DE69728529T2

DE69728529T2 - Cytokinantagonisten und -agonisten

Info

Publication number: DE69728529T2
Application number: DE69728529T
Authority: DE
Inventors: Angel Lopez; Christopher Bagley; Joanna Woodcock
Original assignee: Medvet Science Pty Ltd
Current assignee: Medvet Science Pty Ltd
Priority date: 1996-01-30
Filing date: 1997-01-29
Publication date: 2005-04-14
Anticipated expiration: 2017-01-30
Also published as: EP0889905A4; EP0889905A1; DE69728529D1; USRE39433E1; AUPN780096A0; EP0889905B1; US6200567B1; EP1386933A1; JP2000505420A; WO1997028190A1; ATE263783T1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft Verfahren zur Isolation von Antagonisten und Agonisten von Cytokinen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Der humane Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierende Faktor (GM-CSF), die Interleukine IL-3 und IL-5 sind Cytokine, die beim hämopoietischen Zellüberleben, bei der Herstellung und Funktion (als Übersicht in Lopez et al., 1992) beteiligt sind. Wegen dieser Eigenschaften werden IL-3 und GM-CSF gegenwärtig klinisch für die Knochenmarkserneuerung nach einer Chemotherapie und Radiotherapie (Groopman et al., 1987) verwendet. Allerdings ist ebenfalls offensichtlich geworden, dass eine übermäßige oder gegen die Regeln verstoßende Produktion von GM-CSF, IL-3 und IL-5 zu Krankheitszuständen führen kann. Beispielsweise sind erhöhte Mengen an GM-CSF in den Lungen von allergischen Individuen (Kato et al., 1992) und in den Gelenken von Patienten mit rheumatoider Arthritis (Williamson et al., 1988) gefunden worden. Erhöhte mRNA für IL-3, GM-CSF und IL-5 sind in der Haut von allergischen Individuen (Kay et al., 1991) gefunden worden. GM-CSF kann die Proliferation von Leukämiezellen (Young et al., 1986) stimulieren, und es ist gezeigt worden, dass IL-3 durch Follikel-B-Zellen-Lymphomas in autokriner Weise produziert wird, was zu einer Proliferation dieser Zellen in einer IL-3-abhängigen Weise (Clayberger et al., 1991) führt.
Es ist aus diesen klinischen Situationen deutlich, dass die Antagonisierung von GM-CSF, IL-3 und IL-5 von therapeutischem Wert sein kann, in Abhängigkeit der in Frage stehenden Erkrankung, wobei die Antagonisierung eines dieser Cytokine ausreichend sein kann.
Eine Zahl von Vorschlägen für Antagonisten ist bereits gemacht worden, beispielsweise in der Spezifikation WO 89 10403, und in der Spezifikation WO 95 04075 sind Varianten von GPM-CSF als Antagonisten zur GM-CSF-Wirkung identifiziert, allerdings gibt es keinen Hinweis darauf, dass diese Antagonisten für mehr als nur die GM-CSF-Wirkung effektiv sind.
Allerdings kann in anderen Situationen der simultane Antagonismus von allen drei GM-CSF, IL-3 und IL-5 erwünscht oder tatsächlich notwendig sein. Beispielsweise können Eosinophile, die der Hauptzelltyp, der bei Allergien beteiligt ist, sein sollen, zahlenmäßig erhalten werden und durch entweder IL-3, GM-CSF oder IL-5 (Lopez et al., 1989) stimuliert werden. Der Antagonismus aller drei Cytokine kann daher notwendig sein, um die Wirkungen von Eosinophilen und Basophilen zu inhibieren. In ähnlicher Weise können Basophile, von denen man ebenfalls annimmt, dass sie eine Effektorrolle bei der Allergie spielen, durch entweder IL-3, GM-CSF oder IL-5 (Lopez et al., 1990) stimuliert werden. Der Antagonismus von GM-CSF, IL-3 und IL-3 kann durch die gleichzeitige Verabreichung spezifischer Antagonisten für jedes verschiedene Cytokin bewerkstelligt werden. Obwohl dieses machbar ist, hat dieser Lösungsansatz den Nachteil, dass man bis zu drei verschiedene Proteine verabreichen muss, was nicht nur unbequem ist, sondern allerdings auch das Risiko der Immogenizität und anderen Nebeneffekten erhöht.
Ein Krankheitszustand, der hier herausragt und der durch erhöhte Gehalte dieser drei Cytokine bekämpft werden kann, ist das Asthma. Die Rollen vom GM-CSF, IL-3 und IL-5 bei Asthma und Allergien sind bereits intensiv untersucht worden und werden weiterhin intensiv untersucht. Verschiedene Studien, durch in situ Hybridisierung, haben erhöhte Gehalte von IL-5-mRNA in mononuklearen Lungenzellen (Fukuda et al., 1994; Robinson et al., 1992; Marini et al., 1992; Hamid et al., 1991) und in Eosinophilen (Broide et al., 1992) bei astmatischen Patienten gezeigt. Die Immunchemie hat ebenfalls erhöhte Mengen an IL-5 Protein in diesen Geweben (Ackerman et al., 1994) gezeigt. Bei Allergen induzierten Hautreaktionen in der späten Phase bei atopischen Individuen, ist erhöhte mRNA für IL-5, IL-3 und GM-CSF verzeichnet worden (Kay et al., 1991).
Bronchoalveolare Spüllflüssigkeiten (BAL) von symptomatischen Asthmapatienten zeigten größere IL-5-Gehalte als Patienten mit symptomatischen Asthma (Sur et al., 1995). Wenn weiterhin symptomatische Asthmapatienten mit einem Antigen in einem Lungensegment angegriffen wurden, verzeichnete man signifikante Gehalte von IL-5 (980 pg/ml) im Vergleich mit einem fingiert angegriffenen Segment des gleichen Patienten (2,8 pg/ml) (Sur et al., 1995). In einer anderen Studie mit ähnlichem Muster erhöhten sich die IL-5-Gehalte von nicht nachweisbar bis 2.800 pg/ml bei sowohl allergischen als auch nicht allergischen Asthmatikern (Zangrilli et al., 1995). Ein kausaler Zusammenhang zwischen den IL-5-Mengen und Asthma leitet sich aus Studien her, wobei die Behandlung von mittelschwerkranken asthmatischen Patienten mit Corticosteroiden für zwei Wochen zu einer Reduktion der Anzahl der Zellen, die IL-5-mRNA (Bentley et al., 1996) exprimieren, führte. Diese Reduktion korrelierte mit der klinischen Verbesserung und ebenfalls mit dem Verlust von CD3⁺-T-Zellen und aktivierten (EG2⁺)-Eosinophilen.
GM-CSF ist ebenfalls in den Lungen von Asthmatikern nachgewiesen worden. Tatsächlich schien in einer Studie von Sputum-Cytokinen GM-CSF einen dominanten Effekt auf das Überleben von Eosinophilen zu haben (Adachi et al., 1995).
IL-5 aktiviert ebenfalls Eosinophile, um das EG2-Epitop zu exprimieren. In einigen Studien waren erhöhte IL-5-Gehalte mit EG2⁺-Eosinophilen in der Lunge assoziiert (Fukuda et al., 1994; Bentley et al., 1996). Des Weiteren gibt es eine Evidenz der gewebespezifischen Aktivierung von Eosinophilen. In einem Experiment wurde die Aktivierung von Eosinophilen in der Lunge mit denjenigen im Blut des gleichen Patienten verglichen. Die Aktivierung wurde durch die Zelloberflächenexpression von CR-3, p150/95, CD67, CD63 und den Verlust von L-Selektin festgestellt. Bei Patienten, die mit dem endobronchialen Antigen angegriffen wurden, wurden sowohl periphere Eosinophile als auch Lungeneosinophile bei 24 h gesehen, jedoch haben nur die Lungeneosinophile erhöhte Werte von GM-CSF-mRNA, was eine lokale Aktivierung dieser Zellen nahe legt. Außerdem gab es eine Evidenz für die Aktivierung von Eosinophilen in der Lunge, allerdings nicht von denen aus Blut. Dieses Ergebnis stimmt mit einem spezifischen Effekt von IL-5 auf Lungen auf Eosinophile und ihre Beteiligung bei Asthma überein.
Tiermodelle legen ebenfalls eine Rolle für IL-5 bei Asthma nahe. Die am meisten signifikanten Daten gibt es mit einem Antikörper (TRFK-5), gegen IL-5 in Affenmodellen von Asthma (Mauser et al., 1995). Ascaris-empfindliche Cynomolgusaffen wurden mit aerosolisierten Ascaris suum Extrakten angegriffen. 0,3 mg/kg TRFK beseitigte die erhöhte Luftwegreaktivität und verminderte die Zahl der Eosinophile in den BAL-Flüssigkeiten. Interessanterweise hielt diese Inhibierung für 3 Monate an (Mauser et al., 1995). Studien mit dem Guineaschwein haben diese Schlussfolgerung unterstützt (Mauser et al., 1993). Weiterhin hatten Mäuse, bei denen das IL-5-Gen genetisch entfernt war, nicht nur nicht nachweisbares IL-5 und eine signifikante Reduktion der Anzahl der Eosinophile, sondern sie entwickelten ebenfalls signifikant weniger schweres Asthma (wie durch Luftwegehyperreaktivität und Lungenschädigung festgestellt wurde) als IL-5-Gen positive Artgenossen (Foster et al., 1996). Ein deutliches Beispiel für die Wiederherstellung von Luftwegereaktionen gegenüber Methacholin wurde verzeichnet, nachdem IL-5-defiziente Mäuse IL-5-exprimierenden, allerdings nicht kontrollierenden, Vaccinvirusinfektionen ausgesetzt wurden (Foster et al., 1996).
Eine mögliche Rolle für das GM-SCF beim Asthma ist ebenfalls durch die Überexpression von GM-CSF in der Rattenlunge, was zu Eosinophilie, Makrophagengranulomae und fibrotischer Reaktion führt, ein Dreierelement, das ebenfalls bei Asthma verzeichnet wird, nahegelegt worden (Xing et al., 1996).
Humanes Interleukin (IL)-3, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie stimulierender Faktor (GM-CSF) und IL-5 üben ihren biologischen Effekt dadurch aus, dass sie an spezifische Oberflächenrezeptoren auf der Oberfläche von Zellen (Bagley et al., 1995; Elliott et al., 1989; Park et al., 1989; Lopez et al., 1991) binden. Die Rezeptoren sind Heterodimere, die eine α-Kette, die für jeden Liganden spezifisch ist, und eine β-Kette (β_c), die zwischen den drei Rezeptoren geteilt wird, umfasst (Lopez, et al., 1992), Kitamura et al., 1991). Während jeder Ligand an die jeweilige α-Kette bindet, gibt es für β_c eine höhere Affinität, was eine Signalgebung ermöglicht (Miyajima et al., 1992 und US-Patent 5112961 von Hayashida et al.). Die Erfinder des US-Patents Nr. 5112961 legen nahe, dass der Rezeptor hoher Affinität ein wertvolles Werkzeug dafür ist, Kandidaten für GM-CF-Agonisten und Antagonisten zu screenen.
Weil alle drei dieser Cytokine über eine gemeinsame Rezeptoruntereinheit (β_c) agieren, was wir hierzu vor als Hypothese aufgestellt haben (Bagley et al., 1995 diese Referenz ist hiermit eingeschlossen), kann es möglich sein, die Wirkung von GM-CSF, IL-3 und IL-5 mit einer einzigen Verbindung zu inhibieren. Es gibt allerdings bisher noch kein Mittel, sich dem Problem des Findens eines Effektors anzunähern, der in koordinativer Weise auf alle drei Cytonkine wirkt. Es ist beispielsweise nicht klar, welche Region der gemeinsamen Rezeptoruntereinheit (β_c) durch diese Cytokine gebunden wird und ob die gleiche Region für alle drei Cytokine bindet oder ob drei verschiedene Regionen beteiligt sind.
Die Analyse von β_c hat gezeigt, dass sie vier extrazelluläre Domänen (Goodall et al., 1993) enthält, mit einer Domäne 1, die das meiste der N-terminalen Domäne darstellt und einer Domäne 4, die das meiste der membrannahen Domäne repräsentiert. Jede Domäne besteht aus sieben β-Strängen, die zusammen durch ineinander verschlungenen Schleifen verknüpft sind. Die hier interessierende Schleife, die F'-G'-Schleife befindet sich in der Domäne 4 von β_c. Die hier interessierenden Reste werden vom N-Terminus am Primärtranslationsterminus mit dem Initiationsmethionin, das Met^I ist, nummeriert.
Die molekulare Basis für die Affinitätsumwandlung von β_c an jeden Liganden ist noch nicht vollständig verstanden, weil der Liganden-Rezeptor-Komplex noch nicht kristallisiert worden ist. Allerdings ist es wahrscheinlich, durch Analogie zur Wechselwirkung des Wachstumshormons (GH) mit seinem homodimären Rezeptor (DeVos et al., 1992), dass es eine direkte Wechselwirkung zwischen dem Liganden und den Rezeptor- α- und β-Ketten gibt. In dem GH : GH-Rezeptorsystem sind die Kontaktpunkte zwischen GH und GHbp2 aus der Röntgenstrahlkristallographie des GH : GHhp1 und 2-Komplexes (DeVos et al., 1992) bestimmt worden. Durch Analogie mit diesem System haben wir (Woodcock et al., 1994) und andere (Lock et al., 1994) kürzlich gezeigt, dass die B'-C'-Schleife von β_c eine gewisse Rolle bei der hohen Affinitätsbindung von GM-CSF, IL-3 und IL-5 spielt. Insbesondere ist gezeigt worden, dass drei Reste, Tyr³⁶⁵, His³⁶⁷ und Ile³⁶⁸ wichtig für die GM-CSF- und IL-5-Hochaffinitätsbindung sind, wobei sie allerdings nur marginal an der IL-3-Hochaffinitätsbindung beteiligt sind (Woodcock et al., 1994). Diese Ergebnisse implizieren, dass ein gezieltes Zusammenspiel dieser drei Aminosäuren mit geeigneten Verbindungen die GM-CSF- und IL-5-vermittelte Aktivität, allerdings nicht die IL-3-vermittelte Aktivität, beeinflussen kann.
Zusammenfassung der Erfindung
Unter Verwendung molekularer Gestaltungstechniken haben wir kürzlich postuliert, dass die F'-G'-Schleife bei der Ligandenbindung (Bagley et al., 1995) beteiligt sein kann. Die Erfindung ist aus einer Untersuchung über diese vorausgesagte F'-G'-Schleife von β_c und aus der Feststellung, dass diese Schleife wesentlich für die Hochaffinitätsbindung und für die Signalgebung aller drei Cytokine GM-CSF, IL-3 und Il-5 ist, entstanden.
Ein weiterer Aspekt dieser Erfindung ist als Ergebnis der überraschenden Identifikation einer einzelnen Aminosäure in der Rezeptor-β_c-Kette für GM-CSF, IL-3 und IL-5 entstanden, die notwendig für die Hochaffinitätsbindung aller dieser drei Liganden an ihre Oberflächenrezeptoren und für die Signalgebung und für die Tatsache, dass alle drei dieser Cytokine die F'-G'-Schleife für die Hochaffinitätsumwandlung benötigen, ist. Es wird angenommen, dass Verbindungen, die an Tyr⁴²¹ binden oder die Bindung des Liganden an Tyr⁴²¹ inhibieren, sich wie generische Antagonisten von IL-3, GM-CSF und IL-5 verhalten. Es wird angenommen, dass Verbindungen, die an F'-G'-Schleife binden, sterisch diese Bindung inhibieren.
Zusätzlich haben möglicherweise diese Feststellungen auch Einflüsse auf andere Mitglieder der Cytokinrezeptorsuperfamilie, einige davon teilen sich Untereinheiten in einer gegeben Subfamilie (das heißt, sie binden einige Cytokine), und einige davon sind Liganden spezifisch und binden an nur ein Cytokin. Die Rezeptor-α-Ketten für GM-CSF, IL-3 und IL-5 und β_c gehören zu der sich schnell vergrößernden Cytokinrezeptorsuperfamilie. Innerhalb dieser Superfamilie haben sich mittlerweile verschiedene Subfamilien hervorgetan, die sich durch das Teilen einer gemeinsamen Rezeptoruntereinheit durch multiple Liganden auszeichnen: gp130 wirkt als Affinitätsumwandler und Signalumwandler für IL-6 (Hibi et al., 1990; Taga et al., 1992), IL-11 (Hilton et al., 1994), Oncostatin M (Liu et al., 1992), ziliarer neutrophischer Faktor, Leukämieinhibierungsfaktor (LIF) (Ip et al., 1992) und Cardiotrophin-1 (Pennica et al., 1995); der LIF-Rezeptor (LIFR) bindet ebenfalls an den ziliaren neutrophischen Faktor (Davis et al., 1993), Cardiotrophin-1 (Pennica et al., 1995) und Oncostatin M zusätzlich zu LIF (Gearing et al., 1994); IL-2R β unterstützt die Affinitätsumwandlung und die Signalgebung von IL-2 und IL-15 (Giri et al., 1994); die IL-2R γ-Kettenaffinität wandelt IL-2 (Takeshita et al., 1992), IL-4 (Russell et al., 1993), IL-7 (Noguchi et al., 1993), IL-9 (Kimura et al., 1995) und IL-15 (Giri et al., 1994) um; die Evidenz legt ebenfalls nahe, dass IL-4 und IL-13 eine Rezeptorkomponente teilen (Zurawski et al., 1993) und diese Untereinheit ist erst kürzlich kloniert worden (Hilton et al., 1996). Es ist nicht bekannt, welche Reste in gp130, LIFR und den IL-2R β- und γ-Ketten für die Ligandenbindung wichtig sind oder welche verschiedenen Liganden tatsächlich einmalige Sets von Bindungsdeterminanten auf diesen gemeinsamen Rezeptoruntereinheiten teilen oder besitzen. Da diese gemeinsamen Untereinheiten für die Übertragung von Signalen durch verschiedene Liganden wichtig sind, tritt die Möglichkeit zutage, dass ein Eingreifen in die Fähigkeit dieser gemeinsamen Untereinheiten, den Liganden zu binden oder Homodimere zu bilden, die Aktion von mehr als einem Liganden beeinträchtigen kann.
Ein Vergleich der vorhergesagten F'-G'-Schleife von β_c mit derjenigen von verschiedenen herkömmlichen Untereinheiten und Liganden spezifischen Rezeptoruntereinheiten haben die Gegenwart von Tyrosin und anderen ähnlichen hydrophoben Resten in diesem Bereich (Tabelle 3) gezeigt. Obwohl die genaue Länge dieser putativen Schleife zwischen 7 bis 14 Aminosäuren unter den verschiedenen Rezeptoren variiert, ist sie auf 2 streng konservierte Sequenzen eingegrenzt; der VRVR-Konsensus am N-Terminus und der WSXWS-Konsensus am C-Terminus. Es ist nahegelegt, dass, obwohl die Natur der Liganden-Rezeptor-Wechselwirkung spezifisch für das beteiligte System ist, die hydrophoben aromatischen Reste im Rezeptor starke Kandidaten für die Ligandenwechselwirkung darstellen. Daher können Mitglieder der Cytokinrezeptorfamilie ein strukturell konserviertes Rezeptorgerüst verwenden, um eine Serie von Schleifen auszubilden, die durch vornehmlich hydrophobe Wechselwirkungen die Bindung der spezifischen Liganden unterstützen. Eine Unterstützung für diese Idee stammt ebenfalls aus der Mutationsanalyse von IL-6 R, die gezeigt hat, dass eine Mutante, bei der sowohl Glu²⁹⁷ als auch Phe²⁹⁸ in der F'-G'-Schleife substituiert waren, einen Verlust der IL-6-Bindung zeigte (Yawata et al., 1993).
Eine neuere Analyse der Reste, die bei der Bindung des Wachstumshormons in GHR beteiligt sind, hat gezeigt, dass der größte Beitrag zur Affinität von hydrophoben Wechselwirkungen kommt (Clackson and Wells, 1995). Die systematische Alaninsubstitution der 33-Reste in GHR, die bekannterweise einer Zersetzung bei der Wachstumshormonbindung nicht zugänglich sind, zeigte, dass die Substitution von nur 11 dieser Reste einen signifikanten Effekt auf die Affinität hatte, und davon waren sechs hydrophob. Des Weiteren sind diese hydrophoben Reste auf der Oberfläche von GHR in einer Region geclustert, die die Grenzfläche für die Wechselwirkung mit dem Wachstumshormon bildet. Außerdem trat bei GHR die größte Affinitätsreduktion bei der Substitution von zwei Tryptophanresten auf (Clackson and Wells, 1995; Bass et al., 1991), was impliziert, dass hydrophopbe aromatische Reste sehr wichtig für die Ligandenwechselwirkung sind. Aufgrund unserer vorliegenden Studie und früheren Arbeiten (Woodstock et al., 1994) haben wir nun eine Gesamtheit von drei hydrophoben Resten in vorhergesagten Schleifen identifiziert, die eine Rolle bei der Ligandenwechselwirkung in β_c spielen, Tyr³⁶⁵, Ile³⁶⁸ und Typr⁴²¹. Daher scheint es, dass die Bindung von β_c an GM-CSF, IL-3 und Il-5 ebenfalls vornehmlich durch die hydrophobe Wechselwirkung unterstützt wird.
Es ist interessant, diese Erkenntnisse im Hinblick auf β_c der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptoren mit der Kristallstruktur- und Mutationsanalyse von GH-GHR zu vergleichen. Im Gegensatz zu heterodimeren Natur der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Rezeptoren ist GHR ein Homodimer. Die beiden identischen Untereinheiten von GHR binden das Wachstumshormon nacheinander und auf nicht äquivalente Weise. In der Kristallstruktur werden die beiden Wachstumshormonbindungsproteine entsprechend als GHbpI und GHbpII identifiziert. Die Anfangswechselwirkung von GHbpI nutzt die Kontakte der Stellen I im Wachstumshormon und ist relativ stark mit einer Dissoziationskonstante von 600 pM (Cunningham et al., 1991). Die nachfolgende Wechselwirkung mit GHbpI über die Kontakte der Stelle II erniedrigt die Dissoziationskonstante auf 200 pM. Deswegen verleiht die Wechselwirkung von GHbpII mit dem Wachstumshormon, das an GHpbI gebunden ist, eine dreifache Erhöhung der Affinität auf dem Rezeptorkomplex. Demzufolge ist funktionell der humane β_c analog GHbpII, wobei nur nach der Anfangsassoziation des Liganden mit der Rezeptor-α-Kette gebunden wird und eine 1.000-fache Erhöhung der Affinität auf dem Rezeptorkomplex verliehen wird (wie es der Fall bei IL-3 ist). Die hier präsentierten Ergebnisse zeigen allerdings drei signifikante Unterschiede zur GH-GHR-Wechselwirkung. Als erstes ist die F'-G'-Schleife in GHbpI und nicht in GHpbII (analog zu β_c) bei der Ligandenbindung beteiligt. Als zweites, obwohl die Reste in der F'-G'-Schleife von GHbpI effektiv bei der Bindung des Wachstumshormons, Lösungsmittel ausgeschlossen bei der Bindung des Wachstumshormons, sind, was einen engen Kontakt zwischen Ligand und Rezeptor indiziert, gibt es offenbar eine sehr geringe produktive Wechselwirkung zwischen den beiden Proteinen in dieser Region. Die Alaninüberprüfungsmutagenese über die Reste dieser Schleife in GHR hatte einen sehr geringen Effekt auf die Wachstumshormonbindungsaffinität in Relation zum Wildtyp-Rezeptor (Clackson and Wells, 1995; Bass et al., 1991). Daher trägt der Kontakt zwischen der F'-G'-Schleife von GHbpI und dem Wachstumshormon wenig zur Bindungsaffinität des Rezeptors bei. Dieses ist im Kontrast zu unseren Feststellen hier, wo wir einen vollständigen Verlust der Affinitätsumwandlung für alle Liganden bei der Substitution von Tyr⁴²¹ beobachten, was eine sehr starke Wechselwirkung zwischen diesem Rest und Ligand im Wildtypmolekül indiziert.
Drittens und konsistent mit dem Mangel einer produktiven Wechselwirkung zwischen der F'-G'-Schleife von GHR und GH, gibt es keine hydrophoben Reste in dieser Schleife. Deswegen, obwohl GHR Kontaktstellen einer deutlich hydrophoben Natur benutzt, liegen diese irgendwo in diesem Rezeptor, was anzeigt, dass der Beitrag zur Affinität der verschiedenen Kontaktstellen unterschiedlich in β_c relativ zu GHR ist.
Der Erfindung liegt ein Verfahren zugrunde, bei dem ein therapeutisches Mittel isoliert wird, das an die F'-G'-Schleife von Domäne 4 der gemeinsamen β_c-Kette des Rezeptors für GM-CSF, IL-3 und IL-5 oder an eine analoge Schleife eines anderen Cytokinrezeptors binden kann, wobei dieses Verfahren die Stufen umfasst, bei denen Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit überprüft werden, an diese Schleife zu binden.
In einer Form dieses zweiten Aspekts der Erfindung umfasst die Stufe der Überprüfung von Kandidatenmolekülen auf ihre Fähigkeit an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz zu binden, die aus der Gruppe gewählt ist, die SEQ ID Nr. 1, SEQ ID Nr. 2, SEQ ID Nr. 3, SEQ ID Nr. 4; SEQ ID Nr. 5, SEQ ID Nr. 6, SEQ ID Nr. 7, SEQ ID Nr. 8, SEQ ID Nr. 9, SEQ ID Nr. 10, SEQ ID Nr. 11 und SEQ ID Nr. 12 umfasst. Es sollte ebenfalls verstanden werden, dass als Alternative nur die zu überprüfende Schleife aus solchen gewählt sein kann, die von einem gemeinsamen Signalübertragungsrezeptor stammt, oder als zweite Alternative von solchen Rezeptoren mit einem hydrophoben Aminosäurerest oder als dritte Alternative von einem solchen Rezeptor, die Signalübertragungsrezeptoren sind.
Alternativ könnte gesagt werden, dass die Erfindung in einem Verfahren zu sehen ist, bei dem ein therapeutisches Mittel isoliert wird, durch Überprüfen auf die Fähigkeit der Verbindungen, an das Tyr⁴²¹ der gemeinsamen β_c des Rezeptors für GM-CF 6, IL-3 und IL-5, oder den entsprechenden aromatischen hydrophoben Rest von gp130 oder an einen analogen aromatischen hydrophoben Rest eines anderen gemeinsamen Signalübertragungsrezeptors oder an einen spezifischen Rezeptor, der auf andere Cytokine antwortet, zu binden.
Das Mittel kann ein Antikörper oder Fragment davon sein, und das Verfahren zur Isolierung dieses Antikörpers sollte so verstanden werden, dass weiterhin die Stufen der Impfung eines Tieres mit einem Peptidmolekül mit der F'-G'-Schleife, der Fusion der Antikörper produzierenden Zellen mit einer Myelomzelllinie und die Überprüfung auf eine Zelllinie, die einen Antikörper reaktiv mit dieser F'-G'-Schleife und das Ernten von Antikörpern aus der Zellline, das Austesten auf die Inhibierung der Hochaffinitätsbindung und das Testen auf die Inhibierung oder Anregung der Funktion umfasst. Das kann weiterhin die Herstellung kleiner Fragmente der Antikörper, die durch die Zelllinie, die an die Schleife bilden kann, hergestellt werden, umfassen. Die Zelllinie kann in geeigneter Weise eine Mauszellenlinie sein, und das Verfahren kann weiterhin den weiteren Schritt der Humanisierung der Antikörperfragmente durch Ersatz der Maussequenzen mit humanen Sequenzen in den nicht bindenden Regionen umfassen.
Mittel, die durch das erfindungsgemäße Verfahren identifiziert werden können, könnten in einem Verfahren zur Behandlung eines Menschen oder eines Tiers einer Krankheit verwendet werden, wobei das Verfahren die Stufe der Verabreichung eines wie oben identifizierten therapeutischen Mittels in einem pharmazeutisch annehmbaren Träger und in einer therapeutisch effektiven Dosis umfassen.
Es könnte erwünscht sein, die Erkrankung mit einem oder mehreren der hier identifizierten oder definierten therapeutischen Mitteln in Kombination zu behandeln, und vielleicht in Kombination mit anderen therapeutischen Mitteln.
Die Behandlung könnte als Ziel die Prävention durch Reduktion des Risikos der Erkrankung abzielen, oder die Behandlung kann dafür verwendet werden, die Erkrankung zu lindern oder zu beseitigen. Die Verabreichung des therapeutischen Mittels kann jede pharmazeutisch annehmbare Form sein und in einem geeigneten Träger vorliegen.
Es wird angenommen, dass die Konstruktion der Verbindungen, die die F'-G'-Schleife von β_c binden, therapeutisch nützlich für Behandlungen von Krankheiten sind, wo IL-3, GM-CSF und IL-5 eine pathogene Rolle spielen, hauptsächlich die Allergie, Asthma, Leukämie, Lymphom und Entzündungen, einschließlich Arthritis.
Ähnlich wie bei anderen Cytokinrezeptoren wird angenommen, dass Antagonisten oder Agonisten therapeutisch nützlich sind. Somit auch für gemeinsame Signalübertragungsrezeptoren. Da gp130 funktionell analog zu β_c in dem GM-CSF/IL-3/IL-5-Rezeptorsystem in der Weise ist, dass es eine gemeinsame Bindungsuntereinheit und Signalüberträger für IL-6, Onkostatin M (OSM), ziliarer neurotrophischer Faktor (CNTF), Leukämieinhibitionsfaktor (LIF) und IL-11 ist, ist nahegelegt, dass die Einnahme/Blockierung dieses Tyrosins zu einem Antagonismus von IL-6, LIF, OSM, CNTF und IL-11 führt. Der Antagonismus dieses Rezeptorsystems ist bei Entzündungen, Leukämie und Lymphomen nützlich. Die Antagonisten von IL-2Rβ/γ können als Immununterdrücker nützlich sein. Der Antagonismus von LIFR kann für die Verhinderung der Implantation von Embryos im Uterus nützlich sein. Der Antagonist von IL-4/IL-13 inhibiert die IgE-Produktion und kann bei der Behandlung von Asthma und Allergien nützlich sein.
Für spezifische Untereinheiten. Der Antagonist von IL-3 kann für die Behandlung von Allergien und Follikel-B-Zellen-Lymphome geeignet sein. Der Antagonist von IL-4 kann die IgE-Produktion inhibieren und für die Behandlung von Asthma und Allergien nützlich sein. Der Antagonist von IL-6R kann als entzündungshemmendes Mittel nützlich sein und kann dafür verwendet werden, das Myelomwachstum zu inhibieren. Antagonisten gegen IL-7 können als Immunsuppressoren nützlich sein. Antagonisten des Leptinrezeptors (OBR) können bei der Behandlung von Cachexie, Gewichtsverlust bei Erkrankungen, wie AIDS, Krebs und Parasitenerkrankungen, nützlich sein.
Der identifizierte Rest spielt deutlich eine vorherrschende Rolle bei der Wirkung des Systems und während einige Moleküle, die mit der F'-G'-Schleife von β_c oder mit entsprechenden Resten in anderen Rezeptoren, (solche wie in Tabelle 3 gezeigt) Wechselwirken, können erwartungsgemäß einen Antagonisteneffekt aufweisen können. Es ist allerdings auch möglich, dass sie einen Agonisteneffekt insbesondere bei Rezeptoren, die durch Homodimerisierung aktiviert werden können, aufweisen.
Als erstes die allgemeinen Signalübertragungsrezeptoren. Agonistenmittel, die an β_c binden, können dafür verwendet werden, um die Hämopoiesis zu stimulieren und die Immunantwort gegenüber Mikroorganismen zu verstärken. Agonistenmittel, die an LIFR binden, können für die Unterdrückung der embryonalen Stammzellendifferenzierung nützlich sein. Agonisten, die an IL-2Rβ binden, können bei der Immunstimulation eingesetzt werden. Agonistenmittel, die an IL-4R/IL-13 binden, können eine Antitumoraktivität aufweisen.
Nun zu den spezifischen Untereinheiten. Agonistenmittel, die IL-3 binden, können bei der in vivo und ex vivo Ausbreitung von frühen hämopoetischen Zellen verwendet werden. Agonistenmittel, die an IL-4 binden, können eine nützliche Antitumoraktivität aufweisen. Agonisten, die an IL-7R binden, können eine nützliche Antitumorimmunität aufweisen. Agonistenmittel, die IL-11 binden, können ein nützliches Mittel in der Krebstherapie darstellen. Agonistenmittel, die an EPOR binden, können dafür verwendet werden, Anämie und chronische Nierenleiden oder chronische Entzündungserkrankungen oder maligne Erkrankungen zu korrigieren. Agonistenmittel, die an TPOR binden, können für die Korrektur von Thrombocytopenie (kann mit chronischen Entzündungserkrankungen, malignen Erkrankungen, Chemo- und Radiotherapie assoziiert sein) nützlich sein.
Beispiele für geeignete Agonisten sind solche für Erythropoietin und Thrombopoietin, um die Zahl der Erythrocyten und Blättchen im Blut nach einem Blutzellenverlust, der Chemotherapie, Radiotherapie, Immumsuppression oder Knochenmarktransplantation zu erhöhen. Agonisten für OBR können dafür verwendet werden, einen Gewichtsverlust zu induzieren, und insbesondere und nicht-Insulin abhängigen Diabetes mellitus beiträgt. Die Moleküle, sei es Agonist oder Antagonist, können auf der Basis ihrer Fähigkeit, mit dem identifizierten Rest in Wechselwirkung zu treten, isoliert werden.
Als kurze Anmerkung, die folgenden Drei- und Einbuchstabenabkürzungen für Aminosäurereste werden in der Spezifikation, wie in Tabelle 1 definiert, verwendet.
Wenn der spezifische Aminosäurerest durch seine Position im Polypeptid eines Proteins angegeben wird, wird die Aminosäureabkürzung mit der Nr. des Restes, angegeben als Superscript (das heißt Xaaⁿ) verwendet.
TABELLE 1
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1A Ist eine schematische Darstellung der extrazellulären Domäne von menschlichem β_c, die zwei Cytokin-Rezeptor-Module (CRM1 & 2) (Goodall et al., 1993) und konservierte Merkmale der Cytokinrezeptorsuperfamilie (Bazan 1990) zeigt.
1B Stellt die Aminosäuresequenzen dar, die der putativen F'-G' Schleife in der Membran proximal zu CRM2 von β_c (Hayashida et al., 1990) entsprechen, ausgerichtet mit den F'-G' Schleifen des Wachstumshormonrezeptors (GHR) (Leung et al., 1987) und Prolactinrezeptors (PRLR) (Boutin et al., 1988). Konservierte Strukturmotive sind als Box dargestellt, und zuvor identifizierte Reste, die am Ligandenkontakt (GH) beteiligt sind (De Vos et al., 1992, und Somers et al., 1994) sind fettgedruckt gezeigt. Die mutanten Formen von β_c, die hergestellt wurden, um die Ligandenbindungsdeterminaten zu identifizieren, sind mit mutierten Resten fettgezeigt.
2 Zeigt graphische Darstellungen, die zeigen, dass die Alaninsubstitution der Reste 418–422 in β_c die Hochaffinität der GM-CSF und IL-3-Bindung abschaltet. Es wurde eine Scatchard-Transformation in Sättigungsbindungsexperimenten unter Verwendung von ¹²⁵J-GM-CSF (linkes Diagramm) und ¹²⁵J-IL-3 (rechtes Diagramm) mit COS-Zellen durchgeführt, die sowohl GM-CSFR und IL-3R-α-Ketten zusammen mit dem Wildtyp (o) oder der Mutante ⁴¹⁸AAAAA⁴²²(•)β_c exprimieren. Der radioiodinierte Ligandenkonzentrationsbereich für GM-CSF- und IL-3 betrug 10 pM–10 nM, und die nicht spezifische Bindung wurde in Gegenwart von 1 μM nicht markiertem Liganden bestimmt. Die gestrichelte Linie zeigt die hohe und niedrige Affinitätsbindung der Komponenten unter Verwendung von Wildtyp β_c, und die durchgezogene Linie stellt die Linie der besten Übereinstimmung für die ⁴¹⁸AAAAA⁴²²-Mutante β_c, dar, was unter Verwendung des Ligand-Programms bestimmt wurde. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt, und die K_d-Werte, die daraus resultieren und verschiedene andere Experimente sind in Tabelle gezeigt.
3 Zeigt den Effekt einer einzelnen Alaninsubstitution der Reste Arg⁴¹⁸, Thr⁴¹⁹, Gly⁴²⁰, Tyr⁴²¹ und Asp⁴²² von humanem β_c auf die Hochaffinitäts-GM-CSF- und Il-3-Bindung. Die Scatchard-Transformation der Sättigungsbindungsstudien mit ¹²⁵J-GM-CSF (oberer Teil) und ¹²⁵J-IL-3 (unterer Teil) wurden wie in 2 beschrieben durchgeführt. Die gestrichelte Linie zeigt die Hoch- und Niedrig-Affinitätsbindungskomponenten unter Verwendung von Wildtyp β_c (o) und die nicht unterbrochene Linie zeigt die Linie der besten Übereinstimmung für jede Mutante β_c (•), was unter Verwendung des Ligand-Programms bestimmt wurde. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt, und die K_d-Werte aus diesen und ähnlichen Studien sind in Tabelle 2 gezeigt.
4 Zeigt den Effekt der Wiedereinführung von Tyr⁴²¹ in ein polyanalinsubstituiertes β_c (⁴¹⁸AAAYA⁴²²) auf die Hochaffinitäts- GMB-CSF und IL-3-Bindung. Die Scatchard-Transformation von Sättigungsbindungsstudien mit ¹²⁵J-GM-CSF (linke Seite) und ¹²⁵I-IL-3 (rechte Seite) wurden wie in 2 beschrieben durchgeführt. Die unterbrochene Linie zeigt die Hoch- und Niedrigaffinitätsbindungskomponenten unter Verwendung von Wildtyp β_c (o), und die durchgehende zeigt die Linie der besten Übereinstimmung für die ⁴¹⁸AAAYA⁴²²-Mutante β_c (•), was unter Verwendung des Ligand-Programms bestimmt wurde. Ein repräsentatives Experiment ist gezeigt, und die K_d-Werte aus diesen und ähnlichen Studien sind in Tabelle 2 gezeigt.
5A Ist die Darstellung eines Autoradiogramms, das zeigt, dass STAT5-ähnliche (STAT5-L) Aktivität durch GM-CSF und IL-3 nur in Jurkat-Zellen, die geeignete α-Ketten zusammen mit dem Wildtyp (Wt) β_c exprimieren, induziert wird. Nukleare Extrakte wurden aus transfizierten Jurkat-Zellen, die für eine Stunde mit oder ohne 300 nM Cytokin stimuliert waren, und über einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay unter Verwendung einer STAT-5 spezifischen Sonde analysiert.
5B Ist eine Darstellung eines Autoradiogramms ähnlich zu dem von 5A, das zeigt, dass das DNA-Bindungsprotein, das durch Cytokin in Rezeptor transfizierten Jurkat-Zellen induziert wird, sich wie STAT5 verhält. Ein nuklearer Extrakt, der aus GM-CSF-stimulierten transfizierten Jurkat-Zellen hergestellt war, wurde einem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay in Gegenwart eines 50-fachen molaren Überschusses von konkurrierenden nicht radioaktiven Oligonucleotiden unterworfen. Die Oligonucleotide für die Kompetition waren: das β-Caseinpromotorelement (β-cas), eine Mutante für das β-Caseinpromotorelement (mut β-cas), eine AP-1- Konsensusbindungsstelle (AP-1) und das Haemopoeitinrezeptorantwortelement (HRRE).
6A Ist eine graphische Darstellung, dass Y421A β_c STAT5-L mit reduzierter Potenz als Reaktion auf die GM-CSF-Stimulierung aktiviert. Eine Dosis/Antwort-Studie der cytokininduzierten STAT5-L-Aktivität wurde mit Jurkat-Zellen durchgeführt, die mit α-Ketten und entweder Wild-Ty- β_c (o) oder Y421A (•) transfiziert waren. Die STAT5-L-Aktivität wurde durch einen elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay unter Verwendung einer STAT5-spezifischen Sonde bestimmt und anschließend durch Phosphorimager-Analyse quantifiziert. Die Ergebnisse sind als Prozentzahl der maximalen Aktivität ausgedrückt, die nach der Korrektur für den Hintergrund und die Proteinkonzentration erhalten wurde.
6B Ist eine graphische Darstellung, dass Y421A β_c STAT5-L mit reduzierter Potenz als Antwort zur IL-3-Stimulation aktiviert. Die Experimente und die Prozeduren sind wie in 6A.
7 Ein Model der räumlichen Anordnung zwischen den putativen B'-C' und F'-G'-Schleifen von β_c und der ersten α-Helix von GM-CSF, IL-3 oder IL-5 auf der Basis der GH-GHR-Kristallstruktur. Nur die membrannahen Domänen von β_c (CRM2) und die erste α-Helix (Helix A) von GM-CSF, IL-3 oder IL-5 sind gezeigt, mit Tyr³⁶⁵ und Tyr⁴²¹ von β_c und dem konservierten Glu von GM-CSF, IL-3 oder IL-5, die in der raumausfüllenden Darstellung gezeigt sind.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER BEISPIELE
BEISPIEL 1
Darstellung der Wirkung von Tyr⁴²¹ bei der β_c-Untereinheitbindung
Grundprinzip für die Mutagenese von putativen Schleifen in der humanen β-Kette
Die Region von β_c, die wir für die Mutagenese gewählt haben, wird durch Regionen flankiert, die eine Konservierung durch die Cytokin-Rezeptorsuperfamilie zeigt: der zuvor beschriebene VRXR-Konsensus (Patthy 1990), worin X am meisten vorkommmend einen aliphatischen Rest darstellt und das WSXWS-Motiv (Cosman et al., 1990; Bazan 1990) (1). Das WSXWS-Motiv ist bereits seit langem als charakteristisches Merkmal dieser Rezeptorfamilie erkannt, und verschiedene Studien sind auf das Verständnis seiner Rolle in der Rezeptorfunktion gerichtet worden (Miyazaki et al., 1991; Yoshimura et al., 1992; Quelle et al., 1992; Rozakis-Adcock and Kelly 1992; Baumgartner et al., 1994). Die GH-GHR-Kristallstruktur (De Vos et al., 1992) und seit kurzem die Kristallstruktur von GH, gebunden an den Prolactinrezeptor (Somers et al., 1994) geben uns etwas Einsicht in die Struktur der VRXR-WSXWS-Region in Cytokinrezeptoren im Allgemeinen. Die beiden betreffenden β-Stränge stehen miteinander in Wechselwirkung und bilden einen Stapel von aromatischen Seitenketten, die durch hydrophobe Bereiche der basischen Seitenketten unterbrochen werden, und in der Konsequenz bilden die Aminosäuren, die diese beiden Motive trennen, eine Schleife. Die Reste in dieser Schleife sind für ein Lösungsmittel in dem Liganden gebundenen Komplex in beiden gelösten Rezeptoren nicht zugänglich (De Vos et al., 1992; Somers et al., 1994). Wir haben daher unser Augenmerk hier auf den analogen F'-G'-Schleifenbereich in der Membran proximal zum Cytokinrezeptormodul (CRM) von β_c gerichtet, um seine Rolle bei der GM-CSF-, Il-3- und Il-5-Bindung zu bestimmen.
Identifikation einer Region, die bei der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Hochaffinitätsbindung beteiligt ist
Zur Untersuchung der möglichen Beteiligung der putativen F'-G'-Schleife von β_c bei der Hochaffinitäts-rezeptorkomplexbildung, wurde die Region durch Substitution von Alaninen über die Reste 418–422 (1) unterbrochen. Die Fähigkeit dieser n-Alanin substituierten Mutante β_c (⁴¹⁸AAAAA⁴²²), die Hochaffinitätsligandenbindung zu unterstützen, wurde durch Co-Expression dieser mit sowohl GM-CSFR- und IL-3R- α-Ketten an COS-Zellen studiert, wobei Radioliganden-Sättigungsbindungsstudien durchgeführt wurden. COS-Zellen wurden routinemäßig mit α-Ketten-cDNAs zusammen mit mutanter β_c-cDNA elektroporatisiert, so dass die gleiche Transfekte auf die GM-CSF- und IL-3-Bindung analysiert werden konnte. In Abwesenheit von transfiziertem β_c, haben GM-CSFR und die IL-3R- α-Kette transfizierten COS-Zellen GM-CSF und IL-3 mit nur geringer Aktivität gebunden (Tabelle 2). Die Co-Expression von Wildtyp β_c verlieh GM-CSF eine hohe Affinitätsbindung, und IL-3 wie die α-Ketten wurden im Überschuss von β_c exprimiert, die geringe Affinitätsbindung war immer noch evident, wie durch die Krummlinigkeit der Scratchard-Plots (2, Tabelle 2) dargestellt ist. Die COS-Zellen, die mit dem mutanten Penta-Alanin β_c (⁴¹⁸AAAAA⁴²²), GM-CSFR und IL-3R- α-Kette transfiziert waren, zeigten eine Zelloberflächenexpression aller Rezeptorketten im Vergleich zu dem Wildtyp Transfektanten (Tabelle 2), sie zeigten allerdings keine hohe Affinitätsbindung von GM-CSF oder IL-3 (2, Tabelle 2). Dieses zeigt, dass die Substitution der Region 418–422 in β_c die Fähigkeit von β_c beeinträchtigt, eine Hochaffinitäts-GM-CSF- und IL-3-Bindung zu unterstützen und legt nahe, dass die Reste in dieser Region bei der Ligandenwechselwirkung beteiligt sind.
Tyr⁴²¹ ist notwendig und ausreichend für die GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Hochaffinitätsbindung
Zur Untersuchung des jeweiligen Beitrags der Reste 418–422 von β_c auf die Hochaffinitäts- GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Bindung, wurde jeder Rest in dieser Region separat mit Alanin substituiert (1). Wie oben wurde die Fähigkeit der einzelnen Mutante, eine Hochaffinitätsligandenbindung zu vermitteln, bestimmt, indem Radioligandensättigungsbindungsstudien bei COS-Zellen, die die Mutante β_c zusammen mit GM-CSFR und IL-3R α-Ketten exprimieren, durchgeführt wurden. Die Ergebnisse zeigten, dass alle Alaninsubstitutionsmutanten ähnlich wie der Wildtyp β_c auf der Zelloberfläche exprimiert wurden (Tabelle 2), und die Alaninsubstitution der Reste Thr⁴¹⁹, Glu⁴²⁰ und Asn⁴²² hatte keinen Einfluss auf die Hochaffinitätsligandenbindung (3, Tabelle 2). Die Alaninsubstitution von Arg⁴¹⁸ reduzierte die GM-CSF- und IL-3-Hochaffinitätsbindung um das 2–3-fache, was ein relativ kleiner Effekt ist (Tabelle 2). Interessanterweise erzeugte allerdings die Alaninsubstitution von Tyr⁴²¹ eine β_c-Mutante, die nicht in der Lage war, die Hochaffinitätsbindung von jeweils GM-CSF oder IL-3 zu unterstützen (2, Tabelle 2). Der Effekt dieser Mutation auf die Hochaffinitäts-IL-5-Bindung wurde ebenfalls bestimmt, indem COS-Zellen mit der Mutante Y421A β_c zusammen mit der IL-5R-α-Kette transfiziert wurde. Die mit radioaktiv iodiertem IL-5 erhaltenen Sättigungsbindungsdaten zeigten eine einzige Klasse eines Rezeptors bei der Scatchard-Analyse. Obwohl β_c einen geringen Effekt auf die Affinitätsumwandlung der IL-5-Bindungsstelle relativ zu IL-3 und GM-CSF hat, zeigten Studien mit der Mutante Y421A β_c einen Verlust der Affinitätsgröße mit dem Verlust der Hochaffinitäts-IL-5-Bindung (Tabelle 2). Dieses zeigt, dass Tyr⁴²¹ eine ähnliche Rolle bei der Unterstützung der Hochaffinitätsbindung von GM-CSF, IL-3 und IL-5 aufweist.
Die Identifikation eines einzigen Restes in einer vorbestimmten Schleife der Membran proximal zu CRM von β_c, die für die Hochaffinitäts- GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Bindung kritisch ist, hat die Möglichkeit eröffnet, dass dieser Rest allein im Zusammenhang einer Schleife ausreichend sein könnte, um die Hochaffinitätsbindung zu unterstützen. Um diese Feststellung zu testen, haben wir einen Tyrosinrest wieder in eine polyalaninsubstituierte β_c-Mutante (⁴¹⁸AAAYA⁴²²) (1) eingeführt. Überraschenderweise war diese Mutante in der Lage, die Hochaffinitäts-GM-CSF- und IL-3-Bindung (4) zu unterstützen, obgleich mit einer dreifach reduzierten Affinität relativ zu Wildtyp GM-CSF- und IL-3-Hochaffinitätsbindung (Tabelle 2). Diese Mutante stellte ebenfalls die Hochaffintätsbindung an IL-5 wieder her (Tabelle 2). Diese Feststellungen zeigen, dass die Reste neben Tyr⁴²¹, keine direkte Rolle bei der Ligandenwechselwirkung spielen, und sie implizieren Tyr⁴²¹ als Schlüsselrest bei der GM-CSF-, Il-3- und IL-5-Hochaffinitätsbindung.
Die Substitution von Tyr⁴²¹ unterbricht die funktionelle Rezeptoraktivierung
Zur Bestimmung der funktionelle Signifikanz der Substitution von Tyr⁴²¹ von β_c durch Alanin, haben wir die Induktion der Signalübertragung und die Transkriptionsaktivitoren (STAT) gemessen. Die produktive Wechselwirkung von GM-CSF, IL-3 und IL-5 mit ihren Hochaffinitätsrezeptoren führt zu einer von β_c vermittelten Signalübertragung (Kitamura et al., 1991b; Kitamura et al., 1992; Takaki et al., 1993). Es ist nun gut dokumentiert, dass die Signalgebung durch β_c die JAK2-Protein-Tyrosinkinase (Silvennoinen et al., 1993; Quelle et al., 1994) aktiviert, und anschließend der Transkriptionsfaktor STAT5 schnell phosphoryliert wird, was diesen in die Lage versetzt, an seine DNA-Bindungsstelle im Kern zu binden (Mui et al., 1995; Azam et al., 1995; Gouilleux et al., 1995; Pallard et al., 1995). Die STAT5-Aktivierung stellt daher eine relativ sofortige Antwort auf die β_c vermittelte Rezeptorsignalgebung dar. STAT5 ist in vielen hämopoietischen Zelllinien, einschließlich Zellen von myeloider und lymphoider Abstammungen beschrieben worden (Mui et al., 1995; Azam et al., 1995; Gouilleux et al., 1995; Pallard et al., 1995). In vorläufigen Experimenten haben wir Jurkat-T-Zellen, die mit GM-CSFR-, IL-3R- oder IL-5R-Rezeptor-α-Ketten zusammen mit Wildtyp β_c transfiziert sind, untersucht. Ein Cytokin induzierbares nukleares DNA-Bindungsprotein wurde nachgewiesen, das eine Oligonucleotidsonde, die die STAT5-Bindungskonsensussequenz (TTc-N₃-GAA) enthält, in einem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay verzögerte.
Dieses DNA-Bindungsprotein war nach der Cytokinbehandlung in den Zellen, die mit der α-Kette und β_c transfiziert waren, induzierbar, allerdings nicht in Abwesenheit von β_c, was anzeigt, dass β_c diesen ligandeninduzierten Prozess vermittelt (5A). Die nicht markierte Sonde wie auch das verwandte Hämopoiteinrezeptorantwortelement (HRRE) (Morella et al., 1995) konkurrierten um die Bindung an die radioaktiv markierte β-Casein-Promotorsonde, wobei beide die STAT5-Bindungskonsenssusequenz enthalten. Allerdings konkurrierten eine β-Casein-Promotermutantensonde, die Mutationen im STAT5-Bindungskonsensus und eine kanonische Sonde der AP-1-Stelle enthielt, nicht um die Bindung (5B). Aus diesem Grund bezeichnen wir dieses Protein als STAT5-ähnlich (STAT5-L), weil, obwohl sie sich in ähnlicher Weise wie es STAT5 verhält, seine wahre Identität noch nicht bestimmt worden ist.
Die Fähigkeit von mutanten Rezeptoren, das STAT5-L-Protein zu aktivieren, wurde bestimmt, indem Jurkat-Zellen mit der Mutante β_c- und die GM-CSFR- oder IL-3R-α-Kette cDNAs cotransfiziert wurden. Die Zelloberflächenexpression von Rezeptoruntereinheiten wurde durch Fliesscytometrie unter Verwendung von kettenspezifischen Antikörpern bestätigt, und es ist festgestellt worden, dass die Expression von Mutanten- und Wildtyp β_c vergleichbar war (Daten nicht gezeigt). Die Transfektanten wurden mit entweder GM-CSF oder IL-3 über einen Konzentrationsbereich stimuliert, und es wurden nukleare Extrakte hergestellt. Die Induktion des STAT5-L-Proteins wurde mit einem elektrophoretischen Mobilitätsverschiebungsassay (EMSA) unter Verwendung der kanonischen STAT5-DNA-Bindungsstelle vom β-Caseinpromotor als Sonde bestimmt.
STAT5-L wurde in Reaktion auf entweder GM-CSF oder IL-3 in dosisabhängiger Weise in Gegenwart der geeigneten α-Kette und des Wildtyp β_c aktiviert (6A & B). Die Alaninsubstitution von Tyr⁴²¹ produzierte ein β_c, das die STAT5-L-Aktivierung als Reaktion auf GM-CSF mit einer etwa 100–1000-fachen Reduktion der Potenz unterstützte (6A). Diese Reduktion der GM-CSF-Antwort mit dieser Mutanten-β_c zeigt, dass Tyr⁴²¹ eine Rolle bei der GM-CSF induzierten Rezeptoraktivierung aufweist. Signifikanterweise hatte Y421A β_c einen größeren Effekt auf die IL-3-induzierte STAT5-L-Aktivierung, die nur geringe Gehalte von nachweisbarem STAT5-L (6B) produzierte, und selbst bei 3 μM IL-3 wurde eine halbe maximale Aktivierung nicht erreicht. Dieses liegt nahe, dass der Tyrosinwert ebenfalls für die Wechselwirkung von IL-3 mit β_c kritisch ist.
BEISPIEL 2
Herstellung von Antikörperantagonisten
Monoclonale Antikörper können hergestellt werden, indem mit β_c oder mit einem Fragment von β_c, das die F'-G'-Schleife enthält, oder mit einem Peptid, das die F'-G'-Sequenz enthält, immunisiert wird. Nach Spezifizitätskontrollen, die die spezifische Bindung an die F'-G'-Schleife zeigen, können die Antikörper für die Blockierung der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Hochaffinitätsbindung und für die Blockierung der GM-CSF-, IL-3- und IL-5-Funktionsstimulation gewählt werden. Wenn einmal ein geeigneter monoclonaler Antikörper identifiziert worden ist, der die GM-CSF-/, IL-3-/ und IL-5-Hochaffinitätsbindung und -funktion blockiert, können kleinere Fragmente hergestellt werden, z. B. F(ab)₂, Fab und schließlich Fv. Unter Anwendung von Techniken der Molekularbiologie kann eine einzelne Kette des Fv-Fragments konstruiert werden (Hv-Lv). Das wäre ein Inhibtionspeptid.
BEISPIEL 3
Herstellung von Peptidantagonisten
Kurze Peptide mit ähnlichen Sequenzen zur F'-G'-Schleife können synthesiert werden, die die Cytokinwechselwirkung mit der F'-G'-Schleife von β_c blockieren. Das Umgekehrte ist ebenfalls möglich: kurze Peptide mit ähnlichen Sequenzen zur Helix A von GM-CSF/IL-3/IL-5 (dieses ist die Region in den Cytokinen, die mit der F'-G'-Schleife wechselwirken soll) können ebenfalls die Cytokinwechselwirkung blockieren.
BEISPIEL 4
Herstellung von Oligonucleotidantagonisten
Ein großer Pool von wahllos synthesierten Oligonucleotiden kann durch ein F'-G'-Peptid, das auf einer festen Matrix (Bock et al., 1992, – diese Referenz ist hiermit eingeschlossen) immobilisiert ist, gegeben werden. Nach dem Waschen verbleiben die starkbindenden Oligonucleotide, die dann bei verschiedenen Bedingungen (Salz, pH, etc.) eluiert werden können. Die Sequenz kann dann durch PCR bestimmt werden und auf ihre Inhibition der β_c vermittelten Funktion auf einem realen Zellsystem getestet werden.
BEISPIEL 5
Ausrichtung von Aminosäuren der F'-G'-Schleife von β_c und gp130
Die Ausrichtung von β_c und gp130 ist publiziert worden. Gp130 und β_c enthalten Domänen, die mit der Fibronectindomäne vom Typ III, die ein charakteristisches Merkmal der meisten Cytokinenrezeptoren ist, verwandt sind. Gp130 hat 6 dieser Domänen, β_c hat 4 dieser Domänen.
Jede Domäne enthält reine eigene F-G-Schleife, somit hat gp130 6 und β_c hat 4. Nur eine dieser F-G-Schleifen ist die wichtige, soweit die vorliegende Erfindung betroffen ist. Die wichtige Domäne ist durch die Gegenwart von i) einem konservierten Muster von Cys-Resten, ii) verschiedenen Trp-Resten, iii) einem YXXRV/IR Motiv und iv) einem WSXWS Motiv (wo X eine Aminosäure ist) charakterisiert. Es ist postuliert, dass Tyr⁴²¹ innerhalb der F-G-Schleife der vierten Domänschleife in β_c (F'-G') liegt. Es ist postuliert, dass das äquivalente funktionell wichtige Tyr in gp130 innerhalb der F-G-Schleife der zweiten Domäne liegt.
Tabelle 3 Ausrichtung der putativen F'-G'-Schleifen von Mitgliedern der Cytokinrezeptorsuperfamilie
Die aromatischen hydrophoben Reste sind unterstrichen.

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SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Verfahren zur Isolierung eines Mittels, das an die F'-G'-Schleife der Domäne 4 der allgemeinen β_c-Kette des Rezeptors für GM-CSF, IL-3 und IL-5 oder an eine analoge Schleife eines anderen Cytokin-Rezeptors binden kann, wobei die F'-G'-Schleife durch SEQ ID Nr. 1 definiert ist und die analoge Schleife derart definiert ist, dass sie sich zwischen den flankierenden Konsensussequenzen V/F/L-R/K/Q-X-R/K/Q und WSXWS befindet, diese allerdings nicht einschließt, die Bindung des Mittels an die F'-G'-Schleife oder eine analoge Schleife einen Antagonisten- oder Agonisteneffekt auf die hohe Affinitätsbindung eines jeweiligen Cytokins aufweist, wobei dieses Verfahren die Schritte aufweist, bei denen die Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit geprüft werden, an die Schleife selektiv zu binden, wobei bei dem Überprüfungsschritt die Kandidatenmittel mit der F'-G'-Schleife oder der analogen Schleife in Kontakt gebracht werden und diejenigen Kandidaten, die an die Schleife binden, isoliert werden.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, worin die Stufe der Überprüfung der Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit, an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz zu binden, die aus der Gruppe gewählt ist, die SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5, SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 7, SEQ ID NR. 8, SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10, SEQ ID NR. 11 und SEQ ID NR. 12 umfasst, umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, worin die Stufe der Überprüfung der Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit, an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz zu binden, die aus der Gruppe gewählt ist, die SEQ ID NR. 1, SEQ ID NR. 2, SEQ ID NR. 3, SEQ ID NR. 4, SEQ ID NR. 5 und SEQ ID NR. 12 umfasst, umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, wobei die Stufe der Überprüfung der Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit, an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz zu binden, die aus der Gruppe gewählt ist, die aus SEQ ID NR. 6, SEQ ID NR. 7 und SEQ ID NR. 8 umfasst, umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, worin die Stufe der Überprüfung der Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit, an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz zu binden, die aus der Gruppe gewählt ist, die SEQ ID NR. 9, SEQ ID NR. 10 und SEQ ID NR. 11 umfasst, umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, worin die Stufe der Überprüfung der Kandidatenmoleküle auf ihre Fähigkeit, an diese Schleife zu binden, die Überprüfung auf die Fähigkeit, an eine Sequenz SEQ ID NR. 1 zu binden, umfasst, umfasst.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 1, worin das Mittel ein Antikörper oder ein Fragment davon ist, wobei das Verfahren weiterhin die Stufe aufweist, ein Tier mit einem Peptidmolekül mit der F'-G'-Schleife zu impfen, die Antikörper produzierenden Zellen mit einer Myelomzelllinie zu fusionieren und auf eine Zelllinie, die einen Antikörper, der mit dieser F'-G'-Schleife, aber nicht mit dem WSXWS-Motiv reaktiv ist, produziert, zu überprüfen und die Antikörper aus dieser Zelllinie zu ernten, um auf die Inhibierung der hohen Affinitätsbindung zu testen und auf die Inhibierung oder Anregung der Funktion zu testen.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 7, wobei das Verfahren weiterhin die Herstellung kleiner Antikörperfragmente, die durch die Zelllinie, die an die Schleife binden kann, produziert werden, einschließt.
Verfahren zur Isolierung eines therapeutischen Mittels nach Anspruch 7, worin die Zelllinie eine Maus-Zelllinie ist und das Verfahren weiterhin den Schritt umfasst, bei dem die Antikörperfragmente durch Ersetzen der Maussequenzen durch humane Sequenzen in den nicht bindenden Bereichen humanisiert werden.