JP2000505306A

JP2000505306A - ２つまたはそれ以上の相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列の新規同定方法

Info

Publication number: JP2000505306A
Application number: JP9530595A
Authority: JP
Inventors: イラグ，ヴィック; ゲ，リミン
Original assignee: Morphosys AG
Current assignee: Morphosys AG
Priority date: 1996-02-26
Filing date: 1997-02-26
Publication date: 2000-05-09
Also published as: WO1997032017A1; EP0883686A1

Abstract

(57)【要約】本発明は２つまたはそれ以上の特異的相互作用ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列の同定に関する。さらに本発明は本発明の方法にしたがって核酸配列を同定するために用いることができるキットに関する。

Description

【発明の詳細な説明】２つまたはそれ以上の相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列の新規同定方法本発明は２つまたはそれ以上の特定の相互作用性ペプチドまたはタンパク質をコードする核酸配列の同定方法に関する。さらに本発明は本発明の方法にしたがって核酸配列を同定するために用いることができるキットに関する。タンパク質−タンパク質相互作用は遺伝子の複製および発現から生物の形態形成まで、すべての生物学的プロセスにおいて重要な役割を演じている（Lewin，B ．1994，Genes V．Oxford University Press）。タンパク質−タンパク質相互作用の検出方法は種々の生物学的プロセスの基本機構および治療学の発展を理解するのに有用であることが証明されている。タンパク質−タンパク質相互作用の検出は２つの主要なカテゴリー：（ｉ）物理−化学に基づくアプローチおよび（ii ）遺伝学的アプローチ（Phizicky，E.，M．& Fields，S．Microbiological Revi ews 59（1995）94-123）に分けられる。通常、物理−化学的方法によるタンパク質−タンパク質相互作用の検出は大量の材料を必要とし、より重要な点は研究するタンパク質の実体（アイデンティティー）が既知でなければならないことである。最近の質量分析法の発達によりこの問題は回避されたが、高性能の装置と熟練性を要するという不都合を伴う（Wang，R．& Chait，B．T.，Current Opinion in Biotech．5（1994）77-84）。対照的に、遺伝的アプローチは純粋な材料および専門の装置を必要とせず、さらに処理量がより高いという利点を有するタンパク質−タンパク質相互作用の簡易かつ強力な同定方法を可能とする。種々の遺伝学的アプローチがタンパク質−タンパク質相互作用の同定に用いられてきた。現在通用している１つの方法は酵母２−ハイブリッドシステム（Fiel ds，S．& Song，O．K.，Nature（London）340，（1989）245-246）であり、これは既知のタンパク質と相互作用する新規タンパク質を同定できる。もう１つの一般的な遺伝学的アプローチはファージディスプレイシステム（特許出願WO90/02809）であり、これは、タンパク質を繊維状ファージの表面タンパク質成分に融合させることにより、目的のリガンドとの結合について選択することを可能とする。ファージ表面にディスプレイ（表示）されるタンパク質をコードする遺伝子はファージ内に包含され、遺伝情報がその遺伝子産物とカップリングされる。これにより「ライブラリー」タンパク質のスクリーニングが可能になり、スクリーニングされたタンパク質の実体をファージの核酸配列から推定することができる。この技術はWinterら（特許出願WO92/20791）によって適用拡大され、特異的結合ペアの多量体メンバー（例えば、抗体のVHおよびVL鎖の組み合わせ）のライブラリーを作成し、相補的な特異的結合ペアメンバーに結合できる機能的な特異的結合ペアメンバー（例えば、抗原）が選択された。このライブラリーは、当該多量体メンバーの対応するサブユニット集団をそれぞれコードする２つのサブライブラリーを組み合わせる（例えば、VH鎖のライブラリーをVL鎖のライブラリーと組み合わせる）ことによって構築されるが、原理的には、第１サブライブラリー由来のそれぞれのサブユニットは第２サブライブラリー由来のそれぞれのサブユニットに非特異的に結合することができるものである。この方法により特定の抗原に対する唯一の抗体を同定することができるけれども、特異的結合ペアの２つのパートナーがともに未知である場合、それらを同定する方法は提供できない。最近、非感染ファージに依存する独特のバージョンのファージティスプレイ法が提唱されている（Duenas，M．& Borrebaeck，C．A．K.，Bio/Technology 12（ 1994）999-1002；EP 0 614989）。junタンパク質と相互作用する、cDNAライブラリーからのタンパク質を同定できるこのシステムのバージョンが記載されている（Gramatikoffら、Nucleic．Acids Res．22（1994）5761-5762）。また、同じ原理が抗体−抗原システムに作用することも示されている（Krebberら、FEBS Lett ers 377（1995）227-231）。前述の遺伝子選択アプローチはすべて強力であるが、これらは遺伝的に異なる単一の集団のみから相互作用する結合性物質を選択することに限定されている（ライブラリーvs．個々）。しかし、ライブラリーvs．ライブラリーセッティングにおいて結合性物質およびそれらの特異的結合パートナーを同時に同定し、好ましくは少なくとも２つの遺伝的に異なる集団が関与する同定方法が強く望まれる。先行文献は、この技術的問題に対する解決法、すなわち２つ以上の遺伝的に異なる集団（ライブラリー vs．ライブラリー）由来の相互作用性物質およびそれぞれの核酸配列を同定することを記載も示唆もしていない。本発明は、上記の技術的問題を請求の範囲に特徴づけされている態様を提供することによって解決するものである。これらの態様を用いることによって（ポリ）ペプチド−（ポリ）ペプチド相互作用が検出される割合を指数関数的に増加させることができた。本発明は機能的ゲノム分野において種々の適用がみいだされ、これにより未知の機能の種々のタンパク質を他のタンパク質と関連づけることができる。すなわち、本発明は、核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーを入手し； (b)工程(a)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(a)および(b)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとがともに相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (c)要すれば、工程(a)および／または(b)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a )および(b)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(c)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程(a)および／または(b)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させることができる）； (d)工程(a)、(b)および任意に(c)に記載の組換えベクターまたは核酸配列の該ライブラリーのメンバーを適当な宿主細胞中、少なくとも１つの相互作用が確立するように発現させ； (e)該（ポリ）ペプチドの相互作用を表すスクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (f)任意に、さらに選択、スクリーニングおよび／または精製工程を行い；そして (g)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定することを特徴とする方法に関する。これゆえ本明細書中では、用語「表現型が区別できる性質」はベクター分子によってコードされる性質もしくは組換え挿入物によってコードされる性質または両方のタイプの性質のいずれかに関する。ベクターにコードされる性質に関しては、これらは例えば耐性マーカーまたは特定栄養の要求性であり得る。組換え挿入物は相互作用に寄与する核酸部分に加えて当該性質をコードする核酸部分を含むことができることに留意すべきである。本明細書中において、用語「別のメンバー」は必ずしもそうではないが、構造的に異なる相違物であり得る。さらに、本発明の本文中において、用語「集合体」は「少なくとも２つ」の意味をもつ。少なくとも２つの組換え挿入物によって発生される新規な性質は本発明の発明原理を反映している。すなわち、２つ（またはそれ以上）の（ポリ）ペプチドが、例えばホモ２量体またはヘテロ２量体形態で相互作用する場合のみ、スクリーニング可能または選択可能な性質が生成する。２つまたはそれ以上の分子間の相互作用は直接の相互作用であるか、あるいは間接的に媒介されてもよい。直接的相互作用の例は、ライブラリー１由来の核酸配列によってコードされる抗体とライブラリー２由来のcDNAタンパク質との結合、cDNAライブラリー１由来の核酸配列によってコードされるタンパク質とcDNAライブラリー２由来のタンパク質との結合および一方のライブラリー由来の核酸配列によってコードされる抗イディオタイプ抗体と他方のライブラリー由来の核酸配列によってコードされる対応する抗体との結合である。核酸配列は好ましくはDNAであり、最も好ましくは遺伝子またはその一部である。間接的相互作用の例は２つのライブラリーによってコードされる２つの（ポリ）ペプチドの、リン酸化酵素によって媒介される架橋である。例えばライブラリー１によってコードされる１つの（ポリ）ペプチドが各々のキナーゼによってリン酸化されると、このタンパク質はライブラリー２によってコードされる第２の（ポリ）ペプチドと相互作用できる。このタイプの相互作用のよい例であるリン酸化酵素は追加の（付加的な）ライブラリー（の１つ）由来の核酸によってコードされてもよいし、ならびに／あるいは宿主細胞のゲノムによってコードされていてもよい。通常、２つの（ポリ）ペプチドの相互作用は分子の「架橋」を形成し、この「架橋」は適当な検出方法を用いて検出可能である。この架橋はライブラリー１または好ましくは２によってコードされるポリペプチドの１つと共役し、あるいはこれによってコードされ、結合するタグ分子によって間単に検出できる。さらに本発明は、核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)適当な宿主細胞中で以下のものを少なくとも１つの相互作用を確立するように発現させる； (aa)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーに含まれる核酸配列； (ab)工程(aa)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる (ポリ)ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(aa)および(ab)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとが相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (ac)要すれば、工程(aa)および／または(ab)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)および(ab)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(ac)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程 (aa)および／または(ab)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能または選択可能性質を発生することができる）； (b)該（ポリ）ペプチドの相互作用を示す当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (c)任意に、さらにスクリーニング、選択および／または精製工程を行い；そして (d)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定するを特徴とする方法に関する。本発明の方法の好ましい態様においては、当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を細胞外に発現させる。この態様は、上記の性質を細胞外検出する従来からの方法、例えばスクリーニング可能なタグを保持させたカラムクロマトグラフィーなどを例えばプラーク精製法とともに使用しているであろう多くの研究室により簡便に利用され、それにより例えばこのカラムクロマトグラフィー工程によって始めに増産した細胞をさらに精製することができる。本発明の方法のさらに好ましい態様においては、工程(a)/(aa)（スラッシュの後に特定した工程は上記した本発明方法の第２態様の対応工程を意味する）の組換えベクター分子は表面に当該（ポリ）ペプチドを表示する複製可能遺伝的パッケージ（RGP）を生み出す。本明細書中において用語「複製可能遺伝的パッケージ（RGP）」は適当な宿主細胞に感染後、複製することができるウイルスまたはバクテリオファージのようなものを意味する。例えばバクテリオファージの場合は、核酸配列集団をファージまたはファージミドベクターのどちらかにファージの外殻成分、例えばgene IIIと解読枠内で挿入すればよく、その結果、コードされる結合性物質がファージの表面に表示される。組換えベクター分子として特に好ましいものは組換えファージ、ファージミドまたはウイルスであり、ファージとしては以下のものが最も好ましい： (a)クラスＩファージfd、M13、If、Ike、ZJ/2、Ffのいずれか； (b)クラスIIファージXf、Pf1およびPf3のいずれか； (c)λファージ群、ラムダ、434、P1のいずれか； (d)包膜ファージ群、PRD1のクラスのいずれか；あるいは (e)パラミクソウイルス群、オソミクソウイルス群、バキュロウイルス群、レトロウイルス群、レオウイルス群およびアルファウイルス群のクラスのいずれか。本発明の方法のさらに好ましい態様においては、上記選択工程(e)/(b)を相互作用性（ポリ）ペプチドを含むポリファージの選択によって行う。ポリファージは１コピーより多くのファージゲノムDNAを含有する。新しく生成するファージ外殼が２またはそれ以上の一本鎖DNA分子を包嚢する場合に、これらは低〜中頻度で天然に存在する。本発明の場合には、生成されるポリファージは少なくとも２つのファージゲノムを含み、これらは（i）両方ともライブラリー１を表すか、または（ii）両方ともライブラリー２を表すか、または（iii）それぞれライブラリー１およびライブラリー２を表すか、または（iv）付加的なライブラリーのいずれかからの少なくとも１つのメンバーと（ｉ）〜（iii）とを組み合わせたものであるか、のいずれかである。当業者に周知のように（例えばLopez，J．およびWebster，R．E.，Virorlogy 127（1983），177-193、Bauer，M．およびSm ith，G．P.，Virology 167（1988）166-175、またはGailus，V．ら、Res.Microb iol．145（1994）699-709参照）、ポリファージの生成効率はファージゲノムに適当な突然変異を導入することによって増加させることができる。本発明の方法のさらに好ましい態様では、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を上記RGPの感染力に結び付ける。この態様では、例えばバクテリオファージの感染力を操作できる可能性を利用し、感染力を当該（ポリ）ペプチドの相互作用と直接相関させるものである。本発明の方法の最も好ましい態様では、RGPは工程(a)/(aa)に用いる当該組換えベクターによってコードされ、非感染性とされており、そしてRGPの感染性力は、RGPに感染力を与えるドメインに融合させた工程(b)/(ab)および/または工程 (c)/(ac)の（ポリ）ペプチドと工程(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドとの相互作用によって回復する。本発明の方法のさらに最も好ましい態様では、RGPが宿主細胞に結合し、感染するのに必要な表面タンパク質をコードする遺伝子配列の修飾によって当該RGP を非感染性にする。 RGPの感染性に関する本発明の方法のこれらの好ましい態様および最も好ましい態様は、スクリーニングタグの別用途として用いられる。これらの態様では、選択感染の現象に利点をみいだすことができる（Krebbsrら、FEBS Letters 377 （1995）227-239）。スクリーニングタグは集合中の他の分子からその分子を物理的に分離することを可能にする一方、選択感染の利用によって相互作用ペアを積極的に選択することを可能にする。この現象は、例えばgeneIIIタンパク質のＣ末端以外のすべてを欠失させることによって非感染性にしたファージに対し感染性を選択的に回復させることができる構築体を利用することに基づくものである。ライブラリー１を表示するためにそのようなファージを利用し、結合性物質を保有する非感染性ファージが得られる。ライブラリー２と共発現させることによって上記のように結合性物質および結合パートナー間の相互作用が確立する。結合性物質−結合パートナーペアを保有するファージは非感染性であるが、上記のスクリーニングタグのかわりに感染性タンパク質を用いると感染性が回復する。本明細書中において用語「感染性タンパク質」はファージと結合した場合に、ファージがその後複製する場である細菌宿主内に侵入することを可能にする物質を意味する。感染性タンパク質の例は繊維状バクテリオファージgeneIIIタンパク質のＮ末端（少なくとも最初の２２０アミノ酸）である。感染性タンパク質はそれを保有するファージに対し、複製能力を与える。これゆえ、結合性物質/パートナーペアを保有するファージのみが複製する。ライブラリー１および２両者由来の遺伝子を含むハイブリッドファージの精製は、例えば上記の２つの選択マーカーの利用に左右される。このファージ中の遺伝子は当業者に周知の方法論を用いて同定できる。本発明のさらに好ましい態様は工程(a)/(aa)の組換えベクター分子が細胞、好ましくは細菌の表面に発現される融合タンパク質を生み出す方法に関する。これらの融合タンパク質は、例えばスクリーニングタグを連結したライブラリー２由来の適当な結合パートナーと相互作用すると、例えば細菌、酵母、昆虫細胞または哺乳類細胞とすることができる宿主細胞の表面にて検出することができる。融合タンパク質の細菌表面における表示自体は当分野に周知である。すなわち、リポタンパク質（Lpp）、外膜タンパク質A（OmpA）および鞭毛は大腸菌細胞表面に対する抗体およびペプチドを標的化するため用いられている。Fuchsら、B io/Technology 9（1991）1369-1372、WO93/01287は大腸菌表面に一本鎖抗体をペプチドグリカン関連リポタンパク質との融合タンパク質として提示させた。この抗体は蛍光ラベルした抗原および表示された一本鎖抗体のリンカーペプチドに指向する蛍光ラベルした抗体の結合によって視覚化された。Franciscoら、Proc．N atl．Acad．Sci．USA 90（1993）10444-10448およびGeorgiu，G．ら、WO93/1021 4は一本鎖抗体のＮ末端をOmpAのＣ末端に融合させ、一方OmpAのＮ末端はシグナル配列およびLppの最初の９アミノ酸と融合させることによって、大腸菌表面に抗体を表示させている。蛍光ラベルした抗原のOmpA−抗体融合タンパク質への結合をFACSによって検出した。Klauser（WO 95/17509）はIgAプロテアーゼシステムを淋菌から大腸菌に移し抗体を表示させた。IgAプロテアーゼ前駆体のベータドメインを外膜に組み込むことによって、プロテアーゼドメインの膜を通した輸送を、続いて培地中への自己タンパク質分解放出を導いた。それゆえIgAプロテアーゼのベータドメインに連結している抗体が細菌の表面に提示される。Furthe r,Lu,Z.ら、Bio/Technology 13（1994）366-371はペプチドをチオレドキシンおよび細菌鞭毛と融合させることによって抗IL-8抗体に対するエピトープのペプチド擬似体に対しスクリーニングする、そのペプチドを細菌表面に表示するシステムを記載している。次いで相互作用性（ポリ）ペプチドをコードする所望の核酸分子のさらなる同定は、当分野に既知の方法、例えば表面にタグを表示している宿主細胞の精製およびさらに抗生物質に基づく（antibioticum-based）選択技術、DNA精製および配列決定によって達成され得る。本発明の方法の特に好ましい態様では、当該細菌は淋菌または大腸菌であり、当該融合タンパク質は少なくとも鞭毛、lamB、ペプチドグリカン関連リポタンパク質またはOmpAタンパク質の一部および当該（ポリ）ペプチドからなる。本明細書の上記部分において繰り返し指摘したように、ライブラリー２にコードされる（ポリ）ペプチドに連結されたタグは所望の核酸配列の同定戦略にて用いられる。したがって本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程(b)/(ab)または(c)/(ac)の組換えベクター分子によってコードされる（ポリ）ペプチドを少なくとも１つのスクリーニングまたは選択タグに連結する。本明細書中において、用語「スクリーニングまたは選択タグ」は特定の物質が認識し、結合することができる短いアミノ酸配列を意味する。タグは一般に生体分子の精製に用いられ、その例は、Niまたは特異的抗体が結合することができるHis(n)［ここにn=4-6 である］ならびに適当な抗体によって認識されるflagおよびmycタグである。これらいずれの場合も、タグはライブラリー２のすべての結合パートナーとのＣ末端融合物としてコードされ得る。本発明では、タグは例えば上記のポリファージの単離に用いることができる。これゆえ、ファージに結合している結合性物質およびその相互作用性結合パートナー間の相互作用はファージ粒子ならびにスクリーニングおよび選択タグ間の連結を確立する。この特徴は相互作用する分子を保有するポリファージを単離するために例えばアフィニティークロマトグラフィーによる工程において利用される。最終工程では、２つの異なる核酸分子、好ましくは遺伝子（結合性物質および結合パートナーをコードする遺伝子）を保有するポリファージをこの２つの遺伝子のうち１つだけを保有するポリファージから、形質導入または個々のゲノムに存在する異なる選択マーカー（例えば抗生物質耐性）に基づく選択によって分離することができる。このようにして、２つの相互作用性分子をコードする遺伝子を同定することができる。本発明の最も好ましい態様は、このスクリーニングまたは選択タグが工程(b)/ (ab)または(c)/(ac)の組換えベクターによってコードされている方法に関する。本発明のさらに最も好ましい態様は、スクリーニングまたは選択タグがHis(n) 、myc、FLAG、malE、チオレドキシン、GST、ストレプトアビジン、ベータ -ガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼT7gene10、Strep-ダグおよびカルモジュリンのリストから選択される方法に関する。これらのスクリーニングタグは当分野に周知であり、当業者は完全に利用可能である。本発明の方法のさらに特に好ましい態様では、当該スクリーニングおよび選択タグが宿主細胞のゲノムによってコードされる。この態様の例は宿主細胞によって発現され、例えばカラムクロマトグラフィーによる精製において別のの架橋として機能できる抗Fcレセプター特異的抗体である。本態様のもう１つの例は宿主細胞によって産生される酵素であって、この酵素によって起こる修飾がスクリーニングまたは選択タグとなるような、工程(b)/(ab)および(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドの相互作用を崩壊させない第２ライブラリーの（ポリ）ペプチドのリン酸化のようなタグを生成させる酵素である。本発明の方法のさらに好ましい態様では、工程(c)/(ac)の追加ライブラリーの核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドが工程(a)/(aa)および(b)/(ab) の（ポリ）ペプチドの少なくとも１つのリン酸化、グリコシル化、メチル化、脂質化またはファルネシル化によって工程(a)/(aa)および(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドの相互作用を引き起こす。本発明のさらに好ましい態様は工程(d)/(a)の宿主細胞が空間的にアドレス可能であり、工程(g)/(a)に記載の核酸配列が対応する空間的アドレス可能宿主細胞から回収できる方法に関する。本発明の本文中において、用語「空間的アドレス可能」は第１、第２および任意に追加ライブラリーメンバーの潜在的組み合わせの１つを担持する個々の細胞がその相対的位置によって、例えば親プレート上のそれらの位置によって同定できる状況を意味する。例えばスクリーニングおよび選択を親プレートから誘導された単一のコロニーか、レプリカプレート上の単一のコロニーかどちらかについて行い、そうしてスクリーニング可能または選択可能な性質と親プレート上の宿主細胞中に含まれる情報との間の結びつきを維持することができる。本発明のさらに好ましい態様は当該スクリーニング可能または選択可能な性質を細胞内において発現させる方法に関する。特に好ましいのは、スクリーニング可能な性質がベーターガラクトシダーゼ、アルカリホスファターゼまたはhis3およびleuのような栄養マーカーまたはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性を与える耐性遺伝子などのレポーター遺伝子の転写のトランス活性化である方法である。さらには、上記本明細書中にて言及した酵母2-ハイブリッドシステムもしくは相互作用トラップシステム（Brentら、EP-A0672 131）またはビブリオコレラのt oxRシステムを利用する上記引用システムに類似する原核生物バージョンシステム（Fritz,H.-J．ら、EP-A 0 630 968）を使用できる。さらに当分野に既知のスクリーニングシステムを本発明の方法と組み合わせることは当業者の技術の範囲内にある。本発明のさらに好ましい方法では、工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および(c)/(ac)の組換えベクターは組換え促進部位を含み、工程(e)/(b)では組換えイベントを選択し、ここでは工程(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列、工程(b )/(ab)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列および任意の工程(c)/(ac)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列はこの同じベクターに含有される。このアプローチでは、ライブラリー１および２を保有するベクター中に適当な組換え部位を組み込む場合には、２つの遺伝子は単一のベクター中にてカップリングさせ、標準サイズのファージ中にパッケージングさせることができる。両方の核酸配列および遺伝子を保有するファージは例えばスクリーニングタグを利用して再び精製することができる。組換えを利用して２つのライブラリー由来の遺伝子をカップリングする場合、部位特異的組換えはあまり効率的でないため、いくつかのハイブリッド後代ファージは非組換えゲノムを含むことがあろう。しかし、ハイブリッドファージは、ライブラリー２を含まない宿主細胞の再感染、続くもう一度のスクリーニングタグによって選択できる。本発明の方法の特に好ましい態様では、当該組換えイベントは部位特異的組換え機構Cre-lox、attP-attB、Mu ginまたは酵母flpによって媒介される。本発明の方法の特に好ましい態様では、当該組換え促進部位は制限酵素認識部位であり、当該組換えイベントは工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および任意に(c)/(ac) に記載の組換えベクター分子の少なくとも２つの異なる制限酵素を用いる切断および当該ベクターに含まれる核酸配列の連結による組換えによって達成される。本発明は別の好ましい態様としてPCRによる選択工程(e)/(b)後に当該核酸配列の同定を行い、および好ましくは当該PCR後に当該核酸配列の配列決定を行う方法に関する。当該選択工程(e)/(b)後、PCRは都合よく組換えベクター分子のベクター部分にハイブリダイズするプライマーを用い、豊富な所望の産物を伴って行うことができる。次いでPCR産物の配列決定は常法により行うことができる。本発明に記載の方法のさらに好ましい態様では、工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および/または(c)/(ac)の組換えベクターは選択マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む。当該選択マーカーをコードする遺伝子は工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および/または(c)/(ac)のそれぞれにおいて異なっている、すなわち当該ベクターは異なる選択マーカーをコードする遺伝子を含むのが好ましい。当該選択マーカーは都合よく工程(f)/(c)においてもくろまれるさらなる精製用に用いることができる。例えば、ライブラリー１および２それぞれの２つのメンバーを含むポリファージは、抗生物質に対する二重耐性に基づいて選択することができる。また成功した組換えイベントはライブラリー１および２由来の核酸分子の両方および異なる選択マーカーをコードする遺伝子を保有する新たな組換えベクターを生む。再び、二重耐性選択が所望産物を同定する助けとなろう。当該方法の特に好ましい態様においては、当該選択マーカーは抗生物質、好ましくはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンに対する耐性である。本発明のさらに好ましい態様は宿主細胞がF'および好ましくは大腸菌XL-1ブルー、K91もしくはその誘導体、TG1、XL1kanまたはTOP10Fである方法に関する。本発明の特に好ましい態様において、当該RGPはR408、M13k07およびVCSM13、M 13de13、fCA55ならびにfKN16またはその誘導体のリストから選択されるヘルパーファージを用いて生産する。さらに好ましいのは、その方法中で少なくとも１つの当該遺伝的に異なる核酸配列が免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードするような方法である。当該方法は当該遺伝的に異なる核酸配列が免疫グロブリンの重または軽鎖のレパートリーをコードするものであれば特に好ましい。本発明の別の好ましい態様においては、当該方法中で当該遺伝的に異なる核酸配列を突然変異法によって生産する。種々の突然変異法は当業者に周知であり、さらに詳細には本明細書中に記載する必要はない。本発明は別の好ましい態様においては、その方法中で当該遺伝的に異なる核酸配列がcDNAライブラリーから生産されるような方法に関する。本発明の方法の最後の好ましい態様において、当該核酸配列は遺伝子またはその一部である。本明細書中に用いている、用語「その一部」は他のライブラリーによってコードされるいくつかの産物と相互作用することができる産物をコードする遺伝子の一部に関する。種々のタンパク質は異なるドメインから構成されることは周知である。当該ドメインの１つだけが、異なる（ポリ）ペプチドと相互作用できる場合がある。本発明によれば、そのようなドメインは当該遺伝子の一部がコードしていることがあり得る。また本発明は２以上の相互作用性ペプチドまたはタンパク質をコードする遺伝子の同定を提供している。これは上記の方法の拡大により、遺伝的に異なる別の核酸をコードする別のベクターを用いることによって行うことができる。前記のように、スクリーニングタグまたは感染性タンパク質のどちらかの存在を用い、複合体の構成成分をコードする遺伝子を保有するファージを精製する。次いで再び、ファージ中のこの遺伝子の配列を当業者に周知の方法論によって決定することができる。加えて、本発明は少なくとも (a)工程(a)/(aa)に記載の組換えベクター分子または相当するベクター分子； (b)工程(b)/(ab)に記載の組換えベクター分子または相当するベクター分子；および任意に (c)工程(c)/(ac)に記載の少なくとも１つのさらなる組換えベクター分子または相当するベクター分子を含むキットに関する。一般に、組換えベクター分子が上記キットに含まれる場合、これは核酸分子のライブラリーを含む。言い換えれば、本発明のキットは種々の組換えベクター分子の集合体を含む。図および表の説明図１：ポリファージ原理の概説図２：２つのファージミドの共形質導入、ポリファージ形成およびHis-タグによる選択：概説 A、B：好ましくは異なる耐性マーカーをもつファージミドのライブラリー； A：gIIIpへの融合物；B：タグ(His)への融合物；共形質導入後、同族ペアを表示する（図の左側）あるいは表示しない（右側）ファージ集合を導くファージ産生、宿主細胞の選択感染後、二重耐性による選択別方法では、プラスミドまたはファージミドに基づくライブラリーBを担持する細胞をファージライブラリーAで感染させる（再必要条件：抑制-耐性構築体）。図３：pBSベクター群：pBS13の機能地図および配列図４：ファージミドの共存在：制限消化の結果二重耐性(Amp/Cm)クローンの制限分析。R1：pIG10.3、Xba/ScaＩ；R2：pBS13、X ba/ScaＩ；R1+R2：R1およびR2をおよそ等しい割合で混合する；M1：マーカーλ ：BstEII；M2：マーカーpBR322：MspＩ；１から10：ランダムにピックアップしたクローン：Xba/ScaＩ図５：ファージミドベクターpYING1-C1：機能地図 fosペプチド含有。対応するベクターpYING1-C2およびpYING1-C3はfosのかわりにそれぞれp75およびIL16ペプチドを含む。図６：ファージミドベクターpYANG3-A：機能地図 junペプチド含有。対応するベクターpYANG3-Ape2、pYANG3-Ape3およびpYANG3-Ap e10はjunのかわりにそれぞれp75結合性ペプチドpe2、pe3およびpe10を含む。図７：選択クローンの分析（表２参照)： 7.a：選択前および後のクローンの制限消化 R：pYANG3-Ape2：XbaＩ;M1：マーカーλ：BstEII；M2：マーカーpBR322：Msp Ｉ；α/1から10：選択前にランダムにピックアップしたクローン：XbaＩ/Hind III；β/1から10：選択後にランダムにピックアップしたクローン：XbaＩ/Hind III；予想サイズ：jun-gIII：745bp；fos：256bp；p75：577bp；IL-16：502bp 7.b：選択後のクローンのプライマーOPEP5LおよびOGIII3を用いるPCR反応 R1：鋳型としてのpYANG3-A；R2：鋳型としてのpYANG3-Ape2；M：マーカーλ： BstEII；β/1から10：選択後にランダムにピックアップした鋳型としてのクローン図８：ファージミドベクターpING1-C1：機能地図 Hisタグペプチド含有。対応するベクターpING3-C1はさらにFLAGエピトープを含み；pING1-C2およびpING3-C2はHisタグのかわりにStrepタグを含み、 pING3-C2はさらにFLAGエピトープを含む。図９：ファージミドベクターpONG3-A:機能地図ファージディスプレイライブラリー（gIII融合体）の作成用図10：ファージおよびプラスミドの共形質導入、ポリファージ形成およびSIPによる選択：概説 fA：ファージ構築体におけるライブラリーA;B：ライブラリーB、IMPと融合しているライブラリーメンバー；好ましくはファージおよびプラスミド上に異なる耐性マーカー；共形質導入後のファージ生産；同族ペア相互作用の場合における感染性ファージの形成；選択；二重耐性のプレートにまくことによるポリファージ粒子の同定。図11：ファージベクターfhag1A：機能地図 α-HAG scFvのファージディスプレイ用図11a：CAT遺伝子モジュール：機能地図および配列図12：ファージベクターfjun1A：機能地図 junペプチドのファージディスプレイ用図13：ファージベクターfjun1B：機能地図 junペプチドのファージディスプレイ用図14：ファージベクターfpep3_-IB：機能地図 p75の細胞内ドメインに結合するペプチドpe3のファージディスプレイ用図15：ファージベクターfNGF_-1B：機能地図 NGFのファージディスプレイ用図16：プラスミドpUC19/IMPhag：機能地図 HAGペプチドのgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む図17：プラスミドpUC18/IMPp75：機能地図 p75細胞内ドメインのgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む； pUC18/IMPfosはp75細胞内ドメインのかわりにfosペプチドを含む。図18：プラスミドpUC18/IMPIL16：機能地図 IL16のgIIIP（IMP）のＮ末端ドメインへの融合物を含む図19：選択クローンの分析（表３参照）レーン１：マーカーλ：BstEII；レーン２から20：Xba/HindIIIで消化したポリファージ形質導入体クローン＃１から＃19；f.._-lb：消化後のファージベクター断片；pUC18：消化後のプラスミド断片；α-HAG：gIIIcへ融合している抗HAG sc Fvを含む断片；IMP-p75およびIMP-HAG：それぞれp75へ融合しているIMP、および IMP-HAGペプチドを含む断片；PeP3-gIIIs：gIIICへ融合しているpep3を含む断片（s：短型）図20：ファージミドの共形質導入、インビボ組換えおよびHisタグによる選択：概説 A、B：ファージミドライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う；A：g IIIpへの融合物；Ｂ：タグ（His）への融合物；lox/loxPのような組換え促進部位(^*)を含む両構築体；共形質導入および組換え後のファージ生産；Ni-NTAによる選択；宿主細胞への再感染、二重耐性による選択図21：インビトロ組換えおよびHisタグによる選択：概説 A、B：ファージミドのライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う； A：gIIIpへの融合物；B：タグ（His）への融合物；制限酵素（+/o）に対応する認識部位を含む両構築体；消化および共ライゲーション後の形質導入およびファージ生産；Ni-NTAによる選択；宿主細胞への再感染、二重耐性による選択図22：ファージベクターfjunhag：junペプチドのファージディスプレイ用機能地図図23：空間的インビボSIP：概説上記方法のいずれかに記載の形質導入または共形質導入後、マスタープレートを作成する。これより、個々のクローンから分泌されたファージは個々に分析でき（上）、あるいはレプリカ（フィルター盤を通す分泌ファージの移動物）はその上でタグの存在または感染性の選択を行うことができるように作成できる。マスタープレートにもどることによって、組換えおよび/またはポリファージ生産を必要とせずに選択された同族の相互作用ペアの情報を回収することができる。図24：大腸菌ディスプレイ：概説 A、B：ファージミドのライブラリー；好ましくは異なる耐性マーカーを伴う；Ａ：大腸菌表面ディスプレイタンパク質への融合物；B：タグ（His）への融合物；共形質導入後の構築体の発現；表面ディスプレイ；同族相互作用が起こった場合における宿主細胞表面のタグのディスプレイ；選択図25：pTERMsc2H10myc3sCAM：機能地図および配列表１：実験２および３用に構築したファージミド表２：実験２の結果（図７参照） 2.a：最初のライブラリーに存在するファージミドの組み合わせ（α） 2.b：選択後に存在するファージミドの組み合わせ（β）表３：実験４の結果（図19参照） 3.a：個々のクローンに存在するファージ／プラスミドの同定 3.b:個々のクローンの感染性についての試験以下の実施例は本発明を例示する。実施例１：ポリファージ原理の概説（図１）ライブラリー１を構成する結合性物質はペプチドまたはタンパク質であってよく、遺伝的に異なるの第１核酸配列の集団によってコードされる。複製可能遺伝的パッケージの表面にこのコードされる結合性物質を表示させる第１ベクター中へこれらの核酸配列を挿入する。これに続く選択のため、第１ベクターは抗生物質耐性のような選択マーカーをコードする遺伝子も保有するべきである。ライブラリー２を構成する結合パートナーはペプチドまたはタンパク質であってよく、第２ベクターに挿入される遺伝的に異なる第２核酸配列の集団によってコードされ得る。例として、この第２ベクターはプラスミドであってよく、あるいはファージまたはファージミドでもよいが、この場合には複製起点が第１ベクターのものと異なっているべきである。これに続く選択のため、第２ベクターは抗生物質耐性のような選択可能マーカーをコードする遺伝子であって、好ましくは第１ベクターに存在するものと異なるものも保有しているべきである。結合性物質-結合パートナーペア間で形成される複合体の精製を容易にするため、ライブラリー２のメンバーにスクリーニングタグを連結するのが都合よい場合がある。次いで２つの遺伝的に異なる核酸集団を、コードされるライブラリー１および２が発現できるように宿主細胞集団に導入する。これは（ｉ）２つのベクターを共形質導入する、すなわち実際に図に示されているようにするか、（ii）相補的核酸集団が導入された細胞集団を高い効率で感染させるために用いることができるベクター（例えばバクテリオファージ）へ核酸集団の１つをパッケージングさせること、のいずれかによって達成できる。この結果、その細胞集団において個々の細胞がそれぞれのライブラリーの代表を保有する細胞集団となる。２つの核酸集団を発現させると、それぞれがそれぞれのライブラリー由来の分子である分子のペアが生産される。それぞれの場合において結合性物質ライブラリーの１つまたはそれ以上のメンバーをRGPの外殻中にパッケージングさせる。いくつかの細胞においては、RGP表面の結合パートナーおよびライブラリー２から発現される結合パートナー間に相互作用が確立するであろう。したがってそのような相互作用が確立した場合、RGPは結合性物質および結合パートナーの両方を保有する。次いで本明細書中、前述ようにポリファージおよび種々の選択マーカーを用い、そのような相互作用を表示するRGPをさらに精製することができる。そのような選択後、１つまたは両方の結合パートナーをコードする核酸配列をDNA配列決定のような当分野に既知の方法論によって都合よく同定することができる。実施例２：同じ大腸菌複製起点をもつファージミドの共形質導入、ポリファージ形成およびHisタグによる正しいペア形成相互作用の選択 2.1：原理（図２参照）ポリファージ形成により、タンパク質ペアの１つのメンバーに融合させたタグを用いて選択される同族タンパク質ペアの遺伝情報が回収可能となることを示すため、ファージミドベクターにおいて２つの別個の小ライブラリーを構築する。 2.2：同じ大腸菌複製起点をもつファージミドの共形質導入試験２つの異なるファージミドを含むポリファージ粒子形成に必要な条件は、異なるファージミドベクターが宿主細胞中に共存できることである。ベクターpBS13はカナマイシン耐性遺伝子のかわりにクロラムフェニコール耐性遺伝子、2H10-gIII融合遺伝子のかわりにβラクタマーゼ遺伝子カセットを含むベクター（Krebberら、1996）の誘導体であり、pto2H10a3sから出発する標準的方法によって組み立てることができる。図３は機能地図およびpBS13配列を含む。pIGHAG1A（実施例4.2.1.f参照）はXbaＩおよびHindIIIによって消化可能である。繊維状ファージｐIIIタンパク質のＣ末端ドメインを融合している抗HAG遺伝子を含むこの1.3kb断片を単離し、前もって消化しておいたファージミドベクターpIG10.3、およびpBS13（XbaＩ-HindIII）と連結し、それぞれベクター pIG10.3-scFv（抗HAG）（Ap^R）およびpBS13-scFv（抗HAG）（Cm^R）を構築する。このベクターを用いてコンピテントXL-1ブルー細胞を形質転換し、Amp/Cm/Tetおよびグルコース（20mM）を含むLBプレート上にて選択する。二重耐性コロニー（Amp/Cm）のクローン由来のファージミドを単離する。制限消化は単一のコロニーから両方のファージミドが共単離されることを示す（図 4）。 2.3：ライブラリーAおよびBの設計ライブラリーAはそれぞれ低アフィニティー神経成長因子（NGF）レセプター（実施例４参照）の細胞内ドメインに結合した３つの環状ペプチドおよびjun転写因子由来ロイシンジッパードメインを含み、これらはすべて繊維状ファージ由来ｇIIIのＣ末端にそのＮ末端を介して融合している。ライブラリーＢはロイシンジッパードメインを介してjunとヘテロニ量体を形成しているfos転写因子のロイシンジッパードメイン、NGFレセプターp75の細胞内ドメイン、およびライブラリーAのメンバーと相互作用しないネガティブコントロールとしてのIL-16の３つのメンバーをコードし、これらすべてはタグとしてのHis₆ペプチドとそのＮ末端で融合している（Hochuliら、1988；Lindnerら、 1992）。同族ペア形成はjunおよびfos（CrameriおよびSuter、1993）ならびにp75および選択される環状ペプチド（実施例４参照）間の相互作用から生じる。非同族ペア形成は記載の非同族ペア間ならびにjunまたは環状ペプチドの１つおよびIL-16 間に起こるであろう。 2.4：個々の構築体のPCR増幅 pOKl（Gramatikoffら、1994）を鋳型として、OFOS-5およびOFOS-3をプライマーとして用い、Ｎ末端がHis₆に融合しているFosをPCR増幅した。ここにHis₆はOF OS-5プライマー中にコードされる。pOK1を鋳型として、オリゴヌクレオチドOJUN -5およびOJUN-3をプライマーとして用い、junをPCR増幅した：ホットスタート法を用いる。段階的タッチダウンPCRを適用する：92℃、１分間；58-52℃、ΔT=2℃、１分間；72℃、１分間。これをその後26サイクル（92℃、１分間；52℃、１分間；72℃、１分間）続ける。 PCR産物をQIAquickキット（Qiagen）を用いて精製し、ddH₂O中に溶出させる。次いで一晩これらをEcoRIおよびEcoRVで消化する。またpUC18-IMPp75（実施例４参照）を鋳型として、オリゴヌクレオチドOP75-5 （ここにHis₆がコードされている）およびOP75-3をプライマーとして用いてp75 断片をPCR増幅する：上記と同じPCRおよび制限消化条件を適用する。 OIL16-5（ここにHis₆がコードされている）およびOIL16-3をプライマーとして用いてcDNAクローンであるpcDNA3-ILHu1（M.Baier,Paul Ehrlich Institute,Germany；Baierら、1995；Bannertら、1996）からIL-16断片を増幅する：上記と同じPCRおよび制限消化条件を適用する。すべての場合においてこれらの断片は容易に増幅され、消化される。 2.5：中間体ベクター中へのクローニング消化したPCR断片をゲル精製（QIAquickキット、Qiagen）し、TE緩衝液中へ溶出させる。またpIG1ベクター（Geら、1995）のEcoRV/EcoRI断片も単離する。fos 、p75およびIL-16消化PCR断片はベクター断片に連結し、この連結ベクターをTG1 細胞中へ形質導入する。 pIG1ベクター中の構築体はこの構築体にインフレームで融合しているOmpAシグナル配列を含む。配列決定によって正しいクローンをスクリーニングし、確認する。これらは次いでXbaI/HindIII消化し、断片を単離する。 2.6：発現ベクター中へのクローニング 2.3より単離した断片をXbaI/HindIIIで切断したpBS13中へ挿入した結果、ベクターpYING1-C1(Fos),pYING1-C2(p75)、pYING1-C3（IL-16）となる(図５参照)。 EcoRV/EcoRIを用いてjunを含む断片をpIG10.3ベクター中へクローニングした結果、pYANG3-Aとなる（図６参照）。XbaI/HindIIIを用いて抗p75ペプチドpe2、pe 3およびpe10（実施例４参照）をpIG10.3中へクローニングした結果、それぞれベクターpYANG3-Ape2、-Ape3、-Ape10（図６参照）となる。 2.7：Hisタグを用いる正しいペア形成の選択 pYANG3-A+pYING1-C1またはpYANG3-A+pYING1-C2またはpYANG3-A+pYING1-C3または（pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10）+pYING1-C1または（pYANG3-Ape2、-Ape3 および-Ape10）+pYING1-C2または（pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10）+pYING1- C3の組み合わせでTG1細胞を形質転換し、これによりすべての可能な組み合わせを作り出し、選択実験においてこれら各々を確実に存在させる。形質転換細胞をアンピシリン/クロラムフェニコール含有LB寒天プレートにまき、二重耐性（Ap^R /Cm^R）をもつコロニーを選択する。このコロニーをプレートからかきとり、2xYT 培地（Amp/Cm）に植え付け、37℃で３時間振とうする。培養物を30℃で１時間誘導（1mM IPTG）し、37℃で30分間R408（Stratagene）で感染させる。培養物を室温で３時間振とうし、カナマイシンを加え、振とうを室温で一晩継続する。一晩培養物からファージ粒子を回収し、混合し、PEG沈殿させる。ファージを固定Ni-NTA（Ni-NTA HisSorb Strips、Qiagen）上で直接選択する。溶出したファージを用いてTG1細胞を感染させ、これをアンピシリン/クロラムフェニコール含有LB寒天プレートにまき、二重耐性（Ap^R/Cm^R）をもつコロニーを選択する。選択されたコロニーのファージミドを単離し、制限消化によって分析し（図7. a参照）、PCRスクリーニング用の鋳型として用いる。プライマーOPEP5Lを用いて pYANG3-Ape2、-Ape3および-Ape10構築体を特異的に増幅する（図7.b参照）。OPE P5L ５'-GACTACAAAGATGTCGACTG 正しいペア形成の構築体が特異的に豊富であった（表２）。実施例３：大腸菌ゲノムDNAライブラリーの相互作用スクリーニング（ポリファージ/タグシステム） 3.1：原理（図２参照）実施例２の２つのモデルライブラリーを用いるかわりに、大腸菌のゲノムDNA ライブラリーを調製し、自身に対してスクリーニングし、相互作用する大腸菌ペプチドまたはタンパク質を同定する。 3.2：ゲノムDNA用表示および発現ベクターの構築オリゴヌクレオチドカセットまたはPCRによってHisタグ、Strepタグ（Schmidt およびSkerra、1994）またはｇIIIのＣ末端ドメイン（gIIIc）いずれかの前に挿入された平滑末端制限部位SmaIを有する発現ベクターを構築する。自己相補的オリゴヌクレオチドOHIS5＆OHIS3およびOSTREP5＆OSTREP3を用いてそれぞれHisタグおよびStrepタグをコードするカセットを作成する：これらのカセットをリン酸化し、アニーリングしてEcoRIおよびHindIII部位を再構築する。これらのカセットを同じ制限酵素で切断したpIG1およびpIG3ベクター（Geら、1995）中へ挿入する。得られたベクターはそれぞれpING1-A1、pING3- A1（pIG1およびpIG3ベクター中のHisタグ用）、pING1-A2および pING3-A2（Strepタグ用）である。正しいベクターをXmaI部位（SmaIのアイソシゾマー）の存在に対してスクリーニングし、配列決定によってこれらの構築体を確認する。これらのベクターのXbaI/HindIII断片をpBS13ベクター中へ挿入し、同じ酵素で線状化した結果、それぞれベクターpING1-Cl、pING3-Cl、およびpING 1-C2、pING3-C2となる（図８参照）。 pIG10.3ベクターをPCR増幅するに当たり、プライマーOGIII5およびベクター中のgeneIIIの3'にアニーリングするOGIII3を用いてSmaI部位を含むgIIIc断片を作成する：ホットスタート：92℃、１分間；46℃、１分間；72℃、1.5分間でPCRを３回行う。続いて、92℃、１分間；50℃、１分間；72℃、1.5分間を30回行う。PCR産物を精製（QIAquick）し、EcoRIおよびHindIIIで消化する。この断片をゲル精製（ QIAquick）し、pIG10.3中へ連結する。得られたベクターpONG3-A（図８参照）の配列は制限分析および配列決定によって確認する。 3.2：Hisタグを用いる大腸菌ゲノムDNA由来の相互作用性ペアの選択大腸菌株XL-１ブルー（Stratagene）のゲノムDNAをブラッド＆セルカルチャー DNAマキシキット（Qiagen）を用いて単離し、TE緩衝液（pH8.0）中に溶出させる。このDNA 200μgをとり、超音波破砕（50回、270mA、0.5秒／ストローク）する。断片化DNA（平均サイズ：最大0.7kB）をT4 DNAポリメラーゼでの充填反応（ギャップをうめる）反応によって平滑末端化する。ベクターpING1-C1およびpONG3-AをEcoRVおよびSmaＩで消化し、これらのベクター断片をゲル精製（Qiagen）する。次いでこれらのベクター断片を16℃で一晩、平滑末端ゲノムDNAと連結する。得られた連結混合物でTG1細胞を形質転換する。 pING1-C1およびpONG3-A形質転換体をプレートからかきとり、それぞれCm/グルコースまたはAmp/グルコースを含有する2xYT培地に植え付ける。pING1-C1培養物をヘルパーファージ（VCSM13またはM13k07）で感染させ、ファージ粒子を単離する。これらのファージ粒子を用いてpONG3-Aを含む対数期細胞を感染させる。得られた培養物を大きなAmp/Cm/グルコースプレート上にまく。コロニーを上記プレート表面からかきとり、Amp/Cmを含有する2xYT培地に移す。37℃で30分間振とうした後、この培養物を30分間誘導（1mM IPTG）し、室温で一晩振とうする。ファージ粒子を一晩培養物から採取し、PEG沈殿させる。これらを固定Ni-NTA （NI-NTA HisSorb Strips、Qiagen）上で選択する。溶出ファージを用いて対数期TG1細胞を感染させる。選択されたタンパク質ペアを対応するDNA配列の決定によって特性化する。実施例４：ポリファージ、およびSIPを用いる正しいペア形成相互作用の選択 4.1：原理（図10参照）この実験の目的は、SIP（選択感染ファージ：Krebberら、1995；この実験セクションに用いている用語「IMP」は繊維状ファージのgeneIIIタンパク質のＮ末端ドメインを含む「感染性媒介粒子」を意味する）選択システムを用いて２つのライブラリーの組み合わせから正しい相互作用性ペアが単離同定でき、ポリファージ粒子の形成および選択によって相互作用性パートナー両方についての情報を回収できることを示すことである。対応するライブラリーのメンバーと相互作用性するペアを形成するライブラリーメンバーは、対応するライブラリーのメンバーと相互作用しないライブラリーメンバーと「混ざる（doped）」ことがあり、ポジティブSIP選択を与えるべきでない。 4.2：ベクター構築 4.2.1：fhag1A（図11参照） a.ファージベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoRVおよびXmnIで消化する。抗HAG Ab遺伝子を含む1.1Kb断片をアガロースゲル電気泳動によって単離し、Qiagenゲル抽出キットを用いて精製する。この断片を前もって消化しておいた pIG10.3ベクター（EcoRV-XmnI）に連結する。連結したDNAをDH5α中へ形質導入し、ポジティブクローンを制限分析で確認する。この組換えクローンをpIGhag1A と称する。上記および以下に記載のすべてのクローニングは標準的手法（Sambro okら、1989）にしたがう。 b.ベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoRVおよびStuIで消化する。 7.9kbの断片を単離し、自己連結させてベクターfhag2を形成させる。 c.鋳型pACYC（CardosoおよびSchwarz、1992）を用いるアセンブリーPCR（GeおよびRudolph、1997）によって組み立てたクロラムフェニコール耐性遺伝子（CAT）（図11aはCAT遺伝子の機能地図および配列を示す）をプライマー：を用いるポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって増幅する。 d.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はBspEIおよびBsu36Iで消化した後、前もって消化しておいたfhag2ベクター（BspEI-Bsu36 I；7.2kb断片）に連結し、fhag2Cを形成させる。 e.ベクターfhag2CをEcoRIで消化し、クレノー断片で充填することによって末端を平滑化する。平滑化ベクターを自己連結させ、ベクターfhag2CdelEcoRIを形成させる。 f.pIGHAG1AをXbaIおよびHindIIIで消化する。繊維状ファージｐIIIタンパク質のＣ末端ドメインに融合した抗HAG遺伝子を含む1.3kb断片を単離し、前もって消化しておいたfhag2CdelEcoRIファージベクター（XbaI-HindIII；6.4kb）と連結し、ベクターfhag1Aを作成する。 4.2.2：fjun1A（図12参照） a.プライマー：を用いるオリゴヌクレオチドサイトダイレクト突然変異（Sambrookら、1989）によってpIG10.3のEcoRV部位をSalI部位に変換する。突然変異pIG10.3をpIG10.3SalIと称する。 b.pOK1（Grammatikoffら、1994）由来junロイシンジッパードメインをプライマー：を用いるPCRによって増幅する。 b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はSalIおよびEcoRIで消化した後、前もって消化しておいたpIG10.3SalIベクター（SalI-E coRI）に連結し、ベクターjun-pIG10.3SalIを形成する。 d.ベクターjun-pIG10.3SalIをXbaIおよびEcoRIで消化する。0.14kb断片を前もって消化しておいたベクターfhag1A（XbaI-EcoRI；7kb）に連結し、ベクターfjun1 Aを形成する。 4.2.3：fjun1B（図13参照） a.繊維状ファージｐIII（短ｇIII）のアミノ末端ドメインからＣ末端ドメインを分離する長いリンカーを含むＣ末端ドメインをコードするDNAをプライマー：を用い、pOK1（Grammatikoffら、1994）を鋳型として用いて増幅する。 b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はEcoRIおよびHindIIIで消化した後、前もって消化しておいたfhag1Aベクター（EcoRI-Hin dIII）に連結し、ベクターfjun1Bを形成する。 4.2.4：fpep2_-1b）fpep3_-1B、fpep10_-1b（図14参照） a.これらの構築物は、SIP実験におけるp75の細胞内ドメインである、NGF低アフィニティーレセプターに対してスクリーニングされたペプチドライブラリーから得られる。 b.6-16アミノ酸の長さ変異体をもつ環状ペプチドのペプチドライブラリーカセットをオリゴ：［ここにＭはcysをコードするコドンを除く19トリヌクレオチドコドンの混合から調製する。長さの変異は、標準カップリング手法を用いる６トリヌクレオチド位置のカップリング、それに続く10カップリングサイクルにおけるDNA合成の間のキャッピング工程を省略し、そしてトリヌクレオチド混合物を希釈して50％のカップリング収率を段階的に達成することにより行われる。上記オリゴをアニーリングし、DNAポリメラーゼＩのクレノー断片で充填し、標準的方法（Sambrookら、1989）を用いて二本鎖DNAカセットを形成する。このカセットをSalI-EcoRIで消化し、Qiaex DNAゲル抽出キットで精製し、前もって消化しておいたfjun1Bベクター（Sal I-EcoR I）に連結し、ペプチドライブラリーを形成する。連結ペプチドライブラリーをpUC18/IMP-p75（以下参照）を宿すコンピテントDH5α細胞中に形質導入し、ルリアブロス（LB）（30μg/ml クロラムフェニコール+l00μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 c.Amp^R Cm^RロニーをLBとともにかきとり、この懸濁液1mlをLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン＋1mM IPTG）25mlに植え付ける。この培養物を一晩室温でインキュベートする。 d.この上清を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって細胞から分離する。30％ PEG/3M NaCl 5mlをこの上清に加え、100回混合する。氷上で１時間後ファージ沈殿物を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって集める。ペレットをTBS緩衝液1 ml中へ再懸濁する。この懸濁物を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）を用いてろ過する。 e.ファージ上清10μlを用いて対数期K91細胞（またはいずれかの雄性大腸菌細胞（Ｆ線毛含有））100μｌを感染させ、LB（30μg/mlクロラムフェニコール）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 f.クロラムフェニコール耐性形質導入体をとり、一晩培養物を調製して、配列決定用DNAを単離する。配列決定によりペプチドpe2、pe3およびpe10を含む fpep2_-1b、fpep3_-1B、fpep10_-1bを同定する。 4.2.5：fNGF1B（図15参照） a.神経成長因子（NGFI）遺伝子をコードするDNAをプライマー：を用い、pXM NGF（Ibanezら、1992）を鋳型として増幅する。 b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はSal IおよびEcoRIで消化した後、前もって消化しておいたfjun1Bベクター (Sal I-EcoR I）に連結し、ベクターfNGF1Bを形成する。 4.2.6：pUC19/IMP-HAG（図16参照） a.ベクターf17/9-hag（Krebberら、1995）をEcoIおよびHindIIIで消化する。 HAGペプチドとIMPの融合遺伝子を含む1.4kb断片を単離し、前もって消化しておいたpUC19（EcoR I-Hind III）中へクローニングし、ベクターpUC19/IMP- HAGを形成する。 4.2.7：pUC18/IMP-p75（図17参照） a.C末端の142アミノ酸を含むp75の細胞内ドメインをプライマーを用い、p75のcDNAクローン（Chaoら、1986）を鋳型として増幅する。 b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物はBsiW I およびHind IIIで消化した後、前もって消化しておいたpUC19ベクター（BsiW I- Hind III）に連結し、ベクターpUC19/IMP-p75を形成する。 c.ベクターpUC19/IMP-p75をXbal IおよびHind IIIで消化する。この1kb断片を単離し、前もって消化しておいたpUC18ベクター（Xbal I-Hind III）中へクローニングし、ベクターpUC18/IMP-p75を形成する。 4.2.8：pUC18/IMP-IL16（図18参照） a.IL16遺伝子をプライマーを用い、クローンpcDNA3-ILHu1（M.Baier、Paul Ehrlich Institute） Germany；Baierら、1995；Bannertら、1996）を鋳型として増幅する。 b.標準的手法（Sambrookら、1989）に引き続いてPCRを行う。増幅産物は Bsu36 ＩおよびHind IIIで消化した後、前もって消化しておいたpUC18/IMP-p75ベクター（Bsu36I-Hind III）中へ連結し、ベクターpUC18/IMP-IL16を形成する。 4.3：共形質導入およびポリファージを用いるインビボSIP 4.3.１：２ライブラリーの組み合わせ（ライブラリー１をｇIIIに融合させ、一方ライブラリー２をIMPに融合させる） a.fjun1B、fjun1A、fpep3_-1B、fhag1A、fNGF1Bの各10ngをpUC18/IMP-p75、pUC18 /IMP-HAG、pUC18/IMP-IL16の各500ngと共にエレクトロポレーションによってDH5 α細胞中へ共形質導入する。この細胞をルリアブロス（LB）（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 Amp^rCm^rコロニーをLBからかきとり、懸濁物1mlをLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン＋1mM IPTG）25mlに植え付けた後、室温で一晩インキュベートする。 4.3.2：インビボSIP。細胞からの上清を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって分離する。30％PEG/3M NaCl 5mlをこの上清に加え、100回混合する。氷上に１時間後、ファージ沈殿物を遠心（10,000RPM、10分間、4℃）によって集める。このペレットをTBS緩衝液1ml中に再懸濁し、この懸濁物を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）を通してろ過する。ファージ上清200μlを用いて、対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有）のいずれか）1.8mlを感染させ、この細胞をLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 4.3.3:感染性ポリファージのDNAパターンおよび感染性の試験。20の独立したAmp^r Cm^rコロニーをそれぞれLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100pg/mlアンピシリン）5ml中に植え付け、環境温度で一晩インキュベートする。Qiagen Miniprep DNA kitを用いてそれぞれのクローンからプラスミドおよびRF DNAを単離する。製造元によって供給され、指示されるように制限酵素Xba IおよびHindIIIを適当な緩衝液といっしよに用いる制限分析によってクローンを分析する。この制限消化は0.8％TBEアガロースゲル中、100Vの一定電圧で1.5時間行う。制限パターンはバンドの相対的な強さと共に（ファージベクター（fjun1B、fjun 1A、fpep3_-1B、fNGF1B,．fhag1A）はプラスミドベクターより非常に少ないコピー数しかないから）、相互作用性ペアの正確な同定を可能にする。ペアfhag1A+p UC19/IMP-HAGに対し、Xba I-Hind III消化により6.5kb、3.3kb、1.3kbおよび0.7 kb断片が生成し、一方ペアfpep3_-1B+pUC18/IMP-p75に対しては同消化によって6. 3kb、2.8kb、1kbおよび0.7kb断片が生成する。問題はfjun1Bまたはfjun1AのpUC1 8/IMP-p75との潜在的非同族ペアの組み合わせを区別することであるが、これらがfpep3_-1B+pUC18/IMP-p75と類似のパターンを与えるからである。さらにこれを解決するためには、同一のパターンを含むクローンをBamH I-Hind IIIで再消化することができる。fjun1Aまたはfjun1BはpUC18/IMP-p75との組み合わせにおいてただ４つのみの断片-4.1kbおよび2.9kb、2.6kb、1.2kb断片-を生成するが、一方同族ペアfpep3_-1B+pUC18/IMP-p75は５断片-3.5kb、2.9kb、2.6kb、1.2kb、0.5 kbを生成するであろう。さらに同族相互作用性ペアが選択されたことを証明するために、クローンの選択的感染性ファージ粒子形成能力を試験する。同族ペアをもつクローンだけが感染性ファージを形成できる。個々のクローンの一晩培養物からの上清を0.45ミクロンフィルター（Sartorius）でろ過する。ファージ上清1 0μlを対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有）のいずれか）100μl と37℃で10分間混合する。この懸濁物をLB（30pg/mlクロラムフェニコール）プレート上にまき、37℃で一晩インキュベートする。この結果を表3.bに示す。要約すると（図19参照）、上記実施例から得られた結果は分析した19クローン中、8/19が同族ペアfpep3_-1B+pUC18/IMP-p75をもって、選択的感染性ファージを生産し；1/19はfhag1A+pUC19/IMP-HAG組み合わせをもち、選択的感染性ファージを生産することを示している。実施例５：組換えおよびタグ系を用いたスクリーニングによる多ライブラリーの単一ファージミドベクターへの組み込み 5.1：原理（図20参照）パートナーの１つに融合したタグによって選択される同族タンパク質ペアに対する遺伝情報の回収を可能にするために、lox組換え促進部位を含むファージミドベクター中に２つの別個のライブラリーを構築し、それをインビボ組換えにおけるcre組換え酵素の働きによって１つのファージミド上に組換えする。 5.2：ベクター構築 loxPおよびloxP511部位（Hoessら、1986）両方を縦一列にベクターpING1-C1中のCo1E1複製起点およびβラクタマーゼが両端に隣接する領域に挿入するが、ベクターpONG3-AにおいてloxP部位はXba Iの上流に、loxP511はHind III部位の下流にクローニングする。これゆえクローニングされたゲノムDNAの両端にはloxP およびloxP511部位が隣接する。 5.3：ライブラリー構築および組換えライブラリーは実施例３に記載のとおりに調製する。二重耐性クローン中のファージミドを、誘導可能なファージミド中にコードされている（Tsurushitaら、 1996）か、あるいはP1ファージの感染によって転位されてる（Rosner、1972；Wa terhouseら、1993）cre組換え酵素によって組換える。ファージは組換えクローンからヘルパーファージ感染によって調製し、これを用いて新たな大腸菌細胞（ cre^-）を感染させる。 5.4：選択ファージ粒子をCm^rクローンから調製し、実施例２および３に記載のとおりにH isタグ選択に付す。mycタグ領域（ライブラリー1）およびHisタグ領域（ライブラリー2）に特異的なプライマーを用いて配列決定することにより、両方のライブラリーのメンバーを現に含むそれぞれのファージミド中にコードされる配列を決定することができる。実施例６：別個に構築されたライブラリーを１つのファージベクターにインビトロ組換えすることによるSIPに基づくライブラリーvs．ライブラリースクリーニング 6.1：原理（図21参照）インビボのSIP相互作用によって選択される同族タンパク質ペアに対する遺伝情報の回収を可能にするために、ファージおよびプラスミドベクター中の２つの別個のライブラリーを構築し、インビトロ組換えにおける共連結によって組換えする。 6.2：ライブラリーAおよびBの構築ライブラリーAは２つのメンバー、すなわちヘマグルチニンから誘導されるペプチドに対する単鎖Fv抗体（fαhag）およびjun転写因子（fjun）から誘導されるロイシンジッパードメインをコードし、両者ともＮ末端を介して繊維状ファージ由来ｇIIIのＣ末端ドメインに融合し、Flagエピトープが後に続くompAシグナル配列の後に続く。ライブラリーBはpUC類プラスミドベクター上の３つのメンバー、すなわち上記 αhag抗体が結合しているヘマグルチニンペプチド（pUC19-IMPhag）、ロイシンジッパードメインを介してjunとヘテロダイマーを形成するfos転写因子のロイシンジッパードメイン（pUC18-IMPfos）および、ライブラリーAメンバーと相互作用しないネガティブコントロールとしての低アフィニティー神経成長因子の細胞内ドメイン（pUC18-IMPp75）をコードしており、これらすべてはファージgIIIタンパク質の感染性媒介Ｎ末端ドメインに融合し、gIIIシグナル配列に後続する。ライブラリーA挿入部位の下流にgIIIのＮ末端ドメイン（N1-N2）を含み、この後にライブラリーBメンバーのインフレーム挿入を可能とするクローニング部位B siW IおよびHind IIIが続くfdファージベクター中へライブラリーAのメンバーをクローニングする。ライブラリーA構築物fαhagはf17/9-hag fdファージベクター（Krebberら、1995）と同一であり、fjun構築の基礎となる。junロイシンジッパーをgIIIのＣ末端部分の290から326のアミノ酸といっしよに実施例４にて構築する構築体fjun1B（gIIIのアミノ酸290から493に融合しているjunロイシンジッパーを含む）からPCR増幅（プライマーFR620およびFR621、それぞれEcoR IおよびSfi I部位含有）する。得られたPCR断片をEcoRV/SfiIで消化したf17/9-hagベクター中へgIIIC末端ドメインのアミノ酸327から493とインフレームで一定方向に連結し、結果としてベクターfjunhag（図22参照）とする。ライブラリーB構築体pUC19IMPhagおよびpUC18-IMPp75の作成は実施例４に記載されている。pUC18-IMPfosを構築するためにgIIIのＮ末端部分のアミノ酸219から272をfosロイシンジッパーといっしょにpOK1ファージミドベクター（Grammati koffら、1994）からPCR増幅（プライマーFR618およびFR619、それぞれBsiW IおよびHind III部位を含む）する。得られたPCR断片をBsiW I/Hind IIIで消化した pUC18-IMPp75中に一定方向に連結し、pUCl8-IMPfos（図17参照）を作成する。プライマー6.3：ライブラリーAおよびBの調製および組換えならびにSIPによる相互作用性タンパク質ペアの選択 αhag抗体のhagペプチドとの非共有結合的な同族相互作用（Krebberら、1995 ）ならびにfosおよびjunロイシンジッパードメインの非共有結合的同族相互作用（Grammatikoffら、1994）は感染性SIPファージを生み出す。これゆえ、モデルライブラリーAおよびBのメンバーの６つの可能な組み合わせ（fαhag-hag、fαh ag-fos、fαhag-p75、fjun-fos、fjun-hag、fjun-p75）から２つの組み合わせ（同族ペアは太字）だけがインビボSIPによって選択されるはずである。すべての可能な順列におけるライブラリーメンバーの組換えのため、ライブラリーAをBsi W I/Hind IIIで消化することによって線状化し、上記の構築体BプールからBsiW I/Hind IIIで集団切断することによって調製されるライブラリーBメンバーをランダムに包含するように調製する。集団切断ライブラリーB断片をライブラリーA ベクター中へ共連結した後、サンプルをコンピテント大腸菌細胞中へ形質導入し、これをクロラムフェニコール含有LBアガープレート上にまき、37℃で一晩培養する。組換えライブラリーのサイズは形質転換体の連続希釈物をプレートにまくことによって測定でき、それは個々のライブラリーAおよびBの複雑性と比較することができる。総組換えライブラリーをLB培地のプレートからかきとり、1mM IPTGを補充した適当な量のクロラムフェニコール選択LB培地に植え付ける。SIPファージを生産させるため30℃で一晩振とうを続けながら培養した後、細菌を遠心によってペレットにし、氷上で１時間20％PEG/2.5M NaCl 0.25 容量を加えることによって上清中に存在するファージを沈殿させる。このファージを30分間、10,000Xgにて、4℃で遠心することによってペレットとする。このペレットを適当な容量の１×TBS緩衝液中に再懸濁し、0.45μＭフィルターを通してろ過する。このろ液を連続希釈してF⁺大腸菌細胞を感染させるのに用いる。標準方法によって得られた形質導入体コロニーから二本鎖の、複製形態ファージ DNAを調製し、制限消化および配列決定によってライブラリーAおよびBメンバーの存在および同一性について分析する。さらに感染性SIPファージの存在について形質導入体コロニーの上清を分析し、組換えライブラリーAおよびBから選択される特定ペアのタンパク質-タンパク質相互作用がSIPファージ感染性の原因であることを確認する。一方、モデルライブラリーA（２メンバー）およびB（３メンバー）を用いてすべての可能な組み合わせ（上記）を個々に構築し、６つの組み合わせそれぞれの等量（50ng）をコンピテント大腸菌細胞中へ共形質導入し、引き続いて上記工程を行うことができる。共形質導入後の個々の構築体の分配およびモデルライブラリーから得られる形質導入体の分配を上記のように分析することができる。同族タンパク質ペアを共コードするファージ構築体の選択回収により、適当な組換えイベント後の結合パートナーのSIPに基づく選択が実現可能であることを示す。実施例７：「空間的」インビボSIP 7.1：原理（図23参照）相互作用ペプチドまたはタンパク質のメンバーについての情報のカップリングは選択可能またはスクリーニング可能な性質をディスプレイする粒子（この実施例においてSIP実験用ファージ）および個々のライブラリーメンバーに対する遺伝情報を含むパッケージ（この実施例において大腸菌細胞が分泌するスクリーニングされるファージ粒子）間の空間的関係、すなわちマスタープレート上における試験されるファージおよび対応する大腸菌宿主の位置間の相関を有することによって達成される。 7.2：２ライブラリーの混合（ライブラリーAはgIIIと融合し、一方ライブラリー BはIMPと融合する） fjun1B、fjun1A、fpep3_-1B、fhag1A、fNGF1Bのそれぞれ10ngをpUC18/IMP-p75 、pUC19/IMP-HAG、pUC18/IMP-IL16のそれぞれ500ngと共にDH5α細胞中ヘエレクトロポレーションによって共形質導入する。形質転換体をLB（30μg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）プレート上にまき、環境温度で一晩インキュベートする。 7.3：SIPによる共形質転換体のスクリーニング共形質転換体のマスタープレートから、それぞれの共形質転換体をラベルし、 LB（30pg/mlクロラムフェニコール+100μg/mlアンピシリン）5ml中に分離して植え付け、環境温度で一晩インキュベートする。 Qiagen Miniprep DNAキットを用いてそれぞれのクローンからプラスミドおよびRF DNAを単離する。製造元によって供給され、指示されたように制限酵素Xba IおよびHind IIIを適当な緩衝液と共に用いて制限分析することによって、クローンを分析する。この制限消化は0.8％TBEアガロースゲル中、100Vの一定電圧にて１-２時間行う。制限パターンは特定クローンの識別を可能にする。個々のクローンの一晩培養物からの上清を0.45ミクロンフィルター（Sartoriu s）を通してろ過する。ファージ上清10μlを対数期K91細胞（または雄性大腸菌細胞（F線毛含有））100μlと37℃で10分間混合する。この懸濁物をLB（30μg/m lクロラムフェニコール）プレート上にまき、37℃で一晩インキュベートする。ポシティブ共形質転換体（すなわち正しい相互作用ペアを含む）は対応する正しい制限パターンを有し、２次またはそれ以降の感染できない感染性ファージを生産することができる。ポリファージ粒子はそのような感染が可能であり、また相互作用ペアの遺伝情報を含むので、これらの制限消化パターンによって容易に同定することができる。実施例８：大腸菌表示 8.1：原理（図24参照）２つのライブラリーを細胞表面に存在するライブラリーAの発現メンバー（例えば抗体、ペプチドまたはcDNAライブラリー）と共に大腸菌細胞中へ導入する。相互作用ペアが形成される場合、ライブラリーBのメンバー（例えば抗体、ペプチドまたはcDNAライブラリー）もまたその同族パートナーとの複合体において細胞表面に輸送され、これゆえタグのような選択可能またはスクリーニング可能な性質を表示する。選択される細胞は相互作用パートナー両方についての情報を含む。 8.2：ライブラリーAの調製チオレドキシンペプチドライブラリーはpFLITRXベクター中、大腸菌鞭毛への融合物として本質的に記載（Luら、1995）のように調製する。 8.3：ライブラリーBの調製 FLAGエピトープを含む環状、変動可能長のペプチドライブラリー（Hoppら、に調製し、カナマイシン耐性遺伝子のかわりにクロラムフェニコール耐性遺伝子を含むpto2H10a3sベクター（Krebberら、1996）の修正バージョンである、pTERM ベクター中にクローニングする。このpTERMベクターはpto2H10a3sから出発する標準方法によって組み立てることができる。この環状ペプチドライブラリーは標準方法（Sambrookら、1989）によりヘルパーファージ（M13K07またはVCSM13）で感染させることによって包含させる。 8.4：ライブラリーAおよびBの混合ライブラリーAを含む大腸菌細胞をLB（100μg/mlアンピシリン）50mlに植え付け、環境温度でOD600が0.4に達するまでインキュベートする。ライブラリーBを含むファージで10多感染（MOI）によりこの細胞を感染させる。30分の感染後、細胞を遠心（5000RPM、10分間、4℃）によって集め、LB 1ml中に再懸濁する。この懸濁物をM9培地（+1mMMgCl₂、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/ mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）プレート上にまく。 8.5：相互作用ペアの選択 Amp^rCm^rコロニーをM9培地（+1mM MgCl₂、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）からひっかきとり、この懸濁物をM9培地（+1mM MgCl₂、0.5％グルコース、0.2％カザアミノ酸、100μg/mlアンピシリン、30μg/mlクロラムフェニコールを補充）25mlに植え付け、37℃で飽和するまでインキュベートする。選択は本質的に記載（Luら、1995）のように行い、修正は選択に用いる抗体をM1抗FLAG抗体（Kodak）とすることである。個々の豊富なAmp^rCm^rコロニーを単離し、対応する相互作用ペプチドおよび環状ペプチドの配列をDNA配列決定によって決定する。そのコードされるペプチドおよび環状ペプチド同族ペアを形成することを確認するために、それぞれのコロニーを上記選択方法に基づく豊富さについて試験し、これにより１回の選択においてAmp^rCm^rコロニーはM1抗FLAG抗体に結合する。文献： Baierら，1995,Nature 378,563 Bannertら，1996,Nature 381,30 CardosoおよびSchwarz,J.Appl.Bacteriol.72(1992)289-293 CrameriおよびSuter,1993,Gene 137,69-75 Geら，1995,Antibody Engineering,2^nded.,229-266 GeおよびRudolph,Bio Techniques 22(1997)28-29 Gramatikoffら,Nucleic Acids Res.22(1994)5761-5762 Hochuliら,1988,Bio/Technology6,1321-1325 Hoessら,1986,Nucleic Acids Res.14,2287-2300 Hoppら,1988,Bio/Technology6,1204-1210 Ibanezら,1992,Cell 69,329-341 Krebberら,1995,FEBS Letter 377,227-231 Krebberら,1996,Gene 178,71-74 Linderら,1992,Methods:A companion to Methods Enzymol.4,41-56 Luら,1995,Bio/Technology 13,366-372 Rosner,1972,Virology 48,679-689 Sambrookら,1989,Molecular Cloning:a Laboratory Manual,2^nded. SchmidtおよびSkerra,1994,J.Chromatogr.A 676,337-345 Tsurushitaら,1996,Gene 172,59-63 Waterhouseら,Nucleic Acids Res.21,2265-2266 表１：実験２および３用に構築されたファージミド表２：実験２の結果（Figure７参照）表２ａ：最初のライブラリーに存在するファージミドの組み合わせ（α）表２ｂ：選択後に存在するファージミドの組み合わせ（β）表３：実験４の結果（Figure１９参照）表３ａ：個々のクローンに存在するファージ／プラスミドの同定表３ｂ：個々のクローンの感染性についての試験

Claims

【特許請求の範囲】１．核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーを入手し； (b)工程(a)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(a)および(b)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとがともに相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (c)要すれば、工程(a)および／または(b)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーを入手し（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子は工程(a)および(b)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(c)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程(a)および／または(b)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させることができる）； (d)工程(a)、(b)および任意に(c)に記載の組換えベクターまたは核酸配列の該ライブラリーのメンバーを適当な宿主細胞中、少なくとも１つの相互作用が確立するように発現させ； (e)該（ポリ）ペプチドの相互作用を表すスクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (f)任意に、さらに選択、スクリーニングおよび／または精製工程を行い；そして (g)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定するを特徴とする方法。２．核酸配列の集合体であって該核酸配列のそれぞれが該核酸配列集合体中の別のメンバーによってコードされる少なくとも１つのさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用できる（ポリ）ペプチドをコードしているものである該核酸配列集合体を同定するための方法であって、工程： (a)適当な宿主細胞中で以下のものを少なくとも１つの相互作用を確立するように発現させる； (aa)（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第１ライブラリーに含まれる核酸配列； (ab)工程(aa)に記載のさらなる（ポリ）ペプチドと相互作用することができる (ポリ)ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の第２ライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物とは表現型が区別できる性質を表示し、また工程(aa)および(ab)に用いるそれぞれのベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドとが相互作用すると、スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を発生させる）； (ac)要すれば、工程(aa)および／または(ab)に記載のさらなる（ポリ）ペプチド（群）と相互作用できる、あるいは該相互作用を引き起こすことができる（ポリ）ペプチドをコードする種々の核酸配列からなる遺伝的に異なる核酸配列を含む組換えベクター分子の付加的なライブラリーに含まれる核酸配列（ここに当該組換えベクター分子および／または組換え挿入物の製造に用いるベクター分子が工程(aa)および(ab)に用いるベクター分子および／または組換え挿入物と表現型が区別できる性質を表示し、また任意に、工程(ac)に用いる当該ベクター分子および／または組換え挿入物によって表示される少なくとも１つの該性質は、工程 (aa)および／または(ab)に用いる当該ベクター分子および／または当該組換え挿入物のいずれかによって表示される少なくとも１つの当該性質とともに、当該付加的なライブラリー由来の（ポリ）ペプチドと当該第１ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドおよび／または当該第２ライブラリー由来の（ポリ）ペプチドのいずれかとが相互作用するとスクリーニング可能または選択可能な性質を発生することができる）； (b)該（ポリ）ペプチドの相互作用を示す当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質の発生について選択し； (c)任意に、さらにスクリーニング、選択および／または精製工程を行い；そして (d)該（ポリ）ペプチドをコードする該核酸配列を同定するを特徴とする方法。３．当該スクリーニング可能なまたは選択可能な性質を細胞外に発現させる請求項１または２に記載の方法。４．工程(a)/(aa)における組換えベクター分子が、複製可能遺伝的パッケージ(R GP)であって当該（ポリ）ペプチドをその表面に表示するものを生じさせる請求項１から３のいずれかに記載の方法。５．組換えベクター分子が組換えファージ、ファージミドまたはウイルスである請求項４に記載の方法。６．ファージが (a)クラスＩファージfd、M13、If、Ike、ZJ/2、Ffのいずれか； (b)クラスIIファージXf、Pf1およびPf3のいずれか； (c)λファージ群、ラムダ、434、P1のいずれか； (d)包膜ファージ群、PRD1のクラスのいずれか；あるいは (e)パラミクソウイルス群、オソミクソウイルス群、バキュロウイルス群、レトロウイルス群、レオウイルス群およびアルファウイルス群のクラスのいずれかである請求項５に記載の方法。７．相互作用性（ポリ）ペプチドを含むポリファージを選択することによって選択工程(e)/(b)を行う請求項４から６のいずれかに記載の方法。８．スクリーニング可能なまたは選択可能な性質が当該RGPの感染性と関連する請求項４から７のいずれかに記載の方法。９．RGPが工程(a)/(aa)に用いる組換えベクターによってコードされ、非感染性にされており、当該RGPに感染力を与えるドメインに融合させた工程(b)/(ab)および／または(c)/(ac)の（ポリ）ペプチドと工程(a)/(aa)の当該（ポリ）ペプチドとの相互作用によって当該RGPの感染力を回復させる請求項８に記載の方法。１０．RGPの宿主細胞への結合および感染に必要な表面タンパク質をコードする遺伝子配列の修飾によつてRGPを非感染性にする請求項９に記載の方法。１１．工程(a)/(aa)の当該組換えベクター分子が、細胞、好ましくは細菌の表面に発現される融合タンパク質を生じさせる請求項１から３のいずれかに記載の方法。１２．細菌が淋菌または大腸菌であり、融合タンパク質が少なくとも鞭毛、1amB 、ペプチドグリカン関連リポタンパク質またはOmpAタンパク質の一部および当該（ポリ）ペプチドからなる請求項11に記載の方法。１３．工程(b)/(ab)または(c)/(ac)の組換えベクター分子によってコードされる当該（ポリ）ペプチドが少なくとも１つのスクリーニングまたは選択タグに連結している請求項３から７、11または12のいずれかに記載の方法。１４．スクリーニングまたは選択タグが工程(b)/(ab)または(c)/(ac)の組換えベクターによってコードされる請求項13に記載の方法。１５．スクリーニングまたは選択タグがHis(n)、myc、FLAG、malE、チオレドキシン、GST、ストレプトアビジン、βガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼ、T7gene10、ストレプタグおよびカルモジュリンのリストから選択される請求項13または14に記載の方法。１６．当該スクリーニングまたは選択タグが宿主細胞のゲノムによってコードされる請求項13に記載の方法。１７．工程(c)/(ac)の追加のライブラリー核酸配列によってコードされる（ポリ）ペプチドが、工程(a)/(aa)および(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドの少なくとも１つのリン酸化、グリコシル化、メチル化、脂質化またはファルネシル化を介して工程(a)/(aa)および(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドの相互作用を生じさせる請求項１から１６のいずれかに記載の方法。１８．工程(d)/(a)の宿主細胞が空間的にアドレス可能であり、工程(g)/(d)に記載の核酸配列を対応する空間的アドレス可能な宿主細胞から回収する請求項１から10および13から17に記載の方法。１９．当該スクリーニング可能または選択可能な性質を細胞内に発現させる請求項１または２に記載の方法。２０．当該スクリーニング可能または選択可能な性質がβガラクトシダーゼ、アルカリ性ホスファターゼまたはhis3およびleuのような栄養性マーカー、またはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンもしくはストレプトマイシンのような抗生物質に対する耐性を与える耐性遺伝子の転写をトランス活性化することである請求項19に記載の方法。２１．工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および(c)/(ac)の組換えベクターが組換え促進部位を含み、工程(e)/(b)では、組換えイベントが選択され、ここに工程(a)/(aa)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列、工程(b)/(ab)の（ポリ）ペプチドをコードする核酸配列および工程(c)/(ac)の（ポリ）ペプチドをコードする任意の核酸配列がその同じベクター中に含まれる請求項１から20のいずれかに記載の方法。２２．部位特異的組換え機構Cre-lox、attP-attB、Mu ginまたは酵母flpによって当該組換えイベントが媒介される請求項21に記載の方法。２３．組換え促進部位が制限酵素認識部位であり、組換えイベントが少なくとも２つの異なる制限酵素による工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および任意に(c)/(ac)に記載の組換えベクター分子の切断、および当該ベクター中に含まれる核酸配列の連結反応による組換えによって生じる請求項21に記載の方法。２４．PCRによる選択工程(e)/(b)後に核酸配列の同定を行い、好ましくは当該PC R後に当該核酸の配列決定を行う請求項１から23に記載の方法。２５．工程(a)/(aa)、(b)/(ab)および/または(c)/(ac)の組換えベクターが選択マーカーをコードする少なくとも１つの遺伝子を含む請求項１から24のいずれかに記載の方法。２６．選択マーカーが抗生物質、好ましくはアンピシリン、クロラムフェニコール、カナマイシン、ゼオシン、ネオマイシン、テトラサイクリンまたはストレプトマイシンに対する耐性である請求項25に記載の方法。２７．宿主細胞がF'および好ましくは大腸菌XL-1 Blue、K91もしくはその派生株、TG1、XL1kanまたはTOP10Fである請求項１から26のいずれかに記載の方法。２８．R408、M13k07およびVCSM13、M13de13、fCA55およびfKN16またはこれらの誘導体のリストからのヘルパーファージを用いて当該RGPを産生させる請求項３から18および21から27のいずれかに記載の方法。２９．当該遺伝的に異なる核酸配列の少なくとも１つが免疫グロブリンスーパーファミリーのメンバーをコードする請求項１から28のいずれかに記載の方法。３０．当該遺伝的に異なる核酸配列が免疫グロブリン重および軽鎖のあるレパートリーをコードする請求項29に記載の方法。３１．突然変異法によって当該遺伝的に異なる核酸配列を作成する請求項１から 30のいずれかに記載の方法。３２．cDNAライブラリーから当該遺伝的に異なる核酸配列を作成する請求項１から31のいずれかに記載の方法。３３．核酸配列が遺伝子またはその一部である請求項１から32のいずれかに記載の方法。３４．少なくとも (a)工程(a)/(aa)に記載の組換えベクター分子または対応するベクター分子； (b)工程(b)/(ab)に記載の組換えベクター分子または対応するベクター分子；および任意に (c)工程(c)/(ac)に記載の少なくとも１つの別の組換えベクター分子または対応するベクター分子を含むキット。