JPH09502980A - Ｎｆ−ａｔポリペプチド及びポリヌクレオチド - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、転写複合体NF−ATと関連した新規のポリペプチド、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、このようなポリペプチドと反応する抗体、このようなポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのポリヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ及びPCR 増幅プローブ、このようなポリペプチドをコードするトランス遺伝子、このようなポリペプチドをコードする相同標的構築物、及び／又はこのようなポリペプチドをコードする遺伝子内又は近くの相同的組込み体、通常はこのようなポリペプチドをコードする機能的に破壊された内因性遺伝子を包含する非ヒトトランスジェニック動物、並びにこのようなポリペプチドをコードするトランス遺伝子を包含するトランスジェニック非ヒト動物を提供する。本発明はさらに、細胞標本中のＴ細胞（活性化細胞を含む）の検出方法、機能冗進又は機能低下Ｔ細胞症状の処置方法、免疫調節薬のスクリーニング方法、リンパ球分化の診断的段階分け方法、研究又は診断試薬として用いるためのNF−ATタンパク質の製造方法、新規ポリペプチドと反応する抗体の産生方法、並びにトランスジェニック非ヒト動物の生成方法を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 NF−ATポリペプチド及びポリヌクレオチド発明の分野 本発明は、転写複合体NF−ATと結びつけられる新しいポリペプチド、かかるポ リペプチドをコードするポリヌクレオチド、かかるポリペプチドと反応性をもつ 抗体、かかるポリペプチドをコードするポリヌクレオチドを検出するためのポリ ヌクレオチドハイブリダイゼーションプローブ及びPCR 増幅プローブ、かかるポ リペプチドをコードするトランスジーン、かかるポリペプチドをコードする及び ／又は、かかるポリペプチドをコードする内因性遺伝子の中又は近くで相同的に 組込まれる相同なターゲティング構成体、かかるポリペプチドを通常コードする 機能的に分断された内因性遺伝子を含む、ヒト以外のトランスジェニック動物、 及びかかるポリペプチドをコードするトランスジーンを含むヒト以外のトランス ジェニック動物を提供する。本発明は同様に、細胞試料中のＴ細胞（活性化され たＴ細胞を含む）を検出するための方法、及び、過剰活性又は過少活性のＴ細胞 条件を治療するための方法、免疫調節作用物質についてスクリーニングするため の方法、リンパ球分化の診断的段階決定のための方法、研究又は診断用の試薬と して使用するためのNF−ATタンパク質を産生するための方法、新しいポリペプチ ドと反応性をもつ抗体を産生するための方法及びヒト以外のトランスジェニック 動物を産生するための方法を提供する。発明の背景 免疫応答は、活性化されたＴ細胞から産生されるサイトカインの 作用によって調整される。ほとんどのＴリンパ球のための前駆体は骨髄の中で発 生し、胸腺まで移動して、ここでこれらの前駆体は分化し、抗原と相互作用する ことのできる受容体を発現する。これらの分化されたＴリンパ球は、次に末梢リ ンパ器官まで移動して、そこで同起源の抗原と接触するまで静止性状態にとどま る。Ｔリンパ球上の抗原受容体と抗原の相互作用は、一連の秩序立った多面発現 の変化つまりＴリンパ球活性化として記されているプロセスを開始させる。Ｔリ ンパ球活性化は、細胞分裂及び、Ｂリンパ球による抗体産生を誘発し顆粒球ヤマ クロファージ前駆体の成長及び分化を制御するリンホカインの産生及び細胞障害 性といった免疫学的機能の獲得を結果としてもたらす、７〜10日間のプロセスで ある。活性化されたＴリンパ球により産生されるサイトカインは、免疫系のその 他の細胞に作用してその挙動を調整し有効な免疫応答をもたらす。 Ｔリンパ球活性化の開始には、抗原提示細胞の表面上の自己組織適合分子と抗 原の組合せとの抗原受容体の複雑な相互作用が必要とされる。Ｔリンパ球は同様 に、カルシウムイオノフォアー（例えばイオノマイシン）とフォルボールミリス テートアセテート(PMA)といったタンパク質キナーゼＣの活性化体の組合せとい った比較的単純な剌激によっても活性化され得る。フィトヘマグルチニン(PHA) を含むいくつかのレクチンも又、Ｔ細胞を活性化するのに使用可能である（Nowe ll（1960）Cancer Res．20：462） Ｔリンパ球活性化には、遺伝子の特定のサブセットの特異的調節が関与する。 Ｔ細胞活性化の特徴である転写調節は、抗原遭遇の数分後に始まり、少なくとも 10日後まで続く。Ｔリンパ球活性化遺伝子は、各遺伝子が転写される剌激後の時 間数に応じてグループ分けできる。早期遺伝子は、活性化プロセス中に発現され る、Ｔリンパ球活性化遺伝子の最初のサブセットである。早期の発現は、活性化 経路内のそれに続く遺伝子の転写変調を開始させる。免疫応答においてＴリンパ 球が非常に重要な役目を果たしていることから、サイクロスポリンＡ及びFK506 といった早期活性化遺伝子の発現と干渉する作用物質が、有効な免疫抑制薬であ る。 早期遺伝子の転写には、それ自体抗原受容体との反応を通して調節されるNF− ATといった特異的転写因子の存在が必要である。これらの転写因子は、早期活性 化遺伝子近くのエンハンサー及びプロモーター要素を通して作用してこれらの遺 伝子の転写速度を変調させるタンパク質である。これらの転写因子の多くは、エ ンハンサ要素の中及び近くにある特異的DNA 配列に可逆的に結合する。 インターロイキン−２（IL−２）遺伝子は、模範的な早期活性化遺伝子である 。IL−２遺伝子産物は、Ｔリンパ球の増殖及び分化において重要な役割を果たす 。IL−２遺伝子は、抗原受容体又はそれに付随する分子を通して剌激されたＴ細 胞の中においてのみ転写活性をもつ（Cantrell and Snuth（1984）Science 224 : 1312）。活性化されたＴリンパ球内のIL−２の転写誘発は、IL−２遺伝子のた めの転写開始部位の上流で325 の塩基対から延びる標準的早期遺伝子転写エンハ ンサーによって媒介される（Durand et al．(1988) Mol．Cell．Biol．８：1715 ）。その調節領域内にNF−AT認識部位を含むものとして知られているその他の遺 伝子としては、α−インターフェロン、IL−４，GM−CSF その他がある。本書中 IL−２エンハンサと呼ばれているこの領域は、Ｔリンパ球の活性化のための必要 条件を詳述に分析するために広範に使用されてきた。NF−AT，NFkb，AP−１，Oc t−１及び OAP−40と呼ばれる Oct−１と会合する新たに同定されたタンパク質 を含む一連の転写因子が、この領域内の配列と結合する（Ullman et al．(1991) Science 254 : 558）。これらの異なる転写因子は、一緒に作用して、Ｔリンパ 球の活性化の ための複雑な必要条件を統合する。 上述の転写因子グループの中でもNF−ATの存在は、その認識配列がトランスジ ェニック動物の活性化されたＴ細胞の中でリンケージされた非相同遺伝子の転写 を増強できるものであるという点で、早期活性化遺伝子が関与する転写事象に特 徴的なことである（Verweij et al.（1990）J．Biol．Chem．265 : 15788）。NF −AT配列要素は同様に、抗原受容体を通してか又はイオノマイシン及びPMA の組 合せを用いたＴ細胞の処理を通してのＴリンパ球の生理学的活性化の無い状態で 転写に対し剌激効果を全くもたない、IL−２エンハンサー中の唯一の既知の転写 要素でもある。例えば、NF−AT要素は、MHC 整合した抗原提示細胞による特異的 抗原の適切な提示を受けた、又はイオノマイシン／PMA の組合せによる刺激を受 けたＴリンパ球内で、リンケージされた配列の転写を増強させるものの、剌激を 受けていないＴリンパ球の中ではこれを増強しない（Durand et al．(1988)前掲 書中；Shaw et al．(1988) op．cit；Karttunen and Shastri（1991）Proc．Nat l．Acad．Sci．USA 88 : 3972 ; Verweij et al．(1990)前掲書中）。その上、N F−AT配列要素は、活性化されたＴリンパ球の中でのみ、IL−２遺伝子の転写を 天然に増強する。 IL−２エンハンサ内のその他の要素、例えばNFkb部位又はAP−１部位は、腫瘍 壊死因子α又は単にPMA 自体といったさほど特異的でない剌激に応えて転写を活 性化する。これらの化合物は、それ自体IL−２遺伝子及びその他の早期活性化遺 伝子の転写を活性化せず、又Ｔリンパ球の活性化も導かない。 このような観察事実は、インターロイキン−２遺伝子といったような或る種の 早期遺伝子の発現がタンパク質複合体NF−ATにより調節され得るということを示 している。同様にデーターからも、NF− ATの選択的遺伝子欠損が、重症複合型免疫不全（SCID）を発生させることがわか る（Chatilla et al．(1989) New Engl．J．Med．320 : 696）。 IL−２エンハンサの中の機能的配列の１つは、IL−２，IL−４及びその他の早 期活性化遺伝子の転写調節物質として機能するNF−AT（nuclear factor of acti vated Tlymphocytes）（活性化Ｔリンパ球の核因子）と呼ばれる多量体タンパク 質複合体のための結合部位である（Shaw et al．(1988) Science 241 : 202）。 NF−AT転写複合体は、抗原受容体からのシグナルに続いて形成される。NF−AT認 識部位に隣接する遺伝子の転写の増強には、NF−AT複合体が認識部位に結合する ことが必要である（Shaw et al．(1988)、前掲書中）。NF−ATの分子構成は完全 に規定されていないが、誘発のためにタンパク質合成を必要とする汎存核成分及 びNF−ATc と呼ばれるＴ細胞特異的構成性細胞質成分からNF−ATを再構成するこ とができる、ということが、諸々の研究によって報告されている(Flanagan et a l．(1991) Nature 352 : 803)。この細胞質成分NF−ATc は、免疫抑制薬サイク ロスポリンＡ(CsA)及びFK506 により阻害されるような形でカルシウムシグナリ ングに応答して核と会合する。NF−ATの核成分は、PMA で誘発され得、CsA 又は FK506 に対する感応性をもたず、HeLa及びCos といった非細胞由来の細胞の中に 見られる。 Northrop et al．(1993) J．Biol．Chem．268 : 2917は、NF−ATの核成分がフ ォルボールエステル誘発可能な転写因子AP−１(Jun/Fos)を含むことを報告して おり、又、Fos(AP−１の一成分)に対する抗血清が、AP−１に対する結合部位を 内含するDNA に対するNF−AT結合を阻害する、ということを示している。その上 、Northrop et al．は、おそらくNF−ATc を含有するＴリンパ球からの細胞質ゾ ルと混合された半精製AP−１タンパク質を用いてインビトロでNF− AT DNA結合を再構築できるということを示している。Northrop et al．は同様に 、AF−ATc の部分的精製についても報告しており、SDS−ポリアクリルアミドゲ ル電気泳動により見積られるような約94〜116kD の分子質量範囲をも報告してい る。 上述の通り、サイクロスポリンＡ(CsA)及びFK506 は、免疫抑制薬として作用 することができる。これらの作用物質は、Ｔ及びＢ細胞の活性化、肥満細胞脱顆 粒、及び有効な免疫応答にとって不可欠であるその他のプロセスを阻害する（Bo rel et al.（1976）Agents Actions ６：468 ; Sung et al．(1988) J．Exp．M ed．168 : 1539 ; Gao et al．Nature 336 : 176）。Ｔリンパ球の中で、これら の薬物は、Ｔ細胞抗原受容体に対する抗原の結合が、免疫応答の調整に関与する 特異的サイトカイン遺伝子の転写の増強を生み出すことになる、シグナル形質導 入経路内の１つの段階を分断する。従って、これらの作用物質は、Ｔリンパ球の 活性化を防ぎCrabtree et al．(1989) Science 243 : 355 ; Schreiber et al． (1989) Science 251 : 283 ; Hohman ＆ Hutlsch（1990）New Biol．２：663)、 免疫抑制薬として作用する。 FK506 及びCsA のための推定上の細胞内受容体についての記述がなされてきて おり、これはシス−トランス プロリルイソメラーゼであることがわかっている （Fischer ＆ Bang(1985) Biochem．Biophyo．Acta 828 : 39 ; Fischer et al ．Nature 337 ; 476 ; Hand-Schumacher et al．(1984) Science 226 : 544 : L ang ＆ Schmid(1988) Nature 331 : 453 ; Standaert et al．(1990) Nature 34 6 : 671）。薬物の結合は、イソメラーゼ活性を阻害する。ただし、その他のプ ロリルイソメラーゼ阻害物質での研究（Bierer et al．(1990) Science 250 : 5 56）及び酵母内でのサイクロスポリン耐性突然変異体の分析は、Ｔリンパ球活性 化の防止が、イソメラーゼ 活性自体の阻害からではなく、薬物とイソメラーゼが関与する阻害性複合体の形 成の結果としてもたらされるものであることを示唆している(Bierer et al．(19 96) Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．87 : 9231 ; Tropschung et al．(1989) Nature 342 ; 953)。CsA 及びFK−506 は、インターロイキン−２転写の誘発に とって必要とされるカルシウム依存性シグナリング事象を阻害することによって 、Ｔ細胞の増殖を妨げる。 さまざまなイソ型で発生するカルモジュリン依存性タンパク質であるカルシニ ューリンが、リンホカイン遺伝子といったNF−AT−依存性遺伝子の転写的活性化 を導くシグナル形質導入経路を通してのＴ細胞活性化の非常に重要な成分として 同定されてきた(Liu et al.（1991）Cell 66 : 807 ; Clipstone and Crabtree （1922）Nature 357 : 695 ; O'Keefe et al．(1992) Nature 357 : 692)。 NF−AT認識配列が関与する転写増強は、効めある濃度のサイクロスポリンＡ又 はFK506 で処理されたＴ細胞の中では、完全に遮断され、AP−１及びNF−KBとい ったその他の転写因子のための認識部位が関与する転写増強に対する特異的効果 はほとんど又は全く無い（Shaw et al．(1988)、前掲書中；Emmel et al.（1989 ）Science 246 : 1617 ; Mattila et al．(1990) EMBO J.9 ：4425）。この遮断 は、生理学的に過剰な量のカルシニューリンの発現によって少なくとも部分的に 克服することができる（Clipstone and Crabtree（1992）前掲書中）。 残念なことに、サイクロスポリンＡもFK506 も両方共効力ある免疫抑制物質で あるものの、両者共不利な特性を有している。例えば、サイクロスポリンは、腎 不全、振せん、悪心、高血圧を含む不利な反応を惹起する。実際、長年にわたり 、研究者は、より優れた代替物を開発することを試みてきており、その最も新し い候補がFK50 6 である。しかしながら、細胞内レベルでサイクロスポリン(又はFK506)が機能 するメカニズムを理解することなしに改良型免疫抑制薬を開発することは、極め て困難な研究努力であり、しかも成功の確率は制限されたものである。 従って、特にCsA 及びFK506 といった免疫抑制薬が早期活性化遺伝子の転写を 阻害するメカニズムに関して、NF−ATが関与するＴ細胞活性の機能ベースを理解 する必要性が著しく存在している。このような知識があれば、薬物候補をスクリ ーニングするための改良型検定が実現可能となるであろうし、このこと自体、研 究プロセスを劇的に増強できることであろう。免疫系の変調、特にＴ細胞活性化 の変調は又、NF−ATの量又は活性を直接変えることによっても実施できる。本発 明は、これらの及びその他のニーズを満たすものである。 本書で引用した参考文献は、本出願の提出日以前に開示されているという理由 だけで示されているものである。本書中のいかなるものも、先行発明に基づいて かかる開示の日付を先行させる権限が発明人に与えられていないことを容認する ものとしてみなされてはならない。発明の要約 本発明は、免疫応答を変調させ免疫応答のモジュレータについてスクリーニン グするためのいくつかの新しい方法及び組成物を提供する。これらの方法は、NF −ATc 組換え型タンパク質をコードするポリヌクレオチド配列及び、NF−ATc ポ リヌクレオチド配列と実質的に同一である相補的ポリヌクレオチドを利用する。 本発明の１つの態様においては、NF−ATc ポリペプチド及びその組成物が提供 されている。NF−ATc ポリペプチドには、図１に示さ れている配列と実質的に同一であるポリペプチド配列又は同起源のNF−ATc 遺伝 子配列が含まれている。 又、NF−ATc をコードする核酸配列が提供されている。図１のヌクレオチド及 び予測アミノ酸配列を含め、クローニングされた配列の特徴が与えられている。 これらの配列を含むポリヌクレオチドは、ヒトNF−ATc 及びマウスNF−ATc とい った大量のNF−ATc ポリペプチドの組換え型発現のための鋳型として役立つ可能 性がある。これらの配列を含むポリヌクレオチドは同様に、インサイチュハイブ リダイゼーションによる個々のリンパ球（又はその他の細胞型）の中で、そして ノーザンブロット分析及び／又はインサイチュハイブリダイゼーション(Alwine et al．(1977) Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．74 : 5350)及び／又はPCR 増幅及び／又はLCR 検出により特定のリンパ球集団の中で、NF−ATc mRNAの転写 及びmRNA発生度を検出するため、核酸ハイブリダイゼーション用のプローブとし ても役立つことができる。かかる組換え型ポリペプチド及び核酸ハイブリダイゼ ーションプローブは、免疫調節作用物質についてのインビトロスクリーニング方 法のため、そして移植片拒絶反応、Ｔ細胞媒介免疫応答、NF−AT活性が疾病の経 過に寄与するリンパ性白血病（例えばＴ細胞白血病又はリンパ腫）、自己免疫疾 患、関節炎などといった病的条件及び遺伝子疾患の診断及び治療のために有効で ある。 一実施態様においては、候補の免疫調節作用物質は、NF−ATのその他の成分（ 例えばAP−１）に対するNF−ATc ポリペプチドの結合を遮断する及び／又はNF− AT認識部位をもつDNA に対するNF／ATの結合を遮断するその能力によって同定さ れる。DNA は好ましくは、NF−ATタンパク質複合体が特異的に結合する単数又は 複数のNF−AT結合部位を含んでいる。DNA に対するNF−ATc を含むNF−ATタンパ ク質の結合を検出するための１つの手段は、固体支持体に対する共有又は非共有 化学結合などによってDNA を固定化し、検出可能な標識（例えば放射標識付けさ れたアミノ酸の取込みによる）で標識付けされたNF−ATc ポリペプチドを含むNF −ATタンパク質複合体と、固定化されたDNA を接触させることにある。このよう な接触は、標準的には、NF−AT結合配列を含む標的DNA に対するNF−ATタンパク 質の結合を可能にする水性条件下で行なわれる。固定化されたDNA に対する標識 付けされたNF−ATの結合は、特異的結合相互作用の結果として標識付けされたNF −ATc ポリペプチドが固定化される程度を決定することによって測定される。か かる特異的結合は可逆的であってもよいし、或いは又、架橋剤が適切な実験条件 下で添加される場合には任意に不可逆的であってもよい。 一つの態様においては、候補の免疫調節作用物質は、NF−AT複合体（例えば、 AP−１，Jun B.など）を含む他のポリペプチドとNF−ATc の間の分子間結合を阻 害（又は増強）することのできる作用物質であるものとして同定される。本発明 は、水性結合条件下でのその他のNF−ATポリペプチド種に対するNF−ATc の結合 と干渉する能力について、作用物質ライブラリをスクリーニングするための方法 及び組成物を提供する。標準的には、少なくともNF−ATc 及び／又はもう１つの NF−ATポリペプチド種のいずれかが検出可能な標識で標識付けされ、NF−ATc と その他のNF−ATポリペプチド種の間の分子間結合が、NF−AT複合体などの中に捕 獲された標識付き種の量によって検知される。 本発明は同様に、同起源のmRNA種の転写及び／又は翻訳を阻害しかくして１つ の細胞（例えば患者のＴリンパ球）の中のそれぞれのNF−ATc タンパク質の量の 減少を行なうために利用されるNF−ATc 配列と相補的なアンチセンスポリヌクレ オチドをも提供する。この ようなアンチセンスポリヌクレオチドは、Ｔ細胞の活性化のために必要とされる NF−ATタンパク質の形成を阻害することにより免疫調節薬として機能できる。 本発明の一変形態様においては、本発明のポリヌクレオチドは、Ｔ細胞新生物 又はＴ細胞機能亢進又は機能低下が関与する病的条件又は遺伝子疾患、さらに特 定的にはNF−ATc ポリペプチドの構造又は発生度、NF−ATc ポリヌクレオチド配 列又はNF−ATc 遺伝子又はフランキング領域の構造の変更が関与する条件及び疾 患の診断のために利用される。 本発明は同様に、少なくとも１×10⁷Ｍ^-1の親和力でNF−ATc に結合し、活性 化されたＴ細胞内に存在するその他のタンパク質に対する特異的な高親和力結合 の欠如している抗体も提供している。かかる抗体は、活性化されたＴ細胞に対す る診断となるよう検定を標準化することによって決定された増大した量のNF−AT c タンパク質を含む細胞であるものとして、患者からの細胞試料（例えばリンパ 球試料、固体組織生検）内のＴ細胞（例えば活性化可能なＴ細胞）を同定するた めの診断試薬として使用できる。往々にして、抗−NF−ATc 抗体は、細胞試料の インサイチュでの免疫組織病理学的染色のため、診断試薬として含み入れられる 。付加的には、Ｔ細胞に対するターゲティングされた送り出し（例えばカチオン 化又はリボソーム／免疫リボソーム送り出しによる）により、抗−NF−ATc 抗体 を治療用に用いることができる。 本発明は同様に、患者から外植された細胞内のNF−ATc mRNAの検出又は疾病特 徴的NF−ATc 対立遺伝子の検出（例えばRFLP又は対立遺伝子特異的PCR 分析によ る）による新生物又は免疫状態の診断のためのNF−ATc ポリヌクレオチドプロー ブも提供する。疾病特徴的NF−ATc 対立遺伝子とは、予め定められた疾病の存在 又は１つの疾 病を発生する性向と統計学的に相関関係づけされる対立遺伝子のことである。標 準的には、検出は、標識づけされた（例えば³²Ｐ，³⁵Ｓ，¹⁴Ｃ，³Ｈ、螢光、ビ オチニル化、ジゴキシゲニル化）NF−ATc ポリヌクレオチドを用いてインサイチ ュハイブリダイゼーションによるものであるが、NF−ATc 特異的プライマを用い たPCR 増幅と同様、細胞試料から分離されたポリＡ⁺RNA 又はバルクRNA につい ての溶液ハイブリダイゼーション、ノーザンブロット法、又はドットブロット法 を使用することもできる。かくして、活性化されたＴ細胞又は活性化可能なＴ細 胞以外の細胞又は細胞型についての標準対照値と比較して増大した量のNF−ATc mRNAを含む細胞が、活性化されたＴ細胞又は活性化可能なＴ細胞として同定され ることになる。同様にして、細胞試料中のNF−ATc 遺伝子座又は密にリンクした 遺伝子座の疾病特徴的再配置又は増幅の検出は、病的条件の存在又は病的条件（ 例えばガン、遺伝子疾患）を発生させる素因の存在を同定することになる。 本発明は同様に、人間の患者からの生物学的試料内に予め定められた疾病特徴 的濃度のNF−ATc タンパク質又はNF−ATc mRNAが存在するか否かを決定するため に診断検定（例えば、特異的にヒトNF−ATc に結合する抗体による、固定された リンパ球の免疫組織化学染色）が使用される、人間の患者の体内のＴ細胞機能亢 進又は機能低下を診断するための方法も提供している：検定が、かかる予め定め られた疾病特徴的濃度以上でNF−ATc タンパク質又はNF−ATc mRNAの存在を示し た場合、その患者は、Ｔ細胞機能亢進又は機能低下条件又は移植片拒絶反応など を有するものとして診断される。 本書中の全ての公報及び特許出願は、その各々の個々の公報又は特許出願が特 定的かつ個別に参考として内含されるべく指示さた場合と同じ意味で、参照とし て内含されている。図面の簡単な説明 図１（図版ａ及びｂ）は、ヒトNF−ATc cDNAのヌクレオチド配列と、演繹され たアミノ酸配列を示す。ヒトＴリンパ球からのNF−ATc のヌクレオチド配列及び 完全な予測アミノ酸配列。予測されたヒト配列内で同定されたウシペプシド（配 列は完全に保存されていない）には下線が付されている。cDNAは、正準ポリアデ ニル化シグナルとポリＡテイルで終結する。 図２は、Ｔ細胞（ジャーカット）及び非Ｔ細胞(Cos)内のNF−ATc タンパク質 の発現を示す。 図３（図版ａ及びｂ）は、NF−ATc cDNAクローンが、NF−AT部位からの転写を 活性化し、非Ｔ細胞内のIL−２プロモータを活性化することのできるタンパク質 をコードする、ということを示している。 図４は、NF−ATc，NF−ATp 及びRel 系統群のメンバー間の相同性を示す。マ ウスのNF−ATp 及びRel タンパク質Dorsal（ショウジョウバエ軸決定タンパク質 ）、ヒトｃ−Rel，NF−kBp50 及びNF−kBp65 のタンパク質配列は、NF−ATc の 配列に整列させられている。番号づけは、NF−ATc との関係におけるものである 。NF−ATc との同一性、開放囲み；既知の残基の機能又は構造の類似性、影付き 部域。星印は、NF−ATc が、（１）その他のRel タンパク質の大部分に対し反転 した電荷をもつか、又は（２）潜在的塩橋残基をヒスチジン又はその他のキレー ト化残基と置換した領域を表わしている。下部部分はNF−ATc 及びNF−ATp の概 略図を示す。 図５（図版ａ−ｃ）。図版ａ：ジャーカット細胞（レーン１〜６）又はHeLa細 胞（レーン７）からのRNA を用いたヒトNF−ATc に対するリボヌクレアーゼの防 御。予想される特異的リボヌクレアーゼ耐性フラグメントは、304 のヌクレオチ ド（矢印）である。HeLa細 胞は、剌激を受けなかった。ジャーカット細胞は、剌激を受けなかったか又は、 ３時間20ng／mlのPMA 及び２μＭのイオノマイシンで剌激され、剌激後指示され た回数だけ±100ng／mlのCsA が添加された。図版ｂ：以下のヒト細胞からのRNA : KJ(preB細胞ALL)，JD−１（Ｂ細胞系列ALL），K562（赤白血症細胞系統）、C ML(骨髄性白血病患者からの骨髄細胞)、ヒト筋組織、HepG２（肝細胞系統）、HP B ALL(剌激を受けていないか又は30分間２μｇ／miのPHA と50ng／mlのPMA で剌 激を受けたＴ細胞系統）及びリボヌクレアーゼ防御で分析されたHeLa細胞。この ゲルのより長い露出は、K562細胞系統が少量のNF−ATc 写しを含んでいることを 表わしている。図版ｃ：マウスの組織及びNF−AT−Tag トランスジェニックマウ スから誘導された皮ふ腫瘍の中のNF−ATc(上部図版及びNF−ATp(下部図版)mRNA 発現(Verweij et al.（1990）J．Biol．Chem．265 : 15788〜15795)。細胞は、 剌激を受けていないか又は３時間20ng／mlのPMA 及び２μＭのイオノマイシンで の剌激を受けたものである。RNA は、マウスのDNA プローブを用いて定量リボヌ クレアーゼ防御により測定された。プローブと相同なフラグメントの予測された サイズは矢印により表わされている。 図６（図版ａ〜ｄ）。図版ａ：Cos細胞及びジャーカット細胞は、NF−AT又はH NF−１（β28）のためのリポーター構成体でトランスフェクションされた。NF− ATc(＋NF−AT)又はHNF−１α（＋HNF−１）のための同時トランスフェクション された発現ベクターは、指示されている場合に内含され、そうでない場合、空の pBJ5ベクターが内含された。細胞は指示通りに剌激を受けた：PMA,Ｐ＋Ｉ(PAMプ ラスイオノマイシン)。図版ｂ：Cos細胞はIL−２ルシフェラーゼ及びａにあるよ うな発現ベクターでトランスフェクションされた。剌激はａにある通りであった 。ａ及びｂ内のデータは、空のpB J5ベクターを伴う剌激無しの値に対するルシフェラーゼ活性の誘発倍数として表 わされている。棒は２〜３回の独立したトランスフェクションの平均と範囲を表 わす。図版ｃ：Cos細胞中のNF−ATc の発現は、特異的DNA 結合活性を発生させ る。pBJ5（レーン１及び３）で、NF−ATc(レーン２及び４〜７)でトランスフェ クションされたCos 細胞から、トランスフェクションされていないジャーカット 細胞から（レーン８〜11）の核抽出物を用いて、又はHeLa核抽出物（レーン15〜 16）と組合わされたpBJ5−又はNF−ATc でトランスフェクションされたCos 細胞 （レーン12〜13，15〜16）からの細胞質を用いてゲル移動度がシフトする。レー ン14，HeLa核抽出物単独。標識づけされたAP−１（レーン１〜２）又はNF−AT（ レーン３〜16）のプローブ及び低温の競争的オリゴヌクレオチドが表わされてい る。矢印は、特異的AP−１及びNF−AT複合体を表わす。図版ｄ：NF−ATの抗血清 に誘発されたスーパーシフト。NF−AT及びAP−１のゲル移動度は、刺激されたジ ャーカット細胞又はマウス胸腺細胞からの核抽出物を用いてシフトする。指示さ れている通り、抗血清、前免疫が全く含まれていないか或いは２つの異なる免疫 抗血清のうちの一方が含まれているかのいずれかであった。矢印は、特異的なNF −AT又はAP複合体又はスーパーシフトされたNF−AT複合体（^*）を表わす。 図７は、優性−陰性NF−ATc を示す。ジャーカットTag 細胞は、ベクタープラ スミド（対照）又は優性陰性NF−ATc プラスミド、そしてそれに加えて、表示さ れている分泌されたアルカリ性ホスファターゼリポータープラスミドで、トラン スフェクションされた。トランスフェクションを受けた細胞は、トランスフェク ションから24時間後に、新鮮な培地に移され、分泌されたアルカリ性ホスファタ ーゼ活性が、１μＭのイオノマイシンプラス20ng／mlのPMA(NF−AT c 及びIL−２リポーター)、20ng／mlのPMA 単独(APIリポーター)での剌激後、又 は全く剌激無しで(RSVリポーター)、16〜24時間後に測定された(Clipstone and Crabtree（1992）Nature 357 : 695〜698)。棒は、対照プラスミドと並行してト ランスフェクションを受けた細胞からの活性の百分率として、優性陰性NF−ATc でトランスフェクションされた細胞からの分泌されたアルカリ性ホスファターゼ 活性を示し、（ｎ）回の独立したトランスフェクションから得られたデータを表 わしている。優性陰性NF−ATc は、アミノ酸463で PruII部位まで延びるエピト ープで標識されたNF−ATc のカルボキシ末端切形から成る。 図８は、ジャーカット細胞内で発現されたエピトープで標識付けされたNF−AT c の移動度の変化を示す。細胞は、図２にあるようにNF−ATc でのトランスフェ クションを受け、２時間±100ng／mlのCsA で、示されているとおりに剌激を受 けた。全細胞リゼイトを、図２にある通り、ウェスタンブロット法によって分析 した。定義 相反する定義づけのないかぎり、本書で使用されている全ての技術的及び科学 的用語は、本発明が属する技術分野の当業者によって一般的に理解されているも のと同じ意味を有する。本書で記述するものと類似又は等価のあらゆる方法及び 材料を本発明の実施又は試験において使用することができるが、好ましい方法及 び材料がここでは記述されている。本発明においては、以下の用語は次のように 定義づけされる。 本書で使用される通り、20の従来のアミノ酸及びその略号は、慣用に従う（本 書に参考として内含されているImmunology - A Synthesis第２版、E．S．Golus 及びD．R．Gren．Eds.，Sinauer Associates，Sunderland，Massachusetts(1991 )）。20の従来のアミノ酸 の立体異性体（例えばＤ−アミノ酸）、非天然アミノ酸例えばα−α−ジ置換ア ミノ酸、Ｎ−アルキルアミノ酸、乳酸及びその他の非慣習的アミノ酸も同様に、 本発明のポリペプチドのための適切な成分であり得る。非慣習的アミノ酸の例と しては、４−ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、ε−Ｎ，Ｎ， Ｎ−トリメチルリシン、ε−Ｎ−アセチルリシン、ｏ−ホスホセリン、Ｎ−アセ チルセリン、Ｎ−ホルミルメチオニン、３−メチルヒスチジン、５−ヒドロキシ リジン、ω−Ｎ−メチルアルギニン及びその他の類似のアミノ酸及びイミノ酸（ 例えば４−ヒドロキシプロリン）が含まれる。本書で使用されているポリペプチ ド表記法において、標準的な慣用、慣習に従って、左方向はアミノ末端方向であ り右方向はカルボキシ末端方向である。同様にして、相反する規定のないかぎり 、１本鎖ポリヌクレオチド配列の左端部は５′末端、２本鎖ポリヌクレオチド配 列の左方向は５′末端と呼ばれる。未完成RNA 写しの５′→３′付加の方向は転 写方向と呼ばれる；RNA と同じ配列をもちRNA 写しの５′末端に対し５′のとこ ろにあるDNA ストランド上の配列領域は「上流配列」と呼ばれる；RNA と同じ配 列をもちRNA 写しの３′末端に対し３′のところにあるDNA ストランド上の配列 領域は「下流配列」と呼ばれる。 物に対し適用される本書で使用する「自然に発生する」という語は、その物が 自然の中に見い出すことのできるものであることを意味する。例えば、自然の中 の供給源から分離でき人間が実験室内で意図的に修正したものでない生体（ウイ ルスを含む）内に存在するポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、「自然に 発生する」ものである。 「〜に対応する」という語は、ここでは、１つのポリヌクレオチド配列が基準 のポリヌクレオチド配列の全部又は一部分と相同であ る（すなわち進化論上厳密に関係をもたずに同一である）こと、又はポリペプチ ド配列が基準ポリペプチド配列と同一であることを意味するのに用いられる。こ れとは対照区別して、「〜に相補的である」という語は、ここでは、相補的配列 が基準ポリヌクレオチド配列の全部又は一部分と相同であることを意味するのに 用いられる。例を挙げると、ヌクレオチド「TATAC」は基準配列「TATAC」に対応 し、かつ基準配列「GTATA」と相補的である。 以下の用語は、２つ以上のポリヌクレオチドの間の配列関係を記述するのに使 用される：「基準配列」「比較ウインドウ」、「配列同一性」、「配列同一性の 百分率」及び「実質的同一性」。「基準配列」は、配列比較のための基礎として 用いられる規定の配列である。基準配列は、例えば図１のポリヌクレオチド配列 といった配列リストの中に示された全長cDNA又は遺伝子配列の１セグメントとし てのより大きい配列のサブセットでもあり得るし、又は完全なcDNA又は遺伝子配 列を含んで成っていてもよい。一般に、基準配列は長さ20ヌクレオチド以上、往 々にして長さ25ヌクレオチド以上、往々にして長さ50ヌクレオチド以上である。 ２つのポリヌクレオチドは各々（１）２つのポリヌクレオチドの間で類似である １つの配列（すなわち完全ポリヌクレオチド配列の一部分）を含んでいてよく、 又（２）さらに、２つのポリヌクレオチドの間で互いに異なる１つの配列を含ん でいてもよいことから、２つ（又はそれ以上）のポリヌクレオチドの間の配列比 較は、標準的には、配列類似性の局所的領域を同定し比較するべく１つの「比較 ウインドウ」全体にわたり２つのポリヌクレオチドの配列を比較することによっ て行なわれる。ここで使用される「比較ウインドウ」は、１つのポリヌクレオチ ドを少なくとも20の隣接するヌクレオチドの基準配列と比較することができ、又 その中のポリヌクレオチド配列の一部分が２つの配列 の最適なアラインメントについて（付加又は欠失を含まない）基準配列に比較し て20パーセント以下の付加又は欠失（すなわちギャップ）を含み得るような、少 なくとも20の隣接ヌクレオチド位置から成る概念的セグメントのことを意味する 。比較ウインドウを整列させるための最適な配列アラインメントは、Smith and Waterman（1981）Adv．Appl．Math.2：482、局所的相同性アルゴリズム；Needli man and Wunsch（1970）J．Mol Biol. 48 : 443 の相同性アラインメントアルゴ リズム；Pearson and Lipman（1988）Proc．Natl．Acad．Sci.（U．S．A.）85の 類似性探索方法；又これらのアルゴリズムのコンピュータ処理された実行（Wisc onsin Genetics Software Package Release 7.0 の中のGAP．BESTFIT，FASTA、 及びTFASTA，Genetics Computer Group，575 Science，Pr.，Madison，WI）又は 検査によって、行なうことができ、さまざまな方法により生成された最高のアラ インメント（すなわち、比較ウインドウ全体にわたり最も高い相同性百分率を結 果としてもたらすもの）が選択される。「配列同一性」という語は、比較ウイン ドウ全体にわたり２つのポリヌクレオチド配列が同一であること（すなわちヌク レオチド毎のベースで）を意味する。「配列同一性百分率」は、比較ウインドウ 全体にわたり２つの最適に整列された配列を比較し、整合した位置の数を生み出 すべく両方の配列内で同一の核酸塩基（例えばＡ．Ｔ．Ｃ．Ｇ．Ｕ．又はＩ）が 起こる位置の数を決定し、整合した位置の数を比較ウインドウ内の合計位置数（ すなわちウインドウサイズ）で除し、その結果に100 を乗じて配列同一性百分率 を得ることによって、計算される。本書中に使用されている「実質的同一性」と いう語はポリヌクレオチドが、少なくとも20のヌクレオチド位置から成る比較ウ インドウ、頻繁には少なくとも25〜50のヌクレオチドから成るウインドウ全体に わたり基準配列と比べて少なくとも85 パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性 、より通常には少なくとも99パーセントの配列同一性をもつ１つの配列を含み、 この配列同一性百分率が、合計が比較ウインドウ全体にわたり基準配列の20パー セント以下となる欠失又は付加を内含しうるポリヌクレオチド配列に対し基準配 列を比較することによって計算されている、ポリヌクレオチド配列の特徴を表わ している。基準配列は、例えば図１に示されている全体ヒトNF−ATc ポリヌクレ オチド配列又は全長マウス又はウシNF−ATc cDNA配列の１セグメントとしてのよ り大きい配列のサブセットであってよい。 ポリペプチドに対して適用される「実質的同一性」という語は、２つのペプチ ド配列が、例えば省略時ギャップ重量を用いてプログラムGAP 又はBESTFIT など によって最適に整列させられたとき、少なくとも80パーセントの配列同一性、好 ましくは90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセント以 上の配列同一性（例えば99パーセントの配列同一性）を共有することを意味して いる。好ましくは、同一でない残基位置は、保存的アミノ酸置換によって異なっ ている。保存的アミノ酸置換というのは、類似の側鎖をもつ残基の互換性のこと を意味する。例えば、脂肪族側鎖をもつアミノ酸のグループはグリシン、アラニ ン、バリン、ロイシン及びイソロイシンである；脂肪族ヒドロキシル側鎖をもつ アミノ酸グループは、セリン及びトレオニンである；アミド含有側鎖をもつアミ ノ酸グループは、アスパラギン及びグルタミンである；芳香族側鎖をもつアミノ 酸グループはフェニルアラニン、チロシン及びトリプトファンである；塩基性側 鎖を有するアミノ酸グループはリジン、アルギニン及びヒスチジンである；硫黄 含有側鎖をもつアミノ酸グループはシステイン及びメチオニンである。好ましい 保存的アミノ 酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、 リジン−アルギニン、アラニン−バリン及びアスパラギン−グルタミンである。 本書で用いられている「NF−ATc 未変性タンパク質」及び「全長NF−ATc タン パク質」という語は、図１に示されている演繹されたアミノ酸に対応するか又は 同起源の全長cDNAの演繹されたアミノ酸配列に対応する自然に発生するNF−ATc ポリペプチドのことを意味する。同様に例えば、NF−ATc 遺伝子を発現する自然 に発生するリンパ球の中に存在する未変性NF−ATc タンパク質は、全長NF−ATc タンパク質とみなされる。 本書にて使用されている「NF−ATc フラグメント」という語は、アミノ末端及 び／又はカルボキシ末端欠失を有するものの、残りのアミノ酸配列が、全長cDNA 配列（例えば図１に示されているcDNA配列）から演繹されたNF−ATc 配列の中に 対応する位置と同一であるポリペプチドのことを意味する。NF−ATc フラグメン トは、標準的には、少なくとも長さがアミノ酸14個、好ましくは20個、通常は少 なくとも50個以上である。 本書で使用する「NF−ATc 類似体」という語は、図１に示されている演繹され たアミノ酸配列の一部分と実質的同一性をもち、かつ（１）適切な結合条件下で のその他のNF−ATタンパク質（例えばAP−１）に対する結合又は（２）Ｔ細胞活 性化の時点で核に局在化する能力、という特性のうちの少なくとも１つを有する 少なくとも25個のアミノ酸の１セグメントから成るポリペプチドのことを意味す る。標準的には、NF−ATc 類似体ポリペプチドは、自然に発生する配列との関係 において保存的アミノ酸置換（又は付加又は欠失）を含んで成る。NF−ATc 類似 体は、標準的には長さが少なくともアミノ酸20個、好ましくは50個以上、最も普 通には全長といった長いも のである自然に発生するNF−ATc(例えば図１に示されているような)である。NF −ATc 類似体の中には、生物活性が欠如しているものの、例えばNF−ATc エピト ープに対する抗体を発生させるため、アフィニティクロマトグラフィによりα− NF−ATc 抗体を検出及び／又は精製するための免疫学的試薬として、又は、未変 性NF−ATc タンパク質機能の競合的又は非競合的アゴニスト、アンタゴニスト又 は部分的アゴニストとして、といったさまざまな用途のためになおも使用できる ものがある。 ここで「NF−ATc ポリペプチド」という語は、NF−ATc の未変性タンパク質、 フラグメント又は類似体を意味する包括的な語として用いられている。従って、 未変性NF−ATc，NF−ATc のフラグメント及びNF−ATc の類似体は、NF−ATc ポ リペプチド属の種である。好ましいNF−ATc ポリペプチドとしては、図１に示さ れているポリペプチド配列を含むヒト全長NF−ATc タンパク質又は、基本的に表 IIに示されている配列から成るポリペプチドが含まれる。 ここで使用されている「同起源ａ」という語は、種の間で進化論的にかつ機能 的に関係のある遺伝子配列のことを意味している。例えば、制限的な意味はない ものの、ヒトゲノムの中で、ヒトCD４遺伝子はマウスCD４遺伝子に対する同起源 の遺伝子である。というのも、これら２つの遺伝子の配列及び構造により、それ らが高い相同性をもつことがわかり、又両遺伝子共MHC クラスIIで制限された抗 原の認識を通してＴ細胞の活性化をシグナリングする上で機能するタンパク質を コードするからである。かくして、ヒトNF−ATc 遺伝子に対する同起源のマウス 遺伝子は、ヒトNF−ATc タンパク質に対する最大レベルの配列同一性をもち（例 えばＴ系列細胞内で発現された）ヒトNF−ATc のものに類似する発現パターンを 示す発現されたタンパク質をコードするマウスの遺伝子である。好ましい同起源 NF−ATc 遺伝子は、ラットNF−ATc、ウサギNF−ATc、イヌNF−ATc、ヒト以外の 霊長類のNF−ATc、ブタNF−ATc、ウシNF−ATc 及びハムスターNF−ATc である。 「NF−ATc 依存型遺伝子」という語はここでは、（１）その遺伝子の第１のコ ーディング配列から約10キロベース以内にあるNF−ATc 結合部位（適切な結合条 件下でNF−ATにより特異的にフットプリントされ得る部位）を有し、（２）前記 遺伝子のための主要な又は副次的転写出発部位から増大又は減少させられた転写 速度の変更を示し、かかる転写速度の変化が、活性化されたＴ細胞内といったNF −AT複合体の中のNF−ATc ポリペプチドの存在と相関関係をもっている遺伝子を 意味するものとして使用されている。 「変更された変調能力」という語はここでは、遺伝子の転写を増強するか又は 阻害する能力を意味するものとして用いられている。かかる増強又は阻害は、Ｔ 細胞剌激といった特異的事象の出現を条件とする可能性がある。この変更は通常 Ｔ細胞刺激の後に起こるIL−２遺伝子の転写増強の阻害として現われることにな る。転写の増強又は阻害を変調させる能力の変更は、上述のIL−２の例にあるよ うな遺伝子の誘発可能な転写に影響を及ぼす可能性もあるし、或いは又遺伝子の 塩基レベルの転写に影響を及ぼす可能性もあり、その両方のこともある。 「作用物質」という語はここでは、化学的化合物、化学的化合物の混合物、生 物巨大分子又は細菌、植物、真菌又は動物（特に哺乳動物）の細胞又は組織とい った生物材料から作られた抽出物を意味するものとして用いられている。作用物 質は、以下で記述するスクリーニング検定における内含により、免疫調節作用物 質（例えば免疫抑制薬）としての潜在的活性について評価される。 「免疫調節作用物質候補」という語は、ここでは、推定上の免疫 調節作用物質として本発明の単数又は複数のスクリーニング方法により同定され ている作用物質を意味するものとして用いられている。いくつかの免疫調節作用 物質候補は、人間に使用するための薬物として治療的効力を有し得る。 本書で使用されている「標識づけする」又は「標識付けされた」という語は、 放射標識付けされたアミノ酸の取込み又は、マークされたアビジン（光学的又は 比色分析方法により検出できる螢光マーカー又は酵素活性を含むストレブトアビ ジン）によって検出できるビオチニル半分のポリペプチドに対する付着による、 検出可能なマーカーの取込みのことを指す。当該技術分野においては、ポリペプ チド及び糖タンパク質のさまざまな標識付け方法が知られており、使用可能であ る。ポリペプチドのための標識の例としては、放射性同位元素（例えば³Ｈ，¹⁴ Ｃ，³⁵Ｓ，¹²⁵Ｉ，¹³¹Ｉ）、螢光標識（例えばFITC、ローダミン、ランタニドリ ン光体）、酵素標識（例えばホースラディッシュペルオキシダーゼ、β−ガラク トシダーゼ、ルシフェラーゼ、アルカリ性ホスファターゼ）、ビオチニル基、二 次レポータにより認識される予め定められたポリペプチドエピトープ（例えば、 ロイシンシッパー対配列、二次抗体用結合部位、金属結合ドメイン、エピトープ タブ）などが含まれるが、これらに制限されるわけではない、いくつかの実施態 様においては、潜在的立体障害を低減させるためさまざまな長さのスペーサーア ームによって標識が付着されている。 本書で使用する「実質的に純粋な」という語は、対象の種が、存在する優占種 であること（すなわちモルベースでそれが組成物内のその他のどの個々の種より も豊富であること）を意味し、好ましくは、実質的に精製された分画は、対象の 種が、存在する巨大分子種全ての少なくとも約50パーセント（モルベースで）を 構成している ような組成物である、一般に、実質的に純粋な組成物は、組成物内に存在する全 ての巨大分子種の約80〜90パーセント以上を含むことになる。最も好ましくは、 対象の種は、組成物が基本的に単一の巨大分子種から成る本質的な均質性にまで 精製される（従来の検出方法により、組成物内に汚染種を検出することはできな い）。アルカリ／SDS 処理、CsClバンディング、カラムクロマトグラフィ、アガ ロースゲル電気泳動及びその他の当該技術分野において周知の方法を含む標準的 方法によって、又は異種宿主細胞内での複製（例えばヒト以外の細胞内のヒトNF −ATc ポリヌクレオチド）によって、その他の自然に発生する細胞成分又はその 他の汚染物質、例えばその他の細胞核酸又はタンパク質から離れるように精製さ れたとき、核酸は「分離された」か又は「実質的に純粋な状態にされた」ことに なる。又、ポリペプチドは、ポリペプチド種と合わさって自然に発生するその他 の細胞成分又は汚染物質から離れるように精製されたとき、「分離された」こと になる。例えば、その他のヒトタンパク質から実質的に精製されたヒトNF−ATc ポリペプチドは、非ヒト細胞（例えばCos 細胞、マウス細胞、CHO 細胞、酵母又 は細菌）の中で発現されるヒトNF−ATc ポリペプチドのように、分離されている 。 本書中で使用されている「疾病特徴的濃度」、「疾病特徴的量」及び「疾病特 徴的染色パターン」という語は、機能亢進又は機能低下Ｔ細胞条件又は移植片拒 絶といった疾病を発生させる素因の存在を表わす。試料中のそれぞれNF−ATc タ ンパク質又はmRNAの濃度、量又は局在化パターンのことを意味する。疾病特徴的 量は、将来の及び／又は既往の臨床統計研究により設定された正常な臨床値範囲 の外にある細胞又は細胞試料中のNF−ATc タンパク質又はNF−ATcmRNAの量であ る。一般に、新生物性疾患（例えばリンパ性白血病） 又はＴ細胞媒介免疫応答を有する個体は、正常で病気のない個体を特徴づける濃 度範囲よりも高い細胞又は組織試料内のNF−ATc タンパク質又はmRNAの量を示す ことになる；標準的には、疾病特徴的濃度は、平均正常値よりも少なくとも約１ 標準偏差だけ高く、さらに通常は、平均正常値より少なくとも２標準偏差以上だ け高い。しかしながら、基本的に、全ての臨床的診断試験は、何パーセントかの 偽陽性及び偽陰性を生み出す。診断検定の感受性及び選択性は、診断的目標及び 関連するあらゆる規則上の規定要件を満たすのに充分なものでなくてはならい。 一般に、本発明の診断方法は、疾病の候補として個体を同定し、有能な保健専門 家が行なう疾病の鑑別診断において付加的なパラメータを提供するのに用いられ る。詳細な説明 一般に、以下で使用する名称、及び以下で記述する細胞培養、分子遺伝子学及 び核酸化学及びハイブリダイゼーションにおける実験室手順は、当該技術分野に おいて周知でかつ一般に利用されているものである。組換え型核酸方法、ポリヌ クレオチド合成及び微生物培養及び形質転換（例えば電気穿孔法、リポフェクシ ョン）のためには標準的技法が用いられる。一般に、酵素反応及び精製段階は、 メーカーの仕様に従って実施される。技術及び手順は一般に、当該技術分野にお いて慣習的な方法及び、本書全体を通して提供されているさまざまな一般的参考 文献（一般的には、本書に参考として内含されているSambook et al.，分子クロ ーニング：実験室マニュアル、第２版（1989），Cold Spring Harbor Laborator y Press，Cold Spring Harbor，N．Y を参照のこと）に従って行なわれる。その 中の手順は、当該技術分野において周知であると考えられ、読者の便宜のために 提供されているものである。その中に含まれている情 報は全て本書に参考として内含されている。 オリゴヌクレオチドは、メーカーが提供する仕様に従ってApplied Bio System s のオリゴヌクレオチド合成装置上で合成可能である。 PCR 増幅の方法は、当該技術分野において記述されている（本書に参考として 内含されている(PCR技術：その原理とDNA 増幅への応用。ed．HA Erlich，Freem an Press，New York，NY（1992）；PCRプロトコル：方法と応用に対する指針。e ds．Innis，Gelfland，Shisky、及びWhite，Academic Press，San Dieg，CA（19 90）；Mattila et al．(1991) Nucleic Acids Res．19 : 4967 ; Eckert．K．A 及びKunkel，T．A．(1991) PCRの方法と応用１：17；PCR, eds．McPherson，Qui rkes、及びTaylor，IRL Press，Oxford；及び米国特許第 4,683,202号）。 1991年８月22日付けで提出された共同で譲渡された出願U．S．S．N．07/749,3 85が本書に参考として内含されている。NF−ATc ポリヌクレオチドのクローニング NF−ATc をコードするゲノミック又はcDNAクローンを、図１に示されているヌ クレオチド配列に基づいて設計されたハイブリダイゼーションプローブを用いて 、又従来のハイブリダイゼーションスクリーニング方法(例えば、Benton WD 及 びDavis RW(1977), Science 196 : 180 ; Goodspeed et al．(1989) Gene 76： １；Dunn et al．(1989) J．Biol．Chem．264 : 13057)を用いて、クローンライ ブラリ（例えば、Clontech，Palo Alto．CA から入手可能なもの）から分離する ことができる。 cDNAクローンが望まれる場合、Ｔ細胞mRNAから誘導されたcDNAを含むクローン ライブラリが好ましい。標準的には、適当なハイブリダイゼーションプローブは 、通常NF−ATc mRNA配列のコーディング 部分（すなわち、図１に示されている番号付けの慣習に従うとおよそヌクレオチ ド240 からおよそヌクレオチド2390まで）を表わす、図１に示されたヌクレオチ ド配列の少なくとも35〜50個の隣接するヌクレオチドを含むことになる。代替的 には、図１に示されている配列の全て又は一部分に対応する合成ポリヌクレオチ ド配列を、オリゴヌクレオチドの化学的合成によって構築することが可能である 。付加的には、図１に開示されている配列データに基づくプライマを用いたポリ メラーゼ連鎖反応(PCR)を使って、ゲノミックDNA，mRNAプールから又はcDNAクロ ーンライブラリからDNA フラグメントを増幅させることが可能である。米国特許 第 4,683,195号及び第 4,683,202号がPCR 方法を記述している。付加的には、図 １に開示されている配列データに基づいている１つのプライマとこの配列データ に基づいていない第２のプライマを利用するPCR 方法を使用することが可能であ る。例えば、ポリアデニル化セグメントと相同な又はこれと相補的なものである 第２のプライマを使用することができる。一実施態様においては、図１の2742の ヌクレオチドの長さをもつ配列を含むポリヌクレオチドを使用できる。遺伝子コ ードの縮重を用いることにより当業者は、図１の716 のアミノ酸の配列をコード する代替的ポリヌクレオチドを容易に構築することができる。図１のNF−ATc 配 列のアミノ酸 418〜710 をコードするポリヌクレオチドも、当業者には構築可能 である。 当業者にとっては、本発明のポリペプチドの中にヌクレオチド置換、欠失及び 付加を組み込むことができるということは明らかである。ヌクレオチド配列の変 動は、さまざまなNF−ATc 対立遺伝子の配列多形現象、わずかな配列決定ミスな どの結果としてもたらされうる。しかしながら、このようなヌクレオチドの置換 、欠失及び付加は、特異的ハイブリダイゼーションを結果としてもたらすのに充 分な緊縮性をもつハイブリダイゼーション条件の下で図１に示されているポリヌ クレオチド配列の１つに対しハイブリッド形成するポリヌクレオチドの能力を、 実質的に分断させてはならない。 本書では、特異的ハイブリダイゼーションを、例えば適切な細胞供給源（例え ばNF−ATc を発現するＴ細胞）から調製されたRNA のノーザンブロット上でNF− ATc mRNAに対応する単一バンド（又はNF−ATc 遺伝子の多数の代替的スプライシ ング産物に対応するバンド）が同定されうるように特定の標的に対し優先的にプ ローブがハイブリッド形成している、プローブポリヌクレオチド（例えば置換、 欠失及び／又は付加を含みうる本発明のポリヌクレオチド）と特定の標的ポリヌ クレオチド（例えば図１の配列をもつポリヌクレオチド）の間のハイブリッドの 形成として定義づけしている。本発明のポリヌクレオチド及び組換えにより産生 されたNF−ATc そしてそのフラグメント及び類似体は、本書に参考として内含さ れているManiatis et al.,分子クローニング：実験室マニュアル、第２版、（19 89），Cold Spring Harbor，N．Y．及びBerger及びKimmel、酵素学の方法、第 1 52巻分子クローニング技術の指針（1987） 、Aeademic Press Inc．San Diego，C A の中で記述されており当該技術分野において既知のものである方法に従って、 図１に提供されている配列データに基づいて調製することができる。 NF−ATc ポリヌクレオチドは、例えばハイブリダイゼーションプローブ及びPC R(又はLCR)プライマとして使用するための短かいオリゴヌクレオチド（例えば25 〜100 塩基の長さ）であり得る。NF−ATc ポリヌクレオチド配列は同様に、より 大きいポリヌクレオチドの一部分（例えば、NF−ATc クローンを含むクローニン グベクター）を含んでいてもよく、又融合タンパク質の発現をコードするため異 なるタンパク質（例えばグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ−β −ガラクトシダーゼ）をコードするもう１つのポリヌクレオチド配列と枠内で、 ポリヌクレオチドリンケージにより融合されてもよい。標準的には、自然に発生 するNF−ATc 配列（例えば図１）と実質的に同一である少なくとも25の連続的な ヌクレオチドを含み、より普通には、NF−ATc ポリヌクレオチドは、自然に発生 するNF−ATc 配列と実質的に同一である少なくとも50〜100 の連続したヌクレオ チドを含む。しかしながら、NF−ATc 標的配列に対する特異的ハイブリダイゼー ションに必要とされるNF−ATc ポリヌクレオチドの最小長さが、なかでもＧ／Ｃ 含有量、不適正塩基の位置づけ（該当する場合）、標的ポリヌクレオチドの集合 と比較した配列の独自性の度合、ポリヌクレオチドの化学的性質（例えばホスホ ン酸メチルバックボーン、ホスホロチオレートなど）といったいくつかの要因に よって左右されるということを、当業者は認識することだろう。 例えば、制限的な意味はないものの、試料中のNF−ATc mRNAの存在を検出し及 び／又は数量化するための適当なハイブリダイゼーションプローブは、表Ｉに示 されている以下の20のヒトNF−ATc 配列とその補体のうち少なくとも１つ、好ま しくは少なくとも２つ、往々にして３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ 、10，11，12，13，14，15，16，17，18又は19、そしてより好ましくはその全て を一般に含んで成る： このようなポリペプチドは標準的には100kb 未満、通常は10000 ヌクレオチド 未満、頻繁には5000ヌクレオチド未満、そして一般的には3000ヌクレオチド未満 、例えは約2750ヌクレオチド又は約2140ヌクレオチド等々である。 同じく制限的意味のない例としては、PCR プライマ（アンプリマ）の以下の対 を、マウス又はヒトのNF−ATc 配列を増幅するのに使用することができる（例え ばNF−ATc 発現細胞からのRNA の逆転写酵素により開始されるPCR により）： 望まれる場合には、実験者の裁量で、実質的に全長のcDNAのコピーを増幅する ためのPCR アンプリマーを選択することができる。同様に、単一のNF−ATc エク ソン又はNF−ATc 遺伝子（マウス又はヒトの）の一部分を増幅するためのアンプ リマも選択できる。 これらの配列の各々は、例えば、リンパ球内の高いNF−ATc mRNAレベルの存在 によって特徴づけされた疾病を診断するため又は組織型別を行なうため（すなわ ちNF−ATc mRNAの発現により特徴づけさ れる組織を同定する）、NF−ATc mRNAの存在を検出するためのハイブリダイゼー ションプローブ又はPCR アンプリマとして使用することができる。同様に、配列 は例えば、法医学的DNA 分析（例えばRFLP分析、PCR 産物長さ分布など）又はNF −ATc 遺伝子の増幅及び／又は再配置により特徴づけされる疾病の診断のため、 DNA 試料中のゲノミックNF−ATc 遺伝子配列を検出するのにも使用することがで きる。NF−ATc ポリペプチドの産生 図１に示されているヌクレオチド及びアミノ酸配列により、当業者は、全長ヒ トNF−ATc ポリペプチド配列の全部又は一部に対応するポリペプチドを産生する ことができる。かかるポリペプチドは、NF−ATc 又はそのフラグメント及び類似 体をコードするポリペプチドの発現により、原核又は真核宿主細胞の中で産生す ることができる。代替的には、かかるポリペプチドは、翻訳を導くためポリヌク レオチド鋳型を用いてインビトロ翻訳システムによって産生することもできるし 又化学的方法によって合成することもできる。組換え型宿主内の異種タンパク質 の発現、ポリペプチドの化学的合成及びインビトロ翻訳のための方法は、当該技 術分野において周知であり、Maniatis et al.,分子クローニング：実験室マニュ アル （1989）、第２版、Cold Spring Harbor，N．Y．及びBerger and Kimmel、酵素学の方法、第 152巻、分子クローニング技術の指針 （1987）、Academic Pre ss Inc．San Diego，CA の中でさらに詳しく記述されている。 NF−ATc のフラグメント又は類似体は、当業者が調製できるものである。NF− ATc のフラグメント又は類似体の好ましいアミノ及びカルボキシ末端は、機能的 ドメインの境界近くで起こる。例えば、制限的な意味なく、このような機能的ド メインとしては、（１）そ の他のNF−AT成分（例えばAP−１）に対する結合特性を付与するドメイン、（２ ）刺激を受けたＴリンパ球内の核局在化の特性を付与するドメイン及び（３）Ｔ 細胞内で充分なレベルで発現されたときＴ細胞の活性化を増強させる特性を付与 するドメインが含まれる。さらに、このような機能的ドメインには、（１）RNA ポリメラーゼ種に対する結合の特性を付与するドメイン、（２）触媒活性（例え ばトポイソメラーゼ、エンドヌクレアーゼ）を含みうる及び／又は構造的特徴（ 例えばジンクフィンガー、ヒストン結合半分）を含みうる。局所的クロマチン構 造を直接変える能力をもつドメイン、及び（３）補助タンパク質及び／又は転写 因子と相互作用できるドメインが含まれる可能性もある。 構造的及び機能的ドメインを同定することのできる１つの方法は、公知の及び 特許の配列データベースに対して、図１に示されたヌクレオチド及び／又はアミ ノ酸配列データを比較することによるものである。好ましくは、ジンクフィンガ ーといったような既知の構造及び／又は機能をもつその他のタンパク質の中に起 こる配列モチーフ又は予測されたタンパク質コンホメーションドメインを同定す るために、コンピュータ処理された比較方法が用いられる。例えば、デヒドロゲ ナーゼ、特に乳酸デヒドロゲナーゼ及びマレイン酸デヒドロゲナーゼのNAD 結合 ドメインはコンホメーションが類似しており、検出可能な形で相同であるアミノ 酸配列を有する(本書に参考として内含されているタンパク質、構造及び分子原 理 、（1984）Creighton(ed.)，W．H．Freeman and Company，Newyork)。さらに 、既知の３次元構造に折りたたまれるタンパク質配列を同定するための方法が知 られている(Bowie et al.（1991）Science 253 : 164)。従って、前述の例は、 当業者が、本発明のNF−ATc 配列内の構造的及び機能的ドメインを規定するのに 用いることのできる配列モ チーフ及び構造的コンホメーションを認識することができる、ということを立証 している。ドメインの１例としては、図１のNF−ATc ポリペプチド配列のアミノ 酸418 からアミノ酸710 までのrel 類似性領域がある。 付加的には、既知の配列データベースに対する図１に示された配列のコンピュ ータ化された比較によって、NF−ATc タンパク質の類似のドメインを表わすその 他のタンパク質又はコーディング配列の中に見られる配列モチーフ及び構造的コ ンホメーションを同定することができる。例えば、制限的な意味無く、NF−ATc 配列と相同性の領域をもつGen Bank／EMBLといったデータベース内の配列を同定 するべく、Wisconsin Geneticsのソフトウェアパッケージ(Genetics Computer G roop，575 Science Dr.，Madison，WI)の中のプログラムGAP，BESTFIT，FASTA 及びTFASTAを使用することができる。このような相同性領域は、構造又は機能的 ドメインの候補である。代替的には、配列データからこのようなドメインを同定 するためのその他のアルゴリズムも提供される。さらに、（１）関連するタンパ ク質配列及びヌクレオチド配列を同定するため及び（２）NF−ATc ポリペプチド 内の構造的又は機能的ドメインを規定するために、ハードウェア又はソフトウェ アのいずれで実行されるかに関わらず、神経網方法を使用することが可能である (本書に参考として内含されているBrunak et al.（1991）J．Mol．Biol．220 : 49)。例えば、β−残基の反復モチーフ−SPRASVTEESWLG−及び−SPRVSVTDDSWLG −は、構造的に関係あるドメインの例である。 １つ又は２つの機能的ドメインを実質的に含むフラグメント又は類似体を非相 同ポリペプチド配列に融合させることができ、この場合、結果として得られる融 合タンパク質は、NF−ATc フラグメントにより付与される機能特性（単数又は複 数）を示す。代替的には、 単数又は複数の機能ドメインが欠失したNF−ATc ポリペプチドは、失なわれたフ ラグメントにより通常付与される特性の喪失を示すことになる。 制限としてではなく一例として記すと、核局在化及び／又はAP−１との相互作 用の特性を付与するドメインはβ−ガラクトシダーゼに融合させられて、核に局 在化され色素産生基質を酵素的に発色基に変換することのできる融合タンパク質 を産生することができる。 好ましい実施態様の１クラスは、機能的ドメインの境界近くのアミノ酸位置に 対応するアミノ及び／又はカルボキシ末端をもつフラグメントであるが、代替的 なNF−ATc フラグメントも調製することができる。このようなフラグメントのア ミノ及びカルボキシ末端の選択は、実験者の裁量に委ねられており、構築の容易 さ、タンパク質分解に対する安全性末端安定性、免疫学的反応度、アミノ又はカ ルボキシ末端残基の修正、又はその他の考慮事項といった経験的考慮事項に基づ いて行なわれることになる。 フラグメントに加えて、NF−ATc の類似体を作ることが可能である。かかる類 似体には、アミノ又はカルボキシ末端又は内部のいずれかにおいて又はその両方 においてアミノ酸配列の単数又は複数の欠失又は付加を含む可能性がある。又類 似体はさらに配列の転位を含んでいる可能性もある。類似体は同様に、アミノ酸 置換、好ましくは保存的置換を含む可能性もある。さらに類似体は、一般にアミ ノ一又はカルボキシ末端でリンクされた非相同配列を含むこともあり、この場合 、未変性NF−ATc タンパク質に自生のものでない結果として得られた類似体に対 し、非相同配列は機能的特性を付与する。しかしながら、NF−ATc 類似体は、そ れぞれ図１に示されているアミノ酸配列の一部分に対する実質的類似性をもちし かも「定義づけ」（前出）のところで列挙した必須の機能特性のうちの少なくと も１つを有する25個のアミノ酸のセグメントを含んでいなければならない。好ま しいアミノ酸置換は、（１）タンパク質分解に対する感受性を低減し、（２）酸 化に対する感受性を低減し、（３）場合によってはリン酸化を含む類似体の翻訳 後の修正を変え、（４）場合によってはカルシニューリンとの相互作用又はそれ によるリン酸化又は脱リン酸を含め、かかる類似体のその他の物理化学的又は機 能的特性を付与又は修正するような置換である。NF−ATc 類似体は、自然に発生 するペプチド配列以外のNF−ATc 配列のさまざまな突然変異タンパク質を内含す る。例えば、自然に発生するNF−ATc 配列内で（好ましくは、機能的ドメインの 外側のポリペプチドの部分で）単一又は多数のアミノ酸置換（好ましくは保存的 アミノ酸置換）を行なうことができる。 保存的アミノ酸置換は、類似の特徴をもつ置換用アミノ酸(例えば、酸性特性 をもつもの：すなわちAsp 及びGlu)によるアミノ酸置換である。保存的（又は同 義の）アミノ酸置換は、親配列の構造的特徴を実質的に変えてはならない（例え ば、置換用アミノ酸は、親配列中に起こるらせん構造を破ってはならず、又親配 列を特徴づけるその他のタイプの２次構造を分析してはならない）。当該技術分 野で認められているポリペプチドの二次及び三次構造の例は、本書中に参考とし て内含されている、タンパク質、構造及び分子原理（1984）Creighton(ed.)，W ．H．Freeman and Company，New York；タンパク質構造入門（1991年）、C．Bra nden and J．Tooze，Garland Publishing，New York，NY ; 及びThornton et al ．(1991) Nature 354 : 105)の中で記述されている。 未変性NF−ATc タンパク質、そのフラグメント又はその類似体は、NF−AT機能 と干渉する作用物質を同定するため、DNA 結合検定及び／又はインビトロ転写検 定における試薬として使用でき、これら の作用物質はこうして、Ｔ細胞活性化を遮断するか又はＴ細胞リンパ性白血病を 治療するためなどに使用できる薬物候補として同定される。標準的には、DNA に 対するNF−ATの結合を測定するインビトロDNA 結合検定は、単数又は複数のNF− AT認識部位のアレイ（未変性NF−ATタンパク質の特異的フットプリント法によっ て規定されるもの）を含む２本鎖DNA を利用する。DNA は、標準的に当業者にと っては既知のさまざまな手段のいずれかによって固体基質にリンクされている。 このようなリンケージは非共有結合であっても（例えばナイロン66といった帯電 レベルの高い表面への結合）、共有結合であってもよい（例えば標準的には、ジ アゾ化といったヌクレオチド塩基内の窒素位置が関与する化学的リンケージによ る）。NF−ATc ポリペプチドは、標準的には、放射能標識付きアミノ酸の取込み によって標識付けされる。通常NF−AT複合体を形成するべくNF−AT核成分で再構 築された標識付きNF−ATc ポリペプチドは、一般にナノモルからマイクロモルの 範囲（１nM〜999 μＭ）内でZn⁺²及び／又はMn⁺²及び／又はMg⁺²を含む、約１× 10 ⁶Ｍ ^-1以上の結合親和力を伴う、対照結合反応中での特異的結合を可能にする 水性条件下（例えば10〜250 mMのNaCl又はKCl 及び５〜100mM のトリスHCl pH５ 〜９、通常pH６〜８）で、固定化されたDNA と接触させられる。結合の特異性は 、標準的には、実験者の裁量で選択されたさまざまな濃度で標識付け無しの競合 物質を添加することによって立証される。標識付け無しのタンパク質競合物質の 例としては、制限的な意味なく、次のものが含まれる：標識付け無しのNF−ATc ポリペプチド、ウシ血清アルブミン及び核タンパク質抽出物。単数又は複数の作 用物質が添加される結合反応が、作用物質を含まない対照結合反応と並行して行 なわれる。対照反応と比較して、DNA に対するNF−ATc ポリペプチドの特異的結 合を阻害する作用物質が、免疫調節薬候 補として同定される。同様に、インビトロでNF−ATによる転写変調を防ぐ作用物 質は、かくして免疫調節薬候補として同定される。 自然に発生するアミノ酸のみで構成されるNF−ATc ポリペプチドに加えて、NF −ATc ペプチド擬似体も同様に提供される。ペプチド類似体は一般に、鋳型ペプ チドのものと類似の特性をもつ非ペプチド薬として、製薬業界で使用されている 。これらのタイプの非ペプチド化合物は「ペプチド擬似体」（peptide mimetics 又はpeptids mimetics）と呼ばれ(本書に参考として内含されているFau chere， J．(1986)，Adv．Drug Res．15 : 29 ; Veber and Freidinger（1985）TINS p39 2；及びEvans et al.（1987）J．Med．Chem．30 : 1229)、通常、コンピュータ 処理された分子モデリングを用いて開発される。構造的に治療に有効なペプチド と類似しているペプチド擬似体は、同等な治療又は予防効果を生み出すように使 用することができる。一般に、ペプチド擬似体はヒトNF−ATc といった典型的ポ リペプチド（すなわち、生物活性又は薬理学活性をもつポリペプチド）に、構造 的に類似しているが、各々本書に参考として内含されている以下の文献にさらに 詳しく記述されている当該技術分野では既知の方法によって、−CH₂NH−，−CH₂ S−，−CH₂−CH₂−，CH＝Ｈ−（シス及びトランス）、−COCH₂−，−CH(OH)CH₂ −及び−CH₂SO−から成るグループの中から選択されたリンケージによって任意 に置換される単数又は複数のペプチドリンケージをもつ：Spatola，A．F．「ア ミノ酸、ペプチド及びタンパク質の化学及び生化学」、B．Weinstein，eds.，Ma rcel Dekker，New York，p267(1983)中；Spatola，A．F．Vega Deta（1983年３ 月）、第１巻、第３号、「ペプチドバックボーンの修正」（総合論評）；Morley ，J．S．Trends．Pharm．Sci.（1980）p463〜468（総合論評）；Hudson．D．et al.，Int J．Pept Prot Res (1979)14 : 177〜185(−CH₂NH− ，CH₂CH₂−）；Spatola，A．F．et al.，Life Sci(1986)38 ;1243〜1249（−CH₂ −Ｓ）；Hann，M．M.，J．Chem Soc．Perkin Trans I．(1982)，307〜314(−CH −CH−、シス及びトランス)；Almquist．R．G et al., J．Med．Chem(1980)23 : 1392〜1398（−COCH₂−）；Jennings−White，C et al., Tetrahedron Lett.（1 982）23：2533（−COCH₂−）；Szelke，M．et al.，European Appla．EP45665（ 1982）CA : 97 : 39405（1982）（−CH(OH)CH₂−）；Holladay M．W．et al., T etrahedron Lett. （1983）24：4401〜4404（−C(OH)CH₂−）；及びHruby，V．J ．Life Sci (1982)31：189〜199(−CH₂−Ｓ−)。特に好ましい非ペプチドリンケ ージはCH₂NH−である。このようなペプチド擬似体は、例えば、より経済的な産 生、より高い化学安定性、増強された薬理学的特性（半減期、吸収、潜在能、効 力など）、特異性の変化（例えば生物活性の広いスペクトル）、抗原性の低下そ の他を含め、ポリペプチド実施態様に比べ著しい利点を有する可能性がある。ペ プチド擬似体の標識付けには通常、定量的構造−活性データ及び／又は分子モデ リングにより予測されるペプチド擬似体上の非干渉位置に対する直接的な又はス ペーサー（例えばアミド基）を通しての単数又は複数の標識の共有結合付着が関 与する。このような非干渉位置は一般に、治療効果を生み出すためペプチド擬似 体が結合する巨大分子（例えば免疫グロブリン上科分子）との直接接触を形成し ない位置である。ペプチド擬似体の誘導体化（例えば標識付け）は、ペプチド擬 似体の望ましい生物活性又は薬理学活性と実質的に干渉してはならない。NF−AT c のペプチド擬似体は、NF−ATc 機能の競合的又は非競合的アゴニスト又はアン タゴニストとして使用することができる。例えば、NF−ATc を含む刺激されたＴ 細胞に対し投与されたNF−ATc ペプチド擬似体は、自然に発生するNF−ATc と競 合して、NF−ATc 活性を低下さ せることができる。代替的には、NF−ATc が欠如したＴ細胞に投与されたNF−AT c ペプチド擬似体は、Ｔ細胞活性化などを誘発する可能性がある。 コンセンサス配列の単数又は複数のアミノ酸を同じタイプのＤ−アミノ酸で系 統的に置換することにより（例えばＬ−リジンの代りにＤ−リジン）、より安定 したペプチドを生成することができる。さらに、当該技術分野において既知の方 法(本書に参考として内含されているRizo及びGierasch（1992）Ann．Rev．Bioch em．61 ; 387)によって、例えば、ペプチドを環化する分子内ジスルフィド架橋 を形成することのできる内部システイン残基を添加することによって、コンセン サス配列又は実質的に同一のコンセンサス配列の変形態様を含む束縛されたペプ チド（環化されたペプチドを含む）を生成することが可能である。 ここで同定されたNF−ATc ポリペプチドのアミノ酸配列により、当業者は、NF −ATc ペプチド配列又はその配列変異体に対応するポリペプチドを産生すること が可能となるだろう。かかるポリペプチドは、頻繁により大きなポリペプチドの 一部として、NF−ATc ペプチド配列をコードするポリヌクレオチドの発現により 、原核又は真核宿主細胞の中で産生され得る。代替的には、かかるペプチドを化 学的方法によって合成することもできる。組換え型宿主内の異種タンパク質の発 現、ポリペプチドの化学合成及びインビトロ翻訳の方法は、当該技術分野におい て周知のものであり、本書に参考として内含されているManiatis et al.,分子ク ローニング；実験室マニュアル （1939）、第２版、Cold Spring Harbor，N．Y． ；Berger and Kimmel、酵素学の方法、第 152巻、分子クローニング技術の指針 （1987）、Academic Press Inc．San Diego，CA ; Merrifield，J.（1969）．J ．Am．Chem．Soc．91 : 501 ; Chaiken I．M．(1981) C RC Crit．Rev．Biochem．11 : 255 ; Kaiser et al．(1989) Science 243 : 187 ; Merrifield，B．(1986) Science 232 : 342 ; Kent，S．B．H．(1988) Ann． Rev．Biochem．57 : 957；及びOfford．R．E．(1980)半合成タンパク質、Wiley Publishingの中でさらに詳しく記述されている。α−NF−ATc 抗体の産生及び適用 原NF−ATc タンパク質、その断片又はその類似体を用いて特異的抗体の産生の ために動物を免疫化した。これらの抗体はポリクローナル抗血清から成るか又は ハイブリドーマ細胞により産生されるモノクローナル抗体から成る。抗体を調製 するための一般的方法に関しては、Antibodics : A Laboratory Manual.（1988 ）E．Harlow and D．Lane．Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harb or，NY(この記載内容は参照により本明細書中に含めるものとする)を参照して頂 きたい。 例えば免疫反応を生じるように当業者に公知の免疫化プロトコールに従ってア ジュバントと一緒に組換えにより産生されるヒトNF−ATc の断片をラットに注入 し得るが、これに限定されない。一般的には、ポリペプチドの長さに依って、少 なくとも約１〜50μｇのNF−ATc 断片又は類似体を初期免疫化に用いる。あるい は組換えにより産生されるNF−ATc ポリペプチドと組合せて、NF−ATc 配列を有 する化学的合成ペプチド（例えば下の表IIに例示したペプチド）を免疫原として 用いて、NF−ATc タンパク質、例えば本質的に図１に示される配列を有する原ヒ トNF−ATc ポリペプチド又は原ヒトNF−ATc ポリペプチド同形体と結合する抗体 を生じ得る。少なくとも１×10⁷Ｍ^-1の結合親和性を有する組換え体断片と結合 するイムノグロブリンを抗血清として免疫化動物から採集し、イムノアフィニテ ィークロマトグラフィー又は他の手段によりさらに精製し得る。さ らに、脾臓細胞を免疫化動物（一般的にラット又はマウス）から採集して、骨髄 腫細胞と融合させて抗体分泌ハイブリドーマ細胞のバンクを生成する。少なくと も１×10⁶Ｍ^-1の親和性を有する組換え生成NF−ATc ポリペプチド（又は化学的 合成NF−ATc ポリペプチド）と結合するイムノグロブリンを分泌するクローンに 関してハイブリドーマのバンクをスクリーニングし得る。マウス及びラット以外 の動物を用いて抗体を生じさせ得る；例えばヤギ、ウサギ、ヒツジ及びニワトリ を用いてNF−ATc タンパク質と反応する抗体を生じさせることもできる。ヒト抗 体を実質的に産生する能力を有するトランスジェニックマウスを免疫化し、α− NF−ATc 抗血清の供給源として及び／又はモノクローナル分泌ハイブリドーマを 生成するために用い得る。 NF−ATc ポリペプチド、例えば全長ヒトNF−ATc タンパク質、NF−ATc 断片（ 例えば下記の表IIに示した配列を有するペプチド）、あるいは図１に示すような 少なくとも14連続アミノ酸のNF−ATc ポリペプチド配列又は表II（下記）のポリ ペプチド配列から成る融合タンパク質との結合に関してバクテリオファージ抗体 表示ライブラリーをスクリーニングし得る。バクテリオファージプラークとして 又はリゾゲンのコロニーとして抗体の組合せライブラリーが生成されている（Hu se et al．(1989) Sience 246 : 1275 ; Caton and Koprowski（1990）Proc．Na tl．Acad．Sci.（U．S．A.）87 : 6450 ; Mullinax et al．(1990) Proc．Natl ．Acad．Sci.（U．S．A.）87 : 8095 ; Persson et al．(1991) Proc．Natl．Ac ad．Sci.（U．S．A.）88 : 2432）。バクテリオファージ抗体表示ライブラリー 及びラムダ発現ライブラリーの種々の態様が記載されている（Kang et al．(199 1) Proc．Natl．Acad．Sci.（U．S．A.）88 : 4363 ; Clackson et al.（1991） Nature 352 : 624 ; McCafferty et al.（ 1990）Nature 348 : 552 ; Burton et al.（1991）Proc．Natl．Acad．Sci.（U ．S．A.）88 : 10134 ; Hoogenboom et al.（1991）Nucleic Acids Res．19 : 4 133 ; Chang et al．(1991) J．Immunol．147 : 3610 ; Breitling et al.（199 1）Gene 104 : 147 ; Marks et al．(1992) Diotechnology 10 : 779 ; Marks e t al.（1992）J．Biol Chem．267 : 16007 ; Lowman et al.（1991）Biochemist ry 30 : 10832 ; Lerner et al.（1992）Science 258 : 1313）（これらの記載 内容は参照により本明細書中に含まれるものとする）。一般的には、免疫化され る（例えばアフィニティークロマトグラフィーにより反応性ファージを濃厚にす るためにクロマトグラフィー樹脂との共有結合により）、及び／又は標識される （例えばプラーク又はコロニーリフトをスクリーニングするために）NF−ATc ポ リペプチドによりバクテリオファージ抗体表示ライブラリーをスクリーニングす る。 試料中のα−NF−ATc 抗体の診断的検出のために、試料中のNF−ATc タンパク 質の診断的検出及び定量のために（例えば標準化競合的ELISA による）、又はバ クテリオファージ抗体表示ライブラリーをスクリーニングするために免疫原とし て有用であるNF−ATc ポリペプチドは、実質的に精製形態で、即ち一般的には約 50％（ｗ／ｗ）又はそれ以上の純度で、実質的に妨害タンパク質及び夾雑物を含 まずに適切に得られる。好ましくはこれらのポリペプチドは少なくとも80％（ｗ ／ｗ）、さらに好ましくは少なくとも約95％（ｗ／ｗ）の純度で単離又は合成さ れて、実質的にヒト、マウスの他のタンパク質、あるいは他の夾雑物を含まない 。好ましい免疫原は、別々のペプチドとして又は（例えばβガラクトシダーゼ又 はグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ配列との）融合ポリペプチドの一部とし て、表IIに示した少なくとも１つのNF−ATc ポリペプチド配列を包 含する。NF−ATc 免疫原は少なくとも１個の、一般的には数個のこのような免疫 原性エピトープを包含する。 例えば免疫交差反応タンパク質を同定するといったようなこれらの抗体のいく つかの適用に関しては、所望の抗血清又はモノクローナル抗体（単数又は複数） は単一特異性でない。これらの場合には、全原タンパク質を用いるよりもむしろ 抗原としてNF−ATc の合成又は組換え体断片を用いるのが好ましい。さらに特定 の構造部分、例えばDNA 結合ドメインを包含する免疫交差反応性ポリペプチドを 同定することが目的である場合は、NF−ATc タンパク質中の同一基準の構造ドメ インの一部又は全部に対応する断片を抗原として用いるのが好ましい。このよう な限定アミノ及びカルボキシ末端を有する組換え体又は合成断片の産生は、図１ に示したNF−ATc 配列により提供される。 抗血清がNF−ATc 融合ポリペプチド、例えばβガラクトシダーゼ又はグルタチ オンＳトランスフェラーゼと融合したNF−ATc 免疫原性エピトープを包含する融 合タンパク質に対して生じる場合、抗血清を好ましくは非NF−ATc 融合相手（例 えばβガラクトシダーゼ又はグルタチオンＳトランスフェラーゼ）で予備吸着し て、免疫原として役立つ融合タンパク質の非NF−ATc 部分に反応を起こさせる（ 即ち特異的に結合する）抗体の抗血清を枯渇させる。ヒト及び／又はネズミNF− ATc タンパク質と結合するモノクローナル又はポリクローナル抗体を用いて、患 者のリンパ球試料から得られた変性タンパク質のウエスターンブロット（例えば SDS−PAGEのニトロセルロースブロット）のような試料中のヒト又はネズミNF−A Tc ポリペプチドの存在を検出し得る。好ましくは、例えばウエスターンブロッ トの濃度計的スキャニング及びシグナル積分法により、定量的検出を実施する。 モノクローナル又はポリクローナル抗体は変性NF−AT c エピトープと結合して、視覚的に又は当業界で公知の方法による標識化二次抗 体又は標識化黄色ブドウ球菌Staphylococcus aureus プロテインＡを用いた他の 光学的手段により同定される。しばしば、より多くのエピトープが結合に用いら れるように、変性NF−ATc は標的抗原として用いられる。 表IIに示したようなNF−ATc 配列は、直接免疫原性ペプチドとして用いうる（ 例えばバクテリオファージ抗体表示ライブラリーをスクリーニングするために、 又はウサギを免疫化するために）か、又は担体高分子(例えばBSA)に抱合される か、又は免疫原として使用される融合タンパク質の一部を構成し得る。好ましい NF−ATc ポリペプチドは以下のアミノ酸配列： を包含し、並びに他の介在及び／又は末端配列を包含し、一般にこのようなポリ ペプチドは長さが1000アミノ酸末端、通常約 500朝未満であって、しばしばスペ ーサーペプチド配列又は末端ペプチド配列は、存在する場合には、天然ポリペプ チド配列、一般に哺乳類ポリペプチド配列に対応する。今述べた好ましいNF−AT c ポリペプチドの一適用は、適切な動物においてαNF−ATc 抗体を生じさせるた めの市販の免疫原として、及び／又は本発明の抗NF−ATc 抗体と組 合せた定量的ELISA(例えば競合的ELISA)又は競合的RIA のための、例えばヒトの NF−ATc 発現リンパ性白血病のステージング又は診断用の、あるいはＴ細胞（例 えば活性化Ｔ細胞及び／又は活性化可能なＴ細胞）の細胞類型分類又は同定用の このようなイムノアッセイの標準化の較正のための市販の免疫診断試薬としてで ある。今述べたばかりの好ましいNF−ATc ポリペプチドは、免疫原又は免疫学的 試薬として役に立つ他に、多数の他の用途がある。１つ又はそれ以上の上記の配 列は、ヒト血清アルブミン、GST などのような融合相手との融合タンパク質中に 取り込まれる。1000アミノ酸以上のこのような融合タンパク質に関しては、融合 相手（アルブミン）部分における欠失を作って、所望によりサイズを約1000アミ ノ酸又はそれ以下にする。 いくつかの態様においては、共有結合中に、通常はペプチド結合中に少なくと も２つのNF−ATc 免疫原性エピトープを包含する多価NF−ATc 抗原を用いるのが 望ましい。このような多価NF−ATc 抗原は一般的に同一種（例えばヒト又はマウ ス）からの多NF−ATc 抗原ペプチドを包含するが、しかし異なる種のNF−ATc タ ンパク質からの抗原ペプチド（即ち種間NF−ATc 多価抗原）の混合物を包含し得 る。しばしば、多価抗原の一次アミノ酸配列における抗原ペプチド配列の空間的 順序は、天然NF−ATc タンパク質と同一配向で生じる（即ち天然NF−ATc タンパ ク質において二次抗原ペプチド配列に対してアミノ末端である一次抗原ペプチド 配列は、多価抗原において上記二次抗原ペプチド配列に対してアミノ末端である ）。しばしば、スペーサーペプチド配列を用いて多価抗原中の抗原ペプチド配列 を多価抗原中の抗原ペプチド配列と結合させるが、このようなスペーサーペプチ ド配列は予定、無作為又は擬無作為配列であってもよい。スペーサーペプチド配 列は、多価抗原で免疫化される動物に対 して非免疫原性であることが公知の配列、例えば動物が耐容化された配列に対応 する。このような多価抗原の多数の例を示すことができるが、説明のために以下 の態様を提示するけれども、これに限定されない。 NAIFLTVSREHERVGC-(aa1)-AKTDRDLCKPNSLVVEIPPFRN-(aa2)-VKASAGGHPIVQL （ここで、（aa１）及び（aa２）は少なくとも１個のアミノ酸及び1000個未満の アミノ酸を有するペプチドスペーサーである；aa１はaa２ペプチド配列から別々 に選択されるペプチド配列である：aa１（多数の異なるアミノ酸で構成される） の長さはaa２（多数の異なるアミノ酸で構成される）の長さとは無関係である） 。 免疫原性NF−ATc ペプチドを用いて動物を免疫化して抗NF−ATc 抗体を生じさ せるか、及び／又は１×10⁷Ｍ^-1又はそれ以上、好ましくは少なくとも１×10^RＭ^-1 〜１×10⁹Ｍ^-1の親和性を有するNF−ATc タンパク質と結合するモノクローナ ル抗体を分泌するハイブリドーマクローンを選択するためのハイブリドーマライ ブラリーを作成するための脾臓細胞の供給源とする。 このような抗体の一用法は、候補新規転写因子又は染色質タンパク質である構 造的に関連した免疫交差反応性タンパク質をコードするcDNA挿入体を含有するク ローンを同定するために、好ましくは種々の組織からのヒト又はネズミmRNA由来 のcDNAを含有するcDNA発現ライブラリーをスクリーニングすることである。cDNA 発現ライブラリーのこのようなスクリーニングは当業界では十分公知であって、 さらにYoung et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．U．S．A．80：1194〜1198（1983 ）（この記載内容は参照により本明細書中に含まれる）、並びに他の発表済の出 典に記載されている。このような抗体の別の用法は、抗体を生成するために用い られる原NF−ATc タンパク 質又は対応するNF−ATc 断片（例えば機能的ドメイン；DNA 結合ドメイン）と構 造的に又は進化的に関連した免疫交差反応性タンパク質を同定及び／又は精製す ることである。このような抗体は、まさに他の抗体（及び生物学的試薬、例えば 制限酵素及びポリメラーゼ）が市販されているように、適用を探究するためのこ のような試薬としての商業的用法があると思われる。 このような抗体の種々の他の用法は、白血病又は他の免疫学的疾病状態を診断 及び／又は段階付けすること、並びに治療的適用（例えば陽イオン化抗体として 、又は標的化リポソーム送連による）に関しては、新生物、高免疫機能、移植拒 否反応等を治療することである。 NF−ATc ポリペプチドの例としては、配列： を有するポリペプチドが挙げられる。NF−ATc ポリペプチド 図１に示したヒトNF-ATc に関する全コード配列の開示は、NF−ATc、その断片 又はその類似体の発現を指図し得る単離ポリヌクレオチドの構築を可能にする。 さらに図１の配列は、NF−ATc をコードするRNA 及びDNA 配列を検出するために 用い得る核酸ハイブリダ イゼーションプローブ及びPCR プライマーの構築を可能にする。 全長NF−ATc あるいはその断片又は類似体をコードするポリヌクレオチドは、 コード配列の転写（発現配列）及び翻訳を促す配列を包含し、したがってコード 化ポリペプチド生成物が生成される。このようなポリヌクレオチドの構築は当業 界で十分公知であり、Maniatis et al., Molecular Cloning : A Laboralory Ma nual ．2nd Bd．(1989)，Cold Spring Harbor，N．Y．にさらに記載されている。 例えばこのようなポリヌクレオチドとしてはプロモーター、転写終結部位（真核 発現宿主におけるポリアデニル化部位）、リボソーム結合部位、及び任意により 真核生物発現宿主に用いるためのエンハンサー、及び任意にベクターの複製に必 要な配列が挙げられる。典型的な真核生物発現カセットは、任意にエンハンサー 及び下流ポリアデニル化部位（例えばSV40大TAg ポリＡ付加部位）と結合するプ ロモーター、例えばHSVtk プロモーター又はpgk(ホスホグリセレートキナーゼ) プロモーターの下流で結合する（即ち翻訳読取り枠配向で：ポリヌクレオチド結 合）NF−ATc ポリペプチドをコードするポリペプチド配列を含む。 好ましいNF−ATc ポリヌクレオチドは、以下のアミノ酸配列の少なくとも１つ を包含するNF−ATc ポリペプチドをコードする： 好ましいNF−ATc ポリヌクレオチドは、以下のアミノ酸配列の２，３，４，５ ，６，７，８，９，10，11、又は12の全てを包含するNF−ATc ポリペプチドをコ ードする： 遺伝暗号の縮重は、これらのアミノ酸配列をコードする有限組のポリヌクレオ チド配列を生じる；この組の縮重配列は、手で又は市販のソフトウェア(Wiscons in Genelics Software Package Release 7.0)を用いてコンピューターにより容 易に生成し得る。したがって、一般的に長さが約10,000ヌクレオチド未満、しば しば3000ヌクレオチド未満で、以下のアミノ酸配列： の各々をコードする配列を包含するの単離ポリヌクレオチドが提供され、他の用 法の中で、免疫原、免疫学的試薬等として用い得るNF−ATc ポリペプチドの発現 のために用いられる。このようなポリヌクレオチドは一般的には、適切な原核生 物又は真核生物宿主細胞中での発現を行う為に操作可能的に結合したプロモータ ーを包含する。このようなポリヌクレオチドの一例としては、哺乳類発現ベクタ ーpSRαとの操作可能的結合でクローン化された図１のヒトNF−ATc cDNA配列が 挙げられ、代替的発現ベクター（例えばpBC12B1 及びp91023（Ｂ）；Hanahan J （1983） J．Mol．Biol．166：577：Culleu et al.（1985）J．Virol．53 : 515 ; Lomedico PT（1982）Proc．Natl．Acad．Sci．（U．S．A.）79 : 5798 ; Mor inaga et al． (1984) Bio／Technology 2 : 636）の使用を含めた多数の代替的態様は、当業者 には明らかである。 さらに、ポリヌクレオチドの発現が望ましくない場合、本発明のポリヌクレオ チドは機能タンパク質をコードする必要はない。本発明のポリヌクレオチドは、 NF−ATc RNA 又はDNA 配列を検出するためのハイブリダイゼーションプローブ及 び／又はPCR プライマー（アンプリマー）及び／又はLCR オリゴマーとして役立 つ。 あるいは、本発明のポリヌクレオチドは、関連遺伝子のRNA 又はDNA 配列を検 出するためのハイブリダイゼーションプローブ又はプライマーとして役に立ち、 このような遺伝子は構造的に又は進化的に関連したタンパク質をコードし得る。 このようなハイブリダイゼーション及びPCR 適用に関しては、本発明のポリヌク レオチドは機能ポリペプチドをコードする必要はない。したがって、本発明のポ リヌクレオチドは、NF−ATc 配列に対する特異的ハイブリダイゼーション又は特 異的増幅が保持される限りは、実質的欠失、付加、ヌクレオチド置換及び／又は 転位を含有し得る。 特異的ハイブリダイゼーションは本明細書中に前記で定義され、Ｔ細胞から調 製されたRNA のノーザンプロット上での各NF−ATc イソフォームに対応して単一 バンドが同定されるように、本発明のポリヌクレオチド（置換、欠失及び／又は 付加を含み得る）と特異的標的ポリヌクレオチド、例えばヒトNF−ATc mRNAとの ハイブリッドの形成と大体要約し得る（即ち、個別のNF−ATc mRNAバンドの検出 を可能にするハイブリダイゼーション及び洗浄条件が確立される）。したがって 当業者は、図１に示した配列と比較した場合に、ヌクレオチド配列の実質的付加 、欠失、置換又は転位を含み得る本発明のポリヌクレオチドを調製し、特異的ハ イブリダイゼーションがNF−ATc mRNAを発現するＴリンパ球株から調製されたRN A を用いてノ ーザンブロットを実施することによる、及び／又はNF−ATc DNA クローン（cDNA 又はゲノムクローン）とのハイブリダイゼーションによるポリヌクレオチドの特 性であるか否かを調べ得る。 特異的増幅は、PCR 反応においてNF−ATc ポリヌクレオチドと一緒に用いた場 合、NF−ATc 遺伝子配列又はmRNA配列に対応する単一主要増幅生成物を実質的に 生成する１組のPCR アンプリマーの能力と定義される。一般に、NF−ATc 発現ヒ ト細胞（例えばJurkat細胞株）からのヒトゲノムDNA 又はmRNAを、PCR 反応のた めの鋳型DNA サンプルとして用いる。特異的増幅を示すPCR アンプリマーは、定 量的PCR 増幅によるNF−ATc mRNAの定量的測定に適している。NF−ATc 対立遺伝 子特異的増幅生成物は、配列及び／又は長さの多形性を有するけれども、この定 義の意図に関しては単一増幅生成物を構成すると考えられる。 一般にハイブリダイゼーションプローブは、図１に示した配列（それぞれヒト 及びネズミNF−ATc 検出のための）の少なくとも約25連続ヌクレオチドを包含し 、好ましくはハイブリダイゼーションプローブは図１に示した配列の少なくとも 50連続ヌクレオチドを含有し、さらに好ましくは図１に示した配列の少なくとも 100 連続ヌクレオチドを包含する。PCR アンプリマーは一般的には、図１に示し た配列の約25〜50連続ヌクレオチドを包含し、通常は図１に示した配列の約25〜 50連続ヌクレオチドで本質的に構成され、存在する場合、付加的ヌクレオチドは 一般にポリメラーゼ介在性鎖延長を妨害しないように５′末端に位置する。PCR アンプリマー設計及びハイブリダイゼーションプローブ選択は、十分に当業者の 裁量の範囲内である。遺伝病に関する方法 本発明の好ましい態様において、NF−ATc 遺伝子を特異的に同定 するハイブリダィゼーションプローブを、遺伝病の診断方法に用い得る。例えば このようにして診断される遺伝病としては関連したNF−ATc 構造又は調節配列の 損傷が挙げられるし、あるいはNF−ATc 遺伝子座と密接に連鎖し、連鎖NF−ATc 遺伝子座での制限断片長多形性又はDNA 配列多形性により同定される遺伝座の損 傷が挙げられるが、これらに限定されない。さらに好ましい態様においては、NF −ATc 遺伝子プローブを用いて、免疫学的疾患に罹りやすい素質を含めた遺伝病 を診断又は同定するが、この場合、内因性NF−ATc の量又は機能性は、個体が免 疫病、特に免疫不全、関節炎又は自己免疫疾患を発症する確率の増大を示すのに 十分である。アンチセンスポリヌクレオチド Ｔ細胞活性化の調節に向けられるさらに別の態様は、図１に示した配列の全部 又は一部と相補的な特異的アンチセンスポリヌクレオチドを用いる方法を含む。 このような相補的アンチセンスポリヌクレオチドは、図１に対応する関連標的配 列がポリヌクレオチドの機能特性として保持される限りは、ヌクレオチド置換、 付加、欠失又は転位を含有し得る。相補的アンチセンスポリヌクレオチドとして は、NF−ATc mRNA種と特異的にハイブリダイズしてmRNA種の転写及び又はコード 化ポリペプチドの翻訳を阻止し得る可溶性アンチセンスRNA 又はDNA オリゴヌク レオチドが挙げられる（Cning et al．（1989）Proc．Natl．Acad．Sci．U．S． A．86 : 10006 : Broder et al．（1990）Ann．Iat．Med．113 : 001 ; Lareae et al．（1990）FEBS Lettors 274 : 53 ; Holcenberg et al.，WO91/11535 ; U ．S．S．N．07/530,165 ; WO91/09865 ; WO91/04753 ; WO99/13641 ; 及び欧州 特許第386563号（これらの記載内容は各々参照により本明細書中に含まれる）） 。したがってアンチセンスポリヌクレオチドはNF−ATc ポリペプチドの生成を阻 害する。NF−ATc タンパク質発 現はＴリンパ球活性化と関連するため、NF−ATc ポリペプチドに対応するmRNAの 転写及び／又は翻訳を阻止するアンチセンスポリヌクレオチドはＴ細胞活性化を 阻害し、及び／又はＴ細胞の活性化表現型を逆転させる。リンパ性白血病を含め た免疫疾患の治療のために、並びに所望により、移植拒否反応の阻止のために、 治療的有効投与量のNF−ATc アンチセンスポリヌクレオチドを含有する組成物を 投与し得る。種々の長さのアンチセンスポリヌクレオチドを生成し得るが、しか しこのようなアンチセンスポリヌクレオチドは一般的には実質的には天然NF−AT c ポリヌクレオチド配列と同一であり、一般的には図１に示した配列と同一であ る少なくとも約25連続ヌクレオチドを包含する。 アンチセンスポリヌクレオチドは、トランスフェクタント細胞又はトランスジ ェニック細胞、例えば個体の逍血幹細胞の全部又は一部を再構成するのに用いら れるトランスジェニック多能性造血幹細胞中の異種発現カセットから生成し得る 。あるいは、アンチセンスポリヌクレオチドは、in vitro培地中で、もしくはin vivoの循環系又は間隙液中で、外環境に投与される可溶性オリゴヌクレオチド を包含し得る。外環境中に存在する可溶性アンチセンスポリヌクレオチドは細胞 質への通路を得て、特異的mRNA種の翻訳を阻止することが明示されている。いく つかの態様においては、アンチセンスポリヌクレオチドはメチルホスホネート部 分を包含するか、又はポリアミド核酸(PNA)である。アンチセンスポリヌクレオ チドに関連した一般的方法に関しては、Xntisense RNA and DNA，(1988)，D．A ．Mellou，Ed.．Cold Spring Harbor Laboratorv．Cold Spring Harbor，NY を 参照して頂きたい。同種ヒトNF−ATc 遺伝子の単離 ヒトゲノムクローンライブラリー、例えば酵母菌人工染色体、コ スミド、又はバクテリオファージλ（例えばλカロン35）中のヒトゲノムライブ ラリーを図１に示したcDNA配列の少なくとも約24連続ヌクレオチド（又はそれら の補体）を包含するポリヌクレオチドプローブでスクリーニングすることにより 、NF−ATc cDNAのヒト相同体を同定し、単離する。一般的には、慣用的ハイブリ ダイゼーション手順に従って高緊縮でハイブリダイゼーション及び洗浄条件を実 行する。陽性クローンを単離し、シーケンシングする。実例として、図１の配列 に対応する全長ポリヌクレオチドを標識して、ハイブリダイゼーションプローブ として用いて、λEMBL４又はλGEM11（Promega Corporation．Madison，Wiscons in）中のヒト又はネズミゲノムクローンライブラリーからゲノムクローンを単離 するが、これに限定されない；プラークリフトをスクリーニングするための典型 的ハイブリダイゼーション条件(Bentor and Davis（1978）Science 196 : 180) は、以下のとおりである：50％ホルムアミド、５×SSC 又はSSPE，１〜５×Denh ardt溶液、0.1〜１％ SDS，100〜200μｇ剪断異種DNA 又はtRNA，０〜10％硫酸 デキストラン、約１×10⁸cpm／μｇの特異的活性を有する１×10⁶〜１×10⁷cpm ／mlの変性プローブ、42℃で約６〜36時間インキュベーション。予備ハイブリダ イゼーション条件は本質的には同一であるが、但しプローブは含まれず、インキ ュベーション時間は一般的に低減される。洗浄条件は、一般的には１〜３×SSC ，0.1〜１％ SDS，50〜70℃で、約５〜30分で洗浄溶液が変化する。 非ヒトNF−ATc cDNA及びゲノムクローン（即ち同種非ヒトNF−ATc 遺伝子）は 、図１に示した配列を基礎にしたプローブを用いて、当業界で用いられる種々の 非ヒトcDNA及びゲノムクローンライブラリー(例えばClontech．Paio Alte．CA) から同様に単離し得るが、ハイブリダイゼーション及び洗浄条件は一般的にはヒ トNF−ATc ク ローンの単離の場合よりも低緊縮性である。 図１に示したヌクレオチド配列に対応する又は相補的な少なくとも約30〜50ヌ クレオチド、好ましくは少なくとも100ヌクレオチドの配列を包含するポリヌク レオチドは、NF−ATc に対応する生殖系列遺伝子を同定及び単離するためのPCR プライマー及び／又はハイブリダイゼーションプローブとして役立つ。これらの 生殖系列遺伝子はヒトであっても、あるいは関連する哺乳類種であってもよく、 好ましくは齧歯類又は霊長類である。このような生殖系列遺伝子は、バクテリオ ファージλ又はコスミドライブラリー中のゲノムライブラリーのハイブリダイゼ ーションスクリーニングによる、又は図１に示した配列に由来するプライマーを 用いたゲノム配列のPCR 増幅による方法を含めた当業界で慣用的な種々の方法に より単離し得るが、これらに限定されない。ヒトゲノムライブラリーは公的に入 手可能であるか、又はヒトDNA からde novo に構築し得る。 NF−ATc、特にネズミ同種NF−ATc 遺伝子のゲノムクローンを用いて、好まし くは破壊されたNF−ATc 対立遺伝子と同型接合体の少なくとも１つの機能的に崩 壊されたNF−ATc 対立遺伝子を有する細胞及びトランスジェニック非ヒト動物を 生成するための相同標的構築物を構築し得る。相同標的構築物の構築のための手 引は本業界で見いだされる。その例を以下に挙げる：Rahemtulla et al．（1991 ） Nature 353 : 180；Jasin et al．（1990）Genes Devel．4 : 157 ; Kah et al．(1992) Science 256 : 1210 ; Molina et al．(1992) Nature 357 : 161 ; Grasby et al．(1991) Science 253 : 1417 ; Bradley et al．(1992) Bio／Tec hnology 10 ： 534（これらの記載内容は参照により本明細書中に含まれる）。 相同標的化を用いて、不活性化NF−ATc 対立遺伝子に関して異型接合体又は同型 接合体であるいわゆる「ノックアウト」マウスを生成し得る。このよう なマウスは、免疫系発現、新生物、Ｔ細胞活性化、シグナル導入、薬物スクリー ニング及び他の用途の調査のための研究動物として市販されている。 キメラ標的化マウスは、Hogan et al.，Manipulating the Mouse Embryo : A Laboratory Manual. Cold Spring Harbor Laboralory（1988）及びTcratocarcin omas and Embryenic Stem Ceils．A Practical Approach, E．J．Robertson．ed .，IRL Press，Washington．D．C.，（1987）（これらの記載内容は、参照によ り本明細書中に含まれる）に従って得られる。発表済の手法（Teratocarcinomas and Bmbryonic Stem Cells : A Practical Approach ，E．J．Robertson，ed.， IRL Press．Washington．D．C.，（1987）：Zjilstra et al．（1989）Nature 3 42 : 435；及びSchwartzberg et al．（1989）Science 246 : 799（これらの各 記載内容は参照により本明細書中に含まれる）に従って、胚幹細胞を操作する。 さらに、NF−ATc cDNA又はゲノム遺伝子コピーを用いて、高レベルで及び／又 は自然ではNF−ATc 遺伝子に隣接しては生じない転写制御配列の転写制御下でNF −ATc ポリペプチドを発現するためのトランス遺伝子を構築し得る。例えば構成 プロモーター（例えばHSV tk又はpgk プロモーター）又は細胞血統特異性転写調 節配列（例えばCD４又はCD８遺伝子プロモーター／エンハンサー）はNF−ATc コ ードポリヌクレオチド配列と操作可能的に結合してトランス遺伝子を形成する（ 一般的にはneo 遺伝子発現カセットのような選択可能なマーカーと組合せて）。 このようなトランス遺伝子は細胞（例えばES細胞、逍血幹細胞）中に導入され、 慣用的方法によりトランスジェニック細胞及びトランスジェニック非ヒト動物が 得られる。NF−ATc の過発現又はNF−ATc の不適切発現は過免疫状態を引き起こ すか又は移植拒否反応を増強するので、トランスジェニック細胞及 び／又はトランスジェニック非ヒト動物を用いて抗新生物薬をスクリーニングし 、及び／又は有力な免疫調節薬をスクリーニングし得る。NF−ATc と結合するタンパク質の同定及び単離 NF−ATc 及び／又はNF−ATc−DNA 複合体と結合するタンパク質は潜在的に重 要な転写調節タンパク質である。このようなタンパク質は、新規の免疫調節薬の 標的となり得る。これらのタンパク質は、本明細書中では補助タンパク質と呼ば れる。補助タンパク質は、当業界で公知の種々の方法により単離し得る。 補助タンパク質を単離する好ましい一方法は、NF−ATc ポリペプチドをNF−AT c ポリペプチドと結合する抗体に接触させて、その結果生じる免疫複合体を単離 することによる。これらの免疫複合体は、NF−ATc ポリペプチドと結合する補助 タンパク質を含有する。変性剤、好ましくは還元剤で免疫複合体を変性させるこ とにより、補助タンパク質を同定し、単離する。変性された、好ましくは還元さ れたタンパク質をポリアクリルアミドゲル上で電気泳動処理する。１つ又はそれ 以上の種々の十分公知の方法（ ）によりポリアクリルアミドゲル上で推定上の 補助タンパク質を同定し、関連の同定されたポリペプチドを含有するポリアクリ ルアミドゲルの一部の切除及びゲル部分からのポリペプチドの溶離により単離し 得る。 推定上の補助タンパク質は、タンパク質がNF−ATc 及び／又はNF−ATc 複合体 と結合することを立証することにより補助タンパク質と同定される。このような 結合は、ポリアクリルアミドゲル電気泳動法による単離の後に正常に戻った推定 上の補助タンパク質を用いた結合検定を含めた種々の手段によりin vitroで示さ れるが、これらに限定されない。あるいは、組換え体又は化学合成された推定上 の補助タンパク質を用いた結合検定を用い得る。例えば推定上の補 助タンパク質を単離し、化学的シーケンシング、例えばエドマン分解によりその アミノ酸配列の全部又は一部を確定し得る。アミノ酸配列情報を用いて、推定上 の補助タンパク質を化学的に合成し得る。（１）アミノ酸配列データに従って縮 退オリゴヌクレオチドプローブでcDNAライブラリーをスクリーニングすることに より推定補助タンパク質をコードするcDNAクローンを単離し、（２）宿主細胞中 でcDNAを発現し、並びに（３）推定補助タンパク質を単離することにより、アミ ノ酸配列を用いて組換え体推定補助タンパク質を生成してもよい。あるいは、オ リゴヌクレオチド合成によりNF−ATc ポリペプチドをコードするポリヌクレオチ ドを構築し、発現ベクター中に入れて、宿主細胞中で発現させてもよい。 in vitroでNF−ATc 及び／又はNF−ATc−DNA 複合体と結合する推定補助タン パク質は、補助タンパク質として同定される。二価性架橋試薬（例えばジメチル スベルミデート、グルタールアルデヒド等）とのin vivo での架橋、及びNF−AT c ポリペプチドを含む架橋化生成物のその後の単離により、補助タンパク質を同 定し得る。架橋の全般的考察に関しては、Kunkel et al．(1981)Mol．Cell．Pio chem．34：３（この記載内容は参照により本明細書中に含まれる）を参照。好ま しくは、NF−ATc ポリペプチドからの補助タンパク質の単離を促すように、二価 性架橋試薬は、架橋複合体の単離後に特定条件下で逆にされ得る架橋を生じる。 NF−ATc ポリペプチドを含有する架橋化複合体の単離は、好ましくは架橋化複合 体の集団に対して少なくとも１×10⁷Ｍ^-1の親和性を有するNF−ATc ポリペプチ ドと結合する抗体と結合し、少なくとも１×10⁷Ｍ^-1の親和性を有する抗体と結 合する複合体のみを回収することにより達成する。NF−ATc ポリペプチドと架橋 するポリペプチドは補助タンパク質として同定される。 適切な結合条件下でのNF−ATc と補助タンパク質（例えばAP−１）との結合を 阻害する薬剤であると候補免疫調節薬を同定するためのスクリーニング検定を開 発し得る。NF−ATc ポリペプチドの発現 最後に所望のNF−ATc ポリペプチドを発現することができる本発明の核酸配列 を、種々の異なるポリヌクレオチド（ゲノム又はcDNA，RNA、合成オリゴヌクレ オチド等）から、並びに種々の異なる方法により生成し得る。 前述のように、配列が発現制御配列と操作可能的に結合（即ち機能を保証する ように位置する）した後に、DNA 配列は宿主中で発現される。これらの発現ベク ターは、エピソームとして又は宿主染色体DNA の欠くことのできない部分として 、一般的には宿主生物中で複製可能である。普通、発現ベクターは選択マーカー 、例えばテトラサイクリン耐性又はハイグロマイシン耐性を含有して、所望のDN A 配列で形質転換されたこれらの細胞の検出及び／又は選択を可能にする（例え ば米国特許第4,704,362号（この記載内容は参照により本明細書中に含まれる） 参照）。 大腸菌は、本発明のDNA 配列をクローニングするのに特に有用な原核生物宿主 の１つである。使用に適した他の微生物宿主としては、バチルス属、例えば枯草 菌Bacillus subtilis、及び他の腸内細菌類、例えばサルモネラ属、Salmenella 、セラチア属Scrratia並びに種々のシュードモナスPseudomenas 種が挙げられる 。これらの原核生物宿主中で、一般的に宿主細胞と適合性の発現制御配列（例え ば複製の原型）を含有する発現ベクターを作製できる。さらに、ラクトースプロ モーター系、トリプトファン(trp)プロモーター系、βラクタマーゼプロモータ ー系、又はλファージからのプロモーター系といったあらゆる数の種々の１分公 知のプロモーターが存在し 得る。プロモーターは一般的には発現を制御し、任意にオペレーター配列を伴い 、転写及び翻訳を開始及び完了するためにリポソーム結合部位配列等を有する。 他の微生物、例えば酵母菌も発現に用い得る。サッカロミセス属Saccharomyce s は好ましい宿主であり、３−ホスホグリセレートキナーゼ又は他の解糖酵素、 及び複製の原型、望ましい場合には終結配列等を含めたプロモーターのような発 現制御配列を有する適切なベクターを伴う。 微生物の他に、哺乳類組織細胞培養を用いて本発明のポリペプチドを発現及び 生成し得る（Winnacker，“Prom Genes to Clones，”VCH Publishers，N．Y.， N．Y．（1987）（この記載内容は参照により本明細書中に含まれる）参照）。無 傷ヒトタンパク質を分泌可能な多数の適切な宿主細胞株が当業界では開発されて いるので、真核生物細胞が実際には好ましく、その例としてはCHO 細胞株、種々 のCOS 細胞株、HeLe細胞、骨髄腫細胞株、Jurkal細胞等が挙げられる。これらの 細胞のための発現ベクターとしては、発現制御配列、例えば複製の原型、プロモ ーター、エンハンサー（Queen et al．(1986)Immunol．Rev．89 : 49(この記載 内容は参照により本明細書中に含まれる)）、及び必要なプロセッシング部位、 例えばリボソーム結合部位、RNA スプライス部位、ポリアデニル化部位及び転写 ターミネーター配列が挙げられる。好ましい発現制御配列は、イムノグロブリン 遺伝子、SV40、アデノウイルス、ウシパピローマウイルス等から得られたプロモ ーターである。問題のDNA セグメント（例えばNF−ATc ポリペプチドをコードす るポリペプチド）を含有するベクターを十分公知の方法（細胞宿主の型により変 わる）により宿主細胞中に移し得る。例えば、CaCiトランスフェクションは普通 は原核生物細胞に使用し、一般CaPO₄処理又はエレクトロポレーショ ンは他の細胞宿主に用い得る（一般的にManiatis et al.，Molecular Cloning : A laboratory Manual．Cold Spring Harbor Press．（1982）（この記載内容は 参照により本明細書中に含まれる）参照）。通常、ベクターはエピソームであり 、染色体外に保持される。 細胞中、特にリンパ球生成血統の細胞中での組換え体NF−ATc タンパク質の発 現を用いて、NF−ATc の存在により陽性又は陰性に転写的に調節される遺伝子を 同定し、単離し得る。このような遺伝子は、一般的には初めに負のcDNAライブラ リーから単離去れたcDNAクローンとして同定され、この場合組換え体NF−ATcを 発現する細胞から単離されたRNA 及び対照細胞（即ち組換え体NF−ATc を発現し ない）から単離されたRNA を用いて負のライブラリー及びスクリーニングプロー ブを生成する。このような方法では、NF−ATc 依存性遺伝子が単離される。NFAT 依存性遺伝子（又はレポーター遺伝子と操作可能的に結合するそれらの調節配列 ）は、有効な転写のために必要な成分としてNF−ATc ポリペプチドを用いるin v itro転写検定の一成分として用い得る、このような転写検定を用いてNF−ATc 依 存性遺伝子転写を阻害する薬物をスクリーニングし、それにより候補免疫調節剤 として同定し得る。法廷用同定法 本発明のNF−ATc ポリヌクレオチド配列は、個人の法廷用同定のために、例え ば死者の同定、父性の決定、犯人同定等に用い得る。例えばDNA 標本はヒト又は 細胞標本（例えば血液、唾液、精液といった犯罪現場証拠）から得られ、RFLP分 析、対立遺伝子特異的PCR，PCRクローニング及びNF−ATc 遺伝子領域の構造を確 定するための増幅生成物のシーケンシング、又は他の適切な法廷用方法を施され る。NF−ATc 遺伝子構造に基づいて、標本が生じた個体が彼／彼女のNF−ATc 遺 伝子型に関して同定される。NF−ATc 遺伝子型は、単 独で又は他の遺伝子マーカーと一緒に用いて個体を決定的に同定するか又は犯罪 者の可能性があるとして個体を除外し得る。 一態様において、個体集団（一般的には種々の人種からの少なくとも50名）か らのヒトゲノムDNA 標本を別々に反応容器（例えばマイクロ滴定プレート上のウ エル）に分別する。各アリコートを、適切な反応条件下（例えばNew England Bi olabs 1992カタログ参照）で１つ又はそれ以上の制限酵素（例えばEcoRＩ，Hind III，SmaＩ，BamHＩ，SalＩ，NotＩ，AccＩ，ApaＩ，Bgl II，XbaＩ，PstＩ） で消化（インキュベート）する。各個体からの対応する消化生成物を別々に電気 泳動ゲル（一般的にはアガロース）に載せ、電気泳動処理して、サザンプロティ ングにより膜上にプロティングして、標識化NF−ATc プローブ（例えば図１の全 長ヒトNF−ATc cDNA配列）とハイブリダイズさせる。集団の成員間で多形性であ る制限断片（バンド）をNF−ATc 遺伝子型を識別するための基本として用いて、 それにより彼らのNF−ATc 遺伝子型に基づいて個体を分類する。 個体の集団からのPCR 増幅生成物をシーケンシングすることにより、対立遺伝 子（遺伝子型）を同定し、それにより個体を同定又は分類するための配列多形性 を用いて、NF−ATc 遺伝子型の同様の分類を実施し得る。酵母菌２ハイブリッドスクリーニング検定 酵母菌２ハイブリッド系を用いて哺乳類（一般的にはヒト）cDNA発現ライブラ リーをスクリーニングし得るが、この場合、それぞれcDNAはGAL4 DNA結合ドメイ ン又はアクチベータードメインと融合させ、NF−ATcポリペプチド配列はGAL4ア クチベータードメイン又はDNA 結合ドメインと融合させる。このような酵母菌２ ハイブリッド系は、NF−ATc 配列と結合するタンパク質をコードするcDNAをスク リーニングし得る。例えばcDNAライブラリーはヒト成熟Ｔ細胞株又は他の適切な 細胞型からのmRNAから生成し得る。酵母菌２ハイブリッド発現系(Chien et al． （1991）Proc．Natl．Acad．Sci．(U．S．A.)88 : 9578 又はCell 72 : 233)中 でクローニングされたこのようなcDNAライブラリーを用いて、NF−ATc と相互作 用するタンパク質をコードし、それによりGAL4依存性レポーター遺伝子の発現を 生じるcDNAを同定し得る。抗体を用いた免疫沈降及び同時沈降種の同定により、 NF−ATc と相互作用するポリペプチドも同定し得る。さらに、NF−ATc ポリペプ チドでペプチドライブラリー（例えばバクテリオファージペプチド表示ライブラ リー、空間的限定VLSIPSペプチド列等）をスクリーニングすることにより、NF− ATc と結合するポリペプチドを同定し得る。理論的薬物設計法 NF−ATc ポリペプチド、特にNF−ATc 複合体中の直接接点を形成するその部分 は、候補NFAT調節剤（例えば抗新生物薬及び免疫調節剤）の理論的薬物設計に用 い得る。実質的精製NF−ATc 及び本明細書中に提供されるようなAP−１活性のた めのドッキング相手としてのNF−ATc の同定により、実質的に純粋なNFATポリペ プチド複合体、並びにＸ線傾析結晶図又は他の構造分析法、例えばDOCKプログラ ムに用い得るコンピューターモデル（Kuntz et al．(1982)J．Mol．Biol．161 : 269 ; Kuntz ID（1992）Science 257 ： 1078）、並びにその変形が生成される 。有力な治療薬は、このようにして提供される構造情報に基づいて理論的に設計 し得る。一態様において、このような薬物を設計してNF−ATc ポリペプチド：NF −ATc ポリペプチド複合体の形成を防止する。したがって、本発明を用いて、NF ATを形成するNF−ATc の結合を阻止する能力を有する薬物を含めた薬物を設計し 得る。 特に好ましい変形は、優性な陰性NF−ATc 突然変異体の構造的模倣体、例えば 本質的に図１のアミノ酸１〜418 で構成され、残渣418 に対するアミノ酸カルボ キシ末端を実質的に欠いたポリペプチドである。優性陰性突然変異体ポリペプチ ドのこのような模倣体は、NF−ATc 活性化（したがってＴ細胞活性化）の拮抗薬 又は部分的作動薬としての実質的活性を有し得る。 以下の実施例は本発明の実例を示すものであって、これらに限定されない。変 更及び代替的態様は当業者には明らかである。 実施例 概説 NF−ATの既存又はサイトゾル成分を示す別々の遺伝子によりコードされる２つ の関連タンパク質を我々は精製した。これらのタンパク質の１つであるNF−ATc に関する全長cDNAの発現は非Ｔリンパ球内のIL−２プロモーターを活性化し、一 方優性均整NF−ATc はＴリンパ球内のIL−２プロモーターの活性化を遮断するが 、このことはNF−ATc がIL−２位で発現に必要であり、IL−２の制限発現に関与 することを示す。NF−ATc RNA 発現はリンパ様組織に対して大きく制限され、細 胞活性化時に誘発される。第二のタンパク質であるNF−ATc は限定ドメイン上で NF−ATc と高度に相同であるが、しかし広範囲の組織分布を示し、Ca＋＋依存性 調節を特徴とする組織中で高度に発現される。これらのタンパク質はともにDNA 結合タンパク質の親族の成員であり、Dorsal／Rel 族の遠縁に当たる（Nolan an d Baltimore（1992）Current Biology，Ltd．２：211 220）。細胞内Ca＋＋を増 大する。又はタンパク質キナーゼを活性化する薬物は別々にNF−ATc の運動性の 変化を生じるが、このことは明瞭なシグナル化経路がNF−ATc に集中してその機 能を調節することを示す。 我々の過去の研究はNF−ATのサイトゾル成分が相対的に低濃度で ヒトリンパ様細胞株中に存在することを示した（Northrop et al．(1993)J．Bio l．Chem．268 : 2917〜2923）ので、ウシ胸腺からNF−ATc を精製することを我 々は選択した。６ペプチドから得られたアミノ酸配列を用いて2742ヌクレオチド に及ぶ２つの重複ヒトcDNAを単離した（図１）。cDNAは予定分子量が77.870ノ71 6 アミノ酸のタンパク質をコードする。イニシエーターメチオニンから上流の枠 内停止コドンは、全NF−ATc タンパク質がこのcDNAによりコードされることを示 す。13残基の独特の反復配列も同定された。NF−ATc のカルボキシ末端半分は、 転写因子のDorsal／Rel 族のDNA 結合及び二量化領域との限定類似性を示す（図 ４。再検討のためには、Nolan and Baltimore（1992）Curreal Biology，Ltd． ２：211〜220）が、しかしNF−ATc はグループの最も遠縁の成員であると思われ る。Rel 族成員とNF−ATc との間の電荷の逆転を引き起こす有意数のアミノ酸変 化が認められるが、これは電荷がこれらの位置で保存されて塩橋を保持すること を示唆する。精製ウシタンパク質から得られる６つの付加的ペプチドはNF−ATp のウシ相同体から得られ、このcDNA断片はMcCaffrey et al．(1993)Science 262 : 750〜754に報告された。NF−ATc とNF−ATp との比較から、それらが別個の 遺伝子であってRel 類似領域での同一性は73％であった（図４）が、しかしこの 領域の外側での類似性はごくわずかであった。NF−ATc に関するネズミcDNAが単 離され、予測タンパク質はヒトNF−ATc と87％の同一性を示し、ネズミNF−ATc とは明らかに異なることが判明した。実施例１．ヒトNF−ATc cDNAのヌクレオチド及びアミノ酸配列の確定 本実施例は、この新規のヒトNF−ATタンパク質であるNF−ATc の単離及び精製 、その断片のアミノ酸配列の確定、並びにこのタンパ ク質をコードするcDNAクローンの単離及びシーケンシングを示す。 新生児仔ウシから得られたウシ胸腺からタンパク質を精製した。約20個のウシ 胸腺を均質化してサイトゾル抽出物を作製し、次にこれに順次、１）硫酸アンモ ニウム沈降、２）スルホプロピルSepharose クロマトグラフィー、３）ヘパリン アガロースクロマトグラフィー、４）Sepharose CL4Bと結合した配列５′ACGCCC AAAGAGGAAAATTTGTTTCATACA−３′を用いたNF−ATc に対する多量体化結合部位を 用いたアフィニティークロマトグラフィー、及び５）逆相C4カラム上での高速液 体クロマトグラフィー処理を施した。その結果生じた精製タンパク質をLysC／Ar gCで切断して、高速液体クロマトグラフィーにより断片を単離した。次にこれら の個々の断片の配列を自動エドマン分解により確定した。得られた配列を以下に 示す：LRNSDIELRKGETDIGR 及びLRNADIELR。GETDIG（逆プライマー）及びRNADIE （前方プライマー）に対応する縮重オリゴを作製した。縮重オリゴPCR プライマ ーは以下の配列を有した： 前方：(A/C)GIAA(C/T)GCIGA(C/T)AT(A/C/T)GA(A/C) 逆 ：ICC(A/G/T)AT(A/G)TCIGT(C/T)TCICC cDNAを単離するために、確定アミノ酸配列に対応するオリゴヌクレオチドプロ ーブを作製し、PCR プライマーとして用いて、ウシ胸腺から調製したウシcDNAか ら45塩基性断片を単離した。ウシPCR 生成物は、−Ｌ−Ｒ−Ｋ−をコードするヌ クレオチド配列 CTG CGG AAAを包含した。同一45 bp 断片は、ヒト及びマウス供 給源から増幅し得る。 次にこのウシPCR 生成物を用いて、ヒトJurkat Ｔ細胞株のcDNAライブラリー をスクリーニングした。約１／100,000〜１／200,000 の頻度でクローンを単離 した。種々の長さの合計５つのヒトcDNAクローンを単離した。各クローン中に存 在する独特のEcoRＩ切断部 位を用いて２つの重複クローン（１つは５′末端を含有し、１つは３′末端を含 有する）を一緒に結紮し、ノーザンプロティングにより確定されたメッセンジャ ーRNA に対応する長さの全長cDNAを生成した。 サンガー法によりNF−ATc の配列を確定したが、その全ヌクレオチド及び予測 アミノ酸配列を図１に示す。この読取り枠をグルタチオントランスフェラーゼ遺 伝子と融合させ、その結果生じたクローンを細菌にトランスフェクションさせる ことにより、図１に示したイニシエーターメチオニンを確定した。その結果生じ たクローンは適切な分子量の融合タンパク質を生成したが、これはイニシエータ ーメチオニンで指定された読取り枠が実際に正しい読取り枠であることを示す。 同一手順により停止コドンの位置を確定した。さらに、停止コドンは９つの確定 アミノ酸配列に関する読取り枠に対応する。 FASTA プログラムの一列パラメーターを用いるDOTALIGNと呼ばれるマッキント ッシュシェアウエアプログラムを用いて個々のRel タンパク質に対して全NF−AT c タンパク質構造を一列に並べた。これらのタンパク質のRel ドメインに対応す るという有意の相同性が観察された。同一組のプログラムからのALIGN を用いて アミノ酸残基整列増強を実施した。必要な挿入を行わずに手で、NF−ATc 及びNF −ATp のRel 類似性領域の整列を実施し、Miyataアルファベット(Miyata et al ．(1979)J．Mol．Evol．12 : 214〜236)を用いて同様の残基を確定した。図４は このような配列整列の結果を示す。実施例２．Ｔ及び非Ｔ細胞におけるNF−ATc の発現 図１に示したcDNAを予測読取り枠内でインフルエンザ菌Hemophilus influenza ヘマグルチニン（HA）12アミノ酸エピトープタグと融合させ、ベクターpBJ5中で SRαプロモーターと操作可能的に結合さ せた（Lin et al.，1990，Science 249 : 677〜679）。その結果生じた構築物を エレクトロポレーションにより一時的にJurkalヒトＴリンパ球中、及びCos 繊維 芽細胞中でトランスフェクトした。HAエピトープを検出する抗体（12CA5，Berke ley Antibody Co.，CA）を用いて、トランスフェクト細胞から調製した全細胞抽 出物のウエスタンブロッティングにより、エピトープタグ化NF−ATc タンパク質 の発現を調べた。 図２は、NF−ATc cDNA構築物が、Jurkat Ｔ細胞及びCos 細胞の両方において 、精製タンパク質とサイズが正確に対応する約120kDAのタンパク質を発現し得る ことを示す（レーン３及び６標識化NF−ATc 参照。レーン２は対照と同様にウエ スターンブロットで検出されないエピトープタグを有さないNF−ATを示す）。実施例３．NF−ATc のトランスフェクションはCos 及びJurkat細胞における転写 を活性化する NF−ATc cDNAを、pBJ ベクター中のSV40初期遺伝子プロモーター及びHIV 転写 調節領域の一部と操作可能的に結合させた。この発現ベクターを、Jurkat及びCo s 細胞中で連鎖した部位と結合し、ルシフェラーゼの転写を指図する（結果は図 3A及び3Bに示す）NF−AT、並びにルシフェラーゼの転写を指図する（結果は図３ Ｂに示す）全IL−２エンハンサー／プロモーターの３つのコピーａ）のいずれか と同時トランスフェクトさせた。サイトゾル抽出物を調製し、標準手順(de Wet et al.，1987，Mol．Cell．Biol．7 : 724 837)によりルシフェラーゼ検定を実 施した。 結果は、Cos 細胞及びJurkat細胞の両方において、NF-ATc タンパク質の過発 現がNF−AT依存性転写を50〜1000倍に増強することを立証した（図3A参照）。さ らに、Cos 細胞におけるNF−ATc タンパク質の過発現は、NF−ATc の非存在下で は活性化されないIL−２プ ロモーターを活性化した（図3B参照）。 これらの結果は、cDNAクローンが機能NF−ATc タンパク質をコードし、NF−AT c がＴ細胞に対するインターロイキン−２の発現を制限することを示す。実施例４．NF−ATc mRNA及びタンパク質発現 NF−ATc mRNAは、IL−２又はNF−AT依存性転写ができない細胞株であるHela細 胞中に存在しない（図５、パネルａ、レーン７）が、しかしJurkat細胞中では誘 導できる（図５、パネルａ）。この誘導はシクロスポリンＡ(CsA)に感受性で、 このことはNF−ATc が、CsA がその核抱合を遮断することが示されているように 、自己剌激性ループに関与し得ることを示す（Flanagan et al．(1991)Nature 3 52 : 803〜807)。２つのＢ細胞株、即ち筋組織Hcp G2細胞及び骨髄性白血病細胞 はNF−ATc mRNAを発現しない（図５、パネルｂ）。これらの観察は、IL−２転写 及びNF−AT活性の観察されたＴ細胞制限化パターンと一致する。過去の研究(Ver weij et al．(1990)J．Biol．Chem．265 : 15788〜15795)は、NF−AT依存性レポ ーター遺伝子を発現するトランスジェニックマウスの主に脾臓、胸腺及び皮膚に おけるNF−AT依存性転写を明示した。これらの観察と一致して、ネズミNF−ATc mRNAは同一パターンの発現を示した（図５、パネルｃ）。少量のNF−ATc 発現が 肺及び心臓で観察されたが、しかしこれは循環Ｔ細胞による汚染によるものと思 われた。定量的リホヌクレアーゼ保護により検定したネズミNF−ATc mRNAは、脳 、心臓、胸腺及び脾臓においてはほぼ等レベルで発現されることが判明した（図 ５、パネルｃ）。NF−ATc に対比して、NF−ATp はPMA 及びイオノマイシンによ り誘導されなかった（図５、パネルｃ）。 方法。特異的ヒト又はマウスNF−ATc、又はマウスNF−ATp cDNA断片を、RNA 転写体の合成のための鋳型として用いた。10μｇの全 RNA を用いてMelton et al．(1984)Nucl．Acids．Res．12 : 7035〜7056に従っ て、リボヌクレアーゼ保護を実施した。脾臓細胞及び胸腺細胞を単離し、上記の ように処理(Verweij et al．(1990)J．Biol．Chem．265 : 15788〜15795)した後 、RNA を単離し、そうでなければ全組織を用いた。実施例５．NF−ATc の機能的発現 NF−ATルシフェラーゼ及びIL−２ルシフェラーゼが記載去れている（Northrop et al．(1993)J．Biol．Chem．268 : 2917〜2923）。NF−ATルシフェラーゼのN F−AT認識部位の代わりに三量体化 HNF−１認識部位（β28）を挿入することよ り、β28ルシフェラーゼを構築した。プラスミドpSV2CAT（Gorman et al．(1982 )Mol．Cell．Biol．２：1044〜1050）をトランスフェクション効率のための内部 対照として用いた。上記のように 1.5μｇのルシフェラーゼレポーター及び３μ ｇの発現構築物で細胞をトランスフェクトした。20時間増殖させた後、20ng／ml PMA＋又は２μＭイオノマイシンで８時間細胞を剌激し、ルシフェラーゼ(de We t et al.，1987，Mol．Cell．Biol．7 : 724〜837)及びCAT検定（Gouman et al ．(1982)Mol．Cell．Biol．2 : 1044〜1050）のために収穫した。 上記のようにCos 細胞をエピトープタグ化NF−ATc でトランスフェクトした。 Cos 細胞、Jurkat細胞及びネズミ胸腺細胞をPMA 及びイオノマイシンで３時間刺 激し、Hela細胞をPMA 単独で３時間刺激し、上記のように核抽出物を調製した（ Fiefing et al．(1990)Gene & Dev．4 : 1823〜1834）。非剌激Cos 細胞からサ イトゾルを調製した。前述のように、ゲル運動性シフトを実施した（Flanagan e t al．(1991)Nature 352 : 803〜807 ; Nouthrop et al．(1993)J．Biol．Chem ．268 : 2917〜2923）。ベクターpGEX3X(Pharmacia)を用いて細菌性発現グルタ チオンＳ−トランスフェラーゼ融合タ ンパク質で免疫化したマウスにおいて抗血清を生じさせて、グルタチオンアガロ ース上で精製した。融合タンパク質は、NF−ATc 残基12〜143(免疫−１)及び12 〜699(免疫−２)を含有した。 非Ｔ細胞株中に発現されたNF−ATc は、NF−AT部位及びIL−２プロモーターか らの転写を特に活性化した（図６、パネルａ（左）、及び図６、パネルｂ）。一 時的トランスフェクト化Jurkat細胞では、NF−ATc の過発現はNF−AT依存性プロ モーターを活性化するが、しかし HNF−１依存性プロモーター（図６、パネルａ （右））又はAP−１依存性プロモーターを活性化しない。NF−ATc cDNAのトラン スフェクションは、内因性NF−ATと識別できないDNA 結合活性を生じた（図６、 パネルｃ、レーン１〜４）。トランスフェクト化cDNAによりコードされるHAエピ トープに対して向けられる抗体はNF−AT複合体の超シフトを誘導し、このことは NF−ATc がこの活性に関与することを示す。トランスフェクト化Cos 細胞中の核 NF−AT活性は、Ｔ細胞中の元の核複合体と同時移動し、同じ結合特異性を有する （図６、パネルｃ、レーン４〜11）。NF−ATc トランスフェクト化Cos 細胞のサ イトゾル抽出物は、Hela核抽出物と混合すると（図６、パネルｃ、レーン12〜16 ）、Ｔ細胞からのサイトゾルと同様に、NF−AT DNA結合活性を再構築し得る（Fl anagan et al．(1991)Nature 352 : 803〜807 ; Northtop et al．(1993)J．Bio l．Chem．268 : 2917〜2923）。NF−ATc との類似性を有さないNF−ATc の細菌 性発現化断片に対して生じた抗血清は内因性NF−AT複合体の超シフトを誘導し得 るが、しかしJurkat細胞又は胸腺細胞からのAP−１複合体はできない（それぞれ 免疫−１及び免疫−２。図６、パネルｄ）。免疫−２抗血清は、ネズミ胸腺核抽 出物を用いて産生されたDNA タンパク質複合体を有意に低減したが、これはウシ 胸腺からの精製タンパク質におけるNF−ATc 及びNF−ATp ペプチドの相対的に 等しい表示と一致した。実施例６．一過性トランスフェクション検定で検定したNF−ATc 優性陰性突然変 異体 cDNAの広範な欠失分析後に調製した優性陰性NF−ATc は、アミノ末端ドメイン が結合に影響を及ぼさずにNF−AT依存性機能を遮断することを示した。cDNAのこ の領域はNF−ATp では見いだされず、したがってIL−２遺伝子の活性化へのNF− ATc の関与を査定するために用い得る。使用した優性陰性NF−ATc は、アミノ酸 463のPvuII部位に延びるエピトープタグ化NF−ATc 発現プラスミド（上記）のカ ルボキシ末端切断で構成される。この優性陰性のトランスフェクションは、IL− ２プロモーター機能、並びにNF−AT部位により指図される転写の90％以上の阻害 を引き起こした（図７）。AP−１部位、又はRSV プロモーター及びエンハンサー により指示された転写は相対的に影響を受けなかったため、この作用は高度に特 異的であった（図７）。これらの結果は、NF−ATc がＴ細胞中でのIL−２遺伝子 発現に実質的に関与することを強く示す。 優性陰性NF−ATc ポリペプチド又はそのペプチド模倣体は、Ｔ細胞のNF−AT媒 介性活性化の薬学的拮抗薬として用い得る。一変形では、このような薬物は、他 の多数の用途（例えば免疫抑制薬）の中で、Ｔ細胞活性等の実験室試験及び分析 のための商業的研究試薬として用い得る。実施例７．NF-ATc の翻訳後修飾 PKC を活性化するか又は細胞内Ca＋＋を増大する薬物で処理した細胞において 、NF−ATc の翻訳後修飾を調べた。図２に示されているように細胞をNF−ATc で トランスフェクトし、100ng／ml CsAを加えた場合と加えない場合で、２時間剌 激した。図２と同様に、全細胞溶解物をウエスターンブロットにより分析した。 イオノマイシ ンで処理した細胞中の大量のNF−ATc が、非処理細胞の場合よりも速く移動し、 この運動性シフトはCsA により阻害された（図８、レーン１，３〜４）。これは 脱リン酸化の場合と一致し、カルシノイリンの直接作用によると思われる(Clips tone and Crabtree（1992）Nature 357 : 695〜697)が、しかし多数の工程はい ずれもが観察された運動性変化を生じ得る。NF−ATc がカルシノイリンの基質で ある証拠が認められたが、しかしNF−ATp 又はNF−ATc のホスファターゼ処理に より生じた運動性シフトは、図８で観察されるものよりはるかに大きかった。こ れらの観察は、NF−ATc がカルシノイリンの直接の基質でないことを示す。PMA 処理は、緩徐移動NF−ATc を生じた（図８、レーン２）；したがってPKC 活性化 経路はおそらく、核成分の活性化の他に、NF−ATc の修飾によるNF−AT活性に関 与するものと思われる。 本発明を理解するために多少詳細に説明をしてきたが、請求の範囲内で変更及 び修正し得ることは明らかである。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ１２Ｎ 5/10 0276−2Ｊ Ｇ０１Ｎ 33/53 Ｋ 15/09 ＺＮＡ 0276−2Ｊ 33/531 Ａ Ｃ１２Ｐ 21/02 9051−4Ｃ Ａ６１Ｋ 37/02 // Ｇ０１Ｎ 33/53 9162−4Ｂ Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ 33/531 9281−4Ｂ 5/00 Ｂ (Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｒ 1:91） (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ (72)発明者 ホー，ステファン エヌ. アメリカ合衆国，カリフォルニア 94025, メンロ パーク，パートリッジ アベニュ 736

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．図１に示されているポリペプチド配列と実質的に同一である少なくとも25 の連続するアミノ酸のポリペプチド配列を含んで成る分離されたNF−ATc ポリペ プチド。 ２．図１に示されている全長NF−ATc ポリペプチド配列と実質的に同一である 、請求の範囲第１項に記載の分離されたNF−ATc ポリペプチド。 ３．哺乳動物の体内で自然に発生するポリペプチド配列である、請求の範囲第 １項に記載の分離されたNF−ATc ポリペプチド。 ４．ヒトNF−ATc ポリペプチドである、請求の範囲第３項に記載の分離された NF−ATc ポリペプチド。 ５．表IIに示されているアミノ酸配列のうち少なくとも２つを含んで成る、請 求の範囲第４項に記載の分離されたNF−ATc ポリペプチド。 ６．図１のNF−ATc ポリペプチド配列のアミノ酸 418〜アミノ酸710 までを含 んで成る、請求の範囲第１項に記載の分離されたNF−ATc ポリペプチド。 ７．図１のアミノ酸１〜418 を含み、基本的に図１のアミノ酸 419〜716 から 成るアミノ酸配列が欠如しているポリペプチド。 ８．長さがアミノ酸716 個未満である、請求の範囲第１項に記載の分離された NF−ATc ポリペプチド。 ９．請求の範囲第１項に記載のNF−ATc ポリペプチドをコードする分離された ポリヌクレオチド。 10．NF−ATc ポリペプチドが というペプチド配列のうちの少なくとも１つを含んで成る、請求の範囲第９項に 記載の分離されたポリヌクレオチド。 11．NF−ATc ポリペプチドが、 という配列を含んで成る、請求の範囲第10項に記載の分離されたポリヌクレオチ ド。 12．NF−ATc ポリペプチドが、図１のアミノ酸 419〜716 を含んで成る、請求 の範囲第９項に記載の分離されたポリヌクレオチド。 13． というNF−ATc ポリヌクレオチド配列のうちの少なくとも１つを含んで成る、分 離されたポリヌクレオチド。 14．NF−ATc ポリペプチドをコードする請求の範囲第13項に記載の分離された NF−ATc ポリヌクレオチド。 15．請求の範囲第９項に記載の、NF−ATc ポリヌクレオチドを内含する宿主細 胞。 16．前記宿主細胞がNF−ATc ポリヌクレオチドを発現しかくしてNF−ATc ポリ ペプチドを産生する、請求の範囲第15項に記載の宿主細胞。 17．NF−ATに依存するリポータ遺伝子をさらに含んで成る、請求の範囲第15項 に記載の宿主細胞。 18．図１に示されているポリペプチド配列と実質的に同一である、実質的に精 製されたNF−ATc ポリペプチドを含んで成る組成物。