JP2000505420A

JP2000505420A - サイトカインアンタゴニストおよびアゴニスト

Info

Publication number: JP2000505420A
Application number: JP9527177A
Authority: JP
Inventors: ロペス，エンジェル; バグリー，クリストファー; ウッドコック，ジョアンナ
Original assignee: メドヴェト・サイエンス・プロプライアタリー・リミテッド
Priority date: 1996-01-30
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 2000-05-09
Also published as: EP0889905A4; EP0889905A1; DE69728529D1; USRE39433E1; AUPN780096A0; DE69728529T2; EP0889905B1; US6200567B1; EP1386933A1; WO1997028190A1; ATE263783T1

Abstract

(57)【要約】ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の受容体の共通のβｃ鎖のドメイン４のＦ’−Ｇ’ループに結合できる治療剤。Ｆ’−Ｇ’ループ中に位置するアミノ酸Ｔｙｒ⁴²¹は、受容体の共通のβｃ鎖に対するＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の作用の高親和性結合および刺激において重要である。サイトカインに対する他の受容体もまた、同様の位置に疎水性アミノ酸を示し、それらもそれらに対する各々のサイトカインの結合並びに作用の調節において重要な役割を果たす可能性がある。Ｆ’−Ｇ’ループに結合できる治療剤が示唆され、治療上の価値を有するはずである。

Description

【発明の詳細な説明】サイトカインアンタゴニストおよびアゴニスト発明の分野本発明は、サイトカインのアンタゴニストおよびアゴニスト、そのようなアンタゴニストおよびアゴニストの治療上の使用、およびそのようなアンタゴニストおよびアゴニストを単離する方法に関する。発明の背景ヒト顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）、インターロイキンＩＬ−３およびＩＬ−５は、造血細胞の生存、産生および機能に関与しているサイトカインである（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ，１９９２に概説されている）。これらの性質のため、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦは、現在、化学療法および放射線療法の後の骨髄再形成において臨床的に用いられている（Ｇｒｏｏｐｍａｎｅｔａｌ，１９８７）。しかし、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の過剰なまたは異常な産生が疾病状態を導きうることも明らかになりつつある。例えば、アレルギーの個体の肺（Ｋａｔｏｅｔａｌ，１９９２）および慢性関節リウマチを有する患者の関節（Ｗｉｌｌｉａｍｓｏｎｅｔａｌ，１９８８）において、増加した量のＧＭ−ＣＳＦが見いだされている。アレルギーの個体の皮膚から、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の増加したｍＲＮＡが見いだされている（Ｋａｙｅｔａｌ，１９９１）。ＧＭ−ＣＳＦは、白血病細胞の増殖を刺激することができ（Ｙｏｕｎｇｅｔａｌ，１９８６）、ＩＬ−３は、濾胞性β細胞リンパ腫によりオートクライン様式で産生され、これらの細胞のＩＬ−３依存的増殖をもたらすことが示されている（Ｃｌａｙｂｅｒｇｅｒｅｔａｌ，１９９１）。これらの臨床状況から、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５と拮抗することは治療上の価値を有することができ、問題とする状態に応じてこれらのサイトカインの１つと拮抗することが十分であろうことが明らかである。アンタゴニストについての多くの示唆が既になされている。例えば、ＰＣＴ／ＡＵ８９／００１７７の明細書およびＰＣＴ／ＡＵ９４／００４３２の明細書においては、ＧＭ−ＣＳＦの変異体がＧＭ−ＣＳＦの作用に対するアンタゴニストとして同定されているが、これらのアンタゴニストがＧＭ−ＣＳＦの作用のみより多くのものについて有効であることは示されていない。しかし、他の状況においては、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の３つすべての同時拮抗作用が望ましいか、または実際に必要であるかもしれない。例えば、アレルギーに関与する主要な細胞タイプであると考えられている好酸球は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−５のいずれかによりその数が維持され剌激されうる（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ，１９８９）。したがって、好酸球および好塩基球の作用を阻害するためには３つすべてのサイトカインの拮抗作用が必要であろう。同様に、アレルギーにおいてエフェクターとしての役割を果たすと考えられている好塩基球は、ＩＬ−３、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−５のいずれかにより刺激されうる（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ，１９９０）。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ −３およびＩＬ−５の拮抗作用は、それぞれの異なるサイトカインに対して特異的なアンタゴニストを共に投与することにより行うことができる。この方法は実行可能ではあるが、３つまでの異なる蛋白質を投与しなければならないという欠点を有し、これは不便であるばかりでなく、免疫原性および他の副作用のリスクを増大させる。これらの３つのサイトカインの増加したレベルにより悪化するかもしれない主な状態の１つは喘息である。喘息およびアレルギーにおけるＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ −３およびＩＬ−５の役割は広く研究されてきており、現在も続けられている。いくつかの研究は、ｉｎｓｉｔｕハイブリダイゼーションにより、喘息患者の肺単核細胞(Ｆｕｋｕｄａｅｔａｌ，１９９４；Ｒｏｂｉｎｓｏｎｅｔａｌ，１９９２；Ｍａｒｉｎｉｅｔａｌ，１９９２；Ｈａｍｉｄｅｔａｌ，１９９１)および好酸球（Ｂｒｏｉｄｅｅｔａｌ，１９９２）においてＩＬ−５ｍＲＮＡの増加したレベルを示した。免疫化学はまた、これらの組織においてＩＬ−５蛋白質の量が増加していることを明らかにした（Ａｃｋｅｒｍａｎｅｔａｌ，１９９４）。アトピー性患者におけるアレルゲン誘導性の後期皮膚反応において、ＩＬ−５、ＩＬ−３およびＧＭ−ＣＳＦのｍＲＮＡの増加が示された（Ｋａｙｅｔａｌ，１９９１）。症候性喘息患者からの気管支肺胞洗浄（ＢＡＬ）液は、無症候性喘息の患者より高いＩＬ−５レベルを有している（Ｓｕｒｅｔａｌ，１９９５）。さらに、症候性喘息患者が１つの肺区中で抗原によりチャレンジされたとき、同じ患者の擬チャレンジ区（２．８ｐｇ／ｍｌ）と比較して有意なレベルのＩＬ−５が示された（９８０ｐｇ／ｍｌ）（Ｓｕｒｅｔａｌ，１９９５）。同様の設計の別の研究においては、アレルギー性および非アレルギー性喘息の両方において、ＩＬ−５レベルは検出できないレベルから２８００ｐｇ／ｍｌに増加した（Ｚａｎｇｒｉｌｌｉｅｔａl，１９９５）。ＩＬ−５のレベルと喘息との間の因果関係は、中程度に重症の喘息患者をコルチコステロイドで２週間治療したときに、ＩＬ−５ｍＲＮＡを発現する細胞の数が減少したという研究から示唆される（Ｂｅｎｔｌｅｙｅｔａｌ，１９９６）。この減少は、臨床的改善と相関しており、またＣＤ３⁺Ｔ細胞および活性化（ＥＧ２⁺）好酸球の損失とも相関していた。ＧＭ−ＣＳＦもまた、喘息性の肺において検出されている。実際、唾液サイトカインの１つの研究において、ＧＭ−ＣＳＦは好酸球生存に支配的な影響を有するようである（Ａｄａｃｈｉｅｔａｌ，１９９５）。ＩＬ−５もまた、好酸球を活性化してＥＧ２エピトープを発現させる。いくつかの研究において、増加したＩＬ−５レベルが肺のＥＧ２⁺好酸球と関連していた（Ｆｕｋｕｄａｅｔａｌ，１９９４；Ｂｅｎｔｌｅｙｅｔａｌ，１９９６）。さらに、好酸球の組織特異的活性化の証拠がある。１つの実験において、肺における好酸球の活性化を、同じ患者の血液におけるものと比較した。活性化は、ＣＲ−３、ｐ１５０／９５、ＣＤ６７、ＣＤ６３の細胞表面発現およびＬ −セレクチンの損失により評価した。気管支抗原でチャレンジした患者においては、２４時間で末梢および肺の好酸球の両方が見られたが、肺の好酸球のみが増加したレベルのＧＭ−ＣＳＦｍＲＮＡを有しており、このことは、これらの細胞の局所的な活性化を示唆する。さらに、肺由来の好酸球においては活性化するが、血液由来のものにおいては活性化しないことの証拠がある。この結果は、肺の好酸球におけるＩＬ−５の特異的影響および喘息におけるそれらの関与と矛盾しない。動物モデルもまた、喘息におけるＩＬ−５の役割を示唆する。最も有意なデータは、喘息のサルモデルにおいてＩＬ−５に対する抗体（ＴＲＦＫ−５）を用いたものに存在する（Ｍａｕｓｅｒｅｔａｌ，１９９５）。回虫感受性カニクイザルをエアロゾル化したＡｓｃａｒｉｓｓｕｕｍ抽出物でチャレンジした。０．３ｍｇ／ｋｇのＴＲＦＫは、ＢＡＬ液における増加した気道反応性および減少した好酸球数を全廃させた。興味深いことに、この阻害は３ヶ月間持続した（Ｍａｕｓｅｒｅｔａｌ，１９９５）。モルモットの研究は、この結論を支持した（Ｍａｕｓｅｒｅｔａｌ，１９９３）。さらに、ＩＬ−５遺伝子を遺伝子的に除去したマウスは、ＩＬ−５遺伝子陽性の同腹仔より、検出可能なＩＬ− ５を有さずかつ好酸球数の有意な減少を有するのみならず、有意に軽症の喘息を発生した（気道過反応性および肺損傷により表して）（Ｆｏｓｔｅｒｅｔａｌ，１９９６）。メタコリンに対する気道反応性の回復の明確な例は、ＩＬ−５欠損マウスにＩＬ−５発現ワクシニアウイルスを感染させた後に見られたが、対照ワクシニアウイルス感染では見られなかった（Ｆｏｓｔｅｒｅｔａｌ，１９９６）。ラット肺におけるＧＭ−ＣＳＦの過剰発現が、喘息においても見られる３つ組である好酸球増加症、マクロファージ肉芽腫および線維症反応を導くことにより、喘息におけるＧＭ−ＣＳＦの同様の役割が示唆されている（Ｘｉｎｇｅｔａｌ，１９９６）。ヒトインターロイキン（ＩＬ）−３、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）およびＩＬ−５は、細胞表面上の特異的表面レセプターに結合することにより、その生物学的作用を発揮する（Ｂａｇｌｅｙｅｔａｌ，１９９５；Ｅｌｌｉｏｔｔｅｔａｌ，１９８９；Ｐａｒｋｅｔａｌ，１９８９；Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ，１９９１）。レセプターは、各リガンドに特異的なα鎖、および３つのレセプターの間で共有されるβ鎖（β_c）を含むヘテロダイマーである（Ｌｏｐｅｚｅｔａｌ，１９９２；Ｋｉｔａｍｕｒａｅｔａｌ，１９９１）。各リガンドはそれぞれのα鎖に結合するが、β_cが高親和性結合を与え、シグナリングを可能とする（Ｍｉｙａｊｉｍａｅｔａｌ，１９９２およびＨａｙａｓｈｉｄａｅｔａｌ，米国特許５１１２９６１）。米国特許５１１２９６１の発明者らは、高親和性レセプターはＧＭ−ＣＳＦアゴニストおよびアンタゴニストの候補をスクリーニングするための貴重な道具であることを示唆する。これらの３つすべてのサイトカインは共通のレセプターサブユニット（β_c）を介して作用するため、我々は以前に、１つの化合物でＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の作用を同時に阻害することが可能であろうという仮説をたてた（Ｂａｇｌｅｙｅｔａｌ，１９９５、この文献を本明細書の一部としてここに引用する）。しかし、これまでのところ、３つすべてのサイトカインに調和的に作用するエフェクターを見いだすという問題にアプローチする手段はなかった。例えば、共通レセプターサブユニット（β_c）のどの領域がこれらのサイトカインにより結合されるのか、および３つすべてのサイトカインについて同じ領域が結合するのか、あるいは３つの異なる領域が関与しているのかは明らかではない。 β_cの分析は、これが４つの細胞外ドメインを含むことを示した（Ｇｏｏｄａｌｌｅｔａｌ，１９９３）。ドメイン１は最もＮ末端のドメインを表し、ドメイン４は最も膜に近いドメインを表す。各ドメインは、介在ループにより一緒に連結された７個のβストランドからなる。問題のループであるＦ’−Ｇ’ループは、β_cのドメイン４に位置する。興味ある残基は、Ｎ末端の一次翻訳末端から番号がつけられ、開始メチオニンがＭｅｔ¹である。 β_cの各リガンドに対する親和性変換の分子的根拠は、リガンド−レセプター複合体がまだ結晶化されていないため、完全には理解されていない。しかし、成長ホルモン（ＧＨ）とそのホモダイマーレセプターとの相互作用（ＤｅＶｏｓｅｔａｌ，１９９２）と同様に、リガンドとレセプターのα鎖およびβ鎖との間には直接的な相互作用がありそうである。ＧＨ：ＧＨレセプター系においては、ＧＨ：ＧＨｂｐ１および２の複合体のＸ線結晶学からＧＨとＧＨｂｐ２との接触点が決定されている（ＤｅＶｏｓｅｔａｌ，１９９２）。この系と同様にして、我々(Ｗｏｏｄｃｏｃｋｅｔａｌ，１９９４)および他の者(Ｌｏｃｋｅｔａｌ，１９９４)は、以前に、β_cのＢ’−Ｃ’ループが、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合に何らかの役割を果たしていることを示した。特に、３つの残基、Ｔｙｒ³⁶⁵、Ｈｉｓ³⁶⁷およびＩｌｅ³⁶⁸がＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の高親和性結合に重要であるが、ＩＬ−３の高親和性結合には僅かにしか関与していないことが示されている（Ｗｏｏｄｃｏｃｋｅｔａｌ，１９９４）。これらの結果は、適当な化合物によりこれらの３つのアミノ酸を標的とすると、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５−媒介性活性は減損するであろうがＩＬ−３−媒介性活性は減損しないであろうことを意味する。発明の概要分子モデリング技術を用いることにより、我々は最近、Ｆ'-Ｇ’ループがリガンド結合に関与しているかもしれないことを仮定した（Bagley et al.，1995）。本発明は、βｃのこの予測されたＦ'-Ｇ'ループに関する研究から、そしてこのループが全ての３つのサイトカインＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合並びにシグナリングに必須であるとの発見から生ずる。本発明のさらなる側面は、３つのリガンドＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ −５全部のそれら表面リセプターに対する高親和性結合並びにシグナリングに必要であるＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のリセプターβｃ鎖内の単一のアミノ酸配列の意外な同定、並びにこれらのサイトカインの３つ全てが高親和性変換のためにＦ'-Ｇ'ループを必要とする事実の結果として生ずる。Ｔｙｒ⁴²¹に結合するかまたはリガンドのＴｙｒ⁴²¹への結合を阻害する化合物は、ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５の一般的なアンタゴニストとして挙動すると信じられる。Ｆ’−Ｇ’ループに結合する化合物は、この結合を立体的に阻害するだろうと考えられる。さらに、この発見は、サイトカインリセプタースーパーファミリーの他のメンバーに関する示唆を有するらしく、その内の幾つかは与えられたサブファミリーにおいてサブユニットを共用し（即ち、それらは幾つかのサイトカインに結合する）、また幾つかはリガンド特異的であってただ一つのサイトカインのみに結合する。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のリセプターα鎖およびβｃは、急速に膨張しているサイトカインリセプタースーパーファミリーに属する。このスーパーファミリー中の幾つかのサブファミリーは、複数のリガンドによる共有のリセプターサブユニットの共用により特徴付けされることが、今浮かび上がりつつあり：ｇｐ１３０はＩＬ−６（Hibi et al.，1990；Taga et al.，1992），ＩＬ−１１（Hilton et al.，1994），オンコスタチンＭ（Liu et al.，1992），毛様体神経栄養性因子、白血病阻害因子（ＬＩＦ）（Ip et al.，1992）およびカルジオトロフィン−１（Pennica et al.，1995）の親和性コンバーターおよびシグナルトランスデューサーとして機能し；ＬＩＦリセプター（ＬＩＦＲ）も、毛様体神経栄養性因子（Davis et al.，1993），カルジオトロフィン−１（Pe nnica et al.，1995）およびＬＩＦに加えてオンコスタチンＭ（Gearing et al. ，1994）に結合し；ＩＬ−２ＲβはＩＬ−２およびＩＬ−１５の親和性変換およびシグナリングを支持し(Giri et al.,1994);ＩＬ−２γ鎖の親和性はＩＬ−２( Takeshita et al.，1992)，ＩＬ−４（Russell et al.，1993），ＩＬ−７（Nog uchi et al.，1993），ＩＬ−９（Kimura et al.，1995）およびＩＬ−１５（Gi ri et al.，1994）を変換し；証拠もＩＬ−４およびＩＬ−１３がリセプター成分を共用すること（Zurawski et al.，1993）およびこのサブユニットが最近クローン化されたこと（Hilton et al.，1996）を示唆する。ｇｐ１３０，ＬＩＦＲおよびＩＬ−２Ｒβ並びにγ鎖の中のどの残基がリガンド結合に重要なのか、あるいは本当に異なるリガンドがこれら共有のリセプターサブユニット上の結合決定基の唯一のセットを共用するかまたは有するのか否かも公知ではない。これらの共通のサブユニットは幾つかのサブユニットによるシグナルを変換するのに必要不可欠であるから、これらの共通のサブユニットがリガンドを結合するかまたはホモダイマーを形成する能力の干渉が、複数のリガンドの作用に影響するかもしれない可能性が生ずる。 βｃの予測されたＦ'-Ｇ'ループと、幾つかの共通のループ並びにリガンド特異的リセプターサブユニットのループとを並べることにより、この領域におけるチロシン並びに同様な疎水性残基の存在が明らかとなった（表３）。この仮想ループの正確な長さは異なるリセプターの間で７−１４アミノ酸の間で変動するが、２つの厳しく保存された配列：Ｎ末端のＶＲＶＲコンセンサスおよびＣ末端のＷＳＸＷＳコンセンサスにより束縛される。リガンド−リセプター相互作用の性質は関与するシステムに特異的になるが、リセプター中の疎水性の芳香族残基はリガンド相互作用の強い候補を意味することが示唆される。即ち、サイトカインリセプターファミリーのメンバーは、構造上保存されたリセプターフレームワークを用いることにより、支配的な疎水性相互作用を通して特定のリガンドの結合を支持する一連のループを現す。この概念の確認は、Ｆ'-Ｇ'ループ中のＧｌｕ²⁹⁷ およびＰｈｅ²⁹⁸が置換された変異体がＩＬ−６結合の損失を表したことを示した（Yawata et al.，1993）ＩＬ−６Ｒの変異分析からも生じた。ＧＨＲ内の成長ホルモンの結合に関与する残基の最近の分析から、親和性への最も大きな貢献は疎水性相互作用に起因することが明らかになった（Clackson a nd Wells，1995）。成長ホルモン結合に際して溶剤に接近不可能なことが知られているＧＨＲ中の３３残基の計画的なアラニン置換は、これら残基の１１の置換のみが親和性に対して顕著な効果を有しており、その内の６つは疎水性であることを示した。さらに、これらの疎水性残基は、成長ホルモンとの相互作用のための境界面を形成する領域において、ＧＨＲの表面上に群をなす。さらに、ＧＨＲにおいて、親和性のもっとも大きな低下が２つのトリプトファン残基の置換により生じており（Clackson and Wells，1995；Bass et al.，1991）、疎水性の芳香族残基がリガンド相互作用に極めて重要であることを含蓄する。我々の現在の研究および我々の過去の仕事から（Woodcock et al.，1994）、我々は、βｃにおいてリガンド相互作用に役割を果たす予測されたループ中の全部で３つの疎水性残基、Ｔｙｒ³⁶⁵，Ｉｌｅ³⁶⁸およびＴｙｒ⁴²¹を、今回同定した。即ち、βｃのＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５への結合も、疎水性相互作用により支配的に支持されているらしい。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５リセプターのβｃにおけるこれらの発見を、ＧＨ−ＧＨＲの結晶構造解析および変異分析と比較することは興味がある。ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５リセプターのヘテロダイマーの特徴とは対照的に、ＧＨＲはホモダイマーである。ＧＨＲの２つの同一のサブユニットは、連続して非均等様式で成長ホルモンを結合する。結晶構造において、２つの成長ホルモン−結合蛋白質はＧＨｂｐＩおよびＧＨｂｐIIに対応するとして同定される。ＧＨｂｐＩの最初の相互作用は、成長ホルモン中の部位Ｉ接点を利用し、解離定数６００ｐＭと相対的に強い（Cunningham et al.，1991）。部位II接点を通したＧＨｂｐIIとの次の相互作用は、解離定数を２００ｐＭに低下させる。よって、ＧＨｂｐＩに結合した成長ホルモンとのＧＨｂｐIIの相互作用は、リセプター複合体上における親和性の３倍の増加を提供する。即ち、機能上、ヒトβｃはＧＨｂｐIIに類似しており、リガンドとリセプターα鎖との最初の対合（association）後にのみ結合して、リセプター複合体上における親和性の１０００倍以下の増加を提供する（ＩＬ−３の場合のとおり）。本明細書に示す結果は、しかしながら、ＧＨ−ＧＨＲ相互作用との３つの顕著な相違を示す。第１に、ＧＨｂｐＩ中にあってＧＨｂｐII（βｃに類似）中にはないＦ'-Ｇ'ループがリガンド結合に関与する。第２に、ＧＨｂｐＩのＦ'-Ｇ'ループ中の残基は成長ホルモンの結合に際して効率的に溶媒除外されるためリガンドとリセプターの間の密接な接触が示されるが、この領域における２つの蛋白質の間の再現性のある相互作用は外観上ほとんど存在しない。ＧＨＲ中のこのループの残基を横切るアラニンスキャニング変異導入は、野生型リセプターに比して、成長ホルモン結合親和性に対する効果をほとんど有さなかった（Clackson and Wells，1995；Bass et al.，1991）。よって、ＧＨｂｐＩのＦ'-Ｇ'ループと成長ホルモンの間の接触は、リセプターの結合親和性にほとんど貢献しない。これは我々の発見、即ち我々がＴｙｒ⁴²¹の置換における全てのリガンドの親和性変換の完全な損失を観察したのとは対照的である（野生型分子におけるこの残基とリガンドとの極めて強固な相互作用を示す）。第３にＧＨＲのＦ'-Ｇ'ループとＧＨの間の再現性相互作用の欠如に一致して、このループ中に疎水性残基が存在しない。即ち、明らかに疎水性である接触部位を用いるＧＨＲにも拘わらず、これらはこのリガンド中のどこかよそに位置し、このことからさまざまな接触部位による親和性への貢献はβｃとＧＨＲとでは異なることが示される。第１の広い側面において、本発明は、したがって、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のリセプターの共通のβｃ鎖のドメイン４のＦ'-Ｇ'ループに結合できる治療剤か、あるいは他のサイトカインリセプターの類似のループに結合できる治療剤であって、その治療剤の結合が各々のサイトカインまたは一つのサイトカインにアンタゴニストまたはアゴニスト効果を有する治療剤に属すると言うことができる。第１の側面の第１の形態において、サイトカインリセプターは共通のシグナル変換リセプターであって、βｃ，ｇｐ１３０，ＬＩＦＲ，ＩＬ−２Ｒβ ＩＬ− ２Ｒγ，およびＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒからなる群から選択されるものであってよい。この側面のより特定の形態において、リセプターはβｃである。この側面のより特定の形態において、治療剤は、リセプターに結合する全ての各サイトカインにアンタゴニストまたはアゴニスト効果を有する。本発明の第１の側面の第２の形態において、Ｆ'-Ｇ'ループは疎水性アミノ酸を含む。各々のリセプターに関する芳香族疎水性アミノ酸は表３に示されるとおりであってよく、本発明は該表に記載されるリセプターに限定されてもよいか、あるいはチロシンに限定されてよく、そして本発明はＦ'-Ｇ'ループ中に存在するチロシンを有するリセプターに限定されてよい。リセプターは、代わりにβｃにも相互作用するリセプターに限定されてもよい。本発明の第１の側面の第３の形態において、サイトカインリセプターはシグナリングリセプターであり、一つのより特定の形態において、単一のサイトカインに特異的であって、ＥＰＯＲ，ＴＰＯＲおよびＯＢＲを含む群から選択されてよい。本発明の第１の側面の第１の形態のより特定の形態に関して上で示したとおり、共通のシグナル変換リセプターはβｃである。４２１位のアミノ酸特異性はかなり厳密であり、治療剤は、結合のためのＴｙｒ⁴²¹の存在を必要とするか、あるいはＴｙｒ⁴²¹が有する通常の相互作用の立体妨害の存在を必要とするものとして特徴付けされる必要があってよい。治療剤は喘息の兆候を軽減することができてよい。治療剤は多くのクラスの化合物のいずれかの形態をとってよく、抗体、ペプチド、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド、または他の有機または無機化合物を含む群から選択されてよい。第２の側面において、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のリセプターの共通のβｃ鎖のドメイン４のＦ'-Ｇ'ループに結合できるか、あるいは他のサイトカインリセプターの類似のループに結合できる治療剤を単離するための方法に属すると言うことができ、該方法は、上記ループに結合するそれらの能力に関して候補分子をスクリーニングする工程を含む。本発明の第２の側面の一つの形態において、上記ループに結合するそれらの能力に関して候補分子をスクリーニングする工程は、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む群から選択される配列に結合する能力に関してスクリーニングすることを含む。別法として、スクリーニングされるループのみを、共通のシグナル変換リセプターに由来するものから選択してよく、または疎水性アミノ酸残基を有するそれらリセプターからの第２の代替物としてあるいはシグナル変換リセプターであるそれらリセプターから第３の代替物として選択してよいことも理解される。別法として、本発明は、ＧＭ−ＣＳＦ，ＩＬ−３およびＩＬ−５のリセプターの共通βc鎖のＴｙｒ⁴²¹、またはｇｐ１３０の対応する芳香族疎水性残基あるいは他の共通シグナル変換リセプターあるいは他のサイトカインに応答性の特異的リセプターの類似の芳香族疎水性残基に化合物が結合する能力に関してスクリーニングすることにより、治療剤を単離する方法に属するということができる。治療剤は抗体またはその断片であってよく、そのような抗体を単離する方法は、Ｆ'-Ｇ'ループを有するペプチド分子を動物に接種して、抗体産生細胞をミエローマ細胞ラインと融合させ、そしてＦ'-Ｇ'ループと反応性の抗体を生産する細胞ラインをスクリーニングし、そして細胞ラインから抗体を回収し、高親和性結合の阻害に関して試験し、機能の阻害または刺激に関して試験する工程をさらに含むことが理解される。これは、ループを結合することができる細胞ラインにより生産される抗体の小断片を作成することをさらに含んでよい。該細胞ラインは便利にはマウス細胞ラインであってよく、該方法は、非結合領域中においてヒト配列でマウス配列を置換することにより抗体断片をヒト化する工程をさらに含んでよい。第３の側面において、本発明はヒトまたは動物の症状を治療する方法に属し、該方法は、薬学上受容可能なキャリアー中にて治療に効果的な用量で上記同定された治療剤を投与する工程を含む。本明細書にて同定または定義されたひとつまたはそれ以上の治療剤を組み合わせて、そしておそらくは他の治療剤と組み合わせて症状を治療することを望んでよい。治療は、症状にかかる危険を減じることにより予防することに照準を合わせてよく、あるいは治療を用いることにより症状を軽減するかまたは未然に防いでよい。治療剤の投与は、任意の薬学上受容可能な形態で適切なキャリアー中でありうる。 βｃのＦ'-Ｇ'ループを結合する化合物の構築は、ＩＬ−３，ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−５が病原性の役割を果たす場合、主にアレルギー、喘息、白血病、リンパ腫、および関節炎を含む炎症である場合の症状の干渉に治療上有用であると考えられる。他のサイトカイン受容体と同様に、アンタゴニストまたはアゴニストは治療において有益なものでありうると考えられている。したがって、共通のシグナル伝達受容体に対するもの。ｇｐ１３０はＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５受容体系におけるβｃと機能的に類似であるため、すなわち、ＩＬ−６、オンコスタチンＭ（ＯＳＭ）、毛様神経向性因子（ｃｉｌｉａｒｙｎｅｕｒｏｔｒｏｐｉｃｆａｃｔｏｒ、ＣＮＴＦ）、白血病阻止因子（ＬＩＦ）およびＩＬ−１１に対して共通の結合サブユニットおよび共通のシグナル伝達物質であるため、このチロシンを標的化／阻害することにより、ＩＬ−６、ＬＩＦ、ＯＳＭ、ＣＮＴＦおよびＩＬ−１１に対する拮抗作用を引き起こしうることが示唆されている。この受容体系の拮抗作用は、炎症、白血病およびリンパ腫において有用でありうる。ＩＬ−２Ｒβ／γに対するアンタゴニストは、免疫抑制薬として有用でありうる。ＬＩＦＲのアンタゴニストは、子宮内部での胎児の着床を阻害するために有用でありうる。ＩＬ−４／ＩＬ−１３のアンタゴニストは、ＩｇＥ産生を阻害する可能性があり、そして喘息やアレルギーの治療において有用でありうる。特定のサブユニットに対するもの。ＩＬ−３のアンタゴニストは、アレルギーやろ胞性Ｂ細胞リンパ腫の治療において有用でありうる。ＩＬ−４のアンタゴニストは、ＩｇＥ産生を阻害することができ、そして喘息やアレルギーの治療に有用でありうる。ＩＬ−６Ｒのアンタゴニストは、抗炎症薬として有用であり、そしてミエローマ成長を阻害するために使用することができる。ＩＬ−７に対するアンタゴニストは、免疫抑制薬として有用でありうる。レプチン受容体（ＯＢＲ）のアンタゴニストは、悪疫質、ＡＩＤＳなどの症状における体重減少、癌および寄生虫疾患において有用でありうる。拮抗作用が見られたことが理解されるけれども、しかしながら、本発明はアゴニストをも含みうると考えるべきである。同定した残基はその系の作用で中枢的な役割を明確に果たし、そしてβｃのＦ’−Ｇ’ループまたは他の受容体の対応する残基（表3に示すようなもの）と相互作用するいくつかの分子は、アンタゴニスト作用を有すると予測することができる一方、それらが、特にホモ二量体化により活性化しうる受容体においてアゴニスト作用を有する可能性も同様にある。第一に共通のシグナル伝達受容体についてである。βｃに結合するアゴニスト試薬は、造血を刺激するためおよび微生物に対する免疫応答を高めるために使用することができる。ＬＩＦＲに結合するアゴニスト試薬は、胚性幹細胞の分化を抑制する場合に有用でありうる。ＩＬ−２Ｒβに結合するアゴニスト試薬は、免疫刺激において使用することができる。ＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３に結合するアゴニスト試薬は、抗腫瘍活性を有する場合がある。次いで、特異的サブユニットについてである。ＩＬ−３Ｒに結合するアゴニスト試薬は、ｉｎｖｉｖｏおよびｅｘｖｉｖｏでの初期造血細胞の増殖において使用することができる。ＩＬ−４Ｒに結合するアゴニスト試薬は、有用な抗腫瘍活性を有する場合がある。ＩＬ−７Ｒに結合するアゴニスト試薬は、有用な抗腫瘍免疫を有する場合がある。ＩＬ−１１に結合するアゴニスト試薬は、癌治療に対する有用な添加物であることが証明されうる。ＥＰＯＲに結合するアゴニスト試薬は、慢性腎不全、慢性炎症性疾患および悪性疾患に伴う貧血を治療するために使用することができる。ＴＰＯＲに結合するアゴニスト試薬は、血小板減少症（例えば、慢性炎症性疾患、悪性病変、化学療法および放射線療法と関連しうる）の治療に対して有用でありうる。有用なアゴニストの実施例は、血液細胞減少、化学療法、放射線療法、免疫抑制または骨髄移植後に生じる血液中の赤血球数および血小板数を増加させるエリスロポエチンおよびトロンボポエチンについてである。ＯＢＲのアゴニストは、体重減少を誘導するために、特に高血圧、冠動脈性心疾患および非インスリン依存性真性糖尿病の一因となる因子と考えられている肥満に対して、使用することができる。アゴニストであるかまたはアンタゴニストであるかを問わず、分子を特定の残基と相互作用することができる能力に基づいて単離することができる。簡略記載のために、アミノ酸残基について以下の３文字略記および１文字略記を表１において示したように本明細書中で使用する。特定のアミノ酸残基をタンパク質のポリペプチド中の位置により表す場合には、残基番号を上付きで表したものを付したアミノ酸略記を用いる（たとえば、Ｘａａⁿ）。表１アミノ酸三文字略記一文字略記アラニンＡｌａＡアルギニンＡｒｇＲアスパラギンＡｓｎＮアスパラギン酸ＡｓｐＤシステインＣｙｓＣグルタミンＧｌｎＱグルタミン酸ＧｌｕＥグリシンＧｌｙＧヒスチジンＨｉｓＨイソロイシンＩｌｅＩロイシンＬｅｕＬリジンＬｙｓＫメチオニンＭｅｔＭフェニルアラニンＰｈｅＦプロリンＰｒｏＰセリンＳｅｒＳトレオニンＴｈｒＴトリプトファンＴｒｐＷチロシンＴｙｒＹバリンＶａｌＶ図面の簡単な説明図１Ａは、二つのサイトカイン受容体モジュール（ＣＲＭ１＆２）（Ｇｏｏｄａｌｌら、１９９３）およびサイトカイン受容体スーパーファミリーの保存された特徴（Ｂａｚａｎ、１９９０）を示すヒトβｃの細胞外ドメインの概略図を表す。図１Ｂは、βｃの膜近位ＣＲＭ２における推定Ｆ’−Ｇ’ループに対応するアミノ酸配列を（Ｈａｙａｓｈｉｄａら、１９９０）、成長ホルモン受容体（ＧＨＲ）のＦ’−Ｇ’ループ（Ｌｅｕｎｇら、１９８７）およびプロラクチン受容体（ＰＲＬＲ）（Ｂｏｕｔｉｎら、１９８８）とともに並べたものを示す。保存的構造モチーフは四角で囲み、そしてリガンド（ＧＨ）接触（ＤｅＶｏｓら、１９９２、およびＳｏｍｅｒｓら、１９９４）に関与すると以前に特定された残基は太字で示す。リガンド結合決定因子を特定するために作成したβｃの変異型は、変異した残基を太字にしたもので示す。図２は、βｃにおける残基４１８−４２２のアラニン置換が、高親和性ＧＭ− ＣＳＦおよびＩＬ−３結合を完全に破壊することを示す図面である。¹²⁵Ｉ −ＧＭ−ＣＳＦ（左パネル）および¹²⁵Ｉ−ＩＬ−３（右パネル）を用いた飽和結合実験のスキャッチャード変換を、ＧＭ−ＣＳＦＲとＩＬ−３Ｒのα鎖の両方を野生型βｃ（○）または変異型⁴¹⁸ＡＡＡＡＡ⁴²²βｃ（●）のいずれかとともに発現するＣＯＳ細胞において行った。ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３の両方ともについて放射標識−ヨード化リガンド濃度範囲を１０ｐＭ−１０ｎＭにし、そして非特異的結合を１μＭの非標識リガンドの存在下で調べた。破線は、野生型β ｃを用いた高親和性および低親和性結合構成要素を示し、そして実線は、ＬＩＧＡＮＤプログラムを用いて決定した、⁴¹⁸ＡＡＡＡＡ⁴²²変異型βｃに対する最適の線を表す。典型的な実験を示し、そしてこれらのおよびいくつかの他の実験由来のＫｄ値を表２に示す。図３は、高親和性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３結合に対する、ヒトβｃの残基Ａｒｇ⁴¹⁸、Ｔｈｒ⁴¹⁹、Ｇｌｙ⁴²⁰、Ｔｙｒ⁴²¹およびＡｓｐ⁴²²の個々のアラニン置換の効果を示す。¹²⁵Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦ（上パネル）および¹²⁵Ｉ−ＩＬ−３（下パネル）を用いた飽和結合実験のスキャッチャード変換を、図２に記載したように行った。破線は野生型βｃ（○）を用いた高親和性および低親和性結合構成要素を示し、そして実線は、ＬＩＧＡＮＤプログラムを用いて決定した、それぞれの変異βｃ（●）に対する最適の線を示す。典型的な実験を示し、そしてこれらのおよび同様な実験由来のＫｄ値を表２に示す。図４は、ポリアラニン置換されたβｃに対してＴｙｒ⁴²¹を再導入したもの（⁴ ¹⁸ ＡＡＡＹＡ⁴²²）の、高親和性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３結合に対する効果を示す。¹²⁵Ｉ−ＧＭ−ＣＳＦ（左パネル）および¹²⁵Ｉ−ＩＬ−３（右パネル）を用いた飽和結合実験のスキャッチャード変換を、図２に記載したように行った。破線は野生型βｃ（○）を用いた高親和性および低親和性結合構成要素を示し、そして実線は、ＬＩＧＡＮＤプログラムを用いて決定した、⁴¹⁸ＡＡＡＹＡ⁴²² 変異型βｃ（●）に対する最適の線を示す。典型的な実験を示し、そしてこれらのおよび同様な実験由来のＫｄ値を表２に示す。図５Ａは、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３により、適切なα鎖を野生型（ｗｔ） βｃとともに発現するＪｕｒｃａｔ細胞においてのみ、ＳＴＡＴ５様（ＳＴＡＴ５−Ｌ）活性が誘導されることを示す、オートラジオグラムを示す図である。３００ｎＭのサイトカインの存在下または非存在下において１時間刺激された、形質導入Ｊｕｒｃａｔ細胞から核抽出物を調製し、ＳＴＡＴ５特異的プローブを用いた電気泳動移動度シフトアッセイにより解析した。図５Ｂは、受容体形質導入Ｊｕｒｃａｔ細胞においてサイトカインにより誘導されるＤＮＡ結合タンパク質が、ＳＴＡＴ５の様に振る舞うことを示す、図５Ａと同様のオートラジオグラムを示す図である。ＧＭ−ＣＳＦ−刺激形質導入Ｊｕｒｃａｔ細胞から調製した核抽出物を、５０倍モル過剰の競合非放射活性オリゴヌクレオチドの存在下において、電気泳動移動度シフトアッセイに供した。競合のために用いたオリゴヌクレオチドは、β−カゼインプロモータエレメント（β −ｃａｓ）、β−カゼインプロモータエレメントの変異型（ｍｕｔβ−ｃａｓ）、ＡＰ−１コンセンサス結合部位（ＡＰ−１）およびヘモポエチン受容体応答エレメント（ＨＲＲＥ）であった。図６Ａは、Ｙ４２１Ａのβｃが、ＧＭ−ＣＳＦ刺激に応答して、強度が弱められたＳＴＡＴ５−Ｌを活性化することを示す図面である。サイトカイン誘導ＳＴＡＴ５−Ｌ活性の容量−反応実験は、α鎖および野生型βｃ（〇）またはＹ４２１Ａ（●）のいずれかの形質導入Ｊｕｒｃａｔ細胞を用いて行われた。ＳＴＡＴ５−Ｌ活性は、ＳＴＡＴ５特異的プローブを用いた、電気泳動移動度シフトアッセイにより決定し、そして引き続いてリン光体画像解析により定量した。結果は、バックグラウンドおよびタンパク質濃度に対して修正をした後に得られた最大活性に対する割合として表す。図６Ｂは、Ｙ４２１Ａのβｃが、ＩＬ−３刺激に応答して、強度が弱められたＳＴＡＴ５−Ｌを活性化することを示す図面である。実験および手順は図６Ａに示したものと同一である。図７は、βｃの推定Ｂ’−Ｃ’ループおよびＦ’−Ｇ’ループの間の空間的配列のモデル、およびＧＨ−ＧＨＲ結晶構造に基づくＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５の第一αヘリックスのモデルである。βｃのＴｙｒ³⁶⁵およびＴｙｒ⁴²¹、および空間充填のための図面中に示されたＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５の保存されたＧｌｕを有する、βｃの膜近位ドメイン（ＣＲＭ２）およびＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３またはＩＬ−５の第一αヘリックス（ヘリックスＡ）のみを示す。実施例の詳細な説明実施例１βｃサブユニット結合中のＴｙｒ⁴²¹の効力の実証ヒトβ鎖中の推定ループの変異誘発の合理性本発明者が変異誘発の標的としたβｃの領域は、サイトカイン受容体スーパーファミリー全体を通じて保存を示す領域：Ｘは最も一般的には脂肪族残基を示す以前に記載した（Patthy 1990）ＶＲＸＲコンセンサス、およびWSXWSモチーフ（ Cosman他、1990；Bazan 1990)に隣接している(図１)。WSXWSモチーフはこの受容体ファミリーの特徴的特徴として長い間認識されており、受容体機能におけるその役割の理解に幾つかの研究が向けられている（Miyazaki他、1991；Yoshimura 他、1992;Quelle他、1992;Rozakis-Adcock及びKelly1992;Baumgartner他、1994 ）。ＧＨ−ＧＨＲ結晶構造（De Vos他、1992）およびより最近になってプロラクチン受容体に結合したＧＨの結晶構造（Somers他、1994）は本発明者に一般のサイトカイン受容体中のＶＲＸＲ−ＷＳＸＷＳ領域の構造への洞察を与えるものである。関与する２つのβ鎖は精巧に相互作用して、塩基性側鎖の疎水性部分によって差し込まれた多数の芳香族側鎖を形成し、その結果、これら２つのモチーフを分離するアミノ酸はループを形成する。このループ中の残基は両方の解明した受容体中のリガンド結合複合体において溶媒接近不能である（DeVos他、1992；S omers他、1994）。従って、本発明者は注意をβｃの膜近位サイトカイン受容体モジュール（CRM）中の類似のF’-G’ループ領域に集中させて、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５結合におけるその役割を調べた。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５高親和性結合に関与する領域の同定高親和性受容体複合体形成におけるβｃの推定F’-G’ループの関与の可能性を調べるために、その領域を残基４１８−４２２を通過するアラニンの置換によって破壊した（図1）。このｎ−アラニン置換変異体βｃ（⁴¹⁸ＡＡＡＡＡ⁴²²）が高親和性リガンド結合を支持する能力を、ＣＯＳ細胞上でそれをＧＭ−ＣＳＦＲおよびＩＬ−３Ｒのα鎖の両方と同時発現し、放射リガンド飽和結合試験を行うことによって試験した。通常通り、ＣＯＳ細胞を両方のα鎖ｃＤＮＡと変異βｃｃＤＮＡと一緒にエレクトロポレーションし、同一のトランスフェクション体をＧＭ −ＣＳＦおよびＩＬ−３結合の両方に関して分析できるようにした。トランスフェクションしたβｃが存在しない場合、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＩＬ−３Ｒα鎖でトランスフェクションしたＣＯＳ細胞は、低い親和性でのみＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３と結合した（表2）。野生型βｃの同時発現はＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ −３に対する高い親和性結合を付与したが、α鎖はβｃの過剰下で発現したので、低親和性結合は依然として、対応するScatchardプロットの曲直線によって表されるように存在していた（図2、表2）。変異ペンタ−アラニンβｃ（⁴¹⁸ＡＡＡＡＡ⁴²²）ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３Ｒα鎖でトランスフェクションしたCOS 細胞は、野生型のトランスフェクション体と匹敵する全ての受容体鎖の細胞表面発現を示したが（表2）、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の高親和性結合は示さなかった（図2、表2）。これは、βｃ中の領域４１８−４２２の置換が、高親和性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３結合を支持するβｃの能力に干渉したことを示し、この領域の残基がリガンド相互作用に関与していることを示唆している。Ｔｙｒ⁴²¹ はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合に必要かつ十分である。高親和性ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５結合に対するβｃの残基４１８−４２２の個々の寄与を調べるために、この領域中の各残基を別々にアラニンで置換した（図１）。上記の通り、高親和性リガンド結合を仲介する個々の変異体の能力は、ＧＭ−ＣＳＦＲおよびＩＬ−３Ｒのα鎖と一緒に変異βｃを発現するＣＯＳ細胞の放射リガンド飽和結合試験を行うことによって測定した。結果は、全てのアラニン置換変異体が野生型βｃと同様に細胞表面に発現し（表２）、残基Ｔｈｒ⁴¹⁹、Ｇｌｕ⁴²⁰およびＡｓｎ⁴²²のアラニン置換は高親和性リガンド結合に影響しないことを示した（図３、表２）。Ａｒｇ⁴¹⁸のアラニン置換は、ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３高親和性結合を２から３倍減少させたが、これは比較的弱い効果である（表２）。しかしながら、興味深いことに、Ｔｙｒ⁴²¹のアラニン置換は、ＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３のいずれかの高親和性結合を支持できないβｃ変異体を生成した（図２、表２）。高親和性ＩＬ−５結合に対するこの変異の影響もＣＯＳ細胞を変異Ｙ４２１ＡβｃでＩＬ５Ｒα鎖と一緒にトランスフェクトすることによって測定した。放射ヨウ素化したＩＬ−５で得られた飽和結合データは、Scatchard分析で単一のクラスの受容体を示した。βｃはＩＬ −３およびＧＭ−ＣＳＦに対してＩＬ−５結合の親和性変換に弱い影響を有するけれども、変異Ｙ４２１Ａβｃによる試験では、高親和性ＩＬ−５結合の損失と釣り合った親和性の損失を示した（表２）。これは、Ｔｙｒ⁴²¹がＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合を支持する際に同様の役割を有することを示す。高親和性ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５結合にとって重要であるβｃの膜近位ＣＲＭの予測されたループ中の単一の残基の同定は、ループのコンテキスト中でこの残基単独で高親和性結合を支持するのに十分であるという可能性を生じさせた。この知見を試験するために、本発明者はポリアラニン置換したβｃ変異体（⁴¹⁸ＡＡＡＹＡ⁴²²）中にチロシン残基を再導入した（図１）。意外なことに、この変異体も、野生型ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ−３高親和性結合に対して３倍減少した親和性であるにもかかわらず、高親和性ＧＭ−ＣＳＦおよびＩＬ− ３結合（図４）を支持することができた（表２）。この変異体はまた、ＩＬ−５に対する高親和性結合を回復した（表２）。これらの知見は、Ｔｙｒ⁴²¹に隣接する残基がリガンド相互作用において直接的な役割を果たしていないことを示しており、ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合における鍵となる残基としてＴｙｒ⁴²¹を示唆している。Ｔｙｒ⁴²¹の置換は機能的受容体活性化を破壊するアラニンの代わりにβｃのＴｙｒ⁴²¹を代用することの機能的な意義を調べるために、本発明者は、転写のシグナル伝達物質および活性化物質（ＳＴＡＴ）の誘導を測定した。ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５とそれらの高親和性受容体との再現的相互作用により、βｃにより仲介されるシグナル伝達が導かれる（Kitamura他、1991b;Kitamura他1992;Takaki他、1993）。βｃによるシグナリングはＪＡＫ２タンパク質−チロシンキナーゼを活性化し（Silvennoinen他、19 93；Quelle他、1994）、続いて転写因予ＳＴＡＴ５が急速にリン酸化されて核中のそのＤＮＡ結合部位に結合できるようになる（Mui他、1995;Aza・他、1995；G ouilleux他、1995;Pallard他、1995）ことが十分に文献に記載されている。従って、ＳＴＡＴ５活性化はβｃ仲介受容体シグナリングに対する比較的迅速な応答を示す。ＳＴＡＴ５は、骨髄性およびリンパ性の系統の細胞株を含む多くの造血細胞株で記載されている（Mui他、1995;Azam他、1995;Gouilleux他、1995;Palla rd他、1995）。予備実験で、本発明者は野生型βｃと一緒にＧＭ−ＣＳＦR、ＩＬ−３RおよびＩＬ−５R受容体α鎖でトランスフェクトしたJurkatＴ細胞を調べた。電気泳動移動度シフトアッセイにおいてＳＴＡＴ５結合コンセンサス配列（ＴＴＣ−Ｎ₃−ＧＡＡ）を含むオリゴヌクレオチドプローブを妨害するサイトカイン誘導性核ＤＮＡ結合タンパク質が検出された。このＤＮＡ結合タンパク質は、α鎖をトランスフェクションした細胞中でのサイトカイン処理後に誘導可能であったが、βｃの不在下では不可能であり、βｃがこのリガンド誘導されたプロセスを仲介することが示される（図５Ａ）。未標識プローブおよび関連造血タンパク質受容体応答要素（ＨＲＲＥ）（Morella他、1995）は共に、放射標識した β−カゼインプロモータープローブに対する結合に競合し、これらは共にＳＴＡＴ５結合コンセンサス配列を含む。しかしながら、ＳＴＡＴ５結合コンセンサス中に変異を含有する変異体β−カゼインプロモータープローブおよび標準的なＡＰ−１部位プローブは結合に競合しなかった（図5Ｂ）。この理由のために、本発明者はこのタンパク質をＳＴＡＴ５−様(ＳＴＡＴ５−Ｌ)と称するが、それはＳＴＡＴ５と同様の様式で挙動するけれども、その本当の同定はなされていない。ＳＴＡＴ５−Ｌタンパク質を活性化する変異体受容体の能力は、Jurkat細胞を変異体βｃおよびＧＭ−ＣＳＦＲまたはＩＬ−３Ｒα鎖ｃＤＮＡｓで同時トランスフェクトすることによって測定した。受容体サブユニットの細胞表面発現は鎖特異的抗体を使用するフローサイトメトリーによって確認し、変異体および野生型βｃの発現は匹敵することが判明した（データは示さず）。トランスフェクション体は一定範囲の濃度のＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の何れかで刺激して、核抽出物を調製した。ＳＴＡＴ５−Ｌタンパク質の誘導は、プローブとしてβ−カゼインプロモーター由来の標準的ＳＴＡＴ５ＤＮＡ結合部位を使用して電気泳動移動度シフトアッセイ（ＥＭＳＡ）によって測定した。ＳＴＡＴ５−Ｌは適当な α鎖および野生型βｃの存在下で用量依存形式でＧＭ−ＣＳＦまたはＩＬ−３の何れかとの応答において活性化された（図6Ａおよび図6Ｂ）。Ｔｙｒ⁴²¹のアラニン置換は、効力が約１００−１０００倍減少したＧＭ−ＣＳＦへの応答におけるＳＴＡＴ５−Ｌ活性化を支持するβｃを産生した（図６Ａ）。この変異体βｃによるＧＭ−ＣＳＦ応答性のこの減少は、Ｔｙｒ⁴²¹がＧＭ−ＣＳＦ誘導受容体活性化で役割を担っていることを示す。重要なことに、Ｙ４２１Ａβｃは、非常に低レベルの検出可能なＳＴＡＴ５−Ｌのみを産生するＩＬ−３誘導ＳＴＡＴ５ −Ｌ活性化に対してより大きな影響を有し、３μＭのＩＬ−３でさえ、最大活性化の半分は得られなかった。これは、チロシン残基もＩＬ−３とβｃとの相互作用にとって決定的であることを示唆する。実施例２抗体アンタゴニストの生成 βｃまたはF’−G’ループを含むβｃのフラグメントまたはF’−G’配列を含むペプチドで免疫化することによって、モノクローナル抗体を作成することができる。特異性対照がF’−G’ループへの特異的結合を実証する後に、抗体をＧＭ −ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の高親和性結合のブロック並びに作用のＧＭ −ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５刺激のブロックについて選択することができる。好適なモノクローナル抗体を一度同定し、ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５の高親和性結合および作用をブロックすることが示されれば、より小さいフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ）₂、Ｆａｂおよび最終的にはＦｖを作成することができる。分子生物学的技法を利用することによって、単一鎖Ｆｖフラグメントを構築することができる（Ｈｖ−Ｌｖ）。これは阻害性ペプチドであろう。実施例３ペプチドアンタゴニストの生成 βｃのF’−G’ループとのサイトカイン相互作用をブロックするF’−G’ループと同様の配列の短いペプチドを合成することができる。その逆も可能である。ＧＭ−ＣＳＦ／ＩＬ−３／ＩＬ−５のらせんＡと同様の配列の短いペプチド（これはF’−G’ループと相互作用することが予測されるサイトカイン中の領域である）も、サイトカイン相互作用をブロックできる。実施例４オリゴヌクレオチドアンタゴニストの生成ランダムに合成したオリゴヌクレオチドの多量のプールを固体マトリックス上に固定化したF’−G’ペプチドを通過させることができる（Bock他、1992、この文献は本明細書中に取り込まれる）。洗浄後、強く結合するオリゴヌクレオチドは残り、次いで異なる条件下で（塩、ｐＨ等）溶出させることができる。次いで、配列をPCRによって決定して、本物の細胞系でのβｃ仲介作用の阻害について試験することができる。実施例５βｃおよびｇｐ１３０のＦ−Ｇループのアミノ酸の整列 βｃとｇｐ１３０の整列は公開されている。ｇｐ１３０とβｃは、大部分のサイトカイン受容体の特徴的特徴であるフィブロネクチンIII型ドメインに関連するドメインを含む。ｇｐ１３０はこれらのドメイン６個を有し、βｃはこれらのドメイン４個を有する。各ドメインはそれ自身のＦ−Ｇループを含有し、従ってｇｐ１３０は６個を有し、βｃは４個を有する。これらのＦ−Ｇループの１個のみが、本発明が関与する限り重要なものである。重要なドメインは、ｉ）Ｃｙｓ残基の保存されたパターン、ii）複数のＴｒｐ残基、iii）ＹＸＸＲＶ／ＩＲモチーフ、そしてiv）ＷＳＸＷＳモチーフ（式中、Ｘは任意のアミノ酸である）の存在によって特徴付けられる。Ｔｙｒ⁴²¹は、βｃ中の第４のドメインループのＦ−Ｇループ(F’−G’ )内に存在すると仮定される。ｇｐ１３０中の均等な機能的に重要なｔｙｒが第２のドメインのＦ−Ｇループ内に存在すると仮定される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ａ６１Ｋ 38/00 Ａ６１Ｋ 39/395 Ｕ 39/395 Ｃ０７Ｋ 14/715 Ｃ０７Ｋ 14/715 16/28 16/28 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/09 ＺＮＡＧ０１Ｎ 33/566 Ｃ１２Ｑ 1/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡＧ０１Ｎ 33/566 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者ロペス，エンジェルオーストラリア連邦サウス・オーストラリア 5000，アデレード，フローム・ロード，インスティチュート・オブ・メディカル・アンド・ヴェテリナリー・サイエンス，ディヴィジョン・オブ・ヒューマン・イムノロジー，ハンソン・センター・フォー・キャンサー・リサーチ (72)発明者バグリー，クリストファーオーストラリア連邦サウス・オーストラリア 5000，アデレード，フローム・ロード，インスティチュート・オブ・メディカル・アンド・ヴェテリナリー・サイエンス，ディヴィジョン・オブ・ヒューマン・イムノロジー，ハンソン・センター・フォー・キャンサー・リサーチ (72)発明者ウッドコック，ジョアンナオーストラリア連邦サウス・オーストラリア 5000，アデレード，フローム・ロード，インスティチュート・オブ・メディカル・アンド・ヴェテリナリー・サイエンス，ディヴィジョン・オブ・ヒューマン・イムノロジー，ハンソン・センター・フォー・キャンサー・リサーチ

Claims

【特許請求の範囲】１．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の受容体の共通のβｃ鎖のドメイン４のＦ’−Ｇ’ループまたは他のサイトカイン受容体の類似のループに結合できる治療剤であって、その治療剤の結合が各々のサイトカインまたはサイトカインの一つに対してアンタゴニストまたはアゴニスト作用を有する、治療剤。２．サイトカイン受容体が共通のシグナル伝達容体である、請求項１に記載の治療剤。３．共通のシグナル伝達受容体が、βｃ、ｇｐ１３０、ＬＩＦＲ、ＩＬ−２Ｒ βＩＬ−２Ｒγ、およびＩＬ−４Ｒ／ＩＬ−１３Ｒを含む群から選択される、請求項２に記載の治療剤。４．共通のシグナル伝達受容体がβｃである、請求項２に記載の治療剤。５．治療剤が上記共通のシグナル伝達受容体に結合する全ての各サイトカインに対してアンタゴニストまたはアゴニスト作用を有する、請求項２に記載の治療剤。６．共通のβｃ鎖の上記Ｆ’−Ｇ’ループのＴｙｒ⁴²¹とＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ −３およびＩＬ−５の何れか１つの間の結合を阻害できる請求項４に記載の治療剤。７．共通のβｃ鎖の上記Ｆ’−Ｇ’ループのＴｙｒ⁴²¹とＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ −３およびＩＬ−５の全ての間の結合を阻害できる請求項４に記載の治療剤。８．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の受容体の共通のβｃ鎖の上記Ｆ ’−Ｇ’ループのＴｙｒ⁴²¹に結合できる請求項６に記載の治療剤。９．Ｆ’−Ｇ’ループが疎水性アミノ酸を含む、請求項１に記載の治療剤。１０．疎水性アミノ酸がチロシンである、請求項９に記載の治療剤。１１．サイトカイン受容体が、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＩＬ−３Ｒα 、ＥＰＯＲ、ＴＰＯＲ、ＯＢＲを含む群から選択される、請求項９に治療剤。１２．サイトカイン受容体が、ＧＭ−ＣＳＦＲα、ＩＬ−５Ｒα、ＩＬ−３Ｒα を含む群から選択される、請求項９に治療剤。１３．各々のサイトカイン受容体の表３に示した各々の芳香族疎水性アミノ酸へのいずれか１つのサイトカインの結合を阻害できる、請求項９に記載の治療剤。１４．サイトカイン受容体がシグナリング受容体である、請求項１に記載の治療剤。１５．シグナリング受容体が単一のサイトカインに特異的である、請求項１４に記載の治療剤。１６．シグナリング受容体がＥＰＯＲ、ＴＰＯＲおよびＯＢＲを含む群から選択される、請求項１４に記載の治療剤。１７．各々のサイトカイン受容体分子の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む群から選択される配列に結合でき、それによってそれに結合できる対応するサイトカインのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、治療剤。１８．各々のサイトカイン受容体分子の配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号１２を含む群から選択される配列に結合でき、それによってそれに結合できる対応するサイトカインのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、治療剤。１９．各々のサイトカイン受容体分子の配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む群から選択される配列に結合でき、それによってそれに結合できる対応するサイトカインのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、治療剤。２０．各々のサイトカイン受容体分子の配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含む群から選択される配列に結合でき、それによってそれに結合できる対応するサイトカインのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、治療剤。２１．βｃ受容体分子の配列番号１の配列に結合でき、それによってＩＬ−３、ＩＬ−５およびＧＭ−ＣＳＦのアンタゴニストまたはアゴニストとして作用する、治療剤。２２．対応するサイトカインのアンタゴニストである、前記請求項のいずれか１項に記載の治療剤。２３．対応するサイトカインのアゴニストである、請求項１から２１のいずれか１項に記載の治療剤。２４．抗体またはそのフラグメント、ペプチド、オリゴ糖類、オリゴヌクレオチド並びに有機及び無機化合物を含む群から選択される、前記請求項の何れか１項に記載の治療剤。２５．ＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−３およびＩＬ−５の受容体の共通のβｃ鎖のドメイン４のＦ’−Ｇ’ループまたは別のサイトカイン受容体の類似のループに結合できる治療剤を単離する方法であって、上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程を含む方法。２６．上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、配列番号１０、配列番号１１および配列番号１２を含む群から選択される配列に結合する能力についてスクリーニングすることを含む、請求項２５に記載の治療剤の単離方法。２７．上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程が、配列番号１、配列番号２、配列番号３、配列番号４、配列番号５および配列番号１２を含む群から選択される配列に結合する能力についてスクリーニングすることを含む、請求項２５に記載の治療剤の単離方法。２８．上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程が、配列番号６、配列番号７および配列番号８を含む群から選択される配列に結合する能力についてスクリーニングすることを含む、請求項２５に記載の治療剤の単離方法。２９．上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程が、配列番号９、配列番号１０および配列番号１１を含む群から選択される配列に結合する能力についてスクリーニングすることを含む、請求項２５に記載の治療剤の単離方法。３０．上記ループへの結合能力について候補分子をスクリーニングする工程が、配列番号１の配列に結合する能力についてスクリーニングすることを含む、請求項２５に記載の治療剤の単離方法。３１．治療剤が抗体またはそのフラグメントであり、該方法がさらに、動物にＦ’−Ｇ’ループを有するペプチド分子を接種し、抗体産生細胞とミエローマ細胞株とを融合し、上記Ｆ’−Ｇ’ループと反応性を有する抗体を産生する細胞株をスクリーニングし、上記細胞株からの抗体を回収し、高親和性結合の阻害について試験し、そして作用の阻害または刺激について試験することを含む方法。３２．該方法がさらに、上記ループに結合できる上記細胞株によって産生される抗体の小さなフラグメントを作製することを含む、請求項３１に記載の治療剤の単離方法。３３．細胞株がマウス細胞株であり、該方法が、非結合領域中でマウス配列をヒト配列に置き換えることによって該抗体フラグメントをヒト化する工程を含む、請求項３１に記載の治療剤の単離方法。