請求項１２に記載の使用。１４．トロンボポエチンが、ａ）断片ポリペプチド、ｂ）変種ポリペプチド、ｃ）キメラポリペプチド、ｄ）ＰＥＧ化ポリペプチド、からなる群より選択される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。１５．ＰＥＧ化ポリペプチドがボリエチレングリコールを用いて調製される、請求項１４に記載の使用。１６．トロンボポエチンが、ａ）哺乳動物から単離されるポリペプチド、ｂ）組換え法により作製されるポリペプチド、およびｃ）合成法により作製されるポリペプチド、からなる群より選択される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。１７．トロンボポエチンが、ａ）ヒト由来であるポリペプチド、およびｂ）ヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド、からなる群より選択される、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。１８．トロンボポエチンが下記式：Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ［式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）はＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹まで（両端を含む）のヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミノ酸配列を示し；ＸはＣｙｓ⁷のアミノ基、または成熟ＴＰＯ、もしくはＭｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒなどが追加された該配列の延長アミノ酸配列、もしくはアルギニンからリジンのような該配列のアミノ酸置換体、もしくはトロンビンの１以上のアミノ末端アミノ酸残基を示し；ＹはＣｙｓ¹⁵¹のカルボキシル末端基、または成熟ＴＰＯもしくはその延長配列の１以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を示す。］により示されるものである、請求項１または請求項２に記載の使用。１９．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、先の請求項のいずれか１項に記載の使用。２０．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチン（１５３）である、請求項１９に記載の使用。２１．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチン（３３２）である、請求項１９に記載の使用。２２．トロンボポエチンがｒｈＴＰＯ₃₃₂である、先の請求項のいずれか１項に記載の方法。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (31)優先権主張番号０８／６９７，６３１ (32)優先日平成８年８月28日(1996．8．28) (33)優先権主張国米国（ＵＳ） (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ

Claims

【特許請求の範囲】１．血小板減少症を患っているか、またはその危険がある哺乳動物を処置する方法であって、そのような処置が必要な哺乳動物に、治療に有効な量のトロンボポエチンを１日１回または低回数の用量投与することを含む、方法。２．トロンボポエチンが治療に有効な用量で１回投与される、請求項１に記載の方法。３．治療用量が約１〜約１０μg/kg の範囲である、請求項１または請求項２に記載の方法。４．サイトカイン、コロニー刺激因子およびインターロイキンからなる群より選択される治療に有効な量の物質を、同時投与することをさらに含む、請求項１または請求項２に記載の方法。５．物質がＫＬ、ＬＩＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、Ｍ−ＣＳＦ、ＥＰＯ、ＦＬＴ−３、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８、ＩＬ−９およびＩＬ−１１から選択されるものである、請求項４に記載の方法。６．物質が静脈内に投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。７．物質が皮下に投与される、請求項１または請求項２に記載の方法。８．物質が薬学的に受容可能な担体または賦形剤と組み合わされて投与される、請求項１または請求項２または請求項３に記載の方法。９．担体または賦形剤がキレート剤を含む、請求項８に記載の方法。１０．キレート剤がＥＤＴＡである、請求項９に記載の方法。１１．トロンボポエチンが、ａ）断片ポリペプチド、ｂ）変種ポリペプチド、ｃ）キメラポリペプチド、ｄ）ＰＥＧ化ポリペプチド、からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。１２．ＰＥＧ化ポリペプチドがポリエチレングリコールを用いて調製される、請求項１１に記載の方法。１３．トロンボポエチンが、ａ）哺乳動物から単離されるポリペプチド、ｂ）組み換え法により作製されるポリペプチド、およびｃ）合成法により作製されるポリペプチド、からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。１４．トロンボポエチンが、ａ）ヒト由来であるポリペプチド、およびｂ）ヒトにおいて非免疫原性であるポリペプチド、からなる群より選択される、請求項１または請求項２に記載の方法。１５．トロンボポエチンが下記式：Ｘ−ｈＴＰＯ（７−１５１）−Ｙ［式中、ｈＴＰＯ（７−１５１）はＣｙｓ⁷からＣｙｓ¹⁵¹まで（両端を含む）のヒトＴＰＯ（ｈＭＬ）アミノ酸配列を示し；ＸはＣｙｓ⁷のアミノ基、または成熟ＴＰＯ、もしくはＭｅｔ、Ｌｙｓ、Ｔｙｒなどが追加された該配列の延長アミノ酸配列、もしくはアルギニンからリジンのような該配列のアミノ酸置換体、もしくはトロンビンの１以上のアミノ末端アミノ酸残基を示し；そしてＹはＣｙｓ¹⁵¹ のカルボキシル末端基、または成熟ＴＰＯもしくはその延長配列の１以上のカルボキシ末端アミノ酸残基を示す。］により示されるものである、請求項１または請求項２に記載の方法。１６．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチンである、請求項１または請求項２に記載の方法。１７．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチン（１５３）である、請求項１６に記載の方法。１８．トロンボポエチンがヒトトロンボポエチン（３３２）である、請求項１６に記載の方法。１９．治療用量が約０．１〜約１０mg/kg の範囲である、請求項１または請求項２に記載の方法。２０．治療用量が約０．５〜２±１．５mg/kg の範囲である、請求項２に記載の方法。２１．治療用量がそれぞれが低回数、二用量投与で、約０．５〜１．５mg/kg の範囲である、請求項１に記載の方法。２２．トロンボポエチンが静脈内に投与される、請求項２０または請求項２１に記載の方法。２３．トロンボポエチンが皮下に投与される、請求項１に記載の方法。２４．総投与量が静脈経路で投与される量の約１〜３倍の範囲である、請求項２３に記載の方法。２５．トロンボポエチンがｒｈＴＰＯ₃₃₂である、請求項１または請求項２０に記載の方法。