JP2000506367A - ▲ｉｉ▼型コラーゲンの調製法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 非加工脊椎動物軟骨組織から軟骨膜の除去を容易にする方法で、上記軟骨から上記軟骨膜を切断または緩めるのに十分な時間の攪拌の下で、酸性プロテアーゼを含む酸性溶液と上記軟骨を接触させることを含む方法。

Description

【発明の詳細な説明】 II型コラーゲンの調製法 発明の分野 本発明は生のII型コラーゲン含有組織を隣接したＩ型コラーゲン含有組織(軟 骨膜)から分離するための、さらに結果として生じたII型コラーゲン含有組織か らプロテオグリカンを除去するための、生のII型コラーゲン含有組織の加工法に 関する。両方法は精製されたII型コラーゲンを生産するための工程での前処理と して用いられる。さらに特に、本発明はII型コラーゲン含有組織をＩ型コラーゲ ン含有組織の除去を容易にするためのペプシンのような一つのプロテアーゼを用 いて処理し、それからII型コラーゲン抽出の前にプロテオグリカンを除去するた めのトリプシンのようなもう一つのプロテアーゼで処理する方法に関する。 発明の背景 コラーゲンは哺乳動物、鳥類、及び魚類の軟骨及び他の結合組織の主要な組成 物である。それはグリシン、プロリン及びヒドロキシプロリンの高含有量を持つ ことによって特徴付けられる。構造的には、全てのコラーゲン分子がGly-X-Yと いう繰り返しアミノ酸配列を含むトリプルストランドのヘリックスドメインを含 み、そこではプロリンがX位に頻繁に見出され、4-ヒドロキシプロリンがY位に頻 繁に見出される。ヘリックスはα鎖と呼ばれる3のポリペプチドから成り、それ ぞれはＩ-III,．Ｖ、及びＸＩ型繊維形成コラーゲンでは長さにおいて約1000ア ミノ酸である。これらの鎖はおよそ300nmの長さで1.5nmの直径のスーパーヘリッ クス構造を形成するために互いに巻き付いている(Petruska,JA及びHodge,AJ,Pro c.Natl.Acad.Sci.,U.S.A.,51:871,1964)。 今日では19の異なるコラーゲンが同定されており、それぞれは異なる遺伝子に コードされている(Prockop,DJ及びKivirikko,KI,Ann.Rev.Biochem.,64:403-434, 1995)。これらのコラーゲンは、その形態または他の構造的特徴に依存して異な るクラスに分類できる。これらの中で最もよく特性指摘されているのがＩ型、II 型、 III型及びIV型コラーゲンである。Ｉ、II及びIII型は結合組織において見出され る主要なコラーゲンタイプである(Miller,EJ,Collagen Types:Structure,Distri bution,and Functions,In:Collagen,Volume I-Biochemistry,ME Nimni編,CRC Pr ess,Boca Raton,FL,1988,第五章、pp.139-156)。これら3のうちでＩ型コラーゲ ンは最も有名である。IV型コラーゲンは基底層でシート状メッシュワーク内に集 合してもっぱら見出され、それは該シート状メッシュワークの主要な部分を構成 している。II型コラーゲンの多数は軟骨構造に見出される。それはまた目の硝子 体にも見出される。 脊椎動物組織(例えば軟骨)からのII型コラーゲンの抽出は、コラーゲンに結合 しているプロテオグリカンの除去によって容易である。プロテオグリカンは全て の結合組織の「基質」を形成し、そこに結合組織繊維が埋め込まれている物質であ る。コラーゲンの抽出の前に軟骨からプロテオグリカンを除去するための様々な 方法が本分野で用いられており、その多くは無機及び有機塩類の水溶液を用いて いる。コラーゲン抽出物からのII型コラーゲンの精製には、一般的にＩ、IX、Ｘ Ｉ型コラーゲンからII型コラーゲンを分離するために特異的な塩沈降が含まれる 。ＩおよびII型コラーゲンは酸性塩沈降において共沈降し、IX及びＸＩ型コラー ゲンと分離し得る。しかしながら中性塩沈降ではII型及びＩ型コラーゲンの効果 的な分離が必要とされる。II型コラーゲンの精製は、もしＩ型コラーゲン含有膜 が抽出及び精製の前に胸骨(または他の軟骨)ソースから除去されれば、より容易 になされる。該分離は軟骨ソースから膜(軟骨膜)を手で剥ぎ取ることによって以 前の技術では成し遂げられている(Butler,WT及びReese,CA,Preparation of Type II Collagen,In:Immunochemistry of The Extracellular Matrix,Volume I.Meth ods,H.Furthmayr編,CRC Press,Boca Raton,FL,1982 pp.55-60)。これは実験室レ ベル工程であり、II型コラーゲンのラージスケール調製には実践的ではない。さ らにＩ型コラーゲンがたくさんのII型コラーゲンを含有した調製物から除去され ることを確立するためのさらなる加工工程が必要があり、結果として精製II型コ ラーゲンの収量が減少するため、該除去では不十分である。該加工工程には中性 pH溶液からＩ型コラーゲンを選択的に沈降するための約2.5Mの濃度での塩化ナト リウムの使用、及び中性溶液からII型コラーゲンを選択的に沈降するための約4. 0M の塩化ナトリウムの使用が含まれる。大量の固体の塩化ナトリウムがさらなる加 工工程においてこれらの沈降のため必要とされる。II型コラーゲン産物における Ｉ型コラーゲンの残余レベルは、0.5%から5.0%の範囲であろう。本発明は軟骨膜 の高く効率のよい除去のための方法を提供し、典型的には1%より少ないＩ型コラ ーゲンのみが最終沈降物に含まれるようになる。 本発明は軟骨膜の大半を部分的に切断し除去するために、そして緩やかに剥離 されたものをこのＩ型コラーゲン膜の実質的に完全な、または完全な除去を引き 起こすであろうように残りの部分を緩めるために、ペプシンのような酸性プロテ イナーゼを用いる方法を開示する。軟骨膜除去はII型コラーゲンを精製するため に必要とされる数多くの加工工程を減少し、それによってII型コラーゲンの調製 を単純化し加工コストを減少する。酸性プロテイナーゼは組織からコラーゲンを 抽出するために決まって用いられているが、一つのコラーゲンタイプから第二の コラーゲンタイプを別々に分離するためには用いられていない。II型コラーゲン はプロテオグリカンによって「保護」されており、それによってこの前処理の間該 酵素によって有意に切断または抽出されないので、該別々の除去は特に胸骨組織 のような軟骨組織からII型コラーゲンを抽出する工程に適用される。 一度軟骨膜が除去されると、軟骨組織はプロテオグリカンを除去するために機 械的に粉砕され処理される。プロテオグリカンはさらなるII型コラーゲン抽出の 前に除去されねばならない。以前の技術では、プロテオグリカンは一般的に無機 または有機塩類を用いて抽出されていた。1から5モル(M)の濃度の塩化ナトリウ ム、塩化カリウム、及び塩化セシウムといったアルカリメタルハロゲン化物を含 む溶液は、組織中に初めに存在する全ヘキスロン酸のわずか15-20%を抽出できる だけである(プロテオグリカンの構成要素である残余のヘキスロン酸はプロテオ グリカン抽出効率の基準として用いられる)(Mason,RM及びMayes,RW,Biochem.Jou rnal,131:535-540,1973)。臭化リチウム(4M)及び塩化リチウム(6M)は、より効率 的なプロテオグリカン抽出試薬であり、軟骨からへキスロン酸の70-80%の抽出に 作用できる。しかしながらリチウム塩類は比較的高価であり、その使用は経済的 に魅力がない(特にラージスケール操作においては)。さらに大量のリチウム塩類 が抽出の必要があり、リチウム含有溶液は環境への悪い影響を避けるために徹底 的に処 分されねばならない。 塩化マグネシウム、塩化カルシウム及び塩化バリウムのようなII属金属ハロゲ ン化物の水溶液もまた、コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを抽出するた めの有用性が見出されている。塩化マグネシウム(3M)または塩化カルシウム(2M) のいずれかを用いた軟骨の抽出は、ウシ関節軟骨から全ヘキスロン酸の60-70%の 除去を引き起こす(Mason,RM及びMayes,RW,Biochemical Journal,131:535-540,19 73)。グアニジン塩酸(3-5M)及び塩化S-メチルイソチオウラニウムのような有機 ハロゲン化物は、塩化マグネシウムまたは塩化カルシウムのそれぞれよりプロテ オグリカンの抽出においてより効率的(80-85%)である(Mason,RM及びMayes,RW,Bi ochemical Journal,131:535-540,1973)。II型コラーゲン含有組織からのプロテ オグリカンの抽出効率は、抽出溶液(すなわちハロゲン化物塩)と同時に処理され る組織のソースと年齢に依存する。胎児及び新生児組織からのプロテオグリカン の抽出は、大人の組織(典型的にはわずか約60%)と比較して高く効率的である(90 %以上)(McNichol,D及びRoughley,PJ,Biochemical Journal,185:705-713,1980)。 鼻、腫瘍、喉頭、及び気管の各軟骨からのプロテオグリカンの抽出(85%除去と同 程度)は、関節及び膝半月板の各軟骨からのもの(典型的には56-62%)より効率的 である(Stanescu,V.,等,Biochem.Biophys.Acta,629:371-381,1980)。抽出効率は また、用いられる方法、すなわち低塩濃度で数多くの塩抽出か、または高塩濃度 で少ない抽出かに影響される。以前の技術で引用されている組織からのプロテオ グリカンのいくつかのさらなる抽出方法には以下のものがある： Cremer等(J.of Immunol.124:2912(1980))は、ヒヨコ胸骨組織からのII型コラ ーゲンの調製の工程としてプロテオグリカンの除去を開示し、そこでは胸骨はあ る程度プロテオグリカンを除去するためにリン酸カリウムバッファーのような低 イオン強度バッファーを用いて処理され、引き続きコラーゲンを抽出するために 酵素:組織の割合が5%でペプシンを用いて処理され、その後II型コラーゲンを精 製するためにクロマトグラフィー工程がなされる。 Steven及びThomas(Biochem.J.,135:245(1973))はヒト軟骨の超薄切片を過酸化 水素溶液で18時間処理することによって軟骨から不溶性コラーゲンを調整する方 法を記述する。それから過酸化水素処理軟骨を水で徹底的に洗浄し、1%塩化ナト リウム溶液で洗浄し、そして組織に対する酵素の割合が1%のトリプシンで切断を 受けさせる。過酸化水素工程はトリプシンによるコアタンパク質の分解の前にプ ロテオグリカンのグリコサミノグリカン側鎖を脱重合化するために実行された。 Kempson等(Biochim.Biophys.Acta,297:456-472,1973)は、ヒト大腿部関節丘を コンドロイチナーゼとトリプシンを用いた処理に引き続いて、インキュベーショ ン溶液内にウロン酸を放出する方法を記述する。トリプシンは37℃で48時間のイ ンキュベーション後、軟骨ウロン酸の94%まで放出するのに効果的である。 他のもの(Heinegard及びHascall,Arch.Biochem.Biophys.,165:427-442,1974、 そしてRoughley及びBarrett,Biochemical Journal,167:629-637,1977)は、トリ プシンが軟骨組織から抽出されたプロテオグリカンを分解するのに効果的である ことを示している。 Trentham等(J.of Exp.Med.,146:857(1977))は、2M塩化マグネシウムを用いた プロテオグリカン抽出の後、組織に対する酵素の割合が2%でペプシン切断、切断 物の遠心分離、そしてDEAEセルロースカラムに上清を乗せ、Tris/NaClバッファ ーを用いたII型コラーゲンの溶出を含む、チキン剣状軟骨からのII型コラーゲン の調製法を開示する。 Bayliss等(Biochem.J.,169:123(1978))は、通常ヒト関節軟骨からのプロテオ グリカンの抽出を開示し、そこでは軟骨をグアニジン塩酸(4Ｍ)で処理し、続い てCsCl密度遠心分離でコラーゲンから軟骨プロテオグリカンを分離する。 上記のプロテオグリカン抽出法は、低イオン強度溶液でのホモゲナイゼーショ ンによる軟骨の機械的破壊、または塩化マグネシウム、塩化カルシウムあるいは 塩酸グアニジンのような塩類の濃縮溶液による化学的抽出に主に依存している。 これらの方法は軟骨からプロテオグリカンを抽出するが、それらは比較的不十分 である。さらにこれらの方法は、残余の塩類を除去するためプロテオグリカン枯 渇軟骨ペレットの徹底的な洗浄に引き続き多量の塩類の使用を必要とし、それは 多量の塩類の調達と処理に関する価格、及びこれらのさらなる工程に必要とされ る高価な工程のため、該方法のコストを増大させる。以前の技術の方法のもう一 つの欠点は、ハロゲン化物塩類を用いて処理された軟骨から生産されたII型コラ ーゲン調製物の純度に不一致が存在することである。 II型コラーゲン含有軟骨からＩ型コラーゲン含有軟骨膜を除去する本方法、及 びII型コラーゲンからプロテオグリカンを分離する本方法は、以前の技術の方法 よりも驚くべきそして期待していなかった利点を持つことが見出され、それは1 ）II型コラーゲンの矛盾のない一回毎の収率と純度、2）引き続くII型コラーゲ ン含有組織からのプロテオグリカンの抽出のより大きい効率;そして3）与えられ た量のスタート物質(例えばチキン胸骨)からのII型コラーゲンの増大した収率を 制限することなく含む。 ここで用いられている以下の単語は以下のものに帰する意味を持つ： 発明の目的 チキン胸骨からＩ型コラーゲン含有軟骨膜の除去に対する効果的な方法を提供 することが本発明の目的である。Ｉ型コラーゲンから実質的にフリーのII型コラ ーゲン含有組織からプロテオグリカンを効率よく除去する方法を提供することも 本発明の目的である。特にII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを除去 する方法を提供することが本発明の目的であり、それは少なくとも以下の一つを 伴う： （a）容易に処分可能な抽出試薬の少量で低価格な量を必要とする； （b）II型コラーゲンからプロテオグリカンの容易な分離を提供する;そして(c) 精製産物の高く矛盾のない収率を引き起こす。 動物組織からプロテオグリカンとＩ型コラーゲン物質の両者が実質的にフリー であるII型コラーゲンを得るための改良された工程を提供することが本発明のも う一つの目的である。 発明の概要 本発明の第一の面は、ペプシンのような酸性プロテイナーゼの存在下で酸性溶 液で非加工II型コラーゲン含有組織を処理し、II型コラーゲン含有組織からＩ型 コラーゲン含有組織の分解と分離を引き起こすのに十分な時間で緩やかな攪拌に 該混合物を受けさせることを含む、II型コラーゲン含有動物組織を含んだＩ型コ ラーゲン含有組織を除去する改良された方法に向けられている。酸性コンディシ ョンで活性を持つ他のタンパク質溶解性酵素の非制限的な例としては、レニン(3 .4.3)及び酸性カテプシン(B及びD)が含まれる。 加えて改良された方法は、中性プロテイナーゼで結合組織を処理することによ ってＩ型コラーゲンから実質的にフリーなII型コラーゲン含有組織からプロテオ グリカンを抽出及び除去し、不溶性II型コラーゲンから可溶性プロテオグリカン を分離するための遠心分離が引き続くことに対して見出されている。一つ以上の 様々なプロテアーゼがII型コラーゲン含有組織からプロテオグリカンを除去する ために用いられ得、それにはトリプシン(3.4.4.4)(好ましい)、キモトリプシンA (3.4.4.5)、キモトリプシンB(3.4.4.6)、膵ペプチダーゼB(3.4.4.7)、カテプシ ンC(3.4.4.9)、パパイン(3.4.4.10)、キモパパイン(3.4.4.11)、及びフィシン(3 .4.4.12)が含まれる(カッコ内の数はEnzyme Commissionリファレンスナンバーで ある)。 好ましい実施態様として、本発明はII型コラーゲン含有組織及び近接したＩ型 コラーゲン含有組織を含む動物組織からII型コラーゲンを精製するための方法を 提供し、該方法は第一に上述したようにＩ型コラーゲン含有組織を除去し、引き 続き最初に記載した方法にしたがってプロテオグリカンを除去することを含む。 発明の詳細な説明 本発明の方法が好ましくは適用される組織は、脊椎動物由来の胸骨、椎間板、 脊索、鼻、腫瘍、喉頭、及び気管の各軟骨のような構造的繊維、特にII型コラー ゲンを含む組織である。それらが多く入手可能であるので、チキン軟骨組織が用 いられており、特にチキン加工工場から入手可能なチキン胸骨の形態が好ましい 。該組織は本発明の方法によって加工される前は4℃以下で保存されるのが好ま しい。該生の組織はいかなる残存している肉または骨を除去するために切り取ら れる。II型コラーゲン含有組織としてチキン胸骨が用いられた場合、該組織のい かなるさらなる工程の前に、Ｉ型コラーゲンを多く含有している軟骨膜を除去す ることが好ましい(そして本発明の重要な面を構成する)。ほとんどの軟骨組織は 繊維状軟骨膜によって取り巻かれている。例外は関節軟骨に存在するようであり (RA Stockwell,Biology of Cartilage Cells,Cambridge University Press,Camb ridge,England,1979)、そして関節軟骨がII型コラーゲンのソースとして用いら れた場合には、Ｉ型コラーゲンを除去する工程が省略される。もちろん以前の技 術に教示されているようなピンセットやメスを用いて軟骨膜を除去することも可 能である。しかしながら好ましくは、非加工の肉及び骨がフリーな胸骨がペプシ ンのような酸性コンディションの下で活性なタンパク質分解酵素の存在下で、希 釈酸性溶液(例えば酢酸、クエン酸、塩酸等)に置かれ、約12から72時間緩やかに 攪拌される。胸骨は数日間酸性溶液で貯蔵され得るが、ペプシンが酸性溶液中の 胸骨の浸漬の時にすぐに加えられた場合、軟骨膜の除去は実質的により容易にな る。コラーゲン組織は塩酸よりも高程度で酢酸中で溶け、これは酸性プロテアー ゼの働きを容易にするので、酢酸が好ましい。 一般的に約0.05Mから約1.0Mの濃度で用いられる希釈有機酸溶液が好ましく、 ペプシンは100mg/リットルから500mg/リットルで加えられる。酸性溶液は好まし くは約0.25から0.75M、好ましくは約0.5Mの濃度の酢酸である。酸性溶液中の典 型的なペプシンの濃度は、約200から500mg/リットル、好ましくは約300から400m g/リットルの範囲である。ペプシンは、芳香族またはジカルボキシルアミノ酸残 基に隣接するペプチド結合を持つアミノ酸を含むペプチドを加水分解する酸性プ ロテイナーゼである。付着したＩ型コラーゲンを除去するための軟骨ソース(チ キン胸骨のような)の処理に対して、軟骨組織からII型コラーゲンの有意な量の 切断と抽出を引き起こさないで、Ｉ型コラーゲン膜を部分的に分解、軟化、そし て緩めるために、十分な活性のペプシンが加えられるべきである。Ｉ型膜を除去 するためのペプシン活性の十分な量は、軟骨組織の視覚による観察によって測定 される。 Ｉ型膜の分解、軟化及び緩めることは、約12から約72時間で成し遂げられるべき である。 ペプシンを用いた添加物の代わりにまたはそこにおいて用いられ得る酸性コン ディションで活性を持つ他のタンパク質分解酵素には、レニン(3.4.4.3)、及び 酸性カテプシン(B,D)が含まれる。ペプシンと同様のタンパク質分解特異性を持 つ酵素であるレニンがＩ型コラーゲン含有膜を除去するために用いられる場合、 それは約300から700mg/リットル、好ましくは約400から600mg/リットルの濃度で 用いられるべきである。カテプシンDはウシ及びウサキ脾臓から精製されている カルボキシエンドプロテイナーゼであり、ペプシンと同様の特異性を示す、カテ プシンBはチオエンドプロテイナーゼである。軟骨膜を除去するために必要とさ れるカテプシンB及びDの濃度は、ペプシン及びレニンのものより高く、約400か ら約1000mgのカテプシン(B及びDのそれぞれ)/リットルの範囲である。Ｉ型コラ ーゲン除去酵素のために必要とされる濃度の範囲はその活性に依存し、該酵素の それぞれのソースに対して測定される必要がある。酵素活性の測定は当業者に対 して容易である。 II型コラーゲン含有組織のペプシン処理の間、該溶液は約4℃から約28℃で維 持され得るが、好ましくは約20℃で維持される。該組織はペプシン処理の間攪拌 されるべきで、該攪拌は好ましくは酸性液体中に懸濁されたII型コラーゲン含有 組織を保つ速度での攪拌を含む。該攪拌速度は混合容器の容量とユニット容量当 たり加えられた胸骨の量に依存する。緩められた膜は攪拌ロッドに巻き付き、該 ロッドから容易に引き離される。典型的なパイロットスケール工程では、ほとん どの肉と骨が除去された300のチキン胸骨(およそ25ポンド)が、溶液のリットル 当たり400mgのペプシンを含む60リットルの希釈有機酸に混ぜられる。該胸骨はL ightnin Mixerのような混合器を用いて約250-350rpmで、または溶液中の胸骨の 懸濁を許容し、容器の底に胸骨が動かず止まっている状態にないような速度で溶 液中で分散される。 軟骨膜は典型的には緩められて壊され、胸骨から分離され、そして攪拌物に巻 き付き、それから容易に除去され得ることができよう。軟骨膜を除去する処理の 後、該胸骨は残余の膜を除去するために水で洗浄されリンスされ、膜粒子が緩め られる。該膜小片は容易に同定され、洗浄は全ての該小片が完全なII型コラーゲ ン含有組織から洗い流されるまで継続されるべきである。時折、水での洗浄とリ ンスでは除去されないいかなる緩められてはいるが未だ付着している軟骨膜を除 去するために、例えば機械的な手段を用いて緩められた膜を拭き取ることや、ま たはII型コラーゲン含有組織を緩やかな研磨用の動きをする第二の混合系に置く ことが必要であろう。 それからほとんど全ての軟骨膜が除去されているII型コラーゲン含有組織を微 粉化を容易にするために凍結させる。該凍結組織をMicron Powder Systems Mikr o-Bantam Pulverizer内に装填する。-20℃以下に温度を保つグラインディングチ ェンバー内に液体窒素を継続的に流す。胸骨を0.062インチスクリーンを通して 均一なパウダーに微粉化する。該パウダーを約-15℃で貯蔵し得る。該パウダー 化組織を7-9の範囲のpH、好ましくはpH8を提供するバッファーと混ぜる。該バッ ファーは好ましくはTrisバッファーである。スラリー中の該パウダー化組織の量 は、約1から約100グラム/リットルの範囲であり、好ましくは約20から40グラム/ リットル、そして最も好ましくは約25グラム/リットルである。該スラリーに対 してプロテアーゼ、好ましくはトリプシンを加える。代わりに(またはその添加 物中に)他の中性プロテアーゼで以下に含まれるのもを用い得る:キモトリプシン A、キモトリプシンB、膵ペプチダーゼB、カテプシンC、パパイン、キモパパイン 、そしてフィシン。トリプシンをバッファー内に溶解し、それから約0.005から0 .05%、好ましくは約0.01から0.025%、そして最も好ましくは0.02%の最終濃度で 加える。トリプシンの効果的な濃度は酵素調製物の特異的な活性に依存する。一 般的にパウダー化組織に対する該プロテアーゼの重量比は、約0.05から約5%の間 であるべきであり、好ましくは約0.8%であるべきである。組織に対する同様な酵 素の重量比が、パパイン、キモトリプシン、膵ペプチダーゼ、キモパパイン、そ してフィシンを用いた場合にも用いられる。正確な量は与えられたロットの特異 的な酵素活性及び酵素のソースに依存し、酵素のユニット重量当たりの特異的な 活性を測定し、それから上述したトリプシン活性と大体等しい酵素活性の量を用 いることによって当業者に容易に突き止められよう。 プロテアーゼの添加後、該スラリーを約4℃から約35℃で、好ましくは約4℃で 、 8から36時間、好ましくは約15から20時間、そして最も好ましくは約17時間攪拌 する。トリプシンは高い純度の形態で容易に入手可能であり、比較的安価である ため、トリプシンが好ましい酵素である。 攪拌後、該スラリーを可溶層から非分解粒子を分離するため遠心分離にかける 。該上清を捨て該ペレットを再懸濁してバッファーで洗浄し、引き続き第二の遠 心分離にかける。該上清を再び捨て、他の酵素を用いてさらに切断され典型的に は>99%II型コラーゲンを含むパウダーに精製されるペレットを得る。Ｉ型コラー ゲン不純物の分析は周知の方法にしたがって逆相HPLCによってなされ、典型的に は1%以下である。プロテオグリカン不純物のレベルも典型的には1%以下である。 プロテオグリカン抽出に引き続き、II型コラーゲン含有組織を、アニオン交換 クロマログラフィーと高塩工程を削除することを除いて、Trentham,1977に記述 されているもののような方法を用いてさらに抽出し精製する。残余の酵素を洗浄 及び/または透析またはジアフィルトレーションによって除去し得る。前述のII 型コラーゲン含有産物は、研究目的の細胞培養において、または例えばU.S.P.第 5,399,347号に教示されているように慢性関節リウマチの治療において有用な経 口製薬学的処方の調製において有用であろう。 全ての引用されている文書は参考として全体として取り込まれる。矛盾ある場 合には本開示が定義を含めて優先するであろう。 以下の実施例は説明のための方法としてのみ与えられ、制限するために構成さ れているものではない。 実施例1:凍結冷製粉チキン胸骨からのII型コラーゲンの抽出 チキン胸骨を地元のUSDA検査チキン胸脱骨工場から得た。胸骨をさらなる加工 まで冷蔵または冷凍しておいた。胸骨をいかなる肉及び骨をも除去するために刻 み、それから0.5M酢酸溶液に置き、それに対してペプシンを400mg/リットルの溶 液で加えた。該胸骨をペプシン含有酸性溶液に懸濁し、緩んだ残余の肉と軟骨膜 を除去するためLightninミキサーセットを用いて280-350rpmで２日間より長く攪 拌した。該胸骨を洗浄し、水気を取り、試験し、そしていかなる残余の軟骨膜を も緩やかに拭き取って除去した。クリーンな胸骨を引き続き凍結した。該凍結胸 骨 をMicron Powder Systems Mikro Bantam^TM Pulverizer内で微粉化し、-20℃以下 に温度を維持するために液体窒素を継続的に流した。パウダーサイズは<0.062イ ンチであった。このパウダーを加工の前に-15℃で凍結して貯蔵しておくとよい 。該パウダー胸骨をTrisバッファー,pH8.0と混ぜ、それに対してトリプシンを0. 02%の濃度で加えておいた。このスラリーを4℃で17時間攪拌した。トリプシンに よって分解されるプロテオグリカンを該スラリーを遠心分離することによって除 去し、引き続き0.25容量のバッファー、すなわちTrisバッファー,pH8.0または脱 イオン水を用いて残余の沈降物を洗浄し、引き続き第二の遠心分離を行った。結 果として生じた沈降物は、不溶化した非溶解形態のII型コラーゲンを含んだ。こ の沈降物は99%より高い純度に容易に精製され得る可溶性II型コラーゲンを生産 するために酵素学的に容易に切断可能であり、その純度では製薬学的使用に適し ている。 実施例2:凍結冷製粉チキン胸骨からのII型コラーゲンの抽出 チキン胸骨を地元のUSDA検査チキン胸脱骨工場から得る。胸骨をさらなる加工 まで冷蔵または冷凍しておく。胸骨をいかなる肉及び骨をも除去するために刻み 、それから0.04M塩酸溶液に置き、それに対してレニンを500mg/リットルの溶液 で加える。該胸骨をレニン含有酸性溶液に懸濁し、緩んだ残余の肉と軟骨膜を除 去するためLightninミキサーセットを用いて280-350rpmで２日間より長く攪拌す る。該胸骨を洗浄し、水気を取り、試験し、そしていかなる残余の軟骨膜をも緩 やかに拭き取って除去する。クリーンな胸骨を引き続き凍結する。該凍結胸骨を Micron Powder Systems Mikro Bantam^TM Pulverizer内で微粉化し、-20℃以下に 温度を維持するために液体窒素を継続的に流す。パウダーサイズは〈0.062イン チである。このパウダーを加工の前に-15℃で凍結して貯蔵しておくとよい。該 パウダー胸骨をTrisバッファー,pH8.0と混ぜ、それに対してパパインを0.04%の 濃度で加えておく。このスラリーを4℃で17時間攪拌する。トリプシンによって 分解されるプロテオグリカンを該スラリーを遠心分離することによって除去し、 引き続き0.25容量のバッファー、すなわちTrisバッファー,pH8.0または脱イオン 水を用いて残余の沈降物を洗浄し、引き続き第二の遠心分離を行う。結果として 生じた沈降物は、 不溶化した非溶解形態のII型コラーゲンを含む。この沈降物は99%より高い純度 に容易に精製され得る可溶性II型コラーゲンを生産するために酵素学的に容易に 切断可能であり、その純度では製薬学的使用に適している。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，Ｓ Ｚ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ， ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，Ｇ Ｅ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ， ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，Ｐ Ｌ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ， ＶＮ

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．非加工脊椎動物軟骨組織から軟骨膜の除去を容易にする方法で、上記軟骨か ら上記軟骨膜を切断または緩めるのに十分な時間の攪拌の下で、酸性プロテアー ゼを含む酸性溶液と上記軟骨を接触させることを含む方法。 ２．上記軟骨のソースがチキン胸骨である請求項1記載の方法。 ３．上記酸性プロテアーゼがペプシンである請求項2記載の方法。 ４．上記ペプシンの濃度が上記酸性溶液のリットル当たり約100から約500mｇで ある請求項3記載の方法。 ５．上記酸性溶液の酸性化する試薬が0.5M酢酸である請求項4記載の方法。 ６．上記処理が約12から約72時間継続する請求項5記載の方法。 ７．上記処理が約24から約48時間継続する請求項5記載の方法。 ８．上記処理が約4℃から約37℃の温度で実施される請求項6記載の方法。 ９．上記処理が約20℃の温度で実施される請求項6記載の方法。 10．Ｉ型コラーゲンから実質的にフリーなII型コラーゲン含有組織からプロテオ グリカンを除去する方法で、上記組織を中性プロテアーゼ含有溶液と接触させ、 上記中性プロテアーゼは組織に対するプロテアーゼの重量比が0.05%から5%の範 囲内で存在し、上記溶液は溶液内の上記組織から上記プロテオグリカンを抽出す るのに本質的に十分な時間で攪拌され、上記パウダー化組織を回収することを含 む方法。 11．上記組織が微粉化の前に軟骨膜が除去されている微粉化軟骨である請求項10 記載の方法。 12．上記軟骨の上記ソースがチキン胸骨である請求項10記載の方法。 13．上記プロテアーゼがキモトリプシン、パンクレアチン、パパイン、フィシン 、キモパパイン、膵ペプチダーゼ、及びトリプシンより成る群から選択され、上 記プロテアーゼが組織に対するプロテアーゼの重量比が約0.05から約5%で存在す る請求項11記載の方法。 14．上記プロテアーゼがトリプシンであり、上記トリプシンが組織に対するプロ テアーゼの重量比が約0.05から約5%で存在する請求項12記載の方法。 15．上記トリプシンが約0.8%の濃度で存在する請求項10記載の方法。 16．上記時間が約8から約36時間である請求項12記載の方法。 17．上記時間が約15から20時間である請求項13記載の方法。 18．上記接触が約4℃から約35℃の温度で実施される請求項10記載の方法。 19．上記接触が約４℃の温度で実施される請求項15記載の方法。 20．II型コラーゲン、プロテオグリカン及びＩ型コラーゲン含有軟骨膜を含む脊 椎動物由来の肉及び骨のないコラーゲン組織からＩ型コラーゲン及び他の不純物 の実質的にフリーなII型コラーゲンを含む産物を得るための方法で、該方法は： 上記膜を切断または緩めるのに十分な時間、酸性プロテアーゼを含む酸性溶液 と上記組織を攪拌と共に接触させ、Ｉ型コラーゲンの実質的にフリーな上記組織 を回収し；及びその後 大体中性のpHの溶液と上記組織を攪拌と共に接触させ、上記溶液はプロテアー ゼが上記組織に含まれるプロテオグリカンを分離するのに十分な時間、プロテア ーゼ:組織の重量比が0.05%-5%の範囲内での中性プロテアーゼを含み、Ｉ型コラ ーゲンとプロテオグリカンの両者が実質的にフリーな上記組織を回収する方法。